Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка биореактора для системы "биологическая искусственная печень"

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Соловьев, Валерий Владимирович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1. Общее представление о системе «биологическая искусственная печень»

1.2. Гепатоциты в системе ИП

1.3. Биореакторы для системы «биологическая искусственная печень»

1.3.1. Биореакторы для суспензионных клеточных культур без иммобилизации клеток

1.3.2. Биореакторы, основанные на использовании иммобилизованных клеток

1.3.3. Биореакторы, основаннце на использовании полупроницаемых мембран, обеспечивающих массообмен и иммобилизацию клеток в аппарате.

1.3.4. Биореакторы, предназначенные для культивирования фрагментов

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение

3.1. Исследование функционального состояния гепатоцитов в тканевых фрагментах печени в культуре

3.1.1. Уровень функциональной активности гепатоцитов во фрагментах печени

3.1.2. Зависимость функциональной активности гепатоцитов от исходного уровня гликогена

3.1.3. Зависимость уровня функциональной активности от размеров фрагментов

3.1.4. Зависимость функциональной активности гепатоцитов во фрагментах от уровня кислорода

3.1.5. Оценка интактности гепатоцитов во фрагментах в культуре по высвобождению ЛДГ

3.1.6. Длительность функционирования гепатоцитов во фрагментах

3.2. Разработка биореактора биологическая искусственная печень»

3.2.1. Основные принципы построения и функционирования биореактора

3.2.2. Масштабирование биореактора

3.2.3. Функциональная активность гепатоцитов во фрагментах печени в новом биореакторе

3.3. Исследование эффективности разработанного биореактора при лечении экспериментальной острой печеночной недостаточности у крыс

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка биореактора для системы "биологическая искусственная печень""

Печень — один из наиболее крупных органов человеческого тела, играющий важную роль в пищеварении и обмене веществ. Печень представляет собой центральный орган химического гомеостаза организма, важнейшими функциями которого являются обмен белков, углеводов, липидов, витаминов, пигментов, водный и минеральный обмен, секреция желчи, детоксицирующая функция.

Во всем мире заболевания печени занимают существенное место среди причин нетрудоспособности и смертности. Более того, отмечается тенденция к росту заболеваемости, в частности, острым вирусным гепатитом ежегодно заболевает не менее одного миллиона жителей земного шара. Кроме того, печень может поражаться вследствие отравлений гепатотропными ядами, паразитарных заболеваний, травм, желчнокаменной болезни и т.п. В результате заболевания происходит угнетение или полное выпадение ряда жизненно важных функций органа — синдром печеночной недостаточности (ПН). Нарушается поддержание химического гомеостаза организма, изменяется состав крови, в частности, наблюдается накопление в ней токсических продуктов метаболизма азотистых соединений, в первую очередь аммиака, ароматических аминокислот, индола, меркаптанов и т.п. Повышение уровня токсических веществ приводит к угнетению функции мозга л развитию печеночной энцефалопатии, что и является зачастую непосредственной причиной смерти при ПН. В тяжелых случаях, определяемых как острая печеночная недостаточность (ОПН), смертность превышает 80 %. Поэтому крайне перспективной представляется идея создания такого способа или устройства, которые позволили бы временно компенсировать функции печени, продлить жизнь больного и дать таким образом возможность дождаться выздоровления его пораженного органа.

Это тем более реально вследствие известной феноменальной способности печени к регенерации и восстановлению функциональной массы.

Наиболее простой и логичной была попытка смоделировать детоксикационную функцию печени, используя различные гемосорбенты или диализные устройства для удаления токсинов из крови при ПН. Действительно, таким образом можно добиться снижения уровней ряда низко- и среднемолекулярных веществ, часть из которых являются токсичными для организма. Однако, эффективность этих подходов для лечения ПН оказалась недостаточной из-за неспецифичности сорбции, в результате чего наряду с удалением токсинов происходит также удаление ряда необходимых веществ. Кроме того, никак не моделируются другие важные печеночные функции. Попытки перфузии крови больного через трупную печень или печень животных, перекрестного кровообращения, трансплантации донорских гепатоцитов оказались сопряжены с рядом трудностей и не дали ощутимого результата. Радикально улучшить выживаемость пациентов (до 65-80 % в течение года) с острыми и хроническими (поздние стадии) заболеваниями печени позволяет лишь трансплантация донорской печени. Однако, применение этой операции не лишено недостатков: высокая стоимость операции, ограниченная доступность донорского материала, что приводит к гибели части больных, ожидающих операцию. Кроме того, значительная часть пациентов имеет медицинские противопоказания к операции, либо психологические или социальные причины для отказа от трансплантации. Длительная иммуносупрессия, применяемая после трансплантации, также обладает рядом негативных побочных эффектов. И, наконец, пересадка донорского органа не оставляет шансов на выздоровление собственной печени, что имеет место в ряде случаев. Поэтому, с учетом вышесказанного, в настоящий момент представляется перспективным применение при ОПН временной экстракорпоральной перфузионной системы, содержащей наряду с неспецифическим сорбентом (типа активированного угля) биологический компонент, назначение которого -осуществление специфических детоксикационных, биотрансформационных и биосинтетических функций печени. В качестве биологического компонента предполагается использовать функционально полноценные живые гепатоциты. Наиболее подходящими для этой цели оказались гепатоциты свиньи, в силу своей доступности и метаболического подобия гепатоцитам человека. Помимо осуществления метаболической активности, живые гепатоциты могут секретировать факторы, стимулирующие процессы регенерации в пораженной печени, и этот момент может оказаться даже более важным, чем только компенсация метаболических функций.

В научной литературе описано довольно большое количество подобных систем, однако большинство из них не испытано даже на животных, единичные образцы в порядке эксперимента подключались человеку, а в широкую практику не вошел ни один из аппаратов. Причина сложившейся ситуации - в высоких требованиях, предъявляемых к устройству, и в недостаточном совершенстве существующих вариантов систем. Основным функциональным элементом системы являются живые клетки, и несовершенство проявляется как раз в том, что в существующих прототипах не решена должным образом задача эффективного и в то же время технологически простого использования гепатоцитов. Это объясняется тем, что система должна содержать достаточно большую массу клеток - от 50 до 500 г. В то же время, объем биореактора, в котором размещаются клетки, должен быть небольшим, так как заполняется кровью больного. Поэтому при разработке системы возникает задача высокоплотного культивирования клеток, что само по себе уже является большой биотехнологической проблемой. Кроме того, необходимо создать условия для длительного сохранения гепатоцитами высокой функциональной активности. Следует решить задачу обеспечения эффективного массообмена между клетками и кровью больного. Необходимо также обеспечить надежную иммобилизацию гепатоцитов в перфузионном реакторе, исключающую возможность их уноса потоком. И, наконец, конструкция системы должна давать возможность легко и быстро подготавливать ее к работе, что является важным моментом при практическом использовании, когда нужна оперативность в оказании медицинской помощи.

В настоящее время в большинстве существующих прототипов подобных систем используются изолированные гепатоциты, полученные путем ферментативной дезинтеграции печеночной ткани. Однако, использование изолированных гепатоцитов сопряжено с рядом трудностей. Для их выделения нужны специальные ферменты. Для длительного сохранения функциональной активности изолированных гепатоцитов необходимо их прикрепление к подходящему матриксу. Малые размеры клеток усложняют их удержание в потоке крови (плазмы). Для преодоления этих проблем приходится предпринимать специальные меры, что усложняет аппаратуру и технологию. В то же время существует возможность использования гепатоцитов в составе микрофрагментов ткани печени. При этом сохраняются все типы клеток печени, межклеточные контакты, естественный многокомпонентный межклеточный матрикс и пространственная структура ткани. Перечисленные факторы крайне важны для длительного сохранения высокой функциональной активности клеток. Методы получения фрагментов ткани размером в доли миллиметра, а также их криоконсервации, хорошо отработаны. Поэтому культура фрагментов успешно применялась и применяется для решения ряда научных и практических задач, например, при исследованиях межклеточных взаимодействий, метаболизма ксенобиотиков, в вирусологии и т.п.

Однако, несмотря на все преимущества использования микрофрагментов, в настоящее время нет такого биореактора, который позволял бы культивировать в перфузионном режиме большое количество микрофрагментов ткани при высокой плотности клеточной популяции, в условиях хорошего массообмена между клетками и перфузатом. Отсюда вытекает настоятельная потребность в создании подобного биореактора.

Целью данной работы являлась разработка биореактора для системы экстракорпоральной поддержки печени, основанной на использовании высокоплотной культуры тканевых фрагментов.

Для достижения обозначенной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучение уровня и длительности функциональной активности гепатоцитов во фрагментах печени в культуре в зависимости от размеров фрагментов, концентрации кислорода в среде.

2. Разработка и изготовление биореактора, позволяющего культивировать тканевые фрагменты печени в условиях высокоплотной перфузируемой культуры.

3. Изучение функциональной активности фрагментов печени в разработанном биореакторе при перфузии через биореактор культуральной среды.

4. Оценка эффективности биореактора в лечении экспериментального острого токсического поражения печени у крыс по биохимическим показателям крови и по выживаемости животных.

В ходе работы фрагменты печени были протестированы в условиях in vitro по ряду параметров, важных с точки зрения детоксикационной и биотрансформационной роли печени: синтезу мочевины, Р-450-зависимому окислению ксенобиотиков, секреции глюкозы, утилизации аммония и этанола, синтезу и секреции белков и др. Полученные данные свидетельствуют о высокой функциональной активности гепатоцитов во фрагментах, соответствующей активности in vivo, и о реальной возможности использования микрофрагментов в системах экстракорпоральной поддержки печени.

Был разработан новый биореактор, предназначенный для культивирования фрагментов тканей в условиях высокоплотной культуры. Равномерное распределение фрагментов по всему объему биореактора и однородность потока обеспечивают одинаково хорошие условия существования для всех фрагментов. К преимуществам аппарата можно отнести также эффективный массообмен, простоту, малый объем заполнения перфузатом, высокую концентрацию биоматериала - до 20 % от объема реактора. При перфузионном культивировании фрагментов печени крысы в разработанном биореакторе было показано длительное (1-2 суток) сохранение высокой функциональной активности и жизнеспособности гепатоцитов. Оригинальность конструкции разработанного биореактора подтверждена патентом на изобретение.

Были проведены эксперименты на животных (крысы) с модельным острым токсическим поражением печени, в результате которых установлена высокая эффективность разработанного биореактора. Обнаружена достоверная стабилизация ряда параметров крови (аммоний, аминокислоты, глюкоза) в течение 4 часов экстракорпоральной перфузии крови через биореактор, содержащий микрофрагменты печени, а также повышение выживаемости животных после сеанса перфузии через биореактор.

Таким образом, проведенные исследования позволяют сделать вывод о перспективности разработанного биореактора для клинического использования в системе «биологическая искусственная печень».

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Соловьев, Валерий Владимирович

Выводы

1. Функциональная активность гепатоцитов во фрагментах, включая детоксикационную и синтетическую функции, сохраняется в культуре не менее суток, что достаточно для использования фрагментов в системе «биологическая искусственная печень».

2. Оптимальные размеры фрагментов ткани печени, при которых наблюдается максимальная детоксикационная активность гепатоцитов, оцениваемая по синтезу мочевины и окислению паранитроанизола при культивировании фрагментов in vitro, составляют 0.4-0.6 мм.

3. Функциональная активность гепатоцитов в тканевых фрагментах размером 0.5 мм в культуре слабо зависит от концентрации кислорода в среде в диапазоне от 150 до 1000 мкМ.

4. Разработан биореактор для системы «биологическая искусственная печень», основанной на использовании микрофрагментов печени для лечения ОПН. Выполнен теоретический анализ характеристик биореактора. Определены допустимые потоки крови и плазмы крови через биореактор, принципы масштабирования биореактора.

5. Показано длительное (1-2 суток) сохранение высокой функциональной активности гепатоцитов и их жизнеспособности при перфузионном культивировании фрагментов печени крысы в разработанном биореакторе.

6. Установлена высокая эффективность разработанного биореактора при лечении экспериментального острого токсического поражения печени у крыс. Обнаружены стабилизация параметров крови (аммоний, аминокислоты, глюкоза) в течение 4 часов экстракорпоральной перфузии крови через биореактор, содержащий микрофрагменты печени, и последующее повышение выживаемости животных.

7. Выполненные исследования свидетельствуют о перспективности разработанного биореактора для клинического использования в системе «биологическая искусственная печень».

Автор выражает благодарность своим руководителям Э.И.Лежневу и B.C. Акатову; Е.А.Гущину за разработку и создание прибора для нарезки микрофрагментов печени; проф.Н.А.Онищенко за постоянное внимание к работе; проф. Е.И.Маевскому за обсуждение результатов работы; к.б.н.Т.А.Мурановой и к.б.н. Л.Ф.Маркиной за неоценимую помощь в проведении биохимических анализов; д-ру Ахмед Hyp ЭльДин Хассану за помощь в проведении исследований; всем сотрудникам лаборатории цитотехнологии ИТЭБ РАН за моральную поддержку.

Заключение

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соловьев, Валерий Владимирович, Пущино

1. Андрейман JT.A. Пути повышения эффективности сорбционных методов при лечении печеночной недостаточности: Автореф. дисс. на соискание ученой степени д-ра мед.наук. М., 1988. - 38 с.

2. Асатиани B.C. Биохимический анализ. Тбилиси: 1962. - 698 с.

3. Бейли Н. Статистические методы в биологии: Пер. с англ. М.: 1962. - 260 с.

4. Березовский В.А. Напряжение кислорода в тканях животных и человека. Киев: Наукова думка, 1975. - 280 с.

5. Бочаров А.В. Использование культивируемых на микроносителях гепатоцитов для искусственного поддержания функций печени при ОПН. Автореф. на соискание ученой степени канд. биол. наук. М., 1990.-23 с.

6. Бунятян А.А. (Ред.). Руководство по анестезиологии. М.: Медицина, 1997.-656 с.

7. Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. Ленининград: Медицина, 1973.- 142 с.

8. Зильбер А.П. Клиническая физиология в анестезиологии и реаниматологии. М.: Медицина, 1984. - 480 с.

9. Коллинз Р. Течения жидкостей через пористые материалы: Пер. с англ. М.: Мир, 1964. - 350 с.

10. Королев Б.А., Гагушин В.А. Хирургия циррозов печени. М: Медицина, 1973. - 160 с.

11. Корухов Н.Ю., Писаревский А.А., Лотц Ю.А., Цимаркина Г.Е., Перминова З.А. Варианты схемы аппарата "Вспомогательная печень" // Медицинская техника. 1988. - №3. - С. 43-46.

12. Лопаткин Н.А., Лопухин Ю.М. Эфферентные методы в медицине. -М.: Медицина, 1989. 348 с.

13. Лукьянова Л.Д, Балмуханов Б. С, Уголев А. Т. Кислород зависимые процессы в клетке и ее функциональное состояние. М.: Наука, 1982. - 302 с.

14. Лукьянова Л.Д.(Ред). Гепатоцит: функционально-метаболические свойства. М.: Наука, 1985. - 260 с.

15. Мазур С.П. Факторы, регулирующие поглощение и биотрансформацию ксенобиотика р-нитроанизола в свежевыделенных и криоконсервированных гепатоцитах крыс: Автореф. на соискание ученой степени канд. биол. наук. Харьков, 1991. - 18 с.

16. Малета Ю.С., Тарасов В.В. Непараметрические методы анализа в биологии и медицине. М.: Издательство МГУ, 1982. - 178 с.

17. Мамхегова Т.Р. Использование регулирующих воздействий клеток органов портальной системы для восстановления функции гепатоцитов поврежденной печени: Автореф. на соискание ученой степени канд. биол. наук. М., 1998. - 32 с.

18. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуелл В. Биохимия человека: Пер. с англ. М.: Мир, 1993. - Т. 1-2.

19. Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П., и др. Под ред. Меньшикова В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник. М.: Медицина, 1987. - С. 217-219.

20. Ночевный В.Т. Оптимизация процессов производства культур клеток и вирусов в суспензии переживающих тканей: Дисс. в форме научногодоклада на соискание ученой степени д-ра биол. наук. М., 1994. - 49 с.

21. Ньюсхолм Э., Старт К. Регуляция метаболизма: Пер. с англ. М.: Мир, 1977.-407 с.

22. Подымова С.Д. Болезни печени. М.: Медицина, 1993. - 544 с.

23. Соловьева М.Е., Акатов B.C., Лещенко В.В., Кудрявцев А.А. Механизмы гибели миеломы NS (0) в культуре. // Изв. АН. Сер. Биол. 1998, Т. 2, С. 194-199.

24. Хаппель Дж., Бреннер Г. Гидродинамика при малых числах Рейнольдса. М.: Мир, 1976. - 630 с.

25. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Писаревский А.А. и др. Способ получения и консервации взвеси клеток печени для экстракорпорального лечения печеночной недостаточности: Методические рекомендации. М., 1990. - 7 с.

26. Шумаков В.И (Ред.). Искусственные органы. М.: Медицина, 1990. -С.117-134.

27. Arkadopoulos N, Detry О, Rozga J, Demetriou AA. Liver assist systems: state of the art. Int J Artif Organs. 1998, 21, 781-787.

28. Bergmeyer H.U. Metods of Ensimatic Analysis, 1963, 59-62.

29. Blei AT. Brain edema and intracranial hypertension: a focus for the use of liver support systems. Artif Organs. 1997, 21, 1182-1184.

30. Busse B, Gerlach JC. Bioreactors for hybrid liver support: historical aspects and novel designs. Ann N Y Acad Sci. 1999, 875, 326-339.

31. Catapano G. Mass transfer limitations to the performance of membrane bioartificial liver support devices. Int J Artif Organs. 1996, 19, 18-35.

32. Chang TM Clinical experience with AC AC coated charcoal hemoperfusion in acute intoxication. Clin Toxicol. 1980, 17, 529-542.

33. Chen SC, Mullon C, Kahaku E, Watanabe F, Hewitt W, Eguchi S, Middleton Y, Arkadopoulos N, Rozga J, Solomon B, Demetriou AA. Treatment of severe liver failure with a bioartificial liver. Ann N Y Acad Sci. 1997, 831,350-360.

34. Clayton DF, Harrelson AL, Darnell JE Jr. Dependence of liver-specific transcription on tissue organization. Mol Cell Biol. 1985, 5, 2623-2632.

35. Colowick SP, Kaplan NO. Methods in Enzymology. Biomembtanes. Part C. v. LII. Academic Press, 1978, p. 48.

36. Demetriou AA. Support of the acutely failing liver: state of the art. Ann Surg. 1998,228, 14-15.

37. Detry O, Arkadopoulos N, Ting P, Kahaku E, Watanabe FD, Rozga J, Demetriou AA. Clinical use of a bioartificial liver in the treatment of acetaminophen-induced fulminant hepatic failure. Am Surg. 1999, 65, 934938.

38. Dich J, Vind C, Grunnet N. Long-term culture of hepatocytes: effect of hormones on enzyme activities and metabolic capacity. Hepatology. 1988, 8, 39-45.

39. Dixit V, Gitnick G. The bioartificial liver: state-of-the-art. Eur J Surg Suppl. 1998, 582, 71-76.

40. Donato MT, Castell JV, Gomez-Lechon MJ. Characterization of drug metabolizing activities in pig hepatocytes for use in bioartificial liver devices: comparison with other hepatic cellular models. J Hepatol. 1999, 31,542-549.

41. Dowling DJ, Mutimer DJ. Artificial liver support in acute liver failure. Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999, 11, 991-996.

42. Dunn JC, Yarmush ML, Koebe HG, Tompkins RG. Hepatocyte function and extracellular matrix geometry: long-term culture in a sandwich configuration. FASEB J. 1989, 3, 174-177.

43. Dunn JC, Tompkins RG, Yarmush ML. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol Prog. 1991,7,237-245.

44. Ellis AJ, Hughes RD, Nicholl D, Langley PG, Wendon JA, O'Grady JG, Williams R. Temporary extracorporeal liver support for severe acute alcoholic hepatitis using the BioLogic-DT. Int J Artif Organs. 1999, 22, 2734.

45. Flendrig LM, te Velde AA, Chamuleau RA. Semipermeable hollow fiber membranes in hepatocyte bioreactors: a prerequisite for a successful bioartificial liver? Artif Organs. 1997, 21, 1177-1181.

46. Fremond B, Malandain C, Guyomard C, Chesne C, Guillouzo A, Campion JP. Correction of bilirubin conjugation in the Gunn rat using hepatocytes immobilized in alginate gel beads as an extracorporeal bioartificial liver. Cell Transplant. 1993, 2, 453-460.

47. Gerlach J, Kloppel K, Schauwecker HH, Tauber R, Muller C, Bucherl ES. Use of hepatocytes in adhesion and suspension cultures for liver support bioreactors. Int J Artif Organs. 1989, 12, 788-792.

48. Gerlach JC. Long-term liver cell cultures in bioreactors and possible application for liver support. Cell Biol Toxicol. 1997, 13, 349-355.

49. Gion T, Shimada M, Shirabe K, Nakazawa K, Ijima H, Matsushita T, Funatsu K, Sugimachi K. Evaluation of a hybrid artificial liver using a polyurethane foam packed-Bed culture system in dogs. J Surg Res. 1999, 82, 131-136.

50. Gripon P, Diot C, Theze N, Fourel I, Loreal O, Brechot C, Guguen-Guillouzo C. Hepatitis В virus infection of adult human hepatocytes cultured in the presence of dimethyl sulfoxide. J Virol. 1988, 62, 41364143.

51. Guguen-Guillouzo C, Gripon P, Vandenberghe Y, Lamballe F, Ratanasavanh D, Guillouzo A Hepatotoxicity and molecular aspects of hepatocyte function in primary culture. Xenobiotica 1988, 18, 773-783.

52. Guillouso A. Plasma protein production by cultured adult hepatocytes. In: Isolated and Cultured Hepatocytes. Ed. by A.Guillouso and C.Guguen-Guillouso. John Libbery Eurotext Ltd/INSERM, 1986, 155-170.

53. Guillouso A. Use of isolated and cultured hepatocytes for xenobiotic metabolism and cytotoxicity studies. In: Isolated and Cultured Hepatocytes. Ed. by A.Guillouso and C.Guguen-Guillouso, John Libbery Eurotext Ltd/INSERM, 1986, 313-322.

54. Hassanein TI, Wahlstrom HE, Zamora JU, Van Thiel DH. Conventional care of fulminant hepatic failure: medical and surgical aspects. Ther Apher. 1997, 1,33-37.

55. Hirasawa H, Sugai T, Oda S, Shiga H, Matsuda K, Ueno H, Sadahiro T. Efficacy and limitation of apheresis therapy in critical care. Ther Apher. 1997, 1,228-232.

56. Hollo way С J, Harstick K, Brunner G. Agarose-encapsulated adsorbents. Int J Artif Organs. 1979, 2, 81-86.

57. Hughes RC, Stamatoglou SC. Adhesive interactions and the metabolic activity of hepatocytes. J Cell Sci Suppl. 1987, 8, 273-291.

58. Hughes RD, Williams R. Use of sorbent columns and haemofiltration m fulminant hepatic failure. Blood Purif. 1993, 11, 163-169.

59. Hughes RD, Williams R. Use of bioartificial and artificial liver support devices. Semin Liver Dis. 1996, 16, 435-444.

60. Isom HC, Secott T, Georgoff I, Woodworth C, Mummaw J. Maintenance of differentiated rat hepatocytes in primary culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 1985,82,3252-3256.

61. Iwata H, Sajiki T, Maeda H, Park YG, Zhu B, Satoh S, Uesugi T, Ikai I, Yamaoka Y, Ikada Y. In vitro evaluation of metabolic functions of a bioartificial liver. ASAIO J. 1999, 45, 299-306.

62. Jauregui HO, McMillan PN, Driscoll J, Naik S. Attachment and long term survival of adult rat hepatocytes in primary monolayer cultures: comparison of different substrata and tissue culture media formulations. In Vitro Cell Dev Biol. 1986, 22, 13-22.

63. Jauregui HO. Perfusion device with hepatocytes. United States Patent № 5,043,260,1991.

64. Jauregui HO. The technology of biological extracorporeal liver assist devices: from infancy to adolescence. Artif Organs. 1997, 21, 1163-1168.

65. Jen AC, Wake C, Mikos AG. Hidrogels for cell immobilisation. Biotechnol Bioeng. 1996, 50, 357-364.

66. Kamohara Y, Rozga J, Demetriou AA. Artificial liver: review and Cedars-Sinai experience. J Hepatobiliary Pancreat Surg. 1998, 5, 273-85.

67. Karlik W, Jozwiak A, Wiechetek M, Werynski A. A simple method for hepatocyte attachment in hollow fibre bioreactors. Int J Artif Organs. 1999, 22, 566-572.

68. Kino Y, Sawa M, Kasai S, Mito M. Multiporous cellulose microcarrier for the development of a hybrid artificial liver using isolated hepatocytes. J Surg Res. 1998, 79, 71-76.

69. Koshino I, Castino F, Yoshida K, Carse C, Kambic H, Scheucher K, Kretz AP, Malchesky PS, Nose Y. A biological extracorporeal metabolic device for hepatic support. Trans Am Soc Artif Intern Organs. 1975, 21, 492-500.

70. Koshino I, Sakamoto H, Shinada Y, Tsuji Y, Kawamata T, Matsushita M, Коп T, Kasai Y. Use of liver slices for an artificial liver. Trans Am Soc Artif Intern Organs. 1979, 25, 493-496.

71. Kremers P. Drug metabolism in cultured fetal hepatocytes. In: Isolated and Cultured Hepatocytes. Ed. by A.Guillouso and C.Guguen-Guillouso. John Libbery Eurotext Ltd/INSERM, 1986, 285-332.

72. Lazar A, Peshwa MV, Wu FJ, Chi CM, Cerra FB, Hu WS Formation of porcine hepatocyte spheroids for use in a bioartificial liver. Cell Transplant. 1995, 4, 259-268.

73. LeBouton A.V. Protein synthesis and secretion. In: Regulation of hepatic metabolism. Ed. by Thurman RG, Kauffman FC, Jungermann K. New York. Plenum Press, 1986, 383-410.

74. Lerche-Langrand C, Toutain HJ. Precision-cut liver slices: characteristics and use for in vitro pharmaco-toxicology. Toxicology. 2000, 16, 153, 221253.

75. Li R, Altreuter DH, Gentile FT. Transport characterisation of hidrogel matrices for cell encapsulation. Biotechnol Bioeng. 1996, 50, 365-373.

76. Lie TS, Jung V, Kachel F, Hohnke C, Lee KS. Successful treatment of hepatic coma by a new artificial liver device in the pig. Res Exp Med (Berl). 1985, 185,483-494.

77. Maas WJ, Leeman WR, Groten JP, van de Sandt JJ. Cryopreservation of precision-cut rat liver slices using a computer-controlled freezer. Toxicol In Vitro. 2000, 14, 523-530.

78. Martin H, Bournique B, Sarsat JP, Albaladejo V, Lerche-Langrand C. Cryopreserved rat liver slices: A critical evaluation of cell viability,histological integrity, and drug-metabolizing enzymes. Cryobiology. 2000, 41, 135-144.

79. Marx U, Bushnaq H, Yalcin E. European research and commercialisation activities in the field of tissue engineering and liver support in world wide competition. Int J Artif Organs. 1998, 21, 119-126.

80. Maslansky CJ, Williams GM. Primary cultures and the levels of cytochrome P450 in hepatocytes from mouse, rat, hamster, and rabbit liver. In Vitro. 1982, 18, 683-693.

81. Matsumura KN, Guevara GR, Huston H, Hamilton WL, Rikimaru M, Yamasaki G, Matsumura MS. Hybrid bioartificial liver in hepatic failure: preliminary clinical report. Surgery, 1987, 101, 99-103.

82. Mcllwain H, Buddie HL.Techniques in Tissue Metabolism. 1. A Mechanical Chopper . Biochem.J. 1953, 53, 412-420.

83. McLaughlin BE, Tosone CM, Custer LM, Mullon С Overview of extracorporeal liver support systems and clinical results. Ann N Y Acad Sci. 1999, 18, 875,310-325.

84. Miyoshi H, Yanagi K, Fukuda H, Ohshima N. Long-term continuous culture of hepatocytes in a packed-bed reactor utilising porous resin. Biotechnol Bioeng. 1994, 43, 635-644.

85. Morsiani E, Pazzi P, Moscioni AD, Rozga J, Azzena G, Demetriou AA. In vitro morphological and functional characterization of isolated porcine hepatocytes for extracorporeal liver support: bile acid uptake and conjugation. J Surg Res. 1998, 79, 54-60.

86. Morsiani E, Rozga J, Scott HC, Kong LB, Lebow LT, McGrath MF, Moscioni AD, Demetriou AA. Automated large-scale production of porcine hepatocytes for bioartificial liver support. Transplant Proc. 1994, 26, 3505-3506.

87. Nadal С, Le Rumeur E, Boffa GA. Rat serum factors inhibiting the Gl-S transition in hepatocytes. I. Production of a low molecular weight inhibitor by proteases or liver fractions. Cell Tissue Kinet. 1981, 14, 601-609.

88. Nakamura T, Nakayama Y, Ichihara A. Reciprocal modulation of growth and liver functions of mature rat hepatocytes in primary culture by an extract of hepatic plasma membranes. J Biol Chem. 1984, 259, 8056-8058.

89. Nau H, Liddiard C, Merker HJ, Brendel K. Preparation, morphology and drug metabolism of isolated hepatotcyte and liver organ cultures from the human fetus. Life Sci. 1978, 23, 2361-2372.

90. Neyrinck A, Eeckhoudt SL, Meunier С J, Pampfer S, Taper HS, Verbeeck RK, Delzenne N. Modulation of paracetamol metabolism by Kupffer cells: a study on rat liver slices. Life Sci. 1999, 65, 2851-2859.

91. Nose Y, Mikami J, Kasai Y, Sasaki E, Agishi T, Danjo Y. An experimental artificial liver utilizing extracorporeal metabolism with sliced or granulated canine liver. Trans. Am. Soc. Artif. Int. Organs.1963, 8, 358-362.

92. Nose Y. Artificial liver for a bridge to liver transplantation. Artif Organs. 1989, 13,415-6.

93. Nyberg SL, Shatford RA, Hu WS, Payne WD, Cerra FB. Hepatocyte culture systems for artificial liver support: implications for critical care medicine (bioartificial liver support). Crit Care Med. 1992, 20, 1157-1168.

94. Nyberg SL, Peshwa MV, Payne WD, Hu WS, Cerra FB. Evolution of the bioartificial liver: the need for randomized clinical trials. Am J Surg. 1993, 166,512-521.

95. Nyberg SL, Hibbs JR, Hardin JA, Germer JJ, Persing DH Transfer of porcine endogenous retrovirus across hollow fiber membranes: significance to a bioartificial liver. Transplantation, 1999, 67, 1251-1255.

96. O'Grady JG, Gimson aE, O'Brien CJ, Pucknell A, Hughes RD, Williams R. Controlled trials of charcoal hemoperfiision and prognostic factors in fulminant hepatic failure. Gastroenterology, 1988, 94, 1186-1192.

97. Ohshima N, Yanagi K, Miyoshi H. Packed-bed type reactor to attain high density culture of hepatocytes for use as a bioartificial liver. Artif Organs. 1997,21, 1169-1176.

98. Okamoto M, Ishida Y, Keogh A, Strain A. Evaluation of the function of primary human hepatocytes co-cultured with the human hepatic stellate cell (HSC) line LI90. Int J Artif Organs. 1998, 21, 353-359.

99. Padgham CR, Paine AJ. Altered expression of cytochrome P-450 mRNAs, and potentially of other transcripts encoding key hepatic functions, are triggered during the isolation of rat hepatocytes. Biochem J. 1993, 289, 621-624.

100. Reid L.M., Narita M, Fujita M, Murray Z, Liverpool C, Rosenberg L. In: Isolated and Cultured Hepatocytes. Ed. A.Guillouso and C.Guguen-Guillouso, John Libbery Eurotext Ltd/INSERM, 1986, 225-258.

101. Riordan SM, Skouteris GG, Williams R. Metabolic activity and clinical efficacy of animal and human hepatocytes in bioartificial support systems for acute liver failure. Int J Artif Organs. 1998, 21, 312-318.

102. Riordan SM, Williams R Extracorporeal support and hepatocyte transplantation in acute liver failure and cirrhosis. J Gastroenterol Hepatol. 1999, 14, 757-770.

103. Roger V, Balladur P, Honiger J, Baudrimont M, Delelo R, Robert A, Calmus Y, Capeau J, Nordlinger B. Internal bioartificial liver with xenogeneic hepatocytes prevents death from acute liver failure: an experimental study. Ann Surg. 1998, 228, 1-7.

104. Rozga J, Morsiani E, LePage E, Moscioni AD, Giorgio T, Demetriou A A. Isolated hepatocytes in a bioartificial liver: a single group view and experience. Biotechnol Bioeng. 1994, 43, 645-653.

105. Rozga J, Demetriou AA. Artificial liver. Evolution and future perspectives. ASAIO J. 1995,41, 831-837.

106. Saito S, Langnas AN, Stratta RJ, Wood RP, Shaw BW Jr, Matsuno T, Markin RS. Hepatic retransplantation: University of Nebraska Medical Center experience. Clin Transplant. 1992, 46, 430-435.

107. Schwarz L.R., Wiebel F.J. Cytochrome P450 in primary and permanent liver cell cultures. Handb. Exp. Pharm. 1993, 105, 399-413.

108. Seglen PO. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol 1976, 13,29-83.

109. Shakil AO, Mazariegos GV, Kramer DJ. Fulminant hepatic failure. Surg Clin North Am. 1999, 79, 77-108.

110. Shi Q, Gaylor JD, Cousins R, Plevris J, Hayes PC, Grant MH. The effects of serum from patients with acute liver failure on the growth and metabolism of Hep G2 cells. Artif Organs. 1998, 22, 1023-1030.

111. Shiraha H, Koide N, Hada H, Ujike K, Nakamura M, Shinji T, Gotoh S, Tsuji T. Improvement of serum amino acid profile in hepatic failure with the bioartificial liver usung multicellular hepatocyte sferoids. Biotechnol Bioeng. 1996,50,416-421.

112. Shnyra A, Bocharov A, Bochkova N, Spirov V. Large-scale production and cultivation of hepatocytes on Biosilon microcarriers. Artif Organs. 1990, 14,421-428.

113. Shnyra A, Bocharov A, Bochkova N, Spirov V Bioartificial liver using hepatocytes on biosilon microcarriers: treatment of chemically induced acute hepatic failure in rats. Artif Organs, 1991, 15, 189-197.

114. Sielaff TD, Nyberg SL, Rollins MD, Hu MY, Amiot B, Lee A, Wu FJ, Hu WS, Cerra FB. Characterization of the three-compartment gel-entrapment porcine hepatocyte bioartificial liver. Cell Biol Toxicol. 1997, 13, 357-364.

115. Soyer T, Lempinen M, Eiseman B. In vitro extracorporeal liver slices and cell suspensions for temporary hepatic support. Ann Surg. 1973, 177, 393401.

116. Soyer T, Lempinen M, Walker JE, Supanwanid P, Eiseman B. Extracorporeal assist of anhepatic animals with liver slice perfusion. Am J Surg. 1973, 126,20-24.

117. Sussman NL, Kelly JH. Extracorporeal liver support: cell-based therapy for the failing liver. Am J Kidney Dis. 1997, 30, S66-S71.

118. Takahashi M, Matsue H, Matsushita M, Sato К, Nishikawa M, Koike M, Noto H, Nakajima Y, Uchino J, Komai T, et al. Does a porcine hepatocyte hybrid artificial liver prolong the survival time of anhepatic rabbits? ASAIO J. 1992, 38, M468-M472.

119. Tajima H, Matsumoto K, Nakamura T. Regulation of cell growth and motility by hepatocyte growth factor and receptor expression in various cell species. Exp Cell Res. 1992, 202, 423-431.

120. Tompkins RG, Carter EA, Carlson JD, Yarmush ML. Enzymatic function of alginate immobilized rat hepatocytes. Biotechnol Bioeng. 1988, 31, 1118.

121. Tsuzuki T, Ogata Y, Iida S, Shimazu M. Hepatic resection in 125 patients. Arch Surg. 1984, 119, 1025-1032.

122. Uchino J, Tsuburaya T, Kumagai F, Hase T, Hamada T, Komai T, Funatsu A, Hashimura E, Nakamura К, Коп T. A hybrid bioartificial liver composed of multiplated hepatocyte monolayers. ASAIO Trans. 1988, 34, 972-977.

123. Wang L, Sun J, Li L, Mears D, Horvat M, Sheil AG. Comparison of porcine hepatocytes with human hepatoma (C3A) cells for use in a bioartificial liver support system. Cell Transplant. 1998, 7, 459-468.

124. Waynworth HB. Experimental and surgical technique in the rat. Ac. Press. - 1980, - 260 p.

125. Werner A, Duvar S, Muthing J, Buntemeyer H, Kahmann U, Lunsdorf H, Lehmann J. Cultivation and characterization of a new immortalized human hepatocyte cell line, HepZ, for use in an artificial liver support system. Ann N Y Acad Sci. 1999, 875, 364-368.

126. Winikoff S, Glassman MS, Spivak W Plasmapheresis in a patient with hepatic failure awaiting liver transplantation. J Pediatr. 1985, 107, 547-549.

127. Wu FJ, Friend JR, Hsiao CC, Zilliox MJ, Ко WJ, Cerra FB, Hu WS Efficient assembly of rat hepatocyte spheroids for tissue engineering applications. Biotechnol Bioeng. 1996, 50, 404-415.

128. Wu FJ, Friend JR, Remmel RP, Cerra FB, Hu WS Enhanced cytochrome P450 IA1 activity of self-assembled rat hepatocyte spheroids. Cell Transplant. 1999, 8, 233-246.

129. Yoon JH, Lee HV, Lee JS, Park JB, Kim CY. Development of a non-transformed human liver cell line with differentiated-hepatocyte and urea-synthetic functions: applicable for bioartificial liver. Int J Artif Organs. 1999, 22, 769-777.