Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез, токсичность и криопроекторная активность оксиэтилированных амидов

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Автореферат диссертации по теме "Синтез, токсичность и криопроекторная активность оксиэтилированных амидов"

И6 Ой

, и н;а|\ 1333

1 1 111и" АЩШИЯ НАУК УКРАИНЫ

ИНСТИПТ ПРОИЕК тошоюш И КВ1 (МЕДИЦИНЫ

На правах рукописи

ЧЕКАНОВА Валентина Владимировна

СИНТЕЗ, ТОКСИЧНОСТЬ И "КРЙОПРОГЕКГОРШ АКТИВНОСТЬ ОКСИЭТИШОВАШШ АМЩОВ

криобиология органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соиомние ученой,степени кандидата (диалогических наук

03.00-22 -02.00.03 -

Харьков - 1993

Работа выполнена в Институте проблем криобиологии а криомедвдины АК Украина

Научные руководители: лауреат Государственной премии Украины, доктор биологических наук, профессор В.И.ЛуговоЙ

доцент, кандидат химических Наук АЛ1.Мельник

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

В.Ф.Козлова доктор химических наук О.А.Пономарев

Ведущая организация: Украинская фармацевтическая академия

„ . > . 3 <0

Защита состоится "¿¿/'¿З-А-С' I993 года в Г "час

на заседании специализированного совета Д 016.60.01 при

Институте проблем криобиологии и криомедицины АН Украины

( 310015, г.Харьков, улица Переяславская, 23 ). ;

• С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института проблем криобиологии и криомэдицины АН Украины.

Автореферат разослан -у/ « иса^ 1993 г.

■ Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

А.Н.Гольцев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Современные методы низкотемпературного консервирования и длительного хранения различных биологических объектов основаны на применении криозащитных сред, главным компонентом которых являются криопротекторы.

Одним из классов соединений, используемых в качестве крио-протекторов является амиды алифатических карбоновых кислот. Некоторые из этих соединений нашли применение в практике низкотемпературного консервирования лейкоцитов и тромбоцитов человека (Агра-ненко В.А. ,1983.), спермы птиц (Курбатов А.Д.,1985), спермиев человека (Паращук Ю.С. ,1985). Однако алифатические амиды в ряде случаев оказывает выраженное токсическое действие как на органиэмен-ном, так и на клеточном уровне, что значительно ограничивает их использование в прикладной криобиологии.

Ранее установлено, что одним из возможных способов уменьшения токсичности веществ, не снижавших их криопротскторной активности, является оксиэтилирование (Гучок М.М.,Шраго М.И.,1978). Так, Оксиэтилирование глицерина, этиленгликоля и морфолина позволило в значительной мере понизить их токсичность и рекомендовать в качестве криопротекгоров для многих биологических объектов (тромбоцитов, лейкоцитов, спермы хряка и т.д.) (Ханина Л.А. ,1984,' Ираго М.И.,1905; Грищенко В.И.,1988).

Естественно предположить, что оксиэтилирование амидов также будет в определенной степени сопровождаться снижением их токсичности, сохраняя криозащитную. активность. Между тем, до настоящего времени вещества ряда оксиэтилироввнных амидов не испытаны в качестве криогротекторов.

Следует отметить, что оксиэтилирование веществ дает возможность иироко варьировать их степень полимеризации и молекулярно-массовое распределение (ММР) и получать при этом смесь полимерго-мологов, вклвчавщих как низко-,так и высокомолекулярные соединения. Известно (Шенфельд Н.,1982), что механизм взаимодействия амидов с оксидами алканов является сложным процессом, течение которого определяется многими факторами: температурой проведения реакции, природой исходного амида, степенью оксиэтилирования, полярность«) среды. Вместе с тем, многие конкретные вопроси оптимизации условий синтеза аддуктов окиси этилена с амидами недостаточно разработаны, а также не изучены их структура и физико-химические свойства, -токсичность и криопротекторная активность.

Таким образом, можно полагать, что оксиэтилированные аниды, представляющие широкую возможность варьировать их степень полимеризации и структуру, является перспективными для создания новых криопротекторов, а также для выяснения возможной зависимости крио-защитной активности исследуемого ряда соединений от их химической структуры и физико-химических свойств не конкретных биологических вбгекгах.

Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным целы) настоящей работы явилось: синтезировать ряд оксиэтильных производных амидов, исследовать их физико-химические свойства, токсичность и криопротекгорную активность на разных биологических объектах.

Для этого предполагалось реиить следувщие задачи:

1. Определить оптимальные условия синтеза аддуктов окиси этилена с амидами с заданной степени полимеризации и моЛекулярно-нассовым распределением, исследовать зависимость молекулярно-маособого распределения от условий синтеза (на примере М-ацетиотано-Iамина).

2. Провести синтез, очистку, идентификации и изучить физико-химические свойства окриэтилированных амидов со степеньп полимеризации п«2-12.

3. Изучить острув токсичность оксиэтилированных амидов.

■Ч. Изучить цитотоксичность и криопротеКторнув активность оксиэтилированных амидов при криокон сервировании различных биологических объектов (клетки костного мозга криа и' перевиваемая клеточная культура почки эмбриона свиньи (СПЭВ).

Научная новизна. Синтезированы новые оксиалкияьные производные алифатических амидов (19 соединений). Исследован функциональный и фракционный состав синтезированных аддуктов оксиэтилированных амидов. Впервые определены оптимальные условия синтеза, позволяющие получать оксиэтилированные амиды с заданной степеньо полимеризации и молекулярно-массовым распределением (температура, катализатор, давление и мольное соотношение окиси этилена : амид). Оценены также кинетические параметры синтеза оксмэтилированного-Ь/ -ацетил этанол амина : константы скоростей расходования и образования конечных продуктов оксизтилирования; константы распределения и энергии активации для каждого компонента смеси.

доказано, что оксиэтилирование анидов сопровождается в большинстве случаев снижениемих общей токсичности по сравнение с исходными амидами.

Впервые Испытаны вещества с различной степенью полимеризации Из ряда оксиэтилированныж амидов (25 соединений) в качестве крио-протесторов при криоконсервировании клеток костного мозга крыс и клеточной культура почки эмбриона свиньи (СПЭВ). В ряду изученных вецеств определены перспективные криопротекторы для перевиваемой клеточной культуры СПЗВ и клеток костного мозга крыс, к которым можно отнести оксиэтилированные ецетамиды со степенью полимеризации п-3-4, 6. 9-10. Разработан оригинальный способ получения нового криопрогектора - оксиэтилированного ацетамида со степенью полимеризации п-3-4, предложен метод криоконсервирования клеток перевиваемой культуры СПЭВ под его защитой (А.с.К 14ВД627).

•Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты, касавшиеся определения оптимальных условий синтеза оксиэтилированного Л'-ацетилэтаноламина, а также способа анализа полидисперсных продуктов реакции оксиэтилированйя имеют определенное значение в области химии полимеров и могут быть рекомендованы для получения еддуктов окиси этилена о другими амидами в лабораторных условиях.

Экспериментальные величины физико-химических свойств оксиэти-лированных амидов, а также кинетические параметры синтеза оксиэтилированного Л'-ацетилзтанолаиина могут быть использованы как справочные данные.

Установленные зависимости' общей токсичности, цитотоксичности И криопротекторной активности оксиэтилированных амидов от их структуры могут служить.методическим подходом для применения новых оксиалкилированных соединений из других классов химических веществ в качестве криозащигных агентов экзо- и эндоцеллилярного механизма действия.

Разработанный режим замораживания-оттаивания для криоконсервирования клеток перевиваемой культуры СПЭВ под защитой оксиэтилированного ацетилэтаноламина со степеньв Полимеризации п«3-4 (A.c. ft IM8627). Имеет прикладное значеняе и может быть использован в практике криоконсервации клеточных культур.

Оксиэтилированные ецетамиды со степенью полимеризации п»Э-4, 6,9-10 являются криопротекторами клеток костного мозга крыс, а со степенью полимеризации п»3-4 для клеток СПЭВ и поэтому рекомендуются для дальнейаего исследования их в качестве криопротектеров для других клеток и тканей.

На защиту выносятся следующие положения

1. На основания изучения кинетических параметров реакции оксиэтилировакия амидов (^'-ацетилэтаноламина) оптимальными условиями для синтеза целевых фракций низкомолекулярных олигомеров (п-3-4) с минимальный содержанием примесей являются: соотношение амидюксид этилена 1:4, температура реакции -IOO-IIO°C, в присутствии катализатора (0,008 Ц КОН), в течение 100 минут.

2. Оксиэтилирование амидов приводит, как правило,к снижении общей токсичности и цитотоксичности полученных олигомеров в сравнении со "стартовыми" амидами, при этом в ряде случаев сохраняется криопротекторная активность их на уровне исходных амидов. В связи с этим реакция оксиэтилирования амидов может быть экспериментально обоснованным подходом для создания новых экзоцеллоляр-ных криопротекторов.

Публикации материалов' исследования. Основные положения диссертации опубликованы в 10 печатных работах и Г авторском свидетельстве на изобретение.

Апробация работы. Материалы раОоты доложены и обсуждены на П Всесоюзной конференции по теоретическим и прикладным вопросам криобиологии (Харьков,I981»), конференции молодых ученых ИПКиК АН Украины (1968), У Всесоюзной конференции по жидкостной хроматографии (РигаДйЮ), 1У Всесоюзной конференции "Водорастворимые полимеры и их применение" (Иркутск, 1991), П Международной-конференции "Успехи современной криобиологии" (Харьков,1992).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 154 стр. машинописного текста и иллюстрирована 21 таблицей и 23 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, б глав собственных исследований и их обсуждения, выводов и указателя литературы, который включает 132 источника.

МАГЕРШИ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ-

В работе были использованы 25 соединенвй, производные окси-этилированных амидов.

Исходные индивидуальные амиды очищались по общепринятым методам (В.Кейл,19бб). Ацетихэтаноламин синтезировали по методу, разработанному ХитринымС.В. (198Э).

$ормилэ!аноламин получен аналогично гзаимодействием ионоэтанолами-на с муравьиной кислотой. Синтез ецетилдиэтаноламина и трифтора-

цетилэтанолемина проведен по разработанному нами методу. Ацетил-диэтаноламин и оксизтилирование амидов проводили в установке синтеза (УСК-1) о дискретной подачей окиси этилена с подогревом по методу "Козлова И.А..Шеломова И.Н.,0сипова О.А.и др.(1980). Полученные продукты очищали углем ОАУ и понижали рН катионнообменной смолой КУ-2-8С.

Узкие фракции синтезированных оксиэтилированных амидов и по-дизтиленоксида с молекулярной массой 400 (ПЭО-ТО), получали методом молекулярной дистилляции в глубоком вакууме при остаточном давлении 2^4•10~5 мм.рт.ст., отбирая соответствующие фракции через Ю-15°С в интервале от 85 до 180°С.'Для идентификации исследуемых веществ Определяли: плотность, показатель преломления, температуру кипения. Для подтверждения структуры синтезированных соединений снимали ИК-спекгры на спектрофотометре"ЗргсогА, 75Ж". Чистоту веществ проверяли хроматогрефически на газожидкостном хроматографе .НХМ-80 с пламенно-ионизационным детектором, жидкостном "Цвет-306", а также ГСХ-хроматографией. Показатель преломления определяли на термосуатируемом рефрактометре "УРЛ-М1", плотность определяли пикнометрически, также при термостатировании. фракционный состав образцов оксиэтилированных амидов определяли газожидкостной хроматографией на хроматографе ЛХМ-80. Аналогично исследован молекулярно-массовый состав. ПЭО-Аио. Изучена кине-.матичгская вязкость оксиэтилированных амидов (Рачинский Ф.Ю. .Рачинская М.Ф., 1982), ГЛБ оксиэтилированных амидов рассчитаны по методу Мельника А. 11.Д988 .

Исследование зависимости острого токсического действия веществ от их химического строения проведено на белых мышах и крысах. 0. степени токсичности Исследуемых веществ судили по сред-несмергельным дозам (ЛД-50),' которые определялись методом В.В.Прозоровского (1978) при двухнедельном сроке наблюдения. Все исследуемые вещества вводились животным внутрибрвшинно в растворах 20$-ной концентрации, которые готовились на изотоническом растворе хлорида натрия.

Цитотоксическое действие'и криопротекторная активность соединений ряда оксиэтилированных амцдов исследована при криоконсерви-ровании клеток костного мозга крыс и клеточной культуры СПЭВ.

Для изучения цитогоксичносги в отношении клеток костного мозга крыс растворы оксиэтилированных амидов и ПЭО-^ОО смешивали с клеточной суспензией миелокариоцитов в соотношении 1:1 и выдержи-

вали ори комнатной температуре в течение 30-180 мин, контролируя их жизнеспособность через 1,2,3 часа. Изучали, цитотоксичноегь веществ в концентрационном диапазоне 2,5Л5£.

Для изучения цитотоксического действия криопротекторов в отношении культуры СПЭЗ клетки переводили в суспенип, обрабатывая ионослой смесью Версена 0,02)5 с трипсином 0,25%, взятых в соотношении 9:1. К суспензии кЛеток в ростовой среде добавляли медленно по каплям равный объем криопротекторов, доведя конечную концентрацию криопротекторов до заданной (5,10,20$). Клетки выдерживали в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего из суспензии отбирали пробы для оценки жизнеспособности.

Криоконсервирование клеток костного мозга крыс осуществляли по методу, разработанному автором. Растворы оксИэтилированнйх амидов. и Ш0-400 (используемый в качестве контроля) на среде Хэнкса смешивали с клеточной суспензией костного мозга в соотношении 1:1 по объему. Диапазон Исследованных концентраций -2,5-15%. ВндерЛи-вали при комнатной температуре 30 минут, затем замораживали £ полиэтиленовых ампулах ёмкостью I мл по программе:- 1°/мин до -12°С, после 4-х минутного интервала 30°/мин до -80°С, с последующим погружением в жидкий азот (-19б°С). Размораживали на водяной бане (42-43°С) со скорость» 50°/мин.

Криоконсервирование клеток СПЭВ проводили по методу, разработанному нами (А.с.№ 1441627).

К суспензии клеток СПЭВ с концентрацией 10x10^ кл/мл добавляли равный объем рабочего раствора криопротекторов, после Чего концентрация криопротекторов равнялась соответственно 2,5; 5; 10%. Полученнуо суспензию клеток разливали в полиэтиленовые ампулы ёмкостью I мл и после 30-минутной экспозиции -замораживали в программном замораткивателе УОП-8 (производства СКГБ с ОП ИПКиК АН Украины). Охлаждение, осуществляли со скоростью 1°/мин до -Ю°С, затем Ю°/мин до -160°С о последующим погружением в азот. Отогрев замороженных образцов производили на водяной бане при 40°С.

Пролиферативную активность клеток изучали путем определения митотического индекса, соотношения фаз митоза на 1000 трансформированных клеток. Митогический индекс определяли как отношение числа митотически делящихся клеток к общей сумме подсчитанных клеток (Дьяконов Л.П.', 1980). Монослой культуры клеток СПЭВ снимали с матрасов смесью Версена с трипсином (9:1) и помещали в приготовленную ростовую среду^ •

После приготовления препаратов клеток СЕЭВ и окрашивания гематоксилином Караччи (Красников Г.А.,Наумова К.А.,1981) общепринятый способом определяли митотический индекс, выражавшийся в промилле, "а также соотноиение фаз митоза - в процентах от соответствующего митогического индекса. Жизнеспособность клеток СПЭВ определяли по методу Биргер М. (1982), а для оценки жизнеспособности клеток костного мозга использовали метод АЦчЛ. Н. (1955)..

Статистическую обработку результатов исследований проводили методом Фишера-Сгыодента (Закс А. ,1976), используя программный комплекс } Ы % ., разработанный на ВЦ ИПКиК АН Украины (ЭВМ СМ-4). Математическая модель и программа расчета оценки кинетических параметров условий синтеза оксиэтилированных амидов и вычисления свободных энергий полимергомологов разработана совместно с вычислительным центром Харьковского политехнического института.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ 0БСЩ1НИЕ

Синтез .идентификация и физико-химические свойства оксиэтилированных амидов. Разработаны условия синтеза, позволяющие получать оксиэтилированные амиды с оптимальным молекулярно-нассовым распределением (ММР). В результате проведенных исследований показано, что лучше проводить оксиэтилирование не исходных амидов, а использовать двухступенчатую реакцию оксиэтилирования о предварительным синтезом форполимера, что позволяет провести реакцию в оптимальных условиях с уменьшением количества примесей и непрореа-гировавшего исходного соединения. Были также разработаны методы синтеза ряда исходных амидов (формилэтаноламина^ ацетилдиэтанола-мина, трифторацетилэтаноламина). В таблице 1 из представленных в ней 25 соединений, 19 соединений получены впервые. Синтезирован систематический ряд амидов с постепенно усложняющейся структурой от К' -формамида, не имеющего заместителей, до г рифт орацетил этанол амина.

С введением оксиэтильной цепи различной длины (от I до 9), а также донорно-акцепторных радикалов в боковую цепь и к атому азота, изменяющих основность и гидрофильно-липофильный баланс молекулы.

Синтезированные вещества очищены и характеризованы по физико-химическим свойствам по общепринятым методикам по температуре кипения, плотности, показателю преломления. Данные хроматографичес-кого анализа оксиэтилированных амидов приведена в Таблице I.

Таблица I

Молекулярно-маесовый состав оксиэтилированных амидов по данным газо-жидкостной, хроматографии

(Средняя , ¡молекуляр( .¡масса ок-;п-1 ,-сиэтилир.{ I амидов ,

пп

Наименование соединений

Содержание ' полим'е^гомологов , %

!п-2 ! гьЗ ! П-4 г ( I

> _ I . >

п-5 !п-б ! п-7 ! п-8 г [ г ( -I !

-Ц

1-—Г-1-1-

п-9 !п—10 !п-П |п-12 I ! » 1

Б—! 9 !,1и 1 И1 1 12 ' 13 ■ : 1Ь

; ■ I, I. ; 2-

3.

4.

•5.

б.

7.. , 3.

9.

10.

11.

12.

13.

и;

15.

16.

Оксиэтилированные: Формамид Формамид. Формамид . Ацетил эт'аноламин

Ацетилацетамид Метил ацетамид

Ацетилацетамид

Ацетилдиэтанола-мин

Трифторацетил-этаноламин ■

133 78.6 16 Д - -

177 3.7 24,7 23,2 3,0 - - - _'.._•

220 1.0 17,6 39,6. 8,3 1,6. - .- ■ - -

179 - 24,9 25,9 15,4 • -

213 - 17,7 39,6 23.8 3,9 - - - -

232 - 8,4 II >5 20,8 35,3 17,5' З.Г - - . - . -

230 - ■ 4,5 27.0 20,4 П.З 1,7 - - . - - - -

370' - - сл. сл. 37,7 50,0 9,1 3,2 -

407 ■ - - - - 8,6 32,6 44,7 14,1 -

225 25.6 23,0 17.5 го ,г 13,7 - ' - - - - - -

270 8,7 26,1 11,0 16,6 4,0 33*6. - - • - - -

348 ' - - _ ;8Д 39,0 41,4 11,5 - - - - . -

367 - - - 20 ,0 33,2 29",0 15 ,4 2 ,4 -

460 - • - - сл. 7,7 23,3 29,0 23<0 12,5 М -

499 - - - - - 10.3 24.8 31,0 23,5 10,4 -

421 29,0 10,9 8,3 2,0 3,9 6,8 7",4 3,7 - - - 15,2

I

со

Продолжение таблицы I

|лекулярная" Содержание гюл и этилен оксида^ ¡наоса окси-

од {

; Наименование пп ) соединения

|0тилир

• ами-

дов

П-2

п-3

п-4 ! п-5 ! п-б

I

п-7

Оксиэтилированные: 1..формамид

2. Формамид

3. Зормамид

4. Ацетил этанол амин

5.

6.

7. Ац етил ац етамид

8. йетилацетамид

9.

Ю.Ацетилацетамвд

11.

12. Ацетилдиэтаноламин

13.

14. /-"15.

16. Трифторацётилэтано-ламин

133 177 220 179 213 232 230 370 407 225 270 348 387 460 49 9

421

3,5

1.9

1Л - , -

11,8. 20,2 1,9

1,5 . 6,0 15,6 8.3 1

13,4 20.5 - -

4.0 б Л 3,0 - \о

3,4 - -

3,9 - 9,9 11,3 10,0 1

- - ■ -

15,2

10,9 1,9

Для более полной характеристики физико-химических свойств новых классов соединений в данной работе определены значения вязкости оксиэгилированных амидов при 20°С и 65°С. Установлено, что кинематическая ьдз кость оксиэтилированных амидов четко зависит от их химической структуры и повышается с увеличением степени полимеризаций и удлинением оксиэтильной цепи, что согласуется с литературными данными А. ,1965; Шенфельд К.Д982; Привал-ко В.,1963). ■

Зависимость молекулярно-массового распределения полимергомо-югов о ксиэтилированных амидов от условий синтеза. '

Известно .(Шенфельд К,1982), что при оксиэтилировании амидов высокомолекулярных карбоновых кислот в зависимости от условий синтеза получается продукт с различным молекулярно-массовым распределением, прр этой образуется ряд побочных продуктов и остается высокая доля неррореагировавшего исходного вещества. Поэтому представляло интерес исследовать влияние различных параметров реакции оцсиэтилирования амидов (количество катализатора, соотношение реагентов, температурного интервала и давления), чтобы получить окси-этилированные амиды с заданной степенью полимеризации и молекуляр-но-массовым распределением на примере синтеза оксиэтилированного У -ацетилэтанолвиина (п-З-Ю при минимальном содержании примесных, продуктов реакции: оказалось, что оптимальными условиями синтеза оксиэтилированного /V' -ацетилэтанолаыина со степенью полимеризации 3-4 и молекулярной массой 239 является: t »Ю0°С, мольное соотношение окись этилена амид 4:1 в присутствии 0,008 М КОН в качестве катализатора (рис.1). При данных'условиях выход продукта максимальный о минимальным количеством примеси полиэтиленгликолей. Молекулярно-массовый состав полученного соединения (рис.1) сле-дувщий: п-3-0,3968; п-4-0,3649; п-5-0,126В. ;п-6-0,0326; ПЭО-О,0768.

С увеличением температуры реакции и повышении содержания окиси этилена приводит к образованию большого числа примесей по-лиэтиленоксидов. Изучены кинетические параметры реакции: константы расходования окиси этилена и Ь/ -ацетилэтанодашна и образования продуктов оксиэтилирования ; константы распределения полимер-гомологов ; энергии активации для каждого компонента смеси. Установлено, что расходование исходных реагентов идет по реакции I порядка, а образование лолимергомологов - по реакции II порядка.

а б

Рис.1. а) Изменение мольных долей полимергомологов /У'-аце-тилэтаноламина во времени.

б) Изменение мольных долей полимергомологов полиэти-ленгликолей во времени.

Условия реакции: 100°С,катализатор - 0,008 М КОН, соотношение окиси этилена : амида (4:1).

Исследование острой токсичности оксиэтилированных амидов. Известно (Голубев А.,1973), что токсичность веществ в гомологических рядах коррелирует с параметрами гидрофобности химических соединений. Одним из параметров, характеризующих гидрофобность соединений, может служить гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ) молекулы. В доступной литературе не обнаружено данных об уровне токсичности оксиэтилированных амидов, поэтому представляло интерес исследовать влияние оксиэтилирования на токсичность оксиэтилированных амидов • по сравнению с исходными "стартовыми веществами", сопоставляя эти данные с показателями ПБ из молекул. Для расчета ГЛБ использовался метод оценки свободных энергий молекул (Мельник А. Д988).

В рядах оксиэтилированных полимергомологов амидов отмечена

четкая зависимость гидрофильно-липофильного баланса их молекул от степени оксиэтилирования. С увеличением количества оксиэтиль-ных звеньев повышается гидрофильность соединений. Все исследованные оксиэтильные производные амидов по степени токсичности (ДД-50) относятся к классу малотоксичных, кроме оксиэтилированного триф-торацетилэтаноламина, который является токсичным веществом.

При наращивании числа оксиэтильных групп в молекулах амидов получены вещества, как правило, с менее выраженной токсич-' иостыо по сравнении с исходными амидами.

Цитотоксичиость и криопротекторная активность оксиэтилирован-ных амидов при криоконсервировании клеток костного мозга крыс.

При сравнительном исследовании цитотоксичности и криопротекторной активности оксизтилированных амидов и ПЭО—100 (контроль) на клетках костного мозга было установлено, что оксиэтилированные амиды в основном характеризуется несколько более высокой цитоток-сичностыо, чем ПЭО-^ОО, в отношении миелокариоцитов. В то же время необходимо отметить, что оксиэтилированные ацетамиды со степенью полимеризации п«3-4, б, 7,9-10 практически не уступают в этом отношении ПЭО-ЛОО, сохраняя после 3-х часовой эквилибрации около 90$ жизнеспособных клеток. Выявлено также, что по сравнению с исходными, "стартовыми" амидами их оксиэтильные производные значительно менее цитотоксичны.

Сравнительный анализ криопротекторной активности, оксизтилированных амидов и ПЭО-^ОО на клетках костного мозга показал, что эти веществе защищают ми ел о кари оци ты от действия низких температур на достаточно высоком уровне. Так, высокой криопротекторной активность» обладают оксиэтилированные ацетамиды со степенью полимеризации п»3-4, б, 9-10, При криоконсервировании клеток костного мозга в присутствии данных веществ в 15% .концентрации удается получить 78-81& жизнеспособных клеток. Указанные вещества могут быть рекомендованы для детального изучения их криопротекторной активности при замораживании клеток костного мозга и других клеточных суспензий. Следует отметить, что по сравнению с исходными амидами их оксиэтильные производные намного эффективнее в качестве криопротекторов.

Цитотоксичиость и криопротекторная активность оксизтилированных амидов при криоконсервировании перевиваемой культуры СП5В

При изучении влияния оксизтилированных амидов на клетки культуры СГОВ было выявлено, что наименьшей цитотоксичностыо в отно-

шении этих клеток обладают оксиэтилированный ецетилдиэтаколамин со степенью полимеризации п»5-6, 8-9, а также оксиэтилированный ацетилэтаноламин со степень» полимеризации п«3-4. Экспозиция клеточной культуры с данными веществами приводит к незначительным повреждениям клеток, количество жизнеспособных клеток на уровне контроля - 85-95$. Введение заместителей к атому'азота независимо от его природы (донор либо акцептор, формамид, метил ацетамид, аце-тилацетамид, трифгорецетилэтаноламин) приводило к увеличению ци-тотоксичности. С'ксизтилированний формилэтаноламин при экви-либрации с клеточной культурой С ГШ сохраняет 29,5'/» жизнеспособных клеток, а с повышением концентрации до 10$ сохранность клеток уменьшилась до 0,85$. Оксиэтилированный метилацетамид и оксиэтилированный ацетилацетамидоказывали токсическое действие, вызывая гибель 42-50$ клеток. Значительной токсичностью по отношению к клеткам СПЭВ обладал и оксиэтилированный трифторацетилэтаноламин. Увеличение концентрации указанного вещества в суспензии клеток до Ю£ приводит к полной гибели клеток.

После замораживания клеточной суспензии СПЭВ По разработанной нами программе с применением изученных оксиэтилированных амидов в качестве криопротекторов удалось получить от 0 до 96$ жизнеспособных клеток. При этом наиболыаей криопрогекторной активность«) (96$ жизнеспособных клеток) по отношению к клеткам культуры СПЭВ обладал оксиэтилированный ацетилэтаноламин со степенью полимеризации 3-4.

Зтоксилаты Л/-ацетилэтаноламина, полученные при различном соотноиении окиси этилена и емида, содержащие меньше 60$ целевой фракции 3-4, оказывали менее выраженное криопротекторное действие (табл.2).

При изучении влияния оксиэтилированных аывдов и ПЭ0-400 на ыитотический режим клеток СПЗВ при криокоисервации было установлено (табя.З), что митотическея активность клеточных элементов, криоконсервирбванных с ПЭСМОО, после размораживания снижалась почти в 8 раз по сравнению о контролем. При криоконсервировании клеток СПЗВ с оксиэтилированным ацетилэтаноламином п»3-4 митотическея активность размороженных клеток достигала контрольного уровня на различных сроках культивирования (до 3-х суток). В то же время митогическИй индекс клеток, криоконсервированных с П30-400 и^на 3-й сутки оставался достоверно ниже контрольного.

- X1» -

Таблица 2

Зависимость хриозащитной эффективности оксиэтилироран-ного ецетилэтаноламина от условий синтеза олигомергомологов

Соотцо- ¡Содержание ,!1изнеспособ-,! Сроки формирования монослоя и

пение ¡фракции ¡ность клеток) его характеристика АЦЭ&М:0Э 3-4, % ¡после замора4

__I _{ живания . ! _

5-е сутки-неполный монослой ( 507.)

2-е.сдеки-непоинй монослой ^-е^т^и .полный монослой -и сутки.полный монослой

: 0 - 56,4+1,6

: I 15.8 . 64,2+0,12

5 2 26,2 69.7+2. II

: 3 43,1 66,1+1 ,«2

; 4 63,4 96,3+1,31

» 5 .52,0 94,8+1,62

: 6 52,0 82,4+2,14

^-е^т^и,полный монослой ^-е^тки, полный монослой ?-иЖки.полный монослой

Таблица 3

Митотический режим клеток СПЗВ после криоконсервирования о различными криопротекгорами

Криопротектор

Т

Митотический индекс. %

I после 24 ч

после 48 ч ! роста

после 72 ч

Контроль (натив- 33,3+1.5 39,0+6,1 43',0+1.5

ные клетки) Р< 0,05 Р < 0,05 Р < 0,05

ПЭО-400 3,7+1,0 14,0+4,0 . 32,0+2,0

Р< 0,001 Р<0,01 Р< 0,05

Оксиэтилированный 38,2+3,4 42,3+1,2 ■ 42,6*2,6

ацетидэтаноламин С п*3—4 5 Р<0,05 ? ^ 0,05 Р < 0,05

Следовательно, анализ мигогического режима клеток можно использовать как перспективный метод при выборе криозащитных веществ, используемых в целях долгосрочного низкотемпературного хра нения клеточных популяций. ,

Таким образом, оксиэтилированный ацетилэтаноламин со степенью полимеризации 3-4 можно считать эффективным криопротекгором и рекомендовать его для практического применения при криоконсер-вировании перевиваемой клеточной культуры СПЭВ.

выводи

1. Синтезированы не описанные ранее аддукгы оксида этилена

с алифатическими амидами низкомолекулярных кислот (19 соединений). Модифицирован способ анализа молекулярно-массового распределения полимергомологов оксиэтилированных амидов, позволяющий одновременно определить количество примесных соединений.

2. Экспериментально обоснованы оптимальные условия проведения реакции оксиэгилирования //-ацетилэтаноламина по соотношению исходных веществ, катализатору, температуре И времени реакции для получения максимального выхода оксиэтилированных полимергомологов с определенным молекулярно-массовым распределением и минимального содержания побочных продуктов (полиэтиленоксидов) в реакции окси-этилирования. Такими условиями для- синтеза Л'-ацетилэтаноламина с п«3-4 является: соотношение амид : окись этилена 1:4 в присут -ствии катализатора КОН (0,008 М) времени реакции - 100 мин, температуре реакции - ICQ°C.

3. Определены кинетические параметры синтеза оксиэтияирован-ного /^-ацетилэтаноламина : константы скоростей расходования окиси этилена и Л'-ацетилэтаноламина и образования продуктов окси-этилирования; константы распределения полимергомологов; энергии активации для каждого компонента смеси. Установлено, что расходование исходных реагентов является реакцией I порядка, а образование полимергомологов - реакцией П порядка.

Оксиэтилирование алифатических амидов приводит в болывин^ стве случаев к снижению острой токсичности по сравнению с исходными амидами. Все исследованные оксиэтильные производные амидов (19 соединений), кроме трифторацетилэтаноламина, по степени острой токсичности (ДЛ-50) относятся к классу малотоксичных соединений. . ■ ■ -' .

5. Оксиэтилированные полимергомологи амидов оказывают на клетки костного мозга крыс и клетки культуры СПЗВ менее выраженное цитотоксическое действие, чем исходные, "стартовые соединения.

6. Криопротекторная активность оксиэтилированных амидов при .криоконсервировании клеток костного мозга крыс зависит от их

молекулярно-массового состава. Показано, что наиболее перспективными криолротекторами в отношении клеток костного мозга в ряду изученных веществ являются оксиэтилированные ацетамвды со степеньв полимеризации п»3-4, 6,9-10.

7. Оксиэтилированный Л'-ацетилэтаноламин со степенью полимеризации Э-^ и средней молекулярной массой 213 обладает высокой криопротекторной активностью при криоконсервировании перевиваемой клеточной культуры СПЭВ и моасет быть использован в практике крио-консервирования этих клеток.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. А.с. 1448627 С07 С103/38, А 01 К 1/02. Способ получения криопротекгора ( соавт .Грищенко В.И.Данина Л.А.,Шраго М.И.и др. 0публ.1.09.88 г.).

2. Синтез, структура, криопротекюрные свойства оксиэтилиро-ванных амидов при применении их для консервирования клеточных суспензий /Сб.научн.тр."Патофизиологические аспекты действия холода на организм".-Харьков.-1989.-С.89-93 (соавт-Луговой В.11.Данина Л.А.,Шраго М.И.и др.).

. 3. Применение криопротекторов при создании коллекции перевиваемых культур человека /Тез.докл.I Всесопз.конф."Геном человека". -Переяславль-Залесский.-1950.-С.37 (соавт.В ерховекая Л.3.,1уго-вой В .И. Данина Л.А.).

•4. Морфофункциональная сохранность макрофагов, крио кон сервированных под защитой оксиэтилироваиного Л'-ацетилэтаноламина /Сб. научн .тр."физико-химические свойства и биологическое действие криопротекторов".Харьков-1990.-С.67-71 (Добасенко Н.П.Данина Л.А.)

5. Криопротекюрные свойства поли этил еноксида-400 в зависимости от молекулярно-массового распределения /Сб.науч.тр."физико-химические свойства и биологическое действие криопротекторов". Харьков.-1990.-С.76-81 (соавт.Луговой В.И.,Шраго М.И.Данина Л.А. и др.).

6. Синтез й свойства новых криопротекторов-аддуктов оксида этилена с амидами низкомолекулярных жирных, кисдот /Тез.докл.4 Все-союз.конф.по химии и физикохимии олигомеров.-Нальчик.-1950.-С.240.

7. Оптимизация фракционного состава криопротектора ПЭО-4ЦО / Тез .докл.4 Всесоюз .конф. "Водорастворимые полимеры и их применение". Иркутск.-1991 .-С.213 (соавт.Луговой В.И.Данина Л.А.и др.).

8. Синтез, свойства криопротекторов на основе водорастворимых аддукгов оксида этилена о амидами и полиолами /Тез.докл.1» Всесовз. конф. "Водорйстворимые полимеры и их применение" .-Иркутск.-1991 .-C.23Î (ооайт.Ханйна Л.А..Луговой В.И.).

9. ТоксинолоЁические свойства и криопротекторная активность охсйэтилирбванных ацетилэтеноламйнов /Тез.докл.б съезда фармакологов УССР "фармакология¡состояние и перспективы исследования".-Харьков.-25-27 сентября 1990 г.-С.бб ( соавт.Гучок В.М.Данина Л.А. и др.).

,10. Жидкостная хроматография аддукгов оксиэтилированных амидов / Теэ.Докл.У Б сесоюз. симпозиума го молекулярной жидкостной хроматографии.Рига.-1990.-С.НО (соавт.Ханина I.A.).

II. Изучение криозадигной эффективности ряда алкил-.этоксил-производннх полиолов и амидов на спермиях человека / П Международная конф."Успехи современной криобиолоГии".-Харьков.-1992.-С.77. (соавт.Калугин Ю.В..Лучко H.A..Черныш E.H.,Кощий C.B.).

Считав своим долгом выразить искреннвв и глубокую признательность старшему научному сотруднику, кандидату химических наук Хайиной Лгдмиле Анатольевне за постоянное внимание к работе, за научные консультации и помощь при обсуждении результатов.

йс/ „—-

V / / —

Поди, к печ. о о Формат 60x84'/,,. Бумага «и. Печать офсетная. Усл. печ. л.

Уч.-изд. л. ' О Тираж /•£<;> экз. Зак. № Бесплатно.

Харьковское межвузовское арендное полиграфическое предприятие. 310093, Харьков, ул. Свердлова, 115.