Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Фармако-токсикологическое обоснование применения колихинола в промышленном птицеводстве

ВАК РФ 06.02.03, Звероводство и охотоведение

Автореферат диссертации по теме "Фармако-токсикологическое обоснование применения колихинола в промышленном птицеводстве"

На правах рукопис«

Стариков Никита Михайлович

ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ КОЛИХИНОЛА В ПРОМЫШЛЕННОМ ПТИЦЕВОДСТВЕ

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

12 ДЕК 2013

Троицк - 2013

005543975

005543975

Диссертация выполнена в отделе экологии и незаразной патологии животных ГНУ Уральского научно-исследовательского ветеринарного института Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный руководитель: Шкуратова Ирина Алексеевна

доктор ветеринарных наук, профессор

Официальные оппоненты: Самородова Инна Моисеевна

доктор ветеринарных наук, профессор ФГБОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины», кафедра физиологии и фармакологии, профессор

Панунндн Константин Хрнстофорович

доктор ветеринарных наук, профессор Заслуженный деятель науки РФ и РТ, заместитель директора Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Государственный аграрный

университет Северного Зауралья», г. Тюмень

Г)Г <г

Защита диссертации состоится » С и V ¿Л*-2013 г. в «I» часов на заседании диссертационного совета Д 220.066.01 при ФГБОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины» (ФГБОУ ВПО «УГАВМ») по адресу: 457100, г. Троицк, Челябинской области, ул. Гагарина, д. 13, тел. 8 (35163) 2-48-88, факс 8 (35163) 2-04-72. E-mail: tvi t@mail.ru, официальный сайт: www.usavm.ac.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Уральской государственной академии ветеринарной медицины».

Автореферат разослан <2-Д_>> Г/у^ 2013 г.

Ученый секретарь г^З'ГуС./—

диссертационного совета Борисенко Елена Валерьевна

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Птицеводство является одной из важнейших отраслей сельского хозяйства, призванной обеспечить население диетическими продуктами питания, характеризующимися большим содержанием белка животного происхождения при низкой калорийности. В общем объеме потребления белка белок мяса птицы и яиц составляет более 27% (В.И. Фисинин, 2011).

Производство птицеводческой продукции сосредоточено на крупных промышленных птицефабриках. На долю крестьянских (фермерских) хозяйств и хозяйств населения приходится 22,0% производства яиц и 9,8%-мяса птицы (МСХ РФ Отраслевая программа «Развитие птицеводства в Российской Федерации на 2012-2015 годы»).

Подверженность высокопродуктивных линий птицы на предприятиях промышленного типа воздействию различных вредных факторов, таких как гиподинамия, отсутствие инсоляции, загазованность и обсемененность воздуха микрофлорой, приводит к развитию постоянного стресса, и, как следствие, к снижению иммунитета и быстрому распространению инфекционной патологии. Недостаток эффективных средств специфической профилактики, а также полирезистентность микроорганизмов ко многим антибиотикам и химиотерапевтическим препаратам значительно усложняют контроль за ситуацией с бактериальными инфекциями птиц (И.Г. Скутарь и др, 1980; Р.Н. Коровин и др., 1989; В.Г. Пилипейко и др., 2005; И.М. Донник, H.A. Шкуратова, 2005, Э.Д. Джавадов, 2007).

Для преодоления лекарственной устойчивости бактерий актуальной проблемой является разработка и внедрение в ветеринарную практику научно-обоснованных комплексных антибактериальных лекарственных препаратов с синергидным действием составляющих компонентов, повышающих эффективность лечения животных и уменьшающих расход антимикробных средств (C.B. Шабунин, 2010, S.I. Liaw, 2002; M. N. AI-Hasan, 2009).

Степень разработанности проблемы. Фторхинолоны являются одними из самых эффективных антибактериальных препаратов, применяемых в промышленном птицеводстве при заболеваниях бактериальной этиологии. Серьезную проблему представляет резистентность микроорганизмов к антибактериальным препаратам, что может быть обусловлено нарушением способа разведения препарата, режимом выпаивания, качеством воды для разведения антибиотика при оральном способе введения.

В связи с этим разработка новых комплексных антибактериальных препаратов имеет большое теоретическое и практическое значение.

Цель исследований - дать фармако-токсикологическое обоснование применения комплексного антибактериального препарата Колихинол в промышленном птицеводстве.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

- разработать новый комплексный антибактериальный препарат, содержащий энрофлоксацин и колистин, обладающий высокой биодоступностью;

- определить острую и хроническую токсичность Колихинола;

- изучить фармакокинетику Колихинола в организме цыплят;

- определить сроки выведения остаточных количеств антибиотиков из организма цыплят и установить сроки возможного использования продукции птицеводства после применения Колихинола;

- определить лечебно-профилактическую эффективность Колихинола при бактериальных инфекциях птиц в производственных условиях;

- разработать проект технических условий и инструкцию по применению Колихинола в птицеводстве.

Предмет н объект исследования. Объектом исследования был новый комплексный антибактериальный препарат Колихинол, содержащий в качестве действующих веществ энрофлоксацин в виде ацетатной соли и колистина сульфат. Предмет исследования - острая и хроническая токсичность, фармакодинамика, фармакокинетика, антибактериальная активность Колихинола.

Научная новизна. Разработан и зарегистрирован в установленном порядке новый комплексный антибактериальный препарат Колихинол на основе ацетатной соли энрофлоксацина и колистина сульфата. В производственных условиях доказана высокая лечебная и профилактическая эффективность препарата при бактериальных инфекциях птиц.

Теоретическая значимость и практическая реализация результатов исследований. На основании теоретических разработок предложен новый эффективный антибактериальный препарат Колихинол для профилактики и лечения бактериальных инфекций у птиц. Лекарственный препарат зарегистрирован и сертифицирован в соответствии с законодательством РФ. Создано и лицензировано фармацевтическое производство Колихинола. Внедрение препарата в схему лечебно-профилактических мероприятий в промышленном птицеводстве способствовало повышению сохранности птицы на 5-7 %.

Практические результаты исследований используются в учебном процессе центра повышения квалификации ГНУ Уральского НИВИ Россельхозакадемии, ФГБУ ВПО Уральский государственный аграрный университет и внедрены в технологическую схему выращивания в ОАО «Птицефабрика «Среднеуральская» Свердловской области и ООО «Птицефабрика «Глазовская» Республики Удмуртия.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Диссертация соответствует паспорту специальности 06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией по следующим пунктам:

1. Механизм действия лекарственных веществ на организм животных, его отдельные системы и функции (фармакодинамика).

2. Всасывание, накопление, превращение (метаболизм) и выведение лекарственных веществ при различных путях их введения.

3. Взаимосвязь между химической структурой лекарственных веществ и характером их фармакологического действия.

4. Совместимость лекарственных веществ.

5. Антибактериальное, антивирусное, антипротозойное, антигельминтное, инсектицидное, акарицидное и родентицидное действия лекарственных веществ и пестицидов.

6. Зависимость фармакологического действия лекарственных средств от их дозы, формы применения, метода введения с учетом видовых особенностей животных, их возраста, пола, физиологического состояния, условий содержания и кормления.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Технология получения нового комплексного антибактериального препарата Колихинол, обладающего повышенной биодоступностью.

2. Колихинол относится к препаратам с низкой токсичностью.

3. Фармакокинетика и фармакодинамика Колихинола в организме птицы.

4. Колихинол обладает низкой кумуляцией в тканях цыплят -бройлеров.

5. Профилактическая и терапевтическая эффективность Колихинола при бактериальных инфекциях цыплят-бройлеров при промышленном содержании.

Апробация работы. Основные полржения диссертации доложены на Ученом совете ГНУ Уральский научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук (2010-2013 гг.), всероссийской научно-практической конференции молодых ученых. «Инновационные достижения в АПК» (Екатеринбург, 2013), международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы ветеринарной медицины в промышленном птицеводстве» (Екатеринбург, 2013), на 4-м съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов России «Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации» (Москва, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ - журнал «Ветеринария Кубани».

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах компьютерного текста и включает разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследования, заключение, выводы, практические рекомендации, приложение. Работа иллюстрирована 42 таблицами, 2 рисунками. Список литературы включает 143 источника, в том числе 78 зарубежных.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в отделе экологии и незаразной патологии животных ГНУ Уральского научно-исследовательского ветеринарного института Российской академии сельскохозяйственных наук по темам «Разработка и внедрение системы эпизоотической безопасности в птицеводческих организациях Свердловской области» (№ госрегистрации 01.2.00704973), «Разработать методологию применения биологически активных веществ для цыплят-бройлеров» (№ госрегистрации 01201359413) в период 2009-2013 годов. Наработку опытных партий препарата Колихинол проводили в Институте органического синтеза имени И .Я. Постовского Уральского отделения Российской академии наук.

На первом этапе работы была разработана рецептура лекарственного препарата Колихинол, проведен подбор компонентов жидкой фазы для растворения субстанций антибиотиков, изучена его стабильность, антимикробное действие. Для проверки бактерицидного действия в качестве тест-культур использовали: Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р, Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, Klebsiella pneumoniae АТСС 43816, Enterobacter agglomerans АТСС 13460, Aeromonas hydrophila ATCC 7966, Shigella sonnei ATCC 11060, Chlamydia trachomatis ATCC VR-885.Использовали 18-24-часовые популяции на плотных питательных средах. Стандартные суспензии (10 ЕД мутности) разбавляли до величины посевной дозы. Испытание проводили на 2-х концентрациях клеток: 104 и 106кл/мл. Подсчет вели в камере Горяева.

Каждый проверяемый образец разбавляли жидкой питательной средой, последовательно уменьшая его концентрацию в 2 раза. Для оценки бактерицидного действия образцы разбавляли мясо-пептонным бульоном (МПБ). Микробные нагрузки вносили в объеме 0,1 мл во все пробирки, включая контрольные. Инкубировали в термостате 48 часов. Контрольными служили пробирки, не содержащие испытуемых образцов. Учет результатов проводили визуально, по мутности. Последняя прозрачная пробирка ряда соответствовала минимальной подавляющей концентрации (МПК). Из всех прозрачных пробирок делали посевы на плотные питательные среды для определения жизнеспособности клеток. При обнаружении живых клеток концентрацию вещества считали бактериостатической, при отсутствии -бактерицидной.

Противомикробную активность in vitro изучали методами микроразведений и диско-диффузным. Растворы антибиотиков для штриховых посевов на агаре и метода диффузии в агар с использованием лунок готовили путем навески энрофлоксацина ацетата - 0,1 г, колистина сульфата - 0,07 г и Колихинола - 0,1 г. Навески растворяли в дистиллированной воде (рН 6,8-7,0) до концентраций 100 мкг/мл, 70 мкг/мл и 100 мкг/мл соответственно. Методом микроразведений сравнивали Колихинол с энрофлоксацина ацетатом и колистина сульфатом. В опыте использовали St. aureus и полевой штамм Е. coli. Расчет МИК и МБК велся по энрофлоксацину.

' б

В лабораторных экспериментах при определении токсичности в качестве опытной модели использовали 40 белых беспородных лабораторных крыс с массой тела 180-200 г, 60 беспородных белых мышей массой 20-25 г, 10 кроликов, которые содержались в виварии ГНУ Уральский НИВИ на стандартном рационе. Все манипуляции с лабораторными животными осуществляли с соблюдением рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (2003).

Токсичность Колихинола определяли в соответствии с методическими рекомендациями Фармакологического Государственного комитета (Руководство по экспериментальному доклиническому изучению новых фармакологических веществ, Москва, 2005;'«Методические рекомендации по токсико-экологической оценке лекарственных средств, применяемых в ветеринарии», 1998).

Изучение аллергизирующих свойств препарата проводили методом «Конъюнктивальной пробы». Местное раздражающее действия препарата определяли на 3 белых кроликах. Опытным животным в области лопаток выбривали шерсть на участке 5x5 см. При этом справа на кожу наносили препарат Колихинол, слева - дистиллированную воду. Наблюдения за животными проводили в течение 10 дней.

Субхроническую токсичность препарата Колихинол определяли на молодняке кур мясо-яичной породы Кучинская-Юбилейная двухмесячного возраста массой 1025,5±105,3 г.

Исследование фармакокинетики действующих веществ Колихинола проводили на цыплятах. Кровь брали перед введением и через 0.5, 1.5, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 часа после введения препарата. Данная схема позволила получить адекватные профили фармакокинетических кривых «концентрация-время» энрофлоксацина и колистина для последующего расчета фармакокинетических параметров.

Содержание антибиотиков в образцах плазмы и тканях цыплят проводилось методом хроматомасс-спектрометрии с использованием трёхквадрупольного масс-спектрометра Applied Biosystems 3200 (США).

Исследование остатков действующих веществ Колихинола проводили через 3, 6, 9 суток после введения препарата. На каждый срок убивали 4 птицы. Данная схема позволила определить допустимые сроки убоя цыплят после применения препарата.

Производственные испытания проводили на базе ОАО «Птицефабрика «Среднеуральская» Свердловской области й ООО «Птицефабрика «Глазовская» Республики Удмуртия. В качестве препарата сравнения использовали Витроцил производства «Interchemiewerken «DeAdelaar», B.V.» (Нидерланды) - 1мл которого содержит энрофлоксацина 100 мг и колистина сульфата 1200000 ME. В опыте были задействованы 2 корпуса с клеточным содержанием по 44000 цыплят. Птица первой контрольной группы получала Витроцил, птица второй опытной группы получала Колихинол. Птицу выращивали без разделения по

полу, с соблюдением принятых технологических параметров содержания, кормили вволю полнорационными кормами по нормам питательности согласно рекомендациям для данного кросса. Препараты задавали цыплятам через медикаторы с водой в дозе 500 мл на 1000 л воды для поения. Курс лечебно-профилактической дачи 5 дней - с 1 по 5 день жизни. В период опыта учитывали основные зоотехнические показатели: живую массу в процессе выращивания, сохранность поголовья, среднесуточный прирост живой массы, потребление и затраты корма на 1 кг прироста живой массы, так же учитывали проявление микоплазмы в виде вторичной инфекции по возрастам. Учет эффективности проводили во время и после срока выращивания птицы.

Статистическую обработку цифровых данных проводили в программе 8ТАТ18Т1СА6.1 гш, для оценки результатов производственного опыта использовали ^критерий Стыодента.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Технология получения н свойства Колихинола

Современная фармацевтическая промышленность производит соль энрофлоксацина как с молочной кислотой, так и с сильным основанием -гидроксидом калия. В условиях' птицеводческих предприятий Уральского региона в пробах воды установлено повышенное содержание щелочноземельных металлов при рН 8-9. Было выявлено, что рабочие растворы энрофлоксацина в зависимости от рН среды снижают срок годности. В готовой лекарственной форме состав стабилен и приготовлен на очищенной воде, но в среде с повышенным уровнем щелочно-земельных металлов начинаются изменения свойств, которые приводят к снижению биодоступности лекарственного средства. Установлено, что ацетатные соединения обладают большей биодоступностью по сравнению с лактатами, поэтому нами использован для производства энрофлоксацина ацетат.

Колихинол — комплексный антибактериальный препарат, представляющий комбинацию энрофлоксацина ацетата и колистина сульфата, обладающий лучшей растворимостью и биодоступностью. Количество энрофлоксацина в растворе было определено исходя из практики применения аналогичных препаратов (100 мг/мл по основанию), а содержание колистина сульфата было увеличено до 1330000 МЕ/мл (что составляет при применении используемой субстанции 70 мг/мл). Повышенное, по сравнению с аналогами, содержание колистина сульфата обосновано описанной в литературе зависимостью между большим количеством птицы в корпусе и требуемой большей дозой колистина в рабочем растворе.

Определение стабильности и качества Колихинола проводили по указанным в проекте ТУ 9347-001-54134286-2010 методикам сразу после изготовления препарата и далее ежеквартально в течение 12 месяцев. Всего было проверено три экспериментальные серии Колихинола. Установлено, что за весь период опыта препарат представлял собой прозрачную жидкость от

желтого до желто-зеленого цвета, плотностью при 20°С - 1,03-1,07 г/см3, рН раствора на всем протяжении была 5,2-5,3. Проверка на подлинность и заявленное содержание энрофлоксацина и колистина в Колихиноле соответствовала ТУ. Все показатели соответствовали проекту ТУ9347-001-54134286-2010.Таким образом, результаты анализа свидетельствуют о стабильности лекарственного препарата Колихинол в течение гарантийного срока хранения (двенадцать месяцев со дня изготовления), при условии соблюдения рекомендаций по хранению.

3.2 Определение антибактериальных свойств Колихинола

Была изучена активность препарата Колихинол в сравнении с энрофлоксацина ацетатом и колистина сульфатом. В зависимости от штамма минимальная ингибирующая концентрация (МИК) в отношении Shigella sonnet составила для Колихинола 0,78 мкг/мл, энрофлоксацина - 2,16 мкг/мл, для колистина сульфата - 3,12 мкг/мл, в отношении Escherichia coli составила для, для Колихинола 0,09 мкг/мл, и энрофлоксацина - 1,56 мкг/мл колистина сульфата - 1,83 мкг/мл.

Антимикробная активность Колихинола по абсолютной массе в отношении Shigella sonnei повысилась по сравнению с колистином в 16 раз, а по сравнению с энрофлоксацином увеличилась в 4 раза.

Более детальное изучение антимикробной активности показало, что Колихинол обладает выраженными антимикробными свойствами. Бактериостатическая концентрация для кокковой микрофлоры составила 3,126,25 мкг/мл.

Активность препарата в отношении'музейных штаммов Escherichia coli была достаточно высокой - 3,12 - 6,25 мкг/мл, однако, в отношении полевых снижалась до 25,0 мкг/мл.

Приведенные данные свидетельствует, что Колихинол имеет выраженное преимущество в антимикробной активности по сравнению с другими антибиотиками.

Минимальное ингибирующее действие Колихинола в отношении Salmonella spp. установлено в концентрации 25,0 мкг/мл. Бактерицидное действие препарата в отношении изученных культур превышало бактериостатическое соответственно в 2 раза.

Сравнение биоцидных свойств образцов показывает, что большей активностью обладает Колихинол, минимальная подавляющая концентрация (МПК) по всем культурам ниже, чем у других образцов. Активность энрофлоксацина ацетата и колистина сульфата практически одинакова, МПК совпадает по всем культурам.

3.3 Определение острой и хронической токсичности Колихинола

Исследования проводили на клинически здоровых животных, ранее не подвергавшихся токсическому воздействию и находящихся в одинаковых

условиях содержания. До начала опытов всех животных выдерживали в режиме карантина в течение 14 суток. Группы животных подбирали по принципу аналогов. Препарат вводили натощак после 12-ти часовой голодной диеты. Корм животные получали через 2 часа после введения препарата. Наблюдение за животными вели в течение 14 суток после введения препарата. Острую токсичность оценивали пс? следующим параметрам: максимально переносимой дозе (МПД), средней смертельной дозе - 1ЛЭ50. Дозы препарата брали так, чтобы низшая из них не вызывала гибели животных (1ЛЭ0), высшая вызывала 100%-ную гибель (Ы)юо) и между ними укладывалось не менее четырех промежуточных доз, вызывающих гибель больше или меньше 50% подопытных и находят ЬО50. Расчет ЬО50 проводили по методу Кербера: 1.О50 = ІЛЗюо - (таблица 1).

Таблица 1 — Определение острой токсичности Колихинола

Вид животных Дозы препарата, мл/кг

п=10 п=10 п=10 п=10 п=10 п=10

Белые мыши 2,5 5,0 10,0 15,0 20,0 30,0

Белые крысы 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 35,0

Установлено, что ЬБюо для крыс соответствует дозе препарата, равной 35 мл/кг (35000 мг/кг), П)50 - 20000 мг/кг; для мышей 1ЛЭюо - 30,0 мл/кг (30000 мг/кг). ЬБ50 - 17200 мг/кг.

Токсическое действие препарата проявлялось симптомами острого отравления - возбуждением с усилением двигательной активности, саливацией. За периодом возбуждения развивалось резко выраженное угнетение, состояние глубокого сна, переходящее в паралич задних конечностей. К моменту гибели животных отмечалось учащенное дыхание и сердцебиение. Развивался цианоз кожи и слизистых оболочек.

При патологоанатомическом вскрытии обнаруживали застой венозной крови в подкожной клетчатке и внутренних органах. Слизистая оболочка желудка и тонкого кишечника была гиперемирована с мелкоточечными кровоизлияниями. Печень и почкй полнокровны, незначительно увеличены, окраска неравномерная с фиолетовым оттенком. Легкие гиперемированы с явлениями отека. Под эпикардом множественные кровоизлияния.

Для исследования подострой токсичности Колихинола были сформированы 4 группы животных: 3 опытных и 1 контрольная, по 10 животных в каждой. Опытным животным ежедневно внутрижелудочно вводили препарат в дозе 0,4 мл/кг, 1,0 мл/кг и 2,0 мл/кг (1/50; 1/20 и 1/100 от 1ЛЭ50) контрольной - воду для инъекций в дозе 2,5 мл на животное. Продолжительность опыта составила 30 дней. За животными всех групп вели ежедневные клинические наблюдения. На 21 и 30 сутки убивали по 5 животных из каждой группы и брали кровь для определения гематологических и биохимических показателей, а так же определяли массу внутренних органов.

Изменений в клиническом состоянии опытных крыс не установлено. При патологоанатомическом вскрытии животных 1 и 2 групп видимых изменений внутренних органов не выявлено.

При изучении биохимических показателей на 21 сутки было выявлено достоверное увеличение щелочной фосфатазы, креатинина и мочевины в группе, получавшей 2 мл/кг Колихинола. Так же уровень мочевины достоверно увеличился в группе, получавшей препарат в дозе 1 мл/кг. В группе, получавшей максимальную дозу препарата, достоверно повысился уровень ACT. На 31 сутки биохимические показатели находились в пределах физиологической нормы и достоверно не отличались от контрольной группы.

Отмеченные на 21 сутки опыта изменения свидетельствуют об отрицательном влиянии высоких доз препарата (1/10 и 1/20 ЛД50) на печень при длительном введении. Однако эти нарушения были обратимы, о чем свидетельствует возвращение всех показателей в норму через 10 суток после отмены препарата.

Гематологические показатели крыс на 21 сутки опыта характеризовались достоверным снижением содержания гемоглобина, лейкоцитов и эозинофилов при дозе препарата 2,0 мл/кг. Выявлена тенденция к снижению уровня эритроцитов, однако эти изменения не были достоверными. На 31 сутки эксперимента все гематологические показатели пришли в норму и не отличались от таковых в контрольной группе.

3.4 Определение аллергизирующего и местно раздражающего действия Колихинола

Изучение аллергизирующих свойств препарата проводили методом «Конъюнктивальной пробы», которая является очень чувствительным тестом и в ряде случаев позволяет выявить реакцию животных на аллерген при слабой аллергизации и отрицательных кожных тестах. 1 каплю раствора Колихинола вводили глазной пипеткой под верхнее веко подопытным (п=4) и контрольным (п=4) морским свинкам массой 428-445, во второй глаз (контрольный) вводили 1 каплю воды для инъекций. Реакцию учитывали через 15 минут (гиперчувствительность немедленного типа) и через 24-48 часов (гиперчувствительность замедленного типа) и оценивали в баллах: 1 - легкое покраснение слезного протока; 2 — покраснение слезного протока и склеры; 3 -покраснение всей конъюнктивы и склеры. Установлено, что через 15 минут после введения 1 капли раствора препарата реакция конъюнктивы отсутствовала; через сутки у животных наблюдалось легкое покраснение слизистой. Через 48 часов после нанесения препарата под верхнее веко животным изменения конъюнктивы не отмечали. Таким образом, Колихинол обладает слабым аллергизирующими свойствами на слизистую глаза морских свинок.

Местное раздражающее действия препарата определяли на 3 белых кроликах. Опытным животным в области лопаток выбривали шерсть на участке 5x5 см. При этом справа на кожу наносили препарат Колихинол, слева

11

-дистиллированную воду. Наблюдения за животными проводили в течение 10 дней. Установлено, что ежедневное нанесение на кожу препарата Колихинол не вызывало покраснения кожи, зуда, а также изменений в общем состоянии, поведении и аппетите животных. Следовательно, препарат не обладает местным раздражающим действием.

Таким образом, Колихинол относится к веществам 4 класса опасности (малоопасные вещества).

3.5 Определение фармакокннетики Колихинола

Результаты изучения фармакокинетики энрофлоксацина в крови цыплят показали, что через 0,5 часа после применения препарата концентрация компонента достигает максимума — 820 нг/мл, затем резко снижается и через 1,5 часа после применения препарата содержание энрофлоксацина снизилось до 180 нг/мл. В дальнейшем, до 6 часов содержание энрофлоксацина в плазме крови поднималось до 350 нг/мл.

г, и

Рисунок 1 - Концентрация энрофлоксацина в образцах плазмы цыплят (нг/мл)

Снижение концентрации энрофлоксацина почти в два раза отмечено к 9 часам. В дальнейшем, наблюдается плавное снижение концентрации компонента в плазме крови цыплят, и к 24 часам оно составило 20 нг/мл. В органах и тканях колистин не обнаружен, что свидетельствует о том, что

колистин не всасывается в желудочно-кишечном тракте и оказывает своё воздействие исключительно на микрофлору кишечника.

Нами определено остаточное количество энрофлоксацина и колистина в образцах органов и тканей цыплят. Максимальная концентрация энрофлоксацина обнаружена в печени и почках, где к 6 дню его содержание было 126 нг/г и 88 нг/г соответственно, в жире-коже 19 нг/г, в мышцах и сердце 18 нг/г, в лёгких 10 нг/г, то есть в рамках допустимых содержаний. Таким образом, спустя 6 дней после применения препарата мясо и ткани птицы оказываются пригодными для употребления в пищу.

Установлено, что применение энрофлоксацина ацетата позволяет сократить срок предубойной выдержки до 7 суток, в отличие от других препаратов энрофлоксацина, где срок предубойной выдержки составляет 10 суток.

3.6 Изучение переносимости препарата Колихинол на птице

Для исследования были сформированы 4 группы цыплят двухмесячного возраста массой 1025,5±100,2 по 10 голов. Птице раствор Колихинола с питьевой водой вводили индивидуально в течение 20 дней ежедневно в следующих дозах (по энрофлоксацину): 1 группа - вода без препарата (контроль); 2 группа - 5 мг/кг массы тела (однократная терапевтическая доза); 3 группа - 15 мг/кг массы тела (трёхкратная терапевтическая доза); 4 группа -25 мг/кг массы тела (пятикратная терапевтическая доза). В течение 31 дня учитывали общее клиническое состояние и сохранность птицы, потребление корма, живую массу (на 7, 14, 21 и 31 сутки опыта), биохимические и гематологические показатели крови (на 21 и 31 сутки от начала введения препарата), проводили патоморфологическое исследование птицы.

Установлено, что применение Колихинола не приводило к изменению в поведении птицы. Птица в опытных группах потребляла корм и воду в тех же количествах, что и в контрольной группе. Цыплята всех групп были активны, состояние перьевого покрова не изменялось. На протяжении всего эксперимента гибели птицы ни в одной из групп не регистрировали.

По результатам биохимического анализа крови после двадцатидневного применения препарата у птицы, получавшей препарат в течение 20 суток в терапевтической дозе 5 мг/кг, не обнаруживали достоверных изменений по сравнению с контролем.

У птицы, получавшей препарат в дозе, трехкратно превышающей терапевтическую (15 мг/кг) в течение 20 суток по сравнению с контролем в сыворотке крови наблюдали достоверное (Р<0,05) увеличение содержания ACT на 18,9% и мочевины на 26,6%, (таблица 2). Через 10 суток после отмены препарата уровень ACT и количество мочевины были в пределах физиологических значений и не отличались от биохимических показателей в контрольной группе.

Таблица 2 - Биохимические показатели крови птиц

Показатель Дозировка препарата по энрофлоксацину

Контроль (без препарата) 5 мг/кг (терапевтическая) 15 мг/кг (трехкратная) 25 мг/кг (пятикратная)

21 сутки 31 сутки 21 сутки 31 сутки 21 сутки 31 сутки 21 сутки 31 сутки

Билирубин общий, Мкмоль/л 2,33±0,21 2,46±0,35 2,47±0,21 2,28±0,42 2,41±0,31 2,53±0,21 2,87±0,44 2,42±0,15

Билирубин прямой, Мкмоль/л 0,84±0,14 0,93±0,21 1,02±0,16 0,88±0,09 0,79±0Д9 0,75±0,13 0,98±0,16 0,92±0,33

ACT, Ед/л 220,4±14,7 214,6±17,1 212,2±9,9 231,6±10,3 262,0±9,7* 224,7±19,5 278,1±24,1* 226,0±17,4

АЛТ, Ед/л 23,7±4,1 27,4±3,2 23,5±2,2 25,9±3,4 27,0±2,1 25,3±0,5 36,3±2,5* 27,5±0,8

Мочевина, Ммоль/л 1,54±0,25 1,75±0,32 1,70±0,08 1,49±0,15 1,95±0,07* 1,81±0,47 2,29±0,18* 1,87±0,33

Креатинин, Мкмоль/л 21,35±1,84 20,08±3,15 22,83±2,62 18,95±1,76 23,32±2,51 21,67±4,19 24,97±1,12* 21,04±0,82

Общий белок, г/л 42,9±1,9 43,6±2,4 43,6±0,2 44,2±2,3 43,4±0,5 43,8±0,7 42,7±1,4 44,3±0,8

Щелочная фосфатаза, Ед/л 686,7±49,7 697,3±61,5 674,7±75,9 695,4±61,2 673,4±56,5 694,1±74,0 648,4±72,3 645,8±39,7

а- амилаза, Ед/л 357,3±53,4 424,3±49,3 364,3±47,6 391,1±42,1 384,5±38,3 390,2±50,2 352,3±28,7 383,1±43,4

ГГТ, Ед/л 37,2±3,7 41,7±4,3 35,7±2,9 . 38,2±2,3 39,4±2,5 37,6±3,48 40,3±2,3 39,9±3,5

Примечание: * - разница достоверна (Р<0,05)

Птица, которой препарат Колихинол выпаивали в дозе, пятикратно превышающей терапевтическую (25 мг/кг), в течение 20 суток по сравнению с контролем в сыворотке крови наблюдали достоверное (Р<0,05) увеличение содержания ACT на 26,2%, AJTT на 53,2% и мочевины на 48,7%. Содержание мочевины и креатинина в сыворотке крови птицы, получавших дозу, превышающие терапевтическую в 5 раз, после двадцатидневного применения препарата было достоверно (Р<0,05) выше, чем в контроле на 48,7% и 17,0%. Таким образом, возможно развитие дозозависимого гепатотоксического и нефротоксического эффекта при длительном применении препарата в дозе 25 мг/кг/гол. Через 10 суток после отмены препарата достоверных различий в изучаемых биохимических показателях у птицы опытных и контрольной групп не наблюдалось, что свидетельствует об обратимости изменений, происходящих в организме птицы под воздействием препарата Колихинол.

3.7 Лечебно-профнлактическая эффективность Колихинола при бактериальных инфекциях птиц в производственных условиях

Первый научно-производственный опыт был проведен на цыплятах-бройлерах кросса «РОСС-308» в стандартных условиях ОАО «Птицефабрика «Среднеуральская» Свердловской области.

В опыте были задействованы 2 корпуса с клеточным содержанием по 44000 цыплят. Птицу выращивали без разделения по полу, с соблюдением принятых технологических параметров содержания, кормили вволю полнорационными кормами по нормам питательности согласно рекомендациям для данного кросса.

Цыплята контрольной группы получали Витроцил производства «rnterchemiewerken «DeAdelaar», B.V.» (Нидерланды) - 1 мл которого содержит энрофлоксацина 100 мг и колистина сульфата 1200000 ME. Птица опытной группы получала Колихинол. Препараты задавали цыплятам через медикаторы с водой в дозе 500 мл на 1000 л воды для поения. Курс лечебно-профилактической дачи антибактериальных препаратов составил 5 дней - с 1 по 5 день жизни (таблица 3).

Анализ полученных данных показал, что сохранность в опытной группе была в 7 дней на 0,6% выше, чем в контрольной, а в целом, за период выращивания была выше на 0,3%. Среднесуточный прирост живой массы в опытной группе составлял 52,2 г, что на 0,8 г выше, чем в контроле, что позволило получить дополнительно 1,56 тонны мяса в живом весе. Категорийность мяса и напряженность иммунитета против инфекционных заболеваний в опытной и контрольной группе одинакова.

Таблица 3 - Эффективность антибактериальных препаратов (ОАО «Птицефабрика «Среднеуральская» Свердловской области)

Показатели 1 группа (Витроцил) 2 группа (Колихинол)

Поголовье 44000 44100

Возраст, дней 38 38

Вес тушки при убое, г 1990 2020

Среднесуточный прирост, г 51,4 52,2

Сохранность за партию, % 97,7 98,0

Сохранность за первую неделю, % 99,2 99,4

Сохранность за 2 недели, % 98,6 99,0

Сохранность за 3 недели, % 98,3 98,7

Сохранность за 4 недели, % 98.1 98,4

Сохранность за 5 недель, % 97,9 98,2

Конверсия корма 1.72 1,67

Получено мяса в живом весе, тонн 85,72 87,28*

Падеж, % 2,3 2,0

*разница в поголовье с опытной группой учтена

С целью изучения лечебно-профилактической эффективности комбинированного антибиотика Колихинол был проведен эксперимент на цыплятах-бройлерах кросса «Смена-7» ООО «Птицефабрика «Глазовская» Республики Удмуртия.

Результаты исследования показали, что сохранность птицы за весь период ее выращивания была выше в опытной группе: за первую неделю выращивания бройлеров - на 3,01%. за две недели выращивания - на 3,16%, за три недели выращивания - на 3,93%, за четыре недели выращивания - на 4,39%, за пять недель выращивания - на 5,39% (таблица 4).

За счет снижения заболеваемости бактериальными инфекциями на 0,69% сохранность всей партии птицы была выше в опытной группе на 8,0%, причем признаки микоплазмоза на второй неделе выращивания бройлеров появились в обеих группах, но в опытной группе данный показатель был ниже на 1,38%, чем в контроле.

Средний вес при убое птицы и ее среднесуточный прирост был выше в опытной группе, при этом конверсия корма в опыте по сравнению с контролем была ниже на 0,02.

Таблица 4 - Эффективность антибактериальных препаратов (ООО «Птицефабрика «Глазовская» Республика Удмуртия)

Показатель 1 группа (контроль) 2 группа (опыт)

Поголовье 27895 26814

Срок откорма 41 41

Средний вес 1 головы при убое, г 1968 2026

Среднесуточный прирост, г 46,3 47,7

Сохранность за партию, % 86 94

Сохранность за 1-ю неделю, % 95,14 98,15

Сохранность за 2 недели, % 93,56 96,72

Сохранность за 3 недели, % 92,13 96,06

Сохранность за 4 недели, % 90,95 95,34

Сохранность за 5 недель, % 89,18 94,57

Конверсия корма 1,94 1,92

% иммунитета к вирусу НБ в возрасте 40 дн. 76 82

Выход мяса первого сорта, % 31 42

Падеж, % 14,0 6,0

Также отмечено, что в группе, где применяли комбинированный антибиотик Колихинол, был выше выход сортового мяса птицы на 11,0%. Таким образом, применение лекарственного препарата Колихинол у цыплят-бройлеров в первые дни жизни положительно влияет на основные зоотехнические показатели производственного процесса выращивания птицы. Применение Колихинола эффективно для профилактики и лечения болезней бактериальной этиологии у бройлеров.

ВЫВОДЫ

1. Новый антибактериальный комплексный препарат Колихинол, содержащий в 1 мл в качестве действующего вещества энрофлоксацин ацетат в количестве 100 мг по основанию и колистина сульфат в количестве 70 мг обладает высокой биологической доступностью за счет более высокой растворимости и устойчивости ацетатных солей энрофлоксацина.

2. Колихинол имеет выраженное преимущество в антимикробной активности по сравнению с энрофлоксацина ацетатом и колистина сульфатом.

3. ЬО50 Колихинола составляет 17200 мг/кг. По результатам определения острой и хронической токсичности Колихинол относится к 4

классу опасности — малотоксичные препараты, не обладает аллергизирующим и местно раздражающим действием.

4. Пероральное введение Колихинола птице в терапевтической дозе 5 мг/кг в течении 20 дней не вызывает изменения внутренних органов, гематологических и биохимических показателей.

5. Пероральное введение Колихинола птице в дозе 25 мг/кг (пятикратное превышение терапевтической дозы) обусловливает повышение содержания в сыворотке крови ACT на 28,3%, мочевины на 18,6, креатинина, щелочной фосфотазы на 12,3 и 15,8 % соответственно, что свидетельствует о дозозависимом гепатотоксическом и нефротоксическом эффекте.

6. Максимальная концентрация энрофлоксацина 820 нг/мл выявляется в крови цыплят через 30 минут после введения Колихинола.

7. Через 6 дней после применения Колихинола концентрация энрофлоксацина в печени была 126 нг/г, в почках, 88 нг/г,в коже 19 нг/г, в мышцах и сердце 18 нг/г, в лёгких 10 нг/г, то есть в пределах допустимых содержаний, что позволяет сократить срок предубойной выдержки до 7 суток.

8. Введение Колихинола в технологическую схему выращивания цыплят в первые 5 дней жизни способствует повышению сохранности на 0,38,0%, увеличению прироста живой массы на 0,8-1,4 г. При использовании Колихинола получено больше мяса птицы, что позволило получить дополнительную прибыль на каждые 1000 голов в размере 9449,08 руб.

9. Разработаны и утверждены технические условия на комплексный антибактериальный препарат Колихинол (ТУ 9347-001-54134286-2012). Препарат зарегистрирован в Государственном реестре лекарственных средств для ветеринарного применения Российской Федерации (регистрационное удостоверение № 46-3-36.12-1263№ПВР-3-36.12/02884 от 26 февраля 2013 г.).

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

Ввести в технологическую схему выращивания цыплят с 1 по 5 день жизни (в предстартовый период) Колихинол в дозе 0,5 литров на 1000 литров воды. Препарат задавать через систему поения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК

1. Стариков Н.М. Использование энрофлоксацина ацетата в комплексном антибактериальном препарате Колнхинол / Н.М. Стариков, И.А. Шкуратова, И.М. Донник // Ветеринария Кубани . - 2013. - №5. - с.27-28.

2. Стариков Н.М. Применение комплексного антибактериального препарата Колнхинол в условиях ОАО «Птицефабрика «Среднеуральская» / И.М. Донник, И.А. Шкуратова, Н.М. Стариков, P.P. Валишин // Ветеринария Кубани. - 2013. - №5. - с. 23-24.

В научных изданиях

3. Стариков Н.М. Колнхинол: инновации от идей до практики / Н.М. Стариков // Био. - 2012. - № 9. - с. 23-26.

4. Стариков Н.М. Успешный опыт применения комплексного антибактериального препарата Колнхинол на птицефабрике «Среднеуральская» / Н.М. Стариков. И.А. Шкуратова, P.P. Валишин // Био. - 2013. - № 11. - с. 1314.

5. Стариков Н.М. Определение острой и хронической токсичности препарата «Колнхинол» (Colichinol) для ветеринарного применения / И.А. Шкуратова, H.A. Верещак, А.И. Белоусов, О.В. Соколова, Н.М. Стариков // Материалы 4 съезда ветеринарных фармакологов и токсикологов России «Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации». - Москва. - 2013. - с.646-649.

СТАРИКОВ НИКИТА МИХАЙЛОВИЧ

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ КОЛИХИНОЛА В ПРОМЫШЛЕННОМ ПТИЦЕВОДСТВЕ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Сдано в набор 18.11.2013 г. Подписано к печати 20.11.2013 г. Формат 60x84/16. Объём 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ №... Гарнитура Ттез^хуНотап Отпечатано в типографии.............