Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние глицерина (пропантриола) и 1,2-пропандиола на структурно-функциональные характеристики криоконсервированных эритроцитов

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лоевский, Марк Михайлович

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Действие 1,2-пропандиола на организм и пути его утилизации ch vcvo

2. Эритроцит как метаболическая система. Критерии структурно-функциональной полноценности

3. Гипотермическое хранение эритроцитов после размораживания. Способы увеличения сроков хранения клеток при 4°С

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4. Материалы и методы

5. Действие криоконсервации (-196°С) и гипотермического хранения на биохимические показатели эритроцитов

6. Состояние транспорта одновалентных катионов в эритроцитах после низкотемпературной консервации под защитой 1,2-пропандиола и глицерина

6.1. Влияние замораживания-отогрева на скорость транспорта 22/Va+ и i6Rb+ в эритроцитах

6.2. Особенности транспорта катионов в эритроцитах после криоконсервации и гипотермического хранения.

7. Состояние мембраны эритроцитов после криоконсервации и гипотермического хранения

8. Изучение возможности длительного гипотермического хранения клеток после криоконсервации под защитой 1,2-пропандиола и глицерина

8.1. Содержание органических фосфатов в эритроцитах при гипотермическом хранении клеток в криопротекторных средах

8.2. Изменение формы клеток после криоконсервации и в процессе гипотермического хранения

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние глицерина (пропантриола) и 1,2-пропандиола на структурно-функциональные характеристики криоконсервированных эритроцитов"

Длительное хранение тканей и клеток при низких и сверхнизких (-19б°С) температурах стало возможным благодаря открытию криопротекторов - веществ различной природы и происхождения, позволяющих предотвращать гибель клеток от низкотемпературной деструкции [3,113]. В настоящее время в практике длительного хранения клеток крови при сверхнизких температурах в нашей стране и за рубежом чаще всего используют.защитные среды, содержащие глицерин [2,178] . Однако, его применение в более широких масштабах ограничено в связи с необходимостью удаления этого криопротектора из деконсервированных клеток, что ведет к дополнительным их повреждениям [2,178] . Эти обстоятельства предопределили интерес к свойствам 1,2-пропандиолау гликоля, молекула которого содержит на одну гидроксильную группу меньше, чем глицерин. Криопротекторные свойства 1,2-пропандиола (1,2-ПД) в отношении эритроцитов были испытаны [из], однако, это соединение не получило распространения на практике из-за недостаточной изученности особенностей взаимодействия криопротектора с клетками [22]. Дальнейшие испытания эффективности 1,2-пропандиола для целей криобиологии показали, что данный криопротектор может быть с успехом использован для криоконсервации клеток крови [22, 69,70]. Исследования, посвященные выяснению взаимосвязи между строением криопротекторов и их криозащитным и физиологическим действием, разрозненны и малочисленны [7]. Поэтому сравнительное изучение двух близких проникающих веществ - 1,2-пропандиола и глицерина (пропантриола) [lI3 J может приблизить нас к пониманию механизмов криоповреждения и криозащиты клеток.

Необходимо отметить, что несмотря на большое количество работ, посвященных криозащитной эффективности различных соединений в отношении эритроцитов, имеется очень ограниченное число сообщений об их влиянии на метаболизм красных клеток крови [72, 135]. Тем не менее очевидно, что именно метаболическое состояние деконсервированных клеток определяет их физиологическую полноценность в случае клинического использования [2,178]. Удобным методическим приемом для изучения структурно-функциональных свойств эритроцитов, подвергнутых низкотемпературной консервации под защитой криопротекторов, является их анализ в гипотермичес-ких условиях (0 - (+4°С)) после отогрева и удаления криопротекторов. Этот подход можно считать целесообразным, т.к. он моделирует практические процедуры, при которых размороженные клетки переливают в разные сроки после их деконсервации [l,I6,I80] . Хранение при позволяет также провести анализ реализации латентных повреждений мембраны [148], возникающих в процессе криоконсервации, и вскрыть некоторые закономерности влияния криопротекторов и факторов среды на биохимические показатели клеток.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилось изучение структурно-функциональных свойств эритроцитов, замороженных под защитой 1,2-пропандиола и глицерина.

В конкретные задачи исследования входило:

I. Изучить влияние замораживания-отогрева под.защитой 1,2-ПД и глицерина на внутриклеточное содержание АТФ,2,3-ДФГ, катионов Na+ и К + в эритроцитах человека на протяжении 120

- б часов гипотермического хранения в ресуспендирующих средах различного состава.

2. Разработать способ количественного определения 1,2-ПД в эритроцитарной взвеси и определить возможности длительного хранения размороженных клеток в гипотермических условиях.

3. Выяснить состояние транспорта одновалентных катионов N(\+» К*) в эритроцитах после низкотемпературной консервации под защитой 1,2-ПД и глицерина и последующего гипотермического хранения.

Оценить барьерные и структурные свойства мембран эритроцитов в присутствии криопротекторов после низкотемпературного воздействия.

5. изучить взаимосвязь между динамикой биохимических показателей эритроцитов и формой клеток после низкотемпературной консервации под защитой 1,2-ПД и глицерина в процессе гипотермического хранения.

Проведенный комплекс биохимических исследований позволил оценить структурно-функциональное состояние эритроцитов, замороженных под защитой 1,2-ПД и глицерина. На основании анализа динамики содержания катионов и фосфорорганических соединений в эритроцитах после низкотемпературной консервации под защитой изученных криопротекторов установлено, что метод криоконсерва-ции эритроцитов под защитой 1,2-ПД можно рассматривать как альтернативный традиционному - под защитой глицерина.

На основании разработанного нам способа количественного определения 1,2-пропандиола в эритровзвеси определены концентрации 1,2-ПД, остающиеся после удаления криопротектора.

С помощью метода флуоресцентного зондирования впервые показано, что применение 1,2-ПД и глицерина позволяет практически полностью избежать регистрируемых структурных перестроек мембранных белков, индуцируемых низкими температурами. Установлено, что осмотические факторы на этапе удаления криопротекторов являются определяющими в процессе повреждения мембранных структур, что ведет к снижению микровязкости фосфолипидного бислоя эритроцитарных мембран и дезагрегации их белковых комплексов.

Впервые показано, что длительная экспозиция эритроцитов в составе изученных криопротекторных сред при 4°С после низкотемпературной консервации приводит для обоих криопротекторов к различным структурно-функциональным сдвигам. Отмечено, что хранение клеток в среде 1,2-ПД, по сравнению с глицерином, сопровождается сохранением более высокого уровня АТФ и 2,3-ДФГ в клетках, более выраженным повышением проницаемости мембран эритроцитов для катионов и активацией No., К - насоса при 37°С после удаления криопротекторов. 1,2-ПД индуцирует образование стоматоцитов и книзоцитов, глицерин-эхиноцитов и акантоцитов.

Впервые установлено, что пребывание размороженных клеток . в составе криопротекторных сред позволяет значительно, с 1-2 до 10-14 суток, увеличить сроки хранения деконсервированных эритроцитов в гипотермических условиях.

Установлено, что в основе консервирующего действия криопротекторных сред при 4°С лежат механизмы ингибирования метаболических процессов в эритроцитах, как показано для гексокиназы.

Практическая ценность работы заключается в том, что проведенные исследования впервые дают биохимическое обоснование целесообразности применения метода криоконсервации эритроцитов под защитой 1,2-пропандиола. На основании полученных результатов выявлены преимущества использования в качестве ресуслендирующей среды для клеток, замороженных-отогретых под защитой 1,2-ПД и глицерина, сахарозосодержащую среду Ц0ЛИГ1К 8в.

Выявленная взаимосвязь между формой клеток при гипотермичес-ком хранении, состоянием их транспортных систем, динамикой биохимических показателей и видом криопротектора имеет прогностическое значение при возможной оценке и выборе проникающих защитных агентов.

Установленный факт возможности значительного увеличения продолжительности хранения деконсервированных клеток при в присутствии 1,2-ПД и глицерина открывает дополнительные перспективы для. оптимального использования замороженной крови в клинических условиях.

Данные диссертации включены в материалы, направленные в Фармкоштет МЗ СССР с целью разрешения клинического изучения криопротектора 1,2-пропандиола.

Результаты исследований, касающиеся увеличения сроков хранения размороженных эритроцитов при 4°С используются в работе ЦНИИГПК МЗ СССР.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Использование 1,2-пропандиола в качестве криопротектора позволяет эффективно криоконсервировать эритроциты и длительно хранить их в гипотермических условиях после отогрева.

2. Проникающие криопротекторы глицерин и 1,2-ПД, применяемые в практике низкотемпературной консервации, модифицируют структурно-функциональное состояние размороженных эритроцитов путем ингибирования процессов обмена и изменения структурных и барьерных свойств их мембраны.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Действие 1,2-пропандиола на организм и пути его утилизации Ln vivo.

В настоящее время глицерин, в отличие от 1,2-пропандиола, считается хорошо изученным соединением как с точки зрения его

Использование 1,2-пропандиола для целей криозащиты клеток диктует необходимость детального анализа особенностей утилизации этого гликоля в организме, а также изучения его влияния на функциональное состояние организма в целом. В отношении 1,2-ПД известно, что это соединение рассматривается как нечужеродное для организма животных [^2], поскольку гликоль обнаружен в печени [ 153,155] , мозгу крупного рогатого скота и яйцах морского ежа [lI2], в мышцах кролика [l6l] . Окисление 1,2-ПД до лактата осуществляется, в основном, двумя путями и зависит от того, в свободной или фосфорилированной форме находится локализованный в клетке гликоль [154]. Окисление свободного гликоля осуществляется по следующему пути:

CH,CHCH,0HZ1£CHJCHCH0 -2Н+ СН. ССН0+Н20 СИ, си со о и

I л . I 3 II г 3 « он I он

II о

ОН

1,2-ПД лактальдегид метилгллоксаль лактат (I)

Для распада фосфорилированной формы 1,2-пропандиола требуется большее число стадий: cH3cHCHzopo3HLddt снгсснгоро3нр^сн5снсноро2нг он о он он

1,2-ПД фосфат ацетолфосфат лактальдегидфосфат (2) сн3 си сор 0 Нг СНг СНСООН I I/ 3 3 I

ОН О ОН лактилфосфат лактат

Хотя реализация указанных выше путей метаболизма 1,2-ПД в настоящее время доказана, однако не исключена возможность утилизации 1,2-ПД в пропиональдегид, одно- и двухуглеродные соединения или их производные [152]. Уровень 1,2-пропандиолфосфата в печени крыс, определенный изотопным разведением, составляет 1-2$ общего кислоторастворимого фосфора печени [153].

1,2-ПД или его фосфорилированные производные являются возможными промежуточными соединениями в метаболизме ацетона [154]. Конечными продуктами окисления 1,2-ПД может быть формиат, ацетат или 3-х углеродный предшественник (пируват, лактат) цикла трикарбоновых кислот. Участие 1,2-ПД в метаболизме ацетона было доказано с помощью радиоизотопного метода на клетках печени. В частности выяснилось, что радиоактивная метка ^С-метильных групп ацетона инкорпорировалась в р -углерод-серина, метильные группы холина и метионина [154]. Более того, оказалось, что экстрагированная из гликогена печени крыс глюкоза интенсивно метилась в положении 3 и 4-го атомов углерода, а часть ^С-аце-тона при этом превращалась в лактат.

Активность I и б-го атомов глюкозы была гораздо выше, чем 2 и 5-го, что свидетельствует о прямом превращении ацетона в триозы (3): 0 + ^1формиат" или "ацетат" щ с сн3 ~сн,еснгон +§а. щснснгон<С а)

0 0 ОН ^триоза-^-глюкоза б) ацетон ацетол 1,2-ПД (3)

С целью выяснения, является ли 1,2-ПД промежуточным соединением в метаболизме ацетона, либо ацетон самостоятельно карбо-ксилируется в ацетоацетон, формиат или ацетат, метили карбонильные группы ^С в молекуле ацетона [ 156].

Результаты показали, что более высокая активность атомов углерода глюкозы в 2 и 5 положении, чем в I и б свидетельствует в пользу того, что ацетон окисляется именно до стадии триоз (3 б). Было выяснено, что 1,2-пропандиолфосфат стимулирует образование кетокислот (преимущественно пирувата) в гомогенатах печени крыс, в то время как нефосфорилированная форма 1,2-пропан-диола не обладает подобным действием [152]. В соответствии с разработанной схемой распада фосфорилированного гликоля, первый этап предполагает наличие в среде инкубации миогена А - водорастворимой фракции саркоплазматических белков, богатых гликоли-тическими энзимами, в частности, глицерол-3-фосфатдегидрогена-зой [152J. Реакция требует присутствия НАД* в качестве кофактора:

СН3 сиснгоро3 нг + НДД+ глицерол-з-фосфат ЩССНгОРО^г +вд-+н+ 0ц дегидрогеназа Q

1,2-ПД фосфат ацетолфосфат (4)

Ацетолфосфат является источником образования лактальдегидфосфа-та при добавлении тризофосфатизомеразы:

CH}CCHzOPOzHz триозофосфат- CH3 CH - CHDPOsHz jj изомераза ^ (5) ацетолфосфат лактальдегидфосфат

Лактальдегидфосфат окисляется далее Л -глицеральдегид-3-фос-фатдегидрогеназой до лактилфосфата:

СИ^Н°+ШГ ГА-ЗФ-дегидро- Щ^ЩЬ+тщ + ъ* ОН ОН геназа ои 0 лактальдегидфосфат лактилфосфат

Имеются также дополнительные сведения, касающиеся ферментативной реакции 4 [l6lj, где о^-глицеролфосфатдегидрогеназа, присутствующая в мышце кролика, участвует в восстановлении аце-толфосфата в 1,2-пропандиолфосфат. Обратная реакция происходит благодаря наличию специфического энзима, 1,2-пропандиол-1-фос-фатдегидрогеназы в естественной смеси. Показано также £l6l], что печень крыс и гомогенаты почек образуют ацетолфосфат из аце-тола и АТФ посредством фермента, отличного от глицерокиназы. Образование в тканях фосфорилированного гликоля, по-видимому, происходит следующим образом:

СН,ссиг0Н+ АТф ацеголкиназа СН3ССНг0Р0$Нг +

О О (?) ацетол ацетолфосфат

СН3ССНгОРО^Иг + н+ » CH3CHCHZ0PQ3HZ + НАД4" О ацетолфосфат 1,2-ПД-фосфат

8)

Выяснены также возможности биохимического превращения 1,2-ПД и пирувата [152]. В опытах с нормальными и опухолевыми тканями крыс, находящихся в анаэробных условиях, и используя ингибиро-вание реакции солями фтора, было определено, что пируват может превращаться в 1,2-пропандиолфосфат. Из плаценты и семенных пузырьков крупного рогатого скота изолирован фермент, обладающий стереоспецифичностью к Х>-форме 1,2-пропандиола [182] и способный окислить его до лактальдегида.

Баер и соавт. [57] в экспериментах ih у Иго показали, что фосфолипиды, подобные по своему строению d -лецитинам и JL -кефалинам, могут быть синтезированы из 1,2-пропандиола. Оказалось, что J) -пропиленгликоль - oL -фосфорилхолин обладает выраженным гемолитическим действием, в то время как D -пропилен-гликоль- -фосфорилэтаноламин не является гемолитиком.

Таким образом, биохимическое окисление 1,2-пропандиола Lh vivo может идти двумя путями [152,154]. Свободный гликоль метаболизирует до лактата через этап образования лактальдегида и метилглиоксаля, в то время как фосфорилированная форма гликоля окисляется через стадии ацетолфосфата, лактальдегидфосфата и лактилфосфата до лактата. Однако, окисление 1,2-пропандиола не ограничивается лишь только образованием лактата или пирувата.

При этом может образоваться также дезоксиальдегид диола, пропии ональдегид, лактальдегид, фосфолипиды, формат или ацетат.

Показано, что 1,2-ПД обладает низкой токсичностью: в зависимости от вида и пола животного и способа введения гликоля 1,2-ПД приблизительно в 2-3 раза менее токсичен, чем глицерин [25J. Низкая токсичность 1,2-пропандиола и его способность быстро метаболизировать в организме привели к использованию этого соединения в качестве энергетического источника обмена в организме [152]. Показано, что замена 8% крахмала зерна в рационе цыплят 1,2-пропандиолом не приводила к нарушению роста и развития птиц f6l]; согласно данным, 1,2-ПД [152] может использоваться в качестве дополнительного источника питания для собак, крыс, крупного рогатого скота.

У собак, которые получили 8мл/кг и 12 мл/кг 1,2-ПД в виде 50$-ного водного раствора, обнаружили 13 мг/мл гликоля в крови через 2 часа и 9 мг/мл через 4 часа [152*]. Тот факт, что в моче этих животных находилось 12-45$ неизменного 1,2-пропандиола, говорит о том, что гликоль не только хорошо удаляется почками, но и большая его часть метаболизирует в организме. Введение непосредственно в желудок дойной коровы 1,2-ПД, меченного по ^С показало, что через 24 часа 43,7$ метки находилось в составе выдыхаемого С02; 12,4$ - в молоке, 3,5-7$ в моче и менее 0,1$ - в фекалиях £88]. В желудке гликоль всасывается в неизмененном виде, хотя обнаружена очень небольшая часть 1,2-ПД в виде пропио-новой кислоты. Распределение С^ углерода между лактозой и глу-таминовой кислотой показало, что 1,2-пропандиол превращается в глюкозу через механизм карбоксилирования пирувата в оксалацетат [88]. Эти результаты показывают, что 1,2-пропандиол является глюкогенным агентом с достаточно хорошо выраженными свойствами посредством интермедиатов (пирувата и оксалацетата), которые способствуют синтезу глюкозы. Глюкогенез, по-видимому, происходит главным образом в печени, в то время как окисление 1,2-ПД происходит в других тканях [88]. О безвредности 1,2-ПД как фармакологического агента свидетельствуют опыты по пероральному введению крысам 1,2-пропанд.иола в дозе 2,84 мл/кг в течение 30 дней. При этом не выявлено какого-либо отрицательного влияния на уровень гемоглобина в крови, время свертывания крови и лейкоцитарную формулу, хотя отмечено уменьшение скорости оседания эритроцитов на 50$, общего количества лейкоцитов на 22,3$ и уровня восстановленного глютатиона на 11,3$ [51]. При исследовании ферментативной активности клеток выявлено, что после введения 1,2-ПД на 38% увеличивалось содержание белка на 348% - активность кислой фосфатазы, на 233% - (+-Мд + + ) - зависимой АТФ-азы и на 128% возрастала активность 5-нуклеотидазы [51]. Наблюдаемая стимуляция активности ферментов может быть связана с возможными первичными или вторичными перестройками клеточных мембран под действием 1,2-ПД [51]. Однако при внутрижелудочном введении крысам гликоля в дозе 4 мл/кг на протяжении 30 дней не наблюдалось существенных отличий от показателей контрольной группы по содержанию общих фосфолипидов, холестерина, триглицери-дов и свободных жирных кислот плазмы крови, а также в концентрации фосфолипидов, григлицеридов и ганглиозидов печени, в то время, как концентрация холестерина умеренно повышается [ЮЗ]. Вместе с тем, необходимо помнить, что длительное применение 1,2-пропандиола может приводить к отрицательным последствиям. Так, описан единичный случай поражения центральной нервной системы у мальчика II лет, принимавшего 1,2-пропандиол с витамином на протяжении 13 месяцев [5б]. Введение крысам смесей, содержащих диолы в дозах 10 г/кг веса в течение 15 дней, вызывают значительное усиление процессов перекисного окисления липидов, особенно в случае совместного введения 1,2-пропандиола и 1,3-бутан-диола [38].

Отмечено, что включение в рацион крыс 1,2-пропандиола требует определенной адаптации животных к этому соединению [13]. Крысы, получавшие пищу с включением в рацион 1,2-ПД, несколько отставали в развитии в течение первых 10-15 дней по сравнению с контрольными грызунами, однако через некоторое время их рост и развитие соответствовало таковым у животных контрольной группы [13]. Изучение динамики введения диола крысам реч. oj показало, что 1,2-ПД уже через 15 мин обнаруживается в крови и печени после введения. Максимальная концентрация определяется в крови животных через час, а через 12 часов остаются лишь следы гликоля [13]. В опытах на собаках установлено, что внутривенное введение 1,2-пропандиола в сочетании с глюкозой не влияет на элиминацию бромсульфалеина из печени, что свидетельствует об отсутствии гепатотоксического действия 1,2-ПД [30]. Внутрибрюшинное введение 1,2-ПД, в сочетании с глюкозой крысам вызывает незначительные морфологические изменения в паренхиме, носящие, очевидно, обратимый компенсаторно-приспособительный характер [50]. Включение в диету крыс-отъемышей 20$ 1,2-ПД от общей энергетической ценности углеводов способствовало близкому к контролю росту животных, повышению концентрации глюкозы крови и АТФ печени при отсутствии существенных изменений в содержании гликогена, АДФ, лактата и общих липидов печени [14]. Многократное введение гликоля голодающим крысам в интервале шести часов стимулирует синтез гликогена в печени. Сравнение 2-х диет: высокоуглеводной и высокожировой с включением 1,2-ПД показало, что гликоль функционирует как потенциальная углеводная добавка в обмене веществ в организме. Включение диола в состав высокожировой диеты увеличивало содержание гликогена и снижало содержание общих липидов печени [14]. При включении 1,2-ПД в высокоуглеводную диету, изменений в содержании гликогена не происходило, однако наблюдалось повышение концентрации липидов печени [12]. При этом концентрации диоксиацетонфосфата и глицеральдегид-З-фосфата увеличивались на 60$; 3-фосфоглицерата - на 28$ и АТФ - на 30$. Это прямо свидетельствует в пользу того, что 1,2-пропандиол как предшественник в синтезе углеводов включается в ферментативные реакции на уровне триоз [12].

Введение 1,2-пропандиола в любой тип диет сопровождается увеличением фосфатного потенциала ( [АТФ] / [АДф] [фн]) и показателя окислительно-восстановительного состояния клеток ( НАД / НАДН ), а также повышением активности алкогольдегидрогеназы[12].

Таким образом, благодаря низкой токсичности, высокой энергетической ценности, способности быстро метаболизировать в организме 1,2-пропандиол в настоящее время рассматривается как энергетический субстрат при парентеральном питании животных и человека [12,14,32].

В физико-химическом аспекте это соединение обладает свойствами, необходимыми для проявления криопротекторного эффекта: гликоль легко проникает в клетки, обладает низкой токсичностью, эффективно связывает воду, обладает низкой эвтектической температурой 43,113 . Стабильность аморфного состояния его водных растворов намного выше, чем у других криопротекторов [70]. Присутствие 1,2-пропандиола повышает стабильность аморфного состояния других систем [69]. С учетом этих свойств 1,2-пропан-диола в последнее время испытана его эффективность при консервации различных клеток. По данным [3] 1,2-пропандиол относится к числу криозащитных соединений с высокой эффективностью при замораживании клеток и соматических тканей. Так, 7;о-ный раствор 1,2-ПД использован при замораживании спермы быков, баранов и индюков и позволял в смеси с буферными растворами сохранять подвижность и жизнеспособность клеток на более высоком уровне, чем ДМСО и глицерин. Но особенно эффективным пропилен-гликоль оказался при замораживании культуры почечных клеток человека и эритроцитов [22].

Заключение Диссертация по теме "Криобиология", Лоевский, Марк Михайлович

ВЫВОДЫ

1. Низкотемпературная консервация эритроцитов под защитой 1,2-ПД и глицерина характеризуется снижением уровня АТФ, 2,3-ДФГ,

К и повышением содержания А/а в клетках. Изменение этих показателей не отличается достоверно при использовании обоих криопротекторов.

2. Снижение концентрации АТФ и 2,3-ДФГ в размороженных эритроцитах и нарушения катионной асимметрии клеток углубляются при гипотермическом (+4°С) хранении в ресуспендирующих средах ЦОЛИПК 86 и 8в. Менее выраженные изменения отмечены в среде 8в, что подтверждает положительный эффект сахарозы в стабилизации мембран клеток, по сравнению с глюкозой.

3. При инкубации размороженных эритроцитов при 37°С происхо

22 А/ + дит увеличение скорости выведения катиона /Va из клеток и

- в клетки, что можно рассматривать как тенденцию к восстановлению нарушенного при криоконсервации катионного баланса.

4. Применение 1,2-ПД и глицерина вызывает увеличение коэффициента эксимеризации пирена в мембранах эритроцитов и облегчение переноса энергии с триптофанилов мембранных белков на пирен. Это свидетельствует о снижении вязкости фосфолипидного бислоя мембран эритроцитов и дезагрегации их белковых комплексов в присутствии 1,2-ПД и глицерина. Гипотермическое хранение сопровождается снижением коэффициента эксимеризации пирена, даже в присутствии криопротекторов.

5. Хранение эритроцитов при 4°С в среде 1,2-ПД и глицерина приводит для обоих криопротекторов к различным структурно-функциональным сдвигам. Экспозиция клеток в среде 1,2-ПД, по сравнению с глицерином, характеризуется сохранением более высокого уровня АТФ и 2,3-ДФГ в клетках, более выраженным повышением проницаемости мембран эритроцитов для катионов и активацией Na ,К -насоса при 37°С после удаления криопротекторов. 1,2-ПД индуцирует образование стоматоцитов и книзоцитов, глицерин - эхиноцитов и акант о щи ов.

6. Гипотермическое хранение размороженных клеток в криопро-текторных средах на основе 1,2-ПД и глицерина позволяет увеличить сохранность эритроцитов до 2-х и более недель, что подтверждается способностью клеток к трансформациям типа эхиноцит-дис-коцит и стоматоцит-дискоцит и образованию "монетных столбиков" после удаления криопротекторов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Значительные успехи, достигнутые в последние годы в области длительного хранения тканей и клеток при сверхнизких температурах, стали возможными благодаря разработке эффективных методов низкотемпературного хранения биообъектов и более глубокому пониманию механизмов криоповреждения и криозащиты клеток [2,3]. Очевидно, что процесс криозащиты представляет собой сложную многофакторную последовательность событий, происходящих на молекулярном уровне и затрагивающих основные параметры функционирования клеток. Обеспечивая защиту клеток от повреждающего действия холода, с одной стороны, криозащитные соединения при этом оказывают влияние на их структурно-функциональное состояние, в частности, изменяют соотношение внутриклеточных метаболитов, нарушают натив-ное состояние белково-липидных комплексов мембраны, модифицируют форму клеток [7]. Дополнительная информация о взаимосвязи между строением криопротекторов, их защитным и физиологическим действием может быть получена при изучении проникающих криопротекторов, т.к. это дает возможность анализа их действия как на уровне плазматической мембраны клеток, так и на уровне внутриклеточных структур.

В связи с этим нами проведено сравнительное изучение двух близких проникающих веществ - 1,2-пропандиола и глицерина (про-пантриола) на этапе гипотермического хранения (+4°С) эритроцитов, после эквилибрации и криоконсервации клеток с криопротекторами.

Анализ динамики содержания катионов и фосфорорганических соединений в эритроцитах после низкотемпературной консервации показал, что замораживание-отогрев приводит к изменению исследуемых показателей. Наиболее выраженные сдвиги происходят в содержании катионов в клетках, составляющие 20-30% в случае применения среды 86, независимо от вида криопротектора; менее значительны при этом потери 2,3-ДФГ и АТФ .

Дальнейшее гипотермическое хранение размороженных клеток в ресуспендирующих средах ЦОЛИПК 86 и 8в приводит к снижению внутриклеточного содержания органических фосфатов и К + и поступлению А/а+ в эритроциты. Полученные результаты свидетельствуют о значительной роли ресуспендирующей среды в обеспечении структурно-функциональной полноценности деконсервированных клеток, способности компонентов среды отдалять реализацию латентных повреждений мембраны [148], возникающих под действием замораживания-отогрева.

Выход К из клеток и обогащение их катионами Na после криоконсервации под защитой 1,2-пропандиола и глицерина и хранения в среде 86 может быть связан с присутствием глюкозы и низким электролитным составом этой среды, поскольку в сахарозосодержа-щей среде 8в отмеченные изменения проявлялись в значительно меньшей степени. Этот факт подтверждает эффективность сахарозы как одного из основных компонентов ресуспендирующих сред в ее способности стабилизировать структуру мембраны после криовоздействия [19,141].

Сравнительный анализ динамики содержания катионов и органических фосфатов в размороженных эритроцитах, проведенный с целью оценки методов криоконсервации под защитой обоих криопротекторов, свидетельствует об отсутствии достоверных различий, что позволяет рассматривать метод криозащиты с использованием 1,2-пропандиола как альтернативный в отношении традиционного, глицеринового.

Установлено, что нарушение катионной асимметрии эритроцитов, возникающее под действием замораживания-отогрева, сопровождается при последующей инкубации в физиологических условиях (37°С), после удаления криопротекторов, активацией А/а , К -насоса мембран. Обнаружено, что эквилибрация и криоконсервация эритроцитов с 1,2-пропандиолом приводит к возрастанию внутриклеточной концентрации /Уа+и более активному выведению этого катиона после удаления криопротектора, по сравнению с использованием глицерина.

Показано, что в процессе гипотермического хранения размороженных клеток в присутствии криопротекторов происходит дальнейшее аномальное перераспределение Д/а + и К + , которое более выражено в случае экспозиции эритроцитов в среде 1,2-пропандиола, по сравнению с глицерином. Однако факт активации N а , К -насоса после удаления криопротекторов может свидетельствовать о вероятной обратимости отмеченных изменений в физиологических условиях.

Известно, что одной из основных причин нарушения катионной асимметрии эритроцитов в процессе их гипотермического хранения является околонулевая температура, которая ингибирует А/а+, К+-АТФ-азную систему эритроцитов [III,183]. Однако в случае длительного контакта клеток с растворами криопротекторов может изменяться характер гидрофобных взаимодействий в липидном бислое и белок-липидных комплексах мембран [lI5], что сопровождается увеличением их пассивной проницаемости для катионов через "каналы утечки" [87].

Таким образом, в процессе гипотермического хранения эритроцитов в криопротекторных средах возникает двойственный характер нарушения структурно-функционального состояния клеток - торможение активного транспорта и возникновение нерегулируемых потоков ионов в результате изменения барьерных свойств фосфолипидного бислоя мембраны.

Обнаруженная активация А/а , К -насоса после удаления криопротекторов может рассматриваться, с одной стороны, как компенсаторная реакция клеток на изменение катионных градиентов. С другой стороны, активация /Va+, К+-АТФ-азной системы может быть связана со снижением микровязкости бислоя мембраны и А/а*, К+ -АТФ-азы как ее липидзависимого компонента [9] .

С помощью метода флуоресцентного зондирования показано, что в отсутствие криопротекторов наиболее вероятным результатом действия низких температур на мембраны эритроцитов является агрегация белков или транслокация их после криовоздействия из глубины фосфолипидной фазы мембраны в верхнюю часть бислоя. Применение криопротекторов позволяет практически полностью избежать регистрируемых структурных перестроек мембранных белков, индуцируемых низкими температурами, в то время как осмотические факторы на этапе отмывания клеток от криопротекторов являются определяющими в процессе повреждения мембранных структур. Конкретными проявлениями нарушений, развивающихся при удалении криопротекторов, можно считать снижение вязкости фосфолипидного бислоя и дезагрегацию белковых комплексов мембран. Однако известно, что повышение вязкости фосфолипидного бислоя в настоящее время рассматривается как общее нарушение состояния клетки [34,107]. Поэтому логично предположить, что снижение микровязкости мембран в присутствии испытанных криопротекторов является положительным моментом, позволяющим эритроцитам переносить низкотемпературный стресс. В криобиологической литературе окончательно не решен вопрос, является ли состояние мембраны при замораживании с криопротектором изменением, которое можно понимать как стабилизацию ее структуры, или устойчивость связана с более высокой структурной лабильностью и пластичностью мембраны. Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что вторая тенденция является преобладающей, что, вероятно, позволяет клеткам выдерживать низкотемпературное воздействие. В то же время гипотермическое хранение, которое характеризуется повышением вязкости фосфолипидного бислоя, даже в присутствии криопротекторов, может явиться пусковым механизмом развития структурных и функциональных нарушений мембран и последующей деструкции клеток.

Длительное гипотермическое хранение эритроцитов (28 суток) после эквилибрации и криоконсервации под защитой 1,2-ПД и глицерина позволило выявить индивидуальные особенности их влияния на метаболизм клеток. Предполагается, что наиболее вероятным действием глицерина является ингибирование ДФГ-мутазы, в то время как 1,2-ПД ингибирует ДФГ-фосфатазу. Это выражается в поддержании высокого уровня АТФ и, особенно, 2,3-ДФГ в клетках в присутствии 1,2-пропандиола. Обнаруженный феномен дает возможность значительного увеличения продолжительности гипотермического хранения размороженных клеток в среде 1,2-ПД, без введения экзогенных добавок к эритровзвеси, которые создают дополнительную опасность для организма реципиента и повышают стоимость метода [178]. Таким образом, полученные результаты подтверждают возможность метаболической коррекции эритроцитов с целью поддержания внутриклеточной концентрации основных фосфорорганических соединений на высоком уровне. Использование 1,2-пропандиола открывает в этом отношении новые перспективы, так как позволяет криоконсервировать эритроциты под защитой гликоля и длительно хранить клетки при

Выявлена взаимосвязь между видом криопротектора, содержанием органических фосфатов и катионов в клетках и их формой. Установлено, что среда хранения в значительной степени детерминирует форму эритроцитов. Показано, что криопротекторная среда на основе глицерина индуцирует образование эхиноцитов и акантоцитов, в то время как в среде 1,2-ПД преобладающими типами клеток являются стоматоциты и книзоциты. Выявлено, что стоматоцитная морфология клеток коррелирует с повышением пассивной проницаемости мембраны клеток для катионов, что подтверждается данными литературы [190]. Способность криопротекторных сред на основе 1,2-ПД и глицерина длительно поддерживать структурно-функциональное состояние размороженных эритроцитов может быть связана со снижением интенсивности метаболических процессов в клетках в присутствии растворов криопротекторов. Эксперименты на пусковом ферменте метаболизма глюкозы в эритроцитах - гексокиназе показали, что эквилибрация с криопротектором приводит к снижению активности фермента почти вдвое.

Таким образом, результаты изучения длительного гипотермического хранения клеток в криопротекторных средах свидетельствуют, что 1,2-ПД и глицерин оказывают влияние на структурно-функциональное состояние размороженных эритроцитов путем ингибирования ряда биохимических реакций в клетках, замедления темпов старения эритроцитов и отдаления процессов латентных повреждений мембраны. В результате этого становится возможным более длительное хранение клеток при 4°С после их отогрева из замороженного состояния. В то же время оба криопротектора по-разному модифицируют метаболизм эритроцитов. Поддержание высокой концентрации органических фосфатов в клетках с 1,2-ПД свидетельствует о перспективности криоконсервации и последующего хранения эритроцитов в среде на основе 1,2-пропандиола.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лоевский, Марк Михайлович, Харьков

1. Аграненко В.А., Мелкикян Н.А., Щербакова Л.Н. Криоконсервиро-вание эритроцитарной массы, восстановленной после длительных сроков хранения. - Пробд.гематол.,1977, 22, N5, с.45-49.

2. Аграненко В.А., Федорова Л.И. Замороженная кровь и ее клиническое применение. М.: Медицина, 1983. - 96 с.

3. Актуальные проблемы криобиологии / Под ред. Н.С.Пушкаря, А.М.Белоуса. Киев: Наук.думка, 1981. - 606 с.

4. Байшукурова А.К. Изменения концентрации 2,3-ДФГ эритроцитов крыс при различных экспериментальных воздействиях. Физиол. зурн,.СССР, 1980, 66, № 12, C.I808-I8II.

5. Бейли Н. Статистические методы в биологии. М.: Изд-во иностр. лит-ры, 1962. - 260с.

6. Белоус A.M., Бондаренко В.А. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении. Киев: Наук.думка, 1982, - 256 с.

7. Белоус A.M., Бондаренко В.А., Бондаренко Т.П. Молекулярные механизмы криоповреждений биомембран. В кн.: Биофизика / Итоги науки и техники, ВИНИТИ АН СССР / М., 1978, в. 9, с.80-114.

8. Болдырев А.А. К + -зависимая АТФаза. Успехи физиол. наук, 1981, 12, в. 2, с.91-131.

9. Бондаренко Т.П. Роль липидов в повреждении мембран митохондрий и эритроцитов при охлаждении: Дис. . канд.биол.наук. -Харьков, 1981. 151 с.

10. Борзова Л.В. Исследование электрофоретической подвижности эритроцитов при различных сроках и режимах хранения крови. -Пробл. гематол., 1978, 23, № 3, с.40-41.

11. Великий Н.Н., Пархомец П.К., Симонова Н.Д. Окислительно-восстановительное состояние клеток печени крыс, получавших в составе диеты 1,2-пропандиол. Вопр. питания, 1975, Ш 5,с.40-45.

12. Великий Н.Н., Симонова Н.Я., Пархомец П.К., Кириенко Т.А. Динамика поступления и использования орально введенного 1,2-пропандиола в синтезе гликогена печени крыс. Вопр. питания, 1975, Ш I, с.24-27.

13. Великий Н.Н., Чаговец Р.В., Пархомец П.К. и др. В кн.: Научные основы питания здорового и больного человека, т.1: Мат. 1-й Всесоюзн. конф. Алма-Ата, 1974, с.26-27.

14. Виноградов В.Л., Федорова Л.И. Колориметрический метод определения остаточного глицерина в размороженных отмытых эритроцитах. Пробл.гематол., 1980, 25, № I, с.47-49.

15. Виноград-Финкель Ф.Р. Успехи и перспективы развития проблемы консервирования крови. Пробл.гематол., 1979, 24, fe 5,с.46-53.

16. Виноград-Финкель Ф.Р., Гинзбург Ф.Г., Федорова Л.И. и др. Криоконсервирование эритроцитов и их функциональная полноценность (хранение в жидком азоте до 7 лет). Пробл.гематол., 1973, 18, N2 9, с.3-И.

17. Виноград-Финкель Ф.Р., Федорова Л.И., Кудряшова Л.И. и др. Теоретические и практические аспекты проблемы хранения размороженных эритроцитов в условиях положительных температур. -Пробл.гемаюл., 1975, 20, № 9, с.3-8.* . г *

18. Виноград-Финкель Ф.Р., Федорова Л.И., Семенова Н.В. Усовершенствованные растворы для ресуспендирования размороженных эритроцитов после их деглицеринизации. В кн.: Криобиология и криомедицина, Киев: Hayк.думка, 1979, вып.5, с.14-20.

19. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М: Наука, 1972. - 252 с.

20. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М: Наука, 1980. - 320 с.

21. Воротилин A.M., Гучок М.М., Моисеев В.А. и др. А.с. № 888896 (СССР). Способ криоконсервирования эритроцитов. Опубл. в Б.И., 1981, № 46.

22. Григорьев Г.П. Электрофоретическое исследование мембранных белков эритроцитов разного возраста. Вопр.мед.химии, 1981, 27, № I, с.91-96.

23. Гусева Н.Р., Луговой В.И. Введение добавок метаболитов и мем-браннотропных веществ в растворы для ресуспендирования размороженных-отмытых эритроцитов. Пробл.гемаюл., 1982, 27, №4, с.10-14.

24. Гучок М.М., Гучок В.М., Мазалов В.К. Сравнительное исследование токсичности этиленгликоля, Л -пропиленгликоля и глицерина. В кн.: Криобиология и криомедицина, Киев: Наук.думка, 1981, вып.9, о.36-43.

25. Добрецов Г.Е., Петров В.А., Борщевская Т.А., Деев А.И., Владимиров Ю.А. Влияние перекисного окисления на физическую структуру фосфолипидных мембран. Вопр.мед.химии, 1977, 23, № 6, с.818-822.

26. Добрецов Г.Е., Спирин М.М., Карякин А.В. и др. Исследование спомощью индуктивно-резонансного переноса энергии пространственных взаимоотношений между белками и липидами в мембранах микросом печени. Биохимия, 1981, 46, № 3, с.504-511.

27. Жукова Ю.В., Осе Б.П., Эйдус Я.А., Эпынь М.П. Сравнительное изучение и клиническое применение размороженных эритроцитов, хранившихся при 4°С в течение 7 дней. Пробл.гематол., 1982, 27, 4, с.14-16.

28. Инструкция по определению гемоглобина крови гемиглобинциа-нидным методом. М., 1974.

29. Кокта А.Я., Гиргенсоне Н.Я. К вопросу о гепатотоксичности диолов при их парентеральном введении совместно с другими источниками энергии. Бромсульфалеиновая проба. В кн.: Парентеральное питание. Биохимия и клиника. Рига: Зинатне, 1977, с.104-108.

30. Кребс Г., Корнберг Г. Превращение энергии в живых системах. -М,: Изд-во иностр.лит-ры, 1959. 137 с.

31. Кремер Ю.Н., Витолиня С.П., Гиргенсон М.Я. Диоды как потенциальные источники энергии в парентеральном питании. Вестн. АМН СССР, 1980, № 2, с.14-24.

32. Ленинджер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функций клетки. М.: Мир, 1976. - 957 с.

33. Ли B.C., Халилов Э.М., Сабурова В.И., Горбатенкова Е.А., Ази-зова О.А., Арчаков А.И. Липидный состав и структурно-функциональные свойства мембран эритроцитов разного возраста.

34. Вопр.мед.химии, 1982, 28, № 6, с.66-71.

35. Лишко В.К. Натриевый насос биологических мембран. Киев: Hayк.думка, 1977. - 144 с.

36. Л1шко В.К., Колчинська Л.1., Пархоменко М.Т. Тал1й I натр1е-вий "насос" еритроцит!в. Укр.б1ох1м.журн., 1973, 45, № I,с.42-46.

37. Луговой В.И., Гусева Н.Р. Изменение активности Na , К -АТФ-азы и ацетилхолинэстеразы плазматических мембран эритроцитов после замораживания-оттаивания. Укр.биохим.журн., 1981, 53, № 3, с.55-58.

38. Матус В.К., Воробей А.В., Черницкий Е.А. Влияние хлорпрома-зина и температуры на транспорт глюкозы в тенях эритроцитов человека. Биофизика, 1977, 22, Ш 5, с.861-866.

39. Мешкова Н.П., Алексахина Н.В. Определение фосфоглицериновой кислоты. Успехи биол.химии, 1954, № 2, с.285-288.

40. Михнович Е.П., Рождественская М.А. Отмывание и взвешивание размороженных эритроцитов. Пробл.гематол., 1973, 18, № 9, с.31-34.

41. Парк Д.В. Биохимия чужеродных соединений. М.: Медицина, 1973, - 287 с.

42. Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус A.M., Калугин Ю.В. Криопротекторы. Киев: наук.думка, 1978. - 202 с.

43. Спирин М.М., Пучков Е.О., Лапшин Е.Н. Перестройки белково-липидных комплексов в результате замораживания с последующим отогревом: обнаружение по переносу энергии с белка на флуоресцентный зонд. Рукопись депонирована в ВИНИТИ, 1981,5121-81 Деп.

44. Справочник по переливанию крови и кровезаменителей / Под ред. Гаврилова O.K. М.: Медицина, 1982. - 304 с.

45. Твердислов В.А., Яковенко Л.В., Рязаева М.Н. Механизм сопряжения транспорта ионов и гидролиза АТФ в -насосе. Молекулярная биология, 1979, 13, № 2, 377-382 .

46. Тибилова Н.Н., Голубева К.Л., Черненко Г.Т., Смирнов А.В., Лопырева О.И., Азовская С.А., Аграненко В.А. Биохимические механизмы восстановления (омолаживания) эритроцитов. Гематология и трансфузиология, 1983, 28, №> I, с.18-21.

47. Федорова Л.И. Состояние и перспективы развития методов крио-консервирования клеток крови. Гематология и трансфузиология, 1983, 28, № I, с.3-6.

48. Ahluwalia P., Amma М.К.Р., Sareen К. Propane-1,2-diol-in-duced in vivo and vitro changes in rat erythrocytes. Indian. J.Exp.Biol., 1980, 18, IT 4, p.382-384.

49. Albala M.M., Fortier H.L., Glander B.E. Physiologic features of hemolysis associated v/ith altered cation and 2,3 DPG content. Blood, 1978, Д2, II 1, p.135-141.

50. Arnone A. X-ray diffraction study of binding of 2,3-Di-phosphoglycerate to human deoxyhaemoglobin. Nature (London), 1972, 221, N 5351, -p.146-148.

51. Arulanantham K., Genel M. Central nervous system toxicity associated with ingestion of propylene glycol. J.Pediat., 1978, N 3, p.515-516.

52. Baer E., Duce A.J., Buchnea D. Synthesis of propylene glycol phospholipids; analogues of -lecithins and o£-ce-phalins. Can.J.Biochem., 1968, N 1, p.69-74.

53. Barnett R.S. The effect of DMSO and glycerol on (Na+-K+)-ATPase and membrane structure. Cryobiology, 1978,1. N 2, p.227-229.

54. Bartlett G.R.,Barnet H.N. Changes in the phosphate compounds of the human red blood cell during blood bank storage. J.Clin.Invest., 1960, 22.» N 1, p.56-61.

55. Bartocz G. Aging of the erythrocyte. IV. A spin-label studies of membrane lipids, proteins and permeability. Bio-chim. et Biophys. Acta, 1981, 644. N 1, p.69-73.

56. Bayley H.S., Slinger S.J., Summers J.D. The use of propylene glycol as a source of energy for the chick. Poultry Sci., 1967, Д6, N 1, p.19-22.

57. Benesch R., Benesch R.E. The effect of organic phosphates from the human erythrocyte on the allosteric properties of hemoglobin. Biochem. and Biophys.Res.Commun., 1967, 26, И 2, p.162-167.

58. Bessis M. Living blood cells and their ultrastructure. -Berlin Heidelberg - New York: Springer-Verlag, 1973,- 770 p.

59. Beutler E. Red cell metabolism. A manual of biochemical methods. New York: Grime and Stratton, 1975- - 160 p.

60. Beutler E., Villacorte D. Spectrin extractability in blood storage. Transfusion, 1981, 21., N 1, p.96-99.

61. Birchmeier W., Singer S.J. On the mechanism of ATP-induced shape changes in human erythrocyte membranes. II. Role of ATP. J.Cell.Biol., 1977, Ц, N 3, p.647-659.

62. Bjerrum P.J. Hemoglobin-depleted human erythrocyte ghosts: characterization of morphology and transport functions. -J.Membr.Biol., 1979, 48, N 1, p.43-67.

63. Boivin P., Garbarz M. Interactions des enzymes cytosoliques avec la membrane du globule rouge. C.R.Soc.Biol., 1980, 174, N 4, p.605-614.

64. Boutron P., Delage D., Roustit B. et al. Ternary systems with 1,2-propanedioI a new gain in the Stability of the amorphous state in the system water-1,2-propanediol-1-pro-panol. - Cryobiology, 1982, 1Д, N 5, p.550-564.

65. Boutron P;, Kaufmann A. Stability of the amorphous state In the system water-1,2-propanediol. Cryobiology, 1979, 16, N 6, p.557-568. :

66. Brewer J.B. Red cell metabolism and function. In: The Red Blood'. Cell /D.M. Surgenor, ed. New York - London: Acad.Press; . 1974," v.1, p.474-r504.

67. Brewer G.J., Kruckeberg W.C., T/estover C.J., Oberman H.A. Erythrocyte metabolism. «In: Clinical Uses of Frozen-Thawed Red Blood Cells /J. Griep, ed. New York, Liss, 1976,p.5-19.

68. Chailley B., Giraud F., Claret M. Alterations in human erythrocyte shape and the state of spectrin and phospholipid phosphorylation induced by cholesterol depletion. -Biochim. et Biophys.Acta, 1981, 643, К 3, p.636-641.

69. Chalifour R.J., Taki Т., Kanfer J.N. Phosphatidylglycerol formation via transphosphatidylation by rat brain extracts. Can.J.Biochem., 1980, 58, N 10, p.1189-1196.

70. Chanutin A., Curnish R.R. Effect of organic phosphates on the oxygen equilibrium of human erythrocytes. Arch.Biochem. and Biophys., 1967, 121, И 1, p.96-102.

71. Ciavatti M., Michel G., Chataign В., Jouvenceaux A. Preservation of human erythrocyte membrane proteins during cold storage with addition of progesterone. Biochem.Med., 1974, N 3, p.293-300.

72. Deuticlce B. Transformation and restoration of biconcave shape of human erythrocytes induced by amphiphilic agents and changes of ionic environment. Biochim. et Biophys. Acta, 1968, 163, N 4, p.494-500.

73. Eaton J.W., Brewer G.J. Pentose phosphate metabolism. -In: The Red Blood Cell /D.M. Surgenor, ed. New York London: Acad. Press, 1974, v.1, p.436-465.

74. Eilam J., Stein W.D. Kinetics studies of transport across red blood cell membranes. In: Methods in Membrane Biology /E.D. Korn, ed. New York - London: Plenum Press, 1974, v.2, p.283-354.

75. Elford B.C., Solomon A.K. Factors influencing Na+ transport in dog red cells. Biochim. et Biophys. Acta, 1974, 373, N 2, p.253-264.

76. Emery R.S., Brain R.E., Black A.L. Metabolism of DL-1,2,-propanediol-2-С1^ ina a lactatihg cow. J.Nutr., 1967, 21, N 3, p.348-356.

77. Peig S.A., Segel G.B., Shohet S.B., Nathan D.G. Energymetabolism in human erythrocytes. II. Effect of glucose depletion. J.Clin.Invest., 1972, £1, N 6, p.1547-1554.

78. Peo C.J., Leblond P.P. The discocyte-echinocyte transformation: comparison of normal and ATP-enriched human erythrocytes. Blood, 1974, М» N 5, p.639-647.

79. Peo C., Mohahdas N. Clarification of role of ATP in red cell morphology and function. Nature, 1977, N 5590, p.166-168.

80. Gibson J.G., McCue J.P. Reversal of the storage lesion of CPD bank blood: a problem in clinical medicine. Transfusion, 1978, 18", N 5, p.524-529.

81. Glaser R., Leitmannova A. Transformation of human red cell shape regard to fluid-mosaic structure of the membrane. -Studia Biophysica, Berlin, 1975, £8, h.3, s.219-229.

82. Greenquist A.C., Shohet S.B., Bernstein S.E. Marked reduc-5 ••• . tion of spectrin in hereditary' spherocytosis in the common house mouse. Blood, 1978, N 6, p.1149-1155.

83. Grisham O.M., Barnett R.E. The effect of long-chain alcohols on membrane lipids and the (Na+-K+)-ATPase. Biochim. et Biophys.Acta, 1973, 311. N 3, p.417-422.

84. Gupta R.K., Benovic J.L., Rose Z.B. Location of the allo-steric site for 2,3-bisphosphoglycerate on human oxy- and deoxyhemoglobin as observed by magnetic resonance spectroscopy. J.Biol.Chem., 1979, 254, N 17, p.8250-8255.

85. Haest C.W.M., Plasa G., Deuticke B. Selective removal of lipids from the outer membrane layer of human erythrocyte without hemolysis. Consequences for bilayer stability and cell shape. Biochim. et Biophys.Acta, 1981, 649. N 3, p.701-708.

86. Hallafc Gh.J., Wilkinson J.H. Action of metabolic inhibitors on the release of intracellular enzymes from human erythrocytes. Clin.Chim.Acta, 1976, 66, N 2, p.251-261.

87. Hamasaki N., Hirota-Chigita C. ACD-phosphoenolpyruvate-medium as a rejuvenant for blood storage. Transfusion, 1983, £3, N 1, p.1-7.

88. Hoenig V., Werner P. Is propylene glycol an enert substance? Toxicol.Lett., 1980, N 6, p.389-392.

89. Jacobash G., Minakami S., Rapoport S.M. Glycolysis of erythrocyte. In: Cellular and Molecular Biology of Erythrocytes /H.Yoshikawa, S.M. Rapoport, eds. Baltimore e.a., 1974, p.55-92.

90. Jaw A.W.L. , Roulands S. (The stages of osmotic hemolysis. -J.Physiol., 1975, 2§2, N 1, p.1-16.

91. Juel R. 2,3-diphosphoglycerate: its role in health and disease. CRC Crit.Rev.Clin.Lab.Sci., 1979, 10, N 2, p.113-146. —

92. Kadlubowski M. The effect of in vivo aging of the human erythrocyte on the proteins of the plasma membrane. A comparison with metabolic depletion and blood -bank storage.

93. Int.J.Biochem., 1978, N 2, p.79-88. .

94. Kiener P.A., Massaras C.V., Westhead E.W. Phosphorylation and inhibition of human erythrocyte pyruvate kinase by erythrocyte membranes. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1979,-21, N 1, p.50-57.

95. Lacko L., Wittke В., Kromphardt H. Zur kinetik der glucose-aufnahme in erythrocyten. Effekt der trans-konzentration. -Eur.J.Biochem., 1972, 2£, N 3, p.447-454.

96. Laczko J., Feo C.J., Phillips V/. Discocyte-echinocyte re, versability in blood stored in CPD over a period of 56 days.

97. Transfusion, 1979, 12» И 4, p.379-388.

98. Le Due Tu, Maretzki D., Rapoport S. et al. The effect of , temperature ouabain on the breakdown of ATP and 2,3-bisphosphoglycerate in glucose-depleted human red cells. Acta Biol, et Med.Germ., 1979, 28, N "10, s.1413-1417.

99. Lindberg 0. Цит. no: Huff E., Rudney H. The enzymatic oxy-dation of 1,2-propanediol phosphate to acetol phosphate. -J.Biol.Chem., 1959, £2i> N 4, p.1060-1064.

100. Lovelock J.E. The protective action of neutral solutes against hemolysis by freezing and thawing. Biochem.J., 1954, £6, ,N 2, p.265-2j0.

101. Lowry O.H., Rosebrough N. J., Parr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent. J.Biol. Chem., 1951, 193, N 1, p.265-275. "

102. Lucy J.A. Cell fusion. Trends.Biochem.Sci., 1977, 2, N 1, p.17-20.

103. Luque J., Pinilla M., Ventura M.E., Santos-Ruiz A. Factors effecting the concentration of 2,3-diphosphoglycerate in erythrocytes. FEBS Letters, 1972, 2Д., N 1, p.31-33.

104. Lutz H. Vesicles isolated from ATP-depleted erythrocytes and out of thrombocyte-rich plasma. J.Supramol.Struct.,1978, 8, N 3, p.375-389.

105. Maeda N., Коп K., Selcija M., Shiga T. Restoration of the poor oxygen transport function of ACD-stored blood by py-ridoxal 5'-phosphate. Experientia, 1979, 21, N 9, p.1245-1246.

106. Mahoney J.R., Etkin N.L., McSwigan J.D., Eaton J.W. Assessment of red cell sodium transport in essential hypertension. Blood, 1982, 52., N 2, p.439-442.

107. Marchesi V.T. Spectrin: present status of a putative cyto-skeletal protein of the red cell membrane. J.Membr.Biol.,1979, £1, N 2, p.101-133.

108. Marchesi V.T., Furthmayr H., Tomita M. The red cell membrane. In:'Ann.Rev.Biochem., Palo Alto., Calif., 1976, v.45, p.667-698.

109. Marshall W.E., Rassaian N., Greenwald L.S., Qmachi A. Ult-rafiltrable adenosine triphosphate and 2,3-diphosphoglycerate concentrations in cold-stored human erythrocytes. -Transfusion, 1977, Ц, N 5, p.448-453.

110. Matsumoto N., Yav/ata Y., Jacob H.S. Association of decreased membrane protein phosphorylation v/ith red. bloodcell spherocytosis. Blood, 1977, 42., N 2, p.233-239.

111. Meryman H.T., Hornblovver M. Quality control for deglycero- • lized red blood cells. Transfusion, 1981, 21.,N 3, p.235-240.

112. Michielin G.C., Moret V. Interrelationships between protein kinases and spectrin phosphorylation in human erythrocytes.-Biochim.et Biophys, Acta. 1981, 640, N 1, p.240-251.

113. Mircevova L., Simonova A., Rehackova H. Aktivita erythro-cytarni Mg-adenosintrifosfatazy behem skladovani ACD krve.-Cas.bek.Ces., 1980, 119, N38, s.1013-1016.

114. Mohandas N., Greenquist A.C., Shohet S.B. Bilayer balance and regulation of red cell shape changes. J.Supramol. Struc., 1978, 2.» N3, p.453-458.

115. Mohandas N., Shohet S.B. Control of red cell deformability and shape. Curr.Top.Hematol., 1978, 1, p.71-125.

116. Momsen G., Vestergaard-Bogind B. Human erythrocyte 2,3-di-phosphoglycerate metabolism. Influence of 1,3-diphosphogly-cerate and P^. In vitro studies at low pH with computer simulations. Arch.Biochem. and Biophys., 1978, 190. N 1, p.67-84.

117. Moore G.L., Ledford M.E., Bolin R.B. The effect of an eight hour hold prior to component preparation on red cells drawnin CPDA-2. Transfusion, 1980, 20, N 5, p.644.

118. Moore "G.L., L6dford M.E., Brummell 1.1 vR. Improved red blood cell storage'using optional additive systems (OAS) containing adenine, glucose, and.ascorbate-2-phosphate. -Transfusion, 1981, 21, N 6, p.723-731.

119. Moore G.L., Ledford M.E., Brummell M.R., Brooks D.F. The potential use of dihydroxyacetone for improved 2,3-DPG maintenance in red blood cell storage: solution stability and use in packed cell storage. Transfusion, 1980, 20, N 1, p.24-31.

120. Moroff G., Ivleryman H.T. Influence of glycerol on ATP and 2,3-DPG levels of human erythrocytes. Vox Sang., 1979, 26, N 4, p.244-251.

121. Murphy J.R. Erythrocyte metabolism. II. Glucose metabolism and pathways. J.Lab.Clin.Med., 1960, N 2, p.286-302.

122. Myhre B.A., Nakasako Y.Y., Schott R. Studies on 4°C stored frozen-reconstituted red blood cells. II. Chemical and cy-tological changes during storage. Transfusion, 1978, 18, N 1, p.29-37.

123. Nakao M. ATP-requiring phenomena in red cell membranes. -In: Cell.Mol.Biol.Erythrocytes /Н. Yoshikawa, S.M. Rapo-port, eds. Baltimore e.a., 1974, p.35-54.

124. Nakao M., Nakao T. Biochemistry of the erythrocyte membrane with emphasis on'energy metabolism. Asian Med.J., 1976,1. N11, p.8-28.

125. Nakao Ы., Nakajama Т., Nakagura K., Ohta H. Some problemsin enzyme determination in red cells mainly due to the membrane structure. Hemoglobin, 1980, Д, N 5-6, p.707-716.

126. Nakao M., Nakao Т.", Nakajama T.,et al. Further investigation on ATP metabolism and red cell membrane.integrity.

127. Acta Biol:Med.Germ., 1981, 40, h.7-8, s.1003-1008.

128. Nakao'M., Nakao Т., Yamozoe S. Adenosine triphosphate.and maintenance of shape of the human red cells, Nature, 1960, 187, N 4741, p.945-946.

129. Naylor G.J. New approaches to the treatment of manic depressive illness. Neuropharmacology, 1980, 12.» N 12, p.1233-1234.

130. Nei T. Freezing injury to erythrocytes. II. Morphological alterations of cell membranes. Gryobiology, 1976, 1^,1. N 3* p.287-295.

131. Owen J.S., Mclntyre N. Erythrocyte lipid composition and sodium transport in human liver disease. Biochem.et Biophys.Acta, 1978, 510. N 1, p.168-176.

132. Palek J., Liu S.C., Snyder L.M. Metabolic dependence of protein arrangement in human erythrocytes membranes. I. Analysis of spectrin rich complexes in ATP-depleted red cells.-Blood, 1978, N 3, p.385-395.

133. Prankerd T.A.J. Chemical and physical changes in the aging red cell. Folia Haematol., 1961-1962, B78, N 3, s.382-384.

134. Pribor D.B. Osmotic hemolysis contrasted with freeze-thaw hemolysis. Cryobiology, 1971, 8, N 1, p.14-24.

135. Rajagopal G., Ramakrishnan S. A new method for estimation of ethylene glycol in biological material. Analit.Biochem.,1975, J&, N 1-2, p.132-136.

136. Rose Z.B. The purification and properties of diphosphogly-cerate mutase from human erythrocytes. J.Biol.Chem., 1968, 243, N 18, p.4810-4820.

137. Rose Z.B., Liebowitz J. 2,3-diphosphoglycerate phosphatase from i human erythrocytes. General properties and activation by anions. J.Biol.Chem., 1970, 245, N 12, p.3232-3241.

138. Ruddick J.A. Toxicology, metabolism, and biochemistry of1,2-propanedi61. Toxicol.Appl.Pharmacol., 1972, 21, N 1,p.102-111.

139. Rudney H. The synthesis of dl-propanediol-1-phosphate and ^C-labeled propanediol and their isolation from liver tissue. J.Biol.Chem., 1954, 210, N 2, p.353-360.

140. Budney H. Propanediol phosphate as a possible intermediate in the metabolism of acetone. J.Biol.Chem., 1954, 210.1. N 2, p.361-371.

141. Sacks J. A fractionation procedure for the acid-soluble phosphorus compounds of liver. J.Biol.Chem., 1949, 18, N 2, p.655-666.

142. Sakami W., Lafaye J.M. The metabolism of acetone in the intact rat. J.Biol.Chem., 1951, 121, N 1, p.199-203.

143. Schrier S.L. Human erythrocytes membrane enzymes: current status and clinical correlates. Blood, 1977, £0, N 2, p.227-237.

144. Schrier S.L., Hardy N.B.,' Bensch K. et al. Red blood cell membrane storage lesion. Transfusion, 1979, 12.» Я 2,p.158-165.

145. Schrier S.L., Sohmer P.R., Moore G.L. et al. Red blood cell membrane abnormalities during storage. Correlation with in vivo survival. Transfusion, 1982, 22, N 4, p.261-265.

146. Seaman C., Wyss Si, Piomelli S. The decline in energetic metabolism with aging of the erythrocyte and its relationship to cell death. Amer.J.Hematol., 1980, 8, N 1, p.31-42.

147. Sellinger O.Z., Miller O.N. The metabolism of acetol phosphate. J*Biol.Chem., 1959,'221» N 6* p.1641-1646.'

148. Sheetz M.P." Integral membrane protein interaction with triton cytoskeletons of erythrocytes. Biochem. et Biophys.

149. Acta, 1979, 557. N 1, p.122-134.

150. Sheetz M.P., Casaly J. Phosphate metabolites can control membrane skeleton organization. Cytobiologie, 1980, 22, N 1, p.339.

151. Sheetz M.P., Casaly J. Phosphate metabolite regulation of spectrin interactions. Scand.J.Clin.Invest., 1981, 41. Suppl., N 156, p.117-122.

152. Sheetz M.P., Singer S.J. Equilibrium and kinetic effect of drugs on the shape of human erythrocytes. J.Cell.Biol.,1976, 20, N 1, p.247-251.

153. Sherwood W.C., Glackin K., Rykaczewski C. Red cell 2,3-DPG. A profound reduction associated with early "room temperature" storage. Transfusion, 1980, 20, N 5, p.644.

154. Sillery R.A. Improvements made to blood storage by the use of citrate phosphate dextrose. Canad.J.Med.Tech., 1975, 21, N 6, p.179-185.

155. Skaredoff M.N., Madden M.M. The "molecular lung". A review of the stereochemical properties of hemoglobin. Anesthe-siol.Rev., 1979, 6, N 9, p.29-31.

156. Stibenz D., Brox D., Geyer G. Veranderungen von Proteinen der Erythrozytenmembran Wahrend der Blutkonservierung. -Folia Haematol. (DDR), 1980, 101, N 3, s.459-471.

157. Suzuki К., Terao Т., Osawa T. Studies of adenosine-3',5 monophosphate phosphodiesterase of human erythrocyte membranes. Biochim. et Biophys.Acta, 1980, 602, N 1, p.78-86.

158. Takehara J., Rowe A.W. Increase in ATPase activity in red cell membranes as a function of freezing regimen. Cryo-biology, 1971, 8, IT 6, p.559-565.

159. Tsuboi K.K. Regulation of erythrocyte glycolysis membrane mediated activation induced in low-electrolyte medium. -Biochem. et Biophys.Acta, 1974, 352, N 2, p.307-320.

160. Upreti G.C., Rainier S., Jain M.K. Intrinsic differences in the perturbing ability of alkanols in bilayer: action of phospholipase Ag on the alkanol-modified phospholipid bilayer. J.Membrane Biol., 1980, N2, p.97-112.

161. Valeri C.R. Blood banking and the use of frozen blood products. Cleveland, Ohioi CRC Press, 1976. - 417p.

162. Valeri C.R., Valeri D.A., Dennis R.C. et al. Biochemical modification and freeze-preservation of red blood cells. A new method. Crit.Care Med., 1979, 1, N 9, p.439-447.

163. Vanderkooi J.M., Callis J.B. Pyrene. A probe of lateral diffusion in the hydrophobic region of membranes. Biochemistry, 1974, 11, N 19, p.4000-4006.

164. Velle W», Engel L.L. Enzymes from bovine placenta and seminal vesicles that oxidize 1,2-propanediol and other polyal-cohols their possible relation to fructose fermentation. -Endocrinology, 1964, Ц» w 3, p.423-439.

165. Wallas G.H. Sodium and potassium changes in blood bank stored human erythrocytes. Transfusion, 1979, 12.» N 2, p.210-215.

166. Walter H., Krob E.J., Tamblyn C.H., Seaman G.V.F. Surface alterations of erythrocytes with cell age: rat red cell is not a model for human red cell. Biochem. and Biophys.Res. Communs., 1980, 21, N 1, p.107-113.

167. Weed R.I., La Celle P.L., Merril E.W. Metabolic dependence of red cell"defoiraability. J.Glin.Invest., 1969, 48, N 5, p.795-809.

168. Westerman M.P., Pierce L.E., Jensen W.N. Erythrocyte lipids: a comparison-of normal young and normal old populations. -J.Lab.Clin.Med., 1963, 62, N3, p.394-400.

169. White M., Rumsby M.G., Tovey L.A.D. Microvesicles are released from human erythrocytes aging at 4°C in heparin and citrate/phosphate/dextrose anticoagulants; Biochem.Soc. Trans.,'1979, 7, N5, p.931-933.

170. Whittam R., Ager M.E. Vectorial aspects of adenosine-triphosphatase activity in erythrocyte membranes. Biochem.

171. J., 1964, 21» N 2» P.337-348.

172. Whittam R., Ager M.E, The connexion between active cation transport and metabolism in erythrocytes. Biochem.J., 1965, 21» N 1» p.214-227.

173. Wiley J.S., Cooper R.A., Adachi K., Asakura T. Hereditary stomatocytosis; association of low 2,3-diphosphoglycerate with increased*cation pumping by the red cell. Brit.J. Haematol., 1979, Ц, N 1, p.133-141.

174. Willis J.S. The possible roles of cellular К for survival of cells at low temperature. Cryobiology, 1972, 2.» H 5, p.351-366.

175. Wolfe L.C., Lux S.E. Mechanism of storage lesion? Demonstration of an"effect of ATP and 2,3-DPG on red cell membrane skeletal protein. Transfusion, 1981, 21, N 5, p.601.

176. Wood L., Beutler E. Temperature dependence of sodium potassium activated erythrocyte adenosine triphosphatase. -. J.Lab.Clin.Med., 1967, 10, N 3, p.287-294.

177. Wood L.A., Beutler E. The effect of periodic mixing on the preservation of 2,3-diphosphoglycerate (2,3-DPG) levels in stored blood. Blood, 1973, £2, N 1, p.17-25.

178. Wood P.G., Rossleben U. Unmasking of a potassium leak in resealed human red blood cell ghosts. Biochim. et Bio-phys.Acta, 1979, 553. N 2, p.320-325.

179. Woolgar A.E. Hemolysis of human red blood cells by freezing and thawing in solutions containing sucrose: relationship with posthypertonic hemolysis and solute movements. -Cryobiology, 1974, Ц, Ы 1, p.44-51.