Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Синтез и фармако-токсикологическая характеристика ветеринарных противопаразитарных и антибактериальных препаратов в ряду азотсодержащих гетероциклов

ВАК РФ 06.02.03, Звероводство и охотоведение

Автореферат диссертации по теме "Синтез и фармако-токсикологическая характеристика ветеринарных противопаразитарных и антибактериальных препаратов в ряду азотсодержащих гетероциклов"

На правах рукописи

Зубенко Александр Александрович

СИНТЕЗ И ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРОТИВОПАРАЗИТАРНЫХ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ В РЯДУ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ

ГЕТЕРОЦИКЛОВ

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

14 ОКТ 2015

г. Казань-2015

005563302

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт

Научный консультант: член-корреспондент РАН, профессор

Клименко Александр Иванович

Официальные оппоненты: Усенко Виктор Иванович

доктор биологических наук, профессор кафедры анатомии, патанатомии и гистологии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана» Ежкова Асия Мазетдиновна доктор биологических наук, заведующая отделом животноводства ФГБНУ «Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения» Сайтов Вадим Расимович доктор биологических наук, заведующий сектором электронной микроскопии ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»

Ведущая организация Всероссийский научно-исследовательский

ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии (г. Воронеж)

Защита диссертации состоится «22» декабря 2015 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д-220.012.01 при ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, г. Казань, Научный городок-2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань).

Электронный вариант автореферата и текста объявления о защите размещен на официальном сайте ВАК РФ http://vak.ed.gov.ru: полный текст диссертации, автореферата и отзыв научного консультанта - на официальном сайте ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» www.vnivi.ru

Автореферат разослан а/9 » 2015 г.

Ученый секретарь /7 /

диссертационного совета — В.И.Степанов

1 Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Фундаментальным свойством живых организмов является их способность приспосабливаться к неблагоприятным факторам окружающей среды. Не удивительно, что широкое применение химиотерапевтических антибактериальных и противопаразитарных средств приводит к появлению резистентных популяций как микробов, так и паразитов (Смирнов A.A., 1999; Кирилловсих В.А., 2005; Ventos S., 2010; Panasevich L.S., 2004; Mani N.. 2006; Grossmann Т.Н., 2007; Charifson P.S., 2008.). Это создает напряженную ситуацию с сохранностью сельскохозяйственных животных (Мейнел Г., 1976; Кудлай Д.Г., 1977; Зароза В.Г., 1991; Макаров В.В. с соавт., 2000; Шахов А.Г. с соавт., 2000, 2003; Косенко Ю.М., 2009; Карева Э.П., 2012; Клименко А.И. с соавт., 2012). Без расширения арсенала терапевтических средств для ветеринарной медицины трудно ожидать эффективного ведения животноводства.

Следствием этого является необходимость синтеза новых препаратов, в том числе противопаразитарных и антибактериальных средств, что является одним из перспективных направлений ветеринарной фармакологии (Антипов В .А. ,2008,2009,2011; Кузин М.И., 1990; Стручков В.И. с соавт., 1991; Алексеев К.В. с соавт., 2000; Морковник A.C., 2013).

Производные азотсодержащих гетероциклов (имидазола, бензимидазола и других) обладают разнообразной биологической активностью вкупе с низкой токсичностью, поэтому поиск лечебных препаратов в этой области весьма перспективен и постоянно привлекает исследователей (Preston F.N., 1974; Куколенко С.С. с соавт., 1976; Арзыбаев М., 2002; Malleshappa Noolvi et al, 2014). На базе имидазольных систем созданы антигельминтные, фунгицидные, иммуномодулирующие, адаптогенные и другие средства.

Необходимость разработки новых лечебных средств для ветеринарии определяет цель и задачи данного исследования.

Объект исследования: производные азотсодержащих гетероциклов общей формулы А, методы их синтеза, методы биотестирования, лабораторные и сельскохозяйственные животные.

Предмет исследования: противопаразитарные, антибактериальные, токсикологические и терапевтические свойства новых производных азотсодержащих гетероциклов.

Научная гипотеза. При поиске новых лечебных средств в ряду азотсодержащих гетероциклов общей формулы А (указаны заместители 111-114 и нумерация атомов в цикле) нами использован целенаправленный подход, основанный на синтезе стругаур, которые могут быть миметиками природных и синтетических соединений с известной биологической активностью. Как известно, введение различных заместителей, либо замена целых фрагментов придают новые ценные фармако-токсикологические особенности известным препаратам.

В своей работе мы руководствовались следующими предположениями:

соответствующих заместителях Й2, Ю и 114 может выполнять те же функции (быть миметиком), что и шестичленный пиридиновый цикл в алкалоидах анабазине и никотине, которые обладают инсектоакарицидной активностью. Такая замена может привести к новым противопаразитарным препаратам с полезными свойствами.

СН=СН-СН=СН) объёмных липофильных заместителей в положения 1 и 3

144 5 N. В2

11

А

Пяти членный имидазольный фрагмент в структуре А при

Введение в структуру 2-аминобензимидазола (К2=ЫН2; ЮД4=

может усилить обнаруженную нами антипротозойную и антибактериальную активность соединений этого ряда.

• Атом азота, обладающий осн/вными свойствами (положение 3 в формуле А) может быть использован для образования донорно-акцепторных комплексов с антибактериальными галогенами, что придаст ценные фармако-токсикологические свойства данным комплексам в сравнении с исходными компонентами.

Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований явилось разработка методов синтеза, изучение фармако-токсикологических свойств и научное обоснование принципов применения в ветеринарной медицине новых противопаразитарных и антибактериальных препаратов из ряда азотсодержащих гетероциклов.

Для достижения намеченной нами цели были поставлены следующие задачи исследования:

1. Основываясь на научной гипотезе, синтезировать массив новых производных азотсодержащих гетероциклов.

2. Разработать эффективные экспресс-методики и провести скрининг синтезированных соединений на противопаразитарную активность.

3. Изучить фармако-токсикологические параметры соединений с высокой инсектоакарицидной и антибактериальной активностью.

4. Разработать лекарственные формы на основе веществ с высокой биологической активностью и низкой токсичностью.

5. Изучить терапевтическую эффективность препарата ДИХИМ-1 при арахноэнтомозах (эктопаразитозах) животных.

6. Изучить терапевтическую эффективность нового комлексного препарата при колибактериозе телят.

Научная новизна. Сформулирована и экспериментально подтверждена гипотеза о возможности получения высокоэффективных инсектоакарицидных средств путём замены шестичленного пиридинового кольца на пятичленный

имидазольный цикл в структуре природных противопаразитарных алкалоидов анабазине и никотине. Выявлена зависимость величины активности от вида, количества и местоположения заместителей в имидазольном кольце. С учётом выявленных зависимостей структура-активность, было синтезировано новое органическое соединение: 2-(4,5-дихлор-1-имидазолилметил)-2-(нитровинил)-имидазолидин, которое предложено в качестве активно действующего вещества инсектоакарицидного препарата ДИХИМ-1. По результатам исследований получено три патента (патент 1Ш № 2355388 «Способ лечения псороптоза овец и препарат для его осуществления», патент 1Ш №2425035 «Способ получения 4,5-дихлоримидазолов» и патент 1Ш №2427365 «Способ лечения арахноэнтомозов животных и препарат для его осуществления»), «Методические положения по применению препарата ДИХИМ-1 при арахноэнтомозах животных», а также «Регламент лабораторный приготовления препарата ДИХИМ-1 для лечения эктопаразитозов животных» рассмотрены и одобрены секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, протокол №3 от «23» сентября 2010г.

Впервые обнаружен эффект, состоящий в том, что введение заместителей в положения 1 и 3 азотсодержащего гетероцикла бензимидазола при наличии аминогруппы в положении 2. приводит к появлению противопаразитарных (антипротозойных) свойств. При этом анализ зависимости структура-активность позволяет сделать заключение, что решающее значение для наличия активности имеют свойства 1,3-заместителей: гидрофильные заместители и заместители небольшого размера резко снижают активность, 3,4-дихлорбензильный и бета-феноксиэтильный заместители в первом и (или) третьем положении обеспечивают высокий антипротозойный эффект: 11 соединений этого ряда имеют МИК менее 1 мкг/мл в отношении Со1роа!а ¡¡ети. Наряду с этим, структуры с такими заместителями показали высокую антибактериальную активность с величинами МИК 1-5 мкг/мл в отношении Зьаигеиз и 20-50 мкг/мл в отношении Е.соИ. Разработка «1-щ-Арилоксиалкил -и 1-бензилзамещенные 2-иминобензимидазолины и их фармакологически

приемлемые соли, обладающие протистоцидной и антимикробной активностью» признана изобретением и защищена патентом РФ № 2514196. Разработка «1,3-Дизамещенные 2-иминобензимидазолина, обладающие антибактериальным действием» признана изобретением и защищена патентом РФ № 2423355. Разработан «Регламент лабораторный (технологический) синтеза и очистки антибактериальных препаратов на основе 2-иминобензимидазола», который рассмотрен и одобрен секцией «Инфекционная патология животных» Отделением ветеринарной медицины РАСХН, протокол № 2 от 16.04.2013 г.

Сформулирована и экспериментально подтверждена гипотеза, заключающаяся в том, что образование донорно-акцепторных комплексов с участием молекулы йода и азотсодержащими осшвными гетероциклами может привести к препаратам, выгодно отличающимся по фармако-токсикологическим характеристикам от других форм комбинированных препаратов йода. Установлено, что при образовании комплекса резко снижается токсичность комплекса в сравнении с чистым йодом, причем антибактериальная активность при этом не изменяется, а в отношении некоторых микроорганизмов повышается: МИК комплексных соединений йода с азотсодержащими гетероциклами в отношении Е.соН составляет 0,20 — 6,25 мкг/мл, в отношении 81арк.аигеи$ — 0,78 - 6,25 мкг/мл, в то время как для водного раствора йода в йодиде калия МИК составляют 16,0 - 64,0 и 64,0 мкг/мл соответственно. При этом улучшились такие важные характеристики, как безвредность и стабильность в желудочно-кишечном тракте, что позволило создать препарат «Колицид» для лечения телят при колибактериозе (патент Би № 1809942 АЗ).

Теоретическая и практическая значимость работы.

Модификация алкалоидов анабазина и никотина путем замены шестичленного пиридинового фрагмента на 4,5-дихлорзамещённое производное пятичленного гетероцикла имидазола приводит к эффективным

инсектоакарицидам. Это теоретическое положение открывает новые направления в разработке противопаразитарных препаратов.

Полученные в настоящей работе данные позволили установить, что образование донорно-акцепторной связи между йодом и третичным атомом азота гетероциклов придает новым комплексам ряд существенных особенностей по сравнению с отдельными компонентами: резко снижается токсичность йода, повышается устойчивость к инактивирующим веществам, увеличивается антибактериальная активность в отношении некоторых организмов, пролонгируется действие в желудочно-кишечном тракте.

Практическая значимость работы выражается в создании двух новых ветеринарных препаратов для лечения животных при эктопаразитозах и инфекционных заболеваниях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Модификация алкалоидов анабазина и никотина путем замены шестичленного пиридинового фрагмента на производные пятичленного гетероцикла имидазола при соответствующем подборе заместителей приводит к новым эффективным противопаразитарным препаратам с полезными свойствами.

2. Решающее влияние на активность оказывает количество метиленовых звеньев между имидазольным гетероциклом и кольцом 2-(нитровинил)-имидазолидина: соединения с одним метиленовым звеном обладают инсектоакарицидной активностью; увеличение числа звеньев до двух или трёх приводит к полной потере активности.

3. Образование донорно-акцепторных комплексов с участием молекулы йода и азотсодержащими основными гетероциклами с пиридиновым атомом азота позволяет получить препараты, выгодно отличающимся по фармако-токсикологическим характеристикам от других форм комбинированных препаратов йода.

4. Разработка донорно-акцепторных комплексов типа п-а галоген-третичный амин - перспективный путь создания новых химиотерапевтических

средств с высокой антибактериальной активностью политропного действия, низкой токсичностью и длительным действием в условиях желудочно-кишечного тракта животных.

5. Донорно-акцепторные комплексы йода с 5,6-диметилбензимидазолом, 1,2-диметил-5-метоксибензимидазолом и гексаметилентетрамином не влияют на свойства противоколипротейного лактоглобулина, совместимы со средствами регидратации и некоторыми антибактериальными препаратами (в 12 комбинациях из 18 изученных) как по тесту антибактериальной активности, так и по тесту токсичности.

6. В ряду производных 1,3-дизамещенного 2-иминобензимидазолина, обладающих сочетанным противопаразитарным и антибактериальным действием, гидрофильные заместители и заместители небольшого размера резко снижают активность; соединения с 3,4-дихлорбензильным и бета-феноксиэтильным заместителями в первом и (или) третьем положении обеспечивают высокий антипротозойный и антибактериальный эффект.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 25 Российских и Международных конференциях в период с 1991 по 2013 годы, а также представлены на 7 Международных и Российских выставках.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 81 научная работа, 19 из них - в изданиях, рекомендованных ВАК, 1 методическое пособие и 7 патентов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения на 29 страницах. Работа изложена на 288 страницах компьютерного текста, содержит 36 схем, 38 таблиц. Библиографический список включает 373 источника, в том числе 144 иностранных.

2 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 2.1 Методология и методы исследований

Тема диссертационной работы является составной частью комплексной темы научных исследований Государственного научного учреждения СевероКавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации» на 2006-2010 г.г. по заданию 08.03.05 и на 2011-2015 гг. по заданию 08.04.04. Работу выполняли с 1978 по 2013 год в лаборатории химического синтеза ГНУ СКЗНИВИ Россельхозакадемии, Южном Федеральном университете, Ростовском НИИМЭиГ, Новочеркасской СПБЖ, в ветеринарных клиниках Ростовской области, а также в хозяйствах Ростовской области и Краснодарского края.

Синтез соединений осуществляли как по известным методам, которые изложены в руководствах по органической химии, так и по разработанным нами оригинальным методам синтеза новых органических соединений. Скрининг синтезированных соединений на инсектицидную активность проводили на личинках колорадского жука Leptinotarsa decemlineata, на протистоцидную активность - на модели Colpoda steinii по разработанным нами методикам (Фетисов Л.Н., Зубенко A.A., Должиков М.А., 2005; Зубенко A.A., Фетисов JI.H., Зубенко И.В., 2007; Зубенко A.A., Фетисов JI.H., Зубенко И.В., Саяпина Е.А., 2006; Фетисов JI.H., Зубенко A.A., Зубенко И.В., 2007; Фетисов Л.Н., Зубенко A.A., Бодряков А.Н., Бодрякова М.А., 2012). Обе методики детально изложены в разделе «Результаты собственных исследований».

Антимикробную активность новых соединений и препаратов сравнения определяли in vitro по методике серийных разведений в жидкой питательной среде, описанной в кн.: «Методы экспериментальной химиотерапии», М., Медицина, 1971.- С.100-105. Бактериостатическую активность каждого вещества определяли в ряду из 10 разведений от 500,0 мкг/мл до 0,98 мкг/мл. Учитываемая бактериальная нагрузка составляла 250 тысяч микробных клеток в 1,0 мл.

Фармакологическое и токсикологическое исследование массивов новых соединений проводили в соответствии с практическим руководством «Методы экспериментальной химиотерапии» (Фармакологическое и токсикологическое изучение химиотерапевтических препаратов,- М.Д.Машковский.- С.524 - 539) -М., 1971; «Методическими указаниями по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве» (1991), а также

согласно «Руководству по экспернметальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» под ред. Р.У.Хабриева, (2005).

Острую токсичность новых соединений изучали на лабораторных крысах по следующей методике: в предварительном опыте на малом количестве лабораторных животных (по 3 крысы в группе) устанавливали максимально переносимую дозу (МПД), и дозу, вызывающую 100,0% гибель животных (ЛДюо). Затем в основном опыте каждую из 5-7 доз препарата, лежащую в интервале между МПД и ЛДюо, вводили 5 лабораторным крысам. Расчет ЛД50 производили по методу Кербера. В предварительном и основном опытах соединения вводили внутрижелудочно с помощью зонда в виде водных растворов или суспензии в изотоническом растворе хлорида натрия (0,85 % р-р по NaCl). Срок наблюдения - 14 дней. Определяли также острую токсичность путём купания крыс в растворе препарата определённой концентрации с полным погружением (экспозиция 15 секунд). Применяли растворы 0,1%; 0,5%; 1,0% и 2,0% концентрации.

Хроническую (подострую) токсичность новых веществ, (при многократном введении) изучали с учетом «Требований к документации, направляемой в Ветеринарный фармакологический совет» (Утверждено ГУВ МСХ СССР 18 мая 1973 года) по следующей методике: 24 лабораторных крысы массой по 150 граммов разделяли на две группы — опытную и контрольную. Животным опытной группы (6 самок и 6 самцов) ежедневно вводили в желудок с помощью зонда изучаемое соединение в дозе близкой к расчетной терапевтической дозе. После окончания введения препарата (11-й день опыта), а также через 5 дней после окончания введения (16-й день опыта) у части животных (6 голов - 3 самки и 3 самца) брали материал для гематологических и гистологических исследований. Кусочки внутренних органов (сердце, печень, почки, легкие, желудок, толстый и тонкий отделы кишечника) фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина, проводили через спирты повышающейся концентрации, готовили парафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилин-эозином.

При гематологических исследованиях определяли количество эритроцитов и гемоглобина, цветной показатель, количество лейкоцитов и их состав (лейкоцитарная формула); в сыворотке крови - содержание фосфора (по С.А.Ивановскому), кальция (комплексонометрическим методом с мурексидом), общего белка (рефрактометрическим методом). Биохимические исследования также проводили на автоматическом анализаторе EOS Bravo forte (Hospitex Diagnostics Italia), гематологические исследования - на автоматическом анализаторе Hema Screen 18 (Hospitex Diagnostcs Italia).

Испытания инсектицидных свойств активно действующего вещества препарата ДИХИМ-1 в сравнении с известными препаратами проводили как на личинках Leptinotarsa decemlineata, так и на Ctenocephalides canis (на собаках и кошках). Для этого готовили растворы препарата с убывающей концентрацией, начиная с 0,01% и заканчивая 0,0001%. Препаратами сравнения были имидаклоприд, фипронил и дельтаметрин (бутокс). Использовали не менее 5 собак и 3 кошек на обработку растворам определённой концентрации.

Описание методики изучения терапевтической эффективности препарата ДИХИМ-1 при арахноэнтомозах животных.

Саркоптоз свиней.

Диагноз: При осмотре установили, что животные испытывают сильный зуд и постоянное беспокойство. В начальной стадии заболевания очаги поражения кожи обнаружили вокруг глаз, на щеках и ушах. В тяжелых случаях наблюдали утолщение кожи, складчатость, трещины, выпадение щетины. У всех животных находили на коже узелки и корки. Диагноз подтверждали микроскопией соскобов кожи с двух-трех участков (из периферии очага поражения) от каждого животного. Во всех случаях обнаруживали клещей Sarcoptes suis.

Ход испытаний:

Обработку свиней проводили путем двукратного опрыскивания 0,05% водным раствором препарата ДИХИМ-1, содержащего в качестве активно действующего вещества (АДВ) 2-(4,5-Дихлоримидазолилметил)-2-(нитровинил)-имидазолидин, а в качестве вспомогательных веществ -диметилсульфоксид (ДМСО) и эмульгатор ОП-7 при следующем соотношении компонентов в маточном растворе, вес.% : АДВ (10,0); ДМСО (75,0); ОП-7 (5,0); вода (10,0).

Рабочий раствор готовили непосредственно перед обработкой: 100мл маточного раствора растворяли в 20,0 литрах воды. Интервал между обработками составлял 10 дней.

Норма расхода - 15,0 мл рабочего раствора препарата на 1 кг массы тела животных.

В опытных группах было задействована 231 голова свиней 4-6 — месячного возраста; в контрольных группах - 50 голов свиней, которых обрабатывали по принятой в хозяйствах схеме с применением неоцидола или бутокса; 30 голов свиней препаратами не обрабатывали (чистый контроль).

Сифункулятоз свиней.

Диагноз установили известными методами паразитологии. На животных находили в большом количестве вшей Haematopinus suis.

Ход испытаний:

Пораженных животных обрабатывали двукратно опрыскиванием раствором препарата 0,005 % концентрации по АДВ. Для приготовления рабочего раствора 10 мл маточного раствора препарата ДИХИМ -1 растворяли в 20,0 л воды. Норма раствора составляла 7,0-10,0 мл рабочего раствора на 1,0 кг массы тела животных. Интервал между обработками составлял 10 дней. Препаратом сравнения был 0,005 % раствор бутокса. В опытных группах было задействовано 142 головы свиней разных возрастов. Контрольную группу свиней (72 головы) обработали дважды с интервалом в 10 дней.

Псороптоз кроликов.

Диагноз: При осмотре установлено, что животные беспокоились, трясли головой, пытались чесать ушные раковины. В слуховых проходах обнаруживали очаги воспаления. У некоторых животных отмечали гиперемию кожи и отечность ушных раковин. На внутренней поверхности ушных раковин находили корки. У 30,0 % больных животных в слуховых проходах образовались пробки из экссудата и спущенного эпителия. У больных кроликов с мест поражения брали соскобы кожи и просматривали под малым увеличением. У всех обследованных животных находили в соскобах большое количество клещей Psoroptes cuniculi: в соскобах площадью 0,25см2 обнаруживали 15-30 клещей. В опытных группах было задействовано 210 голов кроликов. Контрольных животных (20 голов) обрабатывали 2% эмульсией креолина.

Ход испытаний:

Приготовление рабочего 2,50 % раствора препарата ДИХИМ-1: 10,0 мл маточного раствора смешивали с 30,0 мл дистиллированной воды. В слуховой проход и на кожу ушных раковин наносили 2,50 % раствор ДИХИМ-1 по 0,500,75 мл в каждое ухо, уши слегка массировали. Через 7 дней обработку повторяли аналогичным образом. Контрольных животных обрабатывали также двукратно с интервалом 7 дней. За животными обеих групп вели наблюдение в течение 30 дней после второй обработки.

КтеноцеФалидоз собак и кошек.

Количество животных - 64 собаки, 36 кошек.

Диагноз устанавливали по известным методикам.

Ход испытаний:

Рабочие растворы готовили непосредственно перед обработкой, начиная с высокоэффективной концентрации 0,005% по АДВ (как было установлено ранее) и далее ступенчато снижали концентрацию АДВ: 0,004%, 0,003%, 0,002%, 0,001% и 0,0005%.

Готовили также рабочие растворы бутокса с аналогичными концентрациями по АДВ (дельтаметрину).

Затем больных животных опрыскивали рабочими растворами препаратов из расчета 7,0-10,0 мл на 1,0 кг массы тела. Опрыскивали не менее 5 собак и 3 кошек раствором определенной концентрации. Эффективность определяли через сутки после обработки путем подсчета живых блох на кожном покрове животных.

Отодектоз кошек.

Ход испытания: При осмотре кошек различных пород разного возраста установили, что животные спонтанно заражены клещами 01ос1ес1е$ супоХеь. У кошек отмечали постоянное беспокойство, зуд и расчесы кожи ушных раковин. На коже слухового прохода находили язвочки, а в полости среднего и внутреннего уха - катаральный экссудат. Диагноз подтверждался микроскопией соскобов кожи с мест поражения. Во всех случаях находили в большом количестве клещей О/ос^ес/ея суио/аг. После очистки слухового прохода рабочую эмульсию препарата (2,50 % по АДВ) ватно-марлевым тампоном наносили на поверхность слухового прохода с последующим массажем ушной раковины. На одну обработку расходовали 1,0-2,0 мл препарата. Вторую обработку по той же методике проводили через 7 дней. В опытах было задействовано 15 кошек.

Изучение особенностей распределения препарата ДИХИМ-1 в организме лабораторных животных

Сформировали по принципу аналогов две группы белых крыс (опытную и контрольную) по 12 голов в каждой. Масса животных составляла 140-160 граммов. Животные опытной группы были искупаны (экспозиция - 5 минут) в растворе препарата ДИХИМ-1 0,05% концентрации. Животные контрольной группы были искупаны в растворе вспомогательных веществ препарата ДИХИМ-1. Концентрация вспомогательных веществ была эквивалентна таковой в опытной группе. Через 6, 12, 24 и 48 часов часть животных (по 3 головы) убивали и определяли содержание АДВ ДИХИМ-1 в коже, мышцах и печени животных. Метод идентификации — биологический, с использованием личинок колорадского жука 2-3 - дневного возраста, которые погибают при концентрации АДВ 5 мкг/мл. Методика обработки биологического материала: кожный покров площадью 25 см2 или навеску органа в 1г измельчали, смешивали с 10 мл этанола и перемешивали при 35-40°С в течение 30 минут, центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость отбирали, а из остатка повторно проводили экстракцию при тех же условиях. Объединённые экстракты упаривали досуха на водяной бане. К остатку прибавляли 0,1 мл дистиллированной воды и тщательно растирали. В полученную смесь помещали 5 личинок колорадского жука 2-3 - дневного возраста. При наличии АДВ препарата ДИХИМ-1 в исследуемом образце

гибель личинок наступала в течение 3-5 минут. Двукратно разбавляя экстракт, определяли объём воды V, применение которого даёт активную в отношении личинок смесь и вычисляли количество АДВ в образце биологического материала по формуле:

М = У5,

где M - количество АДВ в образце в микрограммах.

Например, разбавление экстракта водой в объёме 10 мл даёт активную в отношении личинок смесь, а дальнейшее разбавление приводит к потере активности. Следовательно, в экстракте содержится 10'5=50 микрограммов АДВ препарата ДИХИМ-1.

Изучение развития резистентности E.coli к перйодидам 5,6-диметилбензимидазола, гексаметилентетрамина и 1,2-диметил-5-метоксибензимидазола проводили методом пассажей («Методы экспериментальной химиотерапии», М., Медицина.-1971.-С.404-406) при многократных пересевах на бульоне Хотгингера с возрастающей концентрацией изучаемого препарата. В этом эксперименте использовали штамм E.coli 0115.

Определение коэффициента кумуляции трёх перйодидов азотсодержащих гетероциклов проводили на 20 лабораторных крысах для каждого препарата (10 самок и 10 самцов) по тесту «субхронической токсичности» (И.В. Саноцкий «Методы определения токсичности и опасности химических веществ», М., 1970,- С. 107-108).

Влияние перйодидов азотсодержащгх гетероциклов на активность лактоглобулинов по нашей просьбе провели в Ростовском-на-Дону научно-исследовательском институе эпидемиологии, микробиологии и гигиены к.м.н. Соболева C.B. и к.б.н. Минеева Л.Д. Активность противоколипротейного лактоглобулина при совместном применении с перйодидами азотсодержащих гетероциклов изучали в сравнении с активностью нативного препарата лактоглобулина.

Совместимость перйодидов азотсодержащих гетероциклов с известными антибактериальными средствами определяли по двум показателям: по изменению антибактериальной активности и по изменению токсичности соответствующих смесей в сравнении с антибактериальной активностью и токсичностью каждого из компонентов смеси в отдельности. Вначале устанавливали уровень бактерицидной активности препаратов в отдельности, а затем двойных смесей (перйодид + известное средство). Бактерицидную активность определяли методом серийных разведений («Методы экспериментальной химиотерапии», М., Медицина, 1971.-С.104-105). Совместимыми на данном этапе считали смеси, антимикробная активность

которых была не ниже таковой для более активного из компонентов. Отобранные совместимые смеси вводили внутрижелудочно с помощью зонда 3 лабораторным крысам в максимально переносимой дозе по более токсичному из компонентов. Соотношение компонентов при этом пропорционально их терапевтическим дозам. Объем вводимой смеси - 3,0 мл, растворитель -физиологический раствор (0,85% водный раствор хлорида натрия). Совместимыми на этом этапе считались смеси, не вызвавшие гибели животных.

Совместимость перйодидов азотсодержащих гетероциклов со средствами регидратации определяли по двум тестам - изменению антибактериальной активности и изменению токсичности смеси для лабораторных крыс в сравнении с соответствующим перйодидом. Изучили сочетания с раствором Рингера, Регидральтаном и ИФР.

Скорость разложения перйодидов 5,6-диметилбензимидазола, 1,2-диметил-5-метоксибензимидазола и гексаметилентетрамина в желудочно-кишечном тракте определяли по следующей методике: для каждого из трёх изучаемых препаратов формировали 14 групп лабораторных крыс (по 3 крысы в группе) и вводили животным в желудок с помощью зонда соответствующий препарат в дозе 0,25 г/кг массы тела. Затем через определенные промежутки времени после введения (20, 40, 60, 80 и 100 минут, 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 5; 6; 7 и 8 часов) трёх животных убивали и содержимое их желудочно-кишечного тракта исследовали йод-крахмальной реакцией на содержание активного йода. При этом отдельно изучали содержимое желудка, тонкого и толстого отделов кишечника.

Изучение терапевтической эффективности перйодида

гексаметилентетрамина при колибактериозе телят проводили в хозяйствах Ростовской области и Краснодарского края.

Диагноз устанавливали на основании клинической картины, особенностях проявления болезни, условий содержания и кормления телят, патологоанатомической картины, результатов лабораторной диагностики, результатов ранее проводимого лечения. Клинический осмотр животных проводили по общепринятой схеме. При первичном осмотре проводили измерение температуры тела, выясняли срок заболевания, определяли тяжесть течения. Лабораторную диагностику колибактериоза телят проводили в Межрайонных ветеринарных лабораториях Ростовской области и в лаборатории по изучению болезней молодняка сельскохозяйственных животных ГНУ СКЗНИВИ.

Терапевтическую эффективность перйодида гексаметилентетрамина при колибактериозе телят изучали на 220 опытных и 150 контрольных телятах.

В лабораторном (технологическом) регламенте «Синтез и очистка гидрохлоридов 2-имино-1-[(2-арилоксиэтил)- и 2-замещенных бензил] 1,3-дигидро-3-(2-гидрооксиэтил) бензимидазолинов, обладающих

антибактериальной активностью» представили в детальном виде схемы синтеза и методы очистки наиболее активных соединений 1,3-дизамещенных 2-иминобензимидазолинов, привели результаты ЯМР-спектроскопии. В отдельном разделе представили итоги изучения антимикробной активности соединений. Материалы «Регламента» оформили в соответствии с требованиями к документации, представляемой для рассмотрения на секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Синтез и фармако-токсикологическая характеристика противопаразитарных препаратов в ряду азотсодержащих гетероциклов Синтез инсектоакаиицидных соединений, оспованный на научной гипотезе

Научная гипотеза заключается в предположении, что замена пиридинового фрагмента в природных алкалоидах анабазине и никотине, а также в неоникотиноидах на имидазольный цикл может привести к новым инсектоакарицидам с набором полезных свойств. Синтетическая задача заключалась в получении производных имидазола с необходимыми заместителями, которые обеспечивали бы надёжное связывание с биомишенью и тем самым - нужный инсектоакарицидный эффект. В качестве имитаторов пиридинового цикла нами применялись производные имидазола, содержащие как электроноакцепторные, так и электронодонорные заместители в положениях 2,4 и 5. В качестве второго структурного фрагмента были использованы пяти- и шестичленные гетероциклы различного строения.

Производные имидазола соединяли ковалентной связью с гетероциклами с помощью метиленового (СН2), этиленового (СН2-СН2), пропиленового (СН2-СН2-СН2) и бутиленового (СН2-СН2-СН2-СН2) звеньев. Таким способом нами было получено более 200 соединений.

3.2 Скрининг синтезированных соединений на противопаразитарную

активность

Разработка методики предварительной оценки инсектоакарицидных и протистошшных свойств синтезированных соединений

Для исследования больших массивов соединений на инсектоакарицидную активность нами разработана удобная, быстрая и надёжная методика с использованием в качестве тест-объекта личинок Ьгрйпогагза <1есетИпеМа

(колорадского жука) (Л.Н Фетисов, A.A. Зубенко, М.А., Довжиков 2005; Л.Н Фетисов, A.A. Зубенко, И.В. Зубенко, 2007)

В качестве растворителей для препаратов использовали ксилол, толуол, сольвент нефтяной, диметилформамид, диметилсульфоксид и воду. Концентрация испытуемых веществ в рабочих растворах или в эмульсиях составляла 0,2%. В качестве эмульгаторов при приготовлении концентратов-эмульсий использовали неонол, геронол, ОП-7 и другие. Объем расхода — 30 мл готового раствора или эмульсии на один куст с заселением не менее 20 личинок. Опрыскиванием обрабатывали кусты, заселенные личинками второго-третьего возрастов (растущие, активно питающиеся). Наблюдали 24 часа (в отдельных случаях - до 3-х суток). В контрольных опытах кусты опрыскивали растворителями или эмульсиями без испытуемых веществ. Близкие по строению вещества испытывали вначале в виде смесей по 3-5 веществ при стандартной концентрации 0,20 % по каждому веществу. В случае обнаружения инсектицидной активности смеси, испытывали затем каждое соединение по отдельности. Соединения, обнаружившие 100,0 % инсектицидную эффективность (ИЭ) в концентрации 0,20 %, испытывали в более низких концентрациях: 0,10%; 0,05%; 0,02%; 0,01 % и 0,005%.

Скрининг инсектицидов с использованием в качестве тест-объекта личинок Leptinotarsa decetnlineata позволяет получить предварительную информацию о типе токсического действия веществ на насекомых. При репеллентом эффекте личинки покидают обработанное растение; при контактном действии личинки погибают в течение 1-2 часов; при антифидантном (анорексигенном) эффекте личинки вначале живы, активны, питаются, затем прекращают питание и постепенно гибнут (1-3 суток).

Следует указать, что обнаруженная на личинках колорадского жука активность веществ коррелирует с их акарицидной и инсектицидной активностью в отношении насекомых и клещей, имеющих ветеринарное значение. Это подтвердилось не только в лабораторных опытах in vitro, но и при испытаниях на животных.

Протистоцидную активность изучали на культурах Tetrachimena piriformis, Paramecia caudatum, Colpoda steinii и других с применением сред, описанных в кн. «Методы экспериментальной химиотерапии», М., «Медицина», 1971, с.24-26. Использовали метод серийных разведений. Наиболее удобным, доступным и «объективным» тест-объектом оказались колподы вида N. steinii. Работу выполняли в микропланшетах, например, для постановки ИФА. В качестве среды для переживания простейших использовали смесь кипяченой водопроводной воды и стерильной дистиллированной воды в

равных объемах. Первоначальное разведение вещества готовили на дистиллированной воде. Серийные разведения готовили следующим образом:

Раствор №1. 5,0 мг вещества + 50,0 мкл 70,0 % водного раствора ДМСО + 5 мл дистиллированной при перемешивании стеклянной палочкой -учитываемая концентрация - 1000,0 мкг/мл.

Растворы №2-12 - в лунки №№ 2-12 автоматической восьмиканальной пипеткой вносят по 150мкл воды (смесь кипяченой водопроводной и дистиллированной воды), затем во вторую лунку приливают 150 мкл раствора №1 и после перемешивания переносят 150,0 мкл в третью лунку и так далее до конца ряда, из 12 лунки после перемешивания удаляли 150,0 мкл. В лунку №1 вносят 150,0 мкл раствора №1.

Во все лунки с подготовленными разведениями веществ вносили по 30,0 мкл взвеси простейших трехсуточного возраста. Взвесь простейших готовят таким образом, чтобы в каждом поле зрения при микроскопии на малом увеличении насчитывалось 10-15 активных особей. После внесения простейших планшет накрывают крышкой и оставляют при комнатной температуре (20,0— 22,0 °С) на 18,0-20,0 часов. Для учета результатов автоматической микропипеткой с разовым наконечником набирали после перемешивания из последней лунки ряда ЗОмкл содержимого, наносили этот объем на чистое предметное стекло и просматривали под микроскопом при малом увеличении (10x15). Отмечали наличие или отсутствие живых простейших. Просмотр производили справа налево. Первая лунка, где нет ни одной живой особи, считается содержащей минимальную протистоцидную концентрацию изучаемого вещества. Ставили контроли: контроль среды - вода для переживания + простейшие (5 лунок); контроль растворителя (используется при изучении активности водонерастворимых веществ) - 50,0 мкл ДМСО 70,0 % + 5,0 мл дистиллированной воды и далее серийные разведения как для вещества, затем в лунки вносили по 30,0 мкл взвеси простейших. Таким образом, в одном планшете (В х 12 лунок) проводили испытания 8 веществ.

Показатели инсектоакарицидной и протистоцидной активности новых соединений.

Наиболее активным из всех изученных соединений оказался 2-(4,5-дихлор-1-имидазолилметил)-2-(нитровинил)- имидазолидин - активно действующее вещество разработотанного нами инсектоакарицида ДИХИМ-1(таблица 1).

Таблица1

Структурные формулы и МИК АДВ ДИХИМ-1 его гомологов

Во втором и третьем столбцах представлены структуры, в спенсере которых имеется дополнительно одно или два метиленовых звена, что приводит к полной потере активности. Установлено также, что обязательным условием для активных соединений является наличие электроноакцепторных заместителей в имидазольном кольце, причём положение 2 должно оставаться свободным.

Все соединения, обладающие инсектицидной активностью, были испытаны на акарицидную активность в отношении клеща Уаггоа ЛсоЬяот. Интервал эффективных концентраций для этих соединений лежит в диапозоне 50-1000 мкг/мл. Наибольшую активность показало соединение АДВ ДИХИМ-1 (10,0-30,0 мкг/мл).

Таблица 2

Процент погибших личинок в зависимости от концентрации препарата

Препарат Концентрация, %

0,01 0,005 0,001 0,0008 0,0005 0,0001

АДВ ДИХИМ-1 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 40,0

Имидаклоприд 100,0 100,0 100,0 50,0 10,0 0

Фипронил 100,0 100,0 80,0 40,0 0 0

Дельтаметрин 100,0 80,0 40,0 10,0 0 0

В таблице 2 представлены сравнительные испытания эффективности АДВ ДИХИМ-1 и известных инсектоакарицидов в отношении личинок ЬЛесетИпеШа.

Таким образом, АДВ препарата ДИХИМ-1 обладает инсектицидной активностью в несколько раз более высокой, чем препараты сравнения.

Результаты опытов по изучению особенностей распределения препарата ДИХИМ-1 в организме лабораторных животных.

В мышцах и печени активно-действующее вещество препарата не обнаруживается. В кожном покрове площадью 25 смг через 6 часов после

обработки обнаружено 90-120 микрограммов АДВ, через 12 часов - 50-70 микрограммов, через 24 часа - 15-25 микрограммов, через 48 часов - 5-15 микрограммов.

Протистоцидная активность. Среди исследованных нами соединений (более 600) выявлено несколько десятков высокоактивных веществ с минимальными ингибирующими концентрациями в интервале 0,20-15,0 мкг/мл.

Среди изученных производных 2-аминобензимидазола (более 500) выявлено несколько высокоактивных соединений с МИК 0,4-15,0 мкг/мл. Структурные формулы и величины МИК трёх наиболее активных соединений указаны в таблице 3.

Таблица 3

Структурные формулы и величины МИК производных 2-

препаратами, рекомендованными для лечения птиц при кокцидиозе. В таблице 4 представлены величины МИК известных препаратов в отношении Со1рос1а

Таблица 4

Величины МИК в отношении Со1ро<1а $/е//ш препаратов, применяемых

для лечения птиц при кокцидиозе

Байкокс Ампролиум Фуразолидон Трихопол Левомицетин

62,5 мкг/мл 62,5 мкг/мл >250,0 мкг/мл >100,0 мкг/мл >100,0 мкг/мл

Таким образом, синтезированные нами соединения в 10 и более раз активнее в отношении Со1рос1а &1ети, нежели известные противококцидиозные препараты.

3.3 Фармако-токсикологическая характеристика нового инсектоакарицидного препарата ДИХИМ-1

Разработка лекарственной Формы препарата ЛИХИМ-1

В качестве вспомогательных веществ нами использован диметилсульфоксид (ДМСО), который является хорошим растворителем для АДВ и обеспечивает проникновение препарата в глубину кожного покрова; эмульгатор, способствующий смачиванию, самораспределению и длительному сохранению АДВ на кожном покрове, а также дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов (вес.%): АДВ (0,10-20,0); ДМСО (40,080,0); эмульгатор (5,0-10,0); вода (до 100,0).

Обоснование процентного содержания компонентов заключается в следующем: содержание АДВ менее 0,10% приводит к излишнему расходу ДМСО и эмульгатора; содержание АДВ более 20,0% приводит к появлению осадка при хранении препарата. Оптимальным является следующий состав (вес,%), который называется препаратом ДИХИМ-1: АДВ (10,0); ДМСО (75,0); эмульгатор (5,0); вода (10,0).

В качестве эмульгатора применяют неонол, геронол, ОП-7 или ОП-Ю.

Исследование токсических свойств препарата ДИХИМ-1

Определение токсических свойств АДВ (2-(4,5-дихлор-1-имидазолилметил)-2-(нитровинил)-имидазолидина) провели на лабораторных крысах массой 150,0-180,0 г. Препарат вводили внутрибрюшинно в виде тонкой суспензии в изотоническом растворе (0,85%) хлорида натрия в дозах 500,0; 250,0; 125,0; 62,50 и 30,0 мг/кг массы тела. Объем вводимой суспензии составлял от 0,25 до 1,0 мл на животное. Установлено, что ЛДюо составляет 500,0 мг/кг массы тела. Рассчитанная по методу Кербера ЛД50 составляет 292,0 мг/кг массы тела.

При внутрижелудочном введении АДВ препарата ДИХИМ-1 менее токсично: доза 0,30 г/кг массы тела не вызывает острых токсических реакций. В течение 14,0 суток после введения препарата крысы оставались здоровыми и активными, общее состояние, поведенческие и кормовые реакции были адекватны физиологическим.

Изучение хронической токсичности препарата ДИХИМ-1 показало, что трехкратная обработка крыс в рабочем растворе препарата (0,05% по АДВ) не вызывает у животных очевидной токсической реакции. Обработку купанием с двукратным полным погружением животные переносили без осложнений. После обработок животных помещали в чистые клетки, принудительную сушку не применяли. Животные имели возможность заниматься собственным туалетом самостоятельно, что подразумевало и возможность облизывать шерсть и кожу после обработок. Установлено, что показатели функциональной

активности за 12,0 часовой период до купания во всех группах были практически одинаковыми: индекс функциональной активности (ИФА -передвижение по клетке, почесывания, прием корма и воды, игровые движения и т.д.) составлял 0,46-0,54. После купания за такой же период наблюдения в группе контроля ИФА составлял 0,58-0,62, а в опытных группах 0,60-0,63. Индекс активности возрастал в обеих группах в основном за счет времени, которое животные уделяли туалету кожного и шерстного покровов (усилия на сушку, вылизывание и приглаживание). Заключительный осмотр показал, что шерстный покров у опытных и контрольных животных имеет нормальный блеск, не взъерошен, выпадения шерсти не наблюдается, цвет волос остался естественным. Кожа у животных обеих групп на непигментированных участках имеет бледно-розовый цвет, без пятен, узелков, признаков геморрагического диатеза. При пальпации установлено, что кожа опытных и контрольных животных осталась эластичной, умеренно чувствительной; местной температурной реакции не наблюдалось, припухлостей, отеков не обнаружено. Гематологические показатели представлены в таблице 5.

Как в опытной, так и в контрольной группе показатели форменных элементов крови находились в пределах физиологических колебаний для данного вида животных. Среднестатистические данные по каждой группе животных не выходили за пределы нормативных показателей. В таблице 6 представлены биохимические показатели крови опытных и контрольных животных. Из данных таблицы видно, что уровни общего белка, глобулинов, билирубина, неорганического фосфора и общего кальция были в пределах физиологических колебаний и достоверно не отличались.

В совокупности данные по изучению хронической токсичности позволяют отнести препарат ДИХИМ-1 к мало токсичным при неоднократной купке в 0,05% растворе препарата.

Изучена острая токсичность ДИХИМ-1 путем купания животных в рабочих растворах препарата с более высокими концентрациями по АДВ. Установлено, что однократная купка животных (экспозиция 15 секунд) в рабочих растворах с концентрацией по АДВ 0,1%; 0,5%; 1,0% и 2,0% (4 группы по 5 голов) не вызывает у животных видимой токсической реакции.

Таблица 5

Гематологические показатели лабораторных крыс, трижды обработанных 0,05% раствором препарата ДИХИМ-1

Группа животных Сроки взятия крови №№ жив. Нв, г/л Эритр. 10|2/л Лейкоц. Ю'/л Лейкограмма

Э С Л М

Опыт (Животные обработаны купкой 3 раза с интервалом 2 дня в 0,05% растворе препарата) Через 3 дня после последнего купания 1 144,0 5,60 9,0 1,0 25,0 74,0 0

2 156,0 6,50 8,60 2,0 32,0 66,0 0

3 124,0 7,10 8,00 0 23,0 77,0 0

4 120,0 5,80 7,70 0 29,0 71,0 0

5 126,0 5,70 8,70 4,0 31,0 64,0 1,0

б 148,0 7,6 9,70 1,0 27,0 72,0 0

7 140,0 6,30 12,40 3,0 28,0 68,0 1,0

Ср.по группе М 136,0 6,30 9,20 1,50 27,70 69,80 1,0

Норма вида 130,0190,0 5,5011,0 8,0-23,0 1,05,0 25,035,0 55,075,0 1,03,0

Контрольная группа (животные обработаны купкой в эмульсии препарата без ДДВ трижды с интервалом 2 дня) Через 3 дня после последнего купания 1 116,0 7,40 8,0 0 29,0 71,0 0

2 124,0 7,10 7,60 0 21,0 79,0 0

3 126,0 6,0 8,70 1,0 25,0 74,0 0

4 126,0 6,2 10,0 0 27,0 72,0 1,0

5 136,0 6,6 7,80 0 31,0 69,0 0

6 124,0 7,3 8,10 3,0 25,0 71,0 1,0

М 125,0 6,80 8,40 0,60 26,30 72,60 0,30

До опыта (пробы крови взяты за 3 дня до начала обработок) 1 132,0 5,40 8,20 2,0 26,0 72,0 0

2 130,0 7,00 8,80 1,0 28,0 71,0 0

3 128,0 7,40 8,50 1,0 29,0 70,0 0

4 124,0 6,20 8,10 0 23,0 75,0 2,0

5 150,0 7,80 7,90 0 27,0 72,0 1,0

М 133,0 6,80 8,30 0,80 26,60 72,0 0,6

Животные всех групп имели удовлетворительное общее состояние и аппетит, были опрятны, шерстный покров был чистым и блестящим, кожный покров не был гиперемирован, шелушения кожи и узелковой сыпи не наблюдали.

Таким образом, в дозах, превышающих терапевтическую в 4-10 раз, препарат хорошо переносится животными.

Таблица 6

Биохимические показатели крови лабораторных крыс

№ жив- X Показатели сыворотки крови

Общий белок, г/л Глобулины, г/л Билирубин, мкмоль/л Неорг. Фосфор, ммоль/л Общий кальций, ммоль/л

До опыта

Ф1 78,00 44,20 21,20 1,96 2,81

Ф2 78,20 37,60 16,76 1,71 2,18

ФЗ 74,20 38,0 20,86 1,62 2,63

Ф4 79,0 39,40 20,52 1,62 2,38

Ф5 74,0 34,60 21,88 1,55 2,38

М±м=76,70 М±м=38,80 М±м=20,25 М±м=1,69 М±м=2,48

±1,07 ±1,57 ±0,91 ±0,07 ±0,11

о =0,24 а =0,35 о =0,12 а =0,49 а =0,98

Р]>0,99 Р1>0,99 Р]>0,99 Р1>0,99 Р[>0,99

Через 3 дня после обработок

01 74,0 45,50 21,55 1,84 3,12

02 74,50 38,0 20,86 1,82 2,63

03 71,50 48,90 16,07 1,46 2,50

04 69,50 44,60 18,47 1,71 2,94

05 71,50 48,90 21,03 1,39 2,19

Об 72,0 32,80 20,18 1,62 2,81

07 78,0 37,60 20,52 1,39 2,63

М±м=73,00 М±м=42,30 М±м=19,80 М±м=1,44 М±м=2,68

±1,05 ±2,36 ±0,71 ±0,07 ±0,12

а =0,28 а =0,62 а =0,11 а =0,60 о =1,22

Р1>0,99 Р[>0,99 Р,>0,99 Р,>0,99 Р[>0,99

К1 66,00 30,20 22,74 1,94 3,19

К2 72,00 33,80 21,03 1,81 2,81

КЗ 78,20 44,20 19,84 1,65 2,50

К4 74,20 32,80 17,78 1,62 2,81

К5 78,20 43,30 19,15 1,42 2,19

Кб 74,0 35,0 17,44 1,49 2,50

М±м=73,80 ±1,85 а =0,45 Р1>0,99 (12-1=0,08 1ё=0,38 Р2<0,95 М±м=36,50±2,40 а =0,58 Р1>0,99 (12-1=0,58 Ы=1,72 Р2<0,95 М±м=19,66±0,80 о =0,12 Р,>0,99 (12-1=0,01 1(1=0,04 Р2<0,95 М±м=1,65±0,01 о =0,61 Р,>0,99 (12-1=0,16 1(1=0,48 Р2<0,95 М±м=2,67±0,14 0=1,38 Р,>0,99 (12-1=0,08 1(1=0,16 Р2<0,95

Обозначения: Ф1-Ф5 — основные показатели до опыта

01-07 — животные опытной группы К1-К6 — животные контрольной группы (1 — показатели разности средних 1(1 — критерий достоверности разности Р] — достоверность уровня средних величин Р2 — достоверность разности средних опыта и контроля, при Р <0,95 полученная разность не достоверна.

Результаты цитологических и биохимических исследований проб крови свиней, дважды обработанных опрыскиванием препаратом ДИХИМ-1 при изучении терапевтической эффективности при сифункулятозе опытной (п=10) и контрольной (п=10) групп представлены в таблицах 7 и 8.

Таблица 7

Гематологические показатели свиней после двукратной обработки

препаратом ДИХИМ-1 0,005% концентрации (интервал 10 дней)

Группа Цитологические показатели

животных Эритроциты, 10,2/л Лейкоциты, 10' /л Лейкограмма,%

Б Э Ю П С Л М

Свиньи

опыт. гр. п=10 7,10 10,20 1,0 7,0 1,0 5,0 34,0 48,0 4,0

Свиньи

контр, гр. п=10 6,90 11,0 1,0 8,0 1,0 6,0 32,0 47,0 5,0

Норма вида 6,0-7,50 8,0-16,0 0,3- 4,0- 0- 3,0- 25,0- 40,0- 2,0-

0,8 12,0 2,0 6,0 35,0 50,0 5,0

Таблица 8

Результаты биохимических исследований крови свиней после двукратной обработки препаратом ДИХИМ-1 0,005% концентрации путем опрыскивания

Группа животных Биохимические показатели крови свиней

Общий белок, г/л Глобулины, г/л Билирубин, мкмоль/л Нв, г/л Кальций общий, ммоль/л Фосфор неорг., ммоль/л

Свиньи опьгт.гр. п=10 78,0 42,0 5,10 110,0 2,25 1,52

Свиньи контр.гр. п=10 72,0 39,0 4,76 107,0 2,56 1,78

Норма вида 70-85,0 34,0-46,0 1,37-5,13 99,0119,0 2,50-3,50 1,29-1,94

Обработка свиней препаратом ДИХИМ-1 путем опрыскивания 0,005% водным раствором 2 раза с интервалом 10 дней не оказывает негативного воздействия на цитологические и биохимические показатели крови.

Исследование эффективности препарата ДИХИМ-1 при различных заболеваниях животных

Саркоптоз свиней. Испытание провели на 231 голове (в трех опытах) свиней. Наблюдениями в течение 10 дней после второй обработки установили, что общее состояние животных опытной группы улучшилось, беспокойство и зуд прекратились, ранки и язвочки на коже подсохли, новые очаги поражения

не обнаруживались, клещей в соскобах кожи не находили. В группе, обработанной неоцидолом у части свиней (5 из 15 контрольных), которые были наиболее поражены, беспокойство и зуд уменьшились, но не прекратились полностью. Поэтому они были обработаны препаратом ДИХИМ-1. В группе чистого контроля признаки чесотки усилились зуд и беспокойства нарастали, у животных снизался аппетит, развивалось угнетение. В двух опытах животных контрольных групп обрабатывали бутоксом по инструкции. В одном из них ДИХИМ-1 и бутокс показали приблизительно одинаковый терапевтический эффект, в другом опыте после двукратной обработки бутоксом у части животных обнаруживали клещей в соскобах кожи, что потребовало третьей обработки.

Заключение. Установлено, что двукратная обработка с интервалом 10 дней свиней препаратом ДИХИМ-1 0,05% концентрации по АДВ путем опрыскивание из расчёта 15мл на 1кг массы тела освобождает животных от клещей Sarcoptes suis. Испытания показали, что ДИХИМ-1 превышает по эффективности неоцидол и, в отдельных случаях, бутокс.

Сифункулятоз свиней. Испытания провели на 214 головах свиней. Установлено, что уже после первой обработки препаратом ДИХИМ-1 0,005% по АДВ зуд у животных прекращался. После второй обработке (через сутки) животных обследовали на наличие живых вшей. В опытной группе (ДИХИМ-1) живых вшей не обнаруживали. В контрольной группе (препарат сравнения -бутокс 0,005% по АДВ) у части животных (10,0-15,0% от числа обработанных) обнаруживали на коже живых вшей.

Заключение. Препарат ДИХИМ-1 в концентрации 0,005% по АДВ превосходит по эффективности бутокс в концентрации 0,005% при сифункулятозе свиней. Двукратная обработка опрыскиванием препаратом в ДИХИМ-1 полностью освобождает животных от вшей.

Ктеноцефалидоз собак и кошек. Сравнительные испытания показали, что препарат ДИХИМ-1 эффективен в 3 раза более низкой концентрации, чем бутокс (дельтаметрин). Результаты представлены в таблице 9.

Таблица 9

Эффективность ДИХИМ-1 при ктеноцефалидозе собак и кошек

Препарат Количество живых блох после обработки

0,005% 0,004% 0,003% 0,002% 0,001% 0,0005%

ДИХИМ-1 нет нет нет нет нет единичн.

Бутокс нет нет нет единичн. много много

Отодектоз кошек. За животными наблюдали 10 дней после второй обработки; за этот период зуд и расчесы прекратились, животные перестали беспокоиться. Раны и язвочки кожи ушных раковин подсохли. Нарушенный

шерстный покров стал восстанавливаться. Накопление экссудата в слуховых проходах прекратилось. В соскобах кожи с бывших мест поражения при повторной микроскопии возбудителя не находили.

Заключение: двукратная обработка кошек 2,50 % (по АДВ) раствором препарата ДИХИМ-1 полностью освобождает животных от клещей О/оаЛгс/аг супо/ея.

Разработка методических положений и инструкции по применению препарата ДИХИМ-1

Нами разработаны и утверждены Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии (секция «Инвазионные болезни животных») «Методические положения по применению препарата ДИХИМ-1 при арахноэнтомозах животных» (протокол №3 от 23 сентября 2010г.), а также «Регламент лабораторный приготовления препарата ДИХИМ-1 для лечения эктопаразитозов животных» (протокол № 3 от 23 сентября 2010г.). Содержание Методических положений и Регламента изложены в различных разделах данной диссертационной работы.

«Инструкция по применению ДИХИМ-1 при арахноэнтомозах животных»

Общие сведения.

ДИХИМ-1 представляет собой комплексный препарат, содержащий активнодействующее вещество 2-(4,5-дихлор-1-имидазолилметил)-2-(нитровинил)-имидазолидин (10,0 вес.%), а также вспомогательные вещества -диметилсульфоксид (75,0 вес.%), эмульгатор (5,0 вес.%) и воду (10,0 вес.%).

По внешнему виду представляет собой жидкость от светло-желтого до коричневого цвета.

Выпускают ДИХИМ-1 расфасованным по 5,10,100 мл в полипропиленовых или стеклянных флаконах. Маркируют каждую емкость с указанием: названия препарата, номера серии, названия организации-производителя. ДИХИМ-1 по степени воздействия на организм относится к умеренно опасным веществам (3 класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76): ЛД 50 при пероральном введении составляет более 300,0 мг/кг массы тела, при накожном нанесении - более 1000,0 мг/кг массы тела. В рекомендуемых дозах хорошо переносится животными.

Порядок применения.

Приготовление рабочих растворов, нормы расхода и способ обработки представлены в таблице 15.

Не следует наносить препарат на влажную и поврежденную кожу, мыть животное в течение 3 суток после обработки.

Меры личной профилактики.

При работе с ДИХИМ-1 следует соблюдать общие правила личной гигиены и техники безопасности, предусмотренные при работе с лекарственными средствами.

Во время работы с препаратом ДИХИМ-1 не разрешается курить, пить и принимать пищу. По окончании работы следует тщательно вымыть руки теплой водой с мылом.

При опрыскивании животных следует пользоваться респиратором.

При случайном попадании препарата на кожу или в глаза его следует тот час смыть струей воды, при попадании внутрь - обратиться к медицинскому врачу.

В таблице 10 представлен порядок применения препарата ДИХИМ-1.

Таблица 10

Порядок применения ДИХИМ-1 при арахноэнтомозах животных

№ п/п Заболевание Способ приготовления рабочего раствора Концентрация АДВ в рабочем растворе, % Расход рабочего раствора Способ обработки

1 2 3 4 5 6

1. Саркоптоз свиней 50,0 мл препарата растворяют при перемешивании в 10,0 л теплой воды 0,05 15,0 мл на 1,0 кг массы тела Двукратное опрыскивание с интервалом 7,0-10,0 дней

2. Псороптоз кроликов 100, мл препарата растворяют в 300,0 мл воды 2,50 0,50-0,70 мл в каждое ухо Двукратная обработка с интервалом 7,0 дней

3. Сифункулятоз свиней 5,0 мл препарата растворяют в 10,0 л теплой воды 0,005 7,0-10.0 мл на 1,0 кг массы тела Двукратная обработка с интервалом 10,0 дней

4. Ктеноцефали-доз собак а) 5,0 мл препарата растворяют в 10,0 л теплой воды 0,005 7,0-10, мл на 1,0 кг массы тела Опрыскивание

б) 5,0 мл препарата смешивают с 5,0 мл воды 5,0 0,20 мл на 1,0 кг массы тела Нанесение на кожу в 3-4 местах

5. Ктеноцефали-доз кошек 5,0 мл препарата смешивают с 5,0 мл воды 5,0 0,5-0,70 мл на 1 кошку Наносится каплями на кожу в 3-4 местах

6. Отодектоз кошек 5,0 мл препарата смешивают с 151,0 мл воды 2,50 1,0-2,0 мл на 1,0 кошку Нанесение тампоном на очищенный слуховой проход

Хранение препарата.

Хранить препарат ДИХИМ-1 следует в недоступных для детей местах. Хранят препарат в сухом, защищенном от света месте, отдельно от продуктов питания и кормов, при температуре от 0 С0 до 30,0 С0 . Срок годности при соблюдении условий хранения — 2 года со дня изготовления.

3.4 Синтез, антибактериальная активность и токсичность новых препаратов ряда азотсодержащих гетероциклов

За период исследований синтезировали и определили уровень антибактериальной активности более 400 новых веществ. Минимальные бактерицидные концентрации синтезированных нами соединений расположены в интервале от 0,60 до 100,0 мкг/мл и выше. Наибольшей активностью обладают синтезированные в соответствии с научной гипотезой перйодиды гетероциклических аминов, а также полученные для тотального скрининга производные 5-нитро(Ьурана. пиридобензимидазола и 1.3-дизамещенные 2-иминобензимидазолина. Изучена активность 110 соединений ряда 1,3-дизамещённых-2-иминобензимидазолина, 56 перйодидов азотсодержащих гетероциклов, 23 производных пиридобензимидазола, 22 соединения ряда имидазола, 37 полизамещённых производных пиридина и 356 веществ других классов.

3.5 Синтез, антибактериальная активность и токсичность донорно-акцепторных комплексов галоген-гетероцикл (типа п-о).

Большинство синтезированных нами веществ в ряду азотсодержащих гетероциклов представляет собой гетероциклические структуры, имеющие свободную (неподелённую) электронную пару у атома азота, которая (пара) может служить донором электронов для образования донорно-акцептрных комплексов типа п-а с атомами галогена. В нашем исследовании в качестве акцептора мы выбрали уневерсальное антибактериальное вещество - йод. В качестве донора электронов использовали полученные нами, а также промежуточные и исходные азотсодержащие гетероциклы, которые должны были удотворять определенным требованиям: просто и с высоким выходом получаться, иметь низкую токсичность и достаточно высокую основность, которая напрямую связана с прочностью образующегося комплекса. Полученные в соответствии с научной гипотезой донорно-акцепторные комплексы изначально планировалось применять для лечения телят при колибактериозе, что потребовало их детальной фармако-токсикологической характеристики.

В таблице 11 представлена бактерицидная активность девяти наиболее перспективных перйодидов гетероциклических аминов, которые обладают рядом преимуществ перед другими перйодидами: высокими выходами при синтезе, низкой токсичностью, стойкостью при хранении.

Таблица 11

Сравнительная бактерицидная активность донорно-акцепторных комплексов йода с азотсодержащими гетероциклами, известных препаратов йода и некоторых антибиотиков

Препарат Минимальная бактерицидная концентрация веществ, мкг/мл

Е.соН ЙарЛ.аыгег« Рэ.аегиктоза

1 2 3 4

а? \ н 6,25-12,50 0,78 1,56

\ 12,50 6,25 12,50

\ 6,25-12,50 1,56 6,25

да:^ \ 6,25 1,56 6,25

да" \ н 6,25 1,56 6,25

да? \ 6,25 1,56 6,25

_Продолжение таблицы 11

1 2 3 4

1 6,25 0,78 6,25

и1-/

н

1 3,12 1,56 6,25

М-/ \

гРГ?-" 1,56 3,12 6,25

Иодинол 16,0 16,0-32,0 15,0-25,0

Раствор йода 16,0-64,0 64,0 16,0-32,0

Канамицина сульфат 100,0 3,0-6,0 25,0-50,0

Полимиксин 0,19 100,0 0,10-1,0

Левомицетин 100,0 1,50-50,0 100,0

Неоветин 100,0 0,40-10,0 3,0-200,0

Окситетрациклина гидрохлорид 100,0 1,60-100,0 100,0

Сравнивая величину бактерицидной активности перйодидов азотсодержащих гетероциклов с данными для йодинола, йода и ряда антибиотиков, видим, что их показатели в отношении Е.соИ превосходят активность йодинола, раствора йода, канамицина, левомицетина, неоветина и окситетрациклина гидрохлорида; в отношении 8!арк.аигеш активность разработанных нами соединений превосходит активность йодинола, йода, полимиксинна; в отношении Ps.aгruginosa их активность выше, чем у йодинола, раствора йода, канамицина, левомицетина и окситетрациклина гидрохлорида.

Изучение острой токсичности показало, что ЛД50 всех соединений выше 1,5 г/кг массы тела, что в пересчёте на чистый йод составляет более 1,0 г/кг массы тела. В то же время йод в форме водного раствора в йодистом калии в дозе 0,9 г/кг массы тела вызывает гибель 100,0% животных.

Таким образом, в изученных соединениях, благодаря образованию донорно-акцепторной связи йода с атомом азота, токсичность препаратов в пересчёте на чистый йод значительно снизилась при одновременном усилении антибактериальной активности.

Нами детально изучена антимикробная активность трёх перйодидов азотсодержащих гетероциклов в отношении различных видов микроорганизмов и, особенно, в отношении Escherihia coli, поскольку препараты этого ряда планировалось использовать в качестве лечебных средств при колибактериозе телят раннего возраста. Результаты испытаний представлены в таблице 12.

Таблица 12

Минимальные бактерицидные концентрации перйодидов азотсодержащих гетероциклов в отношении Escherihia coli и некоторых других

микроорганизмов

Микроорганизмы Минимальная бактерицидная концентрация, мкг/мл

Snv* LNJ XX? \ H Xcf \

Escherihia coli 015 1,56 0,39 0,39

Escherihia coli 020 6,25 3,12 3,12

Escherihia coli 0117 6,25 3,12 0,62

Escherihia coli (22 штамма; выделены от павших телят,) 0,39-2,50 0,20-0,69 0,20-0,62

Pseudomonas aeruginosa ЮЖ-2 6,25 0,69 0,20

Staphylococcus aureus P209 3,12 0,69 0,39

Staphylococcus aureus (полевой изолях) 6,25 6,25 0,20

Bacillus subtilis 6633 5,0 0,39 0,39

Bacillus mycoides № 537 0,62 0,20 0,39

Sarsina lutea ATCC 9941 1,25 0,62 0,39

Из данных таблицы видно, что перйодиды азотсодержащих гетероциклов обладают высокой политропной бактерицидной активностью в отношении различных штаммов Escherihia coli, а так же других видов микроорганизмов. Полевые изоляты эшерихий так же чувствительны, как и их референтные штаммы.

Пересевы (произведено 100 пассажей) Escherihia coli 1115 на бульоне Хоттингера в присутствии донорно-акцепторных комплексов йода с азотсодержащими гетероциклами не приводят к изменению чувствительности тест-культуры, что является их существенным преимуществом перед другими антибактериальными препаратами.

Установили. что ЛДзд для белых крыс перйодида 5.6-диметилбензимидазола составляет 5.0 г/кг массы тела. Немного менее токсичны перйодиды гексаметилентетрамина и 1.2-диметил-5-метоксибензимидазола ШД^п равно 5.20 и 5.80 г/кг массы тела соответственноУ В результате этих исследований выявили следующую закономерность: образование донорно-акцепторной связи типа п-сг при взаимодействии третичных аминов с йодом приводит к резкому снижению токсичности йода, причем антибактериальная активность в отношении некоторых микроорганизмов возрастает в сравнении с водным раствором йода.

Ветеринарные препараты, применяемые для лечения телят раннего возраста при желудочно-кишечных заболеваниях не должны снижать активности лактоглобулинов. Результаты сравнительного изучения свойств нативного и инкубированного с перйодидами азотсодержащих гетеропиклов противоколипротейного лактоглобулина показали: во всех изученных образцах четко выявлены дуги преципитации у - глобулинов. В - лактоглобулинов и а — лактальбуминов. Как контрольные, так и опытные (инкубированные с перйодидами азотсодержащих гетероциклов) образцы противоколипротейного лактоглобулина существенно не отличались по общему белку, белковым фракциям, содержанию основных классов иммуноглобулинов и титру антител к вакцинным штаммам Е.соИ и Рг.тпгаЫНз.

Совместимость перйодидов азотсодержащих гетероциклов с антибактериальными препаратами по тесту антимикробной активности

Определяли минимальные бактерицидные концентрации (МБК) отдельных препаратов и их смесей с перйодидами азотсодержащих гетероциклов. Рассчёт индекса взаимодействия (ИВ) показал, что в 12 комбинациях из 18 изученных перйодиды гексаметилентетрамина, 5,6-диметилбензимидазола и 1,2-диметил-5-метоксибензимидазола оказались совместимы с полимиксином, неоветином, фурациллином и ципрофлоксацином. Нами установлено также, что данные перйодиды совместимы с антибиотиками и по тесту острой токсичности.

Скорость разложения перйодидов азотсодержащих гетероциклов в желудочно-кишечном тракте лабораторных крыс

Нами изучена скорость разложения в желудочно-кишечном тракте лабораторных крыс трёх перйодидов: гексаметилентетрамина, 5,6-диметилбензимидазола, 1,2-диметил-5-метоксибензимидазола в дозе 0,50 г/кг массы тела. Использовали животных массой 170,0-180,0 г (по 3 головы в группе). Установили, что препараты находились в желудочно-кишечном тракте лабораторных крыс в течение 6 часов. Через 2 часа препараты обнаруживали во всем тонком кишечнике (на расстоянии 60,0-100,0 см, от пилоруса до слепой

кишки). Через 4 часа препараты находили во всех отделах желудочно-кишечного тракта крыс. Скорость разложения всех трёх препаратов была одинаковой.

Результаты исследований показали ряд полезных свойств перйодидов азотсодержащих гетероциклов: высокую бактерицидную активность политропного действия (МПК 1,0 - 3,0 мкг/мл), незначительную токсичность, совместимость с лактоглобулинами и средствами регидратации, сохранение до 6 часов активности в желудочно-кишечном тракте, стабильность антибактериальной активности в присутствии инактивирующих веществ. Таким образом, установили, что перйодиды азотсодержащих гетероциклов по сумме полезных свойств могут быть использованы в качестве активно действующих веществ в ветеринарных препаратах при желудочно-кишечных заболеваниях молодняка сельскохозяйственных животных.

В таблице 13 представлена сравнительная характеристика свойств перйодидов азотсодержащих гетероциклов и других йодсодержащих препаратов.

Таблица 13

Сравнительная характеристика некоторых свойств растворов йода, йодинола и перйодидов азотсодержащих гетероциклов

Наименование веществ Токсичность для белых крыс ЛД!0, г/кг Время действия в жкт Отношение к белкам МПК в отношении Е.соН, мкг/мл

Водный раствор йода 0,40 5-7 мин Реагирует 16-64

Иодинол >0,90 10-15 мин Реагирует 16-32

5,20 б часов Не реагирует 0,60-6,0

XX? \ н 5,0 6 часов Не реагирует 0,30-3,0

Ххг \ 5,80 6 часов Не реагирует 0,30-3,0

Совокупность результатов исследований, представленных выше, позволили нам приступить к изучению перйодидов азотсодержащих гетероциклов в качестве терапевтических средств при инфекционных заболеваниях сельскохозяйственных животных. Поскольку изученные детально перйодиды показали приблизительно одинаковые свойства, то по экономическим соображениям в опытах на сельскохозяйственных животных нами применялся перйодид гексаметилентетрамина.

З.б Применение перйодида гексаметилентетрамина для лечения телят при колибактериозе

Все исследования по применению перйодида гексаметилентетрамина проведены совместно A.A. Зубенко и JI.H. Фетисовым. Материалы исследований изложены в совместных статьях, патенте на препарат «Колицид», материалах, поданных в Ветфармсовет, а также в кандидатской диссертационной работе Л.Н.Фетисова, выполненной под руководством A.A. Зубенко.

Опыты по изучению лечебной эффективности перйодида гексаметилентетрамина при колидиарее телят. Опыты этой серии провели на телятах, принадлежащих двум хозяйствам (колхоз им.Ленина Аксайского района Ростовской области и совхоз «Персиановский» Октябрьского района Ростовской области) с близкими условиями содержания телят раннего возраста: 1-2 секционные профилактории для одновременного содержания 20-30 телят. 92% новорожденных телят на 2-3 день жизни заболевали. Появлялась диарея, быстро приводящая животных к развитию дегидратационного состояния, телята слабели, теряли аппетит. Гибель животных достигала 25%.

Телятам опытных групп с момента появления первых признаков заболевания давали перйодид гексаметилентерамина в дозе 0,15 г/кг массы тела с физиологическим раствором (0,85% водный раствор хлорида натрия) по 50100мл на приём за 20-30 минут до выпойки молока, 2 раза в день. Животные контрольных групп получали антибактериальные препараты, используемые на тот момент в хозяйстве: опыт №1- тетрациклин и норсульфазол; опыт №2 -тетрациклин и фуразолидон; опыт №3 — ЛЭРС; опыт №4 — тетрациклин и сульфамонометоксин; опыт №5 - левомицетин и фталазол; опыт №6 -левомицетин внутрь и неомицин внутримышечно. Препараты применяли в рекомендуемых для телят дозах. При лечении телят обеих групп использовали патогенетические и симптоматические средства, по окончании лечения антибактериальными препаратами назначали бактериальные препараты АБК, ПАБК.

Опыт №1. В опытной группе из 40 телят погибло 2, сохранность составила 95%. Длительность лечения - 2 суток. В контрольной группе из 38 телят погибло 9, сохранность составила 76%, длительность лечения - 3,5 суток.

Опыт№2. В опытной группе из 45 телят пало 4, сохранность составила 91,1%. Длительность лечения - 2,2 суток. В контрольной группе из 25 телят погибло 4. Сохранность составила 84%. Длительность лечения - 2,8 суток.

Опыт №3. В опытной группе из 47 телят погибло 3, сохранность составила 93,6%. Длительность лечения - 2,4 суток. В контрольной группе из 35 телят погибло 3, сохранность составила 91,4%. Длительность лечения - 2,5 суток.

Опыт №4. В опытной группе из 40 телят погибло 4, сохранность составила 90%. Длительность лечения -1,9 суток. В контрольной группе из 22 телят погибли 4, сохранность составила 82%. Длительность лечения - 3,5 суток.

Опыт №5. В контрольной группе из 25 телят все остались живы, сохранность -100%. Длительность лечения - 2,0 суток.

В контрольной группе из 15 телят погибло 2, сохранность составила 86,7%. Длительность лечения - 3,8 суток.

Опыт №6. В опытной группе из 42 телят погибли 3, сохранность составила 93%. Длительность лечения - 2,1 суток. В контрольной группе из 35 телят погибли 5, сохранность составила 85,7%. Длительность лечения - 3,4 суток.

Таким образом, в опытных группах сохранность телят была стабильно выше 90%, достигала в отдельных опытах 100% и в среднем составила 93,8%, в то время как в контрольных группах сохранность была от 76% до 91,4% и в среднем составила 84,4%. Длительность лечения в опытных группах в среднем была на 1,15 суток меньше, чем в контрольных группах.

Выводы

1. Сформулирована и экспериментально подтверждена гипотеза о возможности получения высокоэффективных инсектоакарицидных средств путём замены шестичленного пиридинового кольца на пятичленный имидазольный цикл в структуре природных противопаразитарных алкалоидов анабазине и никотине. Выявлена зависимость величины активности от вида, количества и местоположения заместителей в имидазольном кольце: активностью обладают производные имидазола, не имеющие заместителей во втором положении; соединения с алкильными и аминогруппами в положениях 4 и 5, а также производные бензимидазола, не обладают активностью; наличие атомов галогенов в положениях 4 и 5 повышает активность, причём наиболее

эффективны производные 4,5 - дихлоримидазола. С учётом выявленных зависимостей структура-активность, было синтезировано новое органическое соединение: 2-(4,5-дихлор-1 -имидазолилметил)-2-(нитровинил)-имидазолидин, которое предложено в качестве активно действующего вещества инсектоакарицидного препарата ДИХИМ-1.

2. Выявлен эффект, состоящий в том, что в структуре АДВ ДИХИМ-1 решающее значение для наличия активности имеет длина связывающего мостика (количество метиленовых звеньев) между имидазольным гетероциклом и кольцом 2-(нитровинил)-имидазолидина: соединения с одним метиленовым звеном обладают инсектоакарицидной активностью; напротив, увеличение числа звеньев до двух или трёх приводит к полной потере активности.

3. Разработан новый способ синтеза 4,5 — дихлоримидазола -структурного фрагмента АДВ ДИХИМ-1, что позволяет повысить выход продукта на 20 - 30% по сравнению с описанными в литературе способами.

4. Установлено, что скрининг соединений на инсектоакарицидную активности на модели Ь.<1есет1теа1а - удобный, эффективный и низкозатратный способ биотестирования больших массивов органических соединений.

5. В сравнительных испытаниях на личинках Ь.<1есетНпеа1а АДВ ДИХИМ-1 обеспечивает гибель 100% личинок в концентрации 0,0005%, в то время как для имидаклоприда, фипронила и дельтаметрина эти цифры составляют 0,001%, 0,005% и 0,01% соответственно.

6. Экспериментально установлено, что препарат ДИХИМ-1 обеспечивает 100% эффективность при саркоптозе свиней (двукратное опрыскивание с интервалом 7-10 дней 0,05% раствором по АДВ из расчета 15 мл на 1 кг массы тела), сифункулятозе свиней (двукратное опрыскивание 0,005% раствором из расчёта 7-10 мл на 1 кг массы тела), псороптозе кроликов (двукратная обработка 2,5% раствором с интервалом 7 дней из расчёта 0,5-0,7 мл в каждое ухо), а также при ктеноцефалидозе собак и кошек как путем опрыскивания 0,005% раствором, так и нанесением 5% раствора на кожу животных из расчёта 0,2 мл на 1 кг массы тела. Препарат эффективен также при отодектозе кошек (1-

2 мл 5% раствора на 1 кошку при нанесении тампоном в очищенный слуховой проход).

7. Обнаружен эффект, состоящий в том, что введение заместителей в положения 1 и 3 азотсодержащего гетероцикла бензимидазола при наличии аминогруппы в положении 2 приводит к появлению противопаразитарных (антипротозойных) свойств. При этом анализ зависимости структура-активность позволяет сделать заключение, что решающее значение для наличия активности имеют свойства 1,3-заместителей; гидрофильные заместители и заместители небольшого размера резко снижают активность, 3,4-дихлорбензильный и бета-феноксиэтильный заместители в первом и (или) третьем положении обеспечивают высокий антипротозойный эффект: 11 соединений этого ряда имеют МИК менее 1 мкг/мл в отношении Со1рос1а я 1етН .Наряду с этим, структуры с такими заместителями показали высокую антибактериальную активность с величинами МИК 1-5 мкг/мл в отношении Л.аыгеия и 20-50 мкг/мл в отношении Е.соН.

8. Сформулирована и экспериментально подтверждена гипотеза, заключающаяся в том, что образование донорно-акцепторных комплексов с участием молекулы йода и азотсодержащими осшвными гетероциклами может привести к препаратам, выгодно отличающимся по фармако-токсикологическим характеристикам от других форм комбинированных препаратов йода.

9. Экспериментально установлено, что ЛД50 комплексов йода с 5,6-диметилбензимидазолом, 1,2-диметшг-5-метоксибензимидазолом и гексаметилентетрамином составляет для лабораторных крыс 5,0-5,8 г/кг массы тела, что в пересчете на содержащийся в комплексах йод составляет около 3,4 г/кг массы тела, в то время как йод в форме водного раствора в йодиде калия вызывал гибель 100% животных в дозе 0,9г/кг массы тела, при этом минимальные бактерицидные концентрации синтезированных комплексов составляют 0,2 — 6,0 мкг/мл в отношении трёх референтных и 22 полевых штаммов Е.соН, а также некоторых видов бацилл, причём одинаково чувствительны как референтные, так и полевые штаммы, а многократные пересевы (100 пассажей) Е.соН 0115 в присутствии возрастающих

концентраций препаратов не привели к изменению чувствительности тест-культуры.

10. Комплексы йода с 5,6-диметилбензимидазолом, 1,2-диметил-5-метоксибензимидазолом и гексаметилентетрамином не влияют на свойства противоколипротейного лактоглобулина, совместимы со средствами регидратации и некоторыми антибактериальными препаратами (в 12 комбинациях из 18 изученных) как по тесту антибактериальной активности, так и по тесту токсичности, а также характеризуются длительным (до 6 часов) действием в желудочно-кишечном тракте.

11. На основании анализа выявленных фармако-токсикологических характеристик комплексов йода с азотсодержащими гетероциклами предложен препарат на основе комплекса йода с гексаметилентетрамином для лечения телят при колибактериозе. В серии опытов применение комплекса йода с гексаметилентетрамином в дозе 0.15-0.20 г/кг массы тела 2 раза в день обеспечило сохранность телят выше 90,0%. В отдельных опытах сохранность телят составила 100,0%, а в среднем была не менее 93,8%, в то время как в контрольных группах сохранность была от 76,0% до 91,4% и в среднем составила 84,4%. Длительность лечения в опытных группах в среднем была на 1,15 суток меньше, чем в контрольных группах.

12. Разработан препарат «Колицид» для лечения телят при колибактериозе на основе донорно-акцепторного комплекса йод-гексаметилентетрамин в качестве активно действующего вещества. Производственные испытания показали преимущества «Колицида» по сохранности телят, сокращению сроков лечения, приросту массы тела. В опытной группе из 141 теленка выздоровело 127, пало 14, длительность лечения составила 3 дня, среднесуточный прирост массы тела за первые 10 дней жизни составил 276 г в расчёте на одного телёнка; в контрольной группе из 290 телят выздоровление наступило у 255 телят, пало 35 телят, длительность лечения составила 5,7 дней, прирост массы тела составил 270граммов. Таким образом, лечебная эффективность «Колицида» составила 90,1%, контрольных препаратов (ЛЕРС и этокан) 87,9%. Длительность лечения телят при колибактериозе препаратом «Колицид» в 1,9

раза меньше, чем длительность лечения с использованием средств, применяемых в хозяйстве.

Предложения производству

1. «Методические положения по применению препарата ДИХИМ-1 при арахноэнтомозах животных».

2. «Регламент лабораторный приготовления препарата ДИХИМ-1 для лечения экгопаразитозов животных».

3. «Регламент лабораторный (технологический) синтеза и очистки антибактериальных препаратов на основе 2-иминобензимидазола».

4. Препарат «Колицид» для лечения телят при колибактериозе.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. AC USSR №433148 Способ получения виниловых эфиров в ряду 2-замещённых бензимидазола / Попов И.И., Симонов A.M., Зубенко A.A. - Бюлл. №23,25.06.1974.

2. AC USSR № 444768 Способ получения производных 4-(бензимидазолил-2)-метилен-диоксолана-1,3 / Зубенко A.A., Попов И.И., Симонов A.M. - Опубл. 30.09.1974. Бюлл. № 36, 1974.

3. AC USSR № 449047 Способ получения производных 4-(бензимидазолил-2)-метилен-диоксолана-1,3 / A.M. Симонов, И.И. Попов, A.A. Зубенко - Опубл. 05.11.1974. Бюлл. № 41,1974.

4. AC USSR № 911774. Способ лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний животных и препарат для его осуществления / A.A. Зубенко, В .И. Ливицкий, Л.Н. Фетисов [и др.]- №2759652; заявл. 17.05.1979; Бюлл. № — с 6.

5. Диваева, Л.Н. Синтез, антимикробная и протистоцидная активность гидрохлоридов 1-арилоксиэтил - (бензил)-3-карбомоилметил-2-иминобензимидазолинов / Л.Н. Диваева, A.C. Морковник, A.A. Зубенко [и др.] // Химико-фармацевтический журнал, 2014. - Том 48, № 10. - С. 91 - 94.

6. Должиков, М.А. Скрининг новых инсектоакарицидов: проблемы и перспективы / М.А. Должиков, A.A. Зубенко, И.В. Зубенко [и др.] // Сб. научных трудов ГНУ СКЗНИВИ« Актуальные проблемы научного обеспечения устойчивого развития животноводства Южного федерального округа» -Новочеркасск, 2006. - С. 74-75.

7. Зубенко, A.A. Реакции электрофилыюго замещения в ряду 2-этинилбензимидазолов / A.A. Зубенко, И.И. Попов, A.M. Симонов // Химия гетероциклических соединений, 1974. - №11 - С. 1544-1546.

8. Зубенко, A.A. Реакции нуклеофильного присоединения в ряду 2-этинилбензимидазолов / A.A. Зубенко, И.И. Попов, A.M. Симонов // Химия гетероциклических соединений, 1978. - №11 - С. 1539-1543.

9. Зубенко, A.A. Результаты испытания йодсодержащего препарата КС-2 при балантидиозной дизентерии свиней / Зубенко A.A., Фетисов JI.H. // Сб. научных трудов СКЗНИВИ «Профилактика заболеваний животных в хозяйствах промышленного типа» - Новочеркасск, 1984. — С. 29-32.

10. Зубенко, A.A. Об антимикробной активности йода, адсорбированного на активированном угле / Зубенко A.A., Фетисов Л.Н. // Сб. научных трудов СКЗНИВИ и Прикаспийского зонального НИВИ «Профилактика незаразных болезней сельскохозяйственных животных и ветеринарно-санитарное обеспечение животноводческих помещений» Новочеркасск, 1991. - С. 60-62.

11. Зубенко, A.A. Новые синтезы в ряду 2-этинилбензимидазолов / A.A. Зубенко, И.И. Попов, A.M. Симонов // Химия гетероциклических соединений, 1978. -№8 - С. 1111-1114.

12. Зубенко, A.A. Синтез и превращения ацилпроизводных бензимидазола / A.A. Зубенко, И.И. Попов // Химия гетероциклических соединений, 1997. - № - С.

13. Зубенко, A.A. Синтез и инсектицидная активность производных фталазина / A.A. Зубенко, Д.А. Зубенко, Л.Н. Фетисов // Материалы Первой международной конференции «Химия и биологическая активность азотистых гетероциклов и алкалоидов» - Москва, 2001. - т.2. - С. 115.

14. Зубенко, A.A. 1,2,4 Триазоло- [3,4-а] - фталазины: синтез, инсектицидная и фунгицидная активность / A.A. Зубенко, Л.Н. Фетисов, И.В. Зубенко, Е.А. [и др.] // Материалы международной конференции «Химия и биологическая активность синтетических и природных соединений». - Т.2: М., 2006.-С. 119

15. Зубенко, A.A. Новый инсектоакарицидный препарат из класса азотистых гетероциклов / A.A. Зубенко, Л.Н. Фетисов, И.В. Зубенко // Вестник ветеринарии - Ставрополь, 2007. - №43 (4/2007).- С. 19 - 21.

16. Зубенко, A.A. Новый инсектоакарицидный препарат при псороптозе кроликов / A.A. Зубенко, Л.Н. Фетисов, А.Н. Бодряков [и др.] // Материалы Всероссийской научно-практической конференции СКЗНИВИ «Актуальные проблемы ветеринарного обеспечения Российского животноводства». - Новочеркасск,2010. - С. 111-112.

17. Зубенко, А.А: Токсичность нового инсектоакарицидного средства / A.A. Зубенко, Л.Н. Фетисов, Н.В. Стрельцов (и др.] //

Международный ветеринарный журнал «Ветеринарная патология». - 2011. -№1-2(36).-С. 22-25.

18. Зубенко, A.A. Кокцидиоз, проблемы лечения, скрининг новых протистоцидных веществ / А.А Зубепко., JI.H. Фетисов, А.Н. Бодряков [и др.]. // Международный ветеринарный журнал «Ветеринарная патология». - 2012. - №4(42) (ISSN 1682-5616). - С. 64-66.

19. Клименко, А.И. Скрининг новых инсектоакарицидов в ряду азотсодержащих гетероциклов / А.И. Клименко, JI.H. Фетисов, A.A. Зубенко [и др.] II Международный ветеринарный журнал «Ветеринарная патология». -2011. - №1-2 (36). - С. 33-38.

20. Патент РФ № 2009132. Перйодиды бензимидазолия, обладающие антимикробным действием / A.A. Зубенко, JI.H. Фетисов - № 5037408/04; заявл. 22.04.92; выдан 15.03.94; Бюл. №5. - с. 12.

21. Патент SU 1809942АЗ. Препарат для лечения желудочно-кишечных заболеваний телят / A.A. Зубенко, Л.Н. Фетисов - № 4916405,заявл. 04.03.1991; выдан-10.10.1992. Бюл. №2 - с.8.

22. Патент RU № 2051156 Производные полиоснования, обладающие иммуностимулирующей и антибактериальной активностью / Зубенко A.A., Фетисов Л.Н. - № 5037407, заявл. 22.04.92; per. В Госреестре изобретений 27.12.95., Бюлл. № 36.-е. 12.

23. Патент РФ № 2355388 С2 Способ лечения псороптоза овец и препарат для его осуществления / М.А.Должиков, А.А.Зубенко, А.И.Клименко [и др.]. Заявл. №2007121037/13, 04.06.2007. Опубл. 20.05.2009. Бюлл. № 14.

24. Патент РФ №2425044. Производные нитрофурана, обладающие антибактериальным действием / Кузьменко, Т.А., Морковник A.C., Фетисов Л.Н. [и др.] - №2009134915/04, заявл.17.09.2009; Опубл. 27.07.2011. Бюл.№21. -с. 6.

25. Патент РФ №2425035. Способ получения 4,5-Дихлоримидазолов. / Зубенко A.A., Фетисов Л.Н., Зубенко И.В. [и др.]. - №2009138200/04 заявл. от 15.10 2009. Опубл. 27.07.2011 Бюл.№21. - с. 6

26. Патент RU №2427365. Способ лечения арахноэнтомозов животных и препарат для его осуществления / A.A. Зубенко, А.И. Клименко, Л.Н. Фетисов, [и др.]- от 27.08.2011 опубл. Бюл.№ 24 - с. 5.

27. Патент РФ №2394824. Производные пиридо [1,2-а] бензимидазола, обладающие антибактериальным действием, и способ их получения / Зубенко A.A., Фетисов Л.Н, Попов Л.Д. [и др.] - №2008151859/04; заявл. 25.12.2008, Опубл. 20.07.2010. Бюл.№20. - с. 5

28. Патент РФ № 2423355. 1,3-дизамещенные 2-иминобензимидазолина, обладающие антибактериальным действием / A.C.

Морковник, JI.H. Диваева, Л.Н. Фетисов [и др.] - № 2009134924/04; заявл. 17.09.2009; выдан 10.07.2011, Бюл.№19. - с. 8.

29. Патент РФ № 2514007 С1 Протистоцидная активность 2-(4,5дихлоримидазолил-1)-5- нитропиридина / A.A. Зубенко, А.И. Клименко, Л.Н. Фетисов - №2012142539/15 (068403); заявл. 04.10.2012. Опубл. 27.04.2014. Бюлл. №12.

30. Патент РФ № 2514196 CI, 1-омега-Арилоксиалкил - и 1-бензилзамещенные 2-иминобензимидазолинов и их фармакологически приемлемые соли, обладающие протистоцидной и антимикробной активностью / Л.Н. Диваева, A.C. Морковник, А.И. Клименко, A.A. Зубенко [и др.] - № 2012141810/04 (067323); заявл. 01.10.2012 .Опубл. 27.04.2014. Бюлл.№ 12.

31. Патент РФ № 2513993 С2. Производные 1-(2-арилоксиэтил)- и 1-бензилзамещенных 3-(2-гидроксиэтил)-2-иминобензимидазолина, обладающие антибактериальной и протистоцидной активностью / A.A. Зубенко, А.И. Клименко, A.C. Морковник [и др.] - № 2012110853/04(016310). Опубл. 27.04.2014. Бюлл. № 12.

32. Патент РФ № 2477129. Способ лечения кокцидиоза (эймериоза) сельскохозяйственных животных и птиц / Клименко А.И., Зубенко A.C., Фетисов Л.Н. [и др.] - №2011130121/15 от 19.07.2011. опубл. 10.03.2013 Бюл.№7.

33. Попов, И.И. Превращения 2-формилиндазолов в реакции Виттига / И.И. Попов, A.A. Зубенко, А.М. Симонов [и др.] // Химия гетероциклических соединений, 1975. - №12 - С. 1678-1681.

34. Попов, И.И. Взаимодействие 1-метил-2-этинилбензимидазола с ацетоном / И.И. Попов, А.М. Симонов, A.A. Зубенко // Химия гетероциклических соединений, 1975. - №2 - с.140.

35. Попов, И.И. Присоединение спирта к 1-метил-2-этинилбензимидазолу / И.И. Попов, А.М. Симонов, A.A. Зубенко // Журнал оргапической химии, 1975. — т.11. - С. 1139-1140.

36. Попов, И.И. Превращения диацетонового спирта в реакции с ацетиленидом натрия / И.И. Попов, A.A. Зубенко // Журнал общей химии, 1975. - т.45. — С. 481.

37. Попов, И.И. К синтезу 2-винилбензимидазола / И.И. Попов, А.М. Симонов, A.A. Зубенко II Химия гетероциклических соединений, 1976. - №8-С. 1145.

38. Попов, И.И. Синтез некоторых N-винилбензимидазолов / И.И. Попов, П.В. Ткаченко, A.A. Зубенко, А.М. Симонов // Химия гетероциклических соединений, 1978. - №5 - С. 663-665.

39. Попов, И.И. Новые синтезы в ряду 2-винилбепзимидазолов / И.И. Попов, В.Н. Нарежная, A.A. Зубенко // Химия гетероциклических соединений, 1978. -№9 - С. 1104-1107.

40. Попов, И.И. Превращения 2-этииилбензимидазолов в реакции с алифатическими кетонами / И.И. Попов, A.A. Зубенко, A.M. Симонов // Химия гетероциклических соединений, 1978. - №11 - С. 1535-1538.

41. Попов, И.И. Синтез и превращения ацилпроизводных бензимидазолов / И.И. Попов, A.A. Зубенко // Химия гетероциклических соединений, 1997. - №3 - С. 348-355.

42. Фетисов, JI.H. Личинки колорадского жука как тест - объект при скрининге новых инсектоакарицидов / Л.Н. Фетисов, A.A. Зубенко, М.А. Должиков // Вестник ветеринарии - Ставрополь, 2005. - №32 (1/2005). - С. 3538.

43. Фетисов, Л.Н. Доступные тест-объекты при скрининге инсектоакарицидов / Фетисов Л.Н., Зубенко A.A., Зубенко И.В. // Вестник ветеринарии. - Ставрополь, 2007. - №43 (4/2007). - С. 21-23.

44. Фетисов Л.Н. Проблемы и перспективы скрининга новых протистоцидных средств / Л.Н. Фетисов, A.A. Зубенко, А.Н. Бодряков // Всероссийская научно-практическая конференция «Научное обеспечение устойчивого развития отраслей животноводства Российской федерации». -Новочеркасск, 2012. - С. 110-113.

45. Фетисов, Л.Н. Изыскание новых протистоцидных средств / Л.Н. Фетисов, A.A. Зубенко, А.Н. Бодряков [и др.] // Материалы международного паразитологического симпозиума «Современные проблемы общей и частной паразитологии», 15-16 ноября 2012 года. Опубл. в информационно-аналитическом журнале «Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии». - 2012. - №4/1 (ISSN 2072-6023). -С. 70-73.

46. Щербань, Н.Ф. Применение галогенсодержащего препарата «колицид» в комплексе лечебно-профилактических мероприятий при диарее новорожденных телят / Н.Ф. Щербань, A.A. Зубенко, Л.Н. Фетисов // Сб. трудов СКЗНИВИ и Прикаспийского зонального НИВИ «Бактериальные и вирусные болезни сельскохозяйственных животных и птиц в хозяйствах Северного Кавказа» - Новочеркасск, 1988. - С. 104-106.

Подписано в печать 23.09.2015 г. Объем - 6 печ

отпечатано в типографии ИП Юсупова Л. А., ИНН 166000481539, 420029, г. Казань, ул. Мира 19 - 22, тел.: 279-53-80, заказ № 2229, 2015 г. Тираж 100 экз.