Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Криоконсервация и создание низкотемпературного банка спермы лососей Дальнего Востока

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Криоконсервация и создание низкотемпературного банка спермы лососей Дальнего Востока"

Всероссийский научно-исследовательский институт племенного дела (.ВНИИплем)

КРИОКОНСЕРВАЦИЯ И СОЗДАНИЕ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОГО БАНКА СПЕРМЫ ЛОСОСЕЙ ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА

Специальность: 06.02.01 - Разведение, селекция, генетика и

воспроизводство сельскохозяйственных животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Лесные поляны Московской области 1997 г.

Работа выполнена в Камчатском отделе морской биотехнологии Тихоокеанского океанологического института Дальневосточного отделения РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук ЛЕВИН B.C.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

ЕЮХИНА.С.

кандидат биологических наук АНАНЬЕВ В.И. Ведущее учреждение - Всероссийский научно-исследовательский институт прудового рыбного хозяйства (ВНИИПРХ)

Защита диссертации состоится года в П. часов на

заседании диссертационного совета Д 120.63.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте племенного дела Адрес института: 141212, Московская область, Пушкинский район, пЛесные Поляны, ВНИИплем

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института племенного дела.

Ж .щд

Автореферат разослан "(м/" И -о 1997 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор с.-х. наук

Епишнн В.А.

Актуальность. Усиливающееся антропогенное влияние на биосферу приводит к постоянному ухудшению условий существования животных и растений и, как следствие, к исчезновению не только отдельных видов, но и целых биоценозов. В первую очередь эта опасность угрожает водной среде: резко ухудшающаяся экологическая обстановка, строительство плотин, бесконтрольный сброс неочищенных стоков промышленных предприятий, экологические катастрофы, интенсификация рыбного промысла, селективный вылов наиболее крупных особей приводят к сокращению численности популяций рыб, обеднению генофонда и к полному исчезновению отдельных видов.

Одним из наиболее эффективных и дешевых' способов сохранения биоразнообразия является криоконсервация гамет. Существование сети криобанков гамет редких, исчезающих и ценных видов рыб России могло бы создать определенный резерв генетического материала к тому моменту, когда, в стране появятся средства для восстановления редких и исчезающих видов и популяций рыб. В первую очередь это относится к Тихоокеанским лососям, нерестящимся в реках Камчатского полуострова (чавыча, кета, горбуша, нерка, кижуч, сима) и имеющих большое народнохозяйственное значение.

Создание низкотемпературного банка требует разработки методов криоконсервирования биологического материала.

Методология криоконсервации спермы рыб, и в частности, лососей в настоящее время интенсивно разрабатывается. Установлено, что наиболее эффективным криопротектором для спермы лососей является диметилсульфоксид (ДМСО) (Штайн Г., 1991., Gwo J.C., 1994), а наибольший процент подвижных спермиев (до 40%) получен при замораживании в парах жидкого азота или погружении в сухой лед с последующим хранением при -196°С (Ott A.G. and Horton H.F., 1971, Штайн Г., 1991). Однако данные, полученные на тихоокеанских лососях в других

странах, не могут быть автоматически перенесены на рыб, нерестящихся в реках Камчатки, так они отличаются ареалом обитания, спектром питания и

др.

Одной из существенных трудностей внедрения в практику криоконсервированной спермы рыб является широкий диапазон их видоспецифической толерантности к замораживанию (Kurokura Hisashi, 1994), поэтому актуальной задачей является разработка универсального метода.

Важную народнохозяйственную задачу - разработка метода криоконсервирования и создание низкотемпературного банка половых продуктов лососей Камчатки - целесообразно решать на основе фундаментальных исследований, направленных на выяснение биохимических механизмов, обеспечивающих подвижность спермы. Известно, что в активации и регуляции подвижности спермы лососей принимают участие ионы одно- и двухвалентных металлов, рН, I мембранный потенциал, цАМР (Brokaw С.J., 1987, Shapiro В.М. and Tombes R.M., 1989, Boitano S., and Omoto C.K., 1991, 1992), Однако конкретный механизм активации спермиев остается не выясненным, а подобных исследований на тихоокеанских лососях до настоящего времени проведено не былб!

Цель работы: на основе изучения подвижности спермиев при действии

факторов среды и низких температур разработать______метод

криоконсервирования и создать низкотемпературный банк половых продуктов Тихоокеанских лососей, нерестящихся в реках Камчатки.

Задачи исследования:

1. Исследовать характер движения спермиев лососей в активирующих средах . различного состава, рН и осмотического давления.

2. Изучить роль одно- и двухвалентных катионов в регуляции подвижности спермиев.

3. Оценить взаимосвязь между дыхательной активностью и подвижностью спермиев лососей в различных активирующих средах.

4. Изучить влияние режимов замораживания-отогрева на подвижность спермиев лососей в различных криозащитных средах.

5. Провести сравнительное исследование видовых различий подвижности и оплодотворяющей способности спермы нерки, кеты и чавычи при крюконсервации в различных средах.

6. Выяснить роль отдельных компонентов криозащитных сред в устойчивости спермы лососей к низкотемпературному воздействию.

7. Провести исследования по разработке универсального метода криоконсервировашя спермы лососей Дальнего Востока, обеспечивающего сохранение подвижности и оплодотворяющей способности, а также позволяющего проводить заготовку материала в полевых условиях.

8. Создать низкотемпературный банк спермы Тихоокеанских лососей, нерестящихся в реках Камчатки.

Научная новизна. Основные результаты работы получены впервые. Установлено, что траектория движения спермиев изменяется в процессе активации и зависит от ряда факторов, таких как рН, осмотическое давление, присутствие в среде одно- и двухвалентных катионов. Впервые продемонстрирована активация спермиев в спермальной жидкости при действии высоких концентраций ионов Са2+ и М§2+. Также впервые проведен ингибигорный анализ дыхания и установлено, что основным источником восстановительных эквивалентов для электрон-транспортной цепи митохондрий в составе сперматозоидов являются НАО(Р)-зависимые субстраты и что при активации митохондрии функционируют в режиме максимальной активности. Выявлено существование взаимосвязи между подвижностью и скоростью дыхания спермы лососей. Впервые проведен сравнительный анализ влияния факторов и режимов криоконсервирования на сохранность спермы ряда видов Тихоокеанских лососей.

Теоретическая значимость работы. Общебиологическое значенш , имеют данные о регуляции характера подвижности и дыхательно} активности спермы рыб ионами К+, Са2+, М§2+, Мп2+. Теоретичесю значимыми также являются результаты о роли ионной силы и осмотическоп давления криозшцкгной среды на устойчивость клеток к низкотемпературныи факторам.

Практическое значение имеет простой и дешевый метод криоконсерви рования спермы лососей, который во-первых, не требует применеюи программного зэмораживателя и дорогостоящих реактивов, во-вторых позволяет'производить заготовку материала в полевых условиях, в-третьих обеспечивает высокий процент подвижности и оплодотворяюще1 способности деконсервированной спермы. Народнохозяйственное значен» имеет организация низкотемпературного банка спермы лососей Дальней Востока, в котором уже в настоящее время заложено на неограничен» длительное хранение более 1000 образцов спермы трех видов рыб, чт< исключает возможность их исчезновения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Подвижность и характер движения спермы Тихоокеанских лососе] регулируются соотношением концентраций одно- и двухвалентных катионов увеличение концентрации двухвалентных катионов позволяет активироват сперму в семенной жидкости.

2. Исследования, проведенные на средах различного состава, рН ; осмотического давления указывают на существование взаимосвязи межд подвижностью и дыханием спермы лососей, которое обусловлено окисление! МАГ)(Р)-зависимых субстратов в митохондриях.

3. Использование простой 4-х компонентной среды и режим криоконсервирования, включающего замораживание со скоростью 3 0С*м1ш'' до -70°С, хранение в жидком азоте и быстрый отогрев, позволяе

проводить заготовку материала в полевых условиях и сохранить около 50% подвижных спсрмиск, способных к оплодотворению икры.

4. На базе Парагунского отделения Тихоокеанского Океанологического Института ДВО РАН создан низкотемпературный банк спермы Тихоокеанских лососей.

Объем и структура работы. Работа изложена на 173 страницах машинописного текста, состоит из вступления, обзора литературы, описания методов и материалов исследования, 3 глав собственных исследований с обсуждением полученных результатов, выводов, заключения. Включает 36 рисунков и 11 таблиц. Список использованной в работе литературы насчитывает 167 наименований.

МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ

Объектом исследования служила сперма трех видов тихоокеанских лососей - чавычи (Oncorhynchus tshawytscha Walbaum), нерки или красной {Oncorhynchus nerka Walbaum) и кеты (Oncorhynchus keta Walbaum), выловленных в реках Камчатки - Быстрой (левый приток р. Большой, Западное побережье), и Паратунка. Работа проводилась в течении нерестовых сезонов 1990-1996 годов. Общее количество производителей использованных при проведении данной работы превышало 250 штук. Образцы спермы объемом 15-30 мл получали непосредственно после вылова самцов и доставляли в лабораторию на льду в течение 1 часа или обрабатывали на месте.

Криоконсервация спермы. Охлажденную сперму объемом 20-50 мл смешивали при перемешивании с криозатитмыми средами различно! о состава, эквшшбрировали 10-15 мин и замораживали в мастиковых avm.iav объемом 0.5, 1 о и 1.5 мл или в гранулах оОьсмом 50. ИХ» 200 mk.i следующими способами'

• трехугапио: от 0°С до -15°С со скоростью 1-2 °С*мин"' с непродолжительной остановкой в зоне кристаллизации; от -15 °С до -70 °С со скоростью 15-20 °С*мин"'; от -70 °С до -196 °С погружением в жидкий азот;

• двухэтапно в пластиковых ампулах; от 0°С до -70°С со скоростью 30 °С*мин'' в парах азота; от -70°С до -196°С погружением в жидкий азот;

• двухэтапно в гранулах: суспензию накапывали в ячейки, сделанные в пластине из твердого СОг, с последующим погружением в жидкий азот;

• двухэтапно в спиртовой бане: образцы в пластиковых ампулах помещали в спирт, охлажденный до температуры -25°С, эквшшбрировали 20 мин и переносили в жидкий азот;

• одноэтапно: образцы в пластиковых ампулах или гранулах переносили в жидкий азот. ____

Сперму размораживали на водяной бане при температурах 4 °С, 20 °С и 1 37 °С. " I

Подвижность спермы до и после замораживания определяли в активаторах различного состава.под микроскопом, при увеличении х200 и выражали в процентах подвижных клеток, движущихся по вращательной, прямолинейной или дугообразной траектории, к общему количеству клеток в поле зрения микроскопа. Время движения измеряли с помощью секундомера.

Концентрацию сперматозоидов определяли в камере Горяева и фотоколориметрически при 590 нм, используя калибровочную кривую.

Дыхательную активность сперматозоидов определяли полярографическим методом с помощью закрытого платинового электрода Кларка в ячейке объемом 1 мл.

Осеменение икры проводили сухим и полусухим способом при использовании активаторов с температурой не выше 10 °С. Контрольную и замороженно-отогретую сперму разводили активатором или оттаивали в

активаторе (гранулы), смешивали с икрой (около 500 икринок), перемешивали 30 - 40 сек, затем приливали немного воды и через 2-3 минуты икру отмывали от спермы в течение 10 мин. Икру выдерживали 1.5 -3 часа, необходимых для набухания и перехода в стадию пониженной чувствительности к механическим воздействиям (Смирнов, 1963), раскладывали на рамке и оставляли на инкубацию.

Определение оплодотворяющей способности спермы проводили после начала дробления зародышевого диска и после выклева. личинки. Для определения оплодотворяющей способности спермы в начале развития икры ее фиксировали на стадиях дробления и просветляли малопрозрачную • наружную оболочку. Для этого икру помещали в раствор, содержащий на 1 литр воды 7 г №С1 и 50 мл СН3СООН.

Статистическую обработку полученных результатов проводили методам Фишера-Стыодента [Бейли, 1964].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Регуляция подвижности и дыхательной активности спермы лососей

В репродуктивных органах самцов лососевых рыб спермальные клетки неподвижны и активируются после выхода во внешнюю среду. При активации спермин вначале движутся по вращательной траектории, а затем до полной остановки - по линейной или дугообразной. Характер и время движения сперматозоидов кеты, использованных в данном разделе и качестве модели, зависели от природы активатора: в среде Хаммора очсу I а попала стадия вращательного движения и все сперматозоиды двигались линейно и дольше, чем п речной воде; в 10 мМ трис-НС1 (рН 8.2) 50% сперматозоидов двигалось линейно, а 50% - врашательио: а I! 10 мМ ИаИС'О, время и характер движения соответствовали значениям, наблюдаемым в естественных условиях (речной воле).

Ионы ка.1ия в чи.шмо.шрны.ч концентрациях' изменяли характер шижения и ничытип остановку спермиев (рис. 1.). Концентрация К+, »ы II,тающая переход линейной .раекторпп во враиииельпую у ;ч)% спермиев, составляла 0.47+0,02 мМ, а остановку ¿0% всех клеток (пороговая концентрация) - 0.75+0.05 мМ. При концентрации 1.2 мМ подвижны лишь одиночные спермин. Время. движения спермиев оказалось менее чувствительным к присутствию ионов калия: I достоверное снижение (на 36%) обнаружено лишь при концентрации К+ 1:1 мМ, когда процент подвижный клеток составлял менее 10%.

Двухвалентные катионы (Са2+, М^1*, Мп2+) восстанавливали подвтджность спермы лососей в калий-содержащей среде. Пороговая концентрация М§2+ составляла 7±1 мМ, а Са2+ - 10+1 мМ. Из рис. 2 видно, что ионы Мд2+ в минимальной активирующей концентрации (6 мМ) полностью восстанавливали время движения спермиев, а ионы Са2+ в низких концентрациях (до 7 мМ) вызывали кратковременное движение (7±2 сек), при увеличении концентрации время движения увеличивалось, достигая максимума при 10 мМ, а потом снова снижалось до нормальных значений (25-35 сек). При концентрации 10 мМ время движения в калий-содержащей среде в присутствии ионов Са2+ составляло 80±5 сек и было почти в 3 раза больше, чем при такой же концентрации М§2+ и в безкалиевой среде. После полной

1UU j-

0 0,5 1 1.5 2

Концентрация KCl, мМ

Рис. 1. Влияние ионов калия на общую (Д ) подвижность спермиев кеты, а также на процент клеток, движущихся по линейной (♦) и вращательной (И) траекториям.__

реактивации спермиев в присутствии более 23 мМ двухвалентных катионов характер их движения был таким же как в среде без калия.

Аналогичные закономер-

20 25

Концентрация, мМ Рис. 2. Влияние ионов кальция (■) и магния (♦) на время движения спермиев кеты при активации в калий-содержащей среде._

ности движения были получены в экспериментах, в которых активацию спермы проводили не в активаторе (речной воде или растворе ИаНСОз), а в спермальной жидкости, отделенной от сперматозоидов центрифугированием. Внесение спермы в спермальную жидкость, содержащую ионы Са2+ и Мй2* (также приготовленные на спермальной жидкости), приводило к ее активации. Характер изменения общей подвижности спермы был сходным в средах, содержащих кальций и магний, а пороговые значения (подвижность 50% спермиев) достигались при 15-20 мМ. Эти результаты показывают, что поддержание низкой концентрации двухвалентных катионов является обязательным условием неподвижности спермы в спермальной жидкости и что соотношение концентраций одно- и двухвалентных катионов регулируют подвижность спермы.

Исследования дыхательной активности спермиев были направлены на выяснение взаимосвязи между энергетическим состоянием и подвижностью. Скорости потребления кислорода в речной воде и в 10 мМ растворе ЫаНСОз практически не отличались, а в активаторе Хаммора дыхание спср.миев было в 2,5 раза выше. Присутствие 5 мМ КС1 в среде вызывало стимуляцию дыхания на 60%. а добавка Оа2* или К^2' в равной степени (почти в 2 раза)

подавляли скорость потребления кислорода. Присутствие ионов калия chiimu.1i) иигпбируюшее действие двухвалентных катионов.

СЧ'бстраты гликолиза (глюкоза), глюконеогенеза (лактат), а также митохондриальные субстраты (глутамат, мапат, : сукцинат) не оказывали существенного влияния на дыхательную активность спермы кеты. Исключением являлись лишь фруктоза, которая стимулирует дыхание очевидно используясь в качестве источника энергии, и цитрат, стимулирующее действие которого вероятно обусловлено связыванием

Из рис.3 видно, что потребление кислорода после внесения спермиев в речную воду полностью ингибировалось митохон-дриальными ингибиторами: цитохромоксидазы - цианидам, в-с/-крмплекса антимицином А, КАОН-дегидрогеназы - ротеноном.

I

Этот факт показывает, что потребление кислорода спермиями обусловлено исключительно функционированием митохондрий. При этом дыхание осуществляется за счет субстратов, окисляющихся в первом участке дыхательной цепи - ЫАОН-дегидрогеназном комплексе. Скорость дыхания спермиев не стимулировалась добавкой разобщителей окислительного фосфорилирования - 2,4-дшштрофенола (ДНФ) и 3-хлорметоксикарбонилцианидфеннлгидразона (ХКЦФ). Ингибитор митохондриальнок АТР-синтегазы олигомицин! ингибировал скорость

двухвалентных катионов.

Рис. 3. Ингибиторный анализ дыхательной активности спермы кеты. Добавки: сперма - 1-2x1010 клеток, КСИ - 2 мМ, ДНФ - 50 мкМ, ХКЦФ -1 мкМ, олигомицин - 2 мкг, антимицин А - 2 мкМ.

дыхания более чем в 4 раза, а последующая добавка разобщителя обращала эффект олигомицина (рис. 3.). Этот факт показывает, что в условиях активации митохондрии сперматозоидов работают в максимальном режиме за счет активности АТР-синтетазы. Поэтому ДНФ и ХКЦФ хоть и разобщают окислительное фосфорилирование, но не стимулируют потребление кислорода. Их эффект может быть выявлен только после подавления активности АТР-синтетазного ферментного комплекса. Ингибиторный анализ дыхания показал, что:

• дыхание осуществляется за счет митохондриального потребления кислорода;

» окислению подвергаются главным образом КАВ(Р)-зависимые субстраты;

• скорость окисления субстратов максимальна в связи с высокой активностью АТР-синтетазы, что обуславливает отсутствие стимулирующего

действия разобщителей.

Исследование влияния рН среды активации показало, что при кислых и нейтральных значениях рН спермин лососевых неподвижны (рис. 4.). При рН 7,5 около 40% клеток приобретало подвижность; при этом только половина из них двигалась по линейной траектории. При рН 8.0-8.5 обитая активность спермы достигала максимума (более 80%) и практически все клегкп лишались линейно (рис. 4.). При рН 9,0 возникали спермин, движущиеся по вращательной траектории. С увеличением рН общая активность сохранялась.

РН

Рис. 4. Влияние рН среды на общую активность (1) и характер движения по линейной (2) и вращательной (3) траеториям спермиев кеты.

по процент вращатсльио движущихся клеток увеличивался и при рН 10,0 этот uni движения становился единственным, полностью замещая линейное движение

Изччение влиянии осмотического давления среды на подвижность и дыхательную активность спермиев показало, что общая подвижность при 20 моем составляла более 80% и не изменялась при увеличении тоничности до 220 моем, а затем снижалась до 58±4% - при 320 моем и до 18+3%- при 420 моем. Присутствие калия в среде активации полностью предотвращало подвижность спермиев при низком осмотическом давлении, однако с увеличением тоничности подвижность спермы в присутствии ионов К+ восстанавливалась - так, если при 120 моем подвижность приобретало 28±3% спермиев, то при 220 моем - почти 75%. При последующем увеличении осмотического давления среды активации подвижность сперматозоидов в присутствии калия снижалась так же, как и в его отсутствии. Обращает на себя внимание тот факт, что в калий-содержащих средах спермин, хоть и восстанавливали активность, но двигались по вращательной траектории. Анализ характера движения спермы в отсутствии калия показал, что линейное движение наблюдается в достаточно узком диапазоне осмотического давления (от 20 до 120 моем).

Дыхательная активность спермиев лососей была низкой в средах, обеспечивающих максимальную подвижность с линейной траекторией (20 • моем и рН 8,0 - 8,5)'. Остановка или изменение траектории движения спермиев на вращательную добавкой ионов калия, увеличением осмотического давления или смещением рН сопровождалось увеличением скорости потребления кислорода.

2. Криоконсервация спермы тихоокеанских лососей

Отработку метода криоконсервирования начинали проводить на нерке {Oncorhynchus пегка), используя известные среды и режимы замораживания-

I э

отогрева. В качестве исходных криозащитных сред были использованы среда Orra. \ спешно примененная для криоконсервации спермы чавычи (Ott & Horton. 1971), два варианта среды Штайна (Stein, & Bayrle, 1978; Штайн, 1991) для криоконсервации спермы семги и среда Копейка (Копейка, 1986) для криоконсервации спермы карпа. Первые три среды в качестве криопротектора содержали ДМСО, а четвертая - ' этиленгликоль. На предварительном этапе было показано, что помимо криопротектора, обязательным компонентом криозащитной среды должен быть куриный желток, оптимальная концентрация которого составляла 12,5%.

Диапазон оптимального времени эквилибрации спермы в криозащитных средах находилась в интервале 10-30 мин. Такое время lie вызывало снижения активности до замораживания-отогрева, . являлось достаточным для проникновения криопротекторов внутрь клетки, что проявлялось в максимальном сохранении подвижности после замораживания-отогрева: 24+5%, 37+7%, 27±7%, и 16±4% для сред Штайна 1, Штайна 2, Отта и Копейка, соответственно. Сравнение криозащитных сред показало, что ДМСО лучше защищает спермии от факторов криоконсервации, чем этиленгликоль (показатели подвижности спермы в среде Копейка значительно ниже, чем в ДМСО-содержащих средах). Среди сред, содержащих ДМСО, лучшие результаты получены на среде Штайна 2, а время движения было максимальным в среде Отта. Поэтому дальнейшие исследования проводили на этих двух средах,

В предыдущих экспериментах замораживание проб проводили по классической для спермы лососей трехэтапной программе замораживания. Однако поскольку такой режим трудно осуществить в полевых условиях, исследовали эффективность двухэтапной программы замораживания, включающей охлаждение с различной скоростью до -70°С с последующим погружением образцов в жидкий азот. При исследовании влияния скоростей

охлаждения в диапазоне 1-50 °С*мин"', максимальная сохранность спермы нерки была установлена в диапазоне 30-35 °С*мин"'. Замораживание спермы при помощи двух- и трехэтапных режимов показало сходные результаты независимо от объема ампул в диапазоне от 0,2 до 1,5 мл: подвижность замороженно-оттаянной спермы составляла 25-35%. Учитывая, что двухэгапная программа замораживания проще, дальнейшие исследования проводили с использованием этого режима. Для его проведения в полевых условиях было разработано и изготовлено специальное устройство, помещение которого на поверхность жидкого азота в широкогорлом сосуде Дьюара обеспечивало необходимый режим замораживания, что позволило добиться высоких и воспроизводимых результатов криоконсервирования спермы как в лабораторных, так и в полевых условиях.

После отработки основных параметров замораживания-оттаивания на сперме нерки была предпринята попытка выбора универсальной среды для криоконсервирования спермы других видов тихоокеанских лососей. Для этого помимо двух криозащитных сред, показавших лучшие результаты при криоконсервировашш спермы нерки (среды Штайна 2 и Отта), использовали сахарозно-солевую среду, широко используемую для криоконсервации суспензий клеток животных (МсСапп, РагтаМ, 1976, РеНепко, й а1., 1992). В этой серии экспериментов использовали два режима замораживания: режим 1 - со скоростью 30 °С*мин'1 в парах жидкого азота до -70°С с помощью , описанного выше устройства с последующим погружением в жидкий азот; режим 2 - 20-минутная эквилибрация в спиртовой бане, охлажденной до температуры -25 °С с переносом в жидкий азот. В основе последнего режима лежит быстрое экспоненциальное охлаждение до . умеренно низких температур, служащей для снижения ¡переохлаждения и/или плавления внутриклеточных кристаллов льда (в случае их образования), а также для выравнивания осмотического давления во внутри- и

Таблица I

Влияние сред замораживания на активность и время движения спермы чавычи кеты и нерки.

Условия замораживания Среда Отт Среда Штайн Сахарозно-солевая среда

Активность, % Время движения, сек Активность, % Время движения, сек Активность, % Время движения, сек

ОпсогЬупсЫъ &/шуу&с/га

До замораживания* 70+2 88±2 80+2 41±6 78±4 40+7

Режим 1 27+2 43+7 33±2 35+4 24+2 23+4

Режим 2 3+1 5+1 5+2 7±3 2+1 5+2

Опсог'пупсИиз ке1а

До замораживания 73+6 98±9 78±3 64±4 74±8 63±5

Режим 1 30+5 39±4 35+4 38±2 27±4 28+4

Режим 2 6+2 9+2 8±3 10±2 4±1 6+2

ОпсогЬупсЬш пегка

До замораживания 77+5 53±7 75+6 77±7 71+6 53+6

Режим 1 25+6 45±5 -35+6 39±5 25+3 25+5

Режим 2 5+2 8±2 7±2 9±2 4+1 - 4+2

* - после эквилибрации с криозащитной средой

внеклеточных средах. Этот режим успешно использовался ранее для криоконсервации фибробластов (McGann, Farrant, 1976) и гепатоцитов (Petrenko, et al, 1992), однако на сперме рыб до настоящего времени испытан не был.

В табл. 1 показано, что режим криоконсервации, включающий экспоненциальное замораживание до -25 °С с последующим переносом вжидкий азот, оказался малоэффективным для сохранения функциональной активности спермиев лососей. Криоконсервация, включающая замораживание до -70°С со скоростью 30°*мин"1, позволила сохранить значительное число подвижных клеток - активность деконсервированных спермиев чавычи в средах Огга, Штайна и сахарозно солевой составляла 39%, 41% и 30% по отношению к значениям, полученным до замораживания (после эквилибра-ции с криопротектором), соответственно. Хотя доля подвижных клеток после криоконсервации в первых двух средах |1ри таком сравнении достоверно не отличалась, но по отношению к нктивным клеткам среда Штайна демонстрировала почти 2-кратное преимущество: она позволяла сохранить 40% подвижных клеток, а среда Отта - 21%. Близкие результаты по количеству подвижных клеток были получены и на сперме кеты и нерки.

Эксперименты по оплодотворениею показали, что обязательным условием проявления высокой оплодотворяющей способности является как можно более быстрое использование криоконсервированной спермы после отогрева. При этом спермии чавычи, кеты и нерки, криоконсервированные в среде Штайна, обладали достоверно более высокой способностью к оплодотворению, по сравнению с другими средами. Однако выклев личинки даже при использовании лучшей из известных сред~ (среды "Штайна) оставался низким (не более 20%). В связи с этим, была предпринята попытка модифицировать криозащитную среду, а также по возможности упростить ее для применения в полевых условиях.

3. Подвижность и оплодотворяющая способность спермы лососей

Камчатки пр» крноконсервации в средах различного состава.

Эксперименты по выбору необходимых компонентов криозащитной среды показали, что для сохранения подвижности спермы лососей минимальная среда должна включать электролит, яичный желток, буфер и криопротектор.

Исследовали подвижность и время движения сперматозоидов лососей после эквилибрации и последующего замораживания-отогрева в средах, которые помимо криопротектора (ДМСО), яичного желтка и' буфера в качестве основного осмотического компонента содержали либо электролит (№С1, 130 мМ), либо неэлектролит (сахарозу, 260 мМ). Эквилибрация спермы в сахарозной среде не влияла на процент подвижных спермиев, но увеличивала время их движения. После криоконсервации в сахарозной среде количество подвижных спермиев было на 22% больше, чем в солевой, что указвает на целесообразность использования неэлектролитов в качестве основного осмотического компонента криозащитной среды.

Учитывая, что осмотическое давление среды замораживания играет большое значение для сохранения жизнеспособности клеток, исследовали его влияние на подвижность спермы лососей. Процент подвижных клеток был максимален после криоконсервирования спермы в среде с осмотическим давлением 300 моем (не считая криопротектора ДМСО). Изменение тоничности среды в ту или иную сторону на 50 моем приводило к снижению доли подвижных спермиев на 30%.

Выбор буфера показал, что криоконсервирование спермы лососевых рыб Камчатки целесообразно проводить в средах, содержащих ЫаНСОз, поскольку в его присутствии значения активности и времени движения были выше, чем в растворах Хепес и Трис как до, так и после криовоздсйствия Оптимальная концентрация ЫаНСОз находится в области 30-50 мМ, когда

активность спермы и продолжительность ее движения до и после криоконсервирования максимальны.

Исследовали влияние ряда углеводов - сахароза, глюкоза, маннит, фруктоза и галактоза - на устойчивость спермы кеты к замораживанию-отогреву под защитой ДМСО. Концентрация всех углеводов составляла 200 мМ. После эквилибрации с криозащитными средами (до замораживания-отогрева) процент подвижных спермисв достоверно не отличался в присутствии исследованных углеводов. Время движения сперматозоидов в сахарозной среде было на 40-60% больше, чем в средах, содержащих другие углеводы. После замораживания-оттаивания в средах с различными углеродами процент подвижных клеток варьировал от 30% до 50%. Выживаемость клеток была максимальной при заморажившши в манните, глюкозе и сахарозе (50+6%, 49+5% и 45+5% соответственно), а минимальный (34+4%) - в фруктозе. Вместе с сахароза занимала особое место, поскольку клетки в ней двигались, на 40-80% дольше, чем в средах с остальными углеводами.

Для проверки предположения о том, что отсутствие различий между проникающими и непроникающими углеводами связано с коротким временем и низкой температурой эквилибрации до замораживания, провели серию опытов, в которых сперматозоиды после эквилибрации при 0°С дополнительно инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Результаты этих экспериментов свидетельствуют в пользу того, что защитный эффект углеводов не связан с их проницаемостью внутрь клетки, а локализован на се поверхности или опосредован изменением объема.

Сравнение различных неэлектролитов в качестве основного осмотического компонента криозащитной среды показало, что природа углевода не имеет решающего значения: одинаково высокие показатели подвижности были получены при использовании—сахарозы--маннита и

глюкозы. При этом оказалось важным соотношение концентраций неэлетролита (углевод) и электролита (бикарбонат натрия). При их соотношении 4-8 спермин демонстрировали наилучшие показатели подвижности после криоконсервации. Следует отметить, что бикарбонат натрия в криозащитной среде выполняет по крайней мере две функции, являясь буфером и электролитом. Его присутствие в качестве буфера обеспечивает оптимальное рН для последующей подвижности спермиев.

Таблица 2

Оплодотворяющая способность оттаянной спермы чавычи, кеты и нерки, замороженной с использованием разработанной криозащитной среды.

Условия определения Среда Штайна Разработанная среда

Оплодотворений, % Выклев, % Оплодотворение, % Выклев, %

ОпсЬгИупсИия {зксмукска

Контроль 91±5 57±6 96±5 67±6

После оттаивания 33±2 15+4 78+5 41±7

ОпсогНупсЪт ке!а

Контроль 98±9 46+5 91±9 54±6

После оттаивания 35±4 18±2 . 67+4 36±6

Опсогкупскив пегка

•'контроль 9 6±12 67±6 98±9 69±8

После оттаивания 37±3 16±4 80±9 55± 7

С практической точки зрения важно, что успешные результаты криоконсервирования были получены при использовании для приготовления криозащитной среды пищевых продуктов (сахара, пищевой соды, куриных яиц), обязательных компонентов пищевого рациона любой экспедиции. Таким образом, сперму лососей можно заготавливать имея лишь жидкий азот и криопротектор.

Использование метода криоконсервирс двухэтагшый режим замораживания в модифици;> среде и быстрый отогрев, позволило сохранить спермиев, обладающих высокой оплодотворяюф( оплодотворении свежей икры деконсервированной с: выклев личинки чавычи - 41%, кеты - 36% и нерки -

вания, включающего оваиной криозащитной около 50% подвижных ей активностью. При пер мой удалось получить .55% (табл. 2).

ВЫВОДЫ

1. При активации спермин тихоокеанских лососей, нерестящихся в реках Камчатки, сначала (1-2 сек) двигаются по вра дательной траектории, а затем до полной остановки (25-40 сек) по лишйной или дугообразной. Указанный характер, а также параметры движения (время, процент подвижных клеток) зависят от состава активирующей среды и в растворе

ниям, соответствующим

:ения,-переводя линейную

МаНСОз (10 мМ) наиболее близки к значс естественным (речной воде).

2. Ионы калия вызывают изменение характера дви» траекторию во вращательную, и последующую остановку спермиев. Пороговая концеотрация ионов калия, вызывающая остановку 50% спермиев, для кеты составляет 0,75+0,05 мМ

3. Двухвалентные катионы (Са2+, Mg1*, Мл2+) в р восстанавлшзать подвижность спермы как активирующей среде, так и в семенной плазме, движения спермиев различны при реактивации ка'

4. Скорость дыхания спермы лососей, обусловленного главным образом окислением КМ)(Р)-зависимых субстратов в митс обеспечивающих неподвижность сперматозоидов

5. Количество подвижных клеток, характер • их Движения и дыхательная активность зависят от осмотического давления и Оптимальные значения рН и тоничности являют моей.

авной степени способны в калий-содержащей однако время и характер ионами Са2+ и

хондриях, выше в средах,

рН активирующих сред. ;я 8,5 единиц рН и 20-50

6. Максимальная сохранность спермиев различных видов лососей до -стигается при использовании режима криоконсервации, включающего замораживание со скоростью 30° С мин1 до -70°С,_хранение в жидком азоте и отогрев на водяной бане при 40°С.

7. Активность и время движения спермы лососей лучше сохраняется после криоконсервации в средах с осмотическим давлением 300 моем ( без учета 1фиопротектора), основным осмотическим компонентом которых является манниг, сахароза или глюкоза при соотношении углевод: электролит 4-8. Защитный эффект углеводов не связан с их проницаемостью внутрь клетки.

8. Разработанная простая _ криозащитная_ среда, содержащая^ криопротек-тор.( диметилсульфохсид), яичный желток, бикарбонат натрия и углевод, позволяет после криоконсервнрования сохранить более 50% подвижных спермиев, способных к оплодотворению.

9. Создан низкотемпературный банк спермы тихоокеанских лососей, содержащий более 1000 образцов, полученных от производителей из нескольких популяций ОпсогЬупсЬш ке1а и ОпсогЬусЬиБ пегка, нерестящихся в различных районах Камчатки.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Рекомендуем рыбоводным заводам для_замораживания спермы лососевых рыб использовать синтетическую среду следующего состава: сахароза- 200 мМ; ЫаНСОз - 50 мМ; диметилсульфоксид - 1,5 мМ; желток куриного яйца -12,5 мл; вода дистиллированная - 100 мл.

2. Для глубокого з_амораживания_ спермы лососевых рекомендуем двухэтапное охлаждение со скоростью 30°С в мин. до -70°С и последующим замораживанием в жидком азоте до -19б°С.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Желгоножко О.В., Желгоножко В.В., Черепанов В.В., Петренко А.Ю. Криоконсервация спермы тихоокеанских лососей Камчатки чавычи (Oncorhynchus tshawyischa) и кеты (Oncorhynchus keta) // Проблемы криобиологии. • 1996, - N3. - С. 30 -34.

2. Желгоножко О.В. опыт криоконсервации спермы реофильной нерки и оплодотворение икры размороженной спермой II Тез.докл.Конференция по аквакулыуре. Астрахань.- 1995.С. 1

3. Желгоножко О.В., Желгоножко В.В. Криоконсервация спермы реофильной нерки// серАквакультура. Информ. пакет Проблемы и достижения, вып. 1. 1998.

4. Zheltonozhko O.V., Cherepanov V.V., Petrenko A.Y. Criopreservation and banking of salmonfish sperm on Kamchatka peninsula//CRYO-97 Barcelona, 34 th Annual Meeting of the Society for Criobiology.- Barcelona. Spain, suite,-8-12/-1997.