Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование гетерогенного распределения цитохромов Р450IA1 и P450IIB1 (+B2) в дольке печени крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование гетерогенного распределения цитохромов Р450IA1 и P450IIB1 (+B2) в дольке печени крыс"



АКАДШН ШЗДИЦИНСКИХ ЙШ СССР СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

на правах рукописи

МИТРОФАНОВА Елена Эдуардовна

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕТЕРОГЕННОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОХРОМОВ Р4501А1 и Р450ПВ1 (+В2) В ДОЛЬКЕ ПЕЧЕНИ КРЫС

03.00.04 - Биохимия

А в т о р е ф е р а т диссертации на соискание ученой степени кзндадата биологических наук

Новосибирск - 1991

Работа выполнена в Институте клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения АМН СССР, г. Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук И.Б. Цырлов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук О.Л. Сэров кандидат биологических наук И.Ф. Усынин

Ведущее. учреждение: Институт фармакологии АМН СССР

Защита диссертации состоится "_"_1991 г.

в _часов на заседании специализированного Ученого

Совета К ООГ.37.01 Иаститута биохимии СО АМН СССР по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Ах. Тимакова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии СО АМН СССР

Автореферат разослан

Ученый секретарь

специализированного Ученого СоЕета кандидат медицинских наук

Т.Г. Филатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Микросомная монооксигеназная система подвергает биотрансфэрмации с последующи выведением из организма многочисленные, разнообразные по химической структуре и биологической активности Ееществз. В многообразии индукторов (химических соединений, приводящих к синтезу de novo ферментов моно-оксигеназной системы) можно выделить две группы, отличающиеся специфичным индуцирующим действием,: ксенобиотики ФБ-типа, приводящие к биосинтезу в основном цито'хрома P450IIB1, и ксенобиотики МХ-тина, индуцирующие цитохромы Р4501А1 и Р4501А2 (Thomas et al., 1983).

В настоящее время достаточно полно изучено влияние основных представителей этих двух групп ксенобиотиков на биосинтёз ряда форм цитохрома Р-450 и на их биохимические параметры ~в ми-кросомной фракции печени (Ляхоеич, Цырлов, 1981; Мишин, Ляхо-еич,1985).

Однако, в последнее время появились основания считать, что получаемые результаты не отражают в полной мере ситуацию, имеющую место е клетках. Это может быть связано с высвобождением лизосомальных ферментов в процессе гомогенизации ткани печени, с нарушением возможности проникновения субстратов ' через липидный матрикс мембран эндоплазматического рвтикулума и процессов образования фермент-субстратных комплексов, с нарушением транспорта электронов от NADPH к цитохрому Р-450 (Лукьянова и др., 1985). Более того, возможность изоплотностногс фракционирования свежеизолированных гепатоцитов позволяет исследовать распределение изоформ цитохрома Р-450 в различных субпопуляциях печеночных клеток.

С другой стороны, противоречивость существующих данных по анализу биохимических параметров в субпопуляциях гепатоцитов, полученных методом изоплотностного фракционирования, могла быть прояснена с помощью • иммуногистохимических исоледований распределения ферментов в дольке печени крыс.

Отсутствие комплексных биохимических, иммунохимических и иммуногистохимических исследований распределения содержания и

активности изоформ цитохрома Р-450 служит серьезным препятствием для правильного понимания функционирования монооксигевазной системы на клеточном и органном уровнях, а также возможности применения полученных результатов в области фармакологии и медицины.

Цель работы. Комплексное исследование на крысах индукции шкросомных монооксигеназ: I) на субклеточном уровне (микротомы), 2) на клеточном уровне (изолированные гепатоциты) и 3) на органном уровне (долька печени).

Предметом исследований были молекулярные фарш цитохрома Р-450: Р450ИВ1 - основная, индуцируемая ксенобиотиками ФБ-тша, и Р4501А1 - основная индуцируемая ксенобиотиками МХ-типа.

Задачи исследования:

1. Оценить содержание и активность форм цитохромз Р-4Б0 в микросомах крыс, получавшим ФБ и МХ по разным схемам.

2. Исследовать распределение содержания и активности цитохрокз Р-450 в субпопуляциях гепатоцитов крыс в моделях раздельной и совместной индукций индукторами ФБ- и МХ-типа.

3. Выявить локализацию и динамику распределения индуцированных изоформ цитохрома Р450ПВ1 (+Б2) и Р4501А1 в дольке печени крыс.

4. Исследовать влияние частичной гепатзктомии на распределение форм цитохрома Р-450 в дольке печени крыс.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование распределения форм монооксигеназ Р4501А1 и Р450ПВ1 (+В2) в дольке печени крыс. В работе была использована модель одновременного введения ФБ и ® для выявления распределения содержания и активностей форм цитохрома Р-450 в субпопуляциях гепатоци-тов, полученных методом изоплотностного центрифугирования в градиенте фиколла. Также впервые была исследована локализация' форм Р4501А1 и Р450ПВ1 (+В2) в дольке печени крыс в модели смешанной индукции ксенобиотиками ФБ- и МХ-типа, а также в печени. гепатэктомировашшх крыс, получавших либо ФБ, либо МХ.

Практическая значимость. Работз представляет собой комплексное исследование распределения содержания и активностей форм цитохрома Р-450 на субклеточном, клеточном и органном уровнях в динамике индуцирующего действия ксенобиотиков ФБ- и

МХ-типа и носит преимущественно теоретический характер. Однако, теоретические посылки могут быть использованы для дальнейшего внедрения в области медицины. Тан, например, установленное в работе перераспределение формы Р450Ш в перипортальную зону дольки печени крыс, получавших совместно ЗБ и MX, может быть использовано для направленного, избирательного ингибирования этой форш в печени. Это очень важно в связи с тем, что тленно эта форма катализирует метаболическую активацию канцерогенов типа полициклических ароматических углеводородов и ароматических аминов (PelKonen, Nebert, 1982).

Работа выполнена в рамках Всесоюзной программы "Гидроксилаза" в соответствии с плановой темой, утвержденной Государственным комитетом по науке и технике (№> государственной регистрации 79040821).*

Основные положения, выдвигаемые на защиту:

1. Введение фенобарбитала приводит к выявлению наибольшего содержания форш Р450ПВ1 (+В§) и активности бензфетамин-М-деме-тилазы в легких фракциях гепатоцитов, а введение 3-метилхолант-рена и р-нафтофлзЕонз - к равномерному распределению содержания формы P450IA1 и активности бензпирен-гидроксилазы в субпопуляциях клеток, что соответствует результатам иммуногистохимичес-ких исследований распределения форм в дольке печени крыс.

2. В модели совместного введения фенобарбитала и. р-нафто-флаЕона распределение форм цитохрома Р-450 и специфичных для этих форм активностей в субпопуляциях клеток не 'соответствует картине распределения форм цитохрома Р-450, определяемых имму-нохимически.

3. Частичная гепатэктомия приводит к повышению монооксиге-назной активности в печени крыс после введения фенобарбитала и З-метилхолантрена.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзных конференциях "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды" (Новосибирск, 1987), "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул" (Ялта, 1989), Международнаконференции "Системы метаболизма лекарств" (София, 1986), Гепатологи--ческом симпозиуме (Иена, 1988), 6 Mes,:- конф. по биохимии и биофизике цитохрома Р-450 (Вена, 1988),Т1 Мевд. конф. по фар-

ментным системам метаболизма лекарств (Варна, 1939), 9 Мезд. конф. ДИОКСИН-89 (Торонто, 1989), 3 Евр. конф. по метаболизму чужеродных соединений (Лондон, 1989).

Публикации. По материалам диссертации "опубликовано 12 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена нз 132 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 15 рисунков ж состоит из введения, обзора литературы, описания собственных исследований, включающего материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы из 236 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ЫАГЕИшш и МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы крысы породы Вистар весом 120-200 г. Индукторы микросомных монооксигеназ вводили внутрибркь шинно: 3-метилхолантрен (40 мг на кг веса) и (З-нафтофлаЕон (80 мг/кг) в растительном масле, фенобарбитал (100 мг/кг) в 0.9 % растворе NaCl. Контрольным животным вводили соответствующее количество растворителя.

Операция частичной гепатэктомии проводилась под эфирным наркозом. Через 24 часа после операции крысам веодили ФБ или МХ в течение двух дней. Контролем служили ложнооперированные животные.

Микросомную фракцию печени получали методом дифференциального центрифугирования.

Изолированные гепатоциты получали инкубацией измельченной печени в среде Эрла с 0.2 % ЭДТА и 0.1 % БСА (Канзева и др., 1975). Изоплотностное фракционирование гепатоцктов на субпопуляции проводили по модифицированному наш методу Tonda et al,, 1983. Суспензию гепатоцитов наслаивали на ступенчатый градиент плотности фиколла в среде Эрла и центрифугировали 20 мин при 900 g в центрифуге (ЫР7-340, Польша).

Определение белка проводили по методу Лоури с соавт.

(Lowry et al., 1951). Определение количества Цитохромов P-45Q и Ъ5 проводилось по методу Омура и Сато (Omura & Sato, 1964). Актиеность КАБРН-цитохром P-450-рвдуктазы измерялась методом Фшишпса и Лангдона (Phillips & langdon, 1962) по восстановлению цитохрома с. Скорость N-деметилирования аминопирина и бензфетамина определяли спектрофотометрически по методу Смуклера и др.(Smokier et al., 1967). Актиеность бензпирен-гидроксилазн определяли по методу Роби (Roble et al., 1976) с небольшими модификациями. Определение скорости 0-деэти-лирования 7-этоксирезоруфина проводили по методу Бурке с соавт. (Prougti, Burke et al., 1978).

Антитела к изолированным формам цитохрома Р-450 получали иммунизацией беспородных кроликов, как рекомендовано Каматаки с соавт. (Kanataki et al., 1976). Контрольные антитела получали из сыворотки нэидаунизированных кроликов. Тест двойной ятупо-диффузии по Оухтерлони проводили как" рекомендовано Томасом с соавт. (Thomas et al., 1977). Ракетный . иммуноэлектрофорез проводили по методу Пикетта с соавт. (Pickett et al., 1981).

Для выявления локализации форм цитохрома Р-450 в дольке печэни крыс использовали непрямой иммунопероксидазный метод (Полак, Норден, 1987). Для подавления активности эндогенной пероксидазы е ткани использовали 30 минутную инкубацию в метаноле с 2% перекисью водорода (Woli et al., 1984). Пероксидазную активность вторичных антител выявляли инкубацией с 0.05 % 3,3*-диаминобензидином и 0.001 % перекисью водорода.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование действия ксенобиотиков 36- и МХ-типов на распределение микросомннх монооксигеназ в субпопуляциях гепатоцитоЕ крыс.

Ранее была показана способность многих чужеро/днх для оргзнизма соединений еызыеэть биосинтез ряда молекулярных форм цитохрома Р-450, катализирующих превращения .многих ксенобиотиков, в тем числе лекарственных веществ и канцерогенных соединений. При этом-в первом случае цито^ром P-450-зависимые

реакции сопровождаются снижением активности ксенобиотика, а во втором - его "метаболической активацией" с появлением реактивных промежуточных продуктов. Поэтому выявление факторов регуляции биосинтеза и функционирования разных форм цитохрома Р-450 в печени признается актуальной проблемой.

Теоретически схема нашего исследования основывалась на результатах Вулфа с соавт. (Wolí et al., 1984), которые с помощью нммуногистохимических - методов показали, что при введении крысам ФБ форма P450IIB1 обнаруживается только в цен-тролобулярном -районе, а форма P45QIA1 при введении НФ локализуется только в перипортальном районе дольки печени. Другой группой исследователей (Tonda et al., 1983) было показано, что е гепатоцитах, выделенных из печени крыс, получавших ФБ, после разделения клеток в градиенте перколла наибольшее содержание цитохрома Р-450 и наиболее высокая активность 7-этоксикумз-рин-О-деэтилазы выявляется в менее плотных клетках. Третьей группой ученых (Massey et al., 1979) было показано, что введение ФБ приводит к достоверному увеличению диаметра клеток и площади эндоплазматического рзтикулума гепатоцитов центролобу-лярного района дольки печени.

Основываясь на результатах данных исследований, перед нами стояла' задача получения субпопуляций гепатоцитов крыс, индуцированных ФБ и НФ совместно и раздельно, содержащих избирательно цитохрома P450IIB1(+В2) и P450IA1: в менее плотных гепатоцитах - P450IIB1 (+В2), а в более "тяжелых" клетках -P450IA1.

Влияние фенобарбитала на монооксигеназнув систему - в субпопуляциях гепатоцитов.

Введение ФБ крысам приводит к увеличению содержания цитохрома Р-450 и активностей NABPH-цитохром Р-450-редуктазы и БФА-деметилазы в большей степени в легких фракциях гепатоцитов. Мокно видеть, что содержание цитохрома P-45G снижается примерно от I нмоля/Ш^ клеток в "легких" гепатоцитах до 0.5 нмоля/Ю клеток в "тяжелых" гепатоцитах (табл.1). Однако, содержание цитохрома Р-450 в тяжелых фракциях гепагоцитоЕ выше, чем в тех же фракциях контрольных животных. Это можно объяснить либо тем, что некоторые клетки центролобулярной зоны имеют тг«:<ую же плот-

Таблица. 1 Распределение содержания цитохрома P-45Q и активностей NADPH-цитохром Р-450-ре-дуктааы и бензфетамин-М-деметилазы в субпопуляциях гепатоцитов крыс, получавших ФБ, ( ш=2, п=5). *

Плотность Содержание ци- Содержание ци- Активность бенафетамин- Активность NADPH-P-450-

фиколла тохрома Р-450 тохрома N-деметилазы ре дуга азы

( г/мл ) (нмоль/1 млн (нмоль/1 млн (нмоль НСНО/мин/ ( ед. / 1 млн клеток)

клеток) клеток) 1 млн клеток)

1. ОБО 0. 96+0. 00 о. зе+о. ю 2. 6Э±0. 17 56. 93±б. 58

1.060 0. 98+0.12 0. 46±0. 25 6. 72+1.70 28. 5211. 22

1.070 0. 56t0. 04 0. 25+0. 04 3. 28+0. 42 15.1113. 41

1.075 0. 51 iO. 07 0. 28+0. 08 3. 88±1. 27 16. 04*0. 41

1.080 0. 39+0.12 0. 27±0. 07 2. 38±0. 76 11. 71 ±2. 89

1.085 0. 57i0.10 0. 29±0.11 2. 72±0. 42 12. 30±4. 50

1.090 0. 57±0.10 0. 29±0.11 2. 72*0. 42 12.30±4. 50 >

Примечание: * ш -

число экспериментов; п - число животных в одном эксперименте.

ность, что и перипортальные гепатоциты, либо тем, что цитохром Р-450 индуцируется в небольшом количестве клеток першоргально-то района дольки печени. Аналогичным образом и наибольшая активность БФА-деметилазы приходится на гепатоциты легких фракций (6.72 нмоль НСН0/мин/10 клеток) по сравнению с "тяжелыми" гв-латоцитами (2.38-2.72 нмоль НСНО/мин/Ю6 клеток). Активность ШШРН-цитохром P-450-редуктазы в легких фракциях (56.93 ед./ ■IQ6 клеток) примерна в пять раз превышала таковую в плотных субпопуляциях клеток. .

Поскольку ФБ является представителем большой группа индукторов, приводящих к синтезу йе novo цитохрома P45GIIB1 (+В2), содержание которого как следует из литературных данных составляет' 40-50 % от общего содержания цитохрома Р-450, определяемого спектрально, наш было оценено содержание форма в субпопуляциях гепатоцитов. С помощью метода ракетного иммунозлектрофоре-за в агарозном.геле с антителами, полученными против цитохрома P450IIB1, было определено содержание формы в общем пуле гепатоцитов. крыс, получавших ФБ. Оно составило примерно 37 %от общего содержания цитохрома Р-450, что сравнимо с данными, полученными на микросомах печени ФБ-крыс. Измерение относительного содержания специфичной формы в субпопуляциях гепатоцитов выявило его снижение от 46 % в легких фракциях до 27 % в тяжелых фракциях клеток.

Таким образом, в более легких гепатоцитах крыс, индуцированных ФБ, отмечается более Еысокое содержание цитохрома Р-450 и формы ■ P450IIB1 (+-В2), а также более высокие активности БФА-деметилазы и KADPH-цигохром P-450-редуктазы.

Влияние.р-нафтофлавона и 3-метилхолантренз на моноокси-геназную систему в субгопуляциях гепатоцитов.

Ранее группой Вулфа с соавт. было показано, что индуцируемая MX форма P450IA1 выявляется на протяжении всей дольки печени, а после введения НФ (индуктора-аналога) цитохром P450IA1 обнаруживается только в перипортальном районе дольки. Если пул гепатоцитов, выделенных из печени после индукции НФ, разделить в градиенте плотности фиколла, то мы должны были обнаружить обогащенную цитохромом Р-450 шютную фракцию клеток. Однако, как видно из табл.2 разделение в градиенте фиколла гепатоцитов

Таблица 2. Распределение содержания цитохромов Р-450 иЬ^и активностей МАОРН-цитохром Р-450-редуктааы, бензфетамин-Ы-деметилааы, бенапирен-гидроксилазы и 7-этоксирезоруфин-О-деэтилазы в популяциях гепатоцитов крыс, обработанных НФ.

Плотность Содержание ци- Содержание Активность Активность Активность Активность

фиколла тохрома Р-450 цитохрома fc>5 NADPH-Р-450-ре- бенафетамин-N- бензпирен- 7-этокси-

( г/мл ) (нмоль/1 млн (нмоль/l млн дуктазы (ед. / деметилазы гидроксилазы резоруфин-

клеток) клеток) 1 млн. клеток) (нмоль НСНО/мин/ (нмоль 3-ОН-ЕП/ 0-деатилазы

т=4, п-3 т=4, п=3 ш=2, п-3 1 млн кл.) мин/ 1 млн кл.) (нмоль резо-

ш=2, п=3 т-г, п-3 руфина/мин/

1 млн кл.)

го-1, п-3

1.050 0. 7810. 23 0. 4510.15 14. 819.9 1.1+0.1 1. 87±0. 73 2.05

1.055 0,80±0.15 0. 39+0.14 11.7±8. 3 1. 2+0.1 1. 69±0.88 3.10

1.075 0.72±0.20 0.3110.12 15. 0111. 5' 0. 810.0 1.90±1.20 2.40

1.090 0. 71+0.15 0. 29+0. 05 11. 918. 2 0. 6¿0.4 1.50+0. 70 2.40

1.100 0. 74+0.24 0. 3010.13 15. 4±8.1 0. 910. 2 1. 97Ю. 28 2.56

1.105 0. 8410. 08 0. 4410. 02 9.013.0 0. 610. 4 1.5310. 66 3.70

1.110 0.6110.31 0. 31+0.11 15. 219. 2 0. 8±0.3 1. 4010. 53 2.55

крыс_, получавших НФ, не привело к получению ожидаемых результатов. Содержание цитохрома Р-450 было~1фшёрно одинаковым во всех фракциях гепатоцитов. Более того, выделение клеток из печени крыс, получавших МХ, показало аналогичное распределение количества цитохрома Р-450 в разных по плотности клетках. •

В табл.2 показано распределение активности БП-гидроксила-зы и 73Р-деэтилвзы в субгопуляциях гепатоцитов после введения НФ. Для всех фракций клеток характерна высокая скорость гидро-нсилирования БП (1.87-1.90 нмоль 3-ОН-БП/минЛО® клеток). Скорости метаболизма БП и 7ЭР (специфичных для Форш Р4501А1 субстратов) примерно одинаковы-во всех фракциях НФ-гепатоцктов, так же как и скорость гидроксилирования БП в субпопуляциях гепатоцитов МХ-крыс.

С помощью ракетного иммуноэлектрофореза было оценено содержание формы Р4501А1 в субпопуляциях гепатоцитов НФ-крыс. В общем пуле клеток и в 4,5, и 7-ой фракциях оно составляло около 100 % от всего цитохрома Р-450 после введения НФ.

Исследование распределения МАИРН-цитохром Р-450-р9Дукгазк показало, что как в НФ-, так и в МХ-индуцировзншх животных активность данного фермента примерно одинакова во всех фракциях клеток.

Таким образом, в модели разделения гепатоцитов, выделенных из МХ- и НФ-крыс, е градиенте фкколла нами было выявлено равномерное распределение содержания суммарного цитохрома Р-450, формы Р4501А1, цитохрома Ь5, а также активностей ЕП-гидроксила-зы, 7-этоксирезоруфин-0-деэтилазы и КАПРН-цитохром Р-150-редук-тазы..

В реальных условиях более вероятно одновременное воздействие на организм нескольких ксенобиотиков. Нами была выбрана модель, когда животным вводили одновременно ФВ (в течение 4 дней) и НФ (в течение 3 дней). После разделения общего пула гепатоцитов в градиенте фиколла мы обнаружили только три верхние фракции клеток вместо обычных 6-7 фракций (табл.3). Характерно, что верхняя граница плотности гепатоцитов не изменилась, клетки стали более однороднымми по плотности в "легкув" сторону.' Содержание цитохрома Р-450 в общем пуле гепатоцитов

Таблица 3. Распределение содержания цитохромов Р-450 и Ь.^ и активностей МАОРН-цитохром Р-450-редуктазы, бенафетамин-Ы-деметидазы, бензпирен-1-идрокеилззы и 7-этоксирезоруфин-О-дезтилазы в популяциях гепатоцитов крыс, обработанных ФВ и НФ.

Активность Активность Активность Активность

МАБРН-Р-450-ре- бензф'гтзмин-М- бенапирен- 7-зтокси-дуктазы (ед. / деметшазы гидроксилазы резоруфин-1 млн. клеток) (нмоль НСНО/мин/ (нмоль З-ОН-БП/ 0-дезтилазы т-1, п=»3 1 млн кл.) мин/ 1 млк кл.) (нмоль реэо-ш=1, п=3 т=1, п=3 руфина/мин/

1 млн кл.) т=1, п=3

1.050 0.89+0.33 0.21+0.10 58 1.35 0.449 0.64

1.055 0.97±0.43 0. 20±0.10 82 1.90 0.502 0.90

1.075 0.84+0.41 0.22+0.0 59 1.60 0.561 0.61

Плотность Содержание ци- Содержание

фиколла тохрома Р-450 цитохрома Ь^

( г/мл ) (ншль/1 млн (нмоль/1 млн клеток) , клеток) т=2, п=3* ш=2. п=3

■ :'6ею в I.I5 раза вше, чем в СЕ- и в 1.22 раза Еыше, чем в НФ-] гепатоцитах. В субпопуляциях гепатоцитов крыс, получавших ФБ и [;. BD, количество цитохрома P-45Q было распределено равномерно по г . фракциям клеток

При измерении скоростей метаболизма субстратов, специфичных для цитохррмов P450IIB1 и P450IA1, мы установили также рав-: номерное'распределение активностей БФА-деметилазы, БП-гидро-;.ксзилази и 7ЭР-0-деатилазы в субпопуляциях гепатоцитов крыс после совместного введения индукторов. '' В общей фракции гепатоцитов крыс, получавших два индуктора jf-,одновременно, общее содержание цитохрома Р-450 выше, чем у жи-' !f. bot^jx, индуцированных только ФБ или НФ, однако, относительное Ь содержание специфичных форм и скорости метаболизма специфичных -'субстратов заметно нижа, чем у ФБ- или НФ-индуцированных крыс.

Таким образом, в модели одновременного .введения двух индукторов крысам, когда происходит заметное выравнивание гепа-f тоцитов по плотности, и разделение их в плотностном градиенте

• становится достаточно сложным, задача получения субпопуляций

• гепатоцитов, избирательно обогащенных разными формами цитохро-ь.ма Р-450, становится не совсем корректной. В этом случае для

■ выяснения локализации изоформ цитохрома Р-450 в различных рай' онах дольки печени при введении одного или нескольких индукто-

• ров более удобен и более корректен иммуногистохимический , подход.

Сравнительный анализ локализации молекулярных форм цитохрома Р-450 в дольке печени и содержания этих фор« в микросомах крыс в моделях с раздельным и совместным введением ФЕ и MX.'

'.».'; - Ишуногистохимический анализ показал, что двухдневное введение ФБ сопровождается интенсивным синтезом цитохрома P450IIB1(+В2) только в небольшом'числе клеток, расположенных в ценгролобулярном районе. Непонятно, почему только в единичных йлегках происходит интенсивный синтез цитохрома P450IIB1(+В2). Возможно, это объясняется тем, что в печени краевые центролобу-лярные клетки выполняют барьерную функцию. Данный факт имеет

интерес для исследования механизма и регуляции синтеза цитохро-м ммма Р-450 под действием ксенобиотиков. Можно также объяснить".- ^ тем, что клетки центролобулярного района содержат большее коли-^ чество гладкого эндоплазматического рэтикулума и имеют поэтому,.: большее количество точек встраивания-вновь синтезированных шо-у;', лекул цитохрома Р-450.

Введение ФБ в течение четырех дней приводит к интенсивному окрашиванию всей центролобулярной и в меньшей степени дадиналь-* ной зоны дольки. По-видимому, при длительном введении ФВмоно- ) оксигеназн "барьерных" клеток уже не справляются с функцией ,'j биотрансформащш ксенобиотика, и поэтому подключаются остальные, центролобулярные и частично мединальные гвпатоциты. Общее со-, л держание цитохрома Р-450, измеренное спектрально, и содержание изоформы P450IIB1(+В2), оцененное иммунохимически; в микротомах, печени крыс, получавших ФБ в течение 4 дней, практически в два ; раза ваше, чем после двухдневного введения ФБ. Таким образом, сравнивая иммуногистохимические и ш.мунохшнческие данные, моя-, но предположить, что в печени крыс после введения ФБ в течение •' двух дней практически весь цитохром P45QIIB1 (+В2) сосредоточен, в небольшом числе краевых центролобулярных клеток. -х

В экспериментах по «следованию распределения содержания цитохрома Р-450 и активности метаболизма специфичных субстратов; в субпопуляциях гепатоцитов крыс, получавших НФ и MX, у нас возникло предположение, что эти индукторы одинаково воздействуй ют на распределение формы P450IA1 в дольке печени. В связи'о этим мы провели иммуногистохимическое исследование внутридоль-ковой локализации цитохрома P450IA1 у крыс, получавших эти индукторы, ж в микросомах печени была оценена степень индукции микросомной монооксигеназной системы. Действительно, в отличие от результатов, полученных Вулфом с соавт. и Фостера с соавт.. (Poster et al., 1987), мы обнаружили совершенно аналогичное действиз этих индукторов на распределение цитохрома Р450Ш в дольке, а именно данная форма выявлялась равномерно во всех районах дольки печени.

Введение крысам MX в течение 2 дней приводит к почти мак- , симальной индукции цитохрома Р-450, которая наблюдается после-4-дневного введения индуктора. Иммуногистохимичеокий анализ та1

чени крыс после 2-дневного введения МХ показал, что форма Р4501А1 синтезируется ео всех зонах дольки, а дальнейшее введение ксенобиотика приводит лишь к более интенсивному окрашиванию в клетках. Характерно, что в случае МХ-нндукции как содержание формы Р4501А1 в микросомной фракции печениГ так и распределение этой формы в гепа'тоцитах в зависимости от дозы индуктора меняются одинаково, т.е. дозо-зависимый эффект наблюдается в течение первых двух дней введения МХ. В случае же ФБ-индукции эти показатели меняются по-разному. Дозо-зависимый эффект для содержания формы Р450ПВ1 (+В2) сохраняется в течение 4 дней введения индуктора, а для распределения этой формы в центролобулярном районе предполагается "пороговая" концентрация индуктора ФБ, после превышения которой в синтез формы вовлекаются все клетки центролобулярной и части мединальной зон дольки печени крыс.

Таким'образом, при исследовании динамики индуцирущего действия ФБ и МХ выявляются существенные различия в характере локализации Р45011В1(+В2) и Р4501А1 в гепатоцктах различных зон дольки, что может иметь значение для регуляции отдельных молекулярных форм цитохрома Р-450 в клетках печени.

Для выяснения локализации форм Р450ПВ1 (+В2) и Р4501А1 в моделях с совместным и раздельным введением ФБ и МХ мы использовали следущую схему введения индукторов крысам:

* \ дни . I 2 3 4 5

группы N

I «СБ ФБ - - *

2 ФБ ФБ МХ МХ 3

3 МХ МХ - - а

4 МХ МХ ФБ ФБ б

5 - - ФБ ФБ о

6 - - МХ ЮС й

7 - - - - *

В микросомной фракции целой печени с помощью ракетного иммуноэлектрофореза показано, что, несмотря на увеличивающееся распространение специфичного окрашивания по всей центролобулярной зоне при иммуногистохимическом исследовании, содержание цитохрома Р450ПВ1 (+В2) через 2 суток после отмены индуктора (рис.1) снижается по сравнению с его уровнем после 2-суточного

введения ФБ - 0.82 нмоль на I мг бежа. При последовательном

1.0

X

cz

т

I

2

3

4 5

б

Рис. I. Содержание цитохромов P45GIIB1(+В2) (а) и P450IA1 (б) в макросомэх печени крыс, получавших ксенобиотики ФБ- и МХ-типа; по оси збсцнсс - & группы, по оси ординат - содержание цитохро-ысв Р-4Е0 (нмоль/I мг белка).

* - содержание формы меньше 3 % от общего содержания цитохрома

введении ФБ и МХ крысам 2-й группы содержание Р45011В1(+В2) не снижается по сравнению с содержанием этой формы после 2-суточ-ного введения ФБ крысам (0.82 нмоль/мг белка), как это происходит у крыс соответствующей контрольной группы. При иммуногисто-химическом анализе выявляется интенсивное окрашивание 1-2 рядов клеток вокруг центральной вены. В других клетках центролобуляр-ной зоны окрашивание полностью отсутствует в отличие от гепато-цктов центролобулчрной зоны дольки печени крыс, в которых через 2 суток после отмены ФВ выявляется локализация Р450ПВ1 (+В2).

Форма Р4501А1 при последовательном введении ФБ и МХ перераспределяется в перипортальный район, тогда как при введении крысзм одного Ж эта форма локализуется во всех зонах дольки. В то ке время в микросомной фракции имыунохимически определяется

F-450.

некоторое увеличение содержания формы Р4501А1.

Как показано ранее 2-суточная инъекция крысам МХ приводит к -синтезу изоформы Р4501А1 в гепатоцитах всех зон печеночной дольки. Это, однако, не препятствует синтезу молекулярной формы Р450НВ1 (+-В2) в центролобулярной зоне при последующем введении ФБ. Эти дан^.е находят свое подтверждение при иымунохимическам определенш содержания этой изоформы в микросомах печени животных 4-й группы. Цитохром Р4501А1 в данной группе, так же как и во 2-й груше иммуно1тстохимич8ски определяется только в пери-портальной зоне.

Таким образом, при последовательном введении двух индукторов цитохром Р450ПВ1 (+В2) локализуется только в центролобулярной районе, а форма Р4501А1 - только в перипортальном районе дольки печени крыс; при этом форма Р450ПВ1 (+В2) во Есех случаях связана с центролобулярным районом дольки, а форма Р4501А1, локализуемая при индукции крыс одним МХ во всех трех зонах дольки, при последовательном?,? введении индукторов "перераспределяется" в перилортальную зону дольки печени. Поскольку, тленно форма Р4501А1 катализирует в печени реакции метаболической активации мутагенов и канцерогенов, реально говорить о ключевой роли монооксигеназ перипортальных гепатоцитов на стада инициации химического канцерогенеза.

Влияние частичной гепатэктомии на активность микросомной монооксигеназной системы и распределение форм цитохрома Р-450 в дольке печени крыс, получавших ФБ и МХ.

Удаление 2/3 объема печени сопровождается усиленной пролиферацией гепатоцитов' на 2-й день после операции, что приводит к тому, что суммарная клеточная популяция становится однородной и напоминает гепатоцигн перипортального района. В связи с 5тж.; представлялось актуальным исследование индукции и зональной гетерогенности распределения форм ""4501181 (+В2) и Р4501А1 в дольке печени ФБ- и МХ-крыс после частичной гепатэктомии.

Введение крысам ФБ в течение двух дней после частичной гепатэктомии приводит к увеличен«) в 3.3 раза количества СО-свя-знвающего гемопротеида по сравнен™ с гепатэктомировэнными жи-

вотннми, не получавиими индуктор (табл. 4).

Таблица 4. Влияние частичной гепатэктомии на содержание цитохромов Р-450 и Ь5 и активность бензфетамин-1г-деметилазы в микросомах печени иктакгных и ФБ-индуцированных крыс.

Содержание Содержание Активность

ГРУППА цит. Р-450 цит. Ь5 бензфетамин-

(кмольДмг (нмоль/ 1мг Н-демэтилазы

белка) белка) (нмоль КСНО/мин/ I мг белка)

контроль +

гепатэктомия 0.43+0.17

0.33+0.04

2.20+0.27

ФЕ + гепатэктомия

контроль "ФБ

* 0.30±0.03 24.0±0.75*

0.32+0.03 6.31±0.61

1.43+0.27 0.63+0.06

1.45+0.15* 0.30+0.03

12.0±1.15*

Примечание: * - р < 0.05

Измерение содержания формы Р450НВ1 (+В2)" методом ракетного иммуноэлектрофорезв у крыс после частичной гепатэктомии показа-зало, что у животных, получавших ФБ, обнаруживается 40 % этой формы от общего содержания цитохрома Р-450. Этот показатель практически не отличается по своему уровню от уровня содержания данной форш у нормальных животных, получавших ФБ в течение 2 дней. Однако, введение индуктора приводит к 10-кратному увеличению скорости "Г-деме тилирования БФА в микросомах печени крыс после частичной гепатэктомии в отличие от двукратного увеличения у нормальных жиеотвых.

й.й'.уЕОгистохи?.п1ческий анализ показал, что в дольке печени гепатэктомироваяных ФБ-хрыс форма Р450НВ1 (+В2) обнаруживается

хаотично как в клетках центролобулярного района, так и медина-льного и пэригортального.

Таким образом, очевидно, что гетерогенное распределение форш Р450ПВ1 (+В2) в дольке не связано с градиентом кислородного, гормонального и т.п. микроокрукекия, которое генерируется печеночной циркуляцией через дольку, как предполагали Юнгерман и соавт. (Лищегпвпп еХ, а1., 1986). Более вероятно предположить, что основной причиной локализации форш Р450ПВ1 (+В2) в центролобулярном районе является большая дифференцированность гепатоцитов этого района.

Введение крысам МХ в течение двух дней после частичной ге-патэктомии также приводит к более сильной индукции цитохрома Р-450' (табл.5): возрастание общего содержания цитохрома Р-448 у

Таблица 5. Влияние частичной гепатэктомии на содержание цитохромов Р-450 и ЬБ и активность бензпирен-гидроксилазы в, микросомах печени интактных и МХ-индуцирозанных крыс.

ГРУППА Содержание цит. Р-450 (нмоль/1 мг белка) Активность бензпирен-гидроксилазы 1Л#П ТТХ, ATJTLJ / Ül4l\JJiiJ и J-liif 11МШ/ I мг бежа I нмоль P450IA1

контроль + гепатэктомия 0.43+0.17 0.10+0.01

МХ + гепатэктомия 1.91+0.60* 5.5I+I.BI* 8.86+1.26

контроль 0.63+0.06 0.90+0.10 -

МХ I.10+0.12* 4.27+0.45* 4.00+1.00

Примечание: * - р < 0.05

гепатзктомированных МХ-крыс было в дез с липким разз больше, чем у нормальных животных, инъецированных МХ. Однако иммунохи-

мвческий,анализ показал, если у нормальных животных МХ приводит к индукции 70-80 % форш Р4501А1 от общего содержания цитохрома Р-448, то у гепатэктсмированннх животных содержание формы Р4501А1 составляет 30-40 %. Иммуногистохимический анализ показал, что в регенерирующей печени крыс после введения МХ форма Р4501А1 выявляется во всех районах дольки, подобно тому как это нзблвдается в печени нормальных крыс, получавших МХ в течение двух дней.

Возрастание общей бензпирен-гидроксилазной активности у гепатэктомированшх крыс более, чем в 10 раз превысило этот показатель у нормальных зшеотных. Кроме того, специфичная бензпи-рен-гидроксилззная активность форш Р4501А1 (в расчете на содержание этой форш) у МХ-индуцированных гепатэктомированннх животных оказалась в 2 раза выше, чем у нормальных получавших, МХ. Таким образом, как и в случае с введением ФБ в печени ге-патэктомированных МХ-хрыс отмечается повышенная скорость биотрансформации ксенобиотика по сравнении с нормальными индуцированными .».К животными.

Исследование распределения форм Р4501А1 и Р450ПВ1 (+В2) в гепатоцитах и дольне печени в различных моделях воздействия индукторов свидетельствуют а возможности селективного синтеза форм В'разных зонах дольни. В настоящее время не оставляет сомнений факт, что форма Р450ПЕ1 ответственна за метаболическую детоксикацив ксенобиотиков, а форма Р4501А1 пригодит к биотрансформации чужеродных соединений в реакишные промежуточные метаболиты, опосредуя тем самым процессы канцерогенеза, мутагенеза и т.п. В связи с этим возможность перераспределения форм в разные зоны дольки представляется весьма еэкнсй, поскольку такую возможность реально использовать для направленного избирательного ингибирования определенных форм в дольке печени животных и человека

Нами показано, что частичная гепзтэктсмия приводит к повышенному отьету монооксигеназной системы на введение индукторов (лекарств). Дзнеый факт необходимо учитывать в онкологии, т.к. удаление чзсти печени людям но случаю гепатом и др. болезней, с последующей интенсивной химической обработкой, может приводить

к нежелательным, а возможно, негативным последствиям в организме.

ВЫВОДЫ

1. При индукции фенобзрбиталом наибольшее содержание цито-хрома Р450ПВ1 (+В2) и активность бензфетамин-Ы-деметилазы выявляются в "легких" центролобулярных гепатоцитах, в процессе увеличения дозы фенобарбитала регистрируемая иммуногистохимически ■ площадь локализации формы Р450ПВ1 (+В2) увеличивается от узкого участка вокруг центральной ьены до всей центролобулярной зоны и части мединальной зоны печеночной дольки.

2. Введение З-метилхолангрена или р-нафтофпавона приводит к равномерному распределению содержания формы Р4501А1 и активности бэнзпирен-гидроксилззы в тяжелых ж легких фракциях гепа-тоцитов и во всех зонах дольки печени.

3. В микросомах печени крыс, одновременно получавших 3-метилхолзнтрэн и фенобарбитал, количество форм Р4501А1 и Р450ПВ1 (+В2) соответствует количеству зтиу. форм у крыс, получавших эти индукторы раздельно, в то Еремя как в суммарной фракции гепатоцитов при совместном введении крысам двух индукторов показано меньшее количество форм по сравнению с крысами, получавшими ода® из индукторов.

4. В субпопуляциях гепатоцитов при совместном введении крысам индукторов ФБ- и МХ-типа не выявлено различий в распределении содержания и активностей форм Р4501А1 и Р450ПВ1 (+В2), однако иммуногистохимически выявляется перераспределение формы Р4501А1 в перипортальную зону дольки печени, при этом количество ее в микросомах: (выделенных из гепатоцитов всех трех зон) не уступает содержанию этой формы при введении одного ИХ.

5. Частичная гепатэктомия приводит к увеличению активности изоформ цитохромз Р-450 е печени индуцированных фенобарбиталом или 3-метилхолантреном животных, а также к перераспределению форш Р450ПВ1 (+В2) ео Есе зоны дольки печени крыс, получавших фенобарбитал.

го

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Полякова Н.Е., Суслова Е.Э. Эффекты раздельного и совместного In vivo введения фенобарбитала и 5,6-Оензофлавона на монооксигеназы гепзтоцитоз крыс // Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды: Тез. дскл. Всес. науч. конф.-Новосибирск, 1987,- С. 112.

2. Суслова Е.Э., Беляев Л.Л., Полякова Н.Е. Иммуногисто-химическая детекция изоформм Р-450Ь и Р-450с в печеночной дольке крыс // Цитохром Р-450 и модификация макромолекул: Тез.докл. V Всес. науч. конф.- Ялта, 1989.- С. 217.

3. Суслова Е.Э., Субботин В.М. Влияние частичной гепат-эктомии на индукции ферментов ммикросомальной системы крыс // Там же.- С. 219.

4. Суслова Е.Э., Часовникова О.Б., Митрофанов Д.В., Цырлов И.Б. Действие 2,3,7,8-тетрахлородибензо-р-даоксина на распределение цитохромов Р-450с и Р-4501 в печеночной дольке крыс //Там же.- С. 221.

5. Суслова Е.Е., Беляев Л.Л., Полякова Н.Е., Колесников С.И., Цырлов И.Б. Влияние раздельного и последовательного введения крысам индукторов цлтохрома Р-450 на локализацию различных изоформ фермента в клетках печеночной дольки // Цитология.-1989.- В 7.- С. 757-761.

6. Суслова Е.Э., Беляев Л.Л., Колесников С.И., Цырлов И.Б. Влияние фенобарбитала и 3-метилхолантрена на динамику распределения молекулярных форм цнтохрома Р-450 в печеночной дольке крыс // Дел. в ВИНИТИ 07.09.89.- Ji 5709-В.

7. Tsyrlov I.B., Polyakova N.E., Suslova E.E. Induction of monooxygenases by xenoblotics: New data and. approaches // Symp. "Drug metabolizing systems".- Sofia, 1986.- P. 120.

8. Tsyrlov 1.3., Suslova E.E., Eeljaev b.L. Localisation of molecular forms of cytochrome P-450 In rat liver lobule cells: effects of separate and consecutive treatment with P-450-inducers // Hepatologlsclies Symp.- Jena, 1988.- P. 76.

9.. Tsyrlov I.В., Polyakova N.E., Suslova E.E. A model for analysis of heterogeneous synthesis of cytochrome P-450 molecular forms In rat liver lobule // 6-th. Intern. Conf. on Biochem.

and Blophjs. ol Cytochrome P-450.- Vienna, 1988.- P. 84.

10. Suslova E.E., Tsyrlov I.B. The effects of partial he-patectonjy on the Induction of rat microsomal monooxygenase system // Drug metabolizing enzyme systems: II-th Intern. Sympos.- Varna, 1989.- P. 84.

11. ItfaKhbvIch V.V., Suslova E.E., Chasovnilcova O.B., Mit-rofanov B.V., Tsyrlov I.B. Heterogeneous distribution of monooxygenase lsolorma P-450c and P-450d within liver lobule // DIOHN-89: ibst. 9-th. Intern. Sympos.- Toronto, 1989.- P. Tox. 31.

12. Tsyrlov I.E., Chasovnikova O.B., Suslova E.E. A comparison of benzpyrene-hydroxylases pre induced in rat liver by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dloxln and 3-methylcholanthrene // 3rd Europ. Sympos. on Poreign Compound Metabolism.- London, 1989.- P. ki.

3aK. 77 Tnp. 100 lie«.». 1.0

THnorpe$HH CO AMH CCCP I99Ir.