Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ассоциация и агрегация ферментов гликогенолиза

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ассоциация и агрегация ферментов гликогенолиза"

На правах рукописи

МЕРЕМЬЯНИН Алексей Владимирович

АССОЦИАЦИЯ И АГРЕГАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ ГЛИКОГЕНОЛИЗА

03 00 04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

003162324

Работа выполнена в отделе структурной биохимии белка Института биохимии им А Н Баха Российской академии наук

Научные руководители:

доктор биологических наук Н А Чеботарева

доктор химических наук, профессор Б И Курганов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук НП Юрина

кандидат биологических наук Л В Белоусова

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Защита состоится ноября 2007 г в /V0 час на заседании диссертационного совета К 002 247 01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Институте биохимии им АН Баха РАН по адресу 119071 Москва, Ленинский пр 33, корп 2

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу 119071 Москва, Ленинский пр 33, корп 1

Автореферат разослан «•И » октября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А Ф Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. При неблагоприятных условиях (тепловой, осмотический и окислительный стрессы, продукты вирусных генов и др), а также при неправильном фолдинге образуются структурно-нефункциональные белковые агрегаты, с генерацией которых связан целый ряд так называемых «конформационных болезней» (катаракта и различного рода нейродегенеративные заболевания) Существующие на данный момент механизмы агрегации не могут в полной мере объяснить процесс агрегации Так, например, широко используемый механизм «nucleation-dependent aggregation» (механизм, включающий стадию образования ядер агрегации и стадию роста агрегатов путем присоединения денатурированных мономеров к образовавшемуся ядру) предполагает образование в конечном счете агрегатов предельных размеров, тогда как при тепловой агрегации, согласно экспериментальным данным, не происходит формирования агрегатов ограниченного размера Поэтому остается актуальным установление механизма процесса агрегации

В настоящее время известно, что в организме существует целый ряд соединений, способных подавлять процесс агрегации Одним из таких соединений является а-кристаллин - белок из семейства малых белков теплового шока, обладающий шапероноподобной активностью [Horvitz, 1992] Однако до сих пор до конца не ясно, как именно происходит процесс блокирования агрегации Поэтому актуальным представляется установление механизма подавления агрегации белковых субстратов малыми белками теплового шока

Помимо агрегации существуют и другие процессы, в ходе которых образуются крупные мультимерные белковые частицы, что приводит к снижению активности фермента Одним из таких процессов является самоассоциация Удивительным свойством киназы фосфорилазы, ключевого фермента гликогенолиза, является процесс самоассоциации белка в присутствии ионов Са2+ и Mg2+, приводящий к снижению удельной ферментативной активности Подобная способность киназы фосфорилазы к самоассоциации является неожиданной, так как именно эти ионы необходимы для протекания ферментативного процесса Достоверного механизма самоассоциации киназы фосфорилазы на данный момент не существует, поэтому его установление актуально

Поскольку известно, что условия в живой клетке, содержащей высокие концентрации макромолекул (50-400 мг/мл, условия молекулярного краудинга), сильно отличаются от таковых для разбавленных растворов т vitro, представляется актуальным изучение процесса самоассоциации киназы в условиях, приближенных к физиологическим

Цель работы. Целью настоящей работы является установление механизма тепловой агрегации гликогенфосфорилазы Ь из скелетных мышц кролика и механизма самоассоциации киназы фосфорилазы из того же источника, индуцируемой ионами кальция и магния, выяснение общности механизмов этих процессов В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи

1 Изучить кинетику тепловой агрегации гликогенфосфорилазы Ь при фиксированных значениях температур (37 и 48 °С), а также в режиме, когда температура повышается с постоянной скоростью

2 Изучить влияние а-кристаллина (белка, обладающего шапероноподобной активностью) на стабильность гликогенфосфорилазы Ь и на агрегацию фермента, изучить взаимодействие а-кристаллина с гликогенфосфорилазой Ъ при повышенных температурах

3 Изучить кинетику Са2+- и М§2+-индуцированной самоассоциации киназы фосфорилазы, изучить влияние а-кристаллина и пролина (химического шаперона) на ассоциацию РЖ

4 Изучить Са2+- и М§2+-индуцированную самоассоциацию киназы фосфорилазы в условиях приближенных к физиологическим (при физиологических значениях ионной силы и в условиях краудинга) Проверить обратимость самоассоциации РНК

Научная новизна. Предложен механизм тепловой агрегации гликогенфосфорилазы Ь, включающий две стадии стадию образования стартовых агрегатов и стадию дальнейшего их роста в результате слипания с образованием агрегатов более высокого порядка Впервые были подобраны условия, позволяющие длительное время (на протяжении десятков минут) фиксировать стартовые агрегаты гликогенфосфорилазы Ь и демонстрирующие отсутствие интермедиатов между нативной формой фермента и стартовыми агрегатами Установлен механизм защитного действия а-кристаллина, который при повышенных температурах включается в стартовые агрегаты, что приводит к снижению вероятности слипания сталкивающихся частиц

Впервые установлено, что механизм Са2+- и Г^2+-индуцируемой самоассоциации киназы фосфорилазы имеет сходство с механизмом агрегации белков, а именно, включает две стадии стадию образования стартовых ассоциатов и дальнейшее слипание стартовых ассоциатов Впервые изучена ассоциация киназы фосфорилазы в условиях, имитирующих физиологические (при физиологических значениях ионной силы и в условиях краудинга)

Практическое значение работы. Установленные в диссертационной работе закономерности агрегации белков могут быть использованы для поиска соединений, эффективно подавляющих агрегацию белков Подобные соединения представляют интерес при решении биотехнологических задач (подавление нежелательной агрегации при ренатурации рекомбинантных белков и разработка методов хранения белковых препаратов медицинского назначения) и при разработке методов лечения заболеваний, связанных с образованием белковых агрегатов (катаракта, нейродегенеративные заболевания)

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), 14-ом

Международном Симпозиуме по аналитическому ультрацентрифугированию (Lausanne, 2005), XVIII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2006), Международной школе-конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» (С-Петербург, 2006), 15-ом Международном Симпозиуме по аналитическому ультрацентрифугированию (London, 2006) и на конкурсе аспирантов Института биохимии им А Н Баха РАН на соискание стипендии имени члена-корреспондента РАН В Л Кретовича (Москва, 2006)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 11 работ

Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на

_страницах Список цитируемой литературы включает_наименований

Иллюстративный материал содержит_рисунков и_таблиц

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Гликогенфосфорилазу b (Phè) из скелетных мышц кролика выделяли по методу Фишера и Кребса [Fischer and Krebs, 1958, 1962] Киназу фосфорилазы (PhK) из скелетных мышц кролика выделяли по методу Коэна [Cohen, 1973] с модификацией на последнем этапе очистки [Морозов и др , 1989] а-Кристаллин выделялся из хрусталиков глаза быка согласно методике, описанной ранее [Chiou et al, 1979] совместно с к б н КО Мурановым (лаборатория физико-химических основ рецепции, Институт биохимической физики им H M Эмануэля РАН)

Степень чистоты белков, используемых в работе, анализировали методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН

Калориметрические исследования проводили совместно с к б н СЮ Клейменовым (лаборатория молекулярной организации биологических структур, Институт биохимии им АН Баха РАН) на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре «ДАСМ-4М» (ИБП РАН) при постоянном избыточном давлении 2 2 атм, со скоростью нагревания 1 К/мин Обратимость теплового перехода проверяли путем сравнения остаточной теплоемкости при повторном прогреве образца

Кинетику агрегации белков изучали методом динамического светорассеяния Измерения проводили на установке Photocor Complex (Photocor Instruments Inc , США) с He-Ne лазером (Coherent, USA, Model 31-2082, 632,8 нм, 10 мВ) в качестве источника света Температура образцов поддерживалась при помощи PID temperature controller в пределах ± 0 1 °С Автокорреляционные функции измеряли при помощи Photocor-FC в режиме multiple-tau с использованием 288 каналов и логарифмической шкалой времени Обработку автокорреляционных функций и расчет размеров гидродинамического радиуса Rh проводили при помощи программы DynaLS (Alango, Израиль)

Эксперименты по скоростной седиментации выполнялись совместно с д б н НА Чеботаревой на аналитической ультрацентрифуге «Spinco Е» (Beckman, США), с использованием абсорбционной сканирующей оптической системы при длине волны 280 нм, при 20-48 °С и скоростях вращения ротора от 1000 до 40000 об/мин Коэффициенты седиментации определяли с использованием программы SEDFIT [Schuck, 2000] Полученные коэффициенты седиментации приводили к стандартным условиям (плотность и вязкость растворителя брали для водного раствора, при 20 °С), как было описано ранее [Kurganov et al, 2000]

Следует подчеркнуть, что метод динамического светорассеяния использовался в том случае, когда требовалось установить с высокой чувствительностью процесс агрегации или ассоциации, а для анализа олигомерного состояния белков, главным образом, применялся метод аналитического ультрацентрифугирования, так как в данном случае он обладал большей чувствительностью

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование тепловой агрегация гликогенфосфорилазы Ь

Гликогенфоефорилаза (Phb; КФ 2.4.1. Î) - один из ключевых ферментов гликогене л та, катализирует фосфоролиз гликогена, В покоящейся мышце Ph/> существует в виде неактивной без АМР, кефосфорилировашюй формы Ь, Активность Pli А регулируется как путем ф осф о р и л и ро в а н и я, так и посредством информационных изменений фермента при взаимодействии с аллостерическими эффекторами. Молекула Phfr представляет собой димер, состоящий из двух идентичных субъсдиииц с молекулярной массой 97,4 кДа.

Тепловую агрегацию Phi изучали методом динамического светорассеяния при 48 °С при. Этот метод позволяет измерять гидродинамический радиус (/?h) частиц, образующихся в ходе агрегации. Например, на рис. 1 показано распределение частиц по размерам для различных значений времени инкубации Ph/> (концентрация 1 мг/мл). Функции распределения регистрировали с интервалом 1,5 мин. При / = 3,0 и / = 4,5 мин наблюдался только один пик с /4 = 6 нм, что

соответствует натиеной форме Plié (например, на рис. IA показано распределение частиц по размерам для t = 3,0 мин). При t = б мин (рис. 1Б) появляется дополнительный пик с Я„ = 40,7 им. что свидетельствует об образовании белковых агрегатов. Начиная с момента времени / = 7,5 мин, обнаруживался только один пик, который соответствовал агрегатам, причем гидродинамический радиус а'фегатов увеличивался во времени. Так, при t = 15 мин Л], составил 270 нм (рис. 1В).

Рост агрегатов сопровождался увеличением интенсивности светорассеяния (!) во времени, Анализ зависимостей / от / для различных концентраций Ph/j (рис. 2) показал, что зависимость / от времени может быть описана уравнением:

/ = /,;га{1 -expf-Ai(i-io)]},

(1)

Рис, 1. Анализ тепловой агрегации РЬй (1 мг/м.ч) методом динамического светорассеяния (0,08 М Нереэ буфер, рН 6,8; ОД мМ ЭДТА, 0,1 М К'аСЛ, 48 °С). Распределение частиц по размерам, зарегистрированное при различных временах инкубации: 3 (А), 6 (Б) и 15 (В) мин.

где /|[Л1 — предельное значение интенсивности светорассеяния при / -»ее, !0 - длительность лаг-периода зависимости / от I и к1 -константа скорости реакции первого порядка. Произведение соответствует

тангенсу угла наклона зависимости ! от времени при / = Данный угол наклона обозначен как (Д//с1/) ■ Физический смысл

этой величины - мера скорости аг регации белка [Курганов, 2002].

юооооо, рис 2 Кинетика тепловой агрегации РЬЬ

при 48 °С Зависимости интенсивности светорассеяния (I) от времени для различных концентраций белка 0,3 (1), 0,5 (2) и 1,0 мг/мл Точками обозначены экспериментальные данные, сплошные кривые проведены согласно уравнению (1) Горизонтальные пунктирные линии соответствуют

значениям /|1т

Результаты анализа зависимости интенсивности светорассеяния от времени с использованием уравнения (1) представлены в таблице 1

Таблица 1 Параметры уравнения (1), использованные для описания зависимости интенсивности светорассеяния (Г) от времени для агрегации РЬЬ при 48 °С

мг/мл ¡0, мин /[щ,, фотоотсчет/с &1, мин 1 (фотоотсчет/с) мин"1

0,3 5,5 ±0,1 (4,33 ± 0,04) 105 (4,26 ±0,15) 102 (1,84 ±0,04) 104

0,5 4,6 ± 0,2 (6,04 ±0,04) 105 (3,51 ±0,09) 102 (2,12 ±0,08) 104

1,0 4,9 ±0,1 (9,06 ±0,08) 105 (3,45 ±0,09) 10"2 (3,13 ±0,06) 104

2,4

00 "> п о 2,0

1,6

Б

до9с д о-. д СП

о" Л п о О 1

о 2

□ л з

0,0

0.

5 1,0

1,5

На рис ЗА представлены зависимости белковых агрегатов от времени для различных концентраций РИЬ Начальные участки зависимости могут быть описаны линейной функцией Момент времени, при котором зарегистрирован рост интенсивности светорассеяния

соответствует появлению первичных кластеров (мы их назвали «стартовыми агрегатами», так как именно с их участием происходит формирование более крупных белковых агрегатов) Начальные линейные участки зависимостей гидродинамического радиуса от времени могут быть описаны с помощью следующего уравнения

Рис 3 Зависимости гидродинамического радиуса агрегатов РЬб от времени в координатах (А) и - Льо),

- ¿о} (Б) для различных концентраций фермента 0,3 (1), 0,5 (2) и 1 мг/мл (3)

К - Ко

1 + 7-('-'.) *->й

(2)

где Ль о - гидродинамический радиус стартовых агрегатов, /0 - момент времени, при котором появляются стартовые агрегаты (т е начинается прирост интенсивности светорассеяния), - интервал времени, за который

гидродинамический радиус увеличивается от Ль = Ль о до Ль= 2ЛЬ 0 Параметр /2г< характеризует скорость агрегации (чем выше величина тем выше скорость агрегации)

Анализ зависимостей Ль от времени по уравнению (2) с использованием определенного по уравнению (1) параметра позволил определить параметры Ль о и (таблица 2) Средний гидродинамический радиус стартовых агрегатов составил 16,7 ± 1,0 нм При увеличении концентрации РЫ> происходило падение значения /2К, т е ускорение агрегации

При высоких значениях времени происходит переход линейной функции в степенную, которая описывается следующим уравнением

(3)

где -фрактальная размерность агрегатов

Для анализа характера зависимости Ль от I при высоких значениях времени, данные зависимости были построены в логарифмических координатах Как видно из рис ЗБ, зависимости 1о§(Ль - Ль о) от log(/ - /0) становятся линейными при высоких значениях времени Был определен тангенс угла наклона линейных участков Он составил 0,56 ± 0,02 В соответствии с уравнением (3) обратная величина тангенса угла наклона соответствует параметру (1( (с/[ = 1,78 ± 0,06, таблица 2) Значение параметра фрактальной размерности порядка 1,8 указывает на то, что агрегация протекает в диффузионном кинетическом режиме [\Veitz е1 а1, 1985], при котором скорость процесса ограничивается стадией диффузии, другими словами, каждое столкновение взаимодействующих частиц ведет к их слипанию (вероятность слипания сталкивающихся частиц равна единице)

Таблица 2. Параметры уравнения (2) и (3), использованные для описания зависимости гидродинамического радиуса (/?ь) от времени для агрегации РЬ6 при 48 °С

[РЬ 6], мг/мл Ль о, нм >2К, мин ¿г

0,3 17 ± 1 0,90 ± 0,03 1,78 ±0,07

0,5 17 ± 1 0,83 ± 0,02 1,78 ±0,07

1,0 16± 1 0,66 ± 0,02 1,78 ±0,07

Таким образом, в ходе исследования было установлено, что процесс агрегации идет через стадию образования стартовых агрегатов Однако вследствие того, что при 48 °С агрегация РЬЬ протекает очень быстро,

120000

80000

40000

400 600 800 1000 [(мин)

Рис. 4. Кинетика тепловой агрегации РИ6 (1 мг/мл) при 37 °С (0,08 М Нерез, рН 6,8, содержащий 0,1 М №С1 и 0,2 мМ ЭДТА) Зависимости интенсивности светорассеяния (/) от времени (/)

1000

10 100 R (nm)

гидродинамический радиус стартовых агрегатов находили путем

экстраполяции Для того чтобы более надежно зарегистрировать начальную стадию образования стартовых агрегатов, были подобраны условия, при которых агрегация протекает с меньшей скоростью [37 °С, высокие концентрации белка (1-3 мг/мл)]

На рис 4 показана зависимосить I от времени для Phb в концентрации 1 мг/мл при 37 °С Как видно из рисунка, зависимость I от t включает лаг-период, длительность которого обозначена как параметр t2) Был найден угол наклона линейной части зависимости 1 от времени [параметр (d/ /di) ]> физический смысл

которого - мера скорости агрегации Аналогичным образом были рассчитаны данные параметры для агрегации Phb в концентрации 2 и 3 мг/мл (табл 3) Анализ данных показал, что с увеличением концентрации белка параметр t2 уменьшается (от 380 мин при концентрации Ph6 1 мг/мл до 141 мин при концентрации Phb 3 мг/мл), а параметр (d//d/) увеличивается

На рис 5 показано распределение частиц по размерам для различных значений времени инкубации Phi в концентрации 1 мг/мл при 37 °С В начальное время инкубации была обнаружена только исходная форма белка (рис 5А, время инкубации 27 мин) обнаруженной формы

Рис. 5 Тепловая агрегация Ph6 (1 мг/мл) при 37 °С (0,08 М Hepes, рН 6,8, содержащий 0,1 М NaCl и 0,2 мМ ЭДТА) Распределение частиц по размерам для различных значений времени инкубации (А) 27, (Б) 255 и (В) 750 мин

Таблица 3 Параметры, характеризующие тепловую агрегацию РЬ6 при 37 °С (0,08 М Нереэ буфер, содержащий 0,1 М ЫаС1 и 0,2 мМ ЭДТА)

[Phô], мг/мл ИМ tu мин /2, МИИ (фотоотсчет/сек) мин'1 (мин)

1,0 95,4 ±0,8 255 ± 1 380 ±3 163 ±2 517 ± 5

2,0 100,5 ±0,8 186 ± 1 248 ±3 447 ±4 343 ±3

3,0 105,1 ± 1,2 94 ± 1 141 ±2 1410 ±10 272 ±3

составлял 5,6 ± 0,6 нм, что соответствует нативному состоянию белка При инкубации Phè в течение 255 мин образовывались стартовые агрегаты (рис 5Б), гидродинамический радиус которых составлял 95,4 ± 0,8 нм Вплоть до 517 минут происходило накопление стартовых агрегатов, и их гидродинамический радиус был неизменен во времени При больших значениях времени инкубации происходил рост размеров белковых агрегатов (рис 5В, время инкубации 750 мин)

На рис 6 представлена зависимость гидродинамического радиуса от времени для исходной формы Phb (сплошные кружки) и для белковых агрегатов (полые кружки) Время появления стартовых агрегатов (оно обозначено как параметр /ь табл 3) составило 255 мин Размер стартовых агрегатов (параметр Rh0 в табл 3 определен равным 95,4 ± 0,8 нм) Из рис 6 видно, что существует интервал времени, на протяжении которого размер агрегатов был неизменен Начиная с определенного момента времени, величина Ru белковых агрегатов начинала расти Данный момент времени был обозначен как параметр h (табл 3) Аналогичным образом были рассчитаны параметры и о Для Phà в концентрациях 2 и 3 мг/мл (табл 3) Оказалось, что размер стартовых агрегатов не зависел от концентрации белка Среднее значение Ru о составило 100,3 ± 0,9 нм Параметры и h уменьшались с увеличением концентрации РИЛ

Анализ данных, представленных в таблице 3, показал, что в интервале от 380 до 517 минут при [Phè] = 1 мг/мл, от 248 до 343 мин при [Phè] = 2 мг/мл и от 141 до 272 мин при [Ph6] = 1 мг/мл увеличение интенсивности светорассеяния было связано только с накоплением стартовых агрегатов

Изучение процесса агрегации при 37 °С подтвердило, что начальной стадией тепловой агрегации РЬА является стадия образования стартовых

t (чин)

Рис 6 Зависимость гидродинамического радиуса от времени агрегации для РЬ6 (1 мг/мл) исходная форма (сплошные кружки) и агрегаты (полые кружки) при 37 °С (0,08 М Нерев, рН 6,8, содержащий 0,1 М №С1 и 0,2 мМ ЭДТА)

агрегатов (начало этого процесса характеризуется параметром I]), протекающая по принципу «все или ничего», затем (в интервале времени от tz до /3) происходит накопление стартовых агрегатов (это сопровождается увеличением интенсивности светорассеяния, при неизменности размеров стартовых агрегатов со средним значением гидродинамического радиуса 100,3 нм). Отметим, что при более высоких температурах (например, при 48 °С) параметры и и & совпадают и обозначаются нами как параметр ta.

На основании данных, полученных в ходе изучения процесса тепловой агрегации гликогснфосфорилазы Ь при 37 и 48 °С, нами предложен механизм тепловой агрегации гликогенфосфоршшы h (рис. 7), включающий дее стадии:

1. Стадия образования стартовых агрегатов, протекающая по принципу «все или ничего»,

2. Стадия слипания стартовых агрегатов и агрегатов более высокого порядка, протекающая в кинетическом режиме, при котором скорость агрегации лимитируется диффузией взаимодействующих частиц (вероятность слипания сталкивающихся частиц равна единице).

На'МШШчШ .

пняер М.»ш.™ц

о —

Ком iji |]рм в 1ЕИ(Н1 на- Д^латурнр рялиыы и

MjuerEcmfuii ДЕЕ^ер stwimltp

t'HC. 7. Схема тепловой агрегящр! Phi1.

2. Влияние а-кристаллина на тепловую агрегацию Pli/j

Исследование влияния сс-кристаллина проводили при температуре 48 °С. Как видно из рис. 8, в присутствии а-кристаллина при относительно малых временах наблюдается снижение прироста интенсивности светорассеяния. Однако при I > 47 мин в присутствии а-кристаллина в концентрации 0,1 мг/мл (кривая 1) и при (> 71 мин в присутствии а-крнсталлина в концентрации 0,4 мг/мл (кривая 3) значения интенсивностей светорассеяния были выше

таковых, зарегистрированных в отсутствие а-кристаллина.

В присутствии а-кристаллина образовывались агрегаты меньших

Рис. 8. Влияние a-криега.члина на кинетику тепловой агрегации Phi) (0,5 мг/мл) при 48 °С (0,08 М Hepes буфер, pH 6,8; 0,2 мМ ЭДТА, 0,1 М NaCl). Зависимости интенсивности светорассеяния (I) от времени для различиях концентраций а-кристаллина: 0 (П. 0,1 (21 и 0,4 мг/мл (31.

I (мин)

Рис. 9. Зависимости гидродинамического радиуса от времени для агрегации РЬЬ (0,5 мг/мл) при различных концентрациях а-кристаллина 0 (1), 0,1 (2) и 0,4 мг/мл (3) Зависимость в координатах {/?|„ (А) и зависимости, представленные в координатах {Ьп/?|„ 1} для концентраций кристаллита 0,1 (Б) и 0,4 мг/мл (В) Вставка на рис А дана для концентрации а-кристаллина 0,4 мг/мл с растяжкой по оси ординат для увеличения масштаба)

размеров (рис 9А) Однако в присутствии а-кристаллина в концентрации 0,1 мг/мл (кривая 2 на рис 9А) при Г > 34,5 мин значения /?ь становятся больше по сравнению с контролем

Зависимости гидродинамического радиуса от белковых агрегатов, полученные в присутствии а-кристаллина, имеют линейный характер в координатах {Ьп/^, /} (рис 9Б и 9В), свидетельствующий о том, что зависимость от ( подчиняется экспоненциальному закону Линейная часть зависимости может быть описана следующим уравнением

1п2

1пЛь = 1п Льо+ —

(4)

60 80 I (мин)

Тангенс угла наклона для зависимости 1пКь от времени равен

Расчеты показали, что добавление а-кристаллина приводит к снижению величины \Zt2K (от 1,2 мин"1 в отсутствие а-кристаллина до 0,19 и 0,025 мин1 в присутствии 0,1 и 0,4 мг/мл а-кристаллина, соответственно) Уменьшение величины 1//2я свидетельствует о снижении скорости агрегации в присутствии а-кристаллина

Экспоненциальный характер зависимости гидродинамического радиуса от времени свидетельствует о переходе кинетического режима агрегации в присутствии а-кристаллина в режим, при котором вероятность слипания

Рис. 10. Седиментационное поведение а-кристаллина, Phb и их смеси при 20 °С (А) и при 48 °С (Б) Дифференциальные распределения по коэффициентам седиментации c(s) для Phb (1 мг/мл, кривая 1), а-кристаллина (1 мг/мл, кривая 2) и их смеси в тех же концентрациях (кривая 3) при 20 °С Дифференциальные распределения по коэффициентам седиментации c(s) для Ph6 (кривая 1), а-кристаллина (кривая 2) и их смеси (3) при 48 °С приведены к стандартным условиям (20 °С, вода) Общее время инкубации 3,5 ч при 48 °С Скорость ротора 44000 об/мин (А) и 40000 об/мин (Б) Вставки на рис А и Б показывают распределения при s2o„ > 10 S с растяжкой по оси ординат

сталкивающихся частиц становится меньше единицы, другими словами, а-кристаллин снижает вероятность слипания сталкивающихся частиц Для того чтобы проверить возможность взаимодействия Ph6 с а-кристаллином при комнатной температуре, было изучено седиментационное поведение Phb в присутствии а-кристаллина при 20 °С На рис 10А представлены дифференциальные распределения c(s), полученные методом скоростной седиментации и характеризующие олигомерное состояние Phb (1 мг/мл, кривая 1), а-кристаллина (1 мг/мл, кривая 2) и их смеси (кривая 3) при 20 °С Полученные данные свидетельствуют о том, что при указанной температуре Phi> представлена димерной формой (s2Q w = 7,9 ± 0,2 S), а-кристаллин представлен двумя основными формами с коэффициентами седиментации s2ow = 18,2 ± 1,8 S и j20w = 28,9 ± 1,2 S Положения пиков Ph6 и а-кристаллина для смеси остаются неизменными Это свидетельствует об отсутствии взаимодействия Ph6 с а-кристаллином при 20 °С

На рис 10Б представлено седиментационное поведение PhZ> (1 мг/мл, кривая 1), а-кристаллина (1 мг/мл, кривая 2) и их смеси в тех же концентрациях (кривая 3) при 48 °С На дифференциальном распределении c(s) для PhZ> отмечен пик со значением s2ow = 7,2 ± 0,2 S, немного меньшим, чем для димера, что свидетельствует о частичной диссоциации димера на мономеры (кривая 1) На распределении c(s), соответствующем пробе а-кристаллина, отмечено 4 пика со значениями s2ow = 10,7 ± 0,8, 17,0 ± 1,0, 20 ± 1 и 24 ± 1 S (кривая 2) На дифференциальном распределении для смеси PhA и а-кристаллина (кривая 3) отмечается исчезновение пиков, соответствующих а-кристаллину в районе значений 52ow больше 10 S, что указывает на взаимодействие Phi и

а-кристаллина при 48 °С Пик с 82о№ = 7,6 ± 0,2 Б предположительно соответствует комплексу РН6 с а-кристаллином

Для исследования влияния а-кристаллина на стабильность РИА при повышенных температурах, была изучена кинетика термоинактивации РИ6 в присутствии а-кристаллина На рис 11 представлена кинетика термоинактивации РИА (0,45 мг/мл) при 48 °С в отсутствие (кривая 1) и в присутствии 0,45 мг/мл а-кристаллина (кривая 2) В отсутствие а-кристаллина наблюдался лаг-период на кинетической кривой, за которым следовала инактивация фермента, связанная с необратимой денатурацией белка а-Кристаллин не оказывал влияния на длительность лаг-периода, однако в его присутствии скорость инактивации возрастала Это позволило предположить, что а-кристаллин взаимодействует с интермедиатами разворачивания молекулы РЬЬ (вероятно, с продуктами диссоциации димера)

На основании полученных данных предложен механизм тепловой агрегации РИА в присутствии а-кристаллина (рис 12)

200 300 400 г (мин)

Рис 11 Тепловая инактивация РЬЬ (0,45 мг/мл) при 48 °С (0,08 М Нереэ, рН 6,8, содержащий 0,1 М №01 и 0,2 М ЭДТА) Зависимости относительных ферментативных активностей (А/А0) от времени в отсутствие (1) и в присутствии а-кристаллина (2, 0,45 мг/мл)

Ч+С

DC

Стартовые * агрегаты "

RLCA

Аморфные агрегаты

1С

Рис 12 Схема тепловой агрегации Phi в присутствии а-кристаллина Р - нативный димер Ph6, I - интермедиат разворачивания молекулы Ph6, D - денатурированный белок, С -а-кристаллин, 1С и DC - комплексы а-кристаллина с интермедиатом и денатурированным белком, соответственно RLCA - механизм, при котором вероятность слипания взаимодействующих частиц меньше единицы (reaction-limited cluster-cluster aggregation)

Как показано на схеме, а-кристаллин может взаимодействовать не только с денатурированной формой, но и с интермедиатами разворачивания молекулы Phb Так, предполагается, что пик с s20w = 7,6 S, наблюдаемый для смеси РЬ6 с а-кристаллином, прогретой 3,5 часа при 48 °С (рис 10Б, кривая 3), соответствует комплексу I С Встраивание а-кристаллина в стартовые агрегаты приводит к изменению режима агрегации белка, что сопровождается снижением вероятности слипания стартовых агрегатов и агрегатов более высокого порядка

1200(10

3. Исследование самоассоциации кнназы фосфорилазы

Киназа фосфорилазы [РЬК; КФ 2.7,1.38] играет ключевую роль в нервной и гормональной регуляции гликогенолиза в скелетых мышцах.. РКК. катализирует Са2"1", сАМР зависимое фосфорилирование и активацию рЬй. Молекула фермента с молекулярной массой 1320 кДа имеет сложную молекулярную организацию и представляет собой гексадекамер, состоящий из четырех различных субъединиц со стехиометрией (сфу8)4, причем у-субъединица является каталитической, а а-, ¡3- и б-субъединицы регуляторными. Ионы Са2+ и М§21 стимулируют активность РНК, индуцируя изменения третичной и четвертичной структуры молекулы, а также стимулируют ассоциацию гексадекамер а.

Методом динамического светорассеяния было определено, что в отсутствие ионов Са2+ и М§2+ гексадекамера РЬК составляет 13.0 -Ь 0,5 нм. При инкубации РЬК в присутствии Са2+ и М£ + происходит ассоциация фермента. Ассоциация РЬК сопровождалась увеличением интенсивности светорассеяния (рис. 13А), причиной

которого являлся рост размеров белковых ассоциатов. На рис. 13Б представлена зависимость У4 от времени. Начальный участок этой зависимости имеет линейную функцию. Экстраполяция значения А, на ось абсцисс позволяет найти параметр А\0, который характеризует размер частиц, присутствующих в системе при ( = 0 и названных стартовыми ассоциатами. составил 82 ± 3 нм. Рост ассошатов происходил за счет слипания стартовых ассоциатов и ассоциатов более высокого порядка.

Для того, чтобы оценить количество молекул, входящих в состав стартового ассоциата, было использовано соотношение между молекулярной массой белка (М„ кДа) и гидродинамическим радиусом (Ль,о, нм):

м^о^адо2-33*8

Учитывая молекулярную массу молекулы РЬК (Мг = 1320 кДа), стартовый ассоциат с = 82 ± 3 нм должен содержать 76 ± 7 молекул РЬК.

Участок зависимости /?],(?) при больших временах (участок, который характеризует процесс слипания стартовых ассоциатов) подчиняется стеленной функции (уравнение 3), что следует из линейности зависимости в логарифмических координатах (рис. 13В). Анализ угла наклона линейной функции на рис. 1ЗВ позволил найти параметр с!,:.

0.8

Рис. 13. Ки.чепшз ассоциации РЬК (0,2 мг/мл) в 40 мМ Нерев, рН 6,8, содержащем 0,1 мМ Са"' и 10 мМ Мё2+. 'Зависимость ! и Л], от времени (А и Ь соответственно) и зависимость от времени 1;

логарифмических координатах (В).

0,008

■t-

0,004

0.000

Рис. 14, Самоаскициация PhK (0,3 мг/мл). Дифференциальное распределение по коэффициентам седиментации (40

мМ I-lepes. рН 6,8; 0,1 мМ Са2 M g2-; 10 мМ MaCI; 15 °С). вращения ротора 20000 об/мин.

и 10 мМ

Скорость

Олигомерное состояние PhK

который составил 1,78. Откуда следует, что стадия слипания стартовых ассоциатов и ассоциатор более высокого порядка протекает в диффузионном режиме.

Таким образом, механизм ассоциации РкК сходен с механизмом тепловой агрегации РЫ>. условиях самоассоциации фермента,

индуцированном Са21" и К^2', было изучено методом скоростной седиментации. Полученные результаты показали, что главным образом, фермент представлен гексадекамером РЖ и его димерной, тримерной и тетрамерноп формами, с средними значениями коэффициента седиментации .?20л„ = 23,0 ± 1,5; 37,0 ± 2; 49,0 ±2,5и64± 12,2 Э соответственно (рис. 14).

Методом динамического светорассеяния было покашно влияние пролина, химического шаперона, на процесс ассоциации. Оказалось, что пролин подавляет

ассоциацию РНК (рис. 15), о чем

120000

■А

Я0000

ь

S

iQ 40000

-.7"^úí 'iiV. V^'.''' *-V.

10

15 : мин

20

2S

2<Ю0

IÍ00

1000

500

свидетельствует снижение прироста интенсивности светорассеяния (рис, 15А) и уменьшение размера, образующихся ассоциатов (рис, 15Б) в присутствии пролина. При этом размер стартовых ассоциатов был неизменным.

Исследование олигомериогО

состояния PhK методом седиментации показало, что с увеличением концентрации пролина (рис. 16) пики сдвигаются в сторону гекс аде камера PhK: ,î;o,w = 23,0 ± 1.9 S (16А), 20,0 0= 0,6 S (рис. 16Б), 19,0±0,6 S (рис. Ï6B).

Согласно полученным данным, пролин препятствует ассоциации

Plie. 15. Влияние пролина на самоассоциацию Pli К (0,3 мг/мл). Зависимость интенсивности свсторассеиння (А) и гидродинамического радиуса (Б) от времени при различных конце! ¡-грациях пролина: 0(1), 0,08 M (2), 0,15 M (3).

П:

0.02

0.0 t

0,0« 0,12 0,0 S 0,04 j-ü,flöj

0,06. f

0,04 i-0,021

0.00*' 0

10

20 30 j, S

40 50

Рис. 16. Влияние пролина па самоаесоциацию PliK (0,3 мг/мл). Распределение c(j): в отсутствие пролина (А), в присутствии 0,! S M пролина (Б) и "в присутствии 0,3 M пролипа (В) (40 мМ Hepcs, pli 6,8; 0,1 мМСа2", 10 мМ Ме2+; 10 мМ NaCl; 20 °С), Скорость вращения ротора 30000 об/мин.

молекул PhK. Данных относительно влияния пролина на ассоциацию ферментов в литературе нет, однако есть данные о предотвращении пролином агрегации белков. В настоящей работе предполагается, что за счет взаимодействия пролина с киназой фосфорилазы происходит подавление самоассоциации PliK.

В ходе работы было сделано предположен ие, что а-кристалл ин будет препятствовать самоассоциации PhK. Анализ седиментациоиного поведения смеси РЬК и а-кристаллина проводили в разных экспериментальных условиях, но система является слишком сложной, чтобы рассчитать стехиометрию комп лексообразовани я, В первую очередь было проверено, будет ли взаимодействие между Phè и а-кристаплипом в присутствии ионов Са2+ и Mgîh. Изучение

характера действия а-кристаллина на процесс ассоциации PhK проводилось методом седиментации. На рисунке 17 показаны распределения c(s) для PhK. (0,3 мг/мл, кривая 1) а-кристаллина (0,3 мг/мл, кривая 2) и их смеси в тех же концентрациях (кривая 3). На основании того, что происходит изменение площади пиков я смешение позиции лика и сторону меньших величин „у, был сделан вывод о взаимодействии РЬК и а-кристаллина.

Методом динамического светорассеяния было установлено, что

присутствие высоких концентраций а-кристаллина приводит к подавлению самоассоциации к и налы фосфорилазы, индуцированной ионами Са2т и M.g2+ (рис. 18), о чем свидетельствует снижение прироста интенсивности светорассеяния

0,06

0,04

0,02 f

0,00 L

10 20

30 40 i, s

50 60 70

Рис. 17. Распределения с($) по коэффициентам седиментации для ассоциирующей PhK. (0,3 мг/мл; кривая 1) а-кристаллина (0,3 мг/мл; кривая 2) и их смеси к тех же концентрациях (кривая 3),

Рае. 18. Влияние а-кристаллипа нп самоассоцианичо РЬК. (0,3 мг/мл)-Зависимости интенсивности светорассеяния (/) (А) и гидродинамического радиуса $?[,) (Б) от времени для различных концентраций а-кристаллита* 0 (I), 0,3 мг/мй (2), 0,6 мг/м," [3; сплолшая кривая проведена в соответствий Хрййыеииа = Кь.[)ехр(А7'Я и 0.9 мг/мл (4).

(рис. I 8 А) и формирование ассоциатов меньших размеров (рис. 18Б). При больших концентрациях кристаллина происходит полное подавление

ассоциации и регистрируются только стартовые ассоциаты.

Важно подчеркнуть, что подавление ассоциации киназы фосфорилазы пролнном и «-кристаллИном сходно с защитным действием этих агентов при тепловой агрегации белков.

120000 —

80000

3. Исследование ассоциации киназы фосфорилазы в условиях^ близких к физиологическим (физиологические значения ионной силы, условия краудинга)

Изучение влияния ионной силы на ассоциацию РЬК, индуцируемую ионами Са2" и Ми2*, методом динамического светорассеяния показало, что при увеличении концентрации ШС1 происходило снижение прироста интенсивности светорассеяния (рис. 19), а в присутствии 0,1 М МаС1 интенсивность светорассеяния

остается неизменной во времени (прямая 4 на рис. 19). Однако в распределении частиц по размерам на рис. 20А обнаруживаются две формы (формы 1 и 2 соответственно), средние гидродинамические радиусы Шь) которых составляют 17 и 144 нм. Эти формы были обозначены как «основное» и « в (, 1С око ассоциированное» состояния. Поскольку величина для первой формы = 17 нм) близка к соответствующей величине, измеренной в отсутствие 1ЧаС1 (/?,, = (3 нм), эта форма была названа «основным состоянием». Для второй формы =

40000

О 10 20 30

I (мни)

Рис. 19. ¡(¡тс!ика самоассоциации РЬК (0,2 мг/мл) в Отсутствие (пунктир) и в присутствии различных концентраций ЫаС1; (1)5, (2) 10, (3) 15 и 100 мМ (4). Зависимости интенсивности светорассеяния от времени.

10П0

100 1000 Д,„ им

Рис. 20. Распределения частиц по размерам для Р1чК в присутствии 0,1 М КаО в отсутствие ТМАО (А) и спустя 1 (сплошная линия) и 12 (пунктирная линия) мин после добавления / М ТМАО (Б) 1,2 на обоих рисунках соответствуют основному и высокоассоциированному состояниям РЬК соответственно.

450000

-У ЗООООО

150000

i (Mïiïfj

Рис. 21. Кинетика самоассоциации PhK (0,2 м г/мл), индуцированная ионами Са~' и Mg2+ (0,1 M NaCl, 40 мМ Hepes-буфср, рП 6,8,0,1 мМ Са2"', 10 мМ M g2") 'Зависимости интенсивности светорассеяния от времени в отсутствие ТМЛО ( I) и в присутствии 1М ТМЛО (2).

144 нм) использовано обозначение «высокоассоциированное состояние». Профиль распределения частиц i го размерам для PhK в присутствии 0,1 M NaCl сохраняет свою форму во времени.

При изучении ассоциации PhK в присутствии 0.1 M NaCl и в условиях краудинга, создаваемого 1 M ТМАО, обнаруживается рост интенсивности светорассеяния (кривая 2 на рис. 21). Анализ распределения частиц по размерам для PhK в этих условиях показал, что в системе присутствуют только две формы фермента со средними значениями Rh, равными 31 и 155 нм (формы 1 и 2 на рис. 20Б), и что рост интенсивности светорассеяния связан исключительно с «перекачкой» PhK из основного состояния в высокоассоциированное. Таким

образом, ассоциация PhK в условиях краудинга и в присутствии 0,1 M NaCl существенно отличается от ассоциации фермента при низкой ионной силе.

Для проверки обратимости ассоциации РЬК были поставлены эксперименты с добавлением ЭГТА (1 мМ; рис. 22), специфически связывающего ионы Са2'. В присутствии ЭГТА наблюдается обратная перекачка PhK из в ысокоассоцииро ванного состояния » основное, что указывает на обратимость процесса ассоциации.

Для детальной характеристики «основного» состояния PhK был использован метод скоростной седиментации. При выбранной скорости вращения ротора (30000 об/мин) вы со ко ассоциированная форма PhK осаждается в первые минуты при ускорении ротора. Ссдиментационный анализ показал (рис. 23), что в 0,1 M NaCl как в отсутствие, так и в присутствии ТМАО главный пик на

Ш

600000

Рис 22 Влияние ЭГТА (1 мМ) на самоассоциацию РЬК в условиях молекулярного краудинга, создаваемого присутствием 1 М ТМАО (40 мМ Нерев, рН 6,8, содержащий 0,1 М №С1) (А) Зависимости интенсивности светорассеяния от времени в отсутствие ЭГТА (пунктирная кривая) и после добавления ЭГТА Стрелками обозначены моменты времени, при которых осуществлялось добавление ЭГТА (1) 5, (2) 12 и (3) 37 мин (Б) Распределение частиц по размерам для различных моментов времени 12 минут перед добавлением ЭГТА кривая) и после 78 минут с 1 мМ ЭГТА (пунктирная

инкубации (сплошная инкубации кривая)

1000

дифференциальном распределении с(5,*) с коэффициентом седиментации (.Уго.л) 22 Б соответствует гексадекамеру РЬК В присутствии 1 М ТМАО наряду с главным пиком наблюдаются дополнительные пики, соответствующие небольшим ассоциатам гексадекамера (2-6 молекул РЬК) Таким образом, «основное» состояние РЬК в условиях краудинга представлено гексадекамером и его небольшими ассоциатами

Для грубой оценки числа молекул,

0,16

0,12

0,08-

0,04-

0,00

100

20 w

Рис 23 Седиментационный анализ РЬК при скорости вращения ротора 30000 об/мин (0,1 М 1ЧаС1, 40 мМ Нерев, рН 6,8,

0,

мМ

Ca

10 мМ

Mg2+)

Дифференциальное распределение c{s, flf0) по коэффициентам седиментации с сохранением одномерной проекции c(s, *) для РЬК в условиях краудинга (1 М ТМАО)

входящих в состав «высокоассоциированного» состояния фермента, может быть использовано эмпирическое соотношение между молекулярной массой (А/г, кДа) и гидродинамическим радиусом (7?h = 155 нм) для белков и белковых олигомеров МГ=(1,68Д„)2 3398 Расчет показал, что высокоассоциированное состояние с (/?h = 155 нм) содержит приблизительно 340 молекул PhK

Физиологическая важность

«высокоассоциированных» состояний РЬК может состоять в образовании депонированной формы фермента, обеспечивающей увеличение времени жизни фермента в клетке

Методом динамического

светорассеяния было исследовано

40000

10 100 Л (нм)

1000

Рис 24. Влияние FAD на самоассоциацию PhK (0,2 мг/мл) в условиях молекулярного краудинга (А) Зависимости интенсивности светорассеяния от времени, в отсутствие (1) и в присутствии различных концентраций FAD 5 (2), 30 (3) и 60 (4) цМ (Б) Распределения частиц по их размерам, зарегистрированные при инкубации в течение 30 мин в отсутствие и в присутствии 60 цМ FAD (сплошная и пунктирная линии соответственно)

влияние FAD (физиологического лиганда, связывающегося с PhK) на ассоциацию киназы фосфорилазы в выбранных условиях Как видно из рис 24А, в присутствии FAD снижается прирост интенсивности светорассеяния Таким образом, был сделан вывод о том, что FAD подавляет ассоциацию PhK

Сравнение распределений частиц по размерам после инкубации фермента в течение 30 мин в отсутствие и в присутствии 60 цМ FAD (сплошная и пунктирные кривые соответственно на рис 24Б) показало, что подавление самоассоциации PhK основано на блокировании «перекачки» основной формы фермента в высокоассоциированную

Данные седиментационного анализа подтверждают вывод о подавлении самоассоциации PhK в присуствии FAD

выводы

1 На основании изучения кинетики тепловой агрегации гликогенфосфорилазы Ь из скелетных мышц кролика методом динамического светорассеяния сделан вывод о том, что начальной стадией процесса агрегации является стадия образования стартовых агрегатов, включающих денатурированные молекулы белка Подобраны условия, в которых на протяжении десятков минут в системе регистрируются только два типа частиц нативная форма фермента и стартовые агрегаты Следующей стадией процесса агрегации является стадия слипания стартовых агрегатов и агрегатов более высокого порядка Эта стадия протекает в кинетическом режиме, при котором скорость агрегации лимитируется диффузией взаимодействующих частиц (вероятность слипания сталкивающихся частиц равна единице)

2 Показано, что подавление тепловой агрегации гликогенфосфорилазы Ь в присутствии а-кристаллина (белка, обладающего шапероноподобной активностью) обусловлено переходом агрегации в кинетический режим, при котором вероятность слипания сталкивающихся частиц меньше единицы На основании изучения взаимодействия гликогенфосфорилазы Ь с огкристаллином при повышенных температурах методами дифференциальной сканирующей калориметрии и аналитического ультрацентрифугирования и данных по измерению ферментативной активности сделан вывод о том, что а-кристаллин взаимодействует с интермедиатами разворачивания гликогенфосфорилазы Ь

3 Изучение кинетики индуцированной ионами Са2+ и ассоциации киназы фосфорилазы из скелетных мышц кролика методом динамического светорассеяния при низких значениях ионной силы показало, что процесс ассоциации включает начальную стадию образования стартовых ассоциатов с гидродинамическим радиусом 82 нм и стадию слипания стартовых ассоциатов и ассоциатов более высокого порядка Стадия роста ассоциатов протекает в кинетическом режиме, при котором скорость ассоциации лимитируется диффузией взаимодействующих частиц Показано, что а-кристаллин и пролин (химический шаперон) препятствуют ассоциации киназы фосфорилазы

4 Полученные данные указывают на сходство механизмов обратимой ассоциации киназы фосфорилазы при низкой ионной силе и необратимой тепловой агрегации гликогенфосфорилазы Ь

5 При ионной силе, близкой к физиологическим значениям (0,1 М ЫаС1), киназа фосфорилазы представлена «основным» и «высокоассоциированным» состояниями, средние гидродинамические радиусы которых составляют 17 и 144 нм При добавлении 1 М природного осмолита - триметиламин-Ы-оксида-

регистрируется прирост интенсивности светорассеяния во времени, который связан с «перекачкой» фермента из основного состояния в высокоассоциированное Показано, что FAD (физиологический лиганд, связывающийся с киназой фосфорилазы) препятствует образованию высокоассоциированной формы фермента Согласно данным седиментационного анализа, основное состояние киназы фосфорилазы представлено гексадекамером (Мг = 1320 кДа) и небольшими его ассоциатами

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ, Программы поддержки

ведущих научных школ РФ, программы «Молекулярная и клеточная биология»

Президиума РАН, INTAS

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1 Chebotareva N А , Meremyanin A.V., Makeeva V F , Kurganov В I «Self-association of phosphorylase kinase under molecular crowding conditions» Progress in Colloid and Polymer Sciences, 2006, v 131, p 83-92

2 Меремьянин A.B., Еронина T Б , Чеботарева Н А , Клейменов С Ю , Юдин И К, Муранов К О , Островский М А, Курганов Б И «Влияние а-кристаллина на тепловую агрегацию гликогенфосфорилазы b из скелетных мышц кролика» Биохимия, 2007, т 2, № 5, с 642-654

3 Golub N V , Meremyanin A.V., Markossian К А , Eronina Т В , Chebotareva N S , Asryants R М , Muronets V К, Kurganov В I «Evidence for the formation of start aggregates as an initial stage of protein aggregation» FEBS Letters, 2007, v 581, p 4223-4227

4 Меремьянин A.B., Чеботарева H A, Макеева В Ф, Курганов Б И «Ассоциация киназы фосфорилазы из скелетных мышц кролика в условиях, имитирующих условия в клетке» Доклады Академии Наук, 2007, т 415, №4, с 1-3

Статьи в сборниках:

1 Markossian К А , Kurganov В I, Levitsky D I, Khanova, Н А , Chebotareva N А , Samoilov А М , Eronina Т В , Fedurkma N V , Mitskevich L G , Meremyanin A.V., Kleymenov S Yu , Makeeva V F , Muronetz V I, Naletova I N , Shalova, IN , Asryants R A , Schmalhausen E V , Saso L , Panyukov Yu V , Dobrov E N , Yudin I К, Timofeeva А С , Muranov К О , Ostrovsky M A Mechanism of chaperone-like activity «Protein Folding New Research» (Obalinsky, T R, Ed), Nova Science Publishers, Inc , New York, USA, 2006, p 89-171

2 Меремьянин А В., Курганов Б И «Подавление агрегации белков природными и искусственными шаперонами» Международная школа-конференция молодых ученых «Биотехнология будущего» 5-9 июня 2006 г, Санкт-Петербург Сборник статей ОАО «Авиаиздат», Москва, 2006, с 56-57

Тезисы докладов.

1 Меремьянин А.В. «Влияние молекулярного краудинга на ассоциацию киназы фосфорилазы» XII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» Тез докл Москва, с 147

2 Chebotareva N А , Meremyanin A.V., Makeeva V F , Andreeva I E , Livanova N В , Kurganov В I «Effect of molecular crowding on protein-protein and protein-substrate interactions» Nth International Symposium on Analytical Ultracentrifugation, 3-4 March 2005, Lausanne, Switzerland Abstract P 26

3 Меремьянин А.В., Б И Курганов «Изучение тепловой агрегации мышечной гликогенфосфорилазы b методом динамического светорассеяния» XVIIIзимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Тез докл 2006, с 43

4 Meremyanin A.V., Eronina Т В , Chebotareva N А , Kurganov В I «Thermal aggregation of muscle glycogen phosphorylase ft» The 15th International Symposium on Analytical Ultracentrifugation, London 2006 Abstract P 73

5 Chebotareva N A, Meremyanin A.V., Makeeva V F, Kurganov ВI «Sedimentation behaviour of muscle phosphorylase kinase» 15th International Symposium on Analytical Ultracentrifugation, London 2006 Abstract P 74

Список сокращений:

DLCA - diffusion-limited cluster-cluster aggregation, диффузионный режим агрегации, при котором вероятность слипания сталкивающихся частиц равна единице FAD - флавинадениндинуклеотид Phii - гликогенфосфорилаза Ъ PhK - киназа фосфорилазы

RLCA - reaction-limited cluster-cluster aggregation, режим агрегации, при котором вероятность слипания взаимодействующих частиц меньше единицы

ТМАО - триметиламин-Ы-оксид

ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия ЭГТА - этиленгликольтетраацетат ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

Подписано в печать 10 10 2007 Заказ № 139/10/07 Объем 1,0 п л Тираж 100

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ООО «Цифровичок» г Москва, Большой Чудов пер д 5 (495) 797-75-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Меремьянин, Алексей Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура и свойства гликогенфосфорилазы Ь.

1.2. Структура и свойства киназы фосфорилазы.

1.3. Агрегация белков.

1.4. а-Кристаллин: структура, свойства и шапероноподобная функция.

1.5. Молекулярный краудинг и осмолиты.

1.6. Постановка задачи.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Реактивы.

2.1.2. Выделение гликогенфосфорилазы Ь из скелетных мышц кролика.

2.1.3. Выделение киназы фосфорилазы из скелетных мышц кролика.

2.2. Методы.

2.2.1. Электрофоретический анализ в ПААГ.

2.2.2. Дифференциальная сканирующая калориметрия.

2.2.3. Измерение ферментативной активности.

2.2.4. Динамическое светорассеяние.

2.2.5. Изучение кинетики тепловой агрегации и ассоциации белков методом динамического светорассеяния.

2.2.6. Аналитическое ультрацентрифугирование.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Исследование тепловой агрегации гликогенфосфорилазы Ь.

3.1.1. Денатурация РкЬ.

3.1.2. Сопоставление процессов денатурации и агрегации РкЬ.

3.1.3. Изучение тепловой агрегации РкЬ при 48 °С.

3.1.4. Исследование тепловой агрегации РкЬ при 37 °С.

3.2. Влияние а-кристаллина на тепловую агрегацию РЬ£.

3.2.1. Влияние а-кристаллина на тепловую агрегацию РИЬ.

3.2.2. Влияние а-кристаллина на термоинактивацию и термостабильность РЬЪ.

3.3. Исследование самоассоциации киназы фосфорилазы.

3.3.1. Исследование самоассоциации РНК при низкой ионной силе.

3.3.2. Исследование ассоциации киназы фосфорилазы в условиях, близких к физиологическим (физиологические значения ионной силы, условия краудинга).

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ассоциация и агрегация ферментов гликогенолиза"

При неблагоприятных условиях (тепловой, осмотический и окислительный стрессы, продукты вирусных генов и др.), а также при неправильном фолдинге образуются структурно-нефункциональные белковые агрегаты, с генерацией которых связан целый ряд так называемых «конформационных болезней» (катаракта и различного рода нейродегенеративные заболевания). Существующие на данный момент механизмы агрегации не могут в полной мере объяснить процесс агрегации. Так, например, широко используемый механизм «nucleation-dependent aggregation» (механизм, включающий стадию образования ядер агрегации и стадию роста агрегатов путем присоединения денатурированных мономеров к образовавшемуся ядру) предполагает образование в конечном счете агрегатов предельных размеров, тогда как при тепловой агрегации, согласно экспериментальным данным, не происходит формирования агрегатов ограниченного размера. Поэтому остается актуальным установление механизма процесса агрегации.

На данный момент известно, что в организме существует целый ряд соединений, способных подавлять процесс агрегации. Одним из таких соединений является а-кристаллин - белок, обладающий шапероноподобной активностью [Horvitz; 1992]. Однако до сих пор до конца не ясно, как именно происходит процесс блокирования агрегации. Поэтому актуальным представляется установление механизма подавления агрегации белков.

Помимо агрегации есть и другие процессы, в ходе которых образуются крупные мультимерные белковые частицы, что приводит к снижению активности фермента. Одним из таких процессов является самоассоциация. Так, одним из удивительных свойств киназы фосфорилазы, ключевого фермента гликогенолиза, является процесс самоассоциации белка в присутствии ионов Са2+ и Mg2+, приводящий к снижению удельной ферментативной активности. Подобная способность киназы фосфорилазы к самоассоциации является неожиданной, так как именно эти ионы стимулируют ферментативный процесс. Достоверного механизма самоассоциации киназы фосфорилазы на данный момент не существует, поэтому его установление актуально.

Поскольку известно, что условия в живой клетке, содержащей высокие концентрации макромолекул (50-400 мг/мл; условия молекулярного краудинга), сильно отличаются от таковых для разбавленных растворов in vitro, представляется актуальным изучение процесса самоассоциации киназы в условиях, приближенных к физиологическим.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Меремьянин, Алексей Владимирович

выводы

1. На основании изучения кинетики тепловой агрегации гликогенфосфорилазы Ь из скелетных мышц кролика методом динамического светорассеяния сделан вывод о том, что начальной стадией процесса агрегации является стадия образования стартовых агрегатов, включающих денатурированные молекулы белка. Подобраны условия, в которых на протяжении десятков минут в системе регистрируются только два типа частиц: нативная форма фермента и стартовые агрегаты. Следующей стадией процесса агрегации является стадия слипания стартовых агрегатов и агрегатов более высокого порядка. Эта стадия протекает в кинетическом режиме, при котором скорость агрегации лимитируется диффузией взаимодействующих частиц (вероятность слипания сталкивающихся частиц равна единице).

2. Показано, что подавление тепловой агрегации гликогенфосфорилазы Ь в присутствии а-кристаллина (белка, обладающего шапероноподобной активностью) обусловлено переходом агрегации в кинетический режим, при котором вероятность слипания сталкивающихся частиц меньше единицы. На основании изучения взаимодействия гликогенфосфорилазы Ъ с а-кристаллином при повышенных температурах методами дифференциальной сканирующей калориметрии и аналитического ультрацентрифугирования и данных по измерению ферментативной активности сделан вывод о том, что а-кристаллин взаимодействует с интермедиатами разворачивания гликогенфосфорилазы Ъ.

3. Изучение кинетики индуцированной ионами Са2+ и ассоциации киназы фосфорилазы из скелетных мышц кролика методом динамического светорассеяния при низких значениях ионной силы показало, что процесс ассоциации включает начальную стадию образования стартовых ассоциатов с гидродинамическим радиусом 82 нм и стадию слипания стартовых ассоциатов и ассоциатов более высокого порядка. Стадия роста ассоциатов протекает в кинетическом режиме, при котором скорость ассоциации лимитируется диффузией взаимодействующих частиц. Показано, что а-кристаллин и пролин (химический шаперон) препятствуют ассоциации киназы фосфорилазы.

4. Полученные данные указывают на сходство механизмов обратимой ассоциации киназы фосфорилазы при низкой ионной силе и необратимой тепловой агрегации гликогенфосфорилазы Ъ.

5. При ионной силе, близкой к физиологическим значениям (0,1 М NaCl), киназа фосфорилазы представлена «основным» и «высокоассоциированным» состояниями, средние гидродинамические радиусы которых составляют 17 и 144 нм. При добавлении 1 М природного осмолита - триметиламин-М-оксида - регистрируется прирост интенсивности светорассеяния во времени, который связан с «перекачкой» фермента из основного состояния в высокоассоциированное. Показано, что FAD (физиологический лиганд, связывающийся с киназой фосфорилазы) препятствует образованию высокоассоциированной формы фермента. Согласно данным седиментационного анализа, основное состояние киназы фосфорилазы представлено гексадекамером (М{ = 1320 кДа) и небольшими его ассоциатами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Согласно полученным в диссертационной работе данным начальной стадией процесса необратимой тепловой агрегации белков является стадия образования стартовых агрегатов, включающих денатурированные молекулы белка. Подбор условий, при которых процесс агрегации протекает достаточно медленно, позволил на протяжении десятков минут регистрировать в системе только два типа частиц: нативную форму фермента и стартовые агрегаты. Согласно современным представлениям процесс сборки амилоидных фибрилл протекает через стадию образования протофибрилл [Mauro et al., 2007]. Очевидно, что протофибриллы эквивалентны стартовым агрегатам для процесса агрегации, в ходе которого происходит образование аморфных агрегатов. Таким образом существует сходство механизмов агрегации, приводящих к образованию аморфных агрегатов и амилоидных фибрилл.

При достаточно больших значениях времени зависимость гидродинамического радиуса белковых агрегатов от времени описывается степенной функцией, где показатель степени равен 1/<4 где df- фрактальная размерность, т.е. структурная характеристика агрегата, сформировавшегося в результате неупорядоченных взаимодействий. Найденное значение <4 которое составило 1,8, свидетельствует о том, что процесс агрегации протекает в диффузионном кинетическом режиме, т.е. в режиме, при котором скорость взаимодействия частиц лимитируется диффузией [Weitz et al., 1985; Weitz and Lin, 1986]. Для этого режима агрегации вероятность слипания сталкивающихся частиц равна единице.

В присутствии а-кристаллина зависимость гидродинамического радиуса от времени подчиняется экспоненциальному закону. Это свидетельствует о смене кинетического режима агрегации, в результате чего вероятность слипания сталкивающихся частиц становится меньше единицы (так называемый режим «reaction-limited cluster-cluster aggregation»). а-Кристаллин экранирует гидрофобные участки молекулы PhЪ. Это приводит к тому, что не каждое столкновение взаимодействующих частиц ведет к их слипанию.

Изучение кинетики обратимой самоассоциации киназы фосфорилазы при низких значениях ионной силы показало, что процесс ассоциации включает начальную стадию образования стартовых ассоциатов и стадию слипания стартовых ассоциатов и ассоциатов более высокого порядка. Стадия роста ассоциатов протекает в кинетическом режиме, при котором скорость ассоциации лимитируется диффузией взаимодействующих частиц. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о сходстве механизмов необратимой тепловой агрегации PhЪ и обратимой самоассоциации PhK. Более того, пролин и а-кристаллин, которые подавляют процесс агрегации, проявляют способность препятствовать обратимой самоассоциации PhK.

При ионной силе, близкой к физиологическим значениям, киназа фосфорилазы представлена «основным» и «высокоассоциированным» состояниями. При добавлении 1 М природного осмолита триметиламин-N-оксида (т.е. при моделировании условий молекулярного краудинга) обнаруживается «перекачка» фермента из основного состояния в высокоассоциированное. Наличие основных и высокоассоциированных форм PhK в присутствии 0,1 М NaCl можно рассматривать как кооперативную ассоциацию PhK. Термин «кооперативная ассоциация» впервые был предложен для случая ассоциации биологических макромолекул, приводящей к образованию высокоассоциированных форм без накопления значительных количеств интермедиатов [Winklmair, 1971, Engel and Winklmair, 1972]. Другими словами, в случае кооперативной ассоциации в системе присутствовуют только мономер и высокоассоциированная форма. Подобная ситуация была продемонстрирована экспериментально для гемэритрина [Keresztes-Nagy et al., 1965]. Ферментативные свойства ассоциирующих белковых систем типа мономер з=± N-мер и связывание данными системами специфических лигандов обсуждались в теоретических работах [Nichol et al., 1967, Thomes et al., 1980, Kurganov, 1982]. В рамках этих представлений ферментная система «основная форма PhK» «высокоассоциированная форма PhK» может рассматриваться как пример медленно ассоциирующих систем класса мономер = N-мер. Физиологическая важность «высокоассоциированных» состояний PhK в присутствии Са2+ и в условиях молекулярного краудинга может состоять в образовании депонированной формы фермента, обеспечивающей увеличение времени жизни фермента в клетке. Взаимопревращение между основной и высокоассоциированной формами PhK может находиться под контролем клеточных метаболитов. Один из таких метаболитов - FAD, который представляет особый интерес, т.к. белки, входящие в состав белок-гликогеновых частиц, обладают сродством к FAD. Это было показано для гликогенфосфорилазы [Sprang et al., 1982, Chebotareva et al., 2001], гликогенсинтазы [Sundukov and Solovyeva, 1989] и PhK. Это свидетельствует о том, что белок-гликогеновые частицы могут функционировать как депо флавинов. Принимая во внимание способность FAD препятствовать образованию PhK-гликогенового комплекса [Makeeva et al., 2006], можно предположить, что FAD регулирует локализацию и степень ассоциации PhK в мышечных клетках.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Меремьянин, Алексей Владимирович, Москва

1. Andreeva I.E., Makeeva V.F., Kurganov B.I., Chebotareva N.A., Livanova N.B. (1999) FEBSLett, 445,173-176.

2. Andreeva I.E., Rice N.A., Carlson G.M. (2002) The regulatory alpha subunit of phosphorylase kinase may directly participate in the binding of glycogen Phosphorylase. Biochemistry (Mose.) 67,1197-1202.

3. Augusteyn R.C., Koretz J.F., Schurtenberger P. (1989) The effect of phosphorylation on the structure of a-crystallin. Biochim. Biophys. Acta, 999, 293-299.

4. Augusteyn R.C., Stevens A. (1998) Macromolecular structure of the eye lens. Progr. ColloidPolym. Sei., 23, 375-413.

5. Barford D., Hu S.-H., Johnson L.N. (1991) Structural mechanism for glycogen phosphorylase control by phosphorylation and AMP. J. Mol. Biol., 218, 233-260.

6. Barford D., Johnson L.N. (1989) The allosteric transition of glycogen phosphorylase. Nature., 340, 609-616.

7. Barford D., Johnson L.N. (1992) The Molecular Mechanism for the Tetrameric Association of Glycogen Phosphorylase Promoted by Protein Phosphorylation. Protein Sei., 1, 472-493.

8. Baskakov I.V., Bolen D.W. (1998) Forcing thermodynamically unfolded proteins to fold. J. Biol. Chem., 273, 4831-4834.

9. Baskakov I.V., Bolen D.W. (1998) Time-dependent effects of trimethylamine-N-oxide/urea on lactate dehydrogenase activity: an unexplored dimension of the adaptation paradigm. Biophys. J., 74, 2658-2665.

10. Bettelheim F.A., Ansari R., Cheng Q.F., Zigler J.S., Jr. (1999) The mode of chaperoning of dithiothreitol-denatured alpha-lactalbumin by alpha-crystallin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 261, 292-297.

11. Bolen D.W., Baskakov I.V. (2001) The osmophobic effect: natural selection of a thermodynamic force in protein folding. J. Mol. Biol., 310, 955-963.

12. Bonifacino J.S., Suzuki C.K., Lippincott-Schwartz J., Weissman A.M., Klausner R.D. (1989) Pre-Golgi degradation of newly synthesized T-cell antigen receptor chains: intrinsic sensitivity and the role of subunit assembly. J. Cell Biol., 109, 73-83.

13. Bot G., Kovacs E., Gergely P. (1974) Partial phosphorylation of muscle phosphorylase. I. Formation of a hybrid phosphorylase in vitro. Biochim. Biophys. Acta, 370, 70-74.

14. Boyle D., Takemoto L. (1994) Characterization of the alpha-gamma and alpha-beta complex: evidence for an in vivo functional role of alpha-crystallin as a molecular chaperone. Exp. Eye Res., 58, 9-16.

15. Brown P.H., Schuck P. (2006) Macromolecular size-and-shape distributions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Biophys. J., 90, 4651-4661.

16. Bruschia R.J., Walsh D.A. (1999) Phosphorylase kinase: the complexity of its regulation is reflected in the complexity of its structure. Front, bioscl, 4, 618-641.

17. Buckig A., Tikkanen R., Herzog V., Schmitz A. (2002) Cytosolic and nuclear aggregation of the amyloid beta-peptide following its expression in the endoplasmic reticulum. Histochem. Cell Biol, 118, 353-360.

18. Bukau B., Horwich A.L. (1998) The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell, 92, 351-366.

19. Burg M.B., Peters E.M. (1997) Urea and methylamines have similar effects on aldose reductase activity. Am. J. Physiology, 273, F1048-1053.

20. Chan K.F., Graves D.J. (1982) Isolation and physicochemical properties of active complexes of rabbit muscle phosphorylase kinase. J. Biol. Chem., 257, 5939-5947.

21. Chebotareva N.A., Klinov S.V., Kurganov B.I. (2001) Regulation of muscle glycogen phosphorylase by physiological effectors. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 18, 265-297.

22. Chiti F., Stefani M., Taddei N., Ramponi G., Dobson C.M. (2003) Rationalization of the effects of mutations on peptide and protein aggregation rates. Nature, 424, 805-808.

23. Cohen F.E. (1999) Protein misfolding and prion diseases, J. Mol. Biol, 293, 313-320.

24. Cohen P. (1973) The subunit structure of rabbit skeletal muscle phosphorylase kinase, and the molecular basis of its activation reactions. Eur. J. Biochem., 34,1-14.

25. Cohen P., Burchell A., Foulkes J.G., Cohen P.T.W., Vanaman T.C., Nairn A.C. (1978) Differential interaction of rabbit skeletal muscle phosphorylase kinase isozymes with calmodulin. FEBSLett., 92, 287-293.

26. Cohen P., Duewer T., Fischer E. H. (1971) Phosphorylase from dogfish skeletal muscle. Purification and a comparison of its physical properties to those of rabbit muscle phosphorylase. Biochemistry, 10, 2683-2694.

27. Creighton T.E. (1993) Proteins. Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Co, New York).

28. Diamant S., Eliahu N., Rosenthal D., Goloubinoff P. (2001) Chemical chaperones regulate molecular chaperones in vitro and in cells under combined salt and heat stresses. J. Biol. Chem., 276, 39586-39591.

29. Dobson C., Karplus M. (1999) The fundamentals of protein folding: bringing together theory and experiment. Curr. Opin. Struct. Biol., 9,92-101.

30. Dobson C.M. (1999) Protein misfolding, evolution and disease. Trends Biochem. Sci., 24, 329-332.

31. Dobson C.M. (2004) Principles of protein folding, misfolding and aggregation. Semin. Cell Dev. Biol, 15, 3-16.

32. Ellis R.J. (2001) Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem. Sci., 26, 597-604.

33. Ellis R.J., Minton A.P. (2003) Cell biology: join the crowd. Nature, 425, 27-28.

34. Ellis R.J., van der Vies S.M. (1991) Molecular chaperones. Annu. Rev. Biochem., 60, 321-347.

35. Engel J., Winklmair D. (1972) Cooperative association. Protein-Protein Interactions (R. Jaenicke, E. Helmreich, Eds), Springer-Verlag, Berlin, pp. 159-181.

36. Feil I.K., Malfois M., Hendle J., van der Zandt H., Svergun D.I. (2001) A novel quaternary structure of the dimeric a-cry stall in domain with chaperone-like activity. J. Biol. Chem., 276,12024-12029.

37. Feil I.K., Malfois M., Hendle J., van der Zandt H., Svergun D.J. (2001) A novel quaternary structure of the dimeric alpha-crystallin domain with chaperone-like activity. J. Biol. Chem., 276, 12024-12029.

38. Feldmann K., Zeisel H., Helmreich E. (1972) Interactions between native and chemically modified subunits of matrix-bound glycogen phosphorylase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2278-2282.

39. Fink A.L. (1998) Protein aggregation: folding aggregates, inclusion bodies and amyloid. Folding Dis., 3, R9-R23.

40. Fink A.L. (1999) Chaperone-mediated protein folding. Physiol. Rev., 79, 425-449.

41. Fischer E. H., Graves D. J., Crittenden E. R. S., Krebs E. G. (1959) Structure of the site phosphorylated in the phosphorylase b to a reaction. J. Biol. Chem.,234,1698-1704.

42. Fischer E. H., Krebs E. G. (1962) Muscle phosphorylase b. Methods Enzymol., 5, 368-373.

43. Fischer E.H., Krebs E.G. (1958) The isolation and crystallization of rabbit skeletal muscle phosphorylase b. J. Biol. Chem., 231,65-71.

44. Follmer C., Pereira F.V., DaSilveria N.P. Carlini C.R. (2004) Jack bean urease (EC 3.5.1.5) aggregation monitored by dynamic and static light scattering. Biophys. Chem., Ill, 79-87. (

45. Frydman J. (2001) Folding of newly translated proteins in vivo: The role of molecular chaperones. Annu. Rev. Biochem., 70, 603-647.

46. Fulton A.B. (1982) How crowded is the cytoplasm? Cell, 30, 345-347.

47. Ganzhorn A.J., Plapp B.V. (1988) Carboxyl groups near the active site zinc contribute to catalysis in yeast alcohol dehydrogenase. J. Biol. Chem., 263, 5446-5454.

48. Georgopoulos C. (1992) The emergence of the chaperone machines. Trends. Biochem. Sci., 17, 295-299.

49. Gething M.-J., Sambrook J. (1992) Protein folding in the cell. Nature, 335, 33-45.

50. Giese K.C., Vierling E. (2002) Changes in oligomerization are essential for the chaperone activity of a small heat shock protein in vivo and in vitro. J. Biol. Chem., 277,46310-46318.

51. Graves D.J., Fischer E.H., Krebs E.G. (1960) Specifity studies on muscle phosphorylase phosphatase. J. Biol. Chem., 235, 805-809.

52. Groenen P.J., Merck K.B., de Jong W.W., Bloemendal H. (1994) Structure and modifications of the junior chaperone alpha-crystallin. From lens transparency to molecular pathology. Eur. J. Biochem., 225,1-19.

53. Grunewald K., Medalia O., Gross A., Steven A., Baumeister W. (2003) Prospects of electron cryotomography to visualize macromolecular complexes inside cellular compartments: implications of crowding. Biophys. Chem., 100, 577-591.

54. Haase-Pettingell C.A., King J. (1988) Formation of aggregates from a thermolabile in vivo folding intermediate in P22 tailspike maturation. A model for inclusion body formation. J. Biol. Chem., 263, 4977-4983.

55. Haley D.A., Horwitz J., Stewart P.L. (1998) The small heat-shock protein, alphaB-crystallin, has a variable quaternary structure. J. Mol. Biol, 277, 27-35.

56. Hall D., Minton A.P. (2003) Macromolecular crowding: qualitative and semiquantitative successes, quantitative challenges. Biochim. Biophys. Acta, 1649, 127-139.

57. Hartl F.U. (1996) Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature, 381, 571-579.

58. Hartl F.U., Hayer-Hartl M. (2002) Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein. Science, 295, 1852-1858.

59. Hatters D.M., Minton A.P., Howlett G.J. (2002) Macromolecular crowding accelerates amyloid formation by human apolipoprotein C-II. J. Biol. Chem., 277,7824-7830.

60. Hedrick J.L., Shaltiel Sh., Fischer E.H. (1966) On the role of pyridoxal 5'-phosphate in Phosphorylase. III. Physicochemical properties and reconstitution of apophosphorylase b. Biochemistry, 5, 2117-2125.

61. Hedrick J.L., Shaltiel Sh., Fischer E.H. (1966) On the role of pyridoxal 5'-phosphate in Phosphorylase. III. Physicochemical properties and reconstitution of apophosphorylase b. Biochemistry, 5, 2117-2125.

62. Hedrick J.L., Shaltiel Sh., Fischer E.H. (1969) Conformational changes and the mechanism of resolution of glycogen phosphorylase b. Biochemistry, 8,2422-2429.

63. Heilmeyer L.M.G. (1991) Molecular basis of signal integration in phosphorylase kinase. Biochem. Biophys. Acta, 1094, 148-174.

64. Hendrick J.P., Hartl F.U. (1993) Molecular chaperone functions of heatshock proteins. Annu. Rev. Biochem., 62, 349-384.

65. Hook D.W., Harding J.J. (1998) Protection of enzymes by alpha-crystallin acting as a molecular chaperone. Int. J. Biol. Macromol., 22, 295-306.

66. Horwich A. (2002) Protein aggregation in disease: a role for folding intermediates forming specific multimeric interactions. J. Clin. Invest., 110, 1221-1232.

67. Horwitz J. (1992a) a-Crystallin can function as a molecular chaperone. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10449-10453.

68. Horwitz J. (2003) Alpha-crystallin. Exp. Eye Res., 76,145-153.

69. Horwitz J., Emmons T., Takemoto L. (1992b) The ability of lens alpha crystallin to protect against heat-induced aggregation is age-dependent. Curr. Eye Res., 11, 817- 822.

70. Horwitz J., Huang Q., Ding L. (2004) The native oligomeric organization of alpha-crystallin, is it necessary for its chaperone function? Exp. Eye Res., 79,817-821.

71. Huang C.Y., Graves D.J. (1970) Correlation between subunit interactions and enzymatic activity of phosphorylase a. Method for determining equilibrium constants from initial rate measurements. Biochemistry, 9, 660-671.

72. Hurd S.S., Teller D., Fischer E.H. (1966) Probable formation of partially phosphorylated intermediates in the interconversions of phosphorylase A and B. Biochem. Biophys. Res. Commun., 24, 79-84.

73. Indicula-Thomas S., Balaji P.V. (2007) Correlation between the structural stability and aggregation propensity of proteins. Curr. Sci., 6, 758-767.

74. Ingolia T.D., Craig E.A. (1982) Drosophila gene related to the major heat shock-induced gene is transcribed at normal temperatures and not induced by heat shock. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 525-529.

75. Jaenicke R. (1991) Protein folding: local structures, domains, subunits, and assemblies. Biochemistry, 30, 3147-3161.

76. Jaenicke R. (1995) Folding and association versus misfolding and aggreation of proteins. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 348,97-105.

77. Jaenicke R. (1998) Protein self-organization in vitro and in vivo: partitioning between physical biochemistry and cell biology. Biol. Chem., 379, 237-243.

78. Johnson G.F., Tu J.I., Bartlett M.L.S., Graves D.J. (1970) Physical-chemical studies on the pyridoxal phosphate binding site in sodium borohydride-reduced and native phosphorylase. J. Biol. Chem., 245, 5560-5568.

79. Johnson L.N., Hajdu J., Acharya K.R., Stuart D.I., McLaughlin P.L, Barford D. (1989) Glycogen phosphorylase b. Allosteric Enzymes (Herve G., ed.) Boca Raton: CRC Press., 81-127.

80. Johnson L.N., Snape P., Martin J.L., Acharya K.R., Barford D., Oikonomakos N.G. (1993) Crystallographic binding studies on the allosteric inhibitor glucose-6-phosphate to T state glycogen phosphorylase b. J. Mol. Biol., 232,253-267

81. Johnston J.A., Dalton M.J., Gurney M.E., Kopito R.R. (2000) Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97,12571-12576.

82. Johnston J.A., Ward C.L., Kopito R.R. (1998) Aggresomes: a cellular response to misfolded proteins. J. Cell Biol, 143, 1883-1898.

83. Kane J.F., Hartley D.L. (1991) Properties of recombinant protein-containing inclusion bodies in Escherichia coli. Bioprocess Technol., 12, 121-145.

84. Karimata H., Nakano Sh.-I., Ohmichi T., Kawakami J., Sugimoto N. (2004) Stabilization of a DNA duplex under molecular crowding conditions of PEG. Oxford University Press, 48, 107-108.

85. Kastenschmidt L.L., Kastenschmidt J., Helmreich E. (1968) Subunit interactions and their relationship to the allosteric properties of rabbit skeletal muscle phosphorylase b. Biochemistry, 7, 3590-3607.

86. Kastenschmidt L.L., Kastenschmidt J., Helmreich E. (1968) Subunit interactions and their relationship to the allosteric properties of rabbit skeletal muscle phosphorylase b. Biochemistry, 7, 3590-3607.

87. Kastenschmidt L.L., Kastenschmidt J., Helmreich E. (1968) Subunit interactions and their relationship to the allosteric properties of rabbit skeletal muscle phosphorylase b. Biochemistry, 7, 3590-3607.

88. Kelley M.J., David L.L., Iwasaki N., Wright J., Shearer T.R. (1993) a-Crystallin chaperone activity is reduced by calpain II in vitro and in selenite cataract. J. Biol. Chem., 268,18844-18849.

89. Kelley W.L., Georgopoulos C. (1992) Chaperones and protein folding. Curr. Opin. Cell Biol, 4, 984-991.

90. Keresztes-Nagy S., Klapper M.H., Lazer L., Klotz I.M. (1965) Hybridization experiments: evidence of dissociation equilibrium in hemerythrin. Science, 150, 357-9.

91. Kilimann M.W., Zander N.F., Kuhn C.C., Crabb J.W., Meyer H.E., Heilmeyer L.M.G., Jr. (1988) Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 85, 9381-9385.

92. King M.M., Carlson G.M. (1981) Synergistic activation by Ca2+ and Mg2+ as the primary cause for hysteresis in the phosphorylase kinase reactions. J. Biol. Chem., 256,11058-11064

93. Klemenz R., Frohli E., Steiger R.H., Schifer R., Aoyama A. (1991) Alpha B-crystallin is a small heat shock protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 3652-3656.

94. Kodaka M. (2004) Interpretation of concentration-dependence in aggregation kinetics. Biophys. Chem., 109, 325-332.

95. Kodaka M. (2004) Requirements for generating sigmoidal time-course aggregation in nucleation-dependent polymerization model. Biophys. Chem., 107,243-253.

96. Kopito R.R. (2000) Aggresomes, inclusion bodies and protein aggregation. Trends Cell Biol., 10, 524-530.

97. Koretz J.F. (1999) Quaternary structural changes in native bovine a-crystallin aggregates with temperature. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 40, 214.

98. Koretz J.F., Augusteyn R.C. (1988) Electron microscopy of native and reconstituted alpha-crystallin aggregates. Curr. Eye Res., 7,25-30.

99. Kurganov B.I. (1982) Allosteric Enzymes. Kinetic Behaviour (John Wiley and Sons, Eds.) Chichester, p. 243.

100. Kurganov B.I., Kornilaev B.A., Chebotareva N.A., Malikov V.Ph., Orlov V.N., Lyubarev A.E., Livanova N.B. (2000) Dissociative mechanism ofthermal denaturation of rabbit skeletal muscle glycogen phosphorylase b. Biochemistry, 39,13144-13152.

101. Kurganov B.I., Lyubarev A.E., Sanchez-Ruiz J.M., Shnyrov V.L. (1997) Analysis of differential scanning calorimetry data for proteins. Criteria of validity of one-step mechanism of irreversible protein denaturation. Biophys. Chem., 69,125-35.

102. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

103. Lee G.J., Roseman A.M., Saibil H.R., Vierling E. (1997) A small heat shock protein stably binds heat-denatured model substrates and can maintain a substrate in a folding-competent state. EMBOJ., 16, 659-671.

104. Lee J.S., Samejima T., Liao J.H., Wu S.H, Chiou S.H. (1998) Physiological role of the association complexes of alpha-crystallin and its substrates on the chaperone activity. Biochem. Biophys. Res. Commun., 244, 379-383.

105. Lee J.S., Satoh T., Shinoda H., Samejima T., Wu S.H., Chiou S.H. (1997) Effect of heat-induced structural perturbation of secondary and tertiary structures on the chaperone activity of alpha-crystallin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 237, 277-282.

106. Lin M.Y., Linsday H.M., Weitz D.A, Ball R.C., Klein R., Meakin P. (1989) Universality of fractal aggregates as probed by light scattering. Proc. R. Soc. Lond. A., 423, 71-87.

107. Liu Y., Bolen D.W. (1995) The peptide backbone plays a dominant role in protein stabilization by naturally occurring osmolytes. Biochemistry, 34, 12884-12891.

108. Lyubarev A.E., Kurganov B.I. (1996) in: Organization of Biochemical Systems: Structural and Regulatory Aspects (Kurganov, B.I., Lyubarev, A.E., eds), Nova Science, N.Y., pp. 1-81.

109. Lyubarev A.E., Kurganov B.I. (2001) Study of irreversible thermal denaturation of proteins by differential scanning calorimetry. Recent Res. Devel. Biophys. Chem., 2, 141-165.

110. Lyubarev A.E., Kurganov B.I., Orlov V.N., Zhou H.M. (1999) Two-state irreversible thermal denaturation of muscle creatine kinase. Biophys. Chem., 79, 199-204.

111. MacRae T.H. (2000) Structure and function of small heat shock/alpha-crystallin proteins: established concepts and emerging ideas. Cell. Mol. Life Sci., 57,899-913.

112. Madsen N.B. (1956) The interaction of muscle phosphorylase with p-chloromercuribenzoate. II. A study by light scattering. J. Biol. Chem., 223, 1067-1074.

113. Madsen N.B. (1986) Glycogen phosphorylase. The Enzymes. (Boyer, P.D., Krebs, E.G., eds). New York: Academic Press., v. XVII, Ch. 19, p. 365-394.

114. Madsen N.B., Cori C.F. (1956) The interaction of muscle phosphorylase with p-chloromercuribenzoate. I. Inhibition of activity and effect on the molecular weight. J. Biol. Chem., 223,1055-1065.

115. Madsen N.B., Gurd F.R.N. (1956) The interaction of muscle phosphorylase with p-chloromercuribenzoate. III. The reversible dissociation of phosphorylase. J. Biol. Chem., 223,1075-1087.

116. Mahler H.C., Muller R., Friess W., Delille A., Matheus S. (2005) Induction and analysis of aggregates in a liquid IgGl-antibody formulation. Eur. J. Pharm. Biopharm., 59, 407-417.

117. Maiti M., Kono M., Chakrabarti B. (1988) Heat-induced changes in the conformation of alpha- and beta-crystallins: unique thermal stability of alpha-crystallin. FEBSLett., 236, 109-114.

118. Makeeva V.F., Chebotareva N.A., Andreeva I.E., Livanova N.B., Kurganov B.I. (2006) Interaction of phosphorylase kinase from rabbit skeletal muscle with flavin adenin dinucleotide. Biochemistry (Moscow), 71, 808-814.

119. Mandai K., Dillon J., Gaillard E.R. (2000) Heat and concentration effects on the small heat shock protein, a-crystallin. Photochem. Photobiol., 71, 470-475.

120. Mashino T., Fridovich I. (1987) Effects of urea and trimethylamine-N-oxide on enzyme activity and stability. Arch. Biochem. Biophys., 258, 356-360.

121. Mauro M., Craparo E.F., Podesta A., Bui one D., Carrotta R., Martorana V., Tiana G., San Biagio P.L. (2007) Kinetics of different processes in human insulin amyloid formation. J. Mol. Biol., 366, 258-274.

122. Mayer M.P., Bukau B. (2005) Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell Mol. Life Sci., 62, 670-684.

123. McLaurin J., Yang D., Yip C.M., Fraser P.E. (2000) Review: modulating factors in amyloid-beta fibril formation. J. Struct. Biol, 130, 259-270.

124. Meng F.-G., Park Y.-D., Zhou H.-M. (2001) Role of proline, glycerol, and heparin as protein folding aids during refolding of rabbit muscle creatine kinase. Int. J. Biochem. Cell Biol, 33, 701-709.

125. Merck K.B., Groenen P.J., Voorter E., de Haard-Hoekman W.A., Horwitz J., Bloemendal H., de Jong W.W. (1993) Structural and functional similarities of bovine a-crystallin and mouse small heat shock protein. J. Biol Chem.,268,1046-1052.

126. Merlini G., Bellotti V., Andreola A., Palladini G., Obici L., Casarini S., Perfetti V. (2001) Protein aggregation. Clin. Chem. Lab. Med., 39, 10651075.

127. Meyer E., Heilmeyer L.M.G, Hashke R.H., Fisher E.H. (1970) Control of phosphorylase activity in a muscle glycogen particle. I. Isolation and characterization of the protein-glycogen complex. J. Biol. Chem., 245, 6642-6648.

128. Militello V., Casarino C., Emanuele A., Giostra A., Pullara F., Leone M. (2004) Aggregation kinetics of bovine serum albumin studied by FTIR spectroscopy and light scattering. Biophys. Chem., 107, 175-187.

129. Minton A.P. (2001) The influence of macromolecular crowding and macromolecular confinement on biochemical reactions in physiological media. J. Biol. Chem. 276, 10577-10580.

130. Morange M., Buc H. (1979) The interplay between covalent and non-covalent regulation of glycogen phosphorylase. The role of different effectors of phosphorylase b on the phosphorylase b to a conversion rate. Biochimie, 61, 633-643.

131. Murugan R. (2003) Competitive model on denaturant-mediated protein unfolding. Biophys. J., 84, 770-774.

132. Myers J.K., Oas T.G. (2002) Mechanism of fast protein folding. Annu. Rev. Biochem., 71,783-815.

133. Nadeau O.W., Traxler K.W., Fee L.R., Baldwin B.A., Carlson G.M. (1999) Activators of phosphorylase kinase alter the cross-linking of its catalytic subunit to the C-terminal one-sixth of its regulatory alpha subunit. Biochemistry, 38, 2551-2559.

134. Nichol L.W., Jackson W.J., Winzor D.J. (1967) A theoretical study of the binding of small molecules to a polymerizing protein system. A model for allosteric effects. Biochemistry, 6, 2449-2456.

135. Oikonomakos N.G., Stamnaki V.T., Tsitsanou K.E., Gavalas N.G., Johnson L.N. (2000) A new allosteric site in glycogen phosphorylase b as a target for drug interactions. Struct. Fold. Des., 8, 575- 584.

136. Oosawa F., Kasai M. (1962) A theory of linear and helical aggregations of macromolecules. J. Mol. Biol., 4, 10-21.

137. Ostrovsky M.A., Sergeev Y.V., Atkinson D.B., Soustov L.V., Hejtmancik J.F. (2002) Comparison of ultraviolet induced photo-kinetics for lens-derived and recombinant beta-crystallins. Mol. Vis., 8, 72-78.

138. Perutz M.F. (1997) Amyloid fibrils mutations make enzyme polymerize. Nature, 385, 773-775.

139. Perutz M.F. (1999) Glutamine repeats and neurodegenerative diseases: molecular aspects. Trends Biochem. Sci., 4, 8-63.

140. Pickett-Gies C.R., Walsh D.A. (1986) Phosphorylase kinase. The Enzymes (Boyer, P.D., and Krebs, E.G., eds), Vol. 17, Academic Press, Orlando, pp. 396-461.

141. Plaxco K.W., Dobson C.M. (1996) Time-resolved biophysical methods in the study of protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol., 6, 630-636.

142. Priddy T.S., Macdonald B.A., Heller W.T., Nadeau O.W., Trewhella T., Carlson G.M. (2005) Ca -induced structural changes in phosphorylase kinase detected by small-angle X-ray scattering. Protein Sci., 14,1039-1048.

143. Prusiner S.B. (1998) Prions. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 95,13363-13383.

144. Prusiner S.B., Hsiao K.K. (1994) Human prion diseases. Ann. Neurol., 35, 385-395.

145. Radford S.E. (2000) Protein folding: progress made and promises ahead. Trends Biochem. Sci., 25, 611-618.

146. Raman B., Rao C.M. (1997) Chaperone-like activity and temperature-induced structural changes of alpha-crystallin, J. Biol Chem., 272, 23559-23564.

147. Rao C.M, Raman B., Ramakrishna T., Rajaraman K., Ghosh D., Datta S., Trivedi V.D., Sukhaswami M.B. (1998) Structural perturbation of a-crystallin and its chaperone-like activity. Int. J Biol. Macromol., 22,271-281.

148. Rao P.V., Horwitz J., Zigler J.S. (1993) Alpha-crystallin, a molecular chaperone, forms a stable complex with carbonic anhydrase upon heat denaturation. Biochem. Biophys. Res. Commun., 190, 786-793.

149. Rao P.V., Huang Q.L., Horwitz J., Zigler J.S., Jr. (1995) Evidence that alpha-crystallin prevents non-specific protein aggregation in the intact eye lens. Biochim. Biophys. Acta, 1245, 439-447.

150. Ratnaparkhi, G.S., Varadarajan, R. (2001) Osmolytes stabilize ribonuclease S by stabilizing its fragments S protein and S peptide to compact folding-competent states. J. Biol. Chem., 276,28789-28798.

151. Ren G., Lin Z., Tsou C. L., Wang C.C. (2003) Effects of macromolecular crowding on the unfolding and the refolding of D-glyceraldehyde-3-phosophospate dehydrogenase. J. Protein Chem., 22,431^139.

152. Rousseau F., Schymkowitz J., Serrano L. (2006) Protein aggregation and amyloidosis: confusion of the kinds? Curr. Opin. Struct. Biol., 16,118-126.

153. Samuel D., Kumar T.K., Ganesh G., Jayaraman G., Yang P.-W., Chang M.-M., Trivedi V.D., Wang S.-L., Hwang K.-C., Chang D.-K., Yu C. (2000) Proline inhibits aggregation during protein refolding. Protein ScL, 9, 344-352.

154. Samuel D., Kumar T.K., Jayaraman G., Yang P.W., Yu C. (1997) \/ Biochem. Mol. Biol. Int., 41,235-242.

155. Sanchez-Ruiz J.M. (1992) Theoretical analysis of Lumry-Eyring models in differential scanning calorimetry. Biophys. J., 61, 921-935.

156. Santhoshkumar P., Sharma K.K. (2001) Analysis of a-crystallin chaperone function using restriction enzymes and citrate synthase. Mol Vis., 7, 172-177.

157. Santhoshkumar P., Sharma K.K. (2002) Identification of a region in alcohol dehydrogenase that binds to alpha-crystallin during chaperone action. Biochim. Biophys. Acta, 1598,115-121.

158. Schuler J., Frank J., Saenger W., Georgalis Y. (1999) Thermally induced aggregation of human transferrin receptor studied by light-scattering techniques. Biophys J., 77,1117-1125.

159. Seery V.L., Fischer E.H., Teller D.C. (1970) Subunit structure of glycogen phosphorylase. Biochemistry, 18, 3591-3598

160. Siezen R.J., Bindels J.G., Hoenders H.J. (1979) The interrelationship between monomeric, oligomeric and polymeric alpha-crystallin in the calf lens nucleus. Exp. Eye Res., 28, 551-567.

161. Silow M., Tan Y.-J., Fersht A.R., Oliveberg M. (1999) Formation of shortlived protein aggregates directly from the coil in two-state folding. Biochemistry, 38, 13006-13012.

162. Skuster J.R., Chan K.F., Graves D.J. (1980) Isolation and properties of the catalytically active gamma subunit of phosphorylase b kinase. J. Biol. Chem., 255, 2203-2210.

163. Smith D.F., Whitesell L., Katsanis E. (1998) Molecular chaperones: biology and prospects for pharmacological intervention. Pharmacol Rev., 50,493-514.

164. Soti C., Pal C., Papp B., Csermely P. (2005) Molecular chaperones as regulatory elements of cellular networks. Curr. Opin. Cell Biol., 17,210-215.

165. Speed M.A., King J., Wang D.J. (1997) Polymerization mechanism of polypeptide chain aggregation. Biotechnol. Bioeng., 54, 333-343.

166. Speed M.A., Wang D.I., King J. (1996) Specific aggregation of partially folded polypeptide chains: the molecular basis of inclusion body composition. Nat. Biotechnol., 14, 1283-1287.

167. Sprang S., Fletterick R., Stern M., Yang D., Madsen N., Sturtevant J. (1982) Analysis of an allosteric binding site: the nucleoside inhibitor site of phosphorylase. Biochemistry, 21,2036-2048.

168. Srinivas V., Datta S., Ramakrishna A.T., Rao Ch.M. (2001) Studies on the a-crystallin target protein binding sites: sequential binding with two target proteins. Mol. Vis., 7,114-119.

169. Stromer T., Ehrnsperger M., Gaestel M., Buchner J. (2003) Analysis of the interaction of small heat shock proteins with unfolding proteins. J. Biol Chem.,278,18015-18021.

170. Sugrobova N.P., Lisovskaya N.P., Kurganov B.I. (1983) Turbidimetric method for determination of glycogen phosphoiylase activity and its use for estimation of equilibrium position of enzymatic reaction. J. of Biochem. and Biophys. Methods, 8, 299-306.

171. Sun Y., MacRae T.H. (2005) The small heat shock proteins and their role in human disease. FEBS J. 272, 2613-2627.

172. Sundukov S.Yu., Solovyeva G.A. (1989) Interaction of glycogen synthase of rabbit skeletal muscles with flavin mononucleotide. Biokhimiia, 54, 1478-1484.

173. Surewicz W.K., Olesen P.R. (1995) On the thermal stability of alpha-crystallin: a new insight from infrared spectroscopy. Biochemistry, 34, 9655-9660.

174. Thomes J.C., Archambault De Vençay J., Julien R. (1980) New relations for activity analysis of associating enzymes. Biochem. J., 185, 339-47.

175. Thomson J.A., Augusteyn R.C. (1983) a-Crystallin: the native form of the protein? Exp. Eye Res., 37, 367-377.

176. Thomson J.A., Augusteyn R.C. (1988) On the structure of alpha-crystallin: The minimum molecular weight. Curr. Eye Res., 7, 563-569.

177. Thomson J.A., Augusteyn R.C. (1989) On the structure of a-crystallin: construction of hybrid molecules and homopolymers. Biochim. Biophys. Acta, 994, 246-252.

178. Titani K., Koide A., Hermann J., Ericsson L. H., Kumar S., Wade R. D., Walsh K. A., Neurath H., Fischer E. H. (1977) Complete amino acid sequence of rabbit muscle glycogen phosphorylase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 4762-4766.

179. Treweek T.M., Morris A.M., Carver J.A. (2003) Intracellular protein unfolding and aggregation: the role of small heat-shock chaperone proteins. Aust. J. Chem., 56, 357-367.

180. Crystal structure and assembly of a eukaryotic small heatshock protein. Nature Struct. Biol., 8, 1025-1030.

181. Vanhoudt J., Abgar S., Aerts T., Clauwaert J. (2000b) A small-angle X-ray solution scattering study of bovine a-crystallin. Eur. J. Biochem., 267, 3848-3858.

182. Vanhoudt J., Aerts S., Abgar T., Clauwaert J. (2000a) Native quaternary structure of bovine alpha-crystallin. Biochemistry, 39, 4483-4492.

183. Vanhoudt J., Aerts T., Abgar S., Clauwaert J. (1997) Quaternary structure and interaction parameters of bovine a-crystallin: influence of isolation conditions. Progr. ColloidPolym. Sci., 107, 88-93.

184. Venien-Bryan C., Lowe E.M., Boisset N., Traxler K.W., Johnson L.N., Carlson G.M. (2002) Three-dimensional structure of phosphorylase kinase at 22 A resolution and its complex with glycogen phosphorylase b. Structure, 10, 33-41

185. Verkman A. (2002) Solute and macromolecule diffusion in cellular aqueous compartments. Trends Biochem. Sci., 27,27-33.

186. Vidair C.A., Huang R.N., Doxsey S.J. (1996) Heat shock causes protein aggregation and reduced protein solubility at the centrosome and other cytoplasmic locations. Int J. Hyperthermia, 12, 681-695.

187. Wang K., Spector A. (1994) The chaperone activity of bovine a-ciystallin. Interaction with other lens crystallins in native and denatured states. J. Biol. Chem., 269, 13601-13608.

188. Weitz D.A., Huang J.S., Lin M.Y., Sung J. (1985) Limits of the fractal dimension for irreversible kinetic aggregation of gold colloids. Phys. Rev. Lett, 54,1416-1419.

189. Weitz D.A., Lin M.Y. (1986) Dynamic scaling of cluster-mass distributions in kinetic colloid aggregation. Phys. Rev. Lett., 57,2037-2040.

190. Wetzel R. (1994) Mutations and off-pathway aggregation of proteins. Trends Biotechnol, 12, 193-198.

191. Wickner S., Maurizi M.R., Gottesman S. (1999) Posttranslational quality control: folding, refolding, and degrading proteins. Science, 286, 1888-1893.

192. Wiertz E.J., Tortorella D., Bogyo M., Yu J., Mothes W., Jones T.R., Rapoport T.A., Ploegh H.L (1996) Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction. Nature, 384, 432-438.

193. Wilkinson D.A., Fitzgerald T.J., Marion T.N., Carlson G.M. (1999) Mg2+ induces conformational changes in the catalytic subunit of phosphorylase kinase, whether by itself or as part of the holoenzyme complex. J. Prot. Chem., 18, 157-164.

194. Winklmair D. (1971) A simple approach to the theory of cooperative aggregation of biological macromolecules. Arch. Biochem. Biophys., 147, 509-14.

195. Wood J.D., Beaujeux T.P., Shaw P.J. (2003) Protein aggregation in motor neurone disorders. Neuropathol. Appl. Neurobiol., 29, 529-545.

196. Yancey P.H., Siebenaller J.F. (1999) Trimethylamine oxide stabilizes teleost and mammalian lactate dehydrogenases against inactivation by hydrostatic pressure and trypsinolysis. J. Exp. Biol., 202, 3597-3603.

197. Yang D.-Sh., Yip C.M., Huang T.H.J., Chakrabartty A., Fraser P.E. (1999) Manipulating the amyloid-p aggregation pathway with chemical chaperones. J. Biol. Chem., 274, 32970-32974.

198. Young J.C., Hartl F.U. (2002) Chaperones and transcriptional regulation by nuclear receptors. Nature Struct. Biol., 9, 640-642.

199. Yudin I.K., Nikolaenko G.L., Gorodetskii E.E., Markhashov E.L., Agayan V.A., Anisimov M.A., Sengers J.V. (1998) Crossover kinetics of asphaltene aggregation in hydrocarbon solutions. PhysicaA., 251,235-244.

200. Yudin I.K., Nikolaenko G.L., Kosov V.I., Agayan V.A., Anisimov M.A., Sengers J.V. (1997) Simple photon-correlation spectrometer for research and education. Int. J. Thermophys., 18,1237-1248.

201. Zander, N.F., Meyer H.E., Hoffmann-Posorske E., Crabb J.W., Heilmeyer L.M.G., Kilimann M.W. (1988) cDNA cloning and complete primary structure of skeletal muscle phosphorylase kinase (alpha subunit). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2929-2933.

202. Zimmerman S.B., Minton A.P. (1993) Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 22, 27-65.

203. Zimmerman S.B., Trach S.O. (1991) Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J. Mol. Biol., 222, 599-620.

204. Zou Q., Bennion B.J., Daggett V., Murphy K.P. (2002) The molecular mechanism of stabilization of proteins by TMAO and its ability to counteract the effects of urea. J. Am. Chem. Soc., 124, 1192-1202.

205. Земскова M.A., Шур C.A., Сколышева JT.K., Вульфсон П.Л. (1989) Регуляция активности киназы фосфорилазы из скелетных мышц кролика гликогеном. Биохимия, 54, 662-668.

206. Клюева А.В., Левчук Ю.Н., Набока Ю.Н. (2002) Фотонкореляционная спектроскопия белков. Укр. биохим. журн., 74, 12-26.

207. Кривандин А.В., Муратов К.О., Островский М.А. (2004а) Рентгеновское малоугловое исследование комплексообразования врастворах ос- и ßb-кристаллинов при нагревании. Докл. Акад. Наук, 394, \-4.

208. Кривандин A.B., Муранов К.О., Островский М.А. (2004b) Исследование комплексообразования в растворах а- и ßb-кристал-линов при 60 °С. Мол. биол., 38, 1-15.

209. Курганов Б.И. (1998) Кинетика тепловой агрегации белков. Биохимия, 63, 430-432.

210. Курганов Б.И. (2002) Оценка активности молекулярных шаперонов в тест-системах, основанных на подавлении агрегации белков. Успехи биол. химии, 42, 89-138.

211. Курганов Б.И., Рафикова Э.Р., Добров Е.Н (2002) Кинетика тепловой агрегации белка оболочки вируса табачной мазаики. Биохимия, 67, 631-640.

212. Кутышенко В.П., Прохоров Д.А. (2003) Разворачивание молтен-глобулы карбоангидразы под воздействием гуанидингидрохлорида. Мол. биол., 37,1055-1060.

213. Маркосян К.А., Курганов Б.И. (2004) Фолдинг, неправильный фолдинг и агрегация белков. Образование телец включения и агресом. Биохимия, 69,1196-1212.

214. Полторак О.М., Чухрай Е.С., Торшин И.Ю. (1998) Диссоциативная термоинактивация, стабильность и активность олигомерных ферментов (обзор). Биохимия, 63, 360-369.

215. Силонова Г. В., Курганов Б. И. (1970) Изучение ассоциации фосфорилазы b из скелетных мышц кролика кинетическим методом. Молекулярная биология, 4, 445-459.

216. Чеботарева H.A. (2007) Влияние молекулярного краудинга на ферменты гликогенолиза. Успехи биол. химии, 47, 233-258. Чеботарева H.A., Курганов Б.И., Ливанова Н.Б. (2004) Биохимические эффекты молекулярного краудинга. Биохимия, 69,1239-1251.