Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние замораживания-отогрева и криопротекторов на структуру цитохрома Р-450 и содержащих его мембран

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние замораживания-отогрева и криопротекторов на структуру цитохрома Р-450 и содержащих его мембран"

г ~ ■* ъ п'

) I .Л , -

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТШТ ПРОБЛЕМ КРИОБДОЛОГИИ И КРЙЭМВДИЦИНЫ

На правах рукописи

ДГОКО Татьяна Станиславовна

ВЛИЯНИЕ ЗАТО РАЖИВАНИЯ-ОТОГРЕВА И КРЮПРОТЕКТОРОВ НА СТРУКТУРУ ЦИТОХРОМА Р-450 И СОДЕНЩИХ ЕГО МЕМБРАН

03.00.22 - криобиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Харьков - 1992

Работа выполнена в Институте проблем криобиологии и криомедицины АН Украины

Научный руководитель:

Научный консультант:

кандидат физ.-мат. наук, старший научный сотрудник

0.А.Нардид

доктор биологических наук, профессор

В.А.Моисеев

Официальные оппоненты:

доктор физ.-мат. наук, профессор

Ю.П.Благой кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Л.Ф.Розанов

Ведущая организация:

Институт фотобиологии АН Беларус г.Минск

Защита состоится ¡2." декабря 1992 г. в 75 час.^Лшн. на заседании Специализированного совета Д 016.60.01 по специальности "криобиология" в Институте проблем криобиологии и криомедицины АН Украины по адресу: 310015, г.Харьков, ул.Переяславская, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института проблем криобиологии и криомедицины АН Украины. Автореферат разослан

ноября 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного

совета, доктор медицинских наук Гольце;

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследование механизмов криорезистент-:ти и криоповреждений, поиск оптимальных условий криозащиты различных уровнях структурной организации биологических эектов является актуальной задачей современной криобиологии, отцей теоретическое и прикладное значение (В.И.Гриценко, ¡5).

Анализ многочисленных экспериментальных исследований здетельствует о том, что криоповреждение биологических мем-ш сводится в основном к нарушению взаимодействия между глав-ш структурообразующими элементами мембран - белками и ли-;ами (А.М.Белоус, В.А.Бондаренко, 1982). В то время как тер-шдуцированным структурным перестройкам липидного компонен-мембрал посвящено множество работ, влияние низких темпера) и криопротекторов на изменение структурно-функционального :тояния мембранных, в особенности, интегральных белков, ма-изучено. Сложность структурной организации природных мемб-I и, кал следствие этого, неоднозначность интерпретации по-1аемых результатов, позволяющие лишь косвенно оценить роль гегральных белков в реакции биомембран на действие замора-зания-отогрева и криопротекторов, диктует необходимость прогнил исследований на модельных системах. В качестве такой ¡темы нами были выбраны протеолипосомы, образованные фосфо-одами и интегральным микросомальным белком цитохромом Р-450 ! (КФ 1.14.14.1).

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изуче-) влияния замораживания-отогрева и низкомолекулярных крио-зтекторов на структурно-функциональное состояние изолированно и встроенного в искусственные мембраны цитохрома Р-450, гакже на структурное состояние искусственных фосфолипидных «брансодержащих цитохром Р-450.

В задачи работы входило:

- изучение влияния замораживания-отогрева на структурно-шциональное состояние изолированного цитохрома Р-450;

- изучение влияния замораживания-отогрева, а также глицери-(ГЛ), I,2-пропандиола (ПД) и диметилсульфоксида (ДМСО) на

зуктурно-функциональное состояние цитохрома Р-450 в составе

искусственных мембран из яичного фосфатидилхолина (ФХ) и ег смеси с фосфатидилсерином (ФХ+$С);

- изучение влияния замораживания-отогрева, солей и криоп текторов на структуру липидных бислоев, модифицированных ци хромом Р-450.

Научная новизна. Впервые установлено, что замораживани отогрев цитохрома Р-450 в растворе, содержащем глицерин,и в ставе ФХ-липоеом приводит к конформационным перестройкам бе ка, выражающимся в повышении полярности окружения его гемов' группы и снижении . структурной жесткости белковой глобулы. ] этом наблюдается также снижение каталитической активности ф' мента. Показано, что действие замораживания-отогрева на стр; турно-функциональное состояние мембраносвязанного цитохрома Р-450 зависит от состава среды инкубации и липидного окружи белка. Наибольшую ферментативную активность цитохром Р-450 проявляет после замораживания-отогрева в условиях высокой и< ной силы в липосомах, содержащих ФС. Обнаружено, что присутствие в бислое цитохрома Р-450 приводит к модификации взаим< действия искусственных мембран с низкомолекулярными кркопро' торами, которая выражается в увеличении площади поверхности объема неполярной области мембран. Наблюдаемые эффекты усугч ляются при замораживании-отогреве протеолипосом в средах, сс держащих исследованные криопротекторы.

Практическая ценность работы. Полученные экспериментал! ные данные найдут применение в разработке общей теории крио; щиты биологических объектов, в создании эффективных методов криопротекции биологических мембран и цитохрома Р-450, а та! в обосновании научных подходов к выбору основных компонент криозащитных сред.

Апробация работы. Основные положения и материалы дкссе{ тационной работы докладывались на конференциях молодых учень Института проблем криобиологии и криомедицины АН Украины (Хе ков, 1989,1991), У1 Всесоюзной конференции "Органические л минофоры и их применение в народном хозяйстве" (Харьков, 19£ УП Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Хар ■ков, 1991), 1У Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ и его аппаратурное обеспечение" (Москва, 1992), П Междунаро,п ной конференции "Успехи современной криобиологии" (Харьков,

Э92).

Публикации.По материалам диссертации опубликовано II ра-

)Т.

Структура и объем диссертации. Выполненные исследования зляются частью плановых научных работ Института проблем крио-юлогии и криомедицины АН Украины по теме: "Исследование влия-1Я температуры на структурное состояние изолированных и мемб-шосвязанных белков, в том числе в составе цитозоля и цито-селета, на физико-химические процессы в среде инкубирования на метаболизм в клетках с целью изучения криорезистентности ¡еточных структур" (шифр 2.2.6.9).

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, опи-1ния материалов и методов исследования, трех глав собствен-ix экспериментальных исследований, заключения, еыводов и шска цитируемой литературы, включающего 3/5 источников, юсертация изложена на странщах машинописного текста,

»держит рисунков и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цитохром Р-450, форму ЛМ2 выделяли из микросом печени ин-цированных фенобарбиталом кроликов по методу Наидсл, ¿ооя ( »76. Очищенные препараты белков имели удельное содержание ци-хрома Р-450, равное 17-18 нМ/мг белка и характеризовались ,ной полосой при электрофорезе в денатурирующих условиях.

В работе использовали яичный ФХ, ФС из мозга крупного ро-.того скота (Предприятие по производству бактерийных препара-в, г.Харьков), пирен ("¿etiía. пу Германия), 4-диметиламино-лкон (ДОХ), 4-( п -диметиламиностирил-(1-додецилпиридиний я-луолсульфонат (ДСП-12), Ti-терфенил (ПТФ) (" loncle г. га), глицерин ч.д.а. ("Реахим", г.Москва), I,2-пропандиол емеровское ПО "Хидпрсм"), фармакопейный препарат диметил-льфоксида. Криопротекторы перед использованием дополнительно ицали.

Бислойные протеолипосомы, содержащие цитохром Р-450 и сфолипиды (ФХ или его смесь с ФС, 4:1, вес.$), а также без-лковые липосомы, необходимые для контрольных экспериментов,

получали методом диализа с холатом натрия (А.А.Ахрем и др., 1988). Протеолипосомы имели средний диаметр 80-100 нм, а соотношение белок:липид в них составляло 1:500, 1:1000, М/М.

Эффективность ЛГ-деметилирования амидопирина цитохромом Р-450 определяли спектрофотометрически по методу JfciS'h& (1953).

Содержание цитохрома Р-450 в растворе и протеолипосомах рассчитывали из разностного спектра поглощения его карбокси-комплекса при 450 нм с коэффициентом экстинкции 91 мМ~^см~*.

Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометрах СФ-46 ("Л0М0", г.Ленинград) и Туе UniCCLlTL ЯР —8000 (Англия). Флуоресцентные измерения выполняли на спек1 рофлуориметрах Jiùicœài MPF-Zk и Ui+cichi У-4010 (Япония)

Замораживание-отогрев образцов объемом 1-3 мл со скорост: 150-200 °С/мин проводили быстрым погружением в азот в пластмассовых ампулах, отогрев - на водяной бане (40 °С) со средней скоростью ~40 °С/мин.

Эффективность тушения флуоресценции цитохрома Р-450 акри. амидом оценивали по методу Штерна-Фольмера (Дж.Лакович, 1986)

Для характеристики эмиссионного спектра флуоресценции ци тохрома Р-450, использовали параметры

l-(F51sÎFÎÉ5)zg6l J =fc/f/Fur)m A* J-Л, (:

Здесь Fur и Fief - штенсивность флуоресценции в спектре пр: длинах волн 315 и 365 нм соответственно, индексы при скобках ■ длины волн возбуждающего света; величина Л определяется триптофановой флуоресценцией цитохрома Р-450, а величина А характеризует вклад тирозиновых остатков в спектр при Л- = 31; нм (К.К.Туроверов и др., 1970; А.А.Ахрем и др., 1988).

Изменение площади поверхности мембран оценивали по перен су энергии между пиреном и ДСП-12, а изменение объема гидрофобной области мембран - по переносу энергии между ПТФ и пире ном, используя соотношения (Г.Е.Добрецов, 1989)

£м ^ £ti(FOXIFOM) [Fxib\ ln(Fxis>lТмзл) ( Fox!

Уо " (Рс») > (з)

7де , /ия - интенсивность флуоресценции донора в отсут-:твие и в присутствии акцептора , а индексы "о" и "м" отно-:ятся к немодифицированным и модифицированным мембранам соот-)етственно.

Статистическую обработку результатов производили по мето-¡у Фишера-Стьвдента на ЭВМ СМ-4.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние замораживания-отогрева на структурно-функциональные свойства изолированного цитохрома Р-450

Исследования, выполненные на; изолированном цитохроме Р-450 юказали, что в результате замораживания-отогрева происходит :нижение скорости ./У-деметилирования амидопирина после 1-, 3-[ 10-кратных циклов замораживания-отогрева (табл. I). При этом [аблюдался также рост содержания каталитически неактивной форы фермента - цитохрома Р-420.

Таблица I

Влияние замораживания-отогрева на активность цитохрома Р-450 в растворе

Количество циклов замораживал ия-отогрева Активность цитохрома Р-450, % к контролю Р

I 82+1,1 0,1

3 81+1,3 0,1

10 72 + 0,5 < 0,05

Анализ первых производных спектров поглощения цитохрома -450 в области Соре показал, что после замораживания-происхо-ит их смещение в крротковолновую область и снижение интенсив-ости, что отражает изменение микроокружения активного центра, 5условленное увеличением доступности гема цитохрома Р-450 ра-

створителю (Д.И.Метелица, 1982) (рис. I).

Замораживание-отогрев изолированного цитохрома Р-450 приводят к длинноволновому смещению максимума его спектра флуоресценции, причиной которого Х,нм является снижение вклада тиро-зиновой флуоресценции в суммарный эмиссионный спектр (табл.2). Поскольку положение, интенсивность и форма триптофановой флуоресценции при этом не изменились, наблюдаемое тушение тирозиновой флуоресценции мы Рис. I. Первые производные связываем с повышением доступ-спектров поглощения изолиро- ности растворителю поверхност-ванного цитохрома Р-450 после ных индольных групп в результа-

I- (---), 3- (------) и Ю- те вызванного замораживанием-

кратного (-•• — • ) заморажи- отогревом конформационного из-вания-отогрева. менения белка. Косвенным дока-

зательством снижения структурной устойчивости фермента после замораживания является также обнаруженное увеличение его доступности денатурирующим агентам - перекиси водорода и мочевине. В то же время, после замораживания доступность белковых хромофоров изолированного цитохрома Р-450 нейтральному динамическому тушителю - акриламиду не изменилась (рис. 2), что может быть следствием изначальной доступности акриламиду тех поверхностных остатков, которые не тушатся водой до замораживания белка.

Таким образом, проведенные исследования показали, что наблюдаемое в результате замораживания-отогрева снижение ферментативной активности цитохрома Р-450 в растворе сопровождается изменением его конформационного состояния, проявляющегося в увеличении доступности и полипептидной частей белковой глобулы растворителю.

о 8 16 гь С*ю*М

Рис. 2. Графики Штер-на-Фольмера тушения флуоресценции цитохрома Р-450 акриламидом в растворе (о в ), в ФХ- ( Д а ) и в ФХ+ФС-лилосомах (ПН). Заштрихованные обозначения относятся к замораживанию-отогреву.

Таблица 2.

Влияние замораживания-отогрева на форму и положение спектров флуоресценции цитохрома Р-450 в растворе и мембранах

Среда Я % ■Л макс.фл.,нм

Д Авозб.= 280 нм Лвозб.= 296 нм

Трис-буфер 0,92 1,86 0,94 324,5 334,0

* 0,92 1,80 0,86 325,5 334,0

ФХ-липо-сомы 1,00 2,46 1,46 315,2 332,4

* 0,94 2,41 1,47 315,5 332,4

ФХ+ФС-ли-посомы 0,89 2,93 2,04 314,0 332,1

* 0,88 2,80 1,92 315,0 332,1

Примечание: * - после замораживания-отогрева. Среда инку-

бации - 30 мМ трис-буфер, рН 7,4.

Влияние замораживания-отогрева и криопротекторов на структурно-функциональные свойства цитохрома Р-450 в составе искусственных мембран

Перевод цитохрома Р-450 в липидное окружение сопровождается увеличением его ферментативной активности, что характерно для мембранных белков (Д.И.Метелица, 1982). Нами установлено, что активность мембрано-связанного фермента находится в зависимости от ближайшего липид-ного окружения и ионной силы среды инкубации. Повышение мо-лярности трис-буфера от 10 до 90 мМ оказывало стимулируицее воздействие на ферментативную активность мембрановстроенного цитохрома Р-450 (рис. 3). Наблюдаемый эффект может быть обусловлен усилением под влиянием ионной силы гидрофобных взаимодействий в области активного центра цитохрома Р-450 (Л.М.Рай-хман и др., 1973), повышающих его сродство к субстрату I типа

- амидопирину. Характер влияния замораживания-отогрева на активность цитохрома Р-450 в осно! ном зависел от липидного окружения фермента и в меньшей степеш

- от ионной силы среды. Наибольшую каталитическую активность цитохром Р-450 проявлял при за-

ьОП к 11

0,16 0,1*1 0,12 010 ооа ■ 0,06 0,01,

70 90 ,-Зц

10 50 50

[Грие-буферУ 10~'М Рис. 3. Влияние замораживания-отогрева в условиях различной ионной силы на активность цитохрома Р-450 в ФХ- (о •) и в ФХ+ФС- (л а ) липосомах. Заштрихованные обозначения относятся к за-

мораживанию-отогреву.

мораживании-отогреве в условиях высокой (70-90 мМ) ионной сши в липосомах, содержащих ФС. По-видимому,•замораживание-отогре! индуцируют в ФХ4ФС-липосомах перестройки, приводящие в итоге ] формированию более каталитически активной конформации фермент)

В результате замораживания-отогрева мембрановстроенного цитохрома Р-450 его спектры поглощения претерпевают коротко-

юлновый сдвиг, а спектры флуоресценции белка смещаются в длинноволновую сторону, что обусловлено, как и в случае раст-юримого фермента,повышением полярности микроокружения гемо-юй области фермента и увеличением доступности растворителю юлипептидной цепи глобулы (табл. 2). При этой, замораживание-логрев цитохрома Р-450 в липосомах приводит к повышению до-¡тупности его тирозиновых хромофоров акриламиду. Низкотемпе-затурное воздействие также снижает устойчивость мембраносвя-¡анного цитохрома Р-450 к денатурирующему воздействию переки-:и водорода и мочевины.

Наблюдаемое в результате действия замораживания-отогрева увеличение доступности растворителю гемовой и белковой частей иодированного и мембрановстроенного цитохрома Р-450 позволя-5Т предположить, что механизмы воздействия замораживания-отогрева на конформацию фермента в растворе и в составе мембран адеют одинаковую природу и проявляются в его "разрыхлении".

Таблица 3

Влияние криопротекторов и замораживания-отогрева на ферментативную активность цитохрома Р-450 в ФХ-липосомах

Криопротектор Активность цитохрома Р-450, % к контролю

До замораживания После замораживания

Контроль 100,0+ 4,9 87,8 + 9,8

+ 10 % ГЛ 173,2 + 19,5 161,0 + 14,9

+ 20 % ГЛ 173,2 + 16,4 163,4 + 12,2

+ 10 % ПД 158,5 + 24,2 148,8+ 4,9

+ 20 % ПД 212,2 + 30,9 153,7 + 12,3

+ ю% дасо 90,2 + 14,6 92,7 + 6,0

Исследование влияния криопротекторов на каталитическую штивность нембраносвязанного цитохрома Р-450 показало, что ГЛ 1 ПД при добавлении в среду инкубации протеолипосом в кркоза-цитных концентрациях, способствуют ее повышению, в то время сак дасо несколько снижал активность фермента (табл. 3). За-лораживание-отогрев в средах, содержащих ГЛ и ПГ, приводили к :нижению каталитической активности фермента, которая, однако, оставалась выше контрольных значений. В то же время, в присут-

ствии ДМСО дополнительного снижения активности фермента после замораживания не происходило.

В присутствии криопротекторов спектры поглощения цитохро ма Р-450 в области Соре смещадтся в длинноволновую сторону и наблюдается повышение их интенсивности, что связывают с эффектом снижения полярности растворителя ( Н.Лейп 1980). Исследуемые криопротекторы оказывают также влияние на положение и форму спектров флуоресценции мембрановстроенного цито-хрома Р-450, что выражается в увеличении вклада триптофановой флуоресценции в суммарный эмиссионный спектр (табл. 4). Замо-

Таблица 4

Влияние криопротекторов и замораживания-отогрева на форму и положение спектров флуоресценции цитохрома Р-450 в ФХ-липосомах

Воздействие Л Л А Лмакс.фл., им

-Хвозб.= 280 нм Явозб.= 296 нм

Контроль 0,94 2,41 1,47 315,5 332,4

* 0,93 2,38 1,45 315,8 332,5

+ 20 % ГЛ 1,07 2,53 1,46 316,2 332,3

* 1,08 2,56 1,48 317,0 332,4

+ 20 % ПД 1,09 2,52 1,43 317,5. 332,5

* 1,07 2,30 1,23 319,1 332,5

+ 20 % ДОС0 1,Г2 2,51 1,39 316,2 332,3

* 1,15 2,44 1,29 316,5 332,1

Примечание: * - после замораживания-отогрева.

раживание-отогрёв цитохрома Р-450 в присутствии ГЛ не приводит к существенному изменению микроокружения хромофорных остатков мембраносвязанного белка. Анализ формы спектров флуоресценции показал, что наблюдаемое длинноволновое смещение суммарных эмиссионных спектров цитохрома Р-450 (Явозб. = 280 ни) в результате замораживания-отогрева в средах, содержащих ПД и ДЛСО, обусловлено преимущественно снижением вклада тиро-зиновой флуоресценции. Наблюдающееся также при этом увеличение доступности белковых хромофоров акриламиду позволяет пре,

оложить, что в этом случае происходит повышение доступности итохрома Р-450 растворителю, аналогичное наблюдаемому при амораживании-отогреве без криопротекторов.

Влияние замораживания-отогрева, криопротекторов и солей на структурное состояние искусственных мембран, модифицированных цитохромом Р-450

Обнаруженные изменения конформационного состояния цито-эома Р-450 под влиянием состава среды инкубации и заморажива-дя-отогрева позволили предположить, что эти изменения могут сазывать влияние на структурное состояние бислоя, содержаще) цитохром Р-450. Для проверки этого предположения нами было хзведено исследование влияния замораживания-отогрева, крио-хзтекторов и солей на структурное состояние липосом, содер-ицих цитохром Р-450, с использованием флуоресцентных зондов.

Исследование поверхностной области протеолипосом с помо-.ю флуоресцентного зонда ДОС показало, что замораживание-'огрев приводят к нарушению упаковки поверхности бислоя, «являющейся в увеличении коэффициента поляризации и повы-нии гидрофобности микроокружения ДОХ (табл. 5). Присут-вие ПД в среде инкубации протеолипосом также приводит к по-шению гидрофобности микроокружения зонда. Сравнительный ана-з спектров возбуждения и флуоресценции зонда в липосомах и отеолипосомах показал, что в присутствии ПД в протеолипосо-х уменьшены количество и подвижность молекул воды, прони-ющих в слой карбоксильных групп жирнокислотных остатков ли-цов. Одним из возможных механизмов этого явления может быть иенение конформации белка, приводящее к формированию водного протекторной "шубы" на поверхностных участках бислоя, эужающих белок, которая препятствует проникновению воды в хасть карбоксильных групп.фосфолипидов.

При исследовании площади поверхности и объема неполярной ¡асти бислоя методом индуктивно-резонансного переноса энер-1 между локализующимися в различных областях бислоя парами )ен - ДСП-12 и ПТФ - пирен установлено, что при заморажива-1-отогреве протеолипосом площадь поверхности мембран существо не изменяется (табл. 6). В то же время, добавление к 'теолипосомам криопротекторов ГЛ, ПД и ДОСО приводит к уве-

Таблица 5

Влияние замораживания-отогрева и I,2-пропандиола на спектральные характеристики ДМХ в ФХ-липосомах и протеолипосомах, образованных ФХ и цитохромом Р-450**

Воздействие Интенсивность флуоресценции Я м, отн. ед. Коэффициент поляризации Р Полуширина спектра флуоресценции, нм /""497//"540 Положение максимума спектра флуоресценции ^м,нм

Липосомы

Контроль 1,000+0,005' 0,066+0,001 92,5+0,25 0,73 532

* 1,090+0,008 0,094+0,002 95,0+0,61 0,74 532

+ 10 % цд 0,918+0,006 0,091+0,010 90,0+0,12 0,69 534

* 0,843+0,009 0,103+0,004 90,0+0,12 0,68 534

Протеолипосомы Контроль 0,902+0,001 0,041+0,008 88,0+0,52 0,67 535

* I,02+0,004 0,088+0,017 96,5+0,14 0,79 527

+ 10 % пд 0,839+0,008 0,077+0,003 97,5+0,12 0,73 531

* 0,811+0,003 0,048+0,006 100,0+0,02 0,65 535

Примечания: * - после замораживания-отогрева.

** - липосомы и протеолипосомы формировали в среде: 10 мМ трис-буфер +

I мМ ЭДГА + 5 мМ МдС1-2, рН 7,4. Различия по отношению к контроль— —........... —„„„„„„„, ги л п^

Таблица 6

Влияние замораживания-отогрева и криопротекторов на структуру ФХ-липосом и протеолипосом, образованных ФХ и цитохромом Р-450

Воздействие $м Яо Ум V,

Липосомы

Контроль * + 20 % ГЛ * + 20 % ПД * + 20 % ДМСО * 0,64 0,68 0,62 0,60 0,61 0,72 0,61 0,62 0,27 0,43 0,36 0,37 0,34 0,22 0,42 0,32 I 0,82 1,07 1,20 1,14 0,89 1,10 1,05 I 0,59 0,84 0,76 0,90 1,34 0,64 0,92

Протеолипо-сомы

Контроль 0,69 0,47 I I

* 0,73 0,35 0,96 " 1,40

+ 20 % ГЛ 0,65 0,42 1,П 1,23

-* 0,74 0,34 0,94 1,62

+ 20 % ПД 0,58 0,30 1,30 1,24

* 0,63 0,27 1,22 1,94

+ 20 % дасо 0,62 0,30 1,23 1,24

* 0,62 0,26 1,20 2,02

Примечания: Еу и Е^ - эффективность переноса энергии между донорно-акцепторннми парами пирен-ДСП-12 и ПТФ-пирен соответственно; * - после замораживания-отогрева.

¡ичению как площади поверхности, так и, в особенности, объема, занимаемого неполярной областью бислоя. Это показывает, что существенная модификация биомембран происходит уже на этапе их эквилкбрации с низкомолекулярными криопротекторами. Причем, определяющую роль во взаимодействии криопротекторов с бислоем <грает наличие в последнем интегрального белка. Наименьшее де-

стабилизирующее влияние на бислой протеолипосом окалывал ГЛ, а наибольшее - ПД и ДОСО.

Одной из причин нарушения белок-липидных взаимодействий в биологических мембранах может быть также концентоитгавание солей при вымерзании воды ( УГ-Н.ШМгт, 1УГЖпке%± Д977). Проведенное нами исследование влияния 30-минутной экспозиции протеолипосом в растворах, содержащих высокие концентрации ЛСС и №№ на состояние бислоя с использованием пирена и переноса энергии между локализующейся в области углеводородных цепей липидов парой ПТФ-пирен показало, что в концентрированных солевых растворах возрастает микровязкость бислоя; наиболее выражен этот эффект в средах, содержащих ХСС . Кроме того, в протеолипосомах обнаружено изменение монотонного хода зависимостей коэффициента эксимеризации пирена и эффективности индуктивно-резонансного переноса энергии с ПТФ на пирен в области концентраций солей 1,2-1,6 М. Сопоставление этих данных с результатами, полученными Е.Д.Розановой (1984), показавшей, что 1,35 М КС£ и 1,4-1,5 М ШС1 вызывают необратимый конформационный переход изолированного лилопротеинового комплекса цитохромоксидазы, переводящий ее в более криолабильное состояние позволяет предположить, что в наших экспериментах цитохром Р-450 претерпевает аналогичный переход.

Таким образом, полученные в работе результаты позволили ■сопоставить структурные и функциональные изменения изолированного и мембрановстроенного цитохрома Р-450 при замораживании в средах различного состава и найти связь наблюдаемых изменений с процессами, происходящими при этих воздействиях в липид-ном бислое, модифицированном цитохромом Р-450.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что замораживание-отогрев изолированного

и встроенного в ФХ-липосомы цитохрома Р-450 приводит к снижении его ферментативной активности. Увеличение.ионной силы среды инкубации протеолипосом до 70-90 мМ трис-буфера способствует сохранению активности цитохрома Р-450 в процессе замораживания-отогрева.

2. Присутствие глицерина, 1,2-пропандиола и диметйлсульфок'

сида в среде инкубации протеолипосом приводит к меньшему инги-бированию активности фермента в результате замораживания-отогрева по сравнению с замораживанием без криопротекторов.

3. Показано, что замораживание и последующий отогрев ци-тохрома Р-450 в растворе и в составе ФХ-липосом приводит к изменению конформации белка, сопровождающейся повышением полярности окружения гемовой группы и увеличением доступности растворителю полипептидной цепи глобулы. Аналогичные изменения структурного состояния полипептидной цепи цитохрома Р-450 наблюдались при замораживании в присутствии исследованных криопротекторов.

4. Замораживание-отогрев протеолипосом, образованных цито-хромом Р-450 и ФХ, не оказывает существенного влияния на площадь поверхности искусственных мембран, в то же время повышая объем их гидрофобной области.

5. Установлено, что присутствие в среде инкубации протеолипосом глицерина, I,2-пропандиола и диметилсульфоксида приводит к увеличению площади поверхности и объема неполярной области липидного бислоя. Наиболее выраженным этот эффект был при замораживании-отогреве протеолипосом в присутствии криопротекторов.

6. Обнаружено, что инкубация протеолипосом, содержащих в качестве белкового компонента цитохром Р-450 при комнатной температуре в растворах, содержащих ш и мсе , приводит к возрастанию микровязкости гидрофобной области бислоя, более выраженной в средах, содержащих KCl.

СПИСОК работ, опубликованных по теме диссертации

1. Дюбко Т.С., Горбенко Г.П., Нардид O.A., Моисеев В.А. Исследование влияния цитохрома Р-450 на структуру липидного бислоя с помощью флуоресцентных зондов//У1 Всесоюзная конфер. "Органические лшинофоры и их применение в народном хозяйстве": Тез. докл.- Харьков, 1990.- С. 56.

2. Дюбко Т.С., Нардид O.A., Моисеев В.А. Исследование влияния I,2-пропиленгликоля на липид-белковые взаимодействия в искусственных мембранах с использованием 4-диметиламшохалкона// УГ Всесоюзная конфер. "Органические лшинофоры и их применение

в народном хозяйстве": Тез. докл.- Харьков, 1990.- С. 81.

3. Горбенко Г.П., Дюбко Т.С., Нардид O.A., Моисеев В.А. Исследование взаимодействия цитохрома Р-450 с фосфолипидами методом флуоресцентной спектроскопии// Биополимеры и клетка.-

1991, № I.- С. 52-5-1.

4. Горбенко Г.П., Дюбко Т.С., Нардид O.A. Влияние криопро-текторов на липид-белковые взаимодействия в модельных системах// Физико-химические процессы в криобиологических системах/Сб. научных тр.- Харьков, 1991,- С. 14-19.

5. Дюбко Т.С., Нардид O.A. Влияние ионной силы и липидного состава на каталитическую активность нативного и замороженного цитохрома Р-450//Физико-химические процессы в криобиологических системах/Сб. научных тр.- Харьков, 1991.- С. 31-39.

6. Дюбко Т.С., Нардид O.A., Моисеев В.А. Влияние замораживания на собственную флуоресценцию цитохрома Р-450 в протеоли-посомах различного состава//УП Всесоюзная конференция по спектроскопии биополимеров: Тез. докл.- Харьков, 1991.- С. 89.

7. Дюбко Т.С., Горбенко Г.П., Нардид O.A. Действие замораживания и проникающих криопротекторов на структуру протеолипо-сом//П-я Международная конференция "Успехи современной криобиологии": Тез. докл.- Харьков, 1992.- С. 62-63.

8. Нардид O.A., Репина C.B., Дюбко Т.С. Исследование влияния замораживания-отогрева на конформацию мембраносвязанных белков методом собственной флуоресценции//П-я Международная конференция "Успехи современной криобиологии": Тез. докл.- Харьков

1992.- С. 124.

9. Дюбко Т.С., Нардид O.A. Влияние цитохрома Р-450 на свойства липидного бислоя при воздействии замораживания и I,2-пропиленгликоля//Действие холода на биологические объекты/Сб. научн. тр.- Киев: Наукова думка, 1992.- С. 5-9.

10. Дюбко Т.С., Горбенко Г.П., Нардид O.A. Исследование вза имодействия криопротекторов с модельными мембранами методом ~ флуоресцентных зондов//1У Всес. совещание "Люминесцентный анализ в биологии и медицине и его аппаратурное обеспечение": Тез. докл.- Москва, 1992.- С. 15.

11. Нардид O.A., Дюбко Т.С., Моисеев В.А. Исследование влия ния замораживания и органических добавок на флуоресценцию цитохрома Р-450 в мембранах из ДМФХ//1У Всес. совещание "Люминес-

1ТКЫЙ анализ в биологии и медицине и его аппаратурное обес-шше": Тез. докл.- Москва, 1992.- С. 16..

Ответственный за выпуск академик АН Украины, директор ИПКиК АН Украины В.И. Грищенко

до. к печ. 18.11.1992 г. Формат 60x84 1/16 Усл.печ.л.1,0 чать офсетная. Тираж 100 экз. ' Зак. №165.

печатано на ротапринте ФТИНТ АН Украины, Харьков, пр.Ленина,