Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиология роста культур клеток растений в биореакторах (периодические режимы)

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Физиология роста культур клеток растений в биореакторах (периодические режимы)"

ГО ОД

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

i ь i 1 ''ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО 3IIAMEIIII ППСТНТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИИ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

ЛППС1ШЯ Александр Хсмовнч

ФИЗИОЛОГИЯ РОСТА КУЛЬТУР КЛЕТОК РАСТЕНИЙ

В БИОРЕАКТОРАХ (ПЕРИОДИЧЕСКИЕ РЕЖИМЫ)

03.00.12 — физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степеиц кандидата биологических наук

Москва 199?

Работа выполнена в Отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской Академии наук.

Н а у ч ный руководитель:

чл.-корр. РАН, академик РАСХН, доктор биологических паук, профессор Р. Г. БУТЕНКО

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В. И. КЕФЕЛИ, .

доктор технических наук, чл.-корр. АТН РФ, профессор В. В. БИРЮКОВ

Ведущее учреждение — Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, Биологический факультет, кафедра клеточной физиологии и иммунологии.

Защита диссертации состоится 01 июня 1993 г. в 13.00 часов на заседании Специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук К. 002.45.01 при Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН по адресу: Россия, 127276, г. Москва, Ботаническая ул.,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФР

35.

РАН.

Автореферат разослан 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, канд. бнол. наук

Л. и. СЕРГЕЕВА

" " 3 "

Актуальность темы. Общеизвестно, что запасы дикорастущих видов растений - незаменимых источников ценных веществ быстро сокращаются. Их интродукция для технических целей в большинстве случаев очень долгий, дорогостоящий и не всегда результативный путь решения проблемы. Альтернативный подход - биотехнологическое производство ценных метаболитов из культур клеток этих растений при крупномасштабном выращивании в биореакторах. Основные условия для его реализации: получение высокопродуктивного, стабильного' штамма; подбор из имеющегося в микробиологической практике оборудования для выращивания и/или разработка специальных конструкций; изучение физиолого-биохимяческих особенностей клеточных штаммов на всех этапах масштабирования, без которого невозможно экономически эффективно реализовать данный подход (Бутенко, 1964,1986; Fowler,1983).

Однако, особенности физиологии роста культур клеток в цикле периодического Еыращивания в биореакторах, информация о которых необходима для управления культивированием и масштабирования процесса, были исследованы мало (King et al,,1973; Drapeau et al..1986).

Сдерживает внедрение культивируемых клеток растений в промышленность и слабая разработанность подходов к научнообоснобанному поиску режимов выращивания, обеспечивающих экономическую эффективность процесса при высоких концентрациях биомассы, а также отсутствие теоретических обоснований уровня предельной концентрации клеток растений (Goldstein et al., 1980; Fuji ta, Tabata, 1987).

Цель данной работы состояла в изучении закономерностей кинетики роста различных клеточных штаммов растений отдаленных семейств в стандартных условиях, адаптации'клеток при варьировании условий, а также в поиске режимов периодического выращивания в биореакторах - перспективных для производства, и исследовании особенностей физиологии роста клеток при таких нестандартных режимах.

Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить общие и специфические особенности кинетики роста и физиолого-биохимических параметров в цикле периодического выращивания в биореакторах четырех штаммов культур клеток растений из трех различных семейств.

2. Изучить закономерности физиологических реакций культивируй емых клеток на условия выращивания общего характера, которые не зависят от аппаратуры выращивания, а также специфические для биореакторов. с целью расширения возможностей оптимального управления процессами наращивания биомассы и накопления ценных метаболитов.

3. Разработать' теоретические подходы и создать на их основе

практические способы ептимапьного выращивания в периодическом режиме экономически перспективных клеточных штаммов в. стандартных . биореакторах объемами от лабораторного до пилотного.

Научная новизна. Уточнены принципы выделения основных фаз ростового цикла культур при периодическом выращивании по результатам комплексного анализа кинетики роста и физиолого-биохимических параметров четырех штаммов клеток растений из трех различных семейств.

Существенный элемент новизны имеют результата исследований, показавшие наличие специфических адаптационных реакций и исходного, и мутантного штаммов культивируемых клеток диоокореи. Различия наблюдали по: способности к саморегуляции рН среды; скоординированному изменению скоростей роста, дыхания и, в меньшей степени, потребления Сахаров в физиологическом диапазоне температуры.

Изучены особенности ростовых и физиолого-биохимических параметров культур клеток диоскореи шт. ДМ 0,5 и женьшеня шт. Ж 2 в новом многоциклическом режиме выращивания в биореакторах до высоких концентраций биомассы при -30% начальной концентрации биомассы от ее конечной концентрации. Экономическая перспективность такого режима выращивания обоснована оригинальной математической моделью.

Впервые предложен и всесторонне обоснован универсальный коэффициент предельной плотности упаковки культивируемых клеток растений и других микрообъектов с аналогичной формой культивируемых элементов, отражающий морфологические особенности клеток и их агрегатов.

Практическая ценность. Продемонстрирована возможность практического применения оригинальной математической модели, для.поиска экономически перспективных реашмов выращивания ценнйх (сультур клеток в биореакторах.

Использование предложенного универсального коэффициента предельной плотности упаковки суспензионных культур клеток растений позволяет: оценить потенциальную экономическую перспективность штамма на начальных этапах работы; сопоставить результата выращивания как в отношении различных культур клеток растений, так и оптимальности конструкций биореакторов; пересчитать объем осадка крупноагрегированных культур клеток растений на вес биомассы. •

Показана принципиальная возможность вести эффективное выращивание ценных штаммов культур клеток растений, в том числе й женьшеня, клетки которого чувствительны к гидродинамическому стрессу, в стандартных микробиологических биореакторах при рекордно высоких скоростях мешалки простой конструкции.

' " 5 \

Разработаны и успешно применены в данных экспериментах, а ■также в последующей практике других исследователей: конструкции простых и доступных конических барб'отажных биореакторов объемом 1.2 л и 3 л; методы и устройства для асептической работы с ними на культурах клеток растений и иных объектах. Эта методы оказались эффективными при долговременном поддержании асептики и в стандартных микробиологических биореакторах от 7,5 л до -420 л.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены на ежегодных семинарах Отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР; Международном симпозиуме по разработке лабораторных ферментеров (биореакторов), Рейнхардсбрун, ГДР, 1978; трех Всесоюзных (Международных) конференциях по культуре клеток и биотехнологии: Абовян, 1979; Кишинев, 1983; Новосибирск. 1988; Всесоюзном совещании "Культивирование клеток животных и человека", Пущино, 1983; Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии", Пущино, 1986; Международном конгрессе по культуре тканей и клеток растений, Амстердам. Голландия. 1990; Международном симпозиуме по молекулярным и физиологическим аспектам пероксидаз. Женева, Швейцария, 1991.

Публикации. Основных публикаций по материалам диссертации 22, в том числе семь зарубежных, и одно авторское свидетельство.

Структура и обьем работы. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав: обзора литературы; объектов и методов исследования; результатов и обсуждения (три главы); заключения; выводов; списка цитируемой литературы; списка работ, опубликованных по материалам диссертации.

Диссертационная работа изложена на ЛЯг страницах машинописного текста, содержит 35" рисунков и ^таблиц. Список цитируемой литературы - /¡¡ЦТ публикаций, из которых /33 зарубежные.

Сокращения, условные обозначения и термины: N - число клеток в суспензионной культуре, кл/мл; X - сухая масса клеток (сухая биомасса), г/л; Б - биомасса (сырая Оиомасса клеток), г/л;

Нш' Бт ~ максимальные значения критериев в цикле выращивания; /V /V /Б ~ удельные скорости роста по соотв. критерию, сут"1; ■^нш* /'хт1 ~ иаксимальные удельные скорости роста, сут"1; о И - интенсивность дыхания клеток, мг СОг/гХ»ч, /«моль С0г /106кл-ч; ФГ - фуростаноловые гликозиды (агликон - диосгенин - 0,39 г/г); V - экономический коэффициент по сахарозе, г X /г сахарозы; П - продуктивность режима выращивания клеток по X, г X /л-сут; Р - продуктивность выращивания по искомому метаболиту, мг ФГ/л-сут;

KLa0 - объемный коэффициент массопередачи по кислороду, ч"1: М-Сг- минеральные соли (Murashlge, Skoog. 1962); КС - культуральная среда, "старая" питательная среда (фильтрат); КЖ - культуральная жидкость (взвесь клеток и их агрегатов в КС).

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследования служили четыре штамма из различных семейств: Dioscoreaceae, Aralíeaceae, Fabaceae. Они поддерживаются в коллекции суспензионных культур Отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН. Субкультивирования в колбах на качалке и эксперименты в биореакторах проводили на питательных средах по прописям авторов штаммов.

Штамм ИФР Д 1 (исходный. Д 1) был отобран и переведен в суспензионную культуру М.А. Саркисовой и З.Б. Маминой.после обработки азотистым ипритом исходной каллусной ткани, введенной в культуру из корневища стерильного проростка Dioscorea deltoldea Wall, в 1969.г. М.А. Саркисовой и Р.Г. Бутенко (Саркисова, 1973).

Штамм ИФР ИМ 0.5 (мутантный. ДМ 0,5) был получен в 1972 г. С. Л. Карановой после обработки клеток шт. Д 1 мутагеном N-нитрозо-N-метилмочевиной (Каранова и др..1375). В 1982г. A.M. Носов и В.Н. Пауков показали, что шт.ДМ 0.5 - сверхпродуцент диосгенина (Носов, 1984). Позже обнаружено, что клетки накапливают его в виде ФГ -ценного фармацевтического сырья (Васильева и др. .1987; Носов,1992).

Штамм ИФР Ж 2 (К 2) был отобран Р. Г. Бутенко, н. А. Мясоедо-вым и З.Б.Шаминой в 1982-г. из прототрофных по кинетину клеток шт. ИФР Н 1 (Бутенко и др. 1984), введенного в культуру в I960 г. Р. Г. Бутенко из дикорастущего корня Panax ginseng Иеу. (Бутенко, 1964). -ртамм Л 1 (Л 1) - культуры клеток Medtcago sativa был получен сотрудником биофака МГУ А.Ю. Скрипниковымв 1986г. Состав питательной среды улучшен В.В. Урманцевой (Urmantseva et al., 1991). В работе использовали биореакторы трех типов: конические барботажные (КБ) - "мягкий" тип перемешивания; общие объемы ~1.2 л и ~3.0 л (Липский, 1981);

MF-107 - "жесткий" тип перемешивания трехъярусной турбинной мешалкой открытого типа р 50 мм; 7.5 л; фирмы New Brunswick., ■ США;

пилотные (EL-30: EL-75; EL-420) - "мягкий" тип перемешивания . мешалкой "гребной винт" 0 150 мм во всех биореакторах: 30 л, 75 л и 420 л фирмы Electrolux Fermentation (Novaferm), Швеция.

Фирменные биореакторы были оснащены магнитными приводами мешалок, четырьмя отбойниками и стерилизуемыми датчиками рН и рОг.

Режимы стерилизации питательных сред и аппаратуры - общепринятые в практике работ с культурами клеток растений (Бутенко, 1964).

Температура культивирования- шт. Д 1 и шт. ДМ 0,5 - 27 °С, а шт.Ж 2 и шт.Л 1 - 26 °С с точностью <tO,25°C во всех биореакторах.

Содержание клеток в средней пробе культуральной жидкости, размацерированной 20% хромовой к-той. в 2-3 повторностях на пробу, просчитывали 4-8 раз в камере Фукса-Розенталя.-

Конпентрацио биомассы определяли стандартно после фильтрации; 2-3 повторности на пробу; сушили лиофильно и/или при 60 0С.

Оптическую плотность культуральной жидкости и фильтрата измеряли на спектроколориметре Spekol, ГДР (Липский и др. ,1983).

Жизнеспособность клеток.(культивируемых единиц,к.е.) оценивали как долю (%) не окрашенных 0,25% водной краской "Эванса синяя" (Попов и др., 1978); >100 к.е. на пробу, повторность 3-5 кратная. ■

Митогический индекс (ИИ) подсчитывали на мазковых препаратах, окрашенных ацетокармином- 7-10,повторностей на пробу. >5000 клеток.

стерильность контролировали микроскопически в пробах КЖ. окрашенных краской "Эванса синяя", и по высеву проб на среду с мясным бульоном, 0.5% пептона. 1% сахарозы и 1.5% агара (проращивание при 37°С 7 суток). В конце опытов по масштабированию в EL-75 и EL-420 отбирали пробы для стандартного субкультивирования.

Сахара измеряли стандартно фенол-сернокислотным методом ¡в , фильтрате (Dubois et al.,1956).

" ОртоФосйат определяли в фильтрате по Фиске-Суббароу (с эйко-ногеном) в модификации Бартлета (Bartlett, 1959).

МО". НН*, К* и Саг* , измеряли в • фильтрате ионоселективными электродами на приборе Ionolyser 901 фирмы Orion research. США.

ЕЙ контролировали стерилизуемыми электродами непосредственно в биореакторах и/или в отбираемых пробах на иономере ЭВ-74.

fiOg в биореакторах HF-107, Е1-30, EL-75 и EL-420 также контролировали стерилизуемыми электродами; в КБ уровень рОг рассчитывали при экстраполяции кривой интенсивности дыхания пробы КЖ в специальной респирометрической ячейке (Липский. Бутенко.1983).

Содержание C0¿. 0¿ и M¿ в газовой фазе измеряли в 1 мл пробах на газовом хроматографе ЛХМ-8МД с-катарометрои в качестве детектор ра и. колонками: И 1 (С0£> 0.03%) 250'0, 3 см, полисорб 60-80 меш; N 2 (С02>> 0.03%, 02 и N2) две параллельные колонки: 200-0,3 см. полисорб 60-80 меш; 80»0,3 см, молекулярные сита 5Í. Температура колонок 35 °С. детектора 50 °С (Ракитин В.Ю., Ракитин Л.Ю.. 1974). Интенсивность дыхания клеток в биореакторах оценивали по

разности содержания C0g на выходе и входе воздуха (по три пробы).

Содержание фуростанолових гликозилов (ФГ) в сухой биомассе клеток диоскореи шт. ДМО, 5 определяли модифицированным спектрофото-метрическим методом с реактивом Эрлиха (Васильева и др., 1987).

Интенсивность массообмена в биореакторах - KLa0 оценивали по скорости растворения 0g на модельной системе (вода) сульфитным (Cooper et al., 1944) и динамическим (Kato et al., 1975) методами, а также балансовым - в реальной процессе (Перт, 1978).

Противопенные. антиадгезионные поверхностно-активные вещества подбирали по методикам принятым в микробиологии для химических пё-ногасителей (Сойфер, 1973; Липский и др., 1982).

Статистическая обработка результатов микроскопических анализов стандартная, доверительный интервал 0,90 (Рокитский; 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Комплексный анализ кинетики роста клеток к физиолого-бнохимическке характеристики.

Для культивируемых клеток растений при периодическом выращивании общепринято разделение на последовательные фазы ростового цикла. На модельной кривой в линейцрй системе координат выделяют: лаг-фазу, экспоненциальную, линейную, замедления, стационарную (Wilson et al., 1971). Однако, ни в указанной работе, ни в схеме фаз роста предложенной В. П. Холодовой (1981), по аналогии со схемой для микроорганизмов, нет обоснования разделения по фазам. Решение этого вопроса - одна из задач данного исследования.

Кинетика роста и уточненное выделение Фаз в цикле периодического выращивания в биореакторах при стандартных''условиях были проанализированы на четырех штаммах культивируемых клеток растений из трех различных семейств. Типичный пример такого анализа для клеток шт. ДМ 0,5 в биореакгоре EL-75 приведен на рисЛА-Г.

В опытах со всеми исследованными штаммами наблюдали ¿-образные кривые роста по основный критериям - типичные для культивируемых клеток растений (рис. 1А). Представив эти данные в полулогарифмической системе координат (рис. 1Б), выделяли на кривых роста по N. X и В прямолинейные участки, тангенс угла наклона которых к оси абсцисс был численно равен значению flm по каждому из критериев - основной характеристике ростовой активности штампа любого микрообьекта (Бутенко. 1977; Перт, 1978; King et al.. 1973).

Из данного примера, подтвержденного многочисленными опытами в биореакторах для всех четырех штаммов, следует, что эксперимента-

• _ 9 -

Рис.1. кинетика роста и физиолого-биохимические характеристики культуры клеток диоскореи шт. ДМ 0.5 с уточнением фаз цикла обычного периодического выращивания в биореакторе ЕЬ-75.

1»

1* V и

Б

1 и

IV V VI

5 4 3

100

^ 6 о*

■54

-5 с

льно найденные значения почти всегда совпадали с построенными По ним прямолинейными участками на кривых И, X и Б (рис. 1Б). Указанные результаты были приняты наш в качестве обоснования гипотезы о несинхронности роста и деления культивируемых клеток растений при периодическом режиме выращивания. В этом случае дискретные результаты анализа динамики роста подобных культур (рис. !А) могут быть представлены в виде лекальных кривых и подвергнут дифференциальному графоаналитическому исследованию (рис. 1В), а прямолинейные участки на кривых рис. 1Б описаны подобно кинетическим кривым химических реакций первого порядка - экспоненциальной функцией.

Перейдем теперь к изучению закономерностей кинетики роста, параллельно с уточнением принципов выделения фаз роста и физиолого биохимических характеристик (рис.' 1А-Г). В качестве основного критерия роста будем использовать N. а по X и Б, как вспомогательные.

I. Лаг-Фаза. В отличие от формального метода Лодяа-Хиншелвуда (Перт, 1978) в данной работе граница' лаг-фазы определена по "фактическому" методу, как крайняя точка на кривой роста 1 ' рис. 1Б.

ш

- 10 -

когда прирост по числу клеток еще отсутствовал.

Вопреки условности определения границ^ лаг-фазы по разным критериям роста, физиологическая реакция исследованных культур клеток после инокулирования имела явно выраженный адаптационный характер, свойственный именно для лаг-фазы. Типичной для исследованных культур была аутостабилизация питательной среды до определенного уровня рК: шт. ДМ 0,5 - 3.5 (рис. 1А, кривая 4); шт.Д 1 -4,5; шт. Ж 2 - 5,0; шт. Л 1 - 4,0; а также кратковременное 2-х - 3-х кратное повшение R клеток шт. Д 1 и шт. ДМ 0,5 (рис. 1Г. кр. 4).

Столь тесная корреляция, обнаруженных адаптационных реакций с лаг-фазой, мало исследована (Shlml2u et al., 1977).

II. Фаза ускорения роста может быть определена на кривой роста, если'удается идентифицировать период увеличения М от 0 до 1 -левое плечо на графике М(рис. 1Б, кр.4). Граница фазы II с III по "фактическому" методу - первое значение основного критерия роста, которое совпадает с прямолинейным участком на кривой 1 рис. 1Б. На исследованных культурах клеток растений разного происхождения показано,, что в фазу II быстро возрастает не изученный ранее параметр - ускорение роста (H"~dzN/dt8) от 0, но не до максимального значения, как можно было предполагать (рис. 1В, кр.4).

Выделение фазы II по данным литературы мы не обнаружили.

III. Экспоненциальная Фаза роста, большей или меньшей продолжительности. всегда присутствовала на кривой роста в цикле выращивания исследованных нами культур клеток в биореакторах. Верхняя граница этой фазы роста,.определяемая по "фактическому" методу, находится в области максимального значения основного критерия роста. укладывающегося на прямолинейном участке кривой' 1 рис. 1Б.

обнаружено, что максимум ускорения роста коррелирует с максимумом R (рис. ,1В. кр. 4 и 1Г, кр. 4), а область максимума скорости роста - N'-dH/dt (или Х'= dX/dt, или Б'= dB/dt) определяет границу раздела фаз III и IV по соответствующему критерию роста (рис. 1В, кр.1). Уровень характерных значений.максимума R в фазу роста III . при обычных условиях выращивания в биореакторах был равен: шт. Д 1 ~1,2/»<мольСОгЛОвкл'Ч (-27 МГС0./Г'Ч): шт. ДМ 0,5 ~2>мольС0г/106-КЛ'Ч (-13 МГ С02/г-ч>; шт. Ж 2 ~1,7/»мольС0г/10вкл«ч. (-9,8 мгС0? /г»ч). Характерные значения jut исследованных штаммов культур клеток приведены в таблице.

IV. Фаза замедления роста может быть выделена на кривой роста, если достоверно показан период изменения М от 1 до 0 - правое плечо на графике И= Граница этой фазы роста со стационар-

- Ц r

ной фазой (V) находится в области Н' = dH/dt = О (рис.1В, кр.1).

' Постулируемая в работах теоретического характера линейная Фаза роста между фазами III и IV (Street, 1977; Mantell et al.,1985), для которой должно выполняться условие: N'=dN/dt=const и/или X'=dX /ät-const и/или B*=dB/dt=const, не подтверждена полученными нами результатами. Такое условие - частный случай фазы IV. Причем очень важно локализовать период в цикле выращивания между фазами III и IV для успешного поиска факторов лимитирующих и/или ингибирующих рост, ответственных за переход популяции клеток растений в фазу IV.

Характерные значения максимальных удельных скоростей роста -^и культур клеток диоскореи (шт. Д 1 "и шт. ДМ 0.5), женьшеня (шт. 12) и люцерны (шт. Л 1) в биореакторах.

! Штамм 1 jna по основным критериям роста. сут"' !

число клеток ! сухая биомасса ! ! ! биомасса !

! Д 1 0, 30 1 0.27 .! 0,22' !

1 ДМ 0.5 0,22 ! 0,20 ! 0.21 !

1 Ж 2 0,20 ! 0.18 ! 0,17 !

! Л 1 ! 0,28 ! 0,26 ! 1 ! 0,28 1 !

V. Стационарная (Ьаза роста принята нами как период от максимума по N (сЗЫ/с!1=0) до максимума по Б '(аБ/сЛ=0) (рис. 1В). Фаза V характеризовалась в наших опытах относительно высоким уровнем жизнеспособности клеток (рис.1В. кр.5); увеличением накопления ФГ в расчете на клетку шт.ДМО. 5 кр. 3 и на сухую биомассу кр.2 на рис.1Г. В расчете на биомассу уровень ФГ не изменялся в фазы 1-У (кр.1).

Эти данные интересны для изучения физиологической роли ФГ в клетках шт. ДНО.5 и совершенствования режимов их выращивания.

VI. Фаза отмирания (деградации) для всех исследованных культур клеток имела общие характеристики: /КО по всем критериям роста; жизнеспособность и К быстро снижались; рН КС резко возрастал/-» На необходимость всестороннего изучения фазы VI указывают исследования специфичности репродуктивной выживаемости клеток табака и диоскореи в эту Фазу роста (Гусев и др., 1981),

Таким образом, уточненная нами схема разделения по фазам роста отличается от общепринятых для культивируемых клеток расте-

мий прежде всего тем, что границы фаз роста III-и IV определяли в полулогарифмической системе координат, а не в линейной (Wilson et al.. 1971; Холодова, 1981; Mantell et al., 1985; Бутенко, 1990).

Феномен несбалансированности роста. Существенному различию по величине и/или знаку д, и в один и тот же момент цикла выращивания культур клеток растений дридают большое значение (Бутенко, 1978; Холодова, 1981). В этом явлении отражается особенность роста клеток растительного организма - этапность последовательных . периодов деления клеток в меристеме, роста растяжением и перехода в дифференцированное состояние (Иванов, 1974; Кефели, 1978).

Аналогичную несбалансированность роста наблюдали и на исследованных нами четырех клеточных штаммах в фазу II и особенно в фазы IV и V (рис.1Б, кривые 1-3). Для штаммов ДМ 0.5, Ж 2 и Л 1 не была обнаружена существенная несбалансированность в фазу III. Значительная несбалансированность в эту фазу была отмечена только для шт. Д 1, причем междууиип иона могла достигать 20-30% (Табл.).

Исходя из- этого, в фазу III сбалансированный рост по всем критериям может считаться правилом, а не исключением.

Опенка максимальной удельной скорости роста при повторных экспериментах может быть затруднена флуктуациями в условиях культивирования. К ним относятся физиологическое состояние инокулима, режимы стерилизации питательных сред и культивирования.

Для решения этой проблемы в опытах по исследованию зависимости от условий выращивания в каждом из последующих экспериментов один из вариантов поаторялся как контрольный ß пк- Корректное , значение уитр в исследуемом варианте рассчитывали по формуле:

л Аи'Л/Лк- (1)

где jumu - в исследуемом варианте того же эксперимента, суг"1. .

Эффективность этого метода подтверждена в наших экспериментах по изучению зависимости от температуры (Липский, Черняк,1983а).

Адаптационные реакции клеток на условия выращивания.

Исследования общих и специфических особенностей реакции культивируемых клеток растений на' некоторые значимые условия вырадава-нкя в биореакторах выполнены на штаммах диоскореи - Д 1 и ДМ 0,5.

Значение величины инокулюма .изучали при выращивании в биореакторах КБ и MF-107 (рис.2А-Б). Эти результаты позволяют предположить. что определяющую роль в создании плотности культуры, ниже

которой продолжительность лаг-фазы быстро возрастает, играет исходная концентрация клеток. Однако, "средняя" клетка шт.Д1 существенно меньше; чем шт.ДМ0,5. В конце фазы III их диаметры равны -27 мкм и ~40 мкм соответственно (рис. 2А'-Б'). Поэтому, при равных плотностях по Но, значения Хо шт. ДМ 0,5 были приблизительно в 3 раза больше Хо шт. Д 1. Из этих данных видно также, что значения уих не зависят от величины инокулюма в изученных пределах. Они воспроизводились, как характерный физиологический признак штамма.

Рис.2.Кинетика роста культур клеток диоскореи шт.Д1 (А) и шт.ДМО,5 (Б) при изменении величины инокулюма, и их вид в фазу III (А'-Б').

го

15 $ 10 ^ 5.0

8 г, о

Ъ '.о

а 0,50 § 0,30

° 0,10

№ X* IL

г/г ,10'"ли ; 1 O.SO 5.0

г о.ад м

3 0,13 1,0

О 5 10 15 ¿0 £5 3d 35 С/ТКИ

5 10 15 го СУТКИ

Представленные результаты подтверждают предположение о необходимости накопления популяцией клеток для инициации делений "фактора. кондиционирования" (Павлова, Бутенко, 1969: Stuart. Street. 1971). Это следует из данных, показавших, что для разных клеточных штаммов диоскореи существует критическая область величины инокулюма, ниже которой продолжительность лаг-фазы быстро возрастает.

Потребность в С0; газовой Фазы при выращивании в биореакторах КБ клеток диоскореи шт. Д 1 изучали в качестве возможного слагаемого "фактора кондиционирования", недостаточность по которому лимитирует рост клеток на начальных этапах. . Оказалось, что добавление -1% С0г было эффективно по сравнению с контролем (-0,03 % С0г) лишь при начальной плотности инокулюма около 5-Ю4 кл/мл, и не влияло на pH КС (расход воздуха на барботаж _<0,5л/л- мин) .■

Полученные результаты и данные литературы позволяют принять р, качестве рабочей гипотезы, что при начальных концентрациях клеток, превышающих определенный уровень,. например, ~5-104 кл/мл шт. Д 1 или -5-103 кл/мл культуры клеток явора (Gathercole et al., 1976), С02 дыхания клеток обеспечивает необходимый уровень этого важного компонента среды и дополнительного введения СО в воздух на барбо-

таж при выращивании в биореакторах не требуется.

Саморегуляция рН питательной среды (рНн) культивируемыми клетками растений после инокулирования. например, явора (Lamport, 1964) и женьшеня (Константинова и др., 1979), наглядно демонстрирует их способность к адаптации во внешней среде подобно целым растительным организмам (Сабинин,.Минина, 1928)..

Реакция штаммов диоскореи Д 1 и ДМ 0,5 на величину рНн при выращивании в биореакторах КБ также характеризовалась способностью к аутостабилизации рНн и росту клеток при 6,2>рНн>3,5 (рис. ЗА-Б), Клетки обоих штаммов гибли при ~3>рНн>~7," хотя небольшой сдвиг рНи от 3,0 до 3,2-3,4 при этом происходил. Особенность реакции этих культур состояла в способности-смещать рНи из области 3,5-6,2 до характерного уровня стабилизации рН КС: шт! Д 1 ~4,5; шт. ДМ 0.5 -3.5. Из типа кривых изменения рН КС культурами клеток обоих штаммов очевидна большая способность к лодкислению рНи 6, 2- 5,0, чем к подщелачиванию рНн <5,0. Это объясняется, вероятно, большей способностью клеток растений к выделении анионов, чем катионов (Сабинин, Минина, 1928: Курсанов, 1976). На связь этого физико-химического процесса с метаболизмом клеток указывает длительность процесса- аутостабилизации рНн. изменениями КС в цикле выращивания (рис. 4А) могут определяться также последовательностью потребления клетками и NO" (Martin. Rose, 1976) к/или поглощением Сахаров по механизму котранспорта с Н+ (ВаКег, 1978).

Рис.3. Динамика аутостабилизации рН питательной среды культурами клеток диоскореи шт. Д 1 (А) и шт. ДМ 0.5 (Б) в лаг-фазу.

Рис.4. Динамика рН культуральной среды (А), интенсивности ду/ания и роста (Б) клеток шт.Д1 в цикле выращивания вариантов рис. 4А.

О 10 20 » 40 50 60 ЧАСЫ

О ,5 10 t5 £0 , СУТКИ

1

Тесная корреляция периода аутостабилизации рНн и ,1-го пика R с Фазой роста I; 2-го пика R с серединой фазы роста III клеток ди-оскореи шт. Д 1; смещение динамических кривых pH КС. R и X в варианте рНн 3.5 относительно вариантов рНн 4,3-6.2 (рис. 4А-Б кривые 4 и 1, 2, 3 соотв.) можно рассматривать как сумму данных, подтверждающих адаптационные возможности культивируемых клеток растений.

Практическое значение этих результатов-состоит в том, .что рНн' в области ~4,0<рНн<~6,0 для шт.Д 1 , а для шт.ДМ 0,5 ~3.5<рН <~6.0 не требуется подводить до уровня ~ 5,6-6,0, как это общепринято.

Температура - сравнительно мало исследованный физический фактор, имеющий принципиальное значение в регулирований, роста, качественной направленности и интенсивности метаболизма- культивн-' руемых клеток растений (Долгих, 1986; Morris.' 1986).

Рис.5. Соотношение максимальной удельной скорости роста (1). интенсивности дыхания (2) и скорости потребления Сахаров (3) в экспоненциальную фазу роста культур клеток диоскореи шт. . Д 1 (А) и шт. ДМ 0,5 (В) в системе координат Аррениуса.

0.S 0.4

0.3

о.г

33,0 33.5 34,0 34.5 *

Ct/T)-iO'

Адаптационные реакции клеток шт.Д1 и шт.ДМ 0,5 на температуру выращивания в биореакторах КБ анализировали по изменению уи m. R и . скорости потребления сахаров а фазу III, представив данные в системе координат Аррениуса (ркс. 5А.-Б). Обнаружено, что у обоих штаммов температурный оптимум..изученных процессов находился в области 27°С, и при повышении температуры до 32°С не происходило заметного сииже-кия jwXnl и R. Существенно различались: реакции исследуемых штаммов на температуру ниже оптимума. Величина коэффициента Q|0 ^ Хи шт.Д1 была очень высокой - 6;8, что болей чем вдвое выше Q, Q yv шт. ДМ 0,5 - 2.4 и значений Q|0 У*1 Ха в том же диапазоне температуры для клеток табака• шт. ВУ-2 - 3.3 И шт. Xanthl-2,6 (Kato et al., 1976). Можно предполагать, что мутантный шг.ДМ0,5 более устойчив К стрессу при температуре ниже оптимальной, чем исходный шт. Д 1.

Параллелизм прямолинейных участков кривых исследованных

процессов в диапазоне 27-20°С (рис. 5А-Б) свидетельствует о (большей в случае .шт.Д1) скоординированности этих интегральных характеристик основного метаболизма и уровня адаптационных реакций шт. Д 1 « шт. ДМ 0,5. Правомочность" такой интерпретации полученных данных подтверждается результатами исследований на микроорганизмах (Calam et al.. 1951) и соматических клетках животных (Перт. 1978). На культурах клеток растений подобные исследования нам не известны.

Продуктивность культивируемых клеток при различных режимах выращивания в биореакторах. .

Поиск наиболее продуктивных режимов выращивания связан с решением комплекса тесно взаимосвязанных проблем биологии клетки и технологии, специфических для культивируемых клеток растений (Бу-тенко, 1986; Fowler, 1987). При этом йа первый план выступают вопросы оптимизации уровня газо-массообмёна и устойчивость клеток к гидродинамическому стрессу (Scragg et al., 1988).

' Реакцию на режимы аэрации и перемешивания клеток диоскореи шт. Д 1 и шт. ДМ 0,5 б цикле выращивания в биореакторах изучали как Функциональную зависимость максимальных уровней накопления биомас-' сы и ФГ от максимальной Величины объемного коэффициента.массспере-дачи по кислороду - в этом цикле.

Найдено, что в биореакторах КБ-3 минимальный уровень Ktа^ . обеспечивший прирост клеток шт. Д 1 равный ~10 г/л (Хт~ Хо), был . около 10 ч"'. Лимитирование роста клеток в вариантах больших значений могло быть связано с недостаточным уровнем массобмена жидкость клетка (Кх_т) в биореакторах КБ-3 и/или компонентами КС, а также ингибированием роста продуктами метаболизма. .

Клеткам шт. ДМ 0,5 необходимо более интенсивное перемешивание в КБ-3, т.к. для получения -10 г/л X требуется KLaQj ~14ч~' (рис. 6. кр.2). Это, вероятно, объясняется-Тем, что средний диаметр клеток шт. ДМ 0,5 на -35% больше клеток шт. Д 1 в фазу III (рис. 2А' -Б'),, и вдвое превышает диаметр, известный как; "критический" ->20 мкм (Ковров, 1966). метаболизм клеток такого диаметра существенно зависит от" возникающих вокруг этих клеток и их агрегатов изменений уровней плотности субстратов и продуктов метаболизма при недостаточном режиме микроперемешивания. Подобные явления, по-видимому, типичны для клеток растений, диаметр которых > 20 мкм.

ч. Близкие, к показанным для двух штаммов д!юскорен, уровня , соотношения ¿X и KLa0 в биореакторах известны для клеток табака ~14 г/л - -Юч"1 (Kato et al., 1975). женьшеня ~7 г/л - -5ч"1 (Дани-

лов и др., 1981) и диоскореи шт. В-54 -12 г/л —17 ч",1 (Robertson etal., 1989) соответственно.

Рис.6. Зависимость уровней накопления ФГ (1) в клетках шт.ДМ 0,5 и

их биомассы (2) от значений Кьа в биореакторах. $ *

1 - актант»« га - v.mmo? -а, а-75 -а, КОЛБЫ НА КАЧМКЕ -О; 2 - БИОРЕАКТОРЫ КБ -V, №-107 -A, Е1-75 -В, КОЛБЫ НА КАЧАЛКЕ - * .

< 40

- 30

"го 3 '5

3 к»

: г

Lb. 1

' дош отельное

ВГО2НЕ САХАРОЗЫ 4Х * M-C 1X12 • UA | цЛ |мШ

5 10 15 го es

с г т к и _}

ГО =п 100 75

7_

G ■ 50 ш?

5 • 25 1

QQ

3 0 8ü

Рис.7. Выращивание клеток шт. ДМ 0,5 до высоких концентраций.

Низкий уровень накопления биомассы ит. ДМО, 5 в колбах при KLa0i. ~25 ч'1 может указывать на недостаточный газообмен по С02 и Ог или-появление ингибитора роста, не угнетающего накопление в-клетках ФГ.

По результатам опытов в колбах и биореакторах КБ-3 iT EL-75 (мешалка "гребной винт") нашли, что для накопления 100 мг ФГ/г X шт.ДМО,5 необходимо KLa^ -29ч"1 (рис.6, кр. 1). Турбинная мешалка в MF-107 была менее эффективна, т.к. необходимый уровень уже -40ч"1.

Подобный анализ зависимости накопления в клетках растений искомого метаболита от уровня массообмена в биореакторе не найден в литературе. Сообщалось, в частности, что наибольшее накопление ди- . осгенина в клетках диоскореи шт. В-54 было при KLa0 -17 ч"1., уже при -4 ч"1 дио'сгенин не синтезировался (Robertson et'al.-.- 1989): -Полученные нами данные важны для поиска оптимальных режимов перемешивания - клеток растений в биореакторах, и подтверждают

необходимость исследовать К

-наряду; с KLaQj

(Tanaka. 1981).

В процессе масштабирования выращивания клеток ит. ДИ 0,5 до биореактора EL-420: обнаружен меньший- гидродинамический стресс от мешалки "гребной винт", по'сравнению с турбинной; // были на уровне 0,14-0,18 сут"1, что коррелирует с известным снижением скорости роста : клеток растений при масштабировании (Sehi-el, Berlin, 1987); Хп во всех биореакторах была на уровне -19 г/л (начальная концентрация сахарозы -40 г/л); в EL-420 Г достигала -51 мг ФГ/'л-сут .

Характер реакции культур клеток диоскореи на углеводное питание при контролируемых значениях KLa0 был "изучен в режимах: 1) различного исходного количества сахарозы (1-5%) в биореакторах КБ-1,2 (KLa0 - 10-184"') - шт.Д 1; 2) подпитки сахарозой в циклах выращивания и III при высоких концентрациях биомассы шт. ДМ 0,5 в биореакторе MF-107 (К^а^ - 30-40 ч"1) - рис. 7.

Показано, что, так же как в колбах на качалке (Urmaritseva et al.J 1984), прирост биомассы клеток диоскореи пропорционален концентрации сахарозы в обоих типах биореакторов. При замене в Фазе V ~50üä КС на питательную среду М-С с 4% сахарозы и отсутствии лимитирования по 02 (скорости мешалки 550 - 700 об/мин) клетки шт. ДМ 0,5 делились и росли (рис. 7. цикл II). Такой же рост мы наблюдали и при дробном добавлении одной сахарозы (158+1%) в ц. III (ИИ до 1%). В результате были получены культуры клеток большой концентрации: X ~17г/л в ц.I; ~31г/л и ~37г/л соотв.. во II и III циклах.

Ш

Несмотря на увеличение скорости мешалки до 700 об/мин. -//хв- в ц. II и ц: III были на -40% ниже, чем в ц. I "(рис.7, кр.1). Однако. Y в конце фазы V во всех экспериментах были близки -0,43. Этот интегральный параметр основного метаболизма указывает на относительную •удовлетворительность условий выращивания, какими бы парадоксально тяжелыми -для клеток они не казались. Высокие уровни жизнеспособности клеток и содержания в них ФГ (рис. 7, кр.4) подтверждают эту гипотезу. В научном и практическом отношении важно, что П~2,8г/л .сут и Р-264 мг/л-сут, достигнутые в ц. III, больше, чем в ц.1 в 2,2 и 2.5. а в ц. II в 1,д и 1,6 раз соответственно. Уровень Р в ц. III почти 9 2,5 раза выше, чем максимальное значение Р при проточном выращивании (Носов, 1992). Многоциклйческое выращивание (рис.7, ц, II) - один из наиболее перспективных для практики режимов культивирования (Запорожцев и др., 1977), мы относим к варианту периодического выращивания (Липский, 1989).

Математическое моделирование процессов выращивания.

С помощью математических методов проведен анализ оптимального выращивания культур клеток растений.

'' Оптимальность многоциклического выращивания оценивали по уа-ловному'экономическому критерию - себестоимости продуктов биосинтеза. Снижение этого параметра имеет решающее значение для широкого внедрения клеток растений в промышленность (Zenk, 1978: Goldstein •et al.., 1980). Для решения этой задачи разработали модель (Липский, 19°8. 1989) функциональной зависимости условной себестоимости био-

массы (С. руб./кг), как первичного продукта биосинтезу, от физиологических характеристик культур клеток растений и технологических параметров процесса выращивания, следующего вида:

С - {(1п 1/ко)Дк-(1 - *0)2])^В/(Х'^)) + (1/(1 - ко)НЦ/У), (2)

где X'- достигнутый уровень концентрации сухой биомассы, взятый за '

основу, кг/м3; к - отношение X к X'; к - отношение X -.к.Х ; ми о о я »

удельная скорость роста, средняя в цикле выращивания, постоянная для всех циклов, сут"1; дв- удельные затраты на проведение процес§ в биореакторе, руб./м3* сут; У - экономический коэфф. по' основному субстрату, кг X /кг сахара; Ц - цена основного субстрата, руб. /кг.'

■ Разделим слагаемые правой части (2) на составляющие с целью-упрощения вида выражения и поиска решения графоаналитически: . ' *

С = КВ-СВа + К5'С5- <3>

где Кв и К5 - безразмерные коэффициенты составляющих С по процессу выращивания и субстрату, зависимые от переменных кик (рис.8А-Ь).

Р.ис.8. ¡Зависимость К0(А). К,. (А') и условной себестоимости биомассы (Б) от ко и к при выращивании в многоциклическом режиме для варианта: СВа = С3. - 1,00 руб./кг; 0, 05<ко <0, 6 и 1<к<3 .

Положение минимума функции; (2) [Сн) существенно зависит от величины соотношения СВв/С3. но. совершенно не зависит от абсолютных значений С0в и С3 играющих решающую роль в формировании параметра С. Область экстремума - Сщ при СВа/С3)30 имеет малую кривизну, -ко-0,28. С уменьшением величины соотношения СВа/С3 от 30'до 0.2 для 1<к<3 значения К„. при которых . смещаются от 0,2в до 0,05. Например, пунктирная кривая проекции линии С^ на плоскости К; 2; ко (рис. 8Б). диализ накопления в кульгурэльной среде при многоциклическом

рырашивании слабо метаболизируемых компонентов среды и/или экскретов. способных ингибировать рост клеток, проводили, представив процесс разбавления ин'окулюма питательной средой в виде ряда:

С - С, (1 + к + к

II 1 ■ о в

+ к

(4)

где Сц - концентрация интересующего вещества в цикле п. г/л; С4 -концентрация вещества в 1-ом цикле, г/л; Ко '- отношение объема ино-кулюма к конечному объему КК. Например, если сва/сз)30, то по модели (2, 3) к ~0.3, Тогда для п > 3 и

Теоретический предел концентрации

С, = 100% биомассы

С <-143%.

П

пт выращивании

культур клеток растений и иных микрообъектов с аналогичной морфологией найден в виде универсального коэффициента - . Он численно равен общему объему культивируемых элементов с формой условного среднего элемента, приближенной к эллипсоиду, и составляет -0,53 доли от объема, в который эти элементы вписаны (рис. 9А-Б).

Рис.9. Моделирование упаковки условных "средних" культивируемых элементов (/-1,00 г/см3) (А-Б) и вид клеток женьшеня шт.Ж 2 (В): 'А- "рыхлая" упаковка, д -530 г/л: Б- "суперкоыпактная", а -750 г/л.

Величина данного биотехнологического параметра обоснована макромоделированием и наблюдениями за характером истечения из биореактора EL-75 суспензии клеток неньшеня при концентрации 75 - 8555 от возможного значения qL (рис. 9А) - подобно "жидкой пасте"; подтверждается данными на клетках коптис (Fujlta, Tabata, 1987). Многоциклическое выращивание культур клеток диоскореи и женьшеня в режиме kj~0.3. к -3.0 по "моделям (2: 3: 4). В предыдущем разделе показано, что минимальное значение себестоимости биомассы в режиме многоциклического выращивания может быть достигнуто при *о~0.3, когда Cfia/Cs)30 - наиболее вероятный уровень для культур клеток растений (Fowler, Stepan-Sarklsslan, 1983). Задача данного раздела работы состояла в изучении особенностей физиологических характеристик культур клеток диоскореи и жень-

- 21 -

шекя при выращивании в режиме перспективном для практики.

Жизнеспособность клеток в этих экспериментах (рис. ю и И)

Рис. 10.

Фазы роста во П-ом цикле выращивания при высоких концентрациях клеток диоскореи шт. ДМ 0, 5 в биореакторе Мг-107.

s 10

С J Т К N

О 5 10 С 1 Т К И

Рис.11. III, IV и V-ый циклы выращивания при высоких концентрациях, клеток женьшеня шт. Ж 2 в биореакторе EL-75.

р оо £

tri

го

.clt.

д. III о. IV ц. у

N.

\

NI4

{ \

IM

■ 100 '/VCf

ЕС

150

100 Ci1

ED

3 О 10 » 39

д

1<3J

ri-N, IS.100SH-C

_Е_______изг_

t TV. IXIOK и-с т---vt--\S-

cris»

io .га с r t ic и

KJ

была на уровне 10-80%. На хорошее состояние клеток при таких режимах указывают высокие уровни : Y - шт. ДМ 0,5 -0,40- 0,43 и шт. & 2 -0,5-0,6 (рис. ИА-Г),' и содержание ФГ в сухой биомассе шт. ДМ 0,5 •■до 9-10% (рис. ЮГ). Ростовая активность клеток шт. ДМ 0,5 в конце фазы IV выращивания при высокой концентрации биомассы в биореакторе MF-107 (рис. 10), взятых в качестве инокулюма для опыта в EL-75 (рис. 1), была также очень высокой. Важно отметить воспроизводимость основных кинетических и физиолого-биохимических' характеристик по фазам роста (рис.10А-Г срав. рис.1А-Г). В частности, снижение веса "средней" клетки в Фазу III составляло до 30-40% (рис. ЮБ, кр. 5) так же, как и в стандартном цикле выращивания (рис. 1Б, кр.5). Особенностями реакции культур клеток на такие режимы выращивания являлось снижение JH^ на 20-40% относительно уровня характерного для каждого из штаммов при обычных Хо (рис. ЮБ, ИВ, 7, 1 и табл.). a R в 1,5-2 раза (рис. 10В, НА, 7, ц. I-III).

. Данные на рис.11Д-Е подтверждают вывод модели (4)-. В ц. III-V накопление N0~, NH*. К+ и Са2+ в КС не превышало 143% от уровня М-С.

В процессе выращивания в стандартных биореакторах EL-75 и EL-420 скорость мешалки простой конструкции повышали поэтапно от 150 .' об/мин до 4200б/мин (330"'см/с)- шт. 12, и до 575 об/мин (450CM/C) -шт.ДМ 0,5 с целью обеспечения газо-массообмена при высоких концентрациях биомассы. Окружная скорость -450 см/с более, чем в 4 раза выше применявшейся другими авторами для клеток растений. Эти . эксперименты подтвердили наше предположение о способности клеток растений адаптироваться к гидродинамическому стрессу. Механизм такой адаптации может быть связан не только с изменением качественного состава.гемицеллюлоэи (Tanaka et al., 1989), но также и с автоселекцией клеток более устойчивых к стрессу.

В стационарную фазу роста клеток женьшеня в стандартном биореакторе EL-75 были достигнуты Б равные -400 г/л и -450 г/л (рис. 11Б, ц.V), т.е. соотв. - 755« и -85% от qL. что превышает максимальный, результат (-70% от qL), полученный на клетках коптис в биореакторе специальной конструкции (Fujlta. Tabata,1987),

Опыты по выращиванию клеток диоскореи (рис. 10А-Г) и женьшеня (рис. Ш-Е) при -30% соотношении Хд/Хп показали, что П и Р обоих штаммов в 1,5-2 раза выше, чем при обычных режимах. Значительное увеличение П и Р при повышении ко от 0,1 до 0,3 при высокой концентрации биомассы объясняется сокращением продолжительности цикла выращивания (рис. 1 срав. рис. 10), Короткий цикл уменьшит экономический риск на производстве в случае инфекции.

- 23 -ВЫВОДЫ

1. На основе комплексного анализа кинетики роста и физиологических характеристик культивируемых клеток разных видов растений в цикле периодического выращивания в биореакторах уточнены принципы и методы разделения фаз ростового цикла. Деления и рост клеток в экспоненциальную фазу роста могут' при этом рассматриваться как несинхронизированные процессы и описываться подобно химическим реакциям первого порядка. •

2. Несбалансированность роста по разным критериям в экспоненциальную фазу характерна только для одного из штаммов:. исследованных культур клеток - исходного штамма диоскореи. Дисбаланс удельных .скоростей роста по основным критериям типичен для всех иссле- • дованных культур в Фазы ускорения и замедления роста, а в наиболь1- , шей степени, в стационарной фазе.

3. Изучены некоторые особенности физиологических реакций исходного и мутантного штаммов культур клеток диоскореи на величину начального рН культуральной среды и температуру выращивания в биореакторах. Адаптационные, реакции клеток этих штаммов, имея ряд • общих закономерностей, существенно различались в способности активно регулировать рН среды, в скоординированном изменении дыхания и роста, и,в меньшей степени, в потреблении сахароз - в физиологи-, ческом диапазоне температуры культивирования. ,

4. Выяснено значение-величины инокулюма, концентрации СОг в газовой фазе, концентрации сахарозы и скорости растворения кислорода для клеток исходного и мутантного" штаммов диоскореи. Показано, что величина инокулюма, ниже которой продолжительность лаг-фазы быстро возрастает, определяется концентрацией, клеток; повышенный .

: уровень С02 (-15S) в воздушной смеси на барботая эффективен только при концентрации клеток в области критического уровня;' прирост биомассы клеток данных штаммов пропорционален концентрации Сахаров и скорости растворения кислорода при отсутствии взаимного лимитирования. •. : :

5. Доказано, что культуры клетйк диоскореи и женьшеня при выращивании до высоких концентраций в стандартных 75 л и 420 л биореакторах обладают относительной устойчивостью к гидродинамическому стрессу при высоких и рекордно высоких скоростях мешалки "гребной винт". Высказана гипотеза, что это связано со способностью растительных клеток in vitro адаптироваться н стрессу путем ав- . тосе лекции. клеток с болыией устойчивости) к данному воздействию.

6. Разработан многоциклический режим периодического культивирования клеток диоскореи шт. ДМ 0.5 и женьшеня шт. Ж 2 при 30% начальной концентрации биомассы от ее конечной концентрации. Экономическая перспективность такого режима обоснована оригинальной математической моделью. При этом режиме выращивания продуктивность по сухой биомассе у обоих штаммов достигала 2,0 г/л-сут, а по содержанию стероидных сапонинов (шт. ДМ 0,5) - 180 мг/л-суг, что в 1,5-2,0 раза выше, чем при стандартных режимах.

7. Предложен универсальный коэффициент предельной плотности упаковки суспензионных культур клеток растений и иных объектов с формой условного среднего элемента приближенной к эллипсоиду - qL. Он численно равен общему объему культивируемых элементов, составляющему 0.53 доли от объема, в которьй эти элементы вписаны.

. Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Butenko R.G.. Llpsky A.Kh.. Paukov V.U., Davlüova I.M. Kultivatoren гиг Zuchtung von Pflanzenzellen. In: Entwicklung von Laborfermentoren. (Ed.).Ringphfeil M., Abhandlungen der Akademie der Wissenschaften der DDR. Abteilung Mathematik-Naturwissenschaften-Technik. Jahrgang. 1979, Nr.3 H, Akademie-Verlag, Berlin, 1980, p. 193 - 197. .

2. Butenko-R.G., LipskyA. Kh., Chernyak N. D. and Arya H.C. Changes in culture wedlum pH by cell suspension cultures of Dioscorea deltoidea. Plant Science Letters. 1984, V. 35. И 3. p. 207 - 212.

3.'Llpsky A.m. Nosov A.M.. Paukov V.H. and Karanova S.L. Growth and metabolism of the Dioscorea deltoidea cell culture on submerged cultivation. In: Plant Cell Culture. (Ed.) Butenko R.G., Mir Publishers, Moscow, 1985, p. 76 - 107,

4. Llpsky A.Kh. optimization of biomass production in a multi-cyclic culturlng system of Panax ginseng cells. In: Abstracts VIIth International Congress on Plant Tissue and Cell Culture. Amsterdam, June 24J29, 1990, p. 341.

5. Urraantseva V. V.. Llpsky A.Kh., VolkovaL.A., Gazaryan I.G.,- Verlovkin A.N., Egorov A.M. Peroxidase production by M§dicago sattva cell suspension cultures, там же, p. 331.

6.- Urmantseva V., Volkova L., Llpsky A. and Chalanova S. Peroxidase production by tfte cell suspension of Nedicago sativa. In: Biochemical, Molecular and Physiological Aspects of Plant Peroxidases. (Eds.) J. Lobarzewskl, HP Greppin, с. Репе 1 and Th. Gaspar, University of Geneva, 1991, p. 501 - 504.

7. Llpsky A.Kh. Problems of optimisation of plant cell culture processes. J. Biotechnology, 1992, "V. 26, N. 1, p. 83 - 97.

8. Липский A.X., Черняк Н.Д., Сойфер Р. Д. Некоторые вопросы глубинного культивирования клеток высших растений ' на примере Dioscorea deltoidea Wall. В сб.: "Культура клеток растений^'. Тезисы докладов III Всесоюзной конференция. Лбовян, 21 - 25 мая 1979, с. 21 - 22.

9. Липский А.X. Глубинное культивирование клеток высших растений. В кн.: "Культура клеток растений", под ред. Бутенко Р. Г.. М., "Наука", 1981, с. 51 - 68.

10. Липский А.Х.. Сойфер Р. Д., Бутенко Р.Г. Способ глубинного культивирования клеток Dioscorea deltoidea Wall. Авт. свид. N 770194 от 13.06.80. Опубл. в Б. И. N 34, 15.09.82., с. 301.

11. Липский А.Х. Влияние коэффициента массообмена по-кислороду (К а ) и концентрации сахарозы на культуру клеток диоскореи. В сб. :°г "Культура клеток растений и биотехнология". Тезисы докладов

IV Всесоюзной конференции. под ред. Бутенко Р.Г., Кишинев. Штиинца, 1983, с. 25. ' •

12. Липский А. X., Бутенко Р. Г. Простой барботажный ферментер-для периодического и проточного культивирования клеток.с малой потребностью массообмена. В сб.: "Культивирование клеток животных • и человека". Тезисы докладов Первого Всесоюзного совещания, под ред. Лежнева Э.П., Пущино, 1983. с. 44.

• 13. Липский А.X., Бутенко Р. Г. Респирометрические ячейки для клеток, культивируемых в суспензии. Там же. с. 45.

14. Липский А.Х., Черняк Н.Д. Влияние температуры на культуру клеток Dioscorea de Itoidea Wall, при глубинном выращивании. Физиология растений. 1983, том 30, вып. 3, с. 437 - 447.

15. Липский А.Х., Черняк Н.Д. О необходимости углекислого га?а при глубинном культивировании клеток Dioscorea deltoldea Wall. Фи--зиологи» растений, 1983, том 30. вып. 4, с. 761 - 767.

16. Липский' А.Х.Черняк Н. Д., Бутенко Р. Г. Аутостабилизация pH'питательной среды культурой клеток Dioscorea deltoidea Wall.-В' сб.: " I Всесоюзное совещание молодых ученых по физиологии растительной клетки", Тезисы докладов, под ред. Семенова И.Л., М., ИФР АН СССР, 1983, С. 45.

17. Липский А.X.. Черняк Н.Д., Бутенко Р.Т. Применение оптического метода определения биомассы при глубинном культивировании . клеток Dioscorea dettotdea Wall. Ппихладная биохимия и микробиология, 1983, том 39, вып. 5, с. 624 '- 630.

18. Липский АЛ.. Бутенко Р.Г. Особенности роста двух штаммов культуры клеток диоскореи. В сб.: "Новые направления биотехнологии", Тезисы докладов всесоюзной конференции, под ред. Баева A.A., Пущино. 1986, с. 17.

19. Васильева И.С., Воробьев A.C., Горская II.В., Липский А.X., Гуриелидзе К.Г., Пасешниченко В.А. Определение олигофуростанозидов в культуре клеток Dioscorea deltoidea Wall, спектрофотометрическим методом. Прикладная биохимия и микробиология, 1987, том 28, вып. 5, с. 692 - 696.

20. Липский А.Х. Физиологические характеристики мутантного л исходного штаммов суспензионной культуры клеток диоскореи. В сб.: "Биология культивируемых клеток и-биотехнология", Тезисы докладов

V Муждународной конференции, под ред. Бутенко Р.Г., СО АН СССР, Новосибирск, 1988. с. S5 - 96.

21. Липский А.Х. Себестоимость продуктов биосинтеза как критерий оптимальности режима многоциклического культивирования клеток растений. Там-же, с. 96 - 97.

22.-Липский А.Х. Оптимизация режимов многсшклического-выращивания культивируемых клеток высших растений ло критерию условной

■ себестоимости продуктов биосинтеза. Биотехнология. 1989. том 5, . Н 2, С. 248 - 255.