Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активность ферментов гликолиза в клетках и тканях при замораживании-отогреве

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Андриенко, Алла Николаевна

Введение.

Обзор литературы

1, Роль цитоплазматических ферментов в углеводно-фосфорном обмене.

2. Действие низких температур на ферменты в составе клеток и тканей • ••.••••

Экспериментальная часть

3, Материалы и методы

4. Криочувствительность ферментов гликолиза в составе тканевых препаратов и клеток при замораживании-отогреве.

5. Элиминация ферментных белков в экзоцел-люлярнуго среду как показатель скрытых "латентных" повреждений клеток при замораживании-отогреве

5.1. Значение клеток, сохранившихся после замораживания-отогрева, как источника внеклеточных ферментов

5.2. Гликолитическая активность гепатоцитов после замораживания-отогрева.

5.3. Активность гликолитических ферментов в экзоцеллюлярной среде костного мозга в условиях криоконсервации б. Влияние криопротекторов на элиминацию ферментов при замораживании-отогреве тканей и клеток

Введение Диссертация по биологии, на тему "Активность ферментов гликолиза в клетках и тканях при замораживании-отогреве"

В настоящее время низкие температуры широко используются для сохранения клеток, органов и тканей в длительно жизнеспособном состоянии, что и обуславливает важное значение экспериментальных исследований по изучению механизма изменений, возникающих на молекулярном, субклеточном и клеточном уровнях в результате низкотемпературного воздействия. Первые шаги в криоконсервации биологического « материала подтверждают оптимистические прогнозы применения этого метода для хранения и последующей трансплантации жизненноважных органов человека.

Однако, как известно Е44.7, прямой путь криоконсервации приводит к нежелательным явлениям, вызванным повреждениями биологического материала. Согласно современным представлениям, повреж-. дающее действие низких температур на клетки и ткани обусловлено влиянием многочисленных факторов, возникающих при замораживании, на морфологическую и функциональную организацию живых систем С 64, 159, 2047. Большинство исследований, выполненных как на животных, так и растительных клетках, свидетельствуют, что точка приложения повреждающих факторов локализуется на уровне белковых молекул и щт. тиэнзимных комплексов, связанных с различными мембранными образованиями.

Причем, степень повреждения ферментных белков, как показано Z357, зависит от исходной молекулярной структуры фермента, а также его физико-химического микроокружения в составе клетки или модельной системы. В настоящее время известно, что из многих ферментов наиболее чувствительными к действию низких температур в составе бесклеточной системы оказываются энзимы, имеющие олигомер-ную четвертичную структуру ZT 92 7. Установлено также ^74,26,31,1837, что ферменты и ферментные комплексы, ассоциированные с различными мембранными системами, также изменяют свои каталитические свойства как следствие первичных изменений липопротеидной структуры мембраны после замораживания изолированных клеточных органелл.

В то же время, вопрос о поведении ферментных белков в составе различных биологических объектов остается окончательно не выяснен. По мнению ряда авторов ZTI25J7, энзимы, находящиеся в составе клеток и тканей,являются более стабильными к низкотемпературному воздействию по сравнению с такими же белками в составе бесклеточной системы, что объясняется наличием в клетке ряда метаболических веществ, субстратов, кофакторов. С другой стороны, имеются данные о том, что замораживание-отогрев клеток и тканей в ряде случаев может приводить к изменению структурно-функционального состояния ферментов £9Ъ J. Показано также 214.7, что достаточным условием для появления во внеклеточной среде многих ферментов является не только нарушение мембранной проницаемости, но и снижение энергетического потенциала клетки, контролирующего проницаемость плазматической мембраны для каталитических белков. Как, например, нарушение процессов окислительного фосфорилирования, то есть понижение или блокада продукции энергии, является первопричиной изменения селективной проницаемости клеточных мембран Z~567. При низкотемпературном консервировании различных клеток и тканей было обнаружено угнетение гликолиза ZT37J, снижение уровня гликогена Z~114 J7, уменьшение внутриклеточного содержания Фн, АТФ, АШ Z~33I7, что явно свидетельствует о значительном нарушении энергетических процессов в клетках в результате замораживания.

Существенный интерес представляет изучение активности ряда ферментов основных цепных и циклических процессов метаболизма, определяющих энергетический потенциал клетки - гликолиз, цикл трикар-боновых кислот, пентозофоефатный шунт. Состояние отдельных ферментативных звеньев в конечном счете определяет интегральный уровень энергообеспечения клеток и тканей, что имеет решающее значение для поддержания биологических систем в жизнеспособном и функционально-полноценном состоянии. Особый интерес в этом плане представляют ферменты углеводно-фосфорного обмена, так как они обеспечивают основные каталитические превращения углеводных субстратов на путях их энергетического использования как в физиологических, так и, в особенности, при действии на клетку экстремальных факторов.

Литературные данные по действию низких температур на активность цитоплазматических ферментов малочисленны и носят зачастую прямо противоположный характер. В некоторых случаях наблюдалось снижение активности цитоплазматических ферментов при замораживании-отогреве биологического материала ZTI07J7. Исследованиями других авторов /7I04J7 показана активация ферментов углеводно-фосфорного обмена после низкотемпературной консервации биологических объектов. Различное поведение ферментов при действии низких температур обнаружили £98 J при исследовании энзиматической активности в ткани печени, почек, сердца, скелетной мышцы и мозга крыс. Такая противоречивость экспериментальных данных свидетельствует о недостаточной изученности поведения ферментов обменных процессов при действии низких температур.

В настоящее время с целью предохранения биологического материала от повреждающего действия низких температур ведутся интенсивные исследования по изучению механизма защитного действия крио-протекторов. Основным критерием оценки криопротекторных свойств того или иного вещества является жизнеспособность клеток после отогрева, которая во многом зависит от сохранения механизмов аккумуляции и трансформации энергии в клетке, в частности, механизма гликолитического фосфорилирования. Работ по изучению влияния крио-протекторов на активность цитоплазматических ферментов при криоконсервации биологического материала крайне мало.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилось исследование криоустойчивости и клеточных механизмов нарушения активности ключевых ферментов углеводно-фосфорного обмена в условиях замораживания-отогрева различных тканевых препаратов и клеточных суспензий.

Выполнение поставленной цели требовало решения следующих конкретных задач:

1. Изучить криочувствительность ферментов гликолиза и пенто-зо-фосфатного шунта (гексокиназы, фосфофруктокиназы, лактатдегид-рогеназы, фосфорилазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, 6-фосфоглю-конатдегидрогеназы) в составе тканевых и клеточных препаратов при различных режимах замораживания-отогрева.

2. Оценить значение элиминации ферментных белков в экзоцеллю-лярную среду как показателя повреждений клеток при замораживании-отогреве, выяснив при этом: а. Роль популяции клеток, сохранившихся после замораживания-отогрева, как источника внеклеточных ферментных белков. б. Характер и причины изменения интенсивности гликолиза в клетках при замораживании-отогреве. в. Возможность применения ферментных тестов для диагностики полноценности трансплантационного материала в практике криоконеер-вации.

3. Исследовать влияние некоторых криопротекторов на потерю ферментных белков клетками при замораживании-отогреве.

Выбор указанных ферментов углеводно-фосфорного обмена для решения поставленных задач основывался на общих теоретических пред посылках. Известно, что ферменты, активность которых изучалась в работе, занимают узловую позицию на перекрестках основных метаболических путей или катализируют начальные реакции обменных процессов, выполняя функцию "ключевых" и, одновременно, функцию алло-стерических регуляторов отдельных участков метаболизма клетки.

В результате проведенных исследований различных тканевых и клеточных препаратов впервые выявлена криоустойчивость "ключевых" ферментов углеводно-фосфорного обмена при замораживании-оттаивании. Получены экспериментальные доказательства того, что источником внеклеточных ферментных белков при замораживании биологического материала являются разрушенные клетки, а также популяция сохранившихся клеток со скрытыми "латентными" повреждениями.

Впервые изучены процессы гликолитического расщепления углеводов в криоконсервированных гепатоцитах и показано, что потеря клеткой в процессе замораживания-отогрева "ключевых" гликолитичес-ких ферментов является одной из основных причин снижения интегральной скорости клеточного гликолиза.

На примере клеток костного мозга человека показано, что определение внеклеточной активности ферментов является достаточно чувствительным биохимическим показателем полноценности биологического материала.

Получены новые данные об эффективности ряда криопротекторов -полиолов в отношении сохранности клеток и предупреждения ферментных нарушений в них при замораживании-отогреве.

Практическая ценность работы заключается в том, что результаты полученные на трупном костном мозге до замораживания свидетельствуют, что определение активности гликолитических ферментов во внеклеточной среде может быть также показателем качества трансплантационного материала на этапе его подготовки к низкотемпературному консервированию.

Разработанный на основании экспериментальных данных способ оценки структурно-функциональной полноценности клеток костного мозга и лейкоконцентрата от доноров и посмертного происхождения в условиях криоконсервации, используется в работе Харьковской областной станции переливания крови.

Данные, касающиеся особенностей влияния изучавшихся криопро-текторов на содержание клеток и ферментные изменения в них могут быть полезными при разработке способов низкотемпературной консервации клеточных суспензий.

На защиту выносятся следующие основные положения работы:

1. Ключевые ферменты гликолиза и пентозо-фосфатного пгунта проявляют криоустойчивость в однократном цикле замораживания-оттаивания. Снижение их внутриклеточной активности обусловлено элиминацией соответствующих каталитических белков в экзоцеллюлярную среду из разрушенных, а также сохранивших морфологическую структуру клеточных элементов.

2. Уровень активности гликолитических ферментов в среде замораживания является объективным показателем структурных повреждений клеток и может применяться в комплексе с другими показателями для оценки качества биологического материала и эффективности его криоконсервации.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Роль цитоплазматических ферментов в углеводно-фосфорном обмене

Основой жизнедеятельности является энергетическое обеспечение происходящих в организме процессов. Именно энергетический метаболизм в живых организмах может выступать как один из решающих факторов, определяющий направление и характер разнообразных физиологических процессов и отдельных звеньев внутриклеточного обмена.

Одним из источников образования энергии в клетке является гликолитический путь расщепления органических веществ на более простые соединения. При этом образуется энергия, необходимая для осуществления функциональной деятельности клетки. Гликолиз протекает как в аэробных, так и анаэробных условиях. Процессы анаэробного и аэробного гликолиза в нормальных условиях сосуществуют в значительной части тканей /"52,61 J. Взаимоотношение этих процессов в клетке может нарушаться в условиях патологии или при действии на клетку различных экстремальных факторов /"18,61,68,58,128 7. В физиологических условиях обычно гликолитический механизм резервируется, не проявляясь в данных конкретных условиях. В экстремальных условиях, как например, сильная физическая нагрузка, состояние гипоксии и т.д., скорость потребления АТФ может возрасти более, чем в 100 раз Г 12,407. Эти жесткие требования до некоторой степени удовлетворяются благодаря окислению в митохондриях, но даже в том случае, если максимальная митохондриальная активность отвечала бы существующим запросам, она была бы ограничена притоком кислорода и глюкозы до того момента, пока кровообращение не было бы соответствующим образом отрегулировано. При таких обстоятельствах основным компенсаторным механизмом для поддержания энергетического баланса является гликолиз С42,43 7.

Таким образом, гликолиз играет роль резервного, аварийного пути обмена, мобилизуемого в условиях, когда окислительный обмен не может обеспечить нужного уровня энергетического потенциала в тканях. В процессе жизнедеятельности в клетке могут происходить параллельно или последовательно процессы дыхания и гликолиза, резко отличающиеся по своему количественному эффекту /"30,40,43, 61,1347.

Гликолиз является первым этапом разложения глюкозы до молочной кислоты в процессе тканевого дыхания,за которым следует окисление промежуточных продуктов. Гликолитический путь состоит из последовательных многоступенчатых ферментативных реакций, составляющих основу углеводного обмена веществ в живых клетках ZT53, 547 и начинается с транспорта глюкозы через клеточную мембрану, осуществляемого с помощью специфического механизма с участием переносчика С45,567. В процессе гликолиза крупномолекулярные вещества, разрушаясь образуют относительно мелкие биомолекулы, выделяется свободная энергия, аккумулирующая в последующем в мак-роэргических связях АТФ.

Ферменты, участвующие в каскаде гликолитических реакций, локализованы н цитоплазме, клеточной мембране и митохондриях Г8, 15,27,42,52,72 7.

Процесс гликолиза выражается суммарным уравнением: глюкоза + 2 АДФ + 2 3>н-2 лактата + 2 АТЗ> + 2 Н^О

Условно гликолитический путь расщепления углеводов можно разделить на три этапа. На первом подготовительном этапе различные сахара- глюкоза, сахароза, манноза, пентоза вовлекаются в гликолиз и образуют общий продукт - глицеральдегид-3-фосфат. Первая реакция фосфорилирования глюкозы идет за счет АТФ, катализируется гексокиназой, которая осуществляет перенос фосфатных групп от А1Ф на акцепторы фосфата с образованием низкоэнергетических

2+ фосфатов. Реакция идет в присутствии двухвалентных катионов Mcj или Мп?+, которые связываются с А1Ф, образуя истинные субстраты о, О ,

M(jAT3> или МпАИг £ 32 J. Гексокиназа из различных тканей инги-бируется глюкозо-6-фосфатом, являющимся продуктом катализируемой ею реакции, йнгибирование глюкозо-6-фосфатом является неконкурентным по отношению к субстрату гексокиназной реакции, то есть к глюкозе. Гексокиназа является регуляторным ферментом гликолитического пути - активность этого фермента лимитирует утилизацию глюкозы С10/ существует в нескольких молекулярных формах Z~ 38,211,216.7. Изофер-менты могут катализировать реакции, стоящие в местах разветвления нескольких метаболических путей Z" 203.7. Активность фермента в разных тканях различна Z~32 J, Гексокиназа представляет собой оли-гомерный белок с наличием в димерной молекуле фермента дополнительного регуляторного центра связывания А1Ш. Молекулярная масса гек-сокиназы из дрожжей 102000, содержит четыре полипептидные цепочки £9J.

Известно, что гексокиназа находится в клетке в свободном и связанном с митохондриями состоянии /* 113,1807. Предполагают, что связывание гексокиназы с мембранами митохондрий представляет собой один из механизмов координации активности гликолиза дыханием Z"I6,

136.7. Присутствие гексокиназы в митохондриях обеспечивает стимуляцию окислительного фосфорилирования за счет образующегося в ходе гексокиназной реакции АДр. Связанная форма гексокиназы способна активно функционировать в условиях недостатка субстратов в клетке /~84 J, Образуемая в ходе гексокиназной реакции глюкозо-6-фосфат, путем изомеризации превращается во фруктозо-6-фосфат при участии фермента фосфоглюкоизомеразы. Реакция протекает легко в обоих направлениях. Для фосфорилирования фруктозо-6-фосфат используется еще одна молекула АТФ при участии фермента фосфофруктокиназы. Этот фермент обладает довольно узкой специфичностью, однако, в качестве доноров фосфатной группы могут быть использованы различные три-фосфаты - AI®, П®, Ю. К настоящему времени скопилось достаточно много литературных данных по изучению кинетических и физико-химиче ких свойств фосфофруктокиназы С24,112,143,194.7, так как этот фермент представляет большой интерес для исследователей в связи с его ключевой ролью в процессе регуляции гликолиза. Фосфофрукто-киназа обнаружена во всех тканях млекопитакщих,птиц, в растениях, микроорганизмах; все они обладают, в общем похожими свойствами £у7» Молекулярная масса фермента колеблется от 3*10 до 6*10 , представляет собой олигомерный белок. Молекула фосфофруктокиназы постронна из субъединиц четырех видов, каждый из которых представлен более, чем одной субъединицей, несущей один каталитический центр. Фермент относится к аллостерическим Е28,1857.

На активность фосфофруктокиназы сильно влияют различные эффекторы, действующие таким образом, что реакция идет, когда клетка нуждается в А1Ф и сильно ингибируется, когда адениновые нукле-отиды клетки находятся, главным образом, в форме АШ. Таким образом, при высоком значении отношения АТШ/АДЁ активность фермента сильно падает, а при низком - повышается. Высокое отношение АЗФ/АДР, характерное для окислительного фосфорилирования из-за сильного сродства митохондрий к А1Ф, способствует, таким образом, выключению фосфофруктокиназы и соответственно снижению скорости гликолиза С75,110,148,1707.

Фосфофруктокиназная реакция протекает в присутствии ионов р,

Mg , необходимых для образования субстрата М^АТ®, образующийся фруктозо-1,б-дифосфат в ходе этой реакции, расщепдяется дальше на глицеральдегид-3-фосфат и диоксиацетонфосфат /§3,111,2177.

Второй этап гликолиза заключается в окислительно-восстановительных реакциях и процессах накопления энергии - фосфорилирование АДР до А1Ф. Первые две молекулы АТФ образуются при окислении глицеральдегид-3-фосфата до I,3-диф осф оглицерата. Катализирует эту реакцию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа. В результате этой реакции происходит восстановление НАД1", который служит переносчиком электронов от глицеральдегид-3-фосфата к пирувату, образующемуся в дальнейшем. Вторым участком накопления энергии является превращение фосфоенолпирувата в пируват. Таким образом, на каждую молекулу свободной глюкозы в процессе гликолиза расходуется две молекулы А© и образуется четыре.

Третий этап гликолиза заключается в образовании конечного продукта лактата. При восстановлении пирувата до лактата происходит присоединение двух атомов водорода, источником которых является глицеральдегид-3-фосфат, а переносчиком служит НАД. Эта реакция катализируется лактатдегидрогеназой. Ресурсы НАД1", по сравнению с обеспечением клетки углеводами, сравнительно невелики Г19 J и поэтому, если бы ШЩ, образуемый при окислении глицеральдегид-3-фосфата, не окислялся снова, анаэробный гликолиз должен был бы прекратиться с того момента, как весь НАД*" был бы восстановлен в НАДН. Это предотвращается действием лактатдегидрогеназы. Этот фермент встречается во всех органах и тканях, хотя и в очень разных количествах. Наибольшая активность лактатдегидрогеназы обнаружена в почках, сердечной мышце, скелетной мускулатуре и печени /~9J, представляет собой тетрамер из четырех субьединиц (молекулярная масса каждой 35 ООО). Это первый фермент, для которого были обнаружены множественные формы. В большинстве тканей лактатдегидроге-наз:а представлена в виде 5 изоферментов. Установлено С21,39,94, 95 J, что каждая форма - это различные сочетания двух видов субьединиц, получивших название Н и М. Субьединицы, составляющие изо-фермент лактатдегидрогеназы из сердца, были названы Н-, а из скелетной - М-субьединицами.

Лактатдегидрогеназа является ферментом с высокой субстратной специфичностью. Субстратами являются пировиноградная, молочная кислоты и 2-оксибутират. Фермент ингибируется мочевиной, Agtrc^ , ок-салатом, хлороформом и ацетоном /"9 7.

Равновесие лактатдегидрогеназной реакции сильно сдвинуто в сторону образования молочной кислоты, а не продуктов ее окисления. Лактат - своеобразный тупик в метаболизме; однажды образовавшись, он не может превращаться иначе, как путем обращения лактатдегидрогеназной реакции и образования вновь пировиноградной кислоты в аэробных условиях. Лактат выделяется в окружающую среду через плазматическую мембрану клетки Z~32 J.

Процесс гликолиза осуществляется в соответствии с физиологическими потребностями организма и регулируется действием разнообразных контрольных механизмов, которые варьируют для каждого инди-видума в зависимости от времени, а также от органа к органу и от вида к виду ZTI53J.

Наивысшая скорость гликолиза составляет не более 10^ той скорости, которая могла бы установиться, если бы фермент, мощность которого лимитирует скорость процесса, а именно фосфофруктокиназа, действовал максимально 186.7. В мцшце скорость гликолиза лимитируется скоростью использования АТШ для сокращения; гликолитическая мощность этого органа определяется мощностью фосфофруктокиназы, которая должна соответствовать таковой для фосфорилазы гликогена -фермента, ответственного за расщепление гликогена и поступление резервной глюкозы в эту систему £"46 J.

В настоящее время известно, что контрольные механизмы гликолиза проявляются на трех киназных стадиях С 66,186,191 J : гексокиназной, фосфофруктокиназной и пируваткиназной. Все они являются необратимыми стадиями гликолиза и ограничены участием только в гли-колитическом пути. Итоговая скорость гликолиза определяется доступностью субстрата, утилизацией АТФ и концентрациями различных ферментов Г 212 7. Большое значение в регуляции гликолиза имеют системы отношения АШ/Ш и НАД7НАДН Г161,193,196J. В области высоких концентраций AW недостаток кофермента АДР уменьшает скорость фос-фоглицератной реакции, в результате чего накапливается 1,3-дифос-фоглицерат и снижается скорость глицеральдегид-3-фосфатдегидроге-назной реакции. Постоянно образующийся в фосфофруктокиназной реакции фруктозо-1,6-дифосфат превращается в диоксиацетонфосфат, который используется ^С-глицерофосфатдегидрогеназой для окисления НАДН. Благодаря активной работе оС-глицерофосфатдегидрогеназы и уменьшению скорости глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназной реакции происходит уменьшение концентрации НАДН /"147J, Уменьшение скорости гли-церальдегид-3-фоефатдегидрогеназной реакции приводит к уменьшению гликолитического тока. Скорость фосфофруктокиназной реакции непрерывно меняется, так как изменяются ее концентрации субстрата, продукта и эффектора /777,937. В настоящее время предложено несколько моделей предполагаемой регуляции кинетического поведения фосфо-фруктокиназы С1Ъ0,148,151,185 J, зависящей от концентрации фрукто-зо-6-фосфата, фруктозо-1,6-дифосфата и А1Ш, рассматривается активирующее и ингибирущее действие различных субстратов. Обнаружен синергизм в совместном активирующем действии на фосфофруктокиназу жБ^ + фосфат, ыН£ + фосфат + АШ, фосфат + АД5, фосфат + циклический 3,5* - АШ, N н+ + АШ>, НН+ + фосфат + АШ + AM / III, 176,194 / в условиях, когда ферментативная активность подавляется избытком АТФ. Выраженный синергизм в совместном действии активаторов указывает на наличие в молекуле аллостерического фермента пространственно обособленных центров связывания этих активаторов Z~I00.7,

Регуляторное поведение фосфофруктокиназы по отношению к одному субстрату зависит от концентрации другого С 77, 137,141J. При наивысших физиологических концентрациях А35>, цитрата, жирных кислот и ацетил СоА происходит торможение скорости гликолитического потока. Понижение концентрации этих веществ приводит к ослаблению торможения, давая сигнал о том, что не только снижается А®, но уменьшается и поступление главных топливных субстратов окислительной машины митохондрий. Одновременное возрастание АШ и АД& служит источником сигнала для активации гексокиназы и фосфофруктокиназы ZTlIOj. Одновременно растет концентрация глюкозо-6-фосфата, фруктоз одифосфата, что способствует активации пируваткиназы. Если же приток глюкозы в клетку уменьшается, а содержание жирных кислот увеличивается, то окисление их становится преобладающим процессом; при этом адениновые нуклеотиды полностью заряжены, концентрация интермедиатов цикла Кребса увеличивается, положительные стимулы гликолиза устраняются и вновь включается торможение гликолиза Z~"45,

11 J.

Это объяснение согласуется с результатами прямых исследований концентрации глюкозы, глюкозо-6-фосфата и других промежуточных продуктов гликолиза в интактных клетках до и после перехода от анаэробного гликолиза к аэробному дыханию, когда присутствие кислорода снижает потребление клеткой глюкозы и образование лактата тормозится, то есть вступает в действие эффект Пастера /~5б,9б7.

Таким образом, эффект Пастера можно представить как результат последовательных ступенчатых процессов, происходящих во время окислительного фосфорилирования: а) истощение неорганического фосфата и АЛ?, необходимые для гликолиза и повышение уровня А®; б) инактивация фосфофруктокиназы посредством AI®, что проявляется в накоплении глюкозо-б-фосфата; в) инактивация гексокиназы глюко-зо-6-фосфатом /"2187. В разных клетках последовательность конкуренции окислительного фосфорилирования с гликолизом меняется в зависимости от А®-азной активности, регенерации АИ> из фосфокреа-тина, поглощение N Н^ во время окисления <6-кетоглутарата и т.д. В итоге происходит либо увеличение количества отрицательных эффекторов, либо уменьшение положительных (например, Фн и Н^ ), приводящее к понижению активности фосфофруктокиназы и накоплению глюко-зо-6-фосфата Z~457. При этом, в свою очередь, прекращается потребление глюкозы вследствие подавления активности гексокиназы непосредственно или через какой-нибудь метаболит. Кроме того, может подавляться перенос глюкозы Z~567, который зависит от концентрации субстрата внутри клетки. Согласованная регуляция гексокиназа -фосфофруктокиназа представляет собой гибкий механизм регуляции гликолиза, обеспечивающий синтез гликогена в условиях, когда гликолиз ингибирован и делающий возможно специфическую гормональную и нервную регуляцию фосфорилазы, регулирующей активность фосфофруктокиназы путем изменения активности фруктозо-6-фосфата С25, 30, 567.

Фосфорилаза, являясь регуляторным ферментом гликогенолиза, функционирует на важном участке - между источником клеточного топлива, т.е. гликогеном и ферментативным аппаратом, утилизирующем это топливо Z" 32,667. Конечный продукт фосфорилазной реакции при расщеплении крахмала или гликогена, глюкозо-1-фосфат превращается в глюкозо-6-фосфат под действием фосфоглюкомутазы и включается в процесс гликолиза.

Регуляция активности фосфорилазы осуществляется с помощью трех плановых механизмов - метаболического, гормонального и нервного Z~46, 90, 2107. Активность фосфорилазы регулируется изменениями в концентрациях АТШ, АШ, Фн или глюкозо-б-фосфата. Это следует рассматривать как примитивный регуляторный механизм: факторы повышающие использование энергии мышцей (например, сокращение), повышают активность фосфорилазы параллельно изменению активности фосфофруктокиназы, что ведет к одновременной стимуляции гликогено-лиза и гликолиза /~45,32,1И47. Этот метаболический контроль является не зависящим от гормонального или нервного контроля.

Основным источником энергии в клетке служат гликолиз- и цикл лимонной кислоты. Однако, метаболизм углеводов не ограничивается только этими процессами. Имеется ряд метаболических путей, идущих в обход главных путей обмена глюкозы - своего рода "шунты11. Фос -фоглюконатный путь (известный также как пентозофосфатный путь или гексозомонофосфатный щунт ) выполняет в клетке две основные роли, помимо окисления глюкозы, - является источником восстановительных эквивалентов для и служит клетке, дак Механизм, синтезирующий и поставляющий пентозы. Наличие фосфоглюконатного пути выгодно для клетки в тот момент, когда необходимо ускорить утилизацию глюкозы в клетке, а обычные ее фосфорилирующие механизмы оказались по тем или иным причинам сильно перегруженными. Изучение реакций этого пути показало, что они включают окисление глюкозо-б-фосфата в 6-фосфоглюконовую кислоту, которая затем подвергается окислительному декарбоксилированию с образованием пяти-углеродного сахара, рибулозо-5-фосфата. Все реакции протекают в растворимой части цитоплазмы животных клеток. Первая реакция дегидрирования глюкозо-6-фосфата катализируется ферментом глюкозо-б-фосфатдегидрогеназой. Впервые этот фермент был обнаружен 0. Вар-бургом и Христианом в 1931 г., а в 1961 году была выделен в кристаллическом виде из пивных дрожжей и молочной железы коров /Г327. Содержание этого фермента в различных тканях неодинаково, его мало в скелетных мышцах и много в печени ZTI37J7. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа преимущественно находится в растворимой части клет ки, но имеются данные также о небольшой части связывания этого фермента с митохондриями £"27,86,207J. Как предполагают авторы, митохондриальная глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа может быть источником внутримитохондриального НАДР-Е, и может функционировать с гексокиназой и трансгидрогеназой в обеспечении пути окисления глюкозы, сопряженного с синтезом митохондриального AT® Z~I357.

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа представляет собой димер субь-единиц с молекулярной массой по 67 500 Z~97, проявляет коопера-тивность отрицательную, его действие легко подавляется продуктом реакции НАД&-Н. Шли найдены термолабильные и термостабильные формы глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы ZTI977.

Первичным продуктом окислительной фазы фосфоглюконатного пути является пентозо-рибулозо-5-фосфат, который служит предшественником пентоз, необходимых для синтеза нуклеиновых кислот, Зтот дополнительный путь особенно важен для тех органов и клеток, в которых идет активно синтез жирных кислот и различные реакции гидроксили-рования, протекающие, в частности, при синтезе стероидных гормонов - адипоцитов, печени, молочной железы, коры надпочечников Z~45J

Таким образом, для выяснения характера изменений и возможного механизма нарушения активности цитоплазматических ферментов в составе клеток и тканей после замораживания-отогрева исследовалась активность ряда ключевых ферментов гликолиза и яентозо-фосфатного пути: гексокиназы, фосфофруктокиназы, лактатдегидрогеназы, фосфори-лазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы. Выбор этих показателей для решения поставленной задачи основывался на соответствующих общих и теоретических предпосылках. Известно, что ферменты гликолиза и пентозофосфатного пути локализованы преимущественно в растворимой части цитоплазмы и составляют основную массу растворимых клеточных белков. Кроме того, указанные выше ферменты обеспечивают основные каталитические превращения углеводных субстратов на путях их энергетического использования, в связи с чем комплексное исследование их позволяет получить более полное представление об особенностях функционирования целых метаболических цепей клетки, в данном случае гликолиза и пентозофосфатного шунта в условиях замораживания-отогрева.

Заключение Диссертация по теме "Криобиология", Андриенко, Алла Николаевна

выводы

1. Замораживание-оттаивание тканевых срезов и гепатоцитов из печени крыс вызывает снижение внутриклеточной активности ферментов гликолиза и пентозофосфатного шунта - гексокиназы, фосфорилазы, лактатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, 6-фосфоглюко-натдегидрогеназы, которое сопряжено с появлением их активности в среде замораживания.

2. Замораживание-оттаивание не оказывает влияния на активность изучавшихся ферментов в составе тканевых экстрактов и гомогенатов, а также в системе тканевые срезы + среда замораживания, что свидетельствует о криоустойчивости этих каталитических белков.

3. В процессе медленного замораживания лейкоцитов крови человека до различных температур' в диапазоне 0 —19б°С максимальный выход ферментов в среду замораживания и криоповреждение клеток происходит в температурном интервале 0 —30°С. При этом выяснено, что источником ферментов в экзоцеллюлярной среде являются как полностью разрушенные клетки, так и клетки с сохранившейся морфологической структурой.

4. Гепатоциты, подвергавшиеся замораживанию-оттаиванию, характеризуются сниженной гликолитической активностью. Введение в бескле точную систему белок-содержащей фракции среды замораживания способствует частичному восстановлению скорости гликолиза, что свидетельствует о связи обнаруженных нарушений энергетического баланса в гепатоцитах с дефицитом ферментов гликолиза.

5. Установлена зависимость уровня внеклеточной активности цито-плазматических ферментов от полноценности клеток донорского и посмертного костного мозга человека в условиях практического исполь зования этого трансплантационного материала на этапах заготовки и криоконсервации.

6. При замораживании срезов печени крысы с ПЭГ-300 и ПЭГ-ЮОО в 20%-ной конечной концентрации установлена высокая криозащитная эффективность ПЭГ с молекулярной массой 1000, что проявлялось в минимальном выходе ферментных белков из тканевых срезов в среду замораживания,

7. ПЭГ-400 способствует снижению уровня внеклеточной активности ферментов и сохранению количества клеток в процессе замораживания-оттаивания суспензии лейкоцитов.

8. Применение ПЭГ-400, ПЭГ-1500 и 1,2-пропандиола в 10%, 15# и 20%-ной концентрации соответственно способствует высокой сохранности количества гепатоцитов в процессе замораживания-оттаивания, но не предупреждает в этих условиях элиминации из сохранившихся клеток большинства изучавшихся ферментов в среду замораживания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Согласно современным данным литературы, повреждающий эффект низких температур на клетки и ткани является результатом сочетан-ного действия многочисленных физико-химических факторов - низкотемпературного шока, кристаллизационных явлений, осмотических градиентов, высоких концентраций электролитов и метаболитов, эффектов дегидратации и межмолекулярных взаимодействий, изменения рН среды, возникающих в процессе охлаждения и вымораживания внеклеточной и внутриклеточной воды.

Установлено, что точкой приложения указанных повреждающих факторов могут быть белковые структуры, в частности, каталитические белки, которые находятся в клетке в растворимом состоянии или ассоциированы с различными мембранными образованиями /"81,98,106.7.

Очевидно, что структурно-функциональное состояние ферментов, катализирующих важнейшие обменные процессы, во многом будет определять функциональную и метаболическую полноценность тканей, подвергнутых действию холода. В связи с этим представляет несомненный интерес исследование поведения различных ферментных систем в условиях влияния низких температур, что позволит более детально понять механизм криоповреждений как белковых структур, так и клетки в целом.

Целью настоящей работы явилось изучение криоустойчивости и клеточных механизмов нарушения активности ключевых ферментов гликолиза препаратов различного уровня биологической организации.

После медленного замораживания срезов печени до -30°С - медленного оттаивания было показано, что достоверное снижение активности гликолитических ферментов в составе срезов сопровождалось повышением уровня их активности в среде замораживания. Эти результаты дают основание считать, что одной из возможных причин снижеия активности цитоплазматических ферментов при замораживании -ттаивании тканевых срезов является выход ферментных белков в окру-ающую среду в результате повреждения клеточных мембран.

Однако, нельзя исключить, что снижение активности гликолитичес-их ферментов при замораживании срезов печени крысы может также вляться результатом нарушения нативной конформации белковых молекул.

С целью проверки данного предположения была исследована актив-ость цитоплазматических ферментов после медленного замораживания о -30°С гомогената из срезов печени и надосадочной фракции из го-огенатов. Отсутствие в этих экспериментах изменений активности изу-авшихся ферментов подтвердило с одной стороны, устойчивость гликоли-яческих ферментов к действию низких температур, и с другой, дает знование считать выход каталитических белков во внеклеточную среду зновной причиной снижения их тканевой активности при замораживали - оттаивании тканевых срезов печени.

Подобные результаты были получены при замораживании изолирований из печени крыс суспензии гепатоцитов. Установлено, что быстрое шораживание до -19б°С клеток печени сопровождается резким увеличе-*ем активности всех изучавшихся ферментов в экзоцеллюлярной среде, щовременно в клетках, подвергавшихся замораживанию уровень фер-знтативной активности значительно уменьшался. Дополнительным утверждением устойчивости изучавшихся ферментов явились резуль-1ты, полученные при исследовании активности ферментов в гомогена-IX из замороженных срезов печени, почек и сердца, которые подвергать различным режимам замораживания - отогрева. Установлено, что ^зависимо от применявшихся режимов замораживания - отогрева, сум-ьрная ферментативная активность оставалась без существенных изме-;ний. Полученные результаты дают основание считать, что снижение :тивности гликолитических ферментов в составе тканей и изолированвдх клеток после действия низких температур обусловлено уменьшением внутриклеточного содержания каталитических белков в результате их выхода в экзоцеллюлярную среду через поврежденную замораживанием клеточную мембрану и не связано с изменением их функциональных свойств, в этих условиях.

Снижение активности ферментов углеводно-фосфорного обмена в данных исследованиях, очевидно, подобно освобождению лизосомальных ферментов из состава лизосом /"34,1847 и растворимых митохондри-альных ферментов из митохондрий /"77 в процессе замораживания -оттаивания этих органелл.

По мнению ряда авторов /"47,83,117 J освобождение из клетки мембраносвязанных ферментов является результатом полного нарушения целостности мембранного барьера проницаемости и свидетельствуем по-видимому, о необратимости повреждения соответствующих органелл или клетки в целом.

Сейчас уже экспериментально доказано, что при действии низких температур наиболее чувствительными структурами клеток являются биологические мембраны, что обусловлено их сложной структурной организацией, обеспечивающей направленность и скорость протекания клеточной функции Г119 J.

В настоящее время в процессе замораживания выделяют три основных уровня, вызывающих повреждение мембранных структур клеток: I. Физико-химический, проявляющийся в изменении рН, повышении концентрации электролитов, действия осмотических факторов; 2. Термодинамический - проявляющийся в ослаблении гидрофобных взаимодействий, а также фазовых переходах липидов. 3. Биохимический, проявляющийся в окислении SH-групп белков, активации фосфолипаз, развитии перекисного окисления и других процессов /~бJ.

Фазовое состояние липидов существенно влияет на такие важные функции клетки как каталитическую активность белков, регулирующих метаболизм клетки, транспорт мионов и биомолекул С 497. Под влиянием низких температур в липидах .происходят фазово-структурные переходы, сопровождающиеся кристаллизацией участков, которые ограничивают конформационную подвижность углеводородных молекул, тем самым нарушая функционирование мембраносвязанных ферментов. Фазовые переходы липидов при замораживании способствуют образованию кластеров липидов, латеральной сепарации липидов и агрегации мембранных белков, что ведет к нарушению функционирования клетки в целом, В процессе фазово-структурного перехода, происходящее латеральное разделение липидов в мембране приводит к пространственному перемещению определенных мембраносвязанных ферментов, вызывая нарушение их функции /"1207. Ослабление гидрофобных взаимодействий в мембране при низкотемпературном воздействии отражается на стереохи-мической специфичности различных участков мембраны, включающих системы ионного транспорта, рецепторные зоны мембраны Z~787, приводит к изменению активности мембраносвязанных ферментов, тем самым изменяя скорости протекания окислительно-восстановительных реакций в клетке. Перестройки белок-липидных компонентов мембраны могут приводить к развитию перекисного окисления липидов, активации фосфо-липаз.

При медленных скоростях замораживания, используемых нами в работе со срезами печени, основными повреждающими факторами являются "эффекты раствора", возникающие при вымораживании свободной воды из клеток £497. Кристаллизация основной массы воды в лед сопровождается увеличением концентрации растворенных веществ, дегидратацией макромолекул, возникновением осмотических градиентов на границе биологических мембран, изменением рН среды, нарушением межмолекулярных взаимодействий Z~787. Очевидно, комплексное влияние этих факторов или преимущественное действие одного из них определяют основной характер и степень повреждения плазматических мембран в исследованном режиме замораживания. Проведенное исследование активности гликолитических ферментов в диапазоне температур от 0° до -30°С, свидетельствуют, что одной из самых главных причин повреждения плазматических мембран может быть повышение концентрации растворенных веществ. Комплекс физико-химических сдвигов, возникающих при вымораживании свободной воды, способствует ультраструктурным и биохимическим изменениям в плазматической мембране, в результате чего нарушается ионная проницаемость и наблюдается выход каталитических белков в окружающую среду.

С целью выяснения некоторых сторон механизма криоустойчивости изучавшихся ферментов в клетках и тканях была проведена серия модельных экспериментов, в которых исследовалось действие низких температур на активность изолированной дрожжевой гексокиназы в различных 0,15 М растворах неорганических солей. Показано, что замораживание гексокиназы не сопровождалось изменением ферментативной активности. Исключение составляли растворы хлорида кальция и тио-цианата, в которых наблюдалось выраженное падение активности фермента, что можно объяснить повреждающим действием на структуру фермента высоких концентраций ионов кальция и тиоцианата, которые обладают выраженными лиотропными свойствами в отношении белков.

Многократный цикл замораживания-отогрева вызывает падение активности исследуемой изолированной дрожжевой кристаллической гексокиназы в 0,15 М растворе хлорида натрия, потеря которой после 10-ти циклов составляла 93,4%, что свидетельствует о явно выраженном нонформационном изменении белковой молекулы в результате суммирующего действия факторов криоповреждения.

При замораживании-отогреве ферментов происходит дегидратация макромолекул вследствие вымораживания воды, непосредственно связанной с белком. Исследованиями многих авторов £"108,158,2007 было показано, что гидратационный слой воды структурно связанный с белковой молекулой, имеет большое значение для стабилизации ее на-тивной конформации и реализации белком специфических функций. При сравнительном действии £"200 J дегидратации и замораживания на каталазу и пероксидазу был обнаружен однотипный характер инактивации ферментов, что и дает основание считать молекулярную дегидратацию основной причиной криоповрежедний каталитических белков. Таким образом, в результате многократных циклов замораживани-отогрева проявляется многократное повреждающее действие дегидратации-регид-ратации на молекулу фермента.

Полученные нами данные о защитном влиянии глюкозы и альбумина при многократных циклах замораживания гексокиназы в 0,15 М растворе хлорида натрия, а также при замораживании в растворах хлорида кальция и тиоцианата, могут служить экспериментальным обоснованием для объяснения возможного механизма криоустойчивости гликолитических ферментов.

Из данных литературы /"125,139J известно, что криочувстви-тельность белка, находящегося в составе клетки и изолированного белка различна. Поводов для различного отношения белка in vivo и in vitro к альтерирующим факторам вполне достаточно. Во-первых, в клетке и в растворе белок находится в совершенно разной концентрации. Во-вторых, в клетке и в растворе белковую молекулу окружают среды совершенно разного состава. Далее, извлекая белок из клетки, мы часто вырываем его из комплекса с другими соединениями (белками, липидами, полисахаридами), отщепляем от него лиганды; все это может стабилизировать или лабилизировать структуру белка.

Чаще всего белок в системе клеток значительно стабильнее, чем в гомогенате ткани или в выделенном состоянии ZTI02, 109,115,131, 136,143J. В исследованиях по белкам Z~I J было установлено, что при выделении и очистке белки отделяются от физико-химических условий, определяющих их нативный характер: при этом белки, как правило, становятся лабильнее и легче денатурируют. Например, глюта-матдегидрогеназа печени быка при прогреве печеночной ткани оказывается стабильнее, чем в очищенном состоянии. Альдолаза и актомио-зин в мышцах лягушки термостабильнее, чем в выделенном состоянии. Большая термостабильность ферментов in vivo , чем in vitro установлена и на бактериях - термофильных, мезофильных и психрофиль ных.

Так по данным С 126,130,133,219 J ферменты, находящиеся в клетке, менее чувствительны к действию низких температур, чем изолированные ферменты. Относительная криостабильность ферментов, находящихся в составе клетки объясняется наличием ряда метаболических веществ, субстратов и кофакторов СI, 198, 179,162,152,1507.

Поскольку ферменты гликолиза в составе тканей, клеток и бесклеточных тканевых препаратов находятся в контакте с соответствующими субстратами, коферментами и другими белками /"99,161,167,190, 191,195J, можно полагать, что подобное микроокружение играет роль своеобразной естественной криозащитной среды для каталитических белков, обеспечивая в результате специфических и неспецифических взаимодействий с ними более высокую стабильность их молекулярной структуры.

При медленном замораживании ядросодержащих клеток крови в 0,15 М NaCL в диапазоне температур 0° - -196°С до -30°, -70°, -140° и -196°С основной выход ферментов из клеток наблюдался в диапазоне температур от 0° до -30°С. В этой же температурной зоне происходит основная потеря клеток.

По мнению ряда исследователей, диапазон температур от 0°С до -30 —40°С является для многих биологических объектов "критической зоной", поскольку в этом температурном интервале имеют место фазовые переходы в растворах, следствием которых является кристаллизация воды, появление концентрационных и осмотических градиентов растворенных веществ, эвтектическая кристаллизация солей С 119,155,157,172,199,213 7.

Сравнение активности ферментов в экзоцеллюлярной среде лейкоцитов после замораживания с активностью ферментов, определяемых в пробах, где проводилось практически полное разрушение клеток, показало отсутствие отклонений от контрольных величин и стабильность уровня ферментативных активностей для гексокиназы, фосфорилаз: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы независимо от конечной температуры замораживания. Эти данные свидетельствуют о том, что источником ферментных белков в среде замораживания являются главным образом разрушенные клетки. Появление в среде замораживания избыточной лактатдегидрогеназной активности свидетельствует о том, что в условиях криобиологического эксперимента источником, приводящим к увеличению активности фермента являются не только полностью разрушенные клетки, но и лейкоциты, которые считались морфологически сохранившимися. В связи с этим более правильно рассматривать лейкоциты после оттаивания, как клетки с поврежденными мембранными структурами.

С этими данными согласуются результаты полученные нами при исследовании активности ферментов после замораживания до различных температур лейкоцитов, взвешенных в гомологичной плазме. Сохранение клеток после размораживания составляло в среднем 50% от исходного количества лейкоцитов в экспериментальных пробах, а уровень активности всех изучавшихся ферментов не соответствовал количеству разрушенных клеток, намного превышал контрольные величины* Эти данные являются дополнительным доказательством того, что источником ферментов во внеклеточной среде при замораживании биологического материала являются как полностью разрушенные клетки, так и клетки, сохранившие морфологическую структуру, но имеющие, очевидно, скрытые "латентные" повреждения мембранных структур.

Учитывая установленный факт о том, что клетки, подвергавшиеся замораживанию-отогреву, характеризуются повышенной проницаемостью для гликолитических ферментов, представлялось интересным выяснить отражаются ли эти нарушения баланса ферментов на интегральной мощности клеточного гликолиза. Было показано, что замораживание до -196°С клеточной суспензии гепатоцитов приводит к значительному снижению аэробного и анаэробного гликолиза, а также к снижению внутриклеточного содержания АТФ. Полученные результаты согласуются с данными литературы /"10,36J по изучению энергетического обмена в клетках трупного костного мозга в процессе консервации, а также в лейкоцитах после криоконсервации.

Известно, что АТФ может оказывать прямое действие в сохранении целостности мембран, так как она участвует в биосинтезе фосфа-тидиновых кислот, интермедиатов в синтезе фосфолипидов - основных компонентов мембраны /"91,ПО,129,208 7. Снижение содержания АТФ в гепатоцитах после замораживания-отогрева усугубляет нарушения ионной проницаемости цитоплазматической мембраны и способствует, вероятно, выходу в среду замораживания многих каталитических белков, субстратов, метаболитов и кофакторов.

Нами были проведены исследования по выяснению роли дефицита каталитических белков, субстратов и кофакторов в механизмах нарушения гликолитической активности. При введении в гликолизирующую систему из замороженно-отогретых гепатоцитов очищенного фермента гексокиназы, наблюдалось достоверное повышение скорости анаэробного гликолиза, что подтверждает роль этого фермента как ответственного за скорость протекания гликолитического процесса /"19,20, 51 J. При добавлении к гликолизирующей системе фракции, содержащей ферменты и низкомолекулярные компоненты клеток, отмечено существенное восстановление гликолитической активности как в аэробных, так и анаэробных условиях (70,7 и 86,1%соответственно). Присутствие фракции, лишенной белков, не восстанавливает скорость гликоли-тического расщепления углеводов. Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод, что основной причиной снижения гликолитической активности в гепатоцитах после быстрого замораживания до -196°С является уменьшение внутриклеточного фонда каталитических белков.

При изучении активности цитоплазматических ферментов в среде суспендирования донорского и посмертного костного мозга до замораживания было показано, что посмертный костный мозг характеризуется большей частотой появления ферментов в экзоцеллюлярной среде.

После замораживания трупного костного мозга уровень ферментативной активности существенно возрастал, что коррелирует с потерей клеточных элементов в процессе замораживания.

В последнее время с целью оценки степени повреждения биологического материала, подвергаемого низкотемпературной консервации применяется изучение активности различных ферментов в среде замораживания . Показано, например, увеличение активности трансаминаз, лактатдегидрогеназы в экзоцеллюлярной среде после замораживания спермы С 89,118,1747; выход лактатдегидрогеназы из паренхимы почки, хранившейся в гипотермических условиях, используется в качестве критерия жизнеспособности перед трансплантацией в клинике ££7,219J. В литературе отсутствуют подобные данные в отношении ядросодержа-щих клеток костного мозга, клеток крови и клеток печени.

Результаты данной работы, свидетельствующие о корреляции между уровнем экзоцеллюлярной активности ферментов гликолиза и структурными изменениями клеток и тканей при замораживании-оттаивании, могут служить экспериментальным обоснованием для широкого применения ферментных тестов в практике криоконсервации различных биологических объектов. Результаты, полученные на трупном костном мозге до замораживания свидетельствуют, что определение активности гликолитических ферментов во внеклеточной среде может быть также показателем качества трансплантационного материала на этапе подготовки его к низкотемпературной консервации.

В настоящее время ведутся интенсивные поиски по изучению механизма защитного действия разнообразных криопротекторов. Исследование повреждения клеток и тканей в процессе замораживания-оттаивания привело к изысканию способов предохранения тканей от действия этих факторов. Было установлено, что криопротективным действием обладают многие соединения, принадлежащие к различным классам веществ

Г73,154,189,1927.

В данной работе были исследованы в качестве криопротекторов полиэтиленгликоли с различной молекулярной массой, а также 1,2-про-пандиол. Было установлено, что все криопротекторы — ПЭГ-400 - 10%, ПЭГ-1500 - 15%, ПЭГ-300, ПЭГ-ЮОО и 1,2-пропандиол - 20% не изменяют активности изучавшихся ферментов в составе надосадочной фракции из гомогената печени крыс.

При замораживании срезов печени крыс было обнаружено различие криопротекторных свойств ПЭГ-300 и ПЭГ-ЮОО. ПЭГ-ЮОО проявил сравнительно высокую криозащитную эффективность в отношении снижения выхода ферментных белков из тканевых срезов в среду замораживания. Очевидно, ПЭГ-ЮОО, имея большую молекулярную массу, обладает большей способностью стабилизировать плазматическую мембрану, образуя водородные связи С АА 7, тем самым препятствуя элиминированию каталитических белков через дефектные зоны мембраны.

Присутствие в среде замораживания лейкоцитов ПЭГ-400 способствовало значительному сохранению количества клеток (до 95%) и в значительной мере предупреждает выход исследуемых ферментов из клеток.

Криопротекторы ПЭГ-400, ПЭГ-1500 и I,2-пропандиол оказались эффективными в отношении сохранения количества клеток после быстрого замораживания гепатоцитов до -19б°С, но не оказывали выраженного влияния на утечку ферментных белков из клеток при замораживании. Исключение составляла фосфорилаза, для которой проявился защитный эффект ПЭГ-1500 и 1,2-пропандиола.

Результаты этих исследований еще раз подтверждают значение популяции клеток с сохранившейся морфологической структурой и "латентными" повреждениями как источника внеклеточных каталитических белков в условиях замораживания-оттаивания. Таким образом, полученные нами данные, касающиеся особенностей влияния изучавшихся криопротекторов на содержание клеток и ферментные изменения в них, могут быть полезными при разработке способов низкотемпературной консервации клеточных суспензий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Андриенко, Алла Николаевна, Харьков

1. Александров В.Я. Клетки, макромолекулы и температура. Л.: .Наука, 1975. - 328 с.

2. Баев В.И., Друкина М.А. Содержание шриданнуклеотидов.в мозге и миокарде крыс, при сочетанном воздействии гиперкапнии, гипоксии и охлаждения. Вопр. мед. химии., 1976, т.22, № I, с.37-41.

3. Белинова Е.В.,, Коюлова Г.С., Егоров И.А. Влияние ультранизкихтемператур на; активность РНК-азы. Изв. АН СССР. Сер. биол., 1968, В 6, с.847-853.

4. Белоус A.M., Луговой В.И.,, Лемешко В.В. и др. Проблемы криобиохимии. -Вестн. АН УССР, 1976, В 2, с.38-48.

5. Белоус A.M.,. Бондаренко В.А., Бондареыко Т.П. Влияние замораживания-оттаивания на лишдный состав митохондрий. Биохи-, мия, 1978, т.43, Ш 12, с.2175-2182.

6. Белоус A.M., Бондаренко В.А. Механизмы развития холодового, повреждения мембран, клеток. В кн.: Криобиология и криомедицп-на., К.: Наукова думка, 1981, в.9, с.3-17.

7. Белоус A.M., Луговой В.И.,. 1Улевский А.К.Актуальные проблемысовременной криобиохимии. В кн.: Криобиология и криомеди-цина . К. : , Наукова думка, 1981, в.9, с.13-18.

8. Бизольд Д. Распределение, гексокиназы в. субклеточных фракцияхмозговой ткани. В,кн.; Биохимия и функция нервной системы. Л., 1967, с.115-121.

9. Биохимический справочник. -.К.: Вища школа, 1979 , 303 с.

10. Блинов Н.М., Мамышева Т.К. Энергетический, обмен клеток, трупного костного мозга и его; изменение в процессе консервации. -В кн.: Вопросы трансфузиологии и изучения свертывания крови. Кровезаменители.и лечебные препараты крови. Л., 1967, с .3238.

11. П.Ванкова С. Цитохимическое исследование активности сукцинатде-гидрогеназы, консервированной путем замораживания кожи крысы. Изв. Ин-та морфологии Болт. Акад. Наук, 1974, т. 15, C.III-II6.

12. Виноградов В.М. Шддержание жизни в экстремальных условиях. -В кн.Повышение резистентности организма к эктремальнымвоздействиям. Кишинев, 1973, с.105-127.

13. Волжина-Атабекова Н.Г., Рликолитические процессы в, головном мозгу при прерывной и непрерывной адаптации к низким температурам. Научн., докл. высшей школы, 1978, №5, с.32т-36.

14. Волкова 3.А. Гликолиз в головном мозгу и сердце крыс, после воздействия гипоксии, гиперкапнии и охлаждения. Физиол, журн. СССР, 1972, т.58, № I, с.122-128.

15. Гайцхоки B.C. О роли внутримитохондриальных ко ферментов в регуляции скорости, гликолиза в кленках печени, мыши и асцитической карциномы Эрлиха. Биохимия, 1962, т.27, В 2, с.286-292.

16. Гобеев В.Н., Хрипач Л.П. О возможном значении связывания, гексо-: киназы с мембранами митохондрий. Вопр. мед. химии, 1977,т.1, с.120.

17. Горбач З.В., Маглыш B.C., Кубышин B.JI. функционирование окис,, лительной ветви пентозофосфатного, пути в печени крыс при развитии недостаточности витамина В у животных. Вопр. мед. химии, 1983, т.29, № 5, о.36-41.

18. Иванов И.И., Зарембский Р.А., Скорик В.И. и др. О принципе ре. гуляции углеводного обмена по типу обратной связи. Докл. АН УССР, 1966, т.168, £ 5, с.1199.

19. Иванов И.И., Коровкин Б.Ф., Маркелов И.М. Введение в клиничес-, , кую энзимологию. Медицина, 1974. 277 с.

20. Иванов И.И., Коровкин Б.Ф., Маркелов И.М., Черниенко И.С. Изменение ферментативной активности саркоплазматических белков сердечной мышцы при экспериментальном инфаркте миокарда. -, Укр. биохим. журн., 1965, т.37, № 5, с.712.

21. Катаева И.П. Лдхание и окислительное фосфорилирование в изолированных клетках печени. Цитология, 1975, т.17, № 5, с.545-551.

22. Киселев Н.А., Стельмащук В .Я.,: Инсслер К. Четвертичная структура по.данным электронной микроскопии. Докл. АН СССР, 1979, т.247, Jfc X, с.237-239.

23. Носенко Е.А., Каминский Ю.Г. Энергетический обмен в печенимолодых и старых крыс под влиянием голодания. Укр. био: хим. журн., 1983, т.55, № 4, с.425.

24. Кудокоцева Е.В., Гордиенко А.Д.,.Белоус A.M. Дыхание и окислительное фосфорилирование в изолированных клетках печени при замораживании. Укр. биохим. яурн., 1980, т.52, №4, , с.466-471.

25. Кудрявцева Г .В., Гойло Т.А. , Пецке К.Ю., . Колотилова А.И. Растворимые, ядерные и митохондриальные формы дегидрогеназ, трансфераз пентозофосфатного пути и нуклеаз в печени кур. -Биохимия, 1976, т.41, №2, с.363-368.

26. Куликова А.И. Активность фосфофруктокиназы скелетных мышц и сердца крыс цри гемической гипоксии. Воцр. мед. химии, 1966, т.12, с.196-199.

27. Курганов Б.И., Гончиева И.Н., Лисовская Н.П. и,др. Влияние ПЭГна ассоциацию мышечной фосфорилазы В. Биохимия, 1979, т.44, Я 4, с.629-633.

28. Лабори А. Регуляция обменных процессов. М.: Медицина, 1970.- 384 с.31. , Лемешко В.В. , Чаплай Е.В. Активация глюкозо-6-фосфатазы печеникрыс замораживанием. В кн.Криобиология и криомедицина. К.: Наукова думка, 1975, в.1, с.66-67.

29. Ленинжер А,. Биохимия. r М.: Мир, 1976. 956 с.

30. Луговой В.И., Моисеев В.А. Влияние низких температур на растворимые ферменты. Биофизика, 1978, т.9, с.53-79.

31. Луговой В.И., Шенберг М.Г., Кравченко Л.П. и др. Энергетическийобмен лейкоцитов при низкотемпературной консервации под, защитой полиэтдпеноксида. Пробл. гематологии, 1974, т.19, 7, с.27-29.

32. Мишнева Л.Г., Белоус A.M. Влияние ПЭО различного молекулярноговеса на функциональное состояние, митохондрий. В кн.:,Крио-,, биология и криомедицина. К.:; Баукова. думка, 1977, в.З, . с.43-45.

33. Монахов И.К., Нейштадт Э.Л., Шварцман А.Л., Нейфах С.А. Об опухолевом происхождении гексокиназы, в биологических жидкостях человека. Воцр. онкологии, 1978, т.24, № 10, с.50-54.

34. Мосс Д.В., Баттерворт П.Дж, Регуляция ферментативной активнос-, ти. В кн.: Энзимология. и медицина., М.: Медицина, 1978,с.168-199.

35. Неговский В.А. Патофизиология и терапия агонии.и, клинической ' . ,смерти, г М.:.Медгиз, 1954. 256 с.

36. Панин Л.Е. Особенности действия цАМФ на гликолиз и гликогенолиз. в.печени и надпочечниках белых крыс. Бшл. эксп. биол. :и мед., 1981, т.92, $ 8, с.37-39.

37. Цушкарь Н,С., Белоус A.M. Действие низких температур на ферменты. В кн.: Введение в криобиологию. К.: Наукова дзумка,1975, с.100-147.

38. Пушкарь Н.С.,Шраго М.И., Белоус A.M.,,Калугин Ю.В. Криопротек-' торы, г К.:. Наукова думка, 1978.- 201 с.

39. Райдер,К., Тейлор К. Изоферменты. М.: Мир, 1983. - 106 с.52.,Репин В.С. Координация дыхания и гликолиза. В кн.:,Механизмы интеграции клеточного обмена. - Л., 1967. - 206 с.

40. Робертис Э., Новинский В., Саэс Ф. Ферменты, клеточный метаболизм. и биоэнергетика. В кн.: Биология клетки. М.: Мир, 1973, с.73-93.54.:Розенгарт В.И. Ферменты двигатели жизни. - Л.: Наука, 1983.- 158 с.

41. Рокитский П.Ф. Биологическая статистика. Минск: Вадейдаяшкола, 1967. 326 с.56, Рэкер Э. Регуляция энергетического, обмена. В кн.: Биоэнергетические механизмы: новые взгляды.М.: Мир, 1979, с. 172-196.

42. Саратиков А.С., Волошина Э.И. , Ревина Г.А.,. Сахарова С.А.

43. Энергетический обмен мозга при: острой гшюксической гипоксии.- Изв. СО АН СССР, 1971, Т.5, $ I, с.119-125.

44. Северин С.Е,. Внутриклеточный обмен углеводов и биологическоеокисление. В кн.: Химические основы процессов жизнедеятельности. М., 1962, с.156-174.

45. Северин С.Е.,, Цейтлин Л.А. Анаэробное.превращение углеводов втканях сердечной мышцы в, норме и цри экспериментальном миокардите. Во пр. мед. химии, 1961, № 2, с.201-206.

46. Северин С.Е., Цейтлин Л.А. Энергетический обмен сердца в нормеи патологии. В.кн.: Тр. 2-го Всес. съезда терапевтов. М., 1966, с.12.

47. Сейц И.Ф. Взаимодействие дыхания и гликолиза в клетке и сопряженное, фосфорилирование. М.: Медицина, 1961. - 262 с.

48. Семаков В.Г., Рыжков Т.Г. Проницаемость цитоплазматических.мембран сперматозоидов быка и хряка для натрия, калия, кальция и фосфора под влиянием низких температур. С.-х. биология,1976, т.II, Jfc 2, с.200-204.

49. Серов О.Л.; Молекулярная, гибридизация нативных и модифицированных субъединиц изоферментов лактатдегидрогеназы и. альдолазы крысы. Биохимия, 1976, т.41, № 5, с.886-890.

50. Смит 0. Биологическое действие замораживания и переохлаждения.-М.: Иностранная литература, 1963.- 503 с.

51. Суханова Д.И., Федотенков А.Г.Суханов Ю.С., Раевский А.Г.

52. Консервирование клеток аутологичного костяного мозга онкологических больных при -70°С. Пробл. гематологии, 1974, т.19, 7, с.22-23.

53. Умбрейт В.В., БУррис Р.Х., Штрауффер Дж.Ф. Манометрические методы изучения тканевого обмена, г М.: ИЛ, 1951. 153 с.

54. Хайкина Б.И., Якушко В.Е. Гликолиз и его регуляция отдельнымикомпонентами нервной, клетки в покое и при возбуждении. -, Вопр: мед. химии, 1967, т.13, Jfc 6, с.605-611.

55. Чернышова И.А., Фром А.А. Методы получения концентрата ядросодержащих. клеток периферической крови. Пробл. гематологии, 1969, т.14, Ш I, с.55-56.

56. Шепотиновский В.И., Макашинович З.И., Конемович Г.А. Метаболические, последствия нормотермической ишемии почек. Воцр. мед. химии, 1983, т.29, №2, с.44-47.

57. Шумаков В.И., Штенгольд Е.Ш.,; Оншценко Н.Н. Консервация органов. М.: Медицина, 1975. - 249 с.

58. Щербатых Л.Н., Гончарова Н.Ю., Алексахина Н.В. Изменениесвойств гексокиназы гиалошгазмы при связывании с митохондриями. Биохимия, 1977, т.42, $ 8, C.I408-I4II.

59. ТЗ. Aldwinokle T.J., .Ahkong Q.Frj, Bangham A.D.; et al. Effects ofpoly(ethylene glycol) on liposomes and erythrocytes. Permeability changes and membrane fusion. Biochim. et Biophys. Acta, 1982, v.689, N 3, p.548-560.

60. Attenburrow V.D. Functional recovery of isolated rat hepatocytes upon thawing from -I96°C. Cryo-Letters, 1980, N I, p.139-146.75» Bairlein j»L., Faster j.M. Studies on the energy metabolism of human leukocytes. Blood, 1968, vy32, N 3, p.4I2-*I6.

61. Ben-Naim A. Hydrophobic interaction and structural changes in the solvent. Biopolymers, 1975, v.I4, N 7, p.1337-1355.79» Beutler E. Red cell metabolism. A manual of biochemical methods. New York: Grune and Stratton, 1975. - 160 p.

62. Block M.C>, Neut-Kok E.C.M. , Gler J., Deenen L.L. The effectof chain length and lipid transitions on the selective permeability properties of liposomes. Biochim. Biophys. Acta, 1975, v.406, N 2, p.187-196.

63. Bode Ch., Meinel A.< Hhe effect of storage at -8Q°G on the activities of cytoplasmic, mitochondrial and microsomal enzymes in rat liver. j. Clin. Chem. and Clin. Biochem., 1982, v.20, N I, p.9-13.

64. Brener j., Stucky w. Enzymaktivit&ten in serum and plasma vonmensc hund und ratte sowie dereh ver&nderungen beim aufbe-wahren des blutes. Z. Klin. Chem. lind Klin. Biochem. , 1975, V.I3, N 8, p.355-360.

65. Brown 1С. j. , Grabo B.C. , Graham E.F., Pace M.M. Some factorsaffecting loss of intracellular ehzymes from spermatosoa. Biol. Reprod., 1970, N 3, p.I4Q-I42.

66. Campbell T7*H. , Bernofsky C. Mitochondrial glucose-6-phosphatedehydrogenase from Saccharomyces cerevisial. Mol. and Cell. Biochem., 1979, v.25, N I, p.33-42.

67. Carter J.E. , Graham E.F., Eillehei K.S., Blacksher P.L. Theeffeot of high hydrostasic pressure and low temperatures on lactic dehydrogenase and glutamic oxalacetic transaminase. Cryobiology, 1971, v.8, N 5, p.524-534.

68. Carter J.E. , Risch S.J. , Graham E.F., Gillehei E.C. The effectof pressure and cooling rate on spermatosoa, kidney tissue and the whole kidney. Cryobiology, 1973, v.10, N 4, p.263-270.

69. Chalken j.E. , Pagano D., Detwiller Th.C. Regulation of platelet phosphorylase. Biochim. et Biohpys. Acta, 1975, v.403, N 2, p.315-325.

70. Chandry i.H. Does ATP cross the cell plasma membrane? Yale

71. J. Biol, and Med., 1982, v.55, N I, p.I-IG.

72. Chilson O.P., Costello G.A., Caplan N.O. Effect of freezing onenzymes. Fed. Proc., 1965, v.24, N 2, suppl.I5, p.55-65.

73. Colombo G., Tate Ph.W., Girotti A.W., Kemp R.G. interaction ofinhibitors with musle phosphofructokinase. J. Biol. Chem., 1975, v.250, N 24, p.9404-94I2.

74. Conclin j. , Dewey W. , May B. On the heterogeneity of lacticdehydrogenase. J . Histochem. , 1962, v.IO, N 3, p.365-367.

75. Costello L. , Kaplan N. Evidence for two forms of M-type lactamte dehydrogenase in the mouse. Biochim. Biohpys. Acta, 1963, v.74, N 4, p.658-663.!

76. Cox R.F., Baust j.G. Variations of the activity of kreatinekinase and Na-K-ATP-ase from myocardium after prolonged freezing. Cryobiology, 1978, v.15, N 5, p.530-536.

77. Crabo B.G. , Brown K.i. , Graham E.F. Effect of some bufferson storage and freezing of boar spermatozoa. j. Anim. Sci., 1972, v. 35, N 3, p.377-382.

78. Cryer A., Bartley W. The effect of storage on enzyme activities in tissues. Biocliem. j., 1974, v. 144, N 3, p.433-434.

79. Current Topics in Cellular Regulation / Eds. B.L.Horecker,

80. E.R.Stadtman. New York; Acad. Press, 1980, v.I6. - 322p.?

81. Darbyshire B. The influence of dehydratation on catalase stability: a comparison with freezing effects. Cryobiology, 1974, v. II, N 2, p.148-151.

82. Darbyshire B. The results of freezing and dehydratation of horse-radish peroxidase. Cryobiology, 1975, v.I2, N 3, p.276-281.

83. Darlymple R., Hamm R. Postmorten glycolysis in droimd skeletal muskle as influenced byprerigor freezing and subsequent thawing. Z,. Lebensmittel-Vntersuch. und Forsch., 1975, V.I58, N 6, p.333-339.

84. Daw A. , Farrant «I., Morris G.ji.s Membrane leakage of solutesafter thermal shock of freezing. Cryobiology, X973, v.10, N 2, p.126-133.

85. Doery j.C.G.i, Hirsh j. , de Gruchy G.C. Platelet glycolytic enzymes; effect of oellular disruption procedures on activity. Brit. J. Haematol., 1970, v.I9, N 2, p.I45-X53.

86. Dorn A. , Glockner R., Schmidt w« Enzymehistochemische untersucbunfen an isolierten organen und geveben. Acta Histo-chem. , 1975,suppl.15, p.147-148.

87. Drost-Hansen fir. Structure and functional aspects in interfacial (vicinal) water as related to membrane and cellular systems. Colloid. Int. CNRS, 1976, N 246, p.177-186.

88. Drost-Hansen w. Water at biological interfacial structuraland functional aspects. Phys. and Chem. Liquids, 1978, v.7 , N 3 , p.243—248.

89. Mg on the kinetics of human erythrocyte phosphofructolcina-se. j. Biochim», 1981, v.63, N I, p.61-65.

90. Foe L.G., Trujillo j.L. Quaternary structure of pip-live phosphofructokinase. J. Biol. Chem., 1980, v.255, N 21, p. p.10537-10541.

91. Fong B., Vial Ch., Gautheron B.C. intracellular and submitochondrial localization of pig heart hexokinase. FEBS Lett. 1975, V.56 , N I, p.24-29.

92. Fuller B.J. , Morris G.Y., Nutt L.H., Attehburrow V.D. Functional recovery of isolated rat hepatocytes upon thawing from -I96°C. Cryo-Letters, 1980, v.I, N 5, p.139-146.

93. Fung B.M., Wei Sh.Cy The effect of alkali and alkaline earthsalts on the structure and hydrated collagen fibers as studied by deuterium ШЕЦ Biopolimers, 1973, v.12, H $, p.1053-1062.

94. Glampietro 0. Evidence indirectly confirming that plasma glucose decreases on storage at -2G°C. J. Clin. Chem., 1981, v.af, N 8, p.1474-1475.

95. Graham E.F. , Расе M.M. Some biochemical changes in spermatozoadue to freezing. Cryobiology, 1967, v.2, N 4, p.75-84.

96. Gwerin j.F., Menezo Y., Czyda j.C. Modification of the dehydrogenase activities of human sperm after freezing in liquid nitrogen. Cryobiology, 1979, v.16, N 5, p.443-447.

97. Haard N.F. Membrane structure and cellular death in biological tissue. J. Food Sci., 1972, v.37, N 4, p.504-512.

98. DMSO on cultured beating cells at temperatures above zero. Cryobiology, 1973, v.10, N 3, p.244-250.

99. Hallak Gh.j., Wilkinson j.H. Action of metabolic inhibitorson the release of intracellular enzymes from human and rat lymphocytes and human erythrocytes. Clin. Ghim. Acta, 1976, V.66, N 2, p.251-261.

100. Hamm R., Masis D., Tetzlaff L. Einfluss des Gefrierens und

101. Auftauens auf die Subcellulare Verteilung der Asparat-Amino-transferase in der SkeXetmuskulatur Yarschiedener Gefliige-larten. Z. Lebensmittel-Vntersuch. und Forsch., 1971, v.147, N 2, p.71-76.

102. Hanson R.\f. Glycolysis and gluconeogenesis. j. Biochem.

103. Educ., 1981, N 3, p.89-91.

104. Heber V. Freezing injury and uncoupling of phosphorylationfrom electron transport in chloroplasts. Plant. Physiol., 1967, v.42, N 5, p.1343-1350»

105. Heber V. Freezing injury in relation to loss of enzyme activities and protection against freezing. Cryobiology, I96§ v.4, N 3, p.188-201.

106. Hechter 0. Role of water structure in the molecular organization of cell membranes. Fed. Proc., 1963, v.24, suppl. , p.891.

107. Hems D.A. , Brosnan У.Т. Effect of ischaemia on content of metabolites in rat liver and kidney in vivo. «i. Biochem. , I97Q , v.72 , N 4, p.221-226.

108. Henderson W.B. Cold injury and oxidative phosphorylation.

109. Cryobiology, I97Q, v.7, N &, p.581-582.

110. Hertz R. , Barenholz Y. Permeability and integrity propertiesof lecithin-sphingomyelin liposomes. Chem. and Phys. Lipids, I9T5, v.I5, N 2, p. 138-156.

111. Hesterberg L. , Lee J.C., Erickson H.Pw Structural propertiesof an active form of rabbit muscle phosphofructokinase. -j. Biol. Chem., 1981, v.256, N 18, p.9724-9730.

112. Hippel P. Neutral salt effects on the conformational stabilityof biological maoromolecules: model studies. Colloq. Int. CNRS, 1976, N 246, p.19-26.

113. Hogberg j., Orrenins S., Larson R.E. Lipid peroxidation inisolated, hepatocytes. Eur. j. Biochem., 1975, v.50, N 3, p.595-602.

114. Holt j.A.G. , Cancer a disease of defective glucose metabolism.

115. The energy for mitosis appears to come from a glutathion-mediated glycolysis. j. Med. Hypotheses, 1983, v.10, N 2, p.133-150.

116. Holten D., Procsal D., Chang H.-L. Regulation of pentose phosphate pathway dehydrogenases by NABP/NADPH ratios; Biochem. Biophys. Res. Communs, 1976, v.68, N 2, p.436-441.

117. Jacobasch G., Gerth Ch., Fabricius P.-G. Kontrolle der Glykolys del Magnasiummange 1: Untersuchungen an intarten Roten Blutzellen und H&molyzaten. Acta Biol, et Med. Germ., 1977, v.36, N 3-4, p.587-596.

118. Kattlove E.E. The effect of cold on platelets. 3.Adenine nucleotide metabolism after brief storage at cold temperature.- Blood, 1977, v.51, N 4, p.557-564.

119. Kemp E. Kidney preservation. I.fivaluation of perfusion andischemic damage. Scand. j. Urol, and Nephrol,, 1972, v.6, N 3, p.273-279.

120. Kemp E., Jacobsen i.A., Amtrup P. LDH release into perfusates of preserved kidneys. Scand. j. Urol, and Nephrol., 1976, V.IO, N 2, p.142-146.

121. Kemp R,G., Foe L.G. Allosteric regulatory properties of muscle phosphofructokinase. j. Mol. and Cell. Biochem., 1983, V,57, N 2, p.147-154.

122. Kemp R.G. , Tsai M.Y. , Colombo G. A kinetic model for phosphofructokinase bazed on the paradoxical action of effectors.- Biochem. Biophys. Res. Communs, 1976, v.69, N 3, p.942-948.

123. Khan A.W. , Davidkova E. van den Berg L. On cryodenaturationof chicken myofibrillar protein. Cryobiology, 1968, v.4, N 3, p.184-188.

124. Kliman Я.j., Steck Th.L. Association of glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase with the human red cell membrane. A kinetic analysis. J, Biol. Chem., 1980, v.255, N 7, p.6314—6321.

125. Koerner Th.A.\?. , Voll R.L. , Younathan E.Sv A proposed modelfor the regulation of phosphofructokinase and fructose-1,6-bisphosphatase based on their reciprocal anometriccpecificities, FEBS Lett.,uI977, v.84, N 2, p.207-213.

126. Kono N., Uyeda K, Cold labile phosphofructokinase. Biochem.

127. Biophys. Res. Communs, 1971, v.42, N 6, p.I095-II00.

128. ICrebs E.G., Gonzales C., Posner j.B. et al. Control of glycogen metabolism / Ed. 'tf.E.Whelan. London, Churchill, 1964. - 200 p.

129. Lessler M.A. , Jensen j.H., Bergron R.B. Effect of cryostorageon oxygen uptake and autograft viability of rat skin. -Cryobiology, 1973, v.10, N 2, p.185-189.

130. Levitt J. A sulfhydryl-disulfide hypothesis of frost injuryand resistance of plants. j. Theor. Biol., 1962, v.3, N 2 , p.355-391.

131. Levitt j. Cryochemistry of plant tissue protein interactios.- Cryobiology, 1966, v.3, N 3, p.243-251.

132. Levitt j. The multiplay nature of freezing injury. Crybiology, 1972, v.9, N 4, p.381-382.

133. Likhtenstein G.j. Tfater-protein*s interactions and the dynamic structure of the proteins. Colloq. int. CNRS, 1976, N 246, p.15-52.

134. Loecker W.D., Doms D., Stas M.L. , Verstreken j. Metabolicchanges in rat skin stored in buffer medium at -3°C. -Cryobiology, 1974, v.II, N 3, p.359-365.

135. Lovelock j.E. The denaturation of lipid-protein complexes asa cause of damage during freezing. Proc. Roy. Soc. London. Ser. Biol., 1957, v.147, N 907, p.427-433.

136. Madrid M.V., Gweierres j.R. , Martines V.Ii. Glycolysis as atool on study of energy metabolism regulation. Biochem. Soc. Trans., 1981, v.9, N 2, p.291-292.

137. Mandys V., Elleder M., Bartkova j., Cinatl j. Effect of coldadaptation on total enzyme activities of L-cells. j. Physiol. Bohemosl., 1982, v.3I, N 4, p.365-367.

138. Markert C.L. Lactate dehydrogenase isozymes:, dissociation andrecombination of subunits. Science, 1963, v.140, N 3573, p.1329-1330.

139. Mazur P. Physical and chemical basis of injury in single-celled microorganisms subjected to freezing and thawing. In: Cryobiology. London-New York, 1966, p.214-315.

140. McMillan V., Salford L.G. , Siesjo B.K. Metabolic state and blood flow in rat cerebral cortex, cerebellum and brainstem in hypoxic hypoxia. Acta Physiol. Scand., 1974, v.92, N I, p.IOI-113.

141. Medzihradsky F., Marks M.j. Measures of viability in isolatedcells. Biochem. Med.,1975, v.13, N 2, p.164-177.

142. Meisel A.E.F.H., Benson D., Scholte II. 11. The influence of freezing and freeze-drying of tissue specimens on enzyme activity. Histochemistry, 1977, v.51, N 4, p.297-303.

143. Q. Meisel P., Maul D. , Grisc A. Phosphofructokinase-mediated activation of glycolysis in vascular smooth muscle depending on adenylate pool. j. Scr. Med., 1975, v.48, N 6-7, p.405-412.

144. Meryman H.T. General principles of freezing and freezing injury in cillular materials. Ann. N.-Y.; Acad. Sci., I960, v.85, N 6, p.503-509.

145. Meryman H.T. Freezing injury and its prevention in living cells- Ann. Rev. Biophys. Bioenerg. , 1974, v.3, N 4, p.341-363.

146. Moore H.D.M., Hall G.A., Hibbitt K.G. Seminal plasma proteinsand the reaction of spermatozoa from intact boars and from boars without seminal vesicles to cooling. j. Reprodi and Fert., 1976, v.47, N I, p.39-45.

147. Mortimer D., Bramley T.A. Glutamicoxalacetic transaminase leakage from spermatozoa as an indicator of cryogamage. Arch. Androl., 1981, v.6, N 4, p.337-341.

148. Hagasue N. Release of lysosomal enzyme -glucuronidase afterhepatic cryosurgery. Arch. Surg., 1975, v.IIO, N 6, p.956-958.

149. Nakao M., Nakao T., Nagai F., Dogen M. Further investigationon ATP metabolism and red cell membrane integrity. Acta Biol, et Med. Germ., 1981, v.40, N 7-8, p.I0Q3-IQ08.

150. Noble N.A., Tnnaka К.Й., Myhre B.A., Johnson D.E. Red cellenzyme activity during blood storage and reactivation of phosphofructokinase. Amer. J. Hematol., 1982, v.I3, N I, p.1-8.

151. Nome j*E. , Hialmarsson S.G., Lindman В., Zeppezauer M. Anionbinding properties of human serum from halide ion quadrupole relaxation. j. Biochem., 1975, v.14, N 15, p.3401-3408.

152. Otto 1.1., Jacobasch G. , Rapoport S. A comparison of the influence of potassium and ammonium ions on the phosphofructokinase from rabbit muscle and rat erythrocytes. Eur. J. Biochem., 1976, v.65, N I, p.201-206.

153. Ouchi M. , Dohmoto Ch., Kamilcashi T. et al. Mitochondrial andcytosolic hexokinases in rat brain, with special reference to the change in experimental diabetes. j. Brain Res., 1975, v.98, N 2, p.410-414.

154. Pegg D.E», Trotman R.E. The praservation of bone marrow at-79°C. J. Clin, Pathol., 1959, v.I2, N 5, p.477-482.

155. Per J. Stability of plasma enzymes during storage. j. Clin.

156. Chem., 1967, N 13, p.416-422.

157. Persidsky M.D. Lysosomes as primary targets of cryoinjury.

158. Cryobiology, 1971, v»8, N 5, p.482-488.

159. Persidsky M.D. , Ellet M.H. Lysosomes and cell cryoinjury.

160. Cryobiology, 1971, v.8, N 4, p.345-349»

161. Pettigrew D.w* , Frieden C. Correlation of kinetic and structural properties of muscle phosphofructokinase. inj protein Structure, Function and Apply* FEBS 2-nd Meet., Dresden,1978. Oxford e.a., 1979, p.369-376.

162. Pettigrew , Frieden C. Rabbit muscle phosphofructokinase.

163. Polge C., Smith A.W* » Parker A.S. Survival of spermatozoa after vitrification and dehydratation and low temperatures. -Nature, 1949, v.164, p.666.

164. Pushkar N.S. , Shenberg M.G. , Oboznaya E.i. On the mechanismof cryoprotection by polyethylene oxide. Cryobiology, 1976, V.I3, N 2, p.142-146.

165. Rainer j., Engelgard M., Kraus E. , Rainer R. Reversible dissociation of glycolytic enzymes: kinetic studies on lactate dehydrogenase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and aldolase. Biochem. Soc. Trans., 1975, v.3, N 6, p.1051-1054.

166. Richter 0., Betz A., Giersch Ch. The responce of oscillatingglycolysis to perturbations in the NADH/NAB system: a comparison between experimens and a computer model. — J. Biol. Syst. , 1975, v.7 , N I, p. 137-146,.

167. Royt P.w* Partial characterisation and inactivation of membrane-bound. phosphofructokinase from Tetrahymena pyriformis. Biochim. Biophys. Acta, 1981, v.657, N I, p.148-152.

168. Salotra P.T., Singh V.N. Regulation of glucose metabolism inthe lung: hexokinase-catalyzed phosphorylation, a rate-limiting step. Life Sci., 1982, v.3I, N 8, p.291-294.

169. Scheck. R.My, Berden J.A. , Hooghiemstra R. , Slater E.G.- Subuhite interactions in rabbit muscle glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase as measured by NAD and NADU binding. -Biochim. Biophys. Acta, 1979, v.569, N 2, p.124-134.

170. Schofield L.D. , Hadfield i.M. Age-related alterations in theheat-lability of mouse liver glucose-6-phosphate dehydrogenase. J. Exp. Geront., 1978, v.13, N 3-4, p.147-157.

171. Sohrier S.L. Human erythrocyte enzymes; current status andclinical correlates. Blood, 1977, v.50, N 2, p.228-237.

172. Sharron A., Levitt J. The effect of cryoprotective agents onintermolecular S-S formation during freezing of thiogel. -Cryobiology, 1967, v.4, N 2, p.85-89.

173. Shikama It. , Vamaraki <1. Denaturation of catalase by freesingand thawing. Nature, 1961, v.190, N I, p.83-84.

174. Spieckermann P.G. , Gebhard M.M., Nordbeck H. Role of energymetabolism on enzyme retention. A study on isolated perfused canine hearts. Experientia, 1975, v.31, p.I046-IQ47.

175. Starkweather W.H. , Korpp L.E. , Spenser H., Likas P. The preservation of erythrocytes enzyme activity during freezing and thawing. Cryobiology, 1968, v.4, N 4, p.256-260.

176. Stifel F.B., Herman R.H. Role of isozymes in metabolic conrol.- Amer. «t> Clin. Nutr. , 1972, v.25, N 6, p.606-611.

177. Storey K.B., Baust «I.G. , Storey У.М. intermediary metabolismduring low temperature acclimation in the overwintering gall fly larva, Eurosta solidaginis. J. Сотр. Physiol., 1981, V.B144, N 2, p.183-190.

178. Susamu 0. Lipid mobility and function in biological membranes.

179. Experientia, 1973, v.29, N 2, p.249-251.206» Susamu 0. ATP and glycolytic enzymes in stored blood. Possible cause of phosphofructokinase inactivation during storage. -Bull. Yamagushi Med. Sch., 1973, v.20, N 3-4, p.139-153.

180. Thompson R.E. , Spivey H. , Katz A.«J. Rat liver cytoplasmic glucose-6-phosphate dehydrogenase* Steadystase kinetic properties and circular dichroism. Biochemistry, 1976,415, N 4, p.862-867.

181. Umminger B.L., Benzinger D., Levy S. in vitro stimulation ofhepatic glycogen phosphorylase activity by epinephrine and glucagon in the killifish, Fundulus heteroclitus. Comp'. Biochem. Physiol., 1975, V.C5I, N I, p.III-II5.

182. Ureta T., Bravo E., Babul j. Rat liver hexokinase during development. Enzyme, 1975, v.20, N 6, p.334-348.

183. W^nsel K.w., Kurganow B.i. , Zimmerman G. et al. Self-association of human erythrocyte phosphofructokinase. Kinetic behaviour in dependence on enzyme concentration and mode of asso ciation. Eur. j. Biochem., 1976, v.61, N I, p.I8I-I90.

184. Wkittam J.Hy, Rosano H.L. Effects of the freeze-thaw processon -amylase. Crybiology, 1973, v.IQ, N 3, p.240-243.

185. Wilkinson j.II. The escape of enzymes from cells. Spectrum,1975, v.131, N I, p.15-16.1

186. Wilkinson j.H., Robinson j.M. Effect of ATP on release of intracellular enzymes from damaged cells. Nature, 1974, v.249, p.662-663.

187. Yaroby G.K., Kasturi S.R. Kenkare V.W. Magnetic resonance study on. interaction of bovine brain hexokinase with manganese ion glucose-6-phosphate. Arch. Bioohem. Biophys. , 1981, v.211, N I, p.258-268.

188. Youdim М.В.Ы. , Woods H.F. The influence of tissue on metabolic processes and the properties of enzymes. Biochem. Pharmacol., 1975, v.24, N 3, p.317-323.

189. Yeh A.K. , Garubelli R. The inhibitory effect of halide ions nnhuman polymorphonuclear leucocyte neuraminidase. j. Mol. Med., 1976, V.I, N 3, p.265-27I.