Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Факторы, регулирующие поглощение и биотрансформацию ксенобиотика p-нитроанизола в свежевыделенных и криоконсервированных гепатоцитах крыс

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Автореферат диссертации по теме "Факторы, регулирующие поглощение и биотрансформацию ксенобиотика p-нитроанизола в свежевыделенных и криоконсервированных гепатоцитах крыс"

Работа выполнена в Институте проблем криобиологии и криомедицины Академии наук Украины

Научный руководитель: член-корреспондент АН Украины А.М.БЕЛОУС

Научный консультант: кандидат биологических наук А.Ю.ПЕТРЕНКО

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

В.В.ЛЕМЕИКО

доктор биологических наук, профессор

В.И.ЛУГОВОЙ

Ведущая организация: Научно - исследовательский институт фармакологии и токсикологии МЗ УССР, г.Киев

Защита состоится "''/ 1В91 года в " чаиов

на заседании специализированного совета Д 016.60.01 при Институте проблем криобиологии и криомедицины АН УССР (310015, Харьков-15, ул Переяславская, 23).

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Института проблем криобиологии и криомедицины АН УССР

Автореферат разослан

^^^ 1991 года

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук

А.Н.ГОЛЬЦЕВ

общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время изолированные клетки печени находят все более широкое применение в фундаментальных и прикладных областях биологии и медицины. Сохраняя селективные свойства плазматической мембраны и интактность внутриклеточных структур, изолированные гепатоцнты адекватно отражают специфические реакции целого органа CThurman R.G., Kauffnan F.C., 1980]. Их использование в фармакологии и токсикологии позволяет не только изучать особенности метаболизма лекарственных и токсических соединений, но одновременно и определять их цито- и гепатотоксичность CFerro М. et al,19843.

В последнее время интенсивно разрабатываются также вопросы применения изолированных гепатоцитов в клинике для коррекции патологических состояний, вызванных нарушениями функционального состояния печени СОстороверхов Т.Е., 1979; Matas A.J. et al, 19763. В связи с этим становится весьма актуальной проблема направленной регуляции поглощения и биотрансформацни ксенобиотиков, поскольку интенсификация в клетке этих процессов будет способствовать повышению детоксикационных свойств гепатоцитов. В литературе содержится достаточно иного сведений о регуляторном влиянии на метаболизм ксенобиотиков гормонов CFrolkis V.V., Valueva G.V., 1.978; McGeoch С. et al,19853, индукторов СЛяхович В.В.,Цырлов Н.Б.,1981; Conney А.Н., 19863, факторов питания CThurraan R.G., Kauffman F.C., 1980; Alvares А.Р. et al, 1976; Schwass D.E., Finley J.W., 19853, биологически активных соединений [Тиунов Л.А., 1981; Лукиенко П.И. и др., 19873. Однако целенаправленных исследований в этой области не проводилось, а вопросы регуляции поглощения ксенобиотиков практически не изучены.

Наиболее перспективным решением проблемы хранения изолированных клеток печени на данный момент является создание банка криокон-сервированных гепатоцитов. В литературе освещаются вопросы подбора адекватных режимов замораживания-отогрева CFuller B.J. et al, 1980; Gonez-Lechon M.J. et al, 19S43, соответствующих криопротекторов CPowis G. et al, 1987; Chesne C., Guillouzo A., 19883 и сред замораживания CCoundouris J. et al, 1986; Maganto P. et al, 19883. В деконрервированных клетках обычно определяют сохранность плазматической мембраны, белок-синтезирующей активности CGomez-Lechon M.J. et al, 1984; De Loeoker R. et al, 1990], систем глюконеогенеза

CInnes G.К. et al, 19883 и синтеза мочевины CMaganto P. et al, 1988], способности приживляться в культуре CRijntjes R.J.H. et al, 1985; Innés O.K. et al, 19881. В то же время вопросы влияния крио-консервирования на детоксикационные свойства гепатоцитов, которые играют определяющую роль при использовании этих клеток в медицинской практике, изучены в недостаточной мере.

Б сбяэи с этим целью настоящей работы явилось исследование биотрансформации и поглощения ксенобиотика р-нитроакизола (р-НА) изолированными гепатоцитами крыс в зависимости от исходного состояния животного и метода получения клеток, а также изучение действия кпиоконсервирования на детоксикационную способность клеток печени.

В конкретные задачи исследования сходило:

1. Изучение основных характеристик и определение скорость-лимитиру-ющих стадий биотрансформации ксенобиотика р-НА в изолированных гепатоцитах крыс в зависимости от исходного состояния животного (пол, условия питания) и метода выделения клеток.

2. Исследование поглощения и биотрансформации р-НА в гепатоцитах крыс в норме и после введения индуктора фенобарбитала и определение кинетических характеристик этих процессов.

3. Исследование влияния замораживания-отогрева в среде без криопро-тектора на о-деметилирование р-нитроаниэола изолированными гепа-тоцигани. Проведение сравнительного изучения О-деметилазной активности замороженно-отогретых и пермеабилизированных клеток Печени.

4. Изучение действия отдельных этапов криоконсервирования на биотрансформаци") р-НА гепатоцитами крыс и выявление основных причин нарушения детоксикационной активности.

Научная новизна. В работе впервые исследованы кинетические параметры и скорость-лимитирующие стадии метаболизма ксенобиотика "р-НА гепатоцитами крыс б зависимости от исходного состояния животного и метода выделения клеток. Максимальная активность биотрансформации р-НА обнаружена в гепатоцитах сытых самцов крыс.

Параллельно с биотрансформацией впервые изучался процесс поглощения ксенобиотика р-НА в норме и после введения индуктора фенобарбитала. Установлено, что введение фенобарбитала увеличивает способность клеток печени поглощать и метаболизировать ксенобиотик, а скоросгь-лимитирующим фактором в этом случае является содержание восстановительных эквивалентов. Сравнение кинетических параметров

поглощения и биотраксформации р-Нй показало, что процесс поглощения не лимитирует дальнейшего метаболизма ксенобиотика.

Выяснено, что снижение детоксикационной активности криоконсер-вировашшх гепатоцитов не связано с потерей или инактивацией цито-хрона Р-450. Сравнительная оценка Функциональней активности свежо-выделенной и деконсервированной суспензии гепатоцитов с одинаковой жизнеспособностью, полученной в результате разделения клеток в градиенте плотности перколла, позволила установить, что после крио-консервирования клетки обладают повышенной чувствительностью к изотермической инкубации в присутствии ксенобиотика.

Теоретическая и практическая значимость. Проведенные исследования позволяют рекомендовать для наиболее эффективного использования изолированных гепатоцитов в медицинской практике с целью детоксика-ции крови больных применение клеток, выделенных из печени сытых самцов, а также полученных от яивотных, подвергнутых действию индуктора фенобарбитала.

Введение цитрата в среду перфузии оказывает стимулирующее воздействие на монооксигенаэную активность изолированных гепатоцитов, если скорость-лимптируюаши фактором биотрансформирующей активности является содержание в клетке восстановленного НАДФН.

Эксперименты по функционированию детоксикационной системы гепатоцитов после криоконсервирования в присутствии различных криопро-текторов позволяют сделать вывод о преимуществах использования глицерина, так как это позволяет избежать этапа отмывки от криопротектора.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Детоксикационная активность изолированных гепатоцитов зависит от исходного состояния животного (пола, условий питания, введения индуктора) и может быть дополнительно увеличена включением цитрата в среду выделения клеток. Введение индуктора фенобарбитала стимулирует не только биотрансформацию, но и поглощение ксенобиотика р-нитроанизола.

2. Криоконсервирование гепатоцитов под защитой глицерина или ДМСО позволяет в значительной степени сохранить жизнеспособность и биотрансформирукодук; активность суспензии изолированных клеток печени, использование глицерина позволяет исключить этап отмывки от криопротектора.

Апробация работы. Материли диссертационной работы докладывались и обсуждались на конференциях молодых ученых Института проблем

криобиологии и криомедицины АН УССР (Харьков, 1989, 1931 гг) и Всесоюзной научной конференции "Актуальные проблемы лекарственной токсикологии" (Купавна, 1990 г).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 печатных работы.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на страни-

цах машинописного текста, состоящего из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, четырех глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Содержит 13 таблиц и 22 рисунка. Список использованной литературы включает ПО наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Эксперименты проводили на половозрелых самцах и самках крыс линии Вистар весом тела 200-300 г. Исследовались 3 группы животных: 1 - сытые контрольные самцы и самки; 2 - животные, голодавшие в течение 48 часов со свободным доступом к воде; 3 - сытые самки крыс, которым вводился внутрибрюиинно фенобарбитал в дозе 40 мг/кг веса тела в точение 3-х дней.

Объектом . исследования служили с вехе выделенные гепатоциты и микросомы печени крыс.

Изолированные клетки печени получали неферментативным методом ГПетренко А.Ю. и др., 19893 и методом коллагенаэной перфузия по Сеглену CSeglen Р., 19763, Жизнеспособность полученной суспензии определяли по способности клеток исключать витальный краситель три-пановый синий CSeg^n Р., 19763. Концентрацию суспензии определяли по стандартной методике с подсчетом в камере Горяева СНеменова Ю.М., 19723.

Микросомы выделяли по методу дифференциального центрифугирования Арчакова-Каруэиной СКарузина И.И., Арчаков А.И., 19773.

Замораживание изолированных клеток и микросом в среде выделения осуществляли в полиэтиленовых пробирках объемом 1 мл путем быстрого погружения в жидкий азот, скорость замораживания 300-400 град/мин. От трев производили на водяной бане при 40° С со скоростью отогрева 400-500 град/мин.

Криоконсервацию клеток проводили следующим образом. К исходной свежевыделенной суспензии гепатоцитов при 0"С медленно добавляли равный объем . среды замораживания с криопротектором в конечной

концентрации 1,4 И. В качестве криопротехтора попользовались диметглсульфоксид (ДИСО), глицерин, диметилацетамид (ДМАЦ) и 1,2-пропандиол.

Суспензию клеток с криопротектором подвергали быстрому дяух-ступенчатому замораживанию-отогреву -196° С с остановкой при

-20т-25 С в течение 20 минут. Образцы отогревали на водяной бане при 37°С. Скорости охлаждения и отогрева контролировали с помощью медь-константовой термопары.

Для отделения интактных клеток от поврежденных суспензию деконсервированных гепатодитов разделяли в градиенте плотности .перколла CBerry М.Н. et al, 13623

Содержание цнтохрома Р-450 определяли по методу дифференциальной спектроскопии COmura Т., Sato R., 1064] на регистрируют м двух-лучевом спектрофотометре Specord UV-VIS после разрушения клеток быстрым замораживанием-быстрым отогревом или обработкой детергентом тритоном Х-100.

Активность монооксигеназной системы определяли по О-деметили-рованию р-НА. Для этого клетки инкубировали с ксенобиотиком при 37°с d Krebs-Henseleit фосфатном буфере с V/. бычьего сывороточного альбумина (ЕСА). Концентрация клеток в среде инкубации составляла 2 млн/мл, концентрация р-НА при изучении основных характеристик метаболизма - 0,4 «И.

Реакцию останавливали добавкой к 4 мл среды инкубации 1 мл 25%-ной ТХУ. После центрифугирования надосадочную жидкость защела-чивали до рН 9 212-ныи раствором Na2C03. Содержание свободного продукта реакции р-нитрофенола (р-НФ) определяли спектрофотометрически при 435 нм, пользуясь калибровочной кривой tThurnan R.G. et al, 18771. Для определения общего р-НФ - свободный+конъюгированпый -пробы перед защелачиваниен подвергали кислотному гидролизу в присутствии 0.2 и НС1 CHolme J.A. et al, 1982].

Поглощение р-НА клетками оценивалось по элиминации ксенобиотика из среды инкубации, не содержащей БСА. Содержание р-НА определяли в надосадке спектрофотометрически при 317 нм, концентрация рассчитывалась с помощью калибровочной кривой. Для каждого отдельного эксперимента ставился контроль - клетки инкубировали в среде без ксенобиотика.

Дыхательную активность гепатоцитов определяли полярографически с помощью закрытого электрода Кларка в ячейке объемом 1 мл при 37 С. Концентрация клеток в ячейке составляла 2 млн. После регистрации

эндогенного дыхания в течение 3-5 мин, в среду вносили 50 мкМ разобщителя 2,4-динитрофенола (ДНФ).

Полученные результаты обрабатывались статистически по методу Стьюдента-Фишера САимарин И.П. и др., 19753. В случае построения прямых зависимостей использовался метод наименьших квадратов СКелети, 19903.

Характеристика использованных реактивов. Используемые реактивы фирмы "Союзреактив" имели марку "осч" и "хч". БСЛ (фракция V), среда Дюльбекко, среда Лейбовича L15, 0.3% раствор трипанового синего, трис, HEPES - производства фирмы "Serva". Сукцинат, НАДФН, НАДФ'''- производства фирмы "Reanal".

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ .

Гепатоциты, полученные иеферментативннм способом, по своим характеристикам мало отличаются от клеток, выделенных классическим способом с использованием коллагеназы. Так, жизнеспособность получаемой суспенэни клеток по трипановому синему составляет 89±1Х, а скорость эндогенного дыхания - 15.Iii.3 нмоль 0г /мин/млн клеток. Для клеток, выделенных с помощью коллагеназы, значения этих параметров составляют 87±1Х u lg.9i0.7 нмоль 0г /гин/млн клеток, соответственно.

Общее содержание цитохрома Р-450 в гепатоцитах сытых самок крыс, полученных неферментативным методом, составляет 0.252±0.024 нмоль/млн клеток, что соответствует данным, полученным [Jones D.P., Orrenius S., 1981; Holme J.A. et al., 10823 на клетках, выделенных Ферментативным способом. При инкубации с 0.4 вИ р-НА гелатоцитов сытых самок крыс, содержание общего продукта реакции - р-1№ - в среде постоянно увеличивается на протяжении 30 минут и достигает 16.2±0.78 нмоль/2 млн клеток (рис.1А). Основной прирост общего продукта осуществляется за счет увеличения количества конъюгированного р-НФ, содержание свободного продукта сохраняется на постоянном уровне - 3.0-3.6 нмоль/2 млн клеток, что свидетельствует о сбалансированности скорости реакций I и XI фазы биотрансформации.

Исследование зависимости скорости реакции образования общего р-НФ от концентрации субстрата в среде инкубации показало, что реакция О-деметилирования подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментэн. Представление данных в координатах Иди-Хофсти выявило наличие двух процессов с высоким и низким сродством к субстрату, Km каж. которых

составляют 0.038 и . 0.205 юМ, а Утах каж. - 0.564 и 0.372 нмоль р-НФ/2 млн клеток/мин, соответственно (рис.1Б). Это согласуется с данными СЬеУап И. е1 а1.,19843 об участии нескольких иэоформ Р-450 в метаболизме р-НА.

Для выяснения вопроса, ограничивается ли проявлений 0-демет"-лазной активности клеток сытых животных поставками кофактора реакции НАДФН, были проведены исследования на клетках, целостность плазматической мембраны которых нарушалась в процессе выделения. Эти "пермеабилиэированные" гепатоцити более чем на 90% прокрашиваются трипановым синим, а их способность нетаболизировать р-НА составляет лишь . 18* от активности интактных клеток - 2.8±0.3 нмоль общего р-НФ/2 млн клеток х 30 минут. Это падение монооксигеназной активности не обусловлено изменениями в содержании цитохрома Р-450, т.н.

Рис.1. Содержание общего 'свободный*конъюгированный; 1,2) и свободного (3,4) р-НФ при инкубации контрольных (2,4) и индуцированных фенобарбиталом (1,3) гепатоцитов самок крыс в присутствии 0.4 яН р-НА (А). Зависимость Иди-Хофсти для 0-деметилирования р-НА контрольными (2) и индуцированными (1) клетками (Б).

А

6

И Н.О Р?,3 що

время инщбацин, мин

последнее не зависит от целостности плазматической мембраны. Эксперименты с изолированными кикросомами печени крыс показали, что причиной наблюдаемого угнетения не является и изменение ионного микроокружения - микросомы обладают одинаковой 0-деметилазной активностью в средах внутриклеточного и внеклеточного типа. В основе снижения скорости О-деметилирования в пермеабилнзированных гепато-цитах лежит недостаток восстановительных эквивалентов - В присутствии избытка НАДФН эти клетки образуют такое жо количество общего р-НФ как и нативные гепатоциты - 15.4±1.1б нмоль/2 млн клеток х 30 минут. Внесение в среду инкубации одного из субстратов НАДФН-генерируюшмх реакций - цитрата, изоцитрата, малата или глюкозо-6-фссфата - в присутствии окисленного НАДФ+ существенно увеличивает скорость О-деметилирования, что свидетельствует о сохранности ферментных систем. Раздельные добавки НАДФ + и субстратов не оказывают эффекта на t-.онооксигеназную активность пермеабнлизированных клеток.

Эксперименты, проведенные на клетках с нарушенной плазматической мембраной, позволяют заключить, что НАДФН не лимитирует скорость моноохсигеназных реакций в гепатоцитах сытых животных. Этот выгод подтверждается тем, что изолированные мнкросомы обладают такой же О-дсметилазной активностью в расчете на нмоль цитохроиа Р-450 как и нативные клетки - 21.6±2.13 и 22.6±4.3 ннсль р-НФ/нмоль Р-450 х 15 минут, соответственно.

При испольэовг ши изолированных клеток печени в медицинской практике особое значение приобретает их способность захватывать ксенобиотики. Если этот процесс протекает с участием транспортных систем, то нельзя исключить того, что он может ограничивать скорость реакций биотрансформации. Как видно из рис.2Д, в течение 30 минут инкубации . элиминация р-НА .из среды линейна при всех исследованных концентрациях ксенобиотика. Каждый график отсекает на оси ординат величину быстрого связывания, которая изменяется параллельно концентрации субстрата. С увеличением концентрации р-НА повышается и скорость стационарной фазы поглощения.

Зависимость скорости поглощения от концентрации субстрата не является линейной, а график Иди-Хофсти процесса поглощения приобретал линейный характер только в координатах V/CV/S2 ) (рис.2В). Это свидетельствует о том, что в скорость-лимитирующий акт переноса включены не одна, а две молекулы субстрата CHangino H.H. et al., 18883.

йналнз полученной кривой V/iV/S1) позволяет сделать вывод, что

поглощение р-НА изолированными гепатоцитами представлено двумя различными процессами. Первый из них характеризуется Кт как. 0.018 »\Н и Ушах ках. 0.334 нмоль р-НА/2 млн клеток/мин, второй, соответственно - 0.070 шН и 0.803 нмоль р-НА/2 млн клеток/иин. Чти величины отличаются от кинетических параметров О-деметилирояалия р-НА, что свидетельствует об относительной автономности процессов поглощения и О-деметилирования р-НА.

Следует отметить, что количество поглощенного р-НА при каждой исследованной концентрации субстрата превышает количество образовавшегося за то же время 0-декетилированного продукта, то есть поглощение не ограничивает дальнейшего метаболизма р-НА. Таким образом, в нативных гепатоцитах сытых животных скорость-лимитирующим фактором процесса биотрансформации является содержание цитохромз

4

■к

■I

пи гЗ ко 0 Врел/г ингцбацци.

~Й пЬ 33

т а »'/5'

лик

Рис.2. Поглощение р-НА контрольными (А) и индуцированными фенобарбиталом (Б) клетками печени самок крыс при инкубации с 0.08 (1), 0.06 .(2), 0.04 (3) и 0.02 (4) тМ субстрата. Зависимость Иди-Хофсти для поглощения р-НА контрольными <В) и индуцированными (Г) клетками печени.

Р-450 з клетке, а не поставки субстратов и кофакторов.

Клетки, выделенные из печени получавших' фенобарбитал самок крыс, содержат на 70% больше цитохрома Р-450, чем контрольные. За 30 минут инкубации с 0.4 пН р-НА индуцированные гепатоцнты образуют в 1,5 раза большее количество р-НФ, чем клетки контрольных животных (рис.1А). На графике . Иди-Хофсти для О-деметилирования р-НА индуцированными гепатоцитами выявляется только один процесс в исследуемом диапазоне концентр<ций (0.04-0.4 щМ), Кт как. которого совпадает с Кш каж. высокоаффинного процесса контрольных клеток -0.037 тМ, а Ушах каж. его превышает даже суммарную Ушах каж. в контроле - 1.1ЭЗ и 0.936 нмоль р-НФ/2 млн клеток/мин, соответственно (рис.1Б).

После действия индуктора наблюдаются изменения и процесса поглощения р-НА. При каждой из исследованных концентраций количество р-КА, поглощенного индуцированными клетками, в 1.5 раза превышает количество ксенобиотика, которое захватывают за то же время контрольные клетки (рис.2Б). Это увеличение обусловлено, главным образом, повышением стационарной скорости поглощения. Построение графика Иди-Хофсти в этсч случае дает только одну прямую в исследуемом диапазоне концентраций (рис.2Г). Величина Кт каж. этого процесса отличается от обеих Кт каж. для контрольных гепатоцитов - 0.043 вМ, а Утах каж. превышает суммарную Утах каж. для поглощения контрольными клетками - 1,351 и 1,137 нмоль р-НА/2 млн клеток/мин, соответственно.

Сопоставляя активность процессов поглощения и 0-деметилирова-кия в индуцированных клетках, можно сделать вывод, что, как и в гепатоцитах контрольных сытых животных, поглощение не лимитирует дальнейшего метаболизма ксенобиотика.

Таким образом, фенобарбитал стимулирует не только гидроксили-рование, но и поглощение р-НА и изменяет их кинетические параметры. Следует отметить, что фенобарбитал не является специфическим индуктором изофорны цитохрома Р-450, главным образом ответстбенной за метаболизм р-НА ССоппеу А.Н., 19863. Особенность барбитуратов неспецифически индуцировать широкий спектр изоФорм цитохрома Р-450 может иметь существеннее преимущества при использовании индуцированных клеток в клинике.

Чтобы адекватно оценить потенциальные возможности индуктора стимулировать метаболизм ксенобиотика, надо точно определить.ско-рость-лимитирующие этапы этого процесса в новых условиях. Введение

животным фенобарбитала увеличивает активность ферментов, участвующих в генерации НАДФН. Об этом свидетельствуют данные, что перме-абилизированные индуцированные гепатоциты в присутствии окисленного НАДФ+ и одного из субстратов образуют в 2 раза большее количество р-НФ, чем контрольные клетки с нарушенной плазматической мембраной в аналогичных условиях. В то же время в присутствии избытка НАДФН пермеабилизированные индуцированные клетки за 30 мечут образуют на 53% больше р-НФ, чем нативные индуцированные клетки - 36.8±5.6 и 23.9±1.9 нмоль р-НФ/2 млн клеток, соответственно. Таким образом, в интактиой клетке (которая работает только на эндогенных субстратах) возможность фенобарбитала ускорять метаболизм ксенобиотиков ограничена соотношением НАДФН/КАДФ+ в цитоэоле клетки.

Функционирование монноксигенаэной системы а организме зависит от возраста, гормонального статуса, условий содержания животного tConney А.Н., 19863. Адекватный подбор этих параметров может позволить без исполь.ювания индукции увеличить способность изолированных клеток печени метаболизировать ксенобиотики. Эксперименты с ге-патоцитами животных разного пола показали, что клетки печени самцов содержат на 47Х больше цитохрома F-450, чем клетки самок (0 .367±0.057 и 0.252±0.024 нмоль/млн клеток, соответственно). Это, очевидно, определяет и более высокую скорость О-деметилирования р-НА в гепатоцитах самцов - за 30 минут они образуют на 54% больше общего р-НФ. Общий характер метаболизма р-НА при этом у сытых животных разного пола одинаков: преобладание конъюгатов, неизменная стационарная концентрация свободного продукта, отсутствие лимитирующего действия со стороны НАДФН и относительный вклад в его продукцию отдельных НАДФН-генерирующих систем. Различия в скорости моно-оксигенаэных реакций в клетках печени крыс разного пола полностью соответствуют разнице в содержании цитохрома Р-450.

Голодание в течение 40 часов не приводит к изменению общего содержания цитохрома Р-450 в гепатоцитах самцов и самок грыс, однако скорость О-деметилирования р-НА достоверно снижается у самцов на 41%, а у самок наблюдается тенденция к понижению на 243! (табл.1). Голодание вызывает более чем двухкратное снижение скорости эндогенного дыхания гепатоцитов. Скорость дыхания . в присутствии разобщителя 2,4-динитрофенола, которая в условиях клетки лимитируется количеством субстратов, способных окисляться в дыхательной цепи, била на 60Х выше скорости эндогенного дыхания гепатоцитов как для сытых, так и для голодных крыс. Эти результаты указывают на

Таблица 1. Влияние голодания на биотрансформацию р-НА и дыхательную активность изолированных гепатоцнтов (М ± ю).

п = 5 - 12

! ! Голодные животные

Исследуемый параметр I Контрольные 1;_

! . животные ¡клетки выде- ¡клетки выдедя-

! 1 ляли с ЭДТА I ли с цитратом

Образование свободного

р-нитрофенола.

нативные гепатоциты

самок 4 .4 1 0. 6 2. 9 ± 0 .3 4 .6 ± 0. 7

самцов 4 .2 0. .2 4 . .1 ± 0 .6 5 .2 + 0. .8

Образование общего

р-нитрофенола:

нативные гепатоциты

самок 11 .0 ± 1. 3 8. 7 ± 0 .8 12 . 1 ± 1. 2

самцов, 13 .8 ± 1. .7 8. ,2 1 . 0* 14 . 1 4 1. .5

пермеабилизированные

гепатоциты (в присут-

ствии НАДФН)

самок 13 .0 ± 1. .5 22. ,8 ± 2 .4* -

самцов . - 23. .7 ± 8 .2 20 . 1 ± 4 .4

Скорость эндогенного

дыхания (Уэнд.) 11 .7 + 1. ,2 5, .3 + 0 .4* 8 .3 + 0. . 1

Скорость эндогенного

дыхания в присутствии

разобщителя (Ураз.) 18 .8 ± 0 .8 В .5 ± 0 . 8* 15 .6 ± 1 .4

Коэффициент, стимуляции

эндогенного дыхания

разобщителем

(Ураэ./Уэнд.> 1. 68 + 0 . 15 1 .60 : ± 1 0.14 1. 89 ± 0.16

Примечание: Время инкубации клеток с 0.4 тК р-НА - 15 минут.

Образование р-НФ выражено в нмолях/2 млн клеток. Скорость дыхания выражена в нмолях 0г/млн клеток/мин. * различия по отношению к соответствующим показателям для. контрольных животных достоверны

снижение содержания митохондриальных субстратов в клетках голодных крыс. В условиях голодания вследствие истощения запасов.гликогена основными источниками восстановленного НАДФН в цитозоле клетки становятся мигохондриалыго-зависимые пути его генерации CBelinsky S.A. et al., 1985]. Полученные нами данные свидетельствуют о существовании корреляции между состоянием митохондрий и активностью моноокси-геназной системы.

В присутствии избытка НАДФН пермеабилизированиые клетки голодных самцов и самок крыс образуют значительно большее количество р-!№, чем нативные клетки не только голодных, но и сытых крыс (табл.1). На фоне неизменного общего содержания цитохром'а Р-450 эти данные свидетельствуют об избирательном увеличении в результате голодания 0-деметилазной активности, которая в условиях иктактной клетки ограничивается митохондриальными системами генерации НАДМ. В рабс/е была предпринята попытка снять лимитирующее влияние НАДФН, включив в состач среди перфузии НАД1> *-зависимке субстраты. Как указывалось вьше, цитрат (который может заменить ЭДТА в качестве комплексна Са) в присутствии НАДО* стимулирует О-деметилированйе р-НА пермеабилнзнрованнини клетками. Действительно, замена ЭДТА цитратом в среда перфузии при выделении клеток из печени голодных животных на 72Х увеличивает скорость О-деметилирования р-НА гепатоцитами самцов и на 33% - клетками самок (табл.1). Скорость эндогенного дыхания при включении цитрата в среду перфузии увеличивалась более чем на 50%, а разобщенного - на 100% по сравнению с клетками, полученными с использованием ЭДТА (табл.1). Таким образом, использование сред перфузии с цитратом может увеличивать скорость О-деметилирования в условиях дефицита НАДФН.

Широкое использование изолированных клеток печени как в экспериментальных, так и а практических областях требует разработки способов продолжительного хранения суспензии гепатоцитов, что на данный момент может быть решено за счет создания банка криоконсервиро-ванных клеток. В настоящей работе были проведены эксперименты по оптимизации некоторых этапов криоконсервирования под защитой ДНСО с использованием быстрого двухступенчатого замораживания до -138° С с остановкой при -20т-25° С и быстрого отогрева, позволяющего в значительной степени сохранить жизнеспособность клеток печени [Петренко А.Ю., Грищук В.П., 10903. Жизнеспособность размороженной суспензии, оцениваемая по прокрашиванию трипановым синим, значимо выше в образцах, где средой замораживания служили сахарозная среда

и питательная среда ЛейБовича L-15 с добавкой IX БСА по сравнению с минимальной солевой средой Дюльбекко. Но замена БСА на эмбриональную сыворотку теленка (конечная концентрация 20%) в случае среды L-15 снижает выход непрокрашиваемых клеток после размораживания, чего не наблюдалось при использовании сахарозной среды. Б силу этого предпочтение было отдано последней.

При изучении влияния различных концентраций ДМСО было выявлено, что оптимальной является концентрация 1.4 И или 10*.

Сравнительная оценка проникающих криопротехторов - диметил-сульфоксида (ДМСО), глицерина, диметилацетамида и 1,2-пропандиола -показала, что более высоким криоэащитным действием обладают первые два. После отогрева без отмывкч ст криопротектора суспензия изолированных клеток в случае ДМСО содержала 78* непрокрааивае-мых клеток, а в случае глицерина - 72%.

Криоконсервирование с использованием быстрого двухступенчатого замораживания при оптимальном выборе среды и концентрации ДМСО после отмывки от криопротектора позволяет получить клеточную суспензию жизнеспособностью 64±4Х при жизнеспособности свежевыдаленных гепа-тоцитов 86±2%. Эти результаты сравнимы с лучшими результатами, полученными при других программах замораживания CChesne> С., Guillouzo А., 1988; De Loecker R. et al, 1800; Loretz L.J. et al, 1988; Pouis 0. et al, 19373.

Литературные данные о сохранности биотрансформирующей активности клеток печени после криоконсервирования весьма ограничены. Настоящие исследования подтвердили высокую криоустойчивость цито-хром P-450-зависимых процессов изолированных микросои печени после замораживания-отогрева 8 отсутствие криопротектора, установленную ранее [Лемешко В.В., Кудокоц».ва Е.В., Белоус A.M., 1S78; Borton P. et al, 19743. Однако аналогичная обработка суспензии гепатоцитов приводит к практически полной потере способности клеток метаболи-зировать р-НА. Использование описанного ранее режима криоконсервирования с криопротектором ДМСО снижает потерю О-деметилирующей -способности до 37% - если свежевыделенные клетки печени самцов крыс образуют при инкубации с 0.4, юН р-НА 33.8±2.3 кноль р-НФ/2 млн клеток х 30 минут, то криоконсервированнаа гепатоциты са,мцов образуют 21.2±1.3 нмоль р-НФ/2 млн клеток х 30 минут.

Наблюдаемое снижение скорости моиооксигеназных реакций не обусловлено изменениями в содержании цитохрома Р-450, т.к. его количество в криоконсервированных клетках не отличается от содер-

хания в свежевыделенных. Оно скорее вызвано более низкой жизнеспособностью суспензии после криоконсервировання, что, как было показано на пермеабилизированных клетках, имеет решающее значение в поддержании необходимой для конооксигеназной системы концентрации восстановительных эквивалентов. Действительно, гепатоциты,- подвергнутые заморживанию-отогреву в среде без криопротектора,' полностью прокрашиваются трилановым синим, а в присутствии избытка НнДФН обнаруживают такгю же 0-демегилазную активность как и свежевыделенные.

Для выяснения взаимосвязи между жизнеспособностью суспензии и О-деметилирующей активностью были проведены эксперименты, в которых криоконсервированные гепатоциты разделяли в градиенте плотности пер-колла. В результате разделения получали суспензию клеток, по жизнеспособности не отличающуюся от свежевыделенной - 88±1%. Увеличение числа непрокрашиваемых клеток сопровождается повышением скорости О-деметилирования р-НА, но только до 78% от активности свежевыделенных гепатоцитов (р<0.002). В связи с этим было исследовано изменение хизнеспособности клеток и содержания в них цитохрома Р-450 в процессе изотермической инкубации (рис.3). За 30 минут инкубации суспензии свежевыделенных гепатоцитов в присутствии ксенобиотика гибнет 9% клеток, а криконсервирсванных - 26%. Цитохром-Р-450 за 30 минут при 37° С практически не инактивируется в свежевыделенных клетках, а в криоконсервированных его содержание на последних минутах снижается до В5%. Результаты, приведенные на рис.3, свидетельствуют о том, что криоконсервированные клетки более чувствительны к изотермической инкубации. Учитывая время происходящих изменений, мы пришли к выводу, что в основе угнетения монооксигеназной активности лежит повреждение плазматической мембраны части криоконсервированных клеток и вызванная этим потеря эндогенных восстановленных пиридиновых нуклеотидов.

Какого-либо избирательного повреждения фазы II биотрансформации в результате криоконсервировання отмечено не было, о чем свидетельствует отсутствие изменений-в содержании свободного р-.НФ при инкубации криконсервированных клеток.

В работе была проведена, оценка вклада различных этапов криоконсервировання в повреждение суспензии клеток. Было установлено, что основная потеря жизнеспособности происходит на этапе отмывки от криопротектора - с 71Х до 522. Избежать этой стадии в случае использования в качестве криопротектора ДМСО не позволяет его высокая токсичность по отношению к биотрансформации р-НА. Уже в кон-

центрации 0.1Х ДМСО подавляет О-деметилазную активность свежевыде-ленных клеток на 25%, а 2К-ное содержание его угнетает ионооксиге-назную активность на 85Й. Глицериь оказался более слабым ингибитором микросомальных процессов - в концентрации 2% он снижал скорость О-деметилирования р-НА только на ЮЖ. Если в случае ДМСО неотнытые криоконсервированные гепатоциты образуют в 2 раза иеньвее количество р-НФ, чем клетки после отмывки, то при использовании глицерина различия между О-деметилирующей активностью криоконсервироваи-ных клеток до и после отмывки отсутствуют и величина со соответствует активности отмитых, криоконсервировашшх с ДНСО клеток. Оти данные позволяют сделать вывод о предпочтительности использования глицерина в качестве криопротектора для сохранности монооксигеназ-ной системы гепатоцитов.

/ЙЗ

V 10

§ и

£3

I

С)

I

ъа О

Время инкубации. лин

о 1

Рис.3. Изменения жизнеспособности (А) и содержания цитохрока Р--450 (Б) при инкубации свежевыделенных (1) и криоконсервировашшх (2,3)

гепатоцитов до (3) и после (2) разделения в градиенте плотности перколла.

выводы

1. Процесс биотрансформации р-НА (О-деметилировэние и последующая конъюгация) протекает одинаково б гепатоцитах крыс, выделенных неферментативк^м и ферментативным методами. I фаза биотрансформации р-НА представлена двумя процессами с низкой и высокой Кга каж. Скорость- лимитирующим фактором метаболизма р-НА в гепатоцитах сытых крыс является содержание в клетке цитохрома Р-450.

2. Поглощение ксенобиотика р-НА изолированными гепатоцитами представлено по крайней мере двумя процессами с различными кинетическими характеристиками. Поглощение не лимитирует метаболизма р-НА в клетках, выделенных из контрольных и получавших фенобарбитал крыс.

3. Гепатоциты, выделенные из самцов крыс, обладают большей способностью метаболиэировать р-НА по сравнению с клетками печени самок, что обусловлено более высоким содержанием в них цитохрома Р-450.

4. Введение крысам Фенобарбитала увеличивает общее содержание цитохрома Р-450 в клетках печени, возможность НАДФН-генерирующих систем восстанавливать пиридиновые нуклеотиды и, как следствие этого, повышает скорость О-деметилирования р-НА. Индуктор также стимулирует процесс поглощения ксенобиотика. Скорость-лимитирующим фактором биотрансформации р-НА в индуцированном состоянии является содержание в клетке восстановительных эквивалентов.

5. При голодании содержание цитохрома Р-450 в изолированных гепатоцитах крыс не изменяется, а О-деметилазная активность микро-сомальной системы окисления увеличивается. Скорость О-деметилирования в нативных клетках после голодания снижается, причиной чего является недостаток восстановительных эквивалентов. Введение цитрата в среду перфузии при выделении клеток из печени голодных животных увеличивает скорость О-деметилирования р-НА до уровня сытых животных. ...

6. Быстрое двухступенчатое замораживание с остановкой в зоне умеренно низких температур и последующий быстрый отогрев под защитой ДМСО или глицерина позволяет в значительно большей степетч сохранить жизнеспособность суспензии изолированных гепатоцитов и процесс биотрансформации р-НА по сравнению с криоконсервированием под защитой днметилацетамида или 1,2-пропандиола; использование глицерина позволяет избежать этапа отмывки.

7. Снижение скорости О-деметилирования р-НА деконсервирован-

ными гепатоцитами обусловлено повреждением плазматической мембраны при изотермической инкубации с ксенобиотиком и последующей потерей пиридиновых нуклеотидов и ниэкомолекулярных соединений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мазур С.П., Петренко А.Ю. Крисусгой'мвость цитохром Р-450-зависимого О-демегилирования р-нитроанизола б изолированных микросомах печени крыс // Биохимические аспекты крнсповреждения и крио-защиты клеточных систем. - Харьков, 198Э. - С.104-103.

2. Петренко А.Ю., Маэур С.П., Росляков А.Д., Сукач д.Н. Связывание, транспорт и метаболизм ксенобиотиков изолированными гепатоцитами // Тез. Всесоюзной научной конференции "Актуальные проблемы лекарственной токсикологии". - Купавна, 1920. - С.225.

3. Мазур О.П., Петренко А.Ю. Влияние голодания на биотрансформацию р-нитроанизола и дыхательную активность гепат^цитов самцов и самок крыс // Деп. в ВИНИТИ 27.05.91, Н 2216-В91. - 15 с.

4. Мазур С.П., Белоус A.M., Петренко А.Ю. Изучение причин угнетения активности системы биотрансформации р-нитроанизола с изолированных гепатоцитах крыс после криоконсервирования // Проблема криобиологии. .- 1991. - 8 1.- С.3-5.

5. Petrenko A.Yu., Mazur S.P. Rate-limiting factors of xeno-biotic biotransformation in isolated hepatoeytes after cryopreser-vation // I.European Conference on Tissue Banking and Clinical Application. Berlin, October 24-26, 1991. - P.' 124.

АКАДЕМИЯ ПАУК УКРАИНСКОЙ ССР ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРИОБИОЛОГИИ И КРИОМВДИЦИНЫ

На правах рукописи

МАЗУР Светлана Петровна

ФАКТОРЫ, РЕГУЛИРУЮЩИЕ ПОГЛОЩЕНИЕ И БИОТРАНСФОРМАЦИО КСЕНОБИОТИКА р-НИТРОАНИЗОЛА В СВЕЖЕВЫДЕЛЕЯНЫХ И КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ ГЕПАТОЦИТАХ КРЫС

03-00-22 -.криобиология.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Харьков - 1091