Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Криопротекторные свойства полиолов и их производных при замораживании тромбоцитов

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Автореферат диссертации по теме "Криопротекторные свойства полиолов и их производных при замораживании тромбоцитов"

АКАДЕМИЯ НАУК УССР ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРИОБИОЛОГИИ И КРИОЫЕДИЦИНЫ

на правах рукописи

НИКОЛЕНКО АЛЕКСАНДРА ВИКТОРОВНА

КРИОПРОТЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА ПОЛИОЛОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ ПРИ ЗАМОРАЖИВАНИИ ТРОМБОЦИТОВ

03. 00. 22 - криобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Харьков -1991

Работа выполнена в Институте проблем криобиологии и криомедицины АН УССР

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор В. И. Луговой

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук.

профессор А. А. Цуцаева доктор медицнских наук, профессор Е. Я Панков

Ведущая организация - Всесоюзный гематологический научный

специализированно ... .те проблем крио-

биологии и криомедицины АН УССР (31001 Б, г.Харьков, ул. Переяславская, 23)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института проблем криобиологии и криомедицины АН УССР.

Автореферат разослан года.

Центр МЗ СССР

Защита состоится

года на заседании

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук

А.Н.Гольцев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Разработка эффективных методов хранения тромбоцитов при низких и сверхнизких температурах (-196''С) остается до настоящего времени актуальной задачей в области трансфуэиологии и практической криобиологии.

Значительный интерес к проблеме консервирования тромбоцитов объясняется участием кровяных пластинок в механизмах гемостаза, а также необходимостью их клинического применения в лечении тромбоци-топенических геморрагия различного происхождения. Однако, принимая во внимание нестабильность кровяных пластинок при переживании их вне организма, а также учитывая возрастающую потребность клиники в тромбоцитах/Witzig Т., 1986; Sibinga, 1987/,представляется очевидным, что систематическая заместительная трансфузионная терапия тромбоцитами возможна лишь при наличии эффективного и доступного широкой лечебной практике метода их долгосрочного хранения. Вместе с тем, результаты исследований, выполненных в этом направлении отечественными и зарубежными учеными /Аграненко В. А., Компаниец А. М., 1980; Rowe А. , 1978; Armitaghe W. , 1986; Arnaud F. , 1990/, свидетельствуют о том, что решение данной проблемы, остается сложной задачей, что во многом обусловлено специфическими свойствами кровяных пластинок, их чрезвычайной чувствительностью к различного рода воздействиям. При разработке способа низкотемпературного консервирования тромбоцитов одним из важных этапов, по мнению большинства исследователей, является выбор малотоксичного, но достаточно эффективного криопротектора. Показано, что используемые в настоящее время в качестве криопротекторов для тромбоцитов диметилсульфоксид (ДМСО), диметилацетамид (ДМАШ, глицерин имеют ряд существенных недостатков. Так, ДМСО, помимо специфического угнетающего действия на гемостатическую функцию /Jacob S., 1985,1986 /, оказывает неблагоприятное воздействие на организм реципиента, а обязательная процедура удаления криопротектора от кровяных пластинок приводит к дополнительной потере и травматизации клеток на этапе деконсервации /Murphy S. , 1974; Spector J. , 1979; Kotelba-Wltkowska В. , 1985/. В ряде работ /Компаниец А. М. .1980; Vezon G., 1982/ отмечается неблагоприятное влияние ДМАЦ на структурные компоненты мембран, проявляющееся усилением перикисного окисления липидов еще на этапе зкви-

либрации, что существенно сказывается на эффективности последующего замораживании тромбоцитов. Основным недостатком глицерина является частое образование стойких, спонтанно образующихся агрегатов при отогреве /Dayian S. , Pert J. , 1979; Messon S. , 1986/.

Таким образом, поиск веществ, обладающих низкой токсичностью и достаточной криозащитной эффективностью в отношении тромбоцитов является актуальным. В решении данной проблемы может быть использован комплексный подход, включающий направленный синтез новых веществ посредством химической модификации традиционных криопротекто-ров, изучение их физико-химических и крколротекторных свойств, а также характера и особенностей влияния на биологический обьект /Шраго М.И., 1981; Луговой ЕИ., 1990/. В этом отношении наибольший интерес представляют вещества ряда полиолов, представителями которых являются классический криопротектор глицерин и 1,2-пропандиол, зарекомендовавший себя эффективным криопротектором при замораживании эритроцитов /Воротилин А. М., 1981/.

Целью настоящей работы явилось исследование криопротекторных свойств полиолов и их производных в отношении тромбоцитов и экспериментальное обоснование условий их криоконсервирования при использовании наиболее эффективных из изученных криозащйтных веществ.

Задачи исследования.

. 1. Изучить влияние полиолов: глицерина, 1,2-пропандиола (1,2-ПД), 1-монометилового эфира глицерина (1-ММЭГ), 1,2-'Диметило-вого эфира глицерина (1,2-ДМЭГ), . 1,3-диметилового эфипа глицерина (1,3-ДШР), 1-моноэтилового эфира глицерина (1-ЮЭГ), 1,3- и 1, 2-диэтилового эфира глицерина (1,3-ДЭЭГ и 1,2-ДЭЭГ), оксиэтилиро-ванного глицерина (ОЗГ п-5) - на морфофункциональные свойства тромбоцитов йа этапе эквилибрации в зависимости от концентрации веществ и длительности экспозиции.

2. Оценить криозащитные свойства полиолов и их производных при замораживании тромбоцитов по различным программам.

3. Определить условия криоконсервирования (вид криопротектора, программа замораживания, роль переохлаждения), обеспечивающие высокую сохранность тромбоцитов.

Научная новизна. Впервые исследованы криопротекторные свойства полиолов: 1,2-ПД, алкоксизамещенных эфиров глицерина и ОЭГ (п=5) при замораживании тромбоцитов. Исследование влияния этих веществ на

специфические функции кровяных пластинок позволило установить взаимосвязь структуры веществ, степени их гидрофобности с циготоксич-ностью и криопротекторной активностью полиолов. Установлен различный уровень изменения морфофункциональных свойств тромбоцитов на этапах криоконсервирования.

Получены новые данные о сохранности функциональной полноценности тромбоцитов, криоконсервированных под защитой полиолов. Установлен диапазон скоростей замораживания и концентрации криопротек-торов, создающее наиболее оптимальные условия для сохранности тромбоцитов при их низкотемпературном консервировании с подколами.

Впервые на тромбоцитах было исследовано влияние^ переохлаждения, снятие которого позволило повысить сохранность тромбоцитов и получить более стабильные результаты.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Цитотоксичность изученных соединений ряда полиолов в отношении тромбоцитов возрастает с увеличением длины и числа алькильных радикалов-, что коррелирует со степенью гидрофобности их молекул.

2. В ряду полиолов из числа исследованых веществ 1,2-пропандиол 1-монометиловый эфир глицерина и оксиэтилированный глицерин (п-5) характеризуется наиболее выраженными криозапщтными свойствам:! в условиях низкотемпературного консервирования тромбоцитов и, в отличие от глицерина, их криозащитный эффект достигается при более низких концентрациях и не сопровождается агрегацией кровяных пластинок.

3. Переохлаждение является одним из факторов, вызывающих снижение морфофункциональных свойств тромбоцитов при медленных режимах замораживания, а его устранение путем инициирования льдообразования в криозащитном растворе способствует повышедию сохранности кровяных

пластинок.

Практическая значимость работы.. На основании проведенных исследований определены эффективные криопротекторы при замораживании тромбоцитов: 1,2-ПД, 1-ММЭГ И ОЭГ (п-5) /A.C. N 1298203 /, а также условия криоконсервирования, обеспечивающие высокий уровень сохранности кровяных пластинок, что является основой для разработки метода низкотемпературного консервирования тромбоцитов для клинической практики.

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на II Всесоюзной конференции "Механизмы криоповреждения и криозащиты

биологических объектов" (Харьков,1984), ежегодной конференции молодых ученых ИПК и К АН УССР (1987, 1988), заседании Харьковского отделения Украинского научного общества гематологов (Харьков,1988).

Публикация материалов исследования. Основные положения диссертации опубликованы в 8 печатных работах.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и иллюстрирована 25 таблицами и 5 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований и их обсуждения, выводов и указателя литературы, который включает 178 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Исследования проводились на тромбоцитах человека, полученных, из донорской крови методом дифференциального центрифугирования (центрифуга "Jhanetzki", ГДР) в сдвоенные пластикатные мешки типа "Гемакон" на гемоконсерванте "Глюгицир".

Для получения обогащенной тромбоцитами плазмы контейнеры с консервированной кровью центрифугировали при 680 g в течение 12 мин, после чего тромбоплазму переводили в следующий контейнер. Для получения тромбоконцентрата обогащенную тромбоцитами плазму подкисляли глюгициром в соотношении 1/9 (обьем/обьем) и центрифугировали при 2400 g в течение 20 мин, после чего большую часть плазмы над осевшими клетками удаляли. Тромбоциты взвешивали в острившейся плазме не ранее 40-60 мин после окончания центрифугирования для облегчения ресуспендирования клеток. Исследования цитотоксичности и кри-опротекторных свойств веществ ряда полиолов проводились на клетках, полученных путем объединения тромбоконцентратов из 2-3 доз крови, идентичной по системе ABO и резус принадлежности. В ряду полиолов были исследованы: глицерин, 1,2-пропандиол, 1-монометиловый эфир глицерина, 1,3 и 1,2-диметиловые эфиры глицерина, 1,3 и 1,2-диэтиловые эфиры глицерина, оксиэтилированный глицерин со степенью полимеризации п-5.

Глицерин, 1,2-ПД, 1,2-ДМЭГ - промышленные продукты, очищенные вакуумной перегонкой. 1-ММЭГ, 1,3-ДМЭГ, 1,2-ДЭЭГ и 1,3-ДЭЭГ получены путем взаимодействия соответствующих хлорпроизводных глицерина с

алкоголятами натрия /Кимсанов Б. X, 1981/. ОЭГ (п-5) получали путем оксиэтилирования глицерина.

Для идентификации исследуемых соединений определяли показатели преломления, плотности, мольную рефракцию (MR). Были определены также мольный парциальный обьем С V смЗ/моль), вязкость, коэффициент распределения веществ в системе Н-октанол-вода ( Р ) /Leo А., 1971/. Для подтверждения структуры синтезированных соединений регистрировали их ИК-спектры на спектрофотометре "Speccord - 75 JR". Чистоту веществ контролировали методом газо-жидкостной хроматографии. Получение веществ и определение их физико-химических свойств осуществлялось группой химиков отдела криопротекторов ИПК и К АН УССР (руководитель - старший научный сотрудник Л. А. Ханина). Растворы готовили на плазме ex tempore. К образцам тромбоконцентратов медленно в соотношении 1 : 1 добавляли растворы, содержащие 5 X -, 10 X 15 X

- ные концентрации изучаемых веществ. Время экспозиции варьировали от 15 до 60 мин. В серии экспериментов тромбоциты выдерживали в растворах глицерина, 1,2-ПД и 1-ММЭГ в течение 24 часов при комнатной температуре ( +22°С ) и при +4°С без покачивания. Криоконсервирование тромбоцитов осуществляли с ограждающими растворами, содержащими 5 %, 10 % и 15 %-ные концентрации исследуемых веществ. Непосредственно перед замораживанием образцы тромбоконцентрата медленно со скоростью 0,3 мл/мин, постоянно перемешивая, соединяли с равным объемом ограждающего раствора ( 1 : 1 ). После этого смесь тромбоцитов переводили в полиэтиленовые ампулы объемом 1,5 мл. Длительность экспозиции составляла 25-30 мин.

Замораживание проводили в аппарате программного замораживания

- охлаждающее устройство типа УСП-6 (изготовитель - опытное производство ИПК и К АН УССР ). Регистрацию программы замораживания вели по термодатчику - медькапелевой термопаре, установленному в одном из контейнеров партии с записью программы на самописце Эндим типа 622.01. Точность регистрации температуры _+, 0,3°С.

Исследовали линейные режимы замораживания: Io С/мин, 10"С/мин, 20вс/мин, 30°С/мин до -70°С с последующим погружением в жидкий азот. При оптимизации процесса криоконсервирования тромбоцитов были использованы экспоненциальные режимы замораживания /Новиков А. Н., 1986; Гордиенко Е. А., 1989/. При исследовании влияния переохлаждения на тромбоциты использовали стандартные и модифицированные контейнеры

с теплоотводящим стержнем /Новиков А. H , Олейник С. Т., 1985/. После замораживания контейнеры с тромбоконцентратами помешали в бункер с жидким азотом, где хранили от 24 часов до 6 месяцев. Оттаивание замороженных образцов производили на водяной бане при температуре 37аС в течение 50 сек при постоянном покачивании контейнеров.

Функциональную полноценность тромбоцитов оценивали по следующим параметрам: подсчет общего количества клеток в камере Горяева, морфологический контроль в фазово-контрастном микроскопе /Zucker M., Borelli J., 1954/, определение ретрактильной активности /Скопина С.Б., 1975/, АДФ-индуцированной агрегации (фотометрический метод), реакции на гипотонический шок (РШ/Handin Р., et al., 1970/. В исследовании по криоконсервированию тромбоцитов был использован тест, основанный на измерении оптической плотности суспензии тромбоцитов с ограждающими растворами до замораживания и после оттаивания /Odink J., 1977/.

В постановке и анализе экспериментов по оптимизации процесса . низкотемпературного консервирования тромбоцитов был использован метод математического планирования эксперимента - полный факторный эксперимент (ПЭФ-2) /Адлер ICI П., 1976/. Статистическую обработку результатов исследований проводили методом Фишера-Стьюдента /Закс л., 1976/, используя программный комплекс STAT, разработанный на вычислительном центре ДОК и К АН УССР (ЭВМ СМ-1, СМ-4).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ

Было изучено влияние 1,2-Щ, алкиловых эфиров глицерина: 1-ММЭГ, 1,3- ДМЭГ, 1,2-ДМЭГ, 1-МЭЭГ, 1,3-ДЭЭГ, 1,2-ДЭЭГ И ОКСИЭТИ-еированного глицерина со степенью полимеризации - 5 - ОЭГ (п «5) на морфофункциональные свойства тромбоцитов с целью выбора эффективной концентрации веществ в ограждающем растворе, а также условий и длительности экспозиции. Результаты исследований представлены в табл. 1. Установлено, что из девяти исследуемых соединений наименее выраженное влияние на специфические функции тромбоцитов в диапазоне концентраций 2,5 - 7, 5 X оказывали 1,2-ПД, глицерин, 1-ММЭГ и ОЭГ (п=5). Такие показатели, как общее количество клеток, ретрактильная активность, находились на достаточно высоком уровне (80-98 %) относительно исходного уровня, независимо от концентраций' этих веществ и времени экспозиции (15-60 мин). В тоже время сохранность дискоидной формы,

б

Таблица 1

Влияние веществ ряда полиолов на морфофункциональные свойства тромбоцитов. (. 30 мин экспозиция, +225С).

I Нонцен-1 Исследуемые показатели, %

i трещда

Вещества! вещзст -1 Количе- Ретрак- ¡Агрегация,! 1 Содержание

г 1 ва, z 1 ство ция 1 индуктор- 1 Р Г Ш 1дискоидних

1 1 клеток 1АДФсго//м)| 1 форм

Контроль! 0 1 100 63 + 3 1 71 + 4 ! 81 + 5 ¡79 + 7

1 1 п-13 п-11 1 п-11 1 п-11 1 п-9

1 2,5 198 + 2 80 + 2 I 65 + 3 1 75 + 3 ¡73 + 3

1.2-ПД 1 5,0 ¡97 + 3 78 + 2 1 62 + 3 1 72 + 4 ! 69 + 5 „

1 7,5 ¡95+3 75 1 з 1 59 + 4* 1 69 + 4 ¡67 + 4

1 2,5 ¡94 + 2 78 + 2 ! 61 + 5 1 73 + 2 ¡70 + 4

Глицерин! 5,0 ¡92+2 75 + 4 ! 65 + 4 1 61 + 4* 1 55+7*

1 7,5 1 86 + 3* 68 + 3* I 57 + 4* 1 47 + 6* ! 49+8*

! 215 ¡96 + 2 76 + 3 1 60 + 5 1 75 + 3 1 72 + 4

1-ШЭГ 1 5,0 ¡95 + 3 74 + 4 1 58 + 4* 1 63 + 2* ¡64 + 5

1 7,5 I83 + 3* 69 + 4* 1 44 + 5* 1 57 + 4* 1 55. + 6*

1 2,5 ¡95 + 2 78 + 4 1 59 + 5 I 62 + 4* 1 68 + 5

ОЭГ/п-5/! 5,0 ¡90 + 4 69 + 4* 1 50 + 4* 1 50 + 3* 1 58-+ 5*

1 7,5 ¡87 + 3* 66 + 3* 1 32 + 4* 1 33 + 3* 1 50+7*

1 2,5 ¡96+2 67 + 2* 1 49 + 5* 1 36 + 3* ¡70 + 6

1,3-ДМЭП 5,0 ¡93 + 3 58 + 3* 1 36 + 5* 1 24 + 4* 1 52+6*

1 7,5 180 + 3* 52 + 3* 1 22 + 4* 1 15 + 3* 1 39+8*

I 2,5 ¡89+2* 42 + 2* ! 32 + 4* 1 20 + 3* 1 32+8*

1,2-ДЮГ! 5,0 ¡80 + 3* 0 1 0 S 1 0 1 0

I 7,5 168 +3* 0 1 0 0 1 0

• I 2,5 ¡87 + 2* 45 + 2* 1 29 + 4* 1 15 + 3* 1 30+5*

1-МЭЭГ ! 5,0 180 + 3* 25 + 3* 1 14 + 3* 1 12 + 3* 1 0

1 7,5 1 75 + 3* 0 1 0 0 1 0

! 2,5 ¡90+3* 42 + 3* 1 25 + 3* 1 20 + 3* 1 27+6*

1,3-ДЭЭП 5,0 ¡86 + 3* 20 + 3* 1 22 + 5* 1 10 + 3* 1 0

1 7,5 180 +3* 0 1 0 0 I 0

1 2,5 ¡83 + 4* 25 + 4* 1 14 + 5* 1 10 + 5* 1 18+5*

1,2-ДЭЭП 5,0 ¡75 + 3* 0 1 0 0 1 0

1 1 7,5 ¡63+3* 0 I' 0 0 0

Примечание: * - различия результатов по сравнению с контролем достоверны (р < 0,05)

характерной для интактных тромбоцитов, изменения реакции на гипотонический шок и агрегационные свойства тромбоцитов имели концентрационное зависимый характер. Следует отметить, что именно сохранность диоксид-нос™ и степень реакции на гипотонический шок являются самыми информативными показателями in vitro, характеризующими морфофункциональную активность тромбоцитов.- После экспозиции с 2,6 % растворами глицерина, 1,2-ПД, 1-ММЭГ, ОЭГ (п-5) содержание дискоидных форм в образцах не изменялось по сравнению с контролем. С повышением концентрации веществ в клеточной суспензии количество дискоидных форм уменьшалось за счет появления отростчатых и сферических тромбоцитов. Достоверное снижение степени реакции на гипотонический шок, агрегации наблюдалось с увеличением концентраций до 5 и 7,6 X. Установлено отчетливое подавление функциональной активности тромбоцитов растворами, содержащими 1,3-ДМЭГ, особенно способности к реакции на гипотонический шок. Вместе с тем, количество дискоидных пластинок после контакта с 2,5 X раствором 1,3-ДМЭГ не отличалась от контроля. Наиболее выраженное угнетающее действие на специфические функции тромбоцитов оказывали растворы: 1,2-ДМЭГ, 1-МЭЭГ, 1,3-ДЭЭГ и 1,2- ДЭЭГ.. Уже после 15 мин экспозиции с этими веществами уменьшалось общее количество тромбоцитов, наблюдалось снижение ретрактильной активности в среднем на 30-50 X после экспозиции с 2,6%

концентрацией растворов, а 5 и 7,5 X концентрации 1,2 -ДМЭГ, 1,2-ДЭЭГ и 7,5 X концентрации 1-МЭЭГ, 1,3-ДЭЭГ вызывали необратимое подавление данной функции. Одновременно с этим тромбоциты утрачивали способность к ДД^индуцированной агрегации и реакции на гипотонический шок. После 60 мин экспозиции действие этих веществ усиливалось, что проявлялось в уменьшении общего количества клеток и ретрактильной активности, а также необратимом подавлении агрегации и способности к реакции на гипотонический шок при использовании 2,5 % концентрации растворов. Таким образом, анализ полученных данных свидетельствует, что 1,2-ПД, глицерин, 1-ШЭГ и ОЭГ (п=5) в исследуемом диапазоне концентраций не являются токсичными соединениями в отношении тромбоцитов. В серии экспериментов показана возможность пребывания кровяных пластинок в растворах 1,2-ПД, глицерина и 1-ШЭГ в течение 24 часов при +4*С и +22°С без существенного изменения их морфофунк-циональных свойств. Установлено, что после 24 час экспозиции тромбоцитов с исследуемыми веществами сохраняется их способность к рет-

ракции, агрегаций, реакции на гипотонический шок. Результаты, полученные при исследовании цитотоксичности веществ одного ряда с постепенно усложняющейся структурой, свидетельствуют о том, что с увеличением длины и числа алкильных радикалов цитотоксичность веществ возрастает. При этом обнаружена прямая зависимость между цитотоксич-ностью и гидрофобностью этих соединений, которая оценивалась по коэффициенту распределения веществ в системе октанол-вода. Эти данные согласуются с результатами исследований цитотоксичности соединений в ряду диолов для эритроцитов и спермы карпа /Пичугин ¡0. И., 1988/.

При первичном скрининге криопротекторной активности испытуемых соединений, включающем определение общего количества клеток, ретрактильной активности, а также измерение оптической плотности их суспензий с ограждающими растворами до и после замораживания установлено, что наиболее эффективное криозащитное действие наряду с 5 Х-ной концентрацией глицерина оказывают 1,2 - ЦЦ и 1 -ММЭГ в 2,5 %-ной конечной концентрации при скорости охлаждения 1 - 10°С/мин (табл. 2). При использовании б Х-ной концентрации 1,2-ПД, 1-ММЭГ, а также 2,6 X-ной концентрации глицерина показатели сохранности тромбоцитов снижаются. При замораживании тромбоконцентратов под защитой 1,3-ДМЭГ, 1,2-ДМЗГ, 1-МЭЭГ, 1,3- ДЭЭГ, 1,2-ДЭЭГ со скоростью 1 и 10°С/мин общее количество клеток оставалось в пределах 65-80 %. Однако низкие показатели оптической плотности, ретракции плазменного сгустка, а при использовании 1,3-ДЭЭГ и 1.2- ДЭЭГ - полная потеря ретрактильной активности, свидетельствуют об отсутствии криопротекторных свойств у данных соединений на этапе скрининга.

Результаты исследования сохранности основных специфических функций кровяных пластинок, криоконсервированных под защитой полиолов представлены на рис. 1. После замораживания тромбоцитов со скоростью 1 и Ю'С/мин под зашитой 5 X концентрации глицерина определялось в среднем 70 % тромбоцитов, а под защитой 2,5 X концентраций 1,2- ПД и 1-ММЭГ - в среднем 80 X, при этом сохранялась крайне лабильная, высокоспецифическая функция тромбоцитов - агрегационная активность. Достоверных различий между показателями АДФ агрегации тромбоцитов, криоконсервированных с глицерином, 1,2-ВД и 1-ММЭГ не обнаружено и они соответствовали для глицерина - 21 + 4 X, для 1,2-ВД - 18 4 3 % и для 1-ММЭГ -24 + 3% относительно исходного уровня. При замораживании тромбоцитов с глицерином, 1,2-ПД и 1-ММЭГ со скоростью 1 и 10оС/мин

Таблица 2

Сохранность тромбоцитов, криоконсервированных под защитой веществ ряда полиолов при различных режимах охлаждения ( Ы + м, п - 9 )

!Кон-1 Исследуемые показатели

оещеихвш цеп-| ■ 1 тра-1 1 ция 1 ■ 1В-В 1 1 X I-1 1 Кол-во клеток 1 Ретракция 1 Оптическая плотн.

Скорость замораживания, град/мин

1 : 10 : 20 1 1 : 10 : 20 1 1 : 10 : 20

12,5 1 82+3 : 80+3 : 72+2*1,66+4": 61+3": 53+4*191+5 :89+3 : 76+4*

1,2-ВД 15,0) 87+4 : 83+2 : 73+3 1 52+5 : 50+4 : 48+3 ! 80+3 : 78+3 : 75+3

12,5 1 1 1 ■ 60+3 : 65+4 : 72+2*1 39+6 : 41+3 : 30+4 178+3 : 76+4 : 70+3*

Глицерин! 5,0 1 72+4": 73+3 : 76+3 159+3": 52+4": 48+5*183+2 : 81+3 : 78+3

12,5 1 83+2 : 81+2 : 71+4*1 63+4 : 59+3 : 47+4*1 85+3 : 80+3 : :71+2*

1-ММЭГ 15,0 1 85+4 : ; 80+3 :68+3 151+5 : 49+4 : 41+6 179+4 :76+5 : 70+3

12,5 1 1 1 ■ 80+4": : 76+2 : 65+4*1 27+4": : 25+3": 17+2*176+3 : 73+4 : ;61+2* ,

1,3-ДМЭГ15,0 1 69+3 ; : 73+4 :80+3 115+3 : :10+2 : : 0 173+2 : 70+3 : ; 66+4

12,5 1 1 I 70+3 : : 68+4 .-60+4*120+4 : :24+3 : : 30+5 172+3 -.70+5 : :58+5*

1,2-ДМЭГ1 5,0 1 79+2 : : 75+3 : 67+3*1 0 : : 0 : : 0 170+2 : 67+4 : :58+4*

12,5 1 1 1 69+3 : : 66+2 ••59+4*120+3 : ;25+5 : 0 173+3 : 71+4 : : 63+5

1-ШЭГ 15,0 1 76+4 : : 70+3 : 65+5 1 0 : :' 0 ; ; 0 170+2 : 66+3 : :60+3*

12,5 1 1 1 - 71+2 : : 67+3 : 60+3*1 0 : ; 0 : : 0 164+4 : 60+6 : : 55+4

1.3-ДЗЭГ15,0 1 78+3 : : 73+2 : 66+2*1 0 : : 0 : : 0 161+5 :59+6 : : 53+3

12,5 1 63+4 : : 62+3 : 52+4*1 0 : : 0 : : 0 162+4 : 60+4 : : 52+6

1,2-ДЭЭП 5,0 1 70+3 : : 68+2 : 57+3*1 0 : : 0 : : 0 158+5 : 57+6 : 50+5

12,5 1 1 1 76+3 ; : 81+4 :71+4 154+4 : : 65+4*: 50+3 1 81+3 : 78+4 : 70+3*

ОЭГ/п-5/1 5,0 1 89+4 : : 80+3 :69+3 151+5 : : 49 4": : 33 4 182+3 : 77+5 : 75+4

Примечание: * - р < 0.05, достоверность различий по сравнению

скоростью замораживания 1 град/мин "- р < 0.05, достоверность различий между показателями для 2.5 7, и 5 %-ных концентраций веществ

сохранялась реакция на гипотонический шок, наиболее высокие результаты получены после криоконсервирования с 5 % раствором глицерина и 2,5 % растворами 1,2-ПД и 1-ММЭГ и составляли 22 + 3 %, 19 t 4 X, 23 ± 3 % соответственно / рис. 1./. Содержание дисковидных тромбоцитов для 1,2-ПД варьировало от 8 до 25 X, для глицерина и 1-ММЭГ - от 9 до 18 %. С увеличением скорости охлаждения показатели реакции на гипотонический шок снижались, а при охлаждении со скоростью ЗО'с/мин под зашитой 1,2-ПД и 1-ММЭГ тромбоциты полностью утрачивали способность к реакции на гипотонический шок. Следует отметить, что при замораживании тромбоконцентратов с глицерином, мы не смогли избежать в ряде экспериментов возникновения спонтанной агрегации - явления хорошо известного и описанного в литературе /Dayian. J., Pert J. ,1979/, являющегося основным лимитирующим фактором широкого внедрения данного способа в клиническую практику. Поскольку такие исследования на тромбоцитах проводились впервые, нами была изучена функциональная полноценность тромбоцитов и после замораживания с растворами 1,3-ДМЭГ, 1,2-ДМЭГ, 1-МЗЭГ и 1,3 и 1,2-ДЭЭГ. Оказалось, что независимо от скорости охлаждения тромбоциты необратимо утрачивали свои специфические функции: агрегацию, реакцию на гипотонический шок. Морфологически преобладали сферы с шиловидными отростками. Полученные данные подтверждают отсутствие криозащитных свойств в отношении тромбоцитов у выше перечисленных веществ и позволяют' рекомендовать при проведении подобного рода исследований использовать только первичный скрининг с целью упрощения и сокращения времени исследования. Криоконсервирование тромбоконцентратов с ограждающими растворами, содержащими 2,5 и 5 Л ■ концентрации ОЭГ/п =5/ позволяет сохранять от 70 до 80 X тромбоцитов. Наиболее высокие показатели ретракции, агрегации, реакции на гипотонический шок были получены при охлаждении тромбоконцентратов под зашитой 2,5 X раствора ОЭГ /п-5/ со скоростью охлаждения 10°С /мин и составляли: 65 + 3 X, 19 ± 4 Z и 17 ± 4 % соответственно. .

Анализируя полученные данные по цитотоксичности и криопротек-торной активности исследуемых соединений в зависимости от их физико -химических свойств, все их можно разделить на две группы:

1.- Соединения, обладающие слабыми гидрофобными взаимодействиями (глицерин, 1,2-ПД, 1-ММЭГ). Сохранность тромбоцитов после оттаивания находится на относительно высоком и приблизительно одинако- ' вом уровне.

4

3 2 I

1.2-ВД

Глицерин 1-ММЗГ

ОЭГ/п-б/

Рис. I. Показатели функциональной полноценности

тромбоцитов (1-кол-во клеток, 2-ретракция, 3-агрегация, 4-РГШ ) после замораживания под защитой полиолов

2. Для второй группы (1,3-ДМЭГ, 1-МЗЭГ, 1,3-ДЭЭГ, 1,2-ДМЭГ, 1,2-ДЗЭГ) наблюдается снижение сохранности тромбоцитов как до замораживания, так и после оттаивания. Эти соединения имеют в своих молекулах две метильные или одну-две этильные группы в разных положениях и обладают более выраженными гидрофобными взаимодействиями.

Таким образом, тенденция увеличения цитотоксического действия и ослабления криозащитных свойств веществ проявляется по мере усиления гидрофобных взаимодействий из-за увеличения числа и длины ал-кильных групп в молекулах полиолов.

С целью определения оптимальных условий криоконсервинрования тромбоцитов был применен математический метод планирования двухфакторного эксперимента (Ш0 -2) , который позволил изучить влияние на результаты криоконсервирования двух факторов: X 1 - концентрации криопротекторов и X 2 - скорости охлаждения с использованием экспоненциальных режимов замораживания, и, что особенно важно, определить степень их суммарного воздействия и взаимовлияния на сохранность криоконсервированных кровяных пластинок. В качестве криопротекторов использовали: глицерин, 1,2-ПД и 1-ММЭГ, которые проявили наибольшую криопротекторную активность в предварительных исследованиях. Замораживание проводили с использованием экспоненциальных режимов. Их преимущества перед линейными режимами подробно описаны и теоретически обоснованы в работах /Новиков А. а , 1985, Гордиенко Е. А., 1989/. Эксперименты для трех криопротекторов проводились на клетках одного донора. Выло проведено 6 серий по 5-6 параллелей в каждой. На основании проведенного расчета результатов факторного эксперимента получены адекватные со значимыми коэффициентами регрессии выражения:

для глицерина: У .об. - 23 + 4,9 XI - 2,8 Х2 - 3,5 XI Х2; для 1,2-ПД : У Об. - 16,2 - 4,7 XI - 2,8 Х2 + 3,4 XI Х2; ДЛЯ 1-ШЭГ : У об. - 18,3 - 4,5 XI- - 3,4 Х2 + 3,5 XI Х2; Из представленных уравнений следует, что исследуемые факторы XI и Х2 оказывают существенное влияние на эффективность криоконсервирования тромбоцитов. При этом не менее важным является эффект взаимодействия факторов XI Х2. И если при использовании в качестве криоп-ротектора глицерина для повышения эффективности метода криоконсервирования тромбоцитов необходимо разнонаправленное изменение обоих факторов, т. е. увеличение концентрации глицерина и сни-

жение скорости замораживания, то дли 1,2-ЦЦ и 1- ММЭГ необходимо однонаправленное изменение -.низкие концентрации криопротекторов и медленная скорость охлаждения.. Однако, дальнейшее увеличение концентрации глицерина нежелательно вследствие его неблагоприятного воздействия намембрану клеток /Armitaghe V., 1986; Kim В., Baldinl М., 1086/, а более низкие концентрации 1,2-ПД и 1-ММЭГ не оказывают ограждающего действия при замораживании тромбоцитов. Полученные выводы по режиму охлаждения тромбоцитов позволяют предположить, что медленное прохождение фазового перехода вода-лед во внеклеточной среде будет способствовать повышению сохранности клеток. Однако достичь этой цели можно, исключив начальное переохлаждение основной массы внеклеточной среды, что довольно сложно при медленных скоростях охлаждения /0,3 ... 2"С/мин/.

Исследования по влиянию переохлаждения в процессе замораживания тромбоцитов на уровень сохранности клеток подтвердили роль данного фактора в механизме повреждения клеток при криоконсервировании и доказали необходимость управления процессом фазового перехода вода-лед. Было установлено, что, независимо от вида криопротектора и его концентрации в образцах (5-6) одной параллели каждого донора наблюдается значительное варьирование данных и низкий уровень сохранности тромбоцитов. Наиболее чувствительными из исследуемых функций к действию переохлаждения оказались реакция на гипотонический шок и агрегация. Их показатели варьировали от 0 до 10-15 Z. Иници-рование льдообразования во внеклеточной среде при замораживании тромбоцитов в контейнерах с теплоотводящим стержнем со скоростью 2°С/мин до - 70'С с последующим погружением в жидкий азот приводило как к увеличению уровня сохранности кровяных пластинок, так и к стабильности полученных результатов (табл. 3). Отмечалось достоверное повышение сохранности показателей ретракции, агрегации, реакции на гипертонический шок при криоконсервировании тромбоцитов под защитой 2.5, 5 и 7.5 %-ной концентраций глицерина; 2,5 Х-ной концентрации 1,2-ЦЦ и 2.5, 5 %-ной концентраций 1-ММЭГ. Аналогичные результаты получены и при замораживании так называемых "ослабленных" . тромбоцитов, пребывающих вне организма более б часов. Оказалось, что эти тромбоциты особенно чувствительны к явлению переохлаждения. Иници^звание льдообразовавания во внеклеточной среде также приводило к достоверному увеличению всех показателей функциональной со-

Таблица 3

Показатели функциональной полноценности тромбоцитов, криоконсервированных под защитой глицерина, 1,2-ПД и 1-ММЭГ по оптимальной программе (Уохл. -2°С/мин до -70"С ...азот)

1Концен-1 Исследуемые показатели, %

I трация I----------------------------------------------

Вещества! в-в, % I Количество ! Ретракция I Агрегация, I Р Г Ш I I клеток ! I индуктор-АДФ1

I I 1-1 (20/1/Ю I

Без инициирования льдообразования

» 2,5 1 70 + 3 1 41 + 6 * 1 11 + 4 1 - 9 + 3 А

Глицерин! 5,0 ! 71 + 4 ! 48 + 5 * 1 19 + 4 * 1 22 + 3 *

! 7,5 ! 73 + 4 1 61 + 4 * ! 22 + 2 * 1 23 + 4 *

1 2,5 ! 82 + 3 ! 67 + 4 * ! 18 + 4 * 1 16 + 3 *

1,2-ПЦ I 5,0 1 74 + 4 ! 55 + 4 1 10 + 3 1 6 + 2

I 2,5 1 77 4- о ! 59 + 4 * ! 25 + 3 * I 18 + 4 *

1-ММЭГ 1 5,0 ! 53 + о 1 52 + 5 * 1 15 + 3 * 1 12 + 5 *

С инициированием льдообразования

1 2,5 1 - 75 + 4 ! 57 + 3 ! 15 + 2 1 17 + 3

Глицерин! 5,0 1 78 + 2 ! 75 + 3 ! 29 + 2 1 ' 36 + 4

1 1 7,5 1 79 + 2 1 72 + 2 1 37 + 3 1 39 + 4

1 2,5 ! 88 + 2 ! 79 + 2 ! 28 + 2 1 1 31 + 2

1,2-ПД ! 5,0 !. 76 + 4 ! 49 + 3 ! 10 + 3 » 1 9 + 3

I 2,5 ! 85 + 4 I 74 + 3 ! 36 + 3 1 1 28 + 2

1-ММЭГ 1 5,0 ! 77 + 3 ! 78 + 4 ! 23 + 2 1 26 + 3

Примечание:

.* - р < 0,05 достоверность различий по между показателями функциональной полноценности тромбоцитов, криоконсервированных без инициирования и с инициированием льдообразования.

хранности "ослабленных" тромбоцитов.

Проведенные исследования, таким образом, позволили определить оптимальные условия криоконсервирования тромбоцитов в исследуемой области концентраций применяемых криопротекторов и режимов замораживания со снятием переохлаждения, способные обеспечить функциональную полноценность кровяных пластинок. Использование низких концентраций 1,2-ПД и 1-ММЭГ (2,5 X), которые обеспечивают сохранность основных показателей функциональной полноценности тромбоцитов, позволяют рекомендовать их в качестве перспективных криопротекторов при разработке способа низкотемпературного консервирования тромбоцитов для клинической практики.

ВЫВОДЫ

1. 1,2-пропандиол, 1-монометиловый эфир глицерина и оксиэтилирован-ный глицерин п=5 характеризуются высокой криозащитной активностью в отношении тромбоцитов. Преимуществом этих веществ по сравнению с глицерином является сохранение функциональной полноценности тромбоцитов при использовании указанных соединений в более низких концентрациях /2,5%/, а также отсутствие спонтанной агрегации кровяных пластинок.

2. Оптимальными условиями криоконсервирования тромбоцитов в исследуемой области концентраций эффективных криопротекторов и режимов замораживания являются: 5-7,5 % концентрации глицерина, 2,55 % - 1-монометилового эфира глицерина, 2,5 % - 1,2-пропандиола; скорость охлаждения: 2'с/мин до -70'С с последующим погружением в жидкий азот. Для оксиэтилированного глицерина п»5 - 2,5 % концентрация и скорость охлаждения 10"С/мин до -70°С с последующим погружением в жидкий азот.

3. Установлено повреждающее действие переохлаждения, возникающего при медленных скоростях замораживания тромбоцитов, на их морфофунк-циональные свойства.

4. Снятие переохлаждения с использованием инициирования льдообразования при замораживании свежевыделенных и так называемых "ослабленных" тромбоцитов под защитой глицерина, 1,2-пропандиола и 1-монометилового эфира глицерина обеспечивает более высокую сохранность всех показателей морфофункциональной полноценности клеток.

5. Цитотоксичность соединений ряда полиолов нарастает с увеличением длины и числа алкильных радикалов, т. е. с увеличением гидрофоб-ности этих соединений: низкой цитотоксичностью в отношении тромбоцитов обладают вещества, находящиеся в начале ряда полиолов

- 1,2-пропандиол, глицерин, 1-монометиловый эфир глицерина;

6. 1,3 - 1,2-диметиловые эфиры глицерина, 1-моноэтиловый эфир глицерина, 1,3 - 1,2-диэтиловые эфиры глицерина характеризуются высокой цитотоксичностью в отношении тромбоцитов и не могут быть исполь-' зованы в качестве криопротекторов для кровяных пластинок.

Внедрение результатов исследований в практику..

1. Данные о криопротекторных свойствах полиолов используются при разработке метода низкотемпературного криоконсервирования для клинической практики.

2. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, получено авторское свидетельство на изобретение.

Считаю своим приятным долгом выразить искреннюю признательность старшему научному сотруднику, кандидату медицинских наук Компаниец А. М. за постоянное внимание к работе, за научные консультации и помощь при обсуждении результатов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Морфофункциональные свойства тромбоцитов после воздействия криопротекторов // Тез. докл. 11 Всесоюзной конференции по теоретическим и прикладным вопросам криобиологии, т. 1,- Харьков, 1984, -с. 153 /соавтор: А. М. Компаниец/.

2. Проницаемость мембраны тромбоцитов для воды и глицерина при различных температурах. - Рукопись депонирована в ВИНИТИ, 1985, N 22112 - 85 деп. от 26. 03.85. - 9 . с. /соавторы: А. М. Компаниец, А. Н. Новиков, С. Т. Олейник/.

3. "Криопротектор". - А. С. 1298203 /СССР/. Опубл. в Б. И., 1987, N 11 /соавторы: М-ЛШраго, Л.А. Ханина, С. В. Кощий, С. Ю. Видный, Е Ф. Карташов, В. К. Мазалов, П. А. Пустовойт, А. М. Компаниец, Е. Г. Атовт мян, Л. 3. Верховская, В. М. Гучок/.

4. Функциональная полноценность тромбоцитов при различных режимах

замораживания //Мэделирование криобиологических процессов. - Харьков, 1988. -с. 167-173 /соавторы: В. И. Луговой, С. Т. Олейник, А. М. Комланиец/.

б. Влияние глицерина, диметилсульфоксида и 1,2-ПД на показатели функциональной активности тромбоцитов// Теоретические и практические аспекты современной криобиологии. - Киев: Наук, думка, 1989. -с. 45-48.

6. Влияние веществ ряда полиолов на морфофункциональные свойства тромбоцитов. - Рукопись депонирована в ВИНИТИ, N 6037-В. 89 дел. от 28.09.89. - 13 с. /соавторы: А. М. Компанией, С. а Коший, И. А. Иванова, В. И. Луговой/.

7. Монометиловый эфир глицерина: цитотоксичность и криозащитная эффективность при замораживании тромбоцитов// Физико-химические свойства и биологическое действие криопротекторов.- Харьков,1990, с. 59-63 /Соавторы: А. М. Комланиец, С. В. Коший, И. А. Иванова/.

8. Криопротекторные свойства веществ ряда полиолов при замораживании тромбоцитов// Физико-химические свойства и биологическое действия криопротекторов. - Харьков, 1990. - с. 94-98 /Соавторы: A.M. Комланиец, И. А. Иванова/.