Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Новые антипротозойные средства и их фармако-токсикологическая характеристика

ВАК РФ 06.02.03, Звероводство и охотоведение

Автореферат диссертации по теме "Новые антипротозойные средства и их фармако-токсикологическая характеристика"

На правах рукописи

БОДРЯКОВА МАРИЯ АНАТОЛЬЕВНА

НОВЫЕ АНТЕШРОТОЗОЙНЫЕ СРЕДСТВА И ИХ ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ

на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

6 АПР 2015

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, А.В. Коваленко

г. Новочеркасск - 2015

005566886

Работа выполнена в федеральном Государственном бюджетном научном учреждении Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт

Научный руководитель доктор ветеринарных наук, доцент

Коваленко Александр Владимирович

Официальные оппоненты: Беспалова Надежда Сергеевна доктор

ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный аграрный университет имени Императора Петра I», профессор кафедры паразитологии и эпизоотологии

Абрамов Владислав Евгеньевич доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений имени К.И. Скрябина», ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии

Ведущая организация ФГБОУ ВПО «Донской государственный

аграрный университет»

Защита диссертации состоится « 23 » апреля 2015 года в «15-00» часов на заседании диссертационного совета Д 006.004.01 при ГНУ ВНИВИПФиТ Россельхозакадемии по адресу: 394087 г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114 б

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Российской академии сельскохозяйственных наук

Автореферат диссертации разослан «_»_2015 г.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

Ермакова Татьяна Игоревна

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы.

Болезни сельскохозяйственных животных и птиц остаются одной из самых сложных проблем животноводства (К.И. Абуладзе, 1975; Д.Н. Антипин, 1965; А.И. Кириллов, 2008; Saleh Al-Quraishy, 2012; J.J. Zhang, 2013). Для сохранения благополучия в животноводстве и птицеводстве необходимо расширение арсенала средства для борьбы как с бактериозами, так и с паразитарными болезнями. Без решения этого вопроса трудно ожидать быстрого восстановления животноводства в России и Ростовской области, в частности (H.A. Колабский, 1974; А.Ф. Кольчик, 2014).

К заболеваниям, наносящим значительный ущерб животноводству, относится кокцидиоз. Уровень заболеваемости кокцидиозами в России составляет, в зависимости от региона, климатических условий, технологии содержания, кормления животных, от 30 до 70%, при этом в птицеводстве и кролиководстве летальность может достигать 100 % (H.A. Колабский, 1974; Н.М. Лапшин, 1980; C.B. Леонтюк, 1953; Е.А. Логачева, 2002).

Несмотря на значительное количество выполненных работ отечественными и зарубежными учеными, не найдено радикальных мер борьбы с этой инвазией (Б.Л. Дубовой, 1981; H.A. Колабский, 1974; А.Е. Хованских, 1990; Ю.Н. Шиляева, 2004; М. Kennedy, 2001; M. Thrusfield, 1995). Остается много нерешенных проблем, требующих внимания. К таким проблемам относится: быстрое развитие у кокцидий резистентности к лекарственным препаратам, специфичность в выработке иммунитета; высокая устойчивость ооцист во внешней среде (Д.Н. Антипин, 1965; Б.Л. Дубовой, 1972; Кетема Бекеле Эсубалеу, 2002; А.И. Кириллов, 2008; А.Е. Хованских, 1990).

Следствием этих обстоятельств является необходимость синтеза и скрининга среди новых веществ соединений с высокой протистоцидной активностью, низкой токсичностью, недорогих, простых в применении.

Следует подчеркнуть одно важное обстоятельство — это отсутствие в современных кокцидиостатиках активно действующих веществ (АДВ) российского производства. В отечественной ветеринарии практически отсутствуют многие звенья производства ветеринарных препаратов. Страна находится в зависимости от зарубежных фармацевтических фирм. Многие химиотерапевтические средства для животноводства поступают к нам в виде премиксов или растворов с содержанием АДВ от 5 до 10 %. Средства, производимые на территории России - это либо «комбитеры» из известных препаратов, либо препараты-дженерики (М.Н. Аргунов, 1998; И.Ф. Горлов, 2001; Л.Н. Фетисов, 1991; S.B. Singh, 2002).

Нахождение соединений нового класса с высокой протистоцидной активностью in vitro и in vivo является трудной задачей, так как подобные соединения среди новых типов органических структур встречаются редко (Ю.Б. Белоусов, 1997; А.Б. Розенблит, 1984).

Объект исследования:

Простейшие вида Colpoda steinii, бактериальные культуры Е. coli Ol5 и St. aureus R209, лабораторные крысы, морские свинки, кролики породы Советская шиншилла, Новозеландская белая и Колифорнийская, цыплята породы Ломан Браун, перепела породы Фараон.

Предмет исследования: протистоцидные, антибактериальные, токсикологические и терапевтические свойства новых производных органических соединений.

Научная гипотеза.

В ГНУ «Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт» Россельхозакадемии проводятся объемные исследования по синтезу и испытанию биологической активности новых органических соединений. В частности, синтезировано и испытано более 600 соединений на протистоцидную активность на модели Colpoda stienii, в том числе соединений из ряда поверхностно активных веществ и производных имидазольных систем. Была обнаружена высокая активность в концентрации

4

менее 1 мкг/мл, в то время как коммерческие противококцидийные препараты обладали активностью > 30 мкг/мл.

Мы предположили, что высокая активность испытанных соединений in vitro на модели Colpoda stienii обусловлена повышенной чувствительностью данного вида простейших к химическим соединениям и, следовательно, нужны дополнительные исследования, которые определили бы, какие из препаратов, имеющих тот или иной уровень активности in vitro, целесообразно испытывать на животных или птице.

Цель исследования. Изучить новые протистоцидные средства и разработать способы их применения при кокцидиозах, а также терапевтическую эффективность при кокцидиозах (эймериозах) кроликов и птиц новых органических соединений, обладающих значительной протистоцидной активностью in vitro с минимальной ингибирующей концентрацией (МИК) 1-50 мкг/мл.

Для достижения намеченной нами цели были поставлены следующие задачи исследования:

1. Провести скрининг новых соединений на протистоцидную и антибактериальную активность.

2. Изучить фармако-токсикологические свойства амидов жирных кислот и 1,3-дизамещенных 2-иминобензимидазолина с высокой протистоцидной и антибактериальной активностью на лабораторных животных, птице и продуктивных животных.

3. Изучить терапевтическую и профилактическую эффективность 1,3-дизамещенных 2-иминобензимидазолина при кокцидиозе (эймериозе) кроликов и цыплят.

4. Изучить профилактическую и терапевтическую эффективности амидов жирных кислот при кокцидиозе (эймериозе) кроликов и цыплят.

Научная новизна.

Обширный скрининг новых соединений выявил вещества с высоким уровнем протистоцидной активности в ряду амидов жирных кислот и

5

производных бензимидазола. Изучены фармако-токсикологические характеристики этих веществ. Выявлена терапевтическая эффективность новых соединений при кокцидиозах (эймериозах) кроликов и птиц.

Впервые обнаружена терапевтическая эффективность поверхностно активных веществ для лечения кроликов и птиц при кокцидиозе (эймериозе).

Впервые испытан метод по определению экстрагированного N-(3-диметиламинопропил) амида миристиновой кислоты при изучении остаточных количеств препарата в яйцах перепелов.

Научная новизна подтверждена патентами: патент РФ № 2514007(13) С1 «Протистоцидная активность 2-(4,5-дихлоримидазолил-1)-5 нитропиридина» (Опубликовано: 27.04.2014 Бюл. № 12); патент РФ № 2526166 «Способ лечения кокцидиоза птиц» (Опубликовано: 25.06.2014).

Теоретическая и практическая значимость работы.

Впервые выявлена возможность разработки эффективных противококцидийных препаратов в ряду 1,3-дизамещенных 2-аминобензимидазолина и амидов жирных кислот. Была разработана фармакологически приемлемая форма амидов жирных кислот.

Предложен способ лечения кокцидиоза птиц.

Апробация работы.

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на:

Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение устойчивого развития отраслей животноводства Российской федерации». - Новочеркасск, 2012 г; Международном паразитологическом симпозиуме «Современные проблемы общей и частной паразитологии», Санкт-Петербург 15-16 ноября 2012 г; Всероссийской научно-практической конференции «Научные проблемы и современные1 тенденции развития отечественного животноводства в условиях ВТО ». - Новочеркасск, 2013г; XXIII международной агропромышленной выставке «АГРОРУСЬ», Санкт-Петербург 26 - 29 августа 2014 г. в номинации «За достижения в области сельскохозяйственной науки» золотую медаль получил патент РФ №

6

2514007(13) С1 «Протистоцидная активность 2-(4,5-дихлоримидазолил-1)-5 нитропиридина».

Публикации. Основные положения диссертации отражены в 6 научных работах в том числе: 4 в изданиях рекомендованных ВАК; 1 в изданиях, рецензируемых Scopus; i в трудах Всероссийских конференций и съездов.

Личный вклад. Представленная работа является продуктом личных исследований автора. Самостоятельно были проведены экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ данных. Синтез новых органических соединений проведен в лаборатории химического синтеза ГНУ СКЗНИВИ Россельхозакадемии к.х.н. A.A. Зубенко. Изучение протистоцидной активности исследуемых соединений in vitro было проведено по методике, разработанной совместно с A.A. Зубенко, Л.Н. Фетисовым, А.Н. Бодряковым.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы. Работа изложена на 130 страницах компьютерного текста, содержит 32 таблицы и 6 рисунков. Библиографический список включает 201 источников, в том числе 79 зарубежных.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Производные имидазольных систем обладающие протистоцидной активностью, и их фармако-токскологическая характеристика.

2. Производные амидов жирных кислот, обладающие протистоцидной активностью, и их фармако-токскологическая характеристика.

3. Структурная характеристика амидов жирных кислот и их взаимосвязь с уровнем активности.

4. Лечебно-профилактическая активность новых соединений при кокцидиозах животных и птиц: соединений из ряда амидов жирных кислот, соединений из ряда 1,3-дизамещенных 2-иминобензимдазолина,

2. Материалы, методы и методика исследований

Диссертационная работа выполнялась в период с 2010 по 2014 гг. в Государственном научном учреждении Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных (ГНУ СКЗНИВИ Россельхозакадемии) в соответствии с заданием 08.02.02 Плана фундаментальных приоритетных прикладных исследований Россельхозакадемии по научному обеспечению развития АПК Российской Федерации на 2011-2015 гг.

Лабораторные исследования были выполнены в лаборатории химического синтеза и межлабораторном диагностическом центре ГНУ СКЗНИВИ Россельхозакадемии.

Методика работы была комплексной и включала в себя клинические, патологоанатомические и копрологические (К.И. Абуладзе, 1975; H.A. Колабский, 1974; А.Е. Хованских, 1990), микробиологические (Г.Н. Першин, 1971), фармако-токсикологические (Р.У. Хабриева, 2005; И.Т. Фролов, 1965) статистические (Г.Ф. Лакин, 1990; Першин, Г.Н., 1971), а также авторские методы исследований.

В лабораторных исследованиях использовали половозрелых самцов и самок белых крыс с живой массой 70-190 г (п=350); кроликов породы Советская шиншилла, Новозеландская белая и Калифорнийская массой 2501800 г (п=200); морских свинок с живой массой 250-300 г (п=53); цыплят породы Ломан Браун 40-150 г (п=2156); перепелов породы Фараон (п=170).

Опытные и контрольные группы формировались по принципу пар-аналогов. При проведении опытов на лабораторных животных и птицах придерживались требований к врачебно-биологическому эксперименту (Фролов И.Т., 1965; Р.У. Хабриева, 2005).

2.1. Протистоцидную активность изучали по разработанной нами методике, включающей приготовление ряда известных концентраций изучаемого соединения в виде серийных разведений и использование в качестве тест-объекта трехсуточной культуры простейших вида Colpoda steinii. Методика подробно описана в материалах Международного паразитологического симпозиума «Современные проблемы общей и частной паразитологии» (СПб, 15-16 ноября 2012 г)

2.2. Антибактериальную активность изучали на жидких питательных средах методом серийных разведений (Першин Г.Н., 1971). На этом этапе (скрининг активных соединений) использовали две культуры: Е. coli 015 и St. aureus R209.

2.3. «Острую» и «хроническую» токсичность исследуемых веществ определяли согласно «Методам экспериментальной химиотерапии» на белых крысах, кроликах и цыплятах (Г.Н. Першин, 1971).

Расчет ЛД50 проводили по методу Кербера (Першин Г.Н., 1971).

При изучении «хронической» токсичности на лабораторных крысах через сутки после окончания введения препаратов брали пробы крови опытных и контрольных животных для гематологических и биохимических исследований. Биохимические исследования проводили в межлабоаторном диагностическом центре ГНУ СКЗНИВИ Россельхозакадемии на автоматическом анализаторе EOS Bravo forte (Hospitexs Diagnostics Italia), гематологические исследования - на автоматическом анализаторе Неша Screen 18 (Hospitexs Diagnostics Italia).

Влияние амида миристиновой кислоты при длительном применении (в течение 7 месяцев) на рост и развитие птицы устанавливали при выпойке 0,01 % раствор амида миристиновой кислоты перепелам породы Фараон с первого дня жизни. Раствор препарата давали 14 дневными циклами с перерывами по 14 дней. Перепелам контрольной группы давали воду без препаратов. Рацион кормления птиц обеих групп был однотипным.

2.4. Оценку местно-раздражающего действия исследуемых веществ проводили в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», под редакцией Р.У. Хабриева, 2005 г.

2.6. Лечебно-профилактическую эффективность новых веществ, при эймериозе ("кокцидиозе) изучали при спонтанной инвазии кроликов и экспериментальном заражении цыплят.

2.6.1. Определение лечебно-профилактической эффективности новых веществ при спонтанной инвазии кроликов (Е. media, Е. magna, Е. irresidtia).

При определении лечебной эффективности формировали опытные и контрольные группы по 5 голов в возрасте 21-45 дней. Растворимые соединения давали в виде 0,01 % водных растворов свободной выпойкой, нерастворимые вещества давали внутрь в виде порошка в дозе 20 мг/кг массы тела. Терапевтическую эффективность оценивали по сохранности животных, длительности переболевания и по результатам копрологических исследований до начала и по окончании опыта.

При определении профилактической эффективности формировали опытные и контрольные группы по 8 голов в возрасте 15 дней. Профилактическую эффективность оценивали по сохранности животных, приросту массы и по результатам копрологических исследований.

Количество ооцист определяли методом флотации в 20 мкл надосадочной жидкости пробах кала кроликов.

2.6.2. Определение лечебно-профилактической эффективности новых веществ при экспериментальном кокцидиозе цыплят (Е. tenella, Е. necatrix и Е. acervulind).

Определение лечебной эффективности новых веществ, при экспериментальном кокцидиозе цыплят проводили по следующей методике: для заражения использовали спорулированые ооцисты видов Е. tenella, Е. necatrix и Е. acervulina. Материал содержал не менее 70% спорулированых ооцист, с содержанием в 1 мл 65-75 тыс. ооцист, объем заражающей дозы

10

составлял 0,4 мл, заражение осуществляли путем введения в зоб. Цыплята опытных групп (14 дневного возраста) получали испытуемые препараты в виде 0,01 % водных растворов свободной выпойкой с момента появления первых признаков заболевания. Группы формировали по 5-10 цыплят. Контрольные группы получали воду или препарат сравнения. Препараты начинали вводить при появлении первых признаков болезни. Терапевтическую эффективность оценивали по сохранности и интенсивности кокцидийной инвазии.

При определении профилактической эффективности цыплята опытных групп (14 дневного возраста) за 12 часов до заражения начинали получать испытуемые препараты. Контрольные животные получали воду либо препарат сравнения.

Лечебно-профилактическую эффективность оценивали по сохранности, длительности переболевания, приросту массы тела и интенсивности кокцидийной инвазии. Количество ооцист определяли методом Дарлинга.

2.5. Получение фармакологически приемлемых водорастворимых форм амидов жирных кислот

Водорастворимые соли амидов жирных кислот получали путем прибавления одного эквивалента соответствующей кислоты к водной эмульсии соответствующего амида с последующим кратковременным (15-20 мин) перемешиванием при 50-80 °С до образования прозрачного раствора.

«Острую» токсичность соединений изучали на лабораторных крысах при внутрижелудочном введении водных растворов амидов жирных кислот по общепринятой методике (Першин Г.Н., 1971).

2.1. Эмбриотоксическое действие препарата изучали по методике, описанной в книге «Методы экспериментальной химиотерапии» под ред. Г.Н. Першина, 1971, С. 534-535.

2.8. Изучение остаточных количеств препарата в яйцах перепелов проводили по усовершенствованной методике A.A. Зубенко (2014) по определению экстрагированного амида.

Перепелам 60-дневного возраста (п=20) свободной выпойкой в течение 14 дней давали 0,01 % раствор амида жирной кислоты (производное миристиновой кислоты «1с») вместо воды. Для анализа использовали яйца, полученные через сутки после окончания введения препарата.

Определение проводили методом тонкослойной хроматографии на окиси алюминия в хлороформе. Проявитель - пары йода. В предварительных опытах установили, что данным методом можно определить амид при концентрации не ниже 0,25 мг/мл

3 Результаты собственных исследований 3.1 Результаты скрининга новых веществ на протистоцидную и антибактериальную активность in vitro.

Изучена протистоцидная активность 150 новых соединений на простейших вида Colpoda steinii по разработанной нами методике (Зубенко A.A., Фетисов Л.Н., Бодрякова М.А. и Бодряков А.Н.) Из них нами были отобраны для дальнейших исследований следующие соединения:

1. ряда амидов жирных кислот

1(а-р) общей формулы CH3-(CH2)n-(C=0)-R, где п - число метиленовых звеньев

«2» Ы-(З-диметиламинопропил) амид олеиновой кислоты

«3» - олеиновой кислоты (3-диметилбензиламмоний-хлорид-пропил)-амид

2. производные имидазольных систем 4a-d 2-(имидазолил-1 )-5 -нитропиридин

«5»-«7» 1,3-дизамещенные 2-иминобензимидазолина

«5» - бромид 1-(3,4-дихлор-бензил)-3-(2-фенокси-этил)-1Н-бензимидазол-2-ил-амина

«6» - бромид 1-бензил-3-(2-феноксиэтил)-1Н-бензимидазол-2-ил-амина «7» - бромид 1-(3,4-дихлор-бензил)-3-(2-пара-толилокси-этил)-1Н-бензимидазол-2-ил-амина

Таблица 1. Сводные результаты поиска веществ с протистоцидной и

антибактериальной активностью

№ п/п Номер соединения Минимальные протистоцидные концентрации, мкг/мл С. steinii Минимальная ингибирующая концентрация, мкг/мл

St. aureus Е. coli

1 2 3 4 5

1 «1а» 0,90-1,95 62,50 31,25-62,50

2 «1Ь» 3,90-7,80 >250,0 >250,0

3 «1с» 0,50 6,25 6,25

4 «ld» 3,125 3,125-6,25 6,25-12,5

5 «le» 7,80 3,125-6,25 12,50-25,0

6 «lf» 1,95 6,25 6,25

7 «lg» 0,5 6,25 6,25

8 «lh» 3,125 6,25 6,25

9 «Ii» 5,0 31,25 31,25

10 «lk» 7,8 15,60-31,20 15,60-31,20

11 «II» 3,90-7,80 15,60-31,20 15,60-31,20

12 «2» 5,0 12,50-25,0 6,25-12,50

13 «3» 1,90-3,90 6,25 3,125-6,25

14 «4a» 15,60 >100,0 >100,0

15 «5» 0,50 3,90 >250,0

16 «6» 3,90 15,60 >250,0

Как видно из таблицы 1, среди изученных соединений производные амидов жирных кислот продемонстрировали высокую активность как в отношении простейших, так и в отношении бактерий. Так, производные миристиновой кислоты («lc», «ld», «le», «lf») имеют минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) в отношении С. steinii на уровне 0,507,80 мкг/мл, в отношении Е. coli - 6,25-25,0 мкг/мл; в отношении St. aureus -3,125-6,25 мкг/мл. МИК производных пальмитиновой кислоты («lg», «lh») в отношении С. steinii составляет 0,50-3,125 мкг/мл; в отношении Е. coli - 6,25 мкг/мл;' в отношении St. aureus - 6,25 мкг/мл. МИК производных олеиновой кислоты («2», «3») составляет для С. steinii 1,90-3,90 мкг/мл; 6,25-12,50 мкг/мл для Е. coli; 6,25-12,50 мкг/мл для St. aureus. МИК 1,3-дизамещенных

2-иминобензимидазолина («5» и «6») в отношении простейших - 0,50-3,90 мкг/мл; в отношении St. aureus - 3,90-15,60 мкг/мл; Е. coli - >250,0 мкг/мл.

Мы установили, что протистоцидная активность амидов жирных кислот обусловлена, главным образом, числом метиленовых групп в формуле жирной кислоты. Стабильно высокий уровень протистоцидной активности показывают производные лауриновой (число метиленовых звеньев п=10) и миристиновой (число метиленовых звеньев п=12) кислот. Обращает на себя внимание также тот факт, что соединения «1а» (лауриновая кислота), «1с», «ld» и «lf» (миристиновая кислота), содержащие некватернизованную аминогруппу, значительно более активны, чем соединения «1Ь» (лауриновая кислота) и «1е» (миристиновая кислота). Производные декановой кислоты (число метиленовых звеньев п=8) не обладают активностью против простейших.

Уровень антибактериальной активности амидов жирных кислот также зависит от числа метиленовых звеньев (п) в структуре кислоты. Производные лауриновой кислоты (п=10) имеют средний и слабый уровень активности 62,50-250,0 мкг/мл. Производные пальмитиновой (п=14) и стеариновой (п=16) кислот имеют средний уровень активности 15,60-31,20 мкг/мл. Производные миристиновой кислоты (п=12) и часть производных пальмитиновой кислоты (п=14) показали стабильно высокие уровни антибактериальной активности 3,12-12,50 мкг/мл. Следует отметить, что чувствительность к амидам жирных кислот у грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов находится на одном уровне.

Нами установлен факт, что 1,3-дизамещенные 2-иминобензимидазолина (соединения «5» и «6») проявляют более высокую активность в отношении грамположительных микроорганизмов (3,90-15,6 мкг/мл), чем в отношении грамотрицательных (> 250 мкг/мл).

При исследовании активности соединений ряда 2-(имидазолил-1)-5-нитропиридина с различными заместителями в имидазольном кольце

выяснили, что наиболее активным является 2-(4,5-дихлоримидазолил-1)-5 нитропиридин («4а») 15,60 мкг/кг.

3.2 Итоги изучения токсичности веществ

Установлено, что однократное введение в желудок лабораторным крысам амидов жирных кислот (восемь соединений с установленными полезными свойствами - высокой протистоцидной и антибактериальной активностью) в дозе 1 г/кг массы тела в виде 5,0 % водных растворов объемом по 3,0 мл на одно животное не вызывает гибели крыс в течение 15 дней после введения (срок наблюдения).

Вещества «1а» (производное лауриновой кислоты), «1с» и «1е» (производные миристиновой кислоты), «111» и «1Ь> (производные пальмитиновой кислоты), «2» (производное олеиновой кислоты) не вызывают «острой» токсической реакции белых крыс. Животные оставались живыми при удовлетворительном общем состояние в течение 15 дней после введения. Для веществ «11» (производное стеариновой кислоты) и «3» (производное олеиновой кислоты) испытанная концентрация оказалась пороговой (часть животных погибла).

Несколько более высокая токсичность кватернизованного производного олеиновой кислоты («3») в сравнении с некватернизованным производным (соединение «2») объясняется, возможно, образованием более токсичных метаболитов в случае соединения «3» при окислительной деструкции двойной связи в организме животных и птиц.

Безвредными для крыс оказались внутрибрюшинные инъекции водных растворов амидов жирных кислот в концентрации 0,10 % в объеме 1,0 мл. Внутримышечные инъекции водных растворов 0,1 % концентрации амидов жирных кислот также не вызвали у животных «острой» токсической реакции и воспалительных процессов в местах инъекций.

Результаты определения и расчета среднесмертельных доз производных амидов жирных кислот и 1,3-дизамещенного 2-

иминобензимидазолина представлены в таблице 2.

15

Таблица 2. ЛД50 амидов жирных кислот и 1,3-дизамещенного 2-иминобензимидазолина для белых крыс__

№ п/п Номер соединения ЛДюо г/кг при внутрибрюшинном введении, г/кг ЛДзо г/кг при внугрижелудочном введении, г/кг

1 2 3 4

1 «1а» 0,50 >1,0

2 «1с» 0,50 >1,0

3 «1е» 0,50 >1,0

4 «1Ь» 0,50 >1,0

5 «1Ь> 0,50 >1,0

6 «11» 0,26 0,52

7 «2» 0,50 >1,0

8 «3» 0,40 0,80

9 «5» 0,20 0,40

Рассчитанные величины ЛД5о новых соединений согласно классификации, приведенной в книге «Методы определения токсичности и опасности химических веществ (токсикометрия)» под редакцией Саноцкого И.В позволяют отнести производные лауриновой («1а»), миристиновой («1с», «1е»), пальмитиновой («1Ь», «1Ь>) и олеиновой кислот («2») к малотоксичным соединениям. Вещества «11» (производное стеариновой кислоты), «3» (производное олеиновой кислоты) и «5» (1,3-дизамещенное 2-иминобензимидазолина) относятся к среднетоксичным соединениям.

Предварительная оценка «острой» токсичности для лабораторных крыс соединений ряда 2-(имидазолил-1)-5-нитропиридина показала, что доза 300,0-400,0 мг/кг массы тела при введении внутрь безопасна для животных.

Проведенными испытаниями на цыплятах водных растворов амидов жирных кислот установлено, что дозы 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; и 1,0 г/кг массы тела не вызывают гибели цыплят при однократном введении внутрь. Таким образом можно предположить, что ЛД50 изученных соединений для цыплят составляет менее 1,0 г/кг массы тела.

«Подострую» токсичность амидов жирных кислот определяли для кроликов, крыс, цыплят и перепелов. Длительное выпаивание (15 дней) 0,01% водных растворов производных миристиновой кислоты («1с», «Ы») и

16

производных олеиновой кислоты («2», «3») не вызывает у белых крыс видимой токсической реакции. В дни наблюдения все животные оставались активными. Поведенческие реакции, аппетит, общее состояние были удовлетворительными и не отличались от таковых у животных контрольной группы. Нарушений деятельности пищеварительной системы не отмечали.

При определении «подострой» токсичности производных амидов жирных кислот для цыплят раннего возраста была проведена серия опытов.

Производные лауриновой («1а»), миристиновой («1с», «1с1», («1 Г»), пальмитиновой («1ё», «111», «П»), стеариновой («1к», «11») и олеиновой («2») кислот хорошо переносятся цыплятами раннего возраста (1-14 суток) при выпаивании водных растворов 0,01 % концентрации в течение 15 дней. Все птицы оставались живыми, аппетит и общее состояние в период наблюдения были удовлетворительными.

Мы обнаружили феномен более высокого прироста массы тела цыплят по сравнению с контролем при выпаивании некоторых производных амидов жирных кислот. Наибольший прирост массы тела отметили у цыплят, получавших с водой вещества «1с»(+22,70%), «1 Ь»(+13,27%), «Н»(+25,30%), «1к»(+14,66) «11»(+17,30%) и «2»(+11,20%). Для того чтобы более объективно оценить динамику прироста массы тела, был проведен ряд опытов на большем поголовье цыплят. Благодаря использованию производных лауриновой («1а»), миристиновой («1с»), пальмитиновой («111»), стеариновой («1к») и олеиновой («2») кислот прирост массы тела составил от 8,41 до 11,79 %.

Длительное выпаивание (30 дней «хроническая» токсичность) 0,01 % водных растворов производных лауриновой кислоты («1а»), миристиновой кислоты («1с», «I с1», «1е», «15>), пальмитиновой кислоты («1{*», «111»), стеариновой кислоты («1к», «II») и олеиновой кислоты («2») не оказывает хронического токсического действия на кроликов. Производное пальмитиновой кислоты «И» и производное олеиновой кислоты «3» нельзя

считать полностью безвредными при длительном введении, так как отход животных в этих группах составил по 20,0 %.

В период изучения «хронической» токсичности амидов жирных кислот для цыплят мы отмечали, что введение соединений этого ряда более 18 суток подряд вызывают угнетение аппетита, ухудшение общего состояния, расстройство пищеварения. В течение первых 10-12 суток, напротив, отмечали повышение сохранности птицы и прирост массы тела. Чтобы выяснить предельный срок длительности безопасного применения соединений этого ряда, организовали опыт на перепелах. Была поставлена задача выяснить уровень влияния одного из препаратов этого ряда при использовании его циклами по 14 дней с периодами перерывов по 14 дней между выпойками препарата. Полученные результаты показали, что выпаивание 0,01 % раствора амида миристиновой кислоты перепелам с первого дня жизни циклами по 14 дней с перерывами по 14 дней в течение шести месяцев не вызывает значимых токсических последствий: сохранность птицы на пятнадцатый день составила 96,6 %, на тридцатый - 93,3 %, на сорок пятый — 91,6 %. Эти данные несколько превышали показатели контрольных групп, в которой они составили 95,0, 93,3 и 90,0 % соответственно. Период яйцекладки наступил, как и в контрольной группе, в возрасте 45-48 дней, количество яиц от одной курочки составляло шесть яиц за семь дней (с возраста старше двух месяцев). Средняя масса тела перепелов в шестимесячном возрасте составляла в опытной группе 311,95 г, в контрольной группе 307,35 г. Средняя масса самцов в группах составляла в опытной - 251,60 г, в контрольной 247,20 г; средняя масса самок в опытной группе - 332,07 г, в контрольной группе - 327,40 г. Таким образом, режим выпаивания 0,01 % водного раствора производного миристиновой кислоты («1с») по 14 дней с 14-дневными перерывами не оказывает негативного влияния на организм перепелов при длительном применении (6 месяцев)^ -

3.4 Итоги изучения лечебно-профилактической эффективности новых соединений при кокцидиозе (эймериозе^ животных и птиц.

18

После того как лабораторными исследованиями был уточнен диагноз на кокцидиоз (эймериоз) кроликов, сформировали группы для испытаний новых соединений в качестве лечебных средств при этом заболевании.

В опыте по определению терапевтической эффективности при спонтанном кокцидиозе (эймериозе) кроликов испытали два соединения: из ряда амидов жирных кислот - производное миристиновой кислоты («1с»); 1,3-дизамещенное 2-иминобензимидазолина («5») (табл. 3).

Таблица 3. Терапевтическая эффективность производного миристиновой кислоты («1с») и 1,3-дизамещенного 2-иминобензимдазолина («5»)_

№ группы Номер соединения/ Препарат Количество животных Количество ооцист в пробах фецес кроликов

1 ДН. 7 дн. До опыта 7 день опыта

1 7 3 4 ч 6

1 «1с» 5 5 135,60±30,16 2,80±1,74 */*

2 «5» 5 5 125,0±22,52 4,60±3,62 */*

3 Байкокс 5 3 114,40±22,67 133,33±8,21

4 Ампролиум 5 3 128,20±17,70 73,0±14,57

5 Контрольная 5 0 125,60±15,45 -

Примечание: * - Р > 95; */* - достоверность различий в сравнении с байкоксом/с ампролиумом

Как видно из таблицы 5, оба соединения достоверно превзошли по эффективности известные кокцидиостатики Байкокс и Ампролиум как по сохранности кроликов, так и по уровню снижения количества выделяемых ооцист.

При оценке профилактической эффективности изучаемых соединений при спонтанном кокцидиозе (эймериозе) кроликов отметили, что наиболее высокой профилактической эффективностью при кокцидиозе (эймериозе) кроликов обладает водный раствор производных лауриновой («1а»), миристиновой («1с», «1(1», «1е»), пальмитиновой («1Ь») и олеиновой («2») кислот при применении свободной выпойкой в концентрации 0,01 %. Количество ооцист в этих группах снизилось с 13,50-17,65 единиц до 0,500,88 единиц, то есть у некоторых крольчат не были обнаружены ооцисты эймерий. При этом прирост массы составил от 363,75 до 411,0 г за период наблюдения. Соединения «К» (производное миристиновой кислоты) и «1к» (производное стеариновой кислоты) также оказались эффективны, но их

19

показатели несколько ниже: количество ооцист в конце опыта составило 1,50 и 1,63 единицы, прирост массы - 352,0 и 353,20 г.

Производное олеиновой кислоты («3») обладает слабым профилактическим действием при кокцидиозе (эймериозе) кроликов. У животных этой группы отмечали более низкий прирост массы тела (124,50 г), тусклость шерстного покрова, гибель составила 12,50 %.

Изучая лечебно-профилактическую эффективность амидов жирных кислот при экспериментальном кокцидиозе (эймериозе) цыплят провели ряд опытов. Копрологические исследования показали, что наиболее высокой профилактической эффективностью обладает водный раствор производного пальмитиновой кислоты («1{*») количество ооцист по окончании опыта 0-5 в одном поле зрения. Также значительную эффективность показали производные миристиновой («1с») количество ооцист 5-10, стеариновой («II») - 10-20 ооцист и олеиновой («2») кислот - 10-15 ооцист. Защитный эффект оказался не ниже, чем у Байкокса (количество ооцист по окончании опыта 12-18). При вскрытии на 10-й день характерные для кокцидиоза изменения в кишечнике нашли у цыплят, которые получали водный раствор производного стеариновой кислоты («1к») (количество ооцист по окончании опыта 50-100), и у цыплят контрольной группы (количество ооцист по окончании опыта > 100): геморрагии, слизь, неприятный запах, метеоризм, утолщение стенки слепых кишок.

В опытах по определению лечебной эффективности соединений при экспериментальном кокцидиозе (эймериозе) цыплят установили, что наибольшую терапевтическую эффективность проявило соединение «2» (производное олеиновой кислоты), сохранность составила 100 %, прирост массы в сравнении с контролем - 7,62 %. Терапевтическое действие при экспериментальном кокцидиозе проявили также производные миристиновой кислоты («Ы»), производное пальмитиновой кислоты («1^>) и 1,3-дизамещенные 2-иминобензимидазолина («5»), сохранность - по 75,0-87,50 %, прирост массы цыплят 12,17-14,33 %. Клиническое проявление заболевания у цыплят этих групп прекращалось в течение 2-3 дней, а в контрольных группах оно нарастало.

Производные лауриновой («1а»), пальмитиновой («111») и стеариновой («II») кислот не проявили защитного действия при экспериментальном

кокцидиозе цыплят. Сохранность в этих группах составила 12,50-37,50 %, масса цыплят - 132,0, 123,20 и 83,0 г соответственно.

3.3 Получение фармакологически приемлемых водорастворимых форм амидов жирных кислот

Проверили сочетаемость амидов жирных кислот с фармакологически приемлемыми кислотами на предмет изменения токсических свойств (табл.4).

Таблица 4. «Острая» токсичность амидов жирных кислот для белых крыс при введении в желудок 2,0 мл 5,0 % водных растворов амидов жирных кислот

№ группы Вещество Дни наблюдения

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15

1 «1с»+серная кислота 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

2 «1с»+сорбиновая кислота 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

3 «1с»+молочная кислота 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

4 Вода 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Примечание: «0/5»-число погибших / число живых

Таким образом, из данных таблицы 4 видно, что тип применяемой кислоты не влияет на «острую» токсичность изучаемых веществ и они низкотоксичны.

Изучение лечебной эффективности производного миристиновой кислоты в виде солей с фармакологически приемлемыми кислотами при экспериментальном кокцидиозе (эймериозе) цыплят (табл. 5).

Таблица 5. Лечебная эффективность производного миристиновой кислоты («1с») в виде солей фармакологически приемлемых кислот при экспериментальном кокцидиозе цыплят.

№ Вещество Концентрация Количество ооцист в одном

групп водных р-ров поле зрения

веществ, % В слепых кишках В тонком кишечнике

1 «1с»+серная кислота 0,01 5 5

2 «1с»+фосфорная кислота 0,01 7 1

3 «1с»+бромоводородная кислота 0,01 5 1-2

4 Вода - > 100 > 100

Таким образом соединение «1с» (производное миристиновой кислоты) обладает выраженным терапевтическим эффектом при экспериментальном

кокцидиозе цыплят, причем эффект также не зависит от типа применяемой кислоты.

3.5 Эмбриотоксическими и местно-раздражающими свойствами производное амидов жирных кислот в исследованных нами концентрациях не обладают. Существенных различий в плодовитости среди опытных и контрольной групп установлено не было. Мертворождений и абортов не наблюдали.

3.6 Итоги изучения остаточных количеств амидов жирных кислот в яйце перепела.

В изучаемых пробах методом тонкослойной хроматографии производное миристиновой кислоты - соединение «1с» - обнаружено не было.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Предложена эффективная методика оценки протистоцидной активности для отбора протистоцидных веществ. Установлено, что вещества, проявившие свою активность на модели С. steinii in vitro в диапозоне от 0,50 до 7,80 мкг/мл, могут быть использованы для дальнейшего выявления лечебно-профилактической эффективности.

2. Установлена высокая протистоцидная активность 16 соединений с минимальными ингибирующими концентрациями 0,50-20,0 мкг/мл: тринадцать веществ ряда амидов жирных кислот («1а», «1Ь» (производные лауриновой кислоты), «1с», «Id», «1 е», «If» (производные миристиновой кислоты), «lg», «lh», «li» (производные пальмитиновой кислоты), «1к», «11» (производные стеариновой кислоты), «2», «3» (производные олеиновой кислоты)) с уровнем активности от 0,50 и до 7,80 мкг/мл; два из ряда 1,3-дизамещенные 2-иминобензимидазолина («5», «6») с уровнем активности 0,50-3,90 мкг/мл; одно соединение из 2-(имидазолил-1)-5-нитропиридинов («4а») с уровнем активности 15,60 мкг/мл.

3. Выявлено, что величина протистоцидной активности амидов жирных кислот зависит от длины углеродной цепи; введение

22

кватернизованной аминогруппы в некоторых случаях снижает активность соединений этого ряда. Высокие показатели протистоцидной активности определены у производных лауриновой (п=10) и миристиновой (п=12) кислот, у производных пальмитиновой (п=14) и стеариновой (п=16) кислот-несколько ниже. Производные декановой (каприновой) кислоты не проявили протистоцидной активности.

4. Впервые установлена ингибирующая активность двойного (сочетанного) действия (протистоцидная и антибактериальная активность) у соединений ряда амидов жирных кислот: производные миристиновой («1с», «ld», «le», «lf») и олеиновой кислот («2», «3») имеют уровень протистоцидной активности от 0,50 до 7,80 мкг/мл и уровень антибактериальной активности в отношении Е. coli - 6,25-25,0 мкг/мл; в отношении Si. aureus - 3,125-6,25 мкг/мл. У соединений 1,3-дизамещенных 2-иминобензимидазолина («5» и «6») обнаружена высокая активность в отношении простейших (0,50-3,90 мкг/мл) и в отношении грамположительных бактерий (3,90-15,60 мкг/мл).

5. По параметрам острой токсичности шесть соединений ряда амидов жирных кислот можно отнести их к малотоксичным веществам (ЛД50 более 1000 мг/кг). 1,3-Дизамещенные 2-иминобензимидазолина и 2-(4,5-дихлоримдидазолил-1)-5нитропиридина, а также два соединения из ряда амидов жирных кислот («11», «3») - к среднетоксичным (ЛД50 400-800 мг/кг).

6. Разработана лекарственная форма амидов жирных кислот -водный раствор в виде солей с органическими и минеральными кислотами. Выявлено, что тип используемой кислоты не влияет на свойства производных амидов жирных кислот.

7. Впервые установлено, что терапевтической эффективностью при спонтанном кокцидиозе (эймериозе) кроликов и экспериментальном кокцидиозе (эймериозе) цыплят обладают: производные амидов жирных кислот «1с» М-(З-диметиламинопропил) амид миристиновой кислоты и имидазольных систем «5»: бромид 1-(3,4-дихлор-бензил)-3-(2-фенокси-этил)-

1Н-бензимидазол-2-ил-амина. Использование для лечения кроликов, больных кокцидиозом (эймериозом), этих соединений в течение 7 дней приводит к резкому сокращению числа ооцист в кале кроликов со 135,6 до 2,3 единиц и со 125,0 до 4,6 единиц соответственно. При лечении цыплят, больных кокцидиозом (эймериозом), производное миристиновой кислоты «1с» показало лучшие результаты, проявившиеся в полной сохранности цыплят и наибольших привесах в сравнении с контролем (25,90 %).

8. Впервые установлен высокий уровень профилактической эффективности амидов жирных кислот при эймериозе цыплят и кроликов, проявляющийся в повышенной сохранности и получении дополнительного прироста массы тела цыплят в начальный период развития. При изучении профилактической эффективности исследуемых веществ наиболее эффективным оказалось «1с».

Практические предложения

1. Результаты изысканий антипротозойных средств среди производных амидов жирных кислот и имидазольных систем позволили предложить использовать их для разработки новых ветеринарных препаратов.

2. По совокупности полезных свойств (антибактериальной и протистоцидной активности, фармако-токсикологической оценке, лечебно-профилактической эффективности) соединение «1с»: Ы-(З-диметиламинопропил) амид миристиновой кислоты может быть рекомендовано для использования в качестве активно действующего вещества при создании новых противококцидийных препаратов.

3. Материалы данной работы могут быть использованы при составлении учебных пособий и руководств по химиотерапии инвазионных болезней животных и птиц для студентов, обучающихся по специальности «Ветеринария».

Список трудов

1. Зубенко A.A., Фетисов JI.H., Бодряков А.Н., Бодрякова М.А., Жила Е.В., Морковник A.C., Диваева Л.Н. Кокцидиоз, проблемы лечения, скрининг новых протистоцидных веществ - Ветеринарная патология, 2012. -№ 4 (42). - С. 64-66

2. Фетисов Л.Н., Зубенко A.A., Бодряков А.Н., Бодрякова М.А. Изыскание новых протистоцидных средств - Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. Материалы Международного паразитологического симпозиума «Современные проблемы общей и частной паразитологии» 15-16 ноября 2012 г. - № 4/1. — С. 70-72.

3. Фетисов Л.Н., Бодряков А.Н., Зубенко A.A., Бодрякова М.А., Литвинова И.Ю. Определение антибактериальной активности веществ из ряда амидов жирных кислот - Материалы Всероссийской научно-практической конференции 20-21 июня 2013. - Новочеркасск, 2013 - С. 8284.

4. Бодрякова М.А., Фетисов Л.Н., Зубенко A.A., Бодряков А.Н., Коваленко A.B., Лященко Л.А., Жила Е.В. Определение антибактериальной активности новых веществ из ряда амидов жирных кислот — Ветеринарная патология, 2014. - № 1 (47). - С. 55-60

5. Диваева Л.Н., Морковник A.C., Зубенко A.A., Бодрякова М.А. и др. Синтез, антимикробная и протистоцидная активность гидрохлоридов 1-арилоксиэтил-(бензил)-3-карбомилэтил-2-иминобензимидазолинов. -Химико-фармацевтический журнал, 2014. - Том 48, № 10. - С. 91-94. БД Scopus, Web of Scopus.

6. Бодрякова M.A., Коваленко A.B., Зубенко A.A., Фетисов Л.Н., Бодряков А.Н. Скрининг протистоцидной ативности новых веществ из ряда амидов жирных кислот - Известия Оренбургского государственного аграрного университета, 2014. - № 6 (50). — С. 83-85

Подписан в печать 18.3. 2015 г

Объем 1 п.л._ ■ Тираж 100 экз._ Заказ № 055

Отдел оперативной полиграфии НГМА, 346428, г. Новочеркасск, ул. Пушкинская, 111