Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние способов отогрева на морфофункциональную сохранность криоконсервированных сперматозоидов и эмбрионов млекопитающих

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние способов отогрева на морфофункциональную сохранность криоконсервированных сперматозоидов и эмбрионов млекопитающих"

по ин

2 В Г,ЮЛ 1393 • ;

академии шт. Украины

ИНОТИТУТ ПРОЕЛН/, КРИОБИОЛОГИИ И КРИОМНДИЩИЫ

• На правах рукописи

ТОДОРОВ Пламэн Годоров

ВЛИЯНИЕ СПОСОБОВ ОТОГРЕВА НА ШРШШКЩОНиЬНЛ) ' СОХРАННОСТЬ КРИОКОНСЕРВИРОВАНШХ СПЕРМАТОЗОИДОВ И ЭМБРИОНОВ ШКОПИГАШЩ

(03.00.22 - криобиология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на Соисканий - ученой степэнл кандидата биологических ваук

Хврьков - 1993

Работа выполнена в ИПКиК АН Украины, НИЛ ААН Украины, ХГУ и ИБИНРО Болгарской АН.

Научные руководители: академик АН Украиш В.И.Гриценко

Официальные оппоненты: академик ААН Украины, доктор

ветеринарных наук Красников Г.А., кандидат биологических наук Т.П.Линник

Ведущая организация - Институт кивотноводства Академии . Аграрных наук Украины

Защита состоится 1993 года в " ¥\ Т часов

на васедаюга специализированного совета Л 016.60,01 при Институте проблем криобиология и криомедацины АН Украины (г. Харьков, ул. Пвреяолавокая, 23, актовый зал). -

О диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан "У / " 1993 года.

, Ученый секретарь специализированного совета,

доктор медицинских наук А.Н.Гольцев

Актуальность проблемы. Наряду о достигнутыми успехами в криобиолог,-./ КМ-5В2Ч.Я пяргу.'/влъное число нерешенных проблем, в том числе и в области криоконсервация спермц и эмбрионов ююкогпяащих. Длительное врзмя основное внимание уделяли поиску крюзащитных сред, гогднвидуалышх программ замораживания и их совершенствованию, з то врэия как влияние процесса отогрева на сохранность меток остается гжло изученным. Поскольку процесс восстановления функциональной гголяоцешюста кркокоясервированншс биообъектов связан но только с замэргкиг.анкем, но и с отогревом, разработка щадящего сносооа отогрева сперматозоидов является актуальным. Существенно юзростаэт значен;!» этой проблемы в связи о внедрением методов быстрого х сверхбыстрого замораживания спермы, поскольку в этих случаях криоповрэядания клеток возникают в основном на этапа отогрева .

Дальнейшая оптимизация процессов отогрева замороженных спер-мятозокдоп дашзщ предусматривать не только совершенствование ста-, ркх, но я поиск новых, нетрадиционных способов размораживания, в частности, с использованием СВЧ-электромагнитной анергии. Интерес представляет также возможность применения при отогреве ультразвука, так как имеются сведения о положительном действии ультразвуковых волн малой интенсивности в некоторых криобиологических ситуациях. С целью более полной оценки биологической сохранности декон-сервированной спермы, наряду с общепринятыми целесообразно применять и такие методы оценки, которые да!ют представление о степени сохранности акросокалышк-ферментов сперматозоидов. Таким, в частности, является метод определения акросомвльной протеолитяческой активности.

В последние года все тира стали применять способы криоконсер-нации вибрионов млчкопитаицих, предусматривающие прямое погружение в жидкий азот. В этой области основные усилия ученых направлены па шбор оптимальных криозапдапшх сред и увеличение скорости охлаждения, в то время как процессы отогрева почти не изучаются. Поетому актуальным является изучение влияния различил режимов размораживания на морфофункциональные характеристики эмбрионов, криоконсер-вированных прями погружением в кидгатй азот.

Цель и зпдачи исслодовапия. Целью настоящей работы явилась • исследование'влияния некоторых способов отогрева па морфологическую и функциональную сохранность криокакезрвироваяшх спероттозоя-доп и вибрионов млекоггитптоях; соворяшстэование на втоЯ основе

методов теплоподвода с целью повышения их эффективности.

Для достижения поставленной цели намечалось ^решение следующих основных задач: ■ • ' •

1. Изучение ж Сравнение стогони восстановления морфофункцио-нальной полноценности сперматозоидов после следующих способов отогрева:

• а) отогрев в водяной банэ;

0) отогрев в водяной бала с одновременным воздействием ультразвуковыми волнами малой интенсивности.

2. Изучение действия ультразвука на криоконсервированные сперматозоиды на различных этапах процесса отогрева.

3. Выяснение возможности применения СВЧ-элактроэнергии для разкораюшштя стармы.

4. Определение технологических параметров процесса СВЧ-отог-рева спермы, обеспечивающих высокий уровень сохранности сперматозоидов.

5. Выбор наиболее айхзктавного метода криоконсервации эмбрионов из числа методов, включамцкх прямое погружение в жидкий азот, для дальнейшего его изучения и совери&нствования.

6. Изучение влияния разных скоростей размораживания на морфо-функциональные характеристики криоконсервированных эмбрионов.

Научная новизна работы. Впервые изучено влияние ультразвуковых волн малой интенсивности, применяемых на этапе отогрева, на сохранность, анросомы сперматозоидов. Показана зависимость эффективности действия ультразвука от этапа процесса размораживания, на котором он применяется. Вменена возможность использования СВЧ-электромагнитшй энергии для размораямвания спермы быка. Впервые применено быстрое замораживание для криоконсервации эмбрионов крыс и показана его эффективность..Установлено влияние скоростей отогрева на сохранность эмбрионов, замороженных прямым погружением в жидкий азот.

Практическая' ценность. Разработан способ отогрева спермы с применением ультразвуковых волн малой интенсивности, который позволяет повысить по сравнению с традиционными методами отогрева сохранность сперматозоидов после дококсерввции.

Предложен новый, нетрадиционный способ размораживания спе-рмы с использованием СВЧ-электромагнитной энергии. Определены технологические параметры процесса СВЧ-отогрева спермы, обеспечивающие высокий уровень сохранности сперматозоидов.

Бровадена сравнительная оцэкка сущэствущкх методов криокон-сервации вибрионов, включащих прямое погружение в жидкий азот.

Основные положения, втаосимыэ на защиту: '

I. Ультразвук, применяемый на этапа отогрева криоконсервиро- . ванной спермы а зона фазовых переходов лед-вода и положительных ' температур, способствует ловмюнкю сохранности" морфологических и функциональных свойств сперматозоидов и не влияет на их сохранность, если озвучивание применяется в зона кристаллического состояния спермы.

. 2. Сохранность кржжонсервироввняой спермы можно повысить с помощью СВЧ-отогрева, если применять его после предварительного переноса материала в низкотемпературную баня и использовать импульсные реккш СВЧ-облучения.

3. Сохранность деконсервировошах сперматозоидов .цослэ СВЧ-рззмораяиванкя зависит от парамэтров низкотемпературной бани, в которую помещают образцы до облучения.

4. При размораживании нитрифицированных вмбрионов временное повышение температуры суспензии может привести к поступлении избыточных количеств криопротекторов в клетку и проявлению их химичэс-кой токсичности, в связи с чем использование нагревающих бань для отогрэва нецелесообразно. '

Апробация работы. По теме диссертационной работы опубликовано четыре работы. Результаты исследований были доложены и обсуждена .на XVIII конференции молодых ученых (Харьков, 1991г.) и на и Мея-дународной конференции "Успехи современной криобиологии" (Харьков, 21-25 апреля 1992).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит'из введения, обзора литературы, описания методов исследований, вксперименгйльной части, заключения и выводов. Диссертация иллюстрирована 19 рисунками, содержит таблиц. Список цитируемой литературы вклшаот 284 источника, П том числе 193 источника иностранных авторов.

МАТЕРИАЛУ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИИ. '

Материалом исследования была спэрма быков черно-пестрой порода и рмориош крыс линии svistar.

Для'замораяиввяйя использовали эякулята, соотвэтствущйа нормативам ГОСТа 2S020-83 с изменением м 1 от 11.08.87 г. Сваквполу-чттуп сперму оценивали по В.It.Миловапову (1962) а Ф.И.Остяшко (1389). При этом учитывали следующие показатели:

- цвет и прозрачность еякулята;

- объем эякулята;

- концентрация водородных ионов (рН);

- концентрация'сперматозоидов в ! мл спермы;

- подвижность сперматозоидов;

- содержание квртвых сперматозоидов;

- содержание патологически измененных сперматозоидов;

- перекиваемость сперматозоидов при температуре ЗЭ °С.

. Сперму заморагашали по Харьковской технологии в облицованных гранулах объемом-0,25 мл под защитой 5 %-го глицерина (Ф.И.Остсш-ко, 1989).

Контрольные образцы спермы размораживали в водяной бане с температурой 40 сС в течение 40 сек.

В качестве источника ультразвука использовали генератор с частотой 880 КГц и интенсивностью 0,8 Вт/сма. При этом стаканчик о водяной баней с размораживаемыми образцами спермы находился на трубке излучателя. Озвучивание производили через с.™-я контактной жидкости (глицерин), находящейся меаду трубкой ИР'.учателя и дном стаканчика с водяной баней (А.Г.Душейко, ¡985).

СВЧ-раамораяыввшю спермы проводили в экспериментальном СВЧ-устройстве мощностью 500 Вт и рабочей частотой 2370 МГц. Были испытаны два способа размораживания: СВЧ-облучение гранул в воздушной среде и после их предварительного перенесения в низкотемпературную Ьанп. Для приготовления низкотемпературных бань использовали этиловый спирт, толуол и смесь, состоящую из этилового спирта и толуола, охлажденных до -10-, -20, -30, -40 и -50 °С. Применяли два типа режимов размораживания: путем непрерывного СВЧ-облувдния и облучения импульсами.

Для оценки сохранности размороженных сперматозоидов использовали следуищив показатели:

- подвижность;

- перекивавмость при 39.°С;

- содержание мертвых сперматозоидов;

- сохранность акросомапьных ферментов.

Тост демонстрации акросомальной протеолитичэской активности (АЛА) проводил;! по Уотт А. et а1 (1972) и Рхвоог А. (1933).

*" Эмбрионы на стадии- морулы или компактной мору ли получали от пбловозрелых,' обычно овулировавпшх крыс. Растворы для вымывания, замораживания и культивирования эмбрионов делали на среде, состоя-

щей из 80- фосфатно-солевого буфера Двльбекко и 20 % йгаоротки новорожденного, теленка. Замораживание проводили а пластиковых соломинках. объемом 0,25 мл рутам их прямого погружения в гадкий азот.,

Всэ получению ембрионы разделили на 6 груш. Эмбрионы первой группы (п, = 218) криоконсервировали по Мавв1р (1987) следующим образом: эмбрионы с минимально возможным объемом питательной; среды переносили в каплю эквилибрирукщего раствора, содержащего 10 % глицерина и 20 Я проталенгдиколя. ЭКЕИЛЯСрацию проводили в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем эмбрионы помещали в соломинку, заполненную предварительно охлажденной до 4 °0 нитрифицируемой средой (содержащей 26 % глицерина и 25 % лропиленгликоля). Соломинки бистро (до 10 сек) закрывали полимерными пробками и погружали в жидкий азот. Оттаивание проводили в водяной.'банэ при 20 °0.

Витрификацию вибрионов второй группы (п = 94) проводили в соответствии с вышеописанным режимом за исключением того, что оттаивание проводили при 4

Эмбрионы третьей группы (п = 76) криоконсэрвировали по I. (1939) следующим образом: после 10-минутной еквилибрацки при комнатной температуре в среде, содержащей 10 % глицерина, их переносили в соломинку с замораживаемой средой (30 % глицерина, 50 % 2М сахарозы, 20 % СНТ), выдерживали в ней 1,5 мин. и погружали в .жидкий азот. Оттаивание проводили в водяной банэ при 37 °С.

Консервацию вибрионов четвертой группы (п = 331) проводили таким кэ образом, как и третьей, за исключением того, что вторая (замораживаемая) среда содержала 30 Я глицерина и 70 % 1М сахарозы.

Сппкие эмбрионы пятой группы (п = 32) 'служили контролем.

Эмбриош шестой группы (л = 519) после обнаружения переносили в соломинку, содержащую замораживаемую среду (30 %■ глицерина, 70 % 1М сахарозы), выдерживали в течэниэ 3-х минут и погружали в жидкий азот. Эмбрионы вто'й группы разделили яа четыре подгруппы. . Эмбрионы 1, 2 и 3 подгруппы оттаивали в водяной банэ при темперв-турах 40 20 °С, и 4 °0 соответственно. Эмбрионы четвертой под-труппы оттаивали на воздухе при комнатной температуре.

Выведение криопротэкторов из эмбрионов всех огшпшх групп Посла размораживания проводили в среде, содвржвдэй сахяропу. Затем вибрионы отмывали пятикратно в среде культивирования.

, 8 •

О степени сохранности эмбрионов после криоконсервац,'и нудили по их морфологической целостности и по результатам культивирования. Культивирование проводили во-влажной камере в атмосфере 5 % С02 при температуре 37 °0. К среде культивирования добавляли антибиотик. Во всех экспериментах, развившимися считали эмбрионы, дос-тигше стадии экспандарованной бластоцксты.

Цифровой материал обработан методом вариационной статистики.

РЕЗУЛЬТАТЫ КСОЩЦОВЛНЗШ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ .I. Влияние ультразвука на сперматозоида в процессе деконсврвацки клеточной суспензии.

Образу спврмы, заморожошше. под защитой глицерина в 5 % конечной концентрации в облицованных гранулах по оптимальной программе до -196 °С, пороносилк в водяную бани (+40 облучаемую ' ультразвуком, и отогревали в течение 40 секунд. Контрольные образ-;д! разиоракивали в аналогичной водяной бане без обработки ультразвуком.

Проведенные нами исследования показали, что применение ультразвуковых волн малой интенсивности на этапа отогрева криоконсер-вированной спермы оказывает влияние на сохранность сперматозоидов. Озвучиваемые в процессе размораживания образцы достоверно (Р < 0,Ш1) отличались от контрольных по показателю перэкиваемости де-консервированных сперматозоидов при температуре 39 °С. Он составил в среднем 423,75 ± 8,04 мин. по сравнении с 358,50 ± 5,53 мин. в контроле.

• Процент живых сперматозоидов после размораживания в ультразвуковом пола был в среднем,на 5,3 % выше, чем в контроле (54,65 % и 49,35 % соответственно). Наблюдалась тенденция к увеличению подвижности деконсервировашшх сперматозоидов после размораживания в ультразвуковом поле. Подвижность составила в среднем 43,75 % в опытных образцах и 38,75 % -в контрольных. Снижение подвижности сперматозоидов в динамике после их размораживания с применением и без применения ультразвука показано в табл. I.

Одной из наиболее лабильных структур при криоконсврвации является .шсросома сперматозоидов. Учитывая ,вто, мы сочли целесообразным определить влияние применения ультразвука при отогреве^ на сохранность содерзямого акросомы. Для этого использовали тест определения акросомальпой протеолитической активности (АЛА) сперматозоидов (Ибоог А., 1383).' Пр» 1ТОН (^са-оьериы* огличий Ие"'сЛё КС1'~Р°Ь'°НЬ1Н1{ и опытными осУраь^а ни Не

' 9 Таблица I

Подвижность деконсервированннх сперматозоидов после воздействия ультразвука на разных этапах размораживания

Период Подвижность сперматозоидов, %

озвучивания (сек.) после размораж. через 60 мин. через 120 мин. через 500 иин.

с 1-й по'40-в 43,75±2,68 35,БО±3,20 31,25±3,II* 19,25+3,63*

с 7-й по 40-и 43,25±2,38 34,50*2,69 29,00±2,54 18,25±2,В6**

с 15-й по 40-ю 42,75±2,48 33,Б0±2,7В 27,75±2,94 17,25+2,94.

с 20-й по 40-ю 42,25+2,48 32,00+2.91 2б,75±2,86 16,00±2,54

с 25-й по 40-ю 40,25±2,48 30,25+2,48 24,25+3,63 13,25±3,26

с 30-Я по 40-ю 39,25+3,26 30,00±5,4У 23,00+5,09 10,00+2,34

с 1-й по 10-ю 33,00±3,63 29,0Q±4,89 22,50±4,33 8;00+1,37

Отогрез без УЗ (контроль) 38,75±3,П 28,75+4,43 22,0Ó±3,3I 7,00+1,31

Примечание: ^ - Р < 0,01 J ' nQ сравнщШ) 0 кштролем.

Количество проО во всех случаях п = 20.

Для того, чтобы определить на каком етапв отогрева проявляется действие ультразвука на сперматозоида, озвучивание образцов проводами в различных временных интервалах процесса: с 1-ой по 40-ую секунду, с 7-ой по 40-ув сен., с 15-ой по 40-ую сек., с 20-ой по 40-ую сек., с 25-ой пй 40-ую сек., с 30-ой по 40-ую сек. и с 1-ой по 10-ую сек. Результаты представлены в табл. Г и на рис. I. Анализ приведенных данных свидетельствует о том, что в период, пока размораживаемый образец находился в твердофазном (кристаллическом) состоянии, УЗ не проявлял свое положительное действие. Полученные различия в результатах после применения УЗ с самого начала процесса отогрева и начиная о 7-ой, 15-ой или 20-ой секунда после начала отогрева недостоверны. Так, например, га риг I видно, что показатели переккввамости деконсервированных "пэрматозоидов при озвучивании с 1-ой по 40-ую секунду, о 7-ой по 4С ;-л гпк., о 15-ой по 40-ую сек., с 20-ой по 40-ую сек. были почти одинаковы между собой и существенно выше (Р .'< 0,001) контроля. В то же время достоверных различий в содержании возинополоштельшх клеток между . опытными я контрольными образцами не бала.

В показателях подвижности деконсервированных сперматозоидов

( 2 з ч « « г г

1 - Р-СШ1

I - I" -10"; 3 - 7" -40"; 5 - 20"-40"; 7 - 30"-40";

2-1" -40"; 4 - 15"-40"; 6- 25"-40"; 8 - контроль

Рис. I. Переяшзаемость деконсервированных сперматозоидов после воздействия ультразвука на разных этапах отогрева.

(табл. I) достоверных различий между опытными и контрольными образцами-не было на протяжении первых двух часов инкубирования после отогрева. 3 последующем подвижность сперматозоидов из контрольных образцов, а также озвученных с 25-ой и 30-ой по 40-ую сек. снижалась быстрее, чэм из озвученных с 1-ой, 7-ой, 15-ой и 20-ой секунда.

Предполокение о том, что УЗ нэ проявляет свое положительное действие на первом атапе отогрева подтверждается тем, что озвучивание образца о 1-ой по 10-ую секунду (когда он находился в кристаллическом состоянии) нв Еызвало аффекта.

После появления жидкой фазы УЗ проявляет свое стимулирующее действие пропорционально количеству воды в образце и времени озвучивания.

Полученные нами результаты согласуются с данными других авторов о том, что положительное действие УЗ-колебаний на сохранность биообъектов при криоконсервации проявляется в основном в зоне фазовых переходов лед-вода, а также в зоне положительных температур. ,

Результаты проведенных экспериментов позволяют предположить, что озвучивание клеток в процесса плавления льда и в зоне положительных температур (по маре нагрева"образца спермы в водяной бане) в определенной степени предупреждает появление криоповреадений. Не последнюю роль, по-видимому, играет и тепловой эффект УЗ-колеба1шй во время отогрева. За счет акустических течений УЗ интенсифицирует теплообмен между стенками контейнера и теплой водой, с одной сто-ропы, и мекду нагреваемыми. стенками и содержимым контейнера, с другой, а также сникает опасные градиенты температур. Кроме того,

п

часть энергии ультразвукового поля трансформируется в тепло как' структурами биологической среди, так и теплоносителем бани. Сумма-ция данного действия УЗ с его стимулирующим и репарируидим эффектом и позволяет повыоить эффективность размораживания клеточных суспензий.

^цкшисиапи^с ~

?,. Морфологически» свойства сперматозоидов после размораживания спермы с применением электромагнитной энергии сверхвысоких частот.

Основываясь на имеющихся сведениях о применении электромагнитной энергии сверхвысоких частот (СВЧ) для размораживания и нагрева различных- биоматериалов, мы сочли целесообразным выяснить возможности использования СВЧ энергии для размораживания спермы быка.

В первой серии экспериментов предприняли попытку размораживания криоконсервированной спермы путем облучения СВЧ-анэргией в воздушной среде. Ери атом, независимо от продолжительности, облучение оказалось неприемлимым, 'так как при коротких периодах облучения (5 - 10 сек) сперма не размораживалась, а после более длительного облучения таяла оболочка гранул. Этот факт, возможно, обусловлен большей величиной коэффициента диэлектрических потерь кощества оболочнц по сравнению со спермой. По этой причине во время последующих экспериментов перед' облучением гранулы помещали в низкотемпературную банта. Функцией бани является поглощение тепла . разогреваемой оболочки и предохранение поверхностных слоев'спермы от перегрева.-

Вначале в качестве низкотемпературной бани использовали охлажденный этиловый спирт. Отсутствие в доступной жтвратурэ сведений о размораживании криоконсервированной спермы с помощью СВЧ-энергия определило необходимость подбора оптимального режима облучения. Подбор режимов осуществляли путем опробования различных периодов разогрева и температур низкотемпературной бани. Мы поста-вилн перед собой задачу выбрать таков сочетание начальной температуры вгиЬового спирта и длителыюсги облучения, которое привело бы к нагрэяу образца спермы до температур. +30...+35 °С. Понижение томперггцфы бани сопровождалось повышением длительности облучения. Изучали два типа режимов размораживания: осуществляемых путем непрерывного облучения и облучения импульсами.

Результаты наших исследований показали, чтс как при непрерыв-

ном облучении, так и при импульсных режимах облучения большое влияние на сохранность сперматозоидов оказывает начальная температура этилового спирта.

Саше низкие показатели перекиваемости .и подвижности к самое высокое содержание м&ртвых сперматозоидов наблюдалось в том случае, если СВЧ-облутение производили после погружения образца в низкотемпературную баню с температурой -Ю °С или -20 °С. Это, возможно, вызвано врэдашм воздействием концентрированных растворов солей и феномена рекристаллизации, которые наиболее сильно проявляются в области температур -5 °С...-15 °С. Резкое повышение (Р < 0,001) переживавмостк отметили после снижения температуры бани до -30 °0 (рис. 2).

Наиболее высокую сохранность деконсервироввнных сперматозоидов наблюдали при температуре бани -50 °0 и импульсном режиме облучения (три этапа по 5 сёк с интервалом в 3 сек. между ними). В втом случае подвижность сперматозоидов посла размораживания составила 41,60 ± 2,78 а перекиваемость при 39 °С была 363,00 ± 7,64 мин. " "

та

350

' хл газ ¡.'Л 15С 1 № 51 О

и

Й

а -л . -■» -м

Ш'-Я

1 - облучение импульсами,

2 - непрерывное облучение (

Рис. 2. Переживае-мость деконсервированных сперматозоидов, при 39 °С (н/т Саня-этиловый спирт)

При облучении ОВЧ-влектромагнитной анергией этиловый • спирт-нагревался быстрее, чем сперма из-за более высокого коэффициента диэлектрических потерь. Поэтому было неясно, таяли ли гранулы из-за внутреннего генерирования тепла или вследствие их контакта с ухе нагревшимся спиртом. Чтобы выявлять этот вопрос, мы провели серию экспериментов, в которых для приготовления низкотемпературных Сань охлавдали толуол - юдаость с небольшим коэффициентом диэлектрических потерь. В этом слэчвв при СЧВ-облучении гранулы таяли, в то время как температура толуола почти не изменялась. Это

свидетельствует о том, что сгорма нагревается из-за внутреннего генерирования тепло, а не вследствие''нагревания жидкости низкотемпературной бши. Предполагаем, что низкое содержание подвижных' сперматозоидов (рис. 3) объясняется ток фактом, что большое количество клэток, погибают вследствие вторичного охлкгденкя, которое произошло за время извлечения,гранул из СВЧ - камеры и охлажденного толуола (6-7 сек)- О целью синхронизации позышония температуры бани в последующей серии опытов для приготовления Сани использовали смесь этилового спирта и толуола примерю б равных объемшх соотношениях. В эток случае температура бани повышалась синхронно с температурой спврш. Показатели спэрмогрогаш после размораживания спермы в низкоммотратурной Овне, содержащей смесь этилового спирта с толуолом, свидетельствуют о том, что и в этом случае начальная температура бани оказывала большое влияние на сохранность де-консервировннных сперматозоидов. При непрерывном СВЧ-облучении вто

I - облучение импульсами, 2. - непрерывное облучение

Рис. 3. Подвижность 'сперматозоидов после СВЧ-разогрвва (н/т баня-толуол).

выражалось в основном в уменьшении количества подвижных клеток, тогда как в показателях тареамввэмости больших различий не было. Если при начальной температуре бани -10 °0 подвижность деконсерви-рованншс сперматозоидов была всего 13,75 ± 3,П %, то при температуре бани -50 °С она повысилась до 40,75 ± 2,86 % (Р < 0,001). Существенные различия наОлпдались и в содержании еозиноположятельных сперматозоидов при разных начальных температурах охлаждающей жидкости. При температуре бани -10 °0 и -20 °С они составляли соответственно 76,35 ± 3,27 % и 70,25 ± 3,83 %, а при температуре бани -50 °0 их содержание уменьшилось до 4В,55 ± 3,89 % (Р < 0,001). Подобная тенденция к увеличению сохранности деконСервиро-ватшх сперматозоидов с понижением начальной температурой бани от-

г

10 -5;. О :

ЕЭ'- I Н1 - г

мечалась и при импульсных режимах СВЧ-облучания. Эти результаты согласуются с данными некоторых авторов о том, что даже непродолжительное пребывание криоконсврЕировашшх образцов спермы при размораживании в температурной зоне -5 °С...-20 °0 существенно понижает ее качественные показатели. Сравнение результатов непрерывного СВЧ-облучени и облучения импульсами показывает, что импульсные режимы облучения имеют некоторые преимущества. Это, по-видимому, можно объяснить более однородным распределением тепла и тем обстоятельством, что режимы облучения импульсами позволяют частично избежать локальных перегревов спермы. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что оптимальным режимом отогрева крио-консервированной спермы с применением ОВЧ-влектромвгнитной анэргии является импульсный режим СВЧ-облучения образцов спермы, предварительно перенесенных в низкотемпературную баню. Лучшие результаты были получены после перенесения гранул в смесь, состоящую из ети-. лового спирта и- толуола, охлавденную до температуры -50 °0, при импульсном режиме облучения - 4 этапа по 5 секунд с интервалами по 4 секунды между ними. ' ;

3. Влияние режима отогрева на сохранность криоконсервированных вибрионов.

В первой серии експвриментов проводили сравнительное изучение методов криоконсервации вибрионов крыс, вкличащих прямое погружение в жидкий азот с целью выбора наиболее эффективного для его дальнейшего совершенствования. Сравнивали два способа замораживания вибрионов - витрификвцию и быстрое замораживанио.

После деконсервации почти у всех вибрионов опытных групп наблюдали полную морфологическую сохранность. Это свидетельствует о том, что большие концентрации криопротекторов хорошо защищают вмб-рионы от криоповреждений. Вместе с тем, следует отмотить, что на все двконсервированные эмбрионы развивались при последующем куль-, тивирования. Можно предположить, что отрицательное влияние на способность деконсервированных вмбрионов развиваться в культуре оказывает токсичное действие криопротекторов. Данные о развитии до стадии вкспандированной бластоцистн нитрифицированных и замороженных быстрым способом эмбрионов всех групп представлены в таблице 2.

Вышеизложенные данные свидетельствуют о том, что методы нитрификации вибрионов с использованием только проникающих криопро-

15

• Таблица 2.

Развитие Битри£ицированных и замороженных ' Систрам методом эмбрионов после дэконсервации ■

Группа Количество замороженных эмбрионов Количество развившихся после оттаивания эмбрионов

абсолютный показатель м ± •

■I 213 16 7,3 ± 2,0

II 94 11 11,7 ± 1,2

III 76 . 43 . 56,6 ± 5,7

IT ГО 273 В5,0 ± 2,1

т 32 за 93,а ± 3,2

твкторов (I и II контр, группы) малоэффективны. Результата культивирования деконсервированшх Бмбрионов были достоверно ниже (Р < 0,001), чем посла крзшкоясервации эмбрионов быстрым замораживанием (III и IV контр, группы). Необходимо отметить, что после нитрификации у половины эмбрионов, не достигших стадий вкспандиро-ванной бластацисты, во время культивирования проявление жизнедеятельности все не .наблюдалось: дробление отдельных бластомэров или развитие до стадий ранней Сластоцистн.

Результаты размораживания витрифицировашшх эмбрионов показали, что лучше проводить оттаивание в водяной бане с температурой 4 °0, чем 20 °0 (рис. 4).

sunriyaj,?!

т -1 вз - 2

F<0,01

1 - водяная баня 4 °0,

2 - водяная баня 20 ,°С

Рис. 4. Зависимость сохранности деконсервированзшх вибрионов от температуры водяной Сани.

■ . 16

Во второй серия вксгоркмэнтов изучали влияние режима отогрева на сохранность эмбрионов, подвергшихся замораживанию использованием в качества криозацитшй среда 30 % глицерина и 70 % 1М саха-розн. Полученные результаты свидэльствуют о том, что скорость размораживания нэ оказывает существенного влияния на сохранность вибрионов, авмороаюшых быстрым способом. После размораживания в водяной бане с температурой 40 °0, 20 °0, 4 °0 и на воздухе при комнатной температура достоверных различий в способности деконсерви-рованных эмбрионов развиваться в культуре отмечено не было.

ВЫВОДЫ'

1. Применение ультразвуковых волн малой интенсивности на этапе отогрева криоконсервированной спермы увеличивает морфофункцио-нальную сохранность сперматозоидов.

2. Положительное действие ультразвуковых колебаний на сохранность криоконсарвированных сперматозоидов при отогреве проявляется в основном в' зоне фазовых переходов лед-вода", в также в зоне поло-

■ кительных температур.

3. Применение ультразвуковых волн малой интенсивности в зоне кристаллического состояния .криоконсервированной спермы нэ влияет на сохранность сперматозоидов.

4. СВЧ-отогрев сгорш целесообразно применять после предварительного переноса образца в низкотемпературную баню, жидкость которой имеет такие ке диэлектрические свойства, как и сперма.

б. Импульсные режимы СВЧ-облучения при отогреве повышают по. сравнении с непрерывным облучением сохранность криоконсервирован-шх сперматозоидов..

6. При сравнительном изучении методов криоконсервации вибрионов крыс, включающих прямое погружение в жидкий азот, установлено,

■ что наиболее' эффективным является метод замораживания с использованием в качестве кркоаадитиой среда комплекса прокштщога к тап-роникаицего криопротэкторов(ЗС) % глицерина и 70 % 1М сахарозы).

7. При размораживании верифицированных эмбрионов вромошюо повышение температуры суспензии моаот привести к химической токсичности криопротекторов и поступлению избыточных количеств их и клетку, в связи о чем использование нагрэващих бань для отогрева нецелесообразно.

8. Скорость отогрева нэ оказывает существенного влияния на

сохранность вибрионов, замороженных прямим погружением в жидкий азот о применением е качестве криозащятной среда комплекса проникающего и непроникащвго криопротекторов (глицерин и сахароза).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. CristoherJco V., Todorov Р., Ivanova К. Reeherohes experimentales виг l'emploia ds lienergie eleofrronagnstiqus de sjirhaute frequenoe pour la deoongelation fiu spenne de taurean // Comptea

. rendue ds l'Aoademio tiulgare dsB Soienoea.- 1992.- v. 45.- N 1 V. 69-72. '

2. iBachenko V., Isaoiienko E., Xodoro-v Р., Ivanova K. Yitri-fioation and ai t гагар id freszing of яалпзИал етЪгуоа // Comptee rendus de l'Aoademio búlgara dea Soienoes.- 1992.- v. 45.- N 6,-P. 101-104.

3. Тодоров П.Т., Тимошенко Ю.П. Изучение возможности применения СВЧ-енергии для размораживания сшрш / Сб.: Нриоконсэрвирова-ние репродуктивных клеток и вибрионов.- Харьков, 1992.- 0.127-132.

4. Исаченко В.В., Осгашко' Ф.И., Исаченко Е.Ф., Тодоров П.Т., Федорова И.А. Нрысинне эмбрионы: нитрификация и сверхбыстрое замораживание / В кн.: Тезисы 11 Международной конференции "Успехи современной криобиологии", Харьков.1- 1992,- С. 74.