Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фармако-токсикологические свойства и терапевтическая эффективность противопаразитарного препарата на основе эприномектина в форме пур-она

ВАК РФ 03.02.11, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Фармако-токсикологические свойства и терапевтическая эффективность противопаразитарного препарата на основе эприномектина в форме пур-она"

На правах рукописи^,

Семышева Мария Сергеевна

ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРОТИВОПАРАЗИТАРНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЭПРИНОМЕКТИНА В ФОРМЕ ПУР-ОНА

03.02.11 - паразитология

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г 1 ноя 2013

005538716

Москва -

2013

005538716

Работа выполнена в ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ») в отделе качества и стандартизации фармакологических лекарственных средств для животных и ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени

К.И. Скрябина» (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ) на кафедре паразитологии и инвазионных болезней животных

Научные руководители: академик РАН, доктор ветеринарных наук,

профессор

Василевич Федор Иванович

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Виолин Борис Викторович

Официальные оппоненты: Гламаздин Игорь Геннадьевич

доктор ветеринарных наук, профессор кафедры ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»

ЖелтовВасилийАлексеевич

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии»

Ведущая организация: ФГБУ «Федеральный центр токсикологической,

радиационной и биологической безопасности» (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»)

Защита состоится «11» декабря 2013 года в 1500 часов на заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 006.011.11, созданного на базе ГНУ Всероссийский паучно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина (ВИГИС) Россельхозакадемии

по адресу: 117218, г. Москва, Б. Черемушкинская ул., д. 28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИГИС.

Автореферат разослан «/» ноября 2013 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук,

доктор биологических наук, профессор Бережко Вера Кузьминична

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Паразитарные болезни животных имеют широкое распространение и наносят мясному и молочному скотоводству значительный экономический ущерб. Одним из основных энтомозов среди паразитарных болезней крупного рогатого скота является гиподерматоз.

Гиподерматоз — хронически протекающее инвазионное заболевание крупного рогатого скота, вызываемое личинками подкожных оводов Hypoderma bovis и Hypoderma lineatum, характеризующееся воспалительными процессами в местах их локализации и общей интоксикацией организма продуктами жизнедеятельности паразита. В результате, развивающегося патологического процесса, уменьшается мясная и молочная продуктивность, теряется ценность кожевенного сырья, а также снижается качество и биологическая ценность, получаемых от инвазированных животных продуктов. (М.В. Воронин, Е.В. Клементьева, 1964; В.П. Хлопицкий, Р.Т. Сафиуллин, 2006; P.J. Scholl 1993).

Учитывая серьезный ущерб, вызываемый личинками оводов, у нас в стране и за рубежом для лечения и профилактики гиподерматоза используется большой ассортимент лекарственных средств различных химических групп. (Ф.И. Василевич, С.И. Стасюкевич, 2013) Препараты отличаются между собой структурой, механизмом действия, характером метаболизма в организме и продолжительностью остаточного действия, токсичностью для животных и человека, уровнем вреда, наносимого окружающей среде.

В последние годы широкое распространение против личинок подкожных оводов получили лекарственные средства на основе авермектинов и, в первую очередь, ивермектина, более 20 которых зарегистрированы в Российской Федерации. Препараты на основе авермектинов обладают высокой эффективностью, широким спектром действия (инсектицидная, акарицидная и нематоцидная активность), относительно низкой токсичностью для млекопитающих и достаточной экологической безопасностью, поэтому по совокупности положительных свойств сегодня являются эталонными противопаразитарными средствами (J. Vercruysse, R.S. Rew 2002).

Авермектины ничем не отличаются от других лекарственных средств, к действию которых в соответствии с эволюционными процессами рано или поздно возникают устойчивые организмы. Поэтому, начиная с конца 80-х годов прошлого века, появились первые сообщения о формировании у паразитов резистентности к ивермектину. В последнее время количество таких публикаций резко возросло, особенно из стран, где ивермектин и другие авермектиновые препараты широко применяются. (I. Carmichael et al. 1987; N.C. Sangster 1999; С. Entrocasso et al., 2008; C.R. Reinemeyer et al., 2010; L.C. Perez-Cogollo et al., 2010). Учитывая, что в России, ивермектины используются очень широко и без ограничений, тем более, иногда в заниженных в десятки раз дозах, вероятность появления ивермектинрезистентных паразитов достаточно высока.

Одним из наиболее рациональных принципов современной химиотерапии в отношении воздействия на резистентных паразитов и повышения эффективности противопаразитарных лекарственных средств, является применение новых или модифицированных молекул известных химических соединений, к которым

паразиты еще не сформировали механизмов устойчивости. Поэтому нам представлялось актуальным разработать новое высокоэффективное лекарственное средство для лечения и профилактики гиподерматоза крупного рогатого скота на основе структурно измененного ивермектина - эприномектина, представляющего собой полусинтетический макроциклический лактон, состоящий из двух гомологичных компонентов Bia - не менее 90% и В[ь - не более 10%. (М.Н. Fisher 1990).

В доступной литературе отсутствуют сведения о возможной перекрестной резистентности между ивермектином и эприномектином, что, возможно, связано с наличием в молекуле эприномектина метиленовой группы в положении С-25.

При выборе лекарственной формы для борьбы с гиподерматозом крупного рогатого скота мы остановились на растворе для наружного применения «pour-оп», применяемом путем нанесения на ограниченную поверхность кожи, как правило, в области позвоночника. Эприномектин, благодаря своей химической структуре и выраженными липофильными свойствами из пур-она должен диффундировать через кожу в подкожную клетчатку, откуда в дальнейшем разносится с током крови по всему организму. Высокие концентрации препарата, в первую очередь, в подкожной клетчатке - месте локализации гиподерм на личиночной стадии развития, обеспечат эффективное воздействие эприномектина на паразита.

Цель и задачи исследования.

Цель наших исследований заключалась в разработке лекарственного препарата иа основе эприномектина в форме раствора для наружного применения пур-он (далее по тексту эприномектин пур-он), предназначенного для лечения и профилактики гиподерматоза крупного рогатого скота

Для достижения поставленной цели нами были определены следующие задачи:

- обосновать состав лекарственной формы, определить требования к показателям качества препарата и разработать методы их контроля;

- изучить физико-химические свойства и стабильность эприномектина пур-он в процессе хранения;

- определить параметры токсичности и изучить токсикологические свойства эприномектина пур-он в остром и субхроническом экспериментах на лабораторных животных и телятах;

- изучить фармакокинетику и установить сроки выведения остаточных количеств эприномектина из организма крупного рогатого скота после применения эприномектина пур-он;

- определить оптимальную терапевтическую дозу и разработать схему применения эприномектина пур-он при гиподерматозе крупного рогатого скота;

- оценить эффективность и безопасность эприномектина пур-он в условиях производства при гиподерматозе крупного рогатого скота.

Научная новизна. Впервые разработан отечественный лекарственный препарат на основе эприномектина в форме раствора для наружного применения пур-он для лечения и профилактики гиподерматоза крупного рогатого скота.

Изучены физико-химические, фармако-токсикологические свойства и терапевтическая эффективность препарата при гиподерматозе. Установлены особенности распределения, накопления в тканях и органах и сроки выведения остаточных количеств эприномектина из организма животных после применения эприномектина пур-он. В условиях животноводческих хозяйств подтверждена эффективность и безопасность препарата при оводовых инвазиях крупного рогатого скота.

Практическая значимость работы. Разработан, стандартизирован и предложен для лечения гиподерматоза крупного рогатого скота новый отечественный препарат на основе эприномектина в форме раствора для наружного применения пур-он.

Для стандартизации препарата разработаны качественные и количественные методы контроля эприномектина пур-он. Установлен срок годности лекарственного средства.

Разработан метод высокоэффективной жидкостной хроматографии определения остаточных количеств эприномектина в плазме, молоке, органах и тканях животных, позволивший установить сроки возможного использования в пищу человека продукции животноводства, полученной от животных обработанных эприномектина пур-он.

Установлены эффективные терапевтические дозы и разработана схема обработок крупного рогатого скота эприномектином пур-он при гиподерматозе.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на следующих научно-практических конференциях:

III Международная научно-практическая конференция: «Ветеринарные препараты: разработка, контроль качества и применение», доклад «Фармакокинетика эприномектина в плазме крови коров», г. Львов, 2009 г.

III Международная научно-практическая конференция «Научно-техническое творчество молодежи - путь к обществу, основанному на знаниях», стендовый доклад «Эффективность Эпринель пур-он при гиподерматозе крупного рогатого скота», г. Москва, 2011 г.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа является результатом научной работы в период 2009-2013 гг. Работало разработке новой лекарственной формы эприномектина форме пур-она основана на проведении комплекса исследований, связанных с оценкой качества готового препарата, изучения его стабильности в процессе хранения, оценки безопасности препарата в острых и хронических опытах на лабораторных и сельскохозяйственных животных, изучении фармакокинетики и сроков выведения остаточных количеств эприномектина из организма животных, изучении терапевтической эффективности лекарственного средства в производственных условиях при гиподерматозе крупного рогатого скота выполнены автором самостоятельно под научно-методическим руководством академика РАН, д.вет.н. Ф.И. Василевича и к.вет.н., старшего научного сотрудника Б.В. Виолина, которые оказывали помощь в выборе современных методов исследований и анализе полученных результатов.

В четырех публикациях включено более 80% материалов исследований, представленных в диссертационной работе. Соавторы не возражают против использования результатов совместной работы.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- научное обоснование состава и лекарственной формы препарата на основе эприномектина, показатели качества и методы их контроля, результаты изучения стабильности препарата в процессе хранения;

- характеристика фармакологических и токсикологических свойств эприномектина пур-он по результатам исследований в опытах на лабораторных животных и телятах;

- результаты изучения фармакокинетики и динамики выведения остаточных количеств эприномектина из организма животных после применения эприномектина пур-он;

- практические предложения по применению пур-она на основе эприномектина в ветеринарной практике.

Публикации. По теме диссертации опубликовано четыре научные работы, в том числе, три в изданиях, рекомендованных ВАК России, и одна статья в издании, рекомендованном ВАК Украины.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 142 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Работа иллюстрирована 40 таблицами и 9 графиками. Список литературы содержит 306 источников, в том числе 201 иностранных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в течение 2009-2013 г.г. в ФГБУ «ВГНКИ», ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, в виварии ГНУ ВИГИС и в 8 хозяйствах Саратовской области. В опытах было использовано 91 беспородных белых мышей, 137 крыс, б кроликов, 24 белобокие морские свинки, 27 телят, 20 коров. Клиническое испытание препарата в производственных условиях проводили на 1080 коровах.

Разработка лекарственной формы и методов контроля качества препарата.

При разработке лекарственной формы было необходимо: выбрать консервант, позволяющий сохранять стабильность лекарственной формы в течение срока годности; выбрать соответствующие растворители с учетом физико-химических свойств эприномектина, обеспечивающие его полное растворение и наименьшее местно-раздражающее действие при накожном нанесении.

Для стандартизации и контроля качества препарата, а также изучения его стабильности при хранении, в соответствии с требованиями, предъявляемыми к жидким лекарственным формам для наружного применения, были предложены методики качественного и количественного контроля препарата с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для

определения подлинности и массовой доли эприномектина, а также методы определения плотности, прозрачности, цветности и объема наполнения флакона.

Изучение стабильности лекарственной формы.

Стабильность противопаразитарного препарата на основе эприномектина в процессе хранения для установления срока его годности в соответствии с «Временной инструкцией по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода «ускоренного старения» при повышенной температуре» проводили в течении времени, эквивалентном 24 месяцам, а также в естественных условиях хранения при температуре 23±2 °С в темном месте и на свету в течении 24 месяцев.

Опытные серии препарата, расфасованные в пластиковые флаконы вместимостью 50 мл, для оценки методом «укоренного старения» помещали в термостаты при температурах 37 °С и 50 °С и исследовали соответственно через 365 и 90 суток, соответствующие 24 месяцам хранения. При хранении препарата в естественных условиях исследования образцов проводили через 6, 9, 12, 18 и 24 месяца после закладки на храпение.

Оценку качества противопаразитарного препарата при «ускоренном старении» и хранении в естественных условиях проводили в соответствии с разработанными методами контроля по показателям: внешний вид, прозрачность, окраска, плотность, подлинность и содержание массовой доли эприномектина.

Идентификацию и определение содержания эприномектина в препарате проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), который позволяет определять продукты распада эприномектина в случае их появления.

Изучение фапмако-токсикологичесих свойств.

Острую токсичность эприномектина пур-он изучали на 24 белых крысах-самцах массой 180 - 200 г и 70 белых мышах-самцах массой 18-20 г. Препарат вводили однократно внутрижелудочно через зоцд крысам в дозах: 5000, 10000 и 15000 мг/кг, мышам - 5000, 10000, 15000, 17000,20000 и 25000 мг/кг.

Изучение острой накожной токсичности эприномектина пур-он проводили на 24 белых крысах-самцах массой 230-250 г. Пур-он наносили крысам на предварительно выстриженные участка кожи площадью 4x4 см в дозах: 5000, 10000 и 15000 мг/кг.

В течение 14 суток после введения пур-она проводили наблюдение за крысами и мышами, отмечая их общее состояние, особенности поведения, потребление корма и воды, состояние шерстного покрова и кожи, учитывали количество погибших животных в зависимости от дозы и рассчитывали токсикологические параметры (ЛД0, ЛД^, ЛД50, ЛД84 и ЛДюо) по методу Литчифилда-Уилкоксона (М.Л. Беленький, 1969).

Исследования субхронической токсичности эприномектина пур-он проводили на 40 крысах-самцах массой тела 193-216 г, из которых сформировали 3 опытных и 1 контрольную группы по 10 животных в каждой. Ежедневно в течение 14 суток животным 1, 2 и 3 опытных групп препарат наносили на выстриженный участок кожи 3><3 см соответственно в дозах, составляющих 1/5, 1/10 и 1/20 от максимально возможной при наружном нанесении 15000 мг/кг

(установленной в остром опыте). Самцам 4 контрольной группы ежедневно наносили дистиллированную воду в объеме 0,6 мл. Ежедневно у крыс регистрировали массу тела, наблюдали за возможной гибелью, общим состоянием и поведением животных, приемом корма и воды, видимыми физиологическими функциями.

Через сутки после последнего нанесения препарата животных убивали декапитацией и отбирали пробы крови для определения гематологических и биохимических показателей. Основные показатели периферической крови (количество эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, гемоглобина) определяли на гематологическом анализаторе «АСТ-Diff» (США); рассчитывали лейкоцитарную формулу. Биохимические показатели (AJIT, ACT, ЛДГ, мочевина, креатинин, мочевая кислота) определяли на биохимическом анализаторе «Clima-15» (Испания).

Определяли массу основных органов и рассчитывали массовые коэффициенты. Проводили макро- и микроскопическое исследование органов (печени, легких, почек, сердца, селезенки и кожи (с участка, на который наносили препарат)). Пробы отбирали у 5 из 10 находящихся в группе животных. Материал фиксировали в 10%-ном формалине и заливали в парафин. Гистологические срезы окрашивали гематоксилин-эозином.

Местно-раздражаюшее действие эприномектина пур-он при нанесении на кожу и конъюнктиву глаза крыс изучали в соответствии с методическими рекомендациями Фармакологического Государственного комитета. Раздражающее действие препарата на кожу оценивали на 9 белых крысах массой 180 - 200 г, которые по принципу аналогов были разделены на 2 опытные и 1 контрольную группы по 3 головы в каждой. Животным 1 и 2 групп препарат наносили на предварительно выстриженные участки кожи площадью 4x4 см в области спины в двух максимальных возможных для нанесения дозах 10000 и 15000 мг/кг, установленных в опыте по определению острого токсического действия. Крысам контрольной группы наносили дистиллированную воду в объеме 3 мл.

Кроме того, раздражающее действие препарата на кожу оценивали на 6 кроликах массой 2,5 - 3,0 кг, разделенных по принципу аналогов на 2 группы, у которых на участке кожи в области спины (6x6 см) выстригали шерсть. Кроликам первой группы на предварительно выстриженный участок кожи площадью 6x6 см наносили однократно 1 мл препарата, во второй группе 2 серым кроликам и 1 альбиносу препарат наносили в объеме 1 мл пятикратно с интервалом 24 ч. Реакцию кожи на аппликацию пур-она оценивали в течении 10 суток по следующим параметрам: эритема, отек, трещины, изъязвления, некроз, сухость, шелушение, сроки появления шерстного покрова на выстриженных участках.

Оценку местного раздражающего действия эприномектина пур-он на слизистую оболочку глаза проводили на 3 кроликах массой 2-2,5 кг. Одну каплю препарата вносили в конъюнктивальный мешок левого глаза, а правый глаз служил контролем и в него закапывали 1 каплю дистиллированной воды. Ежедневно в течение 7 суток проводили наблюдение за состоянием слизистой оболочки глаза и прозрачностью роговицы.

Изучение эмбриотоксических и тератогенных свойств эприномектина пур-он проводили на 40 белых крысах-самках с массой тела 230-250 г. Беременных самок разделили на 4 группы по 10 голов в каждой. Препарат наносили крысам на выстриженный участок кожи в области спины в трехкратной терапевтической дозе (1,5 мг/кг по ДВ). Перед нанесением препарат разводили до нужной концентрации дистиллированной водой. Животным 1 группы аппликацию препарата проводили ежедневно в течение 1-6 суток беременности; 2 группы - 714 суток; 3 группы - 15-19 суток; крысам 4 группы (контрольной) наносили дистиллированную воду в течение всего опыта. На 20 день беременности всех животных убивали декапитацией. Дальнейшие исследования эмбриотоксического и тератогенного действия эприномектина пур-он проводили в соответствии с Методическими указаниями по изучению репродуктивной токсичности фармакологических веществ Фармакологического Государственного комитета.

Оценка эприномектина пур-он на аллергизирующее и иммунотоксическое действие. Сенсибилизирующую активность эприномектина пур-он изучали на 24 белобоких морских свинках-самцах массой 300 - 350 г путем ежедневного нанесения препарата в течение 20 суток на выстриженные участки боковой поверхности тела (2x2 см) в дозе 1500 мг/кг (1/10 от максимально возможной для нанесения на кожу дозы, установленной в остром опыте). Для оценки возможной сенсибилизации у морских свинок через 10 суток после последнего нанесения препарата проводили конъюнктивальную, назальную, внутрикожную и эпикутанную пробы; ставили непрямую реакцию дегрануляции тучных клеток.

При конъюнктивальном тестировании сенсибилизированным и контрольным морским свинкам (по 3 животных в каждом случае) закапывали в правый глаз под веко каплю испытуемого препарата, в левый глаз (контроль) -дистиллированную воду в том же объеме. Реакцию учитывали через 15 минут (реакция немедленного типа) и через 24 часа (реакция замедленного типа), Конъюнктивальную реакцию оценивали визуально под лупой (увеличение х2) по балльной шкале: 0 - видимой реакции нет; 1 - легкое покраснение слезного протока; 2 - покраснение слезного протока и склеры в направлении к роговице; 3 - покраснение всей конъюнктивы и склеры.

При постановке назальной пробы сенсибилизированным и контрольным морским свинкам (по 3 животных в каждом случае) закапывали в носовые ходы по одной капле эприномектин пур-он и учитывали реакцию через 15 минут и 24 часа.

Для проведения внутрикожной пробы сенсибилизированным и контрольным животным (по 3 животных в каждом случае) вводили эприномектин пур-он в объеме 0,05 мл/животное. Реакцию учитывали через 15 минут; 4; 24 и 48 часов.

При эпикутанном тестировании сенсибилизированным и контрольным животным (по 3 животных в каждом случае) на выстриженный участок кожи размером 2*2 см наносили разрешающую дозу препарата (1500 мг/кг). Реакцию кожи оценивали в баллах через 15; 30 минут и 24; 48 и 72 часа по следующей шкале: 0 - видимой реакции нет; 1 - бледно-розовая эритема по всему участку или по его периферии; 2 - ярко-розовая эритема по всему участку или по его

периферии; 3 - красная эритема по всему участку; 4 - инфильтрация и отек кожи; 5 - выраженная инфильтрация, очаговые изъязвления.

После сенсибилизации у животных отбирали пробы крови и проводили непрямую реакцию дегрануляции тучных клеток. Для тестирования сыворотки крови сенсибилизированных и контрольных морских свинок в реакции использовали тучные клетки, полученные из перитонеальной жидкости интактных белых крыс. Реакцию дегрануляции тучных клеток оценивали как отрицательную, если процент дегранулированных тучных клеток не превышал 10 %.

Определение влияния эприномектина на гуморальное звено иммунитета (т.е. возможное иммунотоксическое действие) проводили на 21 мыши (по 7 мышей в каждой группе) линии СВА массой 18 - 20 г, которым эприномектин пур-он наносили накожно в течение 30 суток в дозах: 1 группа - 1500 мг/кг (1/10 от максимально возможной для нанесения на кожу дозы, установленной в остром опыте) и 2 группа - 150 мг/кг (1/100 от указанной дозы). Мышей опытных групп иммунизировали внутрибрюшинно 5%-ной взвесью эритроцитов барана (ЭБ) в дозе 0,5 мл/животное одновременно с последним введением препарата. Контрольными были мыши, иммунизированные только 5%-ной взвесью ЭБ (3 группа). Через 7 суток после иммунизации у опытных и контрольных животных отбирали пробы крови, получали сыворотку и тестировали ее в реакции гемагтлкяинации, используя 1,5%-ную взвесь ЭБ. Степень иммунодепрессивного эффекта оценивали путем вычисления коэффициента изменения выработки антител или индекса супрессии (ИС), который равен отношению данных опыта к данным контроля. Коэффициент, равный или меньший 0,5 указывает на достоверное угнетение образования антител.

Субхроническую токсичность эприномектина пур-он в опытах на телятах изучали на 15 клинически здоровых телятах голштино-фризской породы массой 250 - 300 кг. Подопытных животных разделили по принципу аналогов на 3 группы по 5 голов в каждой. Эприномектина пур-он наносили наружно на спину, распределяя препарат по позвоночнику от холки до крестца 1 раз в сутки, в течение 5 дней в следующих дозах: 1 группе — 1 мл/10 кг (0,5 мг/кг по ДВ массы тела) - максимальная терапевтическая доза; 2 группе - 2 мл/10 кг (1 мг/кг по ДВ массы тела) - двукратная терапевтическая доза; 3 группе - 5 мл/10 кг (2,5 мг/кг по ДВ массы тела) - пятикратная терапевтическая доза.

В процессе опыта вели наблюдение за общим состоянием и поведением животных, приемом корма и воды, определяли температуру тела и частоту пульса. До нанесения эприномектин пур-он и через 1; 5 и 10 суток после последнего применения из яремной вены животных отбирали пробы крови. Исследование крови проводили на биохимическом анализаторе «Clima-15», Испания и гематологическом анализаторе «АСТ-Diff», США; лейкоцитарную формулу -определяли общепринятым методом. Данные обрабатывали статистически с использованием программы «Student-200».

Разработка методики определения остаточных количеств эприномектина в плазме, молоке, органах и тканях животных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Метод определения эприномектина основан на высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием

флуоресцентного детектора на колонке с обращенной фазой после его экстракции из образцов плазмы, молока, органов и тканей животных органическими растворителями и очистке путем твердофазной экстракции. Измерение массовой концентрации эприномектина основано на получении флуоресцирующих производных путем их дериватизации 1-метил имидазолом и уксусным ангидридом. Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки.

Фармакокинетику эприномектина в плазме крови после однократного нанесения препарата изучали на 10 коровах черно-пестрой породы (возраст от 2 до 5 лет, масса от 470 до 550 кг), разделенных по принципу аналогов на две равные группы. Первой группе животных в области позвоночника однократно накожно наносили препарат в дозе 0,5 мг/кг массы тела (1 мл на 10 кг массы тела), второй группе - в дозе 0,2 мг/кг массы тела (1 мл на 25 кг массы тела). Пробы крови для исследований отбирали до нанесения препарата и через 12,24, 72, 120, 168, 240 и 336 часов после нанесения препарата.

Количественное определение эприномектина в плазме крови проводили методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием после дериватизации.

Остаточные количества эприномектина в молоке после однократного нанесения эприномектина пур-он изучали на 10 коровах черно-пестрой породы (возраст от 2 до 5 лет, масса от 470 до 550 кг), разделенных по принципу аналогов на две равные группы. Первой группе животных в области позвоночника однократно накожно наносили препарат в дозе 0,5 мг/кг массы тела (1 мл на 10 кг массы тела), второй группе - в дозе 0,2 мг/кг массы тела (1 мл на 25 кг массы тела).

У коров опытных групп в утреннюю дойку отбирали средние пробы молока через 0,12,24,72,120,168,240 и 336 часов после нанесения препарата. До анализа образцы хранили при температуре минус 20 °С.

Количественное определение эприномектина в молоке проводили методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием после дериватизации.

Сроки выведения эприномектина из организма телят после применения эприномектин nvp-он проводили на 12 телятах голштино-фризской породы массой тела 80- 100 кг. Телятам однократно наружно на спину, распределяя вдоль позвоночного столба (от холки до крестца) наносили эприномектин пур-он в дозе 1 мл/10 кг массы тела (0,5 мг/кг по действующему веществу). Через 1, 3, 5 и 7 суток после нанесения препарата убивали по 3 теленка и отбирали для исследования пробы печени, почек, мышечной (из задней части туши и непосредственно под местом нанесения препарата) и жировой ткани. До анализа пробы хранили при температуре минус 20°С.

Количественное определение эприномектина в биосубстратах проводили методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием после его дериватизации.

Терапевтическая эффективность эприномектина пур-он в производственных условиях. Ларвоцидную эффективность эприномектин пур-он при гиподерматозе крупного рогатого скота изучали на базе стационарно неблагополучных по данному заболеванию 8 хозяйствах Саратовской области в течении 2009 - 2010 годов. Экстенсивность инвазии составляла 75-79%, интенсивность варьировала от 5,8 до 24,5 личинок на голову.

Для установления оптимальной дозы коров массой 450-550 кг обрабатывали эприномектином пур-он в дозах 0,2 или 0,5 мг/кг массы животного по ДВ, что соответствует 20 или 50 мл/голову. Препарат наносили однократно путем поливания тонкой струйкой вдоль позвоночного столба с профилактической целью против личинок I стадии перед постановкой животных на стойловое содержание (сентябрь-октябрь) и с лечебной целью против личинок II и III стадий - весной (февраль-март). В качестве препаратов сравнения использовали лекарственные средства, зарегистрированные в РФ, которые применяли в соответствии с утвержденными Россельхознадзором инструкциями: 0,01 % пур-он ивермектина в дозе 20 мл/голову и 1,0 % раствор ивермектина для инъекций в дозе 1 мл/50 кг массы животного. Контрольные группы животных лекарственными средствами против гиподерматоза не обрабатывали.

Обобщенная схема опыта по восьми хозяйствам Саратовской области представлена в таблице 1.

Таблица 1

Схема изучения профилактической и лечебной эффективности эприномектин пур-он

Препарат Доза Применение

мл/гол да мг/кг С профилактической целью осенью (голов) С лсчс0ной целью весной (голов)

Эприномектин пур-он* 20 0,2 236 40

50 0.5 224 38

0,01 % пур-он ивермектина* 20 0,004 251 21

1% раствор ивермектина** 10 0,2 127 17

Контроль - - 93 33

*- наружно путем поливания; " - внутримышечно

Для изучения лечебной эффективности эприномектин пур-он отобрали коров, у которых обнаруживали признаки гиподерматоза в марте-апреле. Животных разделили по принципу аналогов на равные группы.

Об эффективности препаратов судили по показателям экстенсэффективности (ЭЭ) и интенсэффективности (ИЭ) обработки по общепринятой методике, разработанной A.A. Непоклоновым и Г.А. Талановым (1973). Поражение животных опытной и контрольных групп личинками подкожного овода устанавливали путем осмотра и пальпации кожи в области спины и крупа. Учет результатов проводили с интервалом 2-4 недели (с конца марта до конца мая).

Статистический анализ полученных результатов выполняли с помощью вариационной статистики по методу Стыодента (Н. Бейли Статистические методы в биологии//Изд-во АН СССР. М. 1963).

Автор выражает благодарность, сотрудникам ГНУ ВИГИС Т.С. Новик, С.И. Чукиной, К.Г. Курочкиной и A.B. Шемшуре за содействие в организации проведения исследований на лабораторных животных, а сотрудникам

ООО «Фармбиомед» С.В. Авчук и В.Г. Тер-Симоняну - за апробацию предложенного метода определения содержания эприномектина в биосубстратах.

2.2. Результаты исследований

Разработка лекарственной формы противопаразитарного препарата на основе эприномектина.

Химико-фармацевтические исследования.

При разработке лекарственной формы для борьбы с гиподерматозом крупного рогатого скота мы остановились на пур-оне, представляющим собой раствор для нанесения на ограниченную поверхность кожи, как правило, в области позвоночника. Трансдермальный путь введения лекарств имеет ряд преимуществ перед их введением орально или парентерально, так как не зависит от рН содержимого желудка, времени последнего приема пищи, возможностей метаболической инактивации. Дозированное постоянное поступление лекарства через кожу исключает большие перепады концентрации, неизбежные при парентеральном пути его введения. Лекарственная форма пур-он удобна при массовых обработках животных, т.к. не требует их специальной фиксации и является безболезненной, что не вызывает стресса и не приводит к снижению продуктивности. Преимуществом пур-она перед опрыскиванием крупного рогатого скота лекарственными средствами, является меньший расход и более точное дозирование препарата, что снижает возможность возникновения токсических реакций.

Поэтому противопаразитарный препарат предложен нами в форме пур-он, содержащего в своем составе в качестве действующего вещества 0,5% эприномектина, в качестве растворителей пропилен гликоль до 100%, изопропиловый спирт 19,5%, а в качестве антиоксиданта и стабилизатора бутилокситолуол 0,01 %.

Выбор растворителей был связан с тем, что действующее вещество препарата плохо растворимо в воде и хорошо растворимо в органических растворителях - пропиленгликоле и изопропиловом спирте, которые разрешены международными фармакопеями для использования в качестве вспомогательных веществ. Подобранное соотношение изопропилового спирта к пропиленгликолю 1:4 обеспечивает стабильность лекарственной формы в процессе хранения. Учитывая, что эприномектин липофилыюе соединение, органические растворители будут способствовать его проникновению через эпидермис и дерму в подкожную клетчатку, что было подтверждено в дальнейшем результатами исследования фармакокинетики эприномектин пур-она.

Для стандартизации и контроля качества эприномектина пур-он, а также изучения его стабильности при хранении нами предложены качественные и количественные методы исследований в соответствии с требованиями, предъявляемыми к растворам для наружного применения, включающие: определение внешнего вида, прозрачности, окраски, относительной плотности, подлинности и массовой доли действующего вещества (таблица 2).

Таблица 2

Показатели качества эприномектина пур-он

Наименование показателя Характеристики и нормы

Внешний вид Прозрачный раствор от бесцветного до слабо желтого цвета

Прозрачность раствора Должен выдерживать сравнение с 50% раствором пропиленгликоля в воде

Окраска раствора Не должен по интенсивности превышать эталон У5

Объем заполнения, мл Должен быть не менее номинального

Плотность раствора 0,990 - 0,998

Подлинность эприномектина Время выхода пиков эприномектина в образце препарата должно соответствовать времени выхода пиков в стандартном образце

Массовая доля эприномектина, % 0,45 - 0,55

Определение окраски, прозрачности и плотности противопаразитарного препарата проводили по методикам, изложенным в Государственной фармакопее XII. При определении окраски для сравнения был выбран эталон № У5. В качестве эталонного раствора для определения прозрачности нами был предложен пропиленгликоль, являющийся основным вспомогательным веществом.

Для характеристики качества препарата, особенно в процессе его хранения, предложен метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), который позволяет определить не только содержание действующего вещества, но и обнаружить, в случае наличия, продукты его распада. Время выхода определяемого компонента из колонки при одних и тех же условиях разделения будет всегда постоянно и может служить характеристикой эприномектина (качественный анализ), а площадь пика - пропорциональна количеству эприномектина в пробе (количественный анализ). Подобранные нами оптимальные условия хроматографирования: длина волны - 246 нм и элюент -ацетонитрил/вода (на 1 л воды 0,8 мл кислоты ортофосфорной 85%) в соотношении 65:35, скорость потока 1,0 мл/мин позволяют одновременно идентифицировать и количественно определять эприномектин. Установлено, что в подобранных условиях время выхода пика эприномектина В составляло 13,5 -14,5 мин, время выхода пика эприномектина В(ь — 10,4 -11,5 минут. Предложенные методы условия проведения хроматографирования обеспечивают требуемую прецизионность результатов (ошибка не превышает 2 %), что удовлетворяет требованиям Фармакопеи.

Изучение стабильности лекарственной формы препарата. В результате «ускоренного старения» препарата установлено, что при повышенной температуре 37°С через 367 суток хранения и при температуре 50°С (соответственно эквивалентно 24 месяцам хранения при комнатной температуре) достоверных изменений в контролируемых показателях качества (внешний вид, прозрачность, окраска, плотность, подлинность и массовая доля) эприномектина пур-он не происходило. Даже при экстремальных условиях хранения 50°С не наблюдалось деградации эприномектина.

При исследовании препарата, хранившегося на свету в прозрачных флаконах в течении 9 месяцев, наблюдали деградацию эприномектина, проявляющуюся в появлении продуктов распада эприномектина в количестве до 27%. По внешнему виду препарат становился красно-коричневого цвета и окраска во все контролируемые сроки превышала предложенный для нормативной документации уровень Уг.

Показатели качества препарата не изменялись в течение 2 лет при хранении препарата в естественных условиях в защищенном от света месте.

На основании данных, полученных при изучении стабильности при повышенной температуре 37 °С и 50 °С, а также при естественных условиях можно установить срок годности эприномектина пур-он 2 года при хранении в защищенном от света месте при температуре не выше 25°С.

Изучение острой токсичности на лабораторных животных. При изучении острой токсичности лекарственного средства на основе эприномектина на лабораторных животных было установлено (таблица 3), что препарат в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 относится к 4 классу опасности — веществам малоопасным (ЛД5о>15000 мг/кг), а в соответствии с классификацией Медведя (1977) - к 4-му классу токсичности - малотоксичным соединениям (ЛД5»>1000 мкг/кг), так как ЛД50 в опыте на белых мышах составила 18200 мг/кг.

Таблица 3

Параметры острой токсичности эприномектина пур-он на белых мышах

ЛДо мг/кг ЛД]в мг/кг ЛД5оМг/кг ЛД84 мг/кг ЛДюо мг/кг

10000 14400 18200 (16304-20096) 21900 25000

Подтверждением низкой токсичности препарата послужило отсутствие гибели крыс при применении пур-она орально и накожно в максимально возможной для введения дозе 15000 мг/кг, что в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 позволяет отнести препарат при наружном применении к 4 классу опасности (Ш5о > 15000 мг/кг).

Результаты изучения субхронической токсичности эприномектин пур-он в опытах на лабораторных животных показали, что препарат при накожном нанесении крысам в течении 14 дней в дозах 750, 1500 и 3000 не вызывал гибели животных, не приводил к изменению поведенческих реакций, не оказывал влияния на гистологическую структуру основных паренхиматозных органов животных.

Снижение активности аланинамино- и аспартатаминотрансфераз у животных получавших эприномектина пур-он в максимальных дозах видимо, не связано с нарушением функции печени, т.к. массовые коэффициенты печени, макроскопическое и гистологическое состояние органа были без изменений.

Такое снижение активности ферментов ACT и АЛТ по данным Д.Т. Даугирдас, П.Д. Блейк, Т.С. Инг (2003), B.C. Камышников (2005), JI.A. Даниловой (2003) может быть связано с почечной недостаточностью, приводящей к инактивации ферментов уремическими токсинами. Подтверждением нарушения функции почек, у животных получавших максимальное количество пур-она в течение двух недель, служило достоверное (р<0,05) увеличение в крови уровня мочевины и креатинина с одновременным изменением массового коэффициента почек.

Результаты изучения субхронической токсичности эприномектин пур-он в опытах на крысах позволили установить, что доза 3000 мг/кг при наружном применении является токсической, т.к. приводит к достоверному (р<0,05) снижению динамики прироста массы тела, изменению массового коэффициента почек, снижению активности АЛТ и ACT, повышению уровня мочевины и креатинина; доза 1500 мг/кг является пороговой, т.к. влияет только на уровень креатинина и мочевины, а доза препарата 750 мг/кг является недействующей, т.к. не вызывает функциональных изменений в организме животных.

При изучении местно-паздражающего действия эприномектина пур-он при однократном нанесении его на кожу крысам и кроликам, а также на конъюнктиву глаза кролика препарат не оказывает раздражающего действия. При многократных аппликациях тестируемого препарата кроликам появляется кратковременное слабое покраснение кожи (раздражающее действие). Подобная реакция не имеет практического значения, так как пур-он рекомендован для однократного применения.

Эприномектин пур-он в трехкратной терапевтической дозе при нанесении крысам на кожу в период с 1 по 19 день гестации не оказывает эмбриотоксического и тератогенного действия, о чем свидетельствует отсутствие достоверных различий (Р>0,05) между опытными и контрольной группой по показателям количество плодов, мест имплантации и желтых тел, масса тела эмбрионов и их кранио-каудальный размер, масса и размер плаценты, общей эмбриональной смертности и пред- и постимплантационной гибели плодов. Результаты наших исследований совпадают с данными Committee for veterinary medicinal products. Eprinomectin. Summary report (1). EMEA/114/96-FINAL June 1996, в которых эприномектин в дозах 12 и 8 мг/кг при пероральном введении соответственно крысам и кроликам в период 6-17 дни беременности не проявил эмбриотоксического и тератогенного действия.

Эприномектин пур-он по данным наших исследований не приводит к сенсибилизации, не проявляет аллергизирующего действия немедленного и замедленного типа и не оказывает иммунотоксического влияния на животных.

Изучение субхронической токсичности эприномектина пур-он в опытах на телятах. При оценке безопасности эприномектина пур-он для телят при пятидневном введении в терапевтической дозе и дозах, превышающих

терапевтическую в 2 и 5 раз (соответственно 0,5; 1; 2,5 мг/кг массы тела по действующему веществу) гибели животных не отмечали.

Основные физиологические (температура тела, частота сердечных сокращений), гематологические и биохимические показатели сыворотки крови телят оставались в пределах нормы и достоверно (р>0,05) не отличались от контроля. Таким образом, было установлено, что пятидневное нанесение эприномектина пур-он в дозах в 2 и 5 раз превышающих терапевтическую не оказывало токсического действия на организм телят во всех испытанных дозах.

Учитывая, что пур-он в ветеринарной практике будет применяться однократно, даже случайная передозировка лекарственного средства не должна будет привести к развитию побочного действия или к серьезной нежелательной реакции.

Разработка методики определения остаточных количеств эприномектина в плазме, молоке, органах и тканях животных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Разработан метод количественного определения эприномектина в продуктах животноводства (органы и ткани животных, молоко) и плазме крови с нижним пределом измерения 1 мкг/кг (таблица 4), который был включен в проект «Методические указания. Определение массовой концентрации эприномектина в плазме, молоке, органах и тканях животных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» может быть использован для проведения лабораторных исследований безопасности пищевой продукции учреждениями госсанэпидслужбы Российской Федерации.

Метод определения эприномектина основан на высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием флуоресцентного детектора на колонке с обращенной фазой после его экстракции из образцов плазмы, молока, органов и тканей животных органическими растворителями и очистки путем твердофазной экстракции. Измерение массовой концентрации эприномектина основано на получении флуоресцирующих производных путем их дериватизации 1-метилимидазолом и уксусным ангидридом. Чувствительность метода составляет 0,1 нг в пробе, нанесенной на колонку.

Таблица 4

Метрологическая характеристика метода

Анализируемый объект Метрологические параметры, р = 0,95; п = 25

Предел обнаружения, мг/кг Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (мг/л) Средний коэффициент извлечения, К Доверительпый интервал средлего результата, "/•, ±

Плазма 0,001 0,001-0,10 0,83 2,35

Молоко 0,001 0,001-0,05 0,84 2,29

Печень 0,002 0,002-0,20 0,65 3,65

Почки 0,002 0,002-0,20 0,84 3,06

Мышцы 0,002 0,002-0,20 0,74 2,71

Жир 0,002 0,002-0,20 0,92 1,27

Предложенный метод был использован для изучения фармакокинстики эприномектина в организме коров и определения сроков возможного убоя животных и использования молока после применения эприномектина пур-он.

Изучение фармакокинетики эприномектина в плазме крови и молоке коров после однократного применения препарата

При проведении исследований нами были определены основные фармакокинетические параметры эприномектина у коров после применения эприномектин пур-он в дозах 0,5 и 0,2 мг/кг.

Фармакокинетика эприномектина пур-он характеризуется созданием постоянной плазменной концентрации в течении 14 суток. Результаты исследований (график 1) показывают, что эприномектин появляется в крови в незначительных концентрациях (0,84-1,72 нг/мл) уже через 12 ч, постепенно всасывается в системный кровоток животных, поскольку фактическое и расчетное время достижения максимальной концентрации исследуемого препарата для всей выборки животных составляет более 3 суток (от 72 до 91,2 ч).

В молоке эприномектин не обнаруживается при нанесении эприномектина пур-он в дозе 0,2 мг/кг массы тела, а при нанесении в дозе 0,5 мг/кг -регистрируется в концентрациях значительно ниже, чем в крови. Его относительная биодоступность в максимальной дозе в молоке по сравнению с плазмой крови в среднем составляет всего 25,28 %. Полученные нами результаты во многом согласуются с данным европейских исследователей, изучавшими фармакокинетику различных наружных формх эприномектина (M. Alvinerie, Е. Lacoste, J.F. Sutra and С. Chartier 1999; Huiqiang Wen, Baoiiang Pan, Yuwan Wang et al, 2010).

Для эприномектина после нанесения пур-он характерна медленная элиминация, т.к. период полувыведения (Тш) в среднем превышал 3 суток (73,89±48,88 час) и длительное среднее время (MRT) нахождения лекарственного вещества в организме, которое в зависимости от дозы (0,2 или 0,5 мг/кг) колебалось от 5,4±3,4 до 6,1± 2,9 суток соответственно (таблица 5). Полученные данные позволяют отнести эприномектин к пролонгировано действующим лекарственным средствам. Умеренные значения объема распределения - Vz (от

8,3±1,6 до 25,2±17,5 л) показывают, что препарат не образует депо, а циркулирует, в основном, в системном кровотоке.

Следует отметить, что в изучаемом диапазоне доз, по-видимому, отсутствует линейная зависимость между дозой и фармакокинетикой эприномектина. То есть, при увеличении дозы в с 0,2 до 0,5 мг/кг площадь под фармакокинетической кривой (АиСо-ззв) эприномектина в плазме крови не увеличивается в 2,5 раза, а повышается только в 1,34 раза.

Таблица 5

Фармакокинетическне параметры зприномектнна в крови и молоке коров после однократного нанесения пур-он в дозах 0,2 и 0,5 мг/кг по ДВ

Доза мг/кг ПАРАМЕТРЫ

АиСо-ззс нг/млхч ^¡лах Ч Сщах нг/мл С1р л/ч ка Ч"1 1 МЯТ ч | ч V, л

Кровь

0,2 1709,352 ±266,87 91,2 ±26,3 13,21 ±3,72 0,1172 + 0,0194 0,0143 ±0,0014 48,87 ±4,72 125,08 ± 12,36 8,28 ±1,61

0,5 2293,02 + 1128,11 72,0 ±0,0 18,43 ± 13,63 0,2389 + 0,1099 0,0116 ± 0,0042 73,89 + 48,88 145,62 ± 69,06 25,15 ±17,51

Молоко

0,2 1 0 0 0 0 0 0 0 0

0 5 579'64 и'3 1 ±158,88 57,6 ±21,5 6,42 ±2,28 0,8127 ±0,4049 0,0120 ±0,0056 76,92 ±55,17 141,47 ±93,87 71,05 +17,49

Результаты проведенного нами исследования позволяют сделать вывод, что предложенная лекарственная форма пур-он обеспечивает трансдермалыюе проникновение эприномектина в системный кровоток, создание эффективной концентрации действующего вещества в местах локализации гиподерм и длительную его циркуляцию в организме, что должно обеспечить терапевтический эффект в отношении различный стадий развития паразита, в том числе перемещающихся в кровеносном русле.

Определение остаточных количеств эприномектина в молоке коров после однократного применения препарата. При определении сроков выведения эприномектина с молоком после применения пур-она в минимальной дозе, т.е. из расчета 2 мл/50 кг массы тела (0,2 мг/кг по ДВ) было установлено (таблица 6), что во все сроки исследования, начиная с первых суток, препарат в молоке отсутствовал (ниже чувствительности метода < 0,0001 мг/л).

Таблица 6

Остаточные количества эприпомектина в молоке коров после применения эприномектин пур-он

Концентрация эприпомектина в молоке (ВиХмг/л) МДУ(МЯЬ)

Доза Время после применения препарата (сутки) ФАО/ВОЗ и

1 2 3 5 7 10 14 ЕМЕА (мг/л)

1 мл/10 кг 0 0,0099 0,0035 0,0006 0,0005 0,0003 0

массы тела 0,0032 0,0039 0,0019 0,0011 0,0004 0 0

(0,5 мг/кг по 0,0009 0,0054 0,0069 0,0022 0,0021 0,0006 0 0,02

ДВ) 0,0007 0,0009 0,0064 0,0034 0,0032 0,0030 0

0,0013 0,0040 0,0048 0,0028 0,0027 0,0010 0

М±т 0,0012 ±0,0005 0,0047 ±0,0013 0,0047 ±0,0009 0,0020 ±0,0005 0,0017 ±0,0005 0,0009 ±0,0005 0

2 мл/50 кг <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0

массы тела <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0

(0,2 мг/кг по <0,001 <0,001 < 0,001 < 0,001 <0,001 < 0,001 0 0,02

ДВ) <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 < 0,001 0

<0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 < 0,001 0

М±т < 0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0

При нанесении нур-она коровам в максимальной дозе 1 мл/10 кг массы тела (0,5 мг/кг по ДВ) эприномектин начинает выделяться с молоком с первых суток в количестве 0,0012±0,0005 мг/л, достигая максимума на вторые-третьи сутки 0,0047 мг/л, постепенно снижаясь к десятым суткам до уровня чувствительности метода 0,0001 мг/мл. При этом необходимо отметить, что во все периоды исследования у каждого животного содержание эприпомектина в молоке было ниже МДУ, установленного Кодексом алиментариус и Евросоюзом - 0,02 мг/л.

Полученные данные позволяют рекомендовать установить значения МДУ эприномектина для молока коров в нашей стране на уровне требований Кодекса алиментариус и использовать молоко в пищу человека после обработки коров эприномектином пур-он (независимо от дозы) без ограничений.

Определение сроков выведения эприномектина из организма телят после применения эприномектин пур-он.

При определении сроков выведения действующего вещества пур-она из организма коров было установлено, что эприномектин относится к веществам, накапливающимся в тканях и достаточно медленно выводящимся из организма (таблица 7). Концентрацию эприномектина в биосубстратах мы рассчитывали в виде суммы компонентов Вь и Вц>, но учитывая, что международные (Кодекс алиментариус) и европейские (ЕМЕА) требования МДУ (МЯЬ) представляют только по компоненту В1а, то в таблице количественное значение препарата мы приводим в двух форматах: по сумме компонентов Ви+В1ь и по компоненту Ви.

Наиболее высокая концентрация эприномектина через 1,3, 5 и 7 суток после применения пур-она отмечается в печени (орган избирательного накопления) и составляет соответственно 0,65±0,06; 1,17±0,09; 0,64±0,12 и 0,34±0,08 мг/кг, что значительно ниже МДУ для печени, разрешенного Кодексом алиментариус и Евросоюзом - 2,0 мг/кг.

Таблица 7

Остаточные количества эприномектина в органах и тканях телят после применения эприномектина пур-он

Орган, ткань/компонент эприномектина Концентрация эприномектнна в органах (мг/кг) МДУ(МКЬ) ФАО/ВОЗ и ЕМЕА (мг/кг)

Время после применения препарата (сутки)

1 3 5 7

печень эприномектин Bla+Blb эприномектин В[а 0,65±0,06 0,62±0,05 1,17+0,09 1,11+0,08 0,64+0,12 0,60+0,10 0,34+0,08 0,32+0,08 2,0

почки эприномектин Bla+Blb эприномектин Bi, 0,07±0,01 0,063±0,008 0,21±0,01 0,20±0,01 0,15+0,02 0,14+0,02 0,09+0,01 0,09+0,006 0,3

мышечная ткань эприномектин Bla+Blb эприномектин В|а 0,01±0,00 0,01+0,00 0,04±0,00 0,037+0,003 0,02+0,00 0,013+0,003 0,01+0,00 0,008+0,002 0,1

мышечная ткань (под местом нанесения препарата) эприномектин Bla+Blb эприномектин Bia 0,01+0,00 0,ОНО,00 0,04+0,00 0,033+0,003 0,02+0,01 0,017+0,003 0,01+0,00 0,006+0,001 0,1

жир эприномектин Bla+Blb эприномектин Bia 0,07±0,01 0,063+0,03 0,10+0,01 0,087+0,003 0,03+0,00 0,027+0,003 0,02+0,01 0,02+0,006 0,25

В мышечной ткани, в том числе под местом нанесения лекарственного средства, содержание эприномектина через 1, 3, 5 и 7 суток после применения иур-она составляет соответственно 0,01±0,08; 0,04±0,00; 0,02±0,00 и 0,01±0,00 мг/кг, что также значительно ниже МДУ для мышц, разрешенного Кодексом алиментариус и Евросоюзом - 0,1 мг/кг.

Аналогичные результаты были получены по остаточным количествам эприномектина в почках и жировой ткани (таблица 6), когда во всех образцах и во все сроки исследования концентрация препарата была ниже МДУ соответственно 0,1 и 0,25 мг/кг.

Таким образом, убой животных после применения эприномектина пур-он можно проводить без ограничений.

Терапевтическая эффективность эприномектина пур-он в производственных условиях.

Изучение терапевтической эффективности эприномектина пур-он в 8 хозяйствах Марксовского и Лысогорского районов Саратовской области показало

(таблицы 8 и 9), что препарат по эффективности превосходит 0,01 % пур-он на основе ивермектина при ранней химиопрофилактике по ЭЭ на 16,5% и по ИЭ на 10,7 %, а при лечении гиподерматоза - по ЭЭ на 23,6 % и по ИЭ на 16,9 %. Препарат по эффективности не уступает 1 % инъекционному раствору ивермектина.

Таблица 8

Эффективность эприномектин пур-он при лечении гиподерматоза в весенний период 2010 г (февраль-март)

Препарат Кол-во Доза Результаты учета апрель-май 2.010 Эффективн ость%

КРС (голов) Желваков мл/гол мг/кг Больных (голов) Желваков (штук) ЭЭ ИЭ

Эприномектин пур-он* 40 260 20 0,2 0 и шо 100

38 306 50 ' 0,5 0 0 100 100

0,01 % пур-он ивермектина* 21 155 20 0,004 4 23 76,4 83,1

1% раствор ивермектина** 17 158 10 0,2 0 0 100 100

Контроль 33 283 - - 33 251 - -

*- наружно путем поливания вдоль позвоночника; ** - подкожно

Изучение профилактической и лечебной эффективности эириномектин пур-он показало целесообразность ранней осенней обработки крупного рогатого скота. В этом случае не происходит интоксикации организма продуктами жизнедеятельности гиподерм и травмирования тканей, благодаря чему сохраняется продуктивность животных.

Таблица 9

Эффективность эприномектин пур-он при ранней химиопрофилактике гиподерматоза в осенний период 2009 г (сентябрь-октябрь)

Препарат Кол-во животных Доза Результаты учета апрель-май'гОЮ Эффективность

мл/гол да мг/кг Больных (голов) Желваков (штук) ЭЭ ИЭ

Эприномектин пур-он* 236 20 0,2 и 0 100 100

224 50 0,5 0 0 100 100

и,01 % пур-он ивермектина* 251 20 0,004 34 141 83,5 89,3

1% раствор ивермектина** 127 10 0,2 0 0 100 100

Контроль 93 - - 82 482 - -

*- наружно путем поливания вдоль позвоночника; ** - подкожно

Отсутствовала разница в эффективности обработки животных эприномектин пур-он в дозе 0,2 и 0,5 мг/кг массы тела. Поэтому для ветеринарной практики оптимальная терапевтическая доза эприномектина пур-он при профилактике и лечении гиподерматоза крупного рогатого скота должна составлять 4 мл на 100 кг массы тела (0,2 мг/кг по эприномектину).

ВЫВОДЫ

1. Теоретически и экспериментально обоснован состав и лекарственная форма препарата для наружного применения на основе зприномектина в форме пур-она, терапевтическая безопасность применения и эффективность которого при гиподерматозе крупного рогатого скота, подтверждена результатами доклинических и клинических исследований.

2. Зприномектина пур-он отвечает требованиям Государственной фармакопеи РФ и Европейской фармакопеи, предъявляемым к растворам для наружного применения, и стабилен в течение 2 лет при температуре не превышающей 25°С.

3. Зприномектина пур-он по параметрам острой токсичности относится к «веществам малоопасным» (4 класс опасности согласно ГОСТ 12.1.007-76). ЛД50 при пероральном введении для белых мышей составляет 18200 мг/кг, при нанесении на кожу в максимально возможной дозе 15000 мг/кг массы тела не вызывает гибели крыс. Препарат не обладает аллергизирующим и раздражающим действием на кожу, слабо и кратковременно раздражает слизистые оболочки глаз.

4. В субхронических экспериментах на крысах установлено, что доза зприномектина пур-он 3000 мг/кг при наружном применении является токсической и приводит к достоверному (р^),05) снижению динамики прироста массы тела, изменению массового коэффициента почек, снижению активности АЛТ и ACT, повышению уровня мочевины и креатинина; доза 1500 мг/кг является пороговой, не изменяет клинических показателей и влияет только на уровень креатинина и мочевины, а доза препарата 750 мг/кг является недействующей, не вызывает функциональных изменений в организме животных.

5. Эприномектин пур-он не оказывает эмбриотоксического и тератогенного действия при нанесении на кожу крысам в трехкратной терапевтической дозе в разные сроки беременности, включая критические стадии эмбриогенеза.

6. Зприномектина пур-он при пятидневном нанесении телятам в дозах терапевтической и в 2 и 5 раз превышающих терапевтическую не вызывает статистически достоверных изменений в физиологическом состоянии, морфологических и биохимических показателях крови, физико-химических показателях мочи.

7. В дозах 0,5 и 0,2 мг/кг массы животного зприномектина пур-он обеспечивает транедермальное проникновение зприномектина в системный кровоток, создание эффективной концентрации действующего вещества в местах локализации гиподерм и длительную его циркуляцию в организме, что обеспечивает продолжительный ларвацидный эффект в отношении различный стадий личинок овода, в том числе перемещающихся с кровотоком.

8. При применении зприномектина пур-он лактирующим коровам в дозе 0,2 мг/кг и 0,5 мг/кг массы животного концентрация действующего вещества в молоке составила менее 0,001 мг/л и 0,0047±0,0013 мг/л соответственно, что в 4 раза ниже установленного Кодексом алиментариус и Евросоюзом МДУ (0,02 мг/л), и позволяет рекомендовать препарат для применения дойным коровам, молоко от которых используется в пищевых целях.

Убой животных на мясо после применения эприномектина пур-он может проводиться без ограничений, т.к. остаточные количества эприномектина в мышцах, печени, почках и жире ниже уровня установленного Кодексом алиментариус и Евросоюзом. 9. Результаты испытания эприномектина пур-ои в условиях производства в дозе 4 мл на 100 кг массы животного (0,2 мг/кг по эприномектину) подтвердили высокую терапевтическую эффективностью препарата при гиподерматозе крупного рогатого скота.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработан и предложен для ветеринарной практики новый антипаразитарный лекарственный препарат на основе эприномектина в форме пур-она для лечения и профилактики гиподерматоза крупного рогатого скота.

Результаты исследований использованы в проектах нормативной документации и инструкции по применению эприномектина пур-он при оводовых инвазиях крупного рогатого скота.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Семышева М.С. Фармакокинетика эприномектина в плазме крови коров / C.B. Авчук, В.Г. Тер-Симонян, С.И. Чукина, Т.С. Новик, A.B. Шемшура, A.A. Литвин, М.С. Семышева, Б.В. Виолин // Научно-технический бюллетень ДНИКИ ветпрепаратов и кормов. - Львов. - 2009. — Выпуск 10. - № 3. - С.406-410.

2. Семышева М.С. Изучение острой и субхронической токсичности эпринель пур-он в опытах на лабораторных животных / М.С. Семышева, О.Д. Янышевская, С.И. Чукина, Т.С. Новик, Е.И. Ковешникова // Аграрная наука.-2010.- №4.-С.27-30.

3. Семышева М.С. Влияние эпринель пур-она на репродуктивную функцию и иммунный статус лабораторных животных / М.С.Семышева, Ф.И. Василевич, Т.С. Новик, К.Г. Курочкина, Б.В. Виолин // Аграрная наука. -2010. — № 6. - С.22-24.

4. Семышева М.С. Терапевтическая эффективность эпринель пур-она при гиподерматозе крупного рогатого скота / М.С. Семышева, П.С. Лобова, Ф.И. Василевич, Б.В. Виолин // Ветеринарный врач. - 2010. - № 6. - С.60-64.

Подписано в печать:

07.11.2013

Заказ № 9045 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Семышева, Мария Сергеевна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЦЕНТР КАЧЕСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И КОРМОВ»

На правах рукописи

Семышева Мария Сергеевна

04201365482

ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРОТИВОПАРАЗИТАРНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЭПРИНОМЕКТИНА В ФОРМЕ ПУР-ОНА

03.02.11 - паразитология

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

академик РАН,

доктор ветеринарных наук,

профессор

Василевич Ф.И.

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Виолин Б.В.

Москва - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

1.1. Гиподерматоз крупного рогатого скота 8

1.2. Средства и методы борьбы с гиподерматозом крупного

рогатого скота 14

1.3. Резистентность к противопаразитарным препаратам 18

1.4. Эприномектин и его применение в ветеринарной практике 23

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 35

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 35

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 54

2.2.1. Разработка лекарственной формы противопаразитарного

препарата на основе эприномектина 54

2.2.2. Химико-фармацевтические исследования 56

2.2.3. Изучение стабильности противопаразитарного препарата эприномектина пур-он 62

2.2.4. Изучение острой токсичности препарата эприномектина пур-он

в опытах на лабораторных животных 64

2.2.5. Изучение субхронической токсичности эприномектина пур-он

в опытах на лабораторных животных 65

2.2.6. Изучение местно-раздражающего действия эприномектина пур-он

при нанесении на кожу и слизистые оболочки 69

2.2.7. Изучение эмбриотоксических и тератогенных свойств эприномектина пур-он 70

2.2.8. Оценка аллергизирующего и иммунотоксического

действия эприномектина пур-он 71

2.2.9. Изучение субхронической токсичности эприномектина пур-он

в опытах на телятах 73

2.2.10. Разработка методики определения эприномектина в плазме крови, молоке, органах и тканях животных

методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 76

2.2.11. Изучение фармакокинетики эприномектина в плазме крови

коров после однократного применения эприномектина пур-он 81

2.2.12. Определение остаточных количеств эприномектина в молоке

коров после однократного применения эприномектина пур-он 83

2.2.13. Определение сроков выведения остаточных количеств эприномектина из организма телят после применения эприномектина пур-он

2.2.14. Терапевтическая эффективность эприномектина пур-он в производственных условиях 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 92 ВЫВОДЫ 111 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 113 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 114 ПРИЛОЖЕНИЯ 146

84

86

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Паразитарные болезни животных имеют широкое распространение и наносят мясному и молочному скотоводству значительный экономический ущерб. Одним из основных энтомозов среди паразитарных болезней крупного рогатого скота является гиподерматоз.

Гиподерматоз - хронически протекающее инвазионное заболевание, вызываемое личинками подкожных оводов Hypoderma bovis и Hypoderma lineatum, паразитирующими в организме животных, и проявляющееся общей интоксикацией организма продуктами жизнедеятельности паразита и воспалительными процессами в местах локализации личинок. В результате развивающегося патологического процесса уменьшается мясная и молочная продуктивность, теряется ценность кожевенного сырья, а также снижается качество и биологическая ценность получаемой от инвазированных животных продукции (22,100). Учитывая серьезный ущерб, вызываемый личинками оводов, у нас в стране и за рубежом для лечения и профилактики гиподерматоза используют большой ассортимент лекарственных средств различных химических групп (14). Препараты отличаются между собой структурой, механизмом действия, характером метаболизма в организме и продолжительностью остаточного действия, токсичностью для животных и человека, уровнем вреда, наносимого окружающей среде.

В последние годы все более широкое распространение против личинок подкожных оводов получили лекарственные средства на основе авермектинов и в первую очередь ивермектина, который в качестве действующего вещества входит в состав более 20 препаратов, зарегистрированных в Российской Федерации. Препараты на основе авермектинов обладают высокой эффективностью, широким спектром действия (инсектицидная, акарицидная и нематоцидная активность), относительно низкой токсичностью для млекопитающих и достаточной экологической безопасно-

стью, поэтому по совокупности положительных свойств сегодня являются эталонными противопаразитарными средствами (2,138,166, 288).

Авермектины ничем не отличаются от других лекарственных средств, к действию которых в соответствии с эволюционными процессами рано или поздно возникают устойчивые паразиты. Поэтому, уже начиная с конца 80-х годов прошлого века, появились первые сообщения о формировании у паразитов резистентности к ивермектину. В последнее время количество таких публикаций резко возросло, особенно из стран, где ивермектин и другие авермектиновые препараты широко используются (139, 159, 235, 236, 246, 254). Учитывая, что в России, ивермектины используются очень широко и без ограничений, тем более, иногда в заниженных в десятки раз дозах, вероятность появления ивермектинрезистентных паразитов достаточно высока.

Одним из наиболее рациональных принципов современной химиотерапии воздействия на резистентных паразитов и повышения эффективности противопаразитарных лекарственных средств, является применение новых молекул или модифицированных молекул известных химических соединений, к которым паразиты еще не сформировали механизмов устойчивости. Поэтому нам представлялось актуальным разработать новое высокоэффективное лекарственное средство для лечения и профилактики гиподерматоза крупного рогатого скота на основе структурно измененного ивермектина - эприномектина, представляющего собой полусинтетический макроциклический лактон, состоящий из двух гомологичных компонентов: В^ (не менее 90%) и В^ (не более 10%) (160,161). В доступной литературе отсутствуют сведения о возможной перекрестной резистентности между ивермектином и эприномектином, что, возможно, связано с наличием в молекуле эприномектина метиленовой группы в положении С-25.

Цели и задачи исследования.

Целью исследований являлась разработка лекарственного препарата на основе эприномектина в форме раствора для наружного применения пур-он (далее по тексту эприномектин пур-он), предназначенного для лечения и профилактики гиподерматоза крупного рогатого скота

Для достижения поставленной цели нами были определены следующие задачи:

- обосновать состав лекарственной формы, определить требования к показателям качества препарата и разработать методы их контроля;

- изучить физико-химические свойства и стабильность эприномектина пур-он в процессе хранения;

- определить параметры токсичности и изучить токсикологические свойства эприномектина пур-он в остром и субхроническом экспериментах на лабораторных животных и телятах;

- изучить фармакокинетику и установить сроки выведения остаточных количеств эприномектина из организма крупного рогатого скота после применения эприномектина пур-он;

- определить оптимальную терапевтическую дозу и разработать схему применения эприномектина пур-он при гиподерматозе крупного рогатого скота;

- оценить эффективность и безопасность эприномектина пур-он в условиях производства при гиподерматозе крупного рогатого скота.

Научная новизна.

Впервые разработан отечественный лекарственный препарат на основе эприномектина в форме раствора для наружного применения пур-он для лечения и профилактики гиподерматоза крупного рогатого скота. Изучены физико-химические, фармако-токсикологические свойства и терапевтическая эффективность препарата при гиподерматозе. Установлены особенности распределения, накопления в тканях и органах и сроки выведения остаточных количеств

эприномектина из организма животных после применения эприномектина пур-он. В условиях животноводческих хозяйств подтверждена эффективность и безопасность препарата при оводовых инвазиях крупного рогатого скота.

Практическая значимость работы.

Разработан, стандартизирован и предложен для лечения гиподерматоза крупного рогатого скота новый отечественный препарат на основе эприномектина в форме раствора для наружного применения пур-он.

Для стандартизации препарата разработаны качественные и количественные методы контроля эприномектина пур-она. Установлен срок годности лекарственного средства.

Разработан метод высокоэффективной жидкостной хроматографии определения остаточных количеств эприномектина в плазме, молоке, органах и тканях животных, позволивший установить сроки возможного использования в пищу человека продукции животноводства, полученной от животных обработанных эприномектина пур-он.

Установлены эффективные терапевтические дозы и разработана схема обработок крупного рогатого скота эприномектина пур-он при гиподерматозе.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- научное обоснование состава и лекарственной формы препарата на основе эприномектина, показатели качества и методы их контроля, результаты изучения стабильности препарата в процессе хранения;

- характеристика фармакологических и токсикологических свойств эприномектина пур-он по результатам исследований в опытах на лабораторных животных и телятах;

- результаты изучения фармакокинетики и динамики выведения остаточных количеств эприномектина из организма животных после применения эприномектина пур-он.;

- практические предложения по применению пур-она на основе эприномектина в ветеринарной практике.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гиподерматоз крупного рогатого скота

Гиподерматозы - хронически протекающие паразитарные болезни крупного рогатого скота, косуль, маралов, оленей, лосей, ланей и некоторых других видов животных, вызываемые личинками подкожных оводов: Hypo-derma bovis (обыкновенный подкожный овод) и Hypoderma lineatum (южный подкожный овод), характеризующиеся воспалительными явлениями в области пищевода или спинномозгового канала, поверхностных фасций и мышц спины, подкожной клетчатки и кожи, сопровождающиеся общей интоксикацией организма и снижением продуктивности животных (61, 68, 187, 306). Известны случаи паразитирования личинок подкожного овода у человека (39).

Гиподерматозы на территории Российской Федерации, также как и в большинстве стран Европы, Азии, Северной и Центральной Америки имеет повсеместное распространение (28, 33, 56, 68, 74, 174, 230).

Оба вида гиподерм распространены преимущественно в северном полушарии, так как их продвижению на юг препятствует высокая температура почвы, вызывающая гибель куколок (28, 97).

Возраст, пол, упитанность животных, климат, условия содержания и ряд других факторов влияет на распространение гиподерматоза. Например, у взрослых животных уровень экстенсивности инвазии проявляется слабее, чем у молодняка. Очевидно, это связано с низкой иммунологической устойчивостью и меньшей толщиной кожи молодых животных, что создает благоприятные условия для развития личинок подкожных оводов (20, 55, 84, 127). У бычков экстенсивность заражения выше, а интенсивность ниже, по сравнению с телочками (39, 82, 83, 227). Упитанные животные меньше инвазируют-ся оводами, чем истощенные, а высокий уровень интенсивности инвазии, в свою очередь, приводит к истощению животных (28, 55, 102).

Существенное влияние на распространение оводов оказывают условия содержания животных. Ночные выпасы, теневые навесы и стойловое содержание препятствует доступу оводов к животным (31, 37). После сухого и жаркого лета зараженность животных личинками подкожного овода выше, чем после прохладного и дождливого, т.к. в пасмурную погоду активность оводов снижается (28, 35, 234). Сильно увлажненные почвы могут привести к гибели личинок из-за развития на них плесневых грибов (28, 119).

Гиподерматоз крупного рогатого скота причиняет огромный экономический ущерб, который складывается из потерь молока и мяса, порчи и обесценивания кожевенного сырья (175).

Соотношение убытков от снижения качества кожи, количества мяса и молока ученые определяли по-разному: М.В. Дегтярев и Д.В. Ненюков (1931), как 51:15:34; В.И. Курчатов (1941), как 24:28:48; К .Я. Грунин (1953), как 1:6:12, из чего следует, что основная часть убытков приходится на потерю молока (27, 31, 54).

В период нападения оводов животные плохо пасутся и остаются голодными, что приводит к потере молочной продуктивности у коров на 40-50% (37), в среднем от каждого животного недополучают по 10-15 литров молока (41, 248). Особенно большие потери молока отмечаются во время паразити-рования личинок под кожей спины животных (33). При средней пораженно-сти (10-12 личинок на 1 голову) удой уменьшается на 10-12%, а при сильной пораженности - до 25% (37, 248).

В США потери молока от паразитирования личинок подкожного овода оцениваются в 15-25% (201, 212), в Европе - в 10-15%, в Канаде - в 50% от общего удоя (112).

Снижение мясной продуктивности складывается из уменьшения массы животного и потерь мяса за счет зачистки туш в местах, где локализуются личинки овода. По данным А.П. Камарли (1958) и A.C. Мустафаева (1960), потери мяса, в среднем, на одно животное составляют от 29,8 до 77 кг; по

данным М.В. Воронина, Е.В. Клементьевой (1964) и В.М. Дмитриева (1965) -до 13,1 кг; а по данным В.З. Ямова (1965) - до 24-25 кг (22, 33, 43, 62, 101).

Во Франции привесы бычков, пораженных 11-15 личинками овода, за месяц составляли 84±18 кг, тогда как животные, пораженных меньшим количеством личинок (меньше 10), давали привесы 102±15 кг (153, 274). В Америке средние привесы здоровых животных составляют 1,03 кг в сутки, тогда как больных - 0,89 кг (201).

При зачистке поверхности туш, поврежденных личинками оводов и непригодных в пищу тканей, потери мяса сильно колеблются - от 200 г при слабом поражении и до 6-7 кг при гнойно-некротическом поражениям в местах локализации личинок на одну зачищенную тушу (22, 41). В Канаде при зачистке туши, пораженной 1-5 личинками, потери составляют 0,7 кг, а при зачистке туши, пораженной 11 и более личинками - до 1,2 кг (247). R.S. Collins и L.W. Dewhirst (1971) сообщают, что потери от зачистки мяса 111893 пораженных туш в 1968 году составили 413188 долларов (143).

Стоимость шкур крупного рогатого скота, поврежденных личинками овода, значительно снижается. После выпадения личинок происходит лишь видимое заживление свищей, но полного восстановления структуры кожи не происходит. Поэтому товарная стоимость шкур резко снижается. Потери от открытых свищей составляют от 8% до 30% от всех заготовленных шкур крупного рогатого скота. При этом негодной для кожевенного сырья оказывается самая востребованная «хребтовая» часть шкуры. Ценность шкур со свищевыми отверстиями снижается на 60-80% (57, 62).

В кожевенной промышленности Германии гиподерматозные шкуры или не используются, или их потенциальная стоимость уменьшается на треть, в связи с чем потери составляют ежегодно более миллиона немецких марок (207).

В результате паразитирования личинок подкожного овода снижается иммунитет у животных (275). Вынужденный убой скота из-за паразитирова-

ния личинок оводов в спинномозговом канале, приводящий к параличу, также приводит к значительным убыткам (293).

Ущерб, вызванный гиподерматозом, является серьезной национальной проблемой в странах, где животноводство составляет существенную часть экономики. В США в 1972 году потери были оценены в 192 миллиона долларов (206), а уже в 1980 г. - в 600 миллионов долларов (154). Потери Франции от гиподерматоза крупного рогатого скота в 1984 году составили, примерно, 200 миллионов франков (216), в Австрии - 100 миллионов шиллингов, в Греции в 1992 году - 42 миллиона долларов (202). В России потери от гиподерматоза оцениваются примерно в 6,5 млрд. рублей в год (5).

Таким образом, подкожные оводы, даже при низкой численности, наносят огромный ущерб животноводству и перерабатывающим предприятиям (35).

Для достижения успеха в борьбе с гиподерматозом необходимо определить оптимальные сроки проведения обработок животных, которые могут быть обоснованы только с учетом биологического цикла развития паразита (50,58).

Свой жизненный цикл оводы проходят в течение года за четыре фазы -яйца, личинки (1, 2-ой и 3-ей стадий), куколки и имаго (28, 77, 259). Отсутствие ротового аппарата у взрослых особей не позволяет им питаться, и продолжительность их жизни в течение 3-28 дней во многом определяется запасом питательных веществ накопленных в личиночную стадию (28 , 82, 273).

Лет оводов Hypoderma bovis начинается с мая, позже, чем у оводов Hypoderma lineatum, лет которых начинается с конца апреля (82).

Оплодотворенная самка Hypoderma bovis откладывает в течение жизни до 670 яиц, прикрепляя их к волосу животного по одному яйцу, в то время как самка Hypoderma lineatum откладывает до 490 яиц, прикрепляя их по 520 яиц в один