Цитологические особенности спермиев ценных видов рыб Волго-Каспийского бассейна и их изменение в зависимости от условий криоконсервации

Акимочкина, Татьяна Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Цитологические особенности спермиев ценных видов рыб Волго-Каспийского бассейна и их изменение в зависимости от условий криоконсервации
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Цитологические особенности спермиев ценных видов рыб Волго-Каспийского бассейна и их изменение в зависимости от условий криоконсервации"

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СПЕРМИЕВ ЦЕННЫХ ВИДОВ РЫБ ВОЛГО-КАСПИЙСКОГО БАССЕЙНА И ИХ ИЗМЕНЕНИЕ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УСЛОВИЙ КРИОКОНСЕРВАЦИИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология и гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Астрахань-2010

004609121

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и биоэкологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Астраханский государственный университет» Федерального агентства по образованию

Научный руководитель: доктор биологических наук

Земков Герман Вениаминович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Алтуфьев Юрий Владимирович

доктор биологических наук, профессор Каниева Нурия Абдрахимовна

Ведущая организация: Всероссийский институт

экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ РАСХН, г. Москва)

Защита состоится «30» июня 2010 года в 14:30 часов на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

Автореферат разослан «28» мая 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Ю.В. Нестеров

Общая характеристика работы

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Сокращение численности ценных и редких видов животного и растительного царства приводит к необходимости принятия срочных мер для их сохранения во всем генетическом многообразии (Державин А.Н., 1947; Кожин Н.И., 1953). В Волго-Каспийском бассейне наряду с традиционными отраслями промышленности, развивается добыча и переработка ископаемых углеводородов. Еще до нефтеразведки, на Каспии насчитывалось несколько ценных видов рыб, занесенных в Красную книгу (Васильченко, 1997; Кокоза, 1997).

Из имеющихся в настоящее время способов сохранения генофонда наиболее перспективным в сложившихся условиях является долговременная криоконсервация генетического материала с последующей возможностью его реализации для получения полноценных особей, как резерва восстановления численности (Вепринцев Б.Н. с соавт., 1984, 1989; Карнаухов В.Н., 1994; Багиров В.А. с соавт., 2004; Грищенко В.И. с соавт., 2004).

Одна из наиболее разработанных отраслей криобиологии - глубокое замораживание сперматозоидов. Это связано как с биологическими особенностями спермиев, делающими их наиболее подходящим объектом для замораживания, так и с большим практическим значением этих работ. Сперматозоиды обладают уникальными морфологическими, биохимическими и физиологическими характеристиками, резко отличающими их от остальных клеток. Разработка методов оценки качества семени животных в настоящее время чрезвычайно актуальна. Знание цитологических и функциональных особенностей спермиев даст возможность прогнозировать изменение их качества под действием различных факторов.

особенностям спермиев рыб немногочисленны и посвящены преимущественно особенностям строения сперматозоидов осетровых видов, как наиболее важных объектов аквакультуры (Гинзбург A.C. с соавт., 1975; Детлаф ТА. с соавт., 1981; Копейка Е.Ф., 1992). Имеются немногочисленные опубликованные данные по химическому составу семенной жидкости и спермиев карповых видов рыб (Жукинский В.Н. с соавт., 1988).

Что касается морфологических изменений спермиев рыб под влиянием низких и сверхнизких температур, и особенно в зависимости от состава криопротекторов, имеющиеся в научной литературе сведения также немногочисленны. Кроме того, отсутствуют публикации, отражающие перечень криоповреждений клеток рыб на различном уровне организации. Именно цитоморфологический анализ служит вполне доступным методом оценки качества спермиев на этапе разработки криопротекторных смесей, что и было положено в основу настоящей исследовательской работы.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Изучить цитологические особенности спермиев некоторых ценных видов рыб Волго-Каспийского бассейна (осетровых, карповых, белорыбицы, окуня) и их изменение в зависимости от состава криозащитной среды, условий замораживания, хранения и размораживания биоматериала.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить цитологические и функциональные особенности спермиев разных видов рыб в нативном состоянии.

2. Изучить морфофункциональные особенности сохранения спермиев рыб после воздействия низких температур в зависимости от состава искусственных криозащитных сред, температуры и других условий замораживания и хранения биоматериала.

3. Определить оплодотворяющую способность и цитоморфологическое состояние дефростированных спермиев рыб после различных сроков хранения в криосреде при использовании стандартных и модифицированных по составу криозащитных сред.

4. Разработать морфологические критерии оценки качества половых клеток после размораживания и разработать базу данных морфологических нарушений спермиев рыб в зависимости от состава криозащитной среды, условий замораживания, хранения и размораживания биоматериала.

5. Разработать способы повышения подвижности и оплодотворяющей способности спермиев рыб после дефростации.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучены и обобщены морфофункциональные особенности спермиев ценных видов рыб Волго-Каспийского бассейна, ранее фрагментарно описанных в современных информационных источниках. В настоящей работе на основе микроскопического анализа впервые дана цитологическая характеристика сперматозоидов белорыбицы, речного окуня и карповых видов рыб, а также проведен сравнительный анализ особенностей головной и хвостовой частей спермиев данных видов рыб.

Впервые дана характеристика морфофункциональных изменений спермиев рыб до и после криоконсервации в зависимости от состава криопротекторных сред, условий замораживания, хранения и размораживания. Выявлены наиболее типичные криоповреждения спермиев рыб на клеточном уровне организации.

Разработана матрица степени морфофункциональных нарушений спермиев рыб в зависимости от различного состава стандартных криопротекторных сред и их модификаций, а также разработаны и апробированы оригинальные составы криопротекторных сред, удовлетворяющих сохранению основных морфофункциональных показателей спермиев после криоконсервации.

На основании результатов проведенных серийных экспериментальных работ доказаны приемлемость замораживания и хранения семенной жидкости рыб в условиях низкой температуры (минус 22 градуса по Цельсию), что является альтернативой криоконсервации биоматериала в жидком азоте.

На основании проведенных опытов по оценке оплодотворяющей способности дефростированной семенной жидкости зарегистрировано оплодотворение яйцеклеток, что указывает на необходимость дальнейших корректив традиционной биотехники искусственного воспроизводства рыб.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Содержанием данной работы являются материалы цитологической и функциональной характеристики половых клеток рыб в норме и на фоне низкотемпературного воздействия. Полученные данные позволили выявить цитологические особенности строения спермиев в зависимости от ряда условий криоконсервации, а именно от состава криопротекгорной среды, способа замораживания, температурных условий хранения и дефростации биоматериала.

Практическая значимость работы заключается в расширении существующих представлений о характере повреждения половых клеток в результате воздействия низких и сверхнизких температур. Основным показателем негативного влияния замораживания спермиев является набухание их головной части, что рекомендуется использовать в качестве

тест-критерия качественного состояния спермиев после хранения их в замороженном виде в условиях криобанка.

Полученные данные являются основой для последующих исследований с целью использования криоконсервированной семенной жидкости в практике искусственного осеменения репродуктивных клеток ценных видов рыб, а также позволит снизить затраты на содержание производителей на рыбоводных заводах.

Результаты проведенного комплекса исследований рекомендуется использовать в рыбоводной практике, а также специалистам в области криобиологии и криоконсервации спермиев и других видов клеток и тканей животных и человека.

Полученные данные могут быть внедрены для преподавания соответствующих разделов цитологии, гистологии, физиологии человека и животных, криобиологии. Результаты исследования могут быть использованы для написания монографий, и служить в качестве методической основы для последующих исследований в этой области.

ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. По внешним морфологическим признакам спермии различных видов рыб отличаются формой и размерами головной части, а также продолжительности поступательного и колебательного движения, отражающего различные энергетические ресурсы в зависимости от вида рыб.

2. Одной из причин морфофункциональных нарушений спермиев при замораживании семенной жидкости является гиперосмотичность плазмы за счет внесения водных растворов различных компонентов криопротекторной среды. Дополнительное введение воды в семенную жидкость перед замораживанием усиливает акустическую эмиссию, что приводит к деструктивным изменениям спермиев.

3. Семенная жидкость рыб после хранения ее при низкой и сверхнизкой температуре сохраняет способность к оплодотворению яйцеклеток, однако необходимо внести коррективы в традиционные способы искусственного осеменения.

4. Функциональную активность дефростированной семенной жидкости рыб возможно увеличить за счет внесения биологически активных веществ различной природы.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

бассейна Каспийского моря» (Астрахань, 2006); в докладах Московского общества испытателей природы «Биотехнология - охране окружающей среды (Москва, 2006); на Международной научной студенческой конференции «Научный потенциал студенчества - будущему России» (Ставрополь, 2007); на Четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007); на Международной конференции «Биоресурсы, биотехнологии, экологически безопасное развитие регионов Юга России» (Сочи, 2007); на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных» (Дубровицы, 2007); на Международном конгрессе молодых ученых, студентов и аспирантов «Перспектива - 2007» (п. Эльбрус, 2007); на Международной конференции «Генетика, селекция, гибридизация, племенное дело и воспроизводство рыб» (Санкт-Петербург, 2008); на II Международной научно-практической конференции «Экология биосистем: проблемы изучения, индикации и прогнозирования» (Астрахань, 2009).

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 22 работы, из них 3 в изданиях, рекомендованных ВАК.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследований, глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Указатель литературы включает в себя 134 отечественных и 152 иностранных источников. Работа содержит 8 таблиц, 34 фотографии, 1 приложение.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования являлись репродуктивные клетки самцов русского осетра (Acipenser guldenshtadti), севрюги (Acipenser stellatus), белорыбицы (Stenodus leucichthys leucichthys), пестрого толстолобика (Aristichthys nobilis), белого амура (Ctenopharyngonod idella), a также самок севрюги (Acipenser stellatus). Семенную жидкость и икру отбирали у репродуктивных самцов и самок рыб, резервированных для искусственного воспроизводства на Александровском, Кизанском, Бертюльском и Волжском рыбоводных заводах Астраханской области. Кроме того, в весенний период для сравнительного анализа отлавливали половозрелых самцов и самок речного окуня (Perca fluviatilis).

Качество нативной спермы определяли по двум показателям: по морфологической целостности спермиев и их подвижности.

Для морфологической оценки спермиев приготавливали мазки семенной жидкости, взяв за основу методику, используемую для изготовления и окраски мазков крови (Иванова Н.Т., 1982). Препараты окрашивали азур-эозином по Романовскому. Микроскопировали мазки спермы при увеличении 8x40 и 8x100. Морфологические особенности описывали и затем фотографировали с помощью видеоокуляра HB 35, копируя с монитора компьютера.

Подвижность спермиев оценивали по времени поступательного и колебательного движения спермиев по общепринятой методике (Гинзбург A.C. с соавт., 1969). По шкале Персова (Персов Г.М., 1941) оценивали процент подвижных клеток в пределах поля зрения микроскопа.

При криоконсервации семенной жидкости были использованы ряд стандартных (Ананьев В.И. с соавт., 1998 а) и модифицированных нами криозащитных сред. Качество спермиев после дефростации также оценивали по морфологической целостности спермиев и их подвижности.

Для разработки и модификации криозащитных сред на специально подготовленной воде приготавливали растворы веществ в объеме 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1; 1,5; 2 мл на 0,5 мл спермы. После определения оптимальной концентрации, которую оценивали по подвижности спермиев, все вещества смешивали. Приготовленную смесь (криозащитную среду) вносили в семенную жидкость в расчете по объему 1:1 (общепринятое соотношение) и вновь наблюдали за подвижностью спермиев.

Было испытано два способа криоконсервации семенной жидкости русского осетра: ступенчатое замораживание в пробирках Эпендорфа и сверхбыстрое замораживание в гранулах до 80-и градусов с последующим погружением в жидкий азот для длительного хранения. Также было испытано два уровня температурного режима замораживания и хранения семенной жидкости рыб: при минус 196 в условиях жидкого азота и минус 22 градуса по Цельсию в морозильной камере.

Размораживание криоконсервированной семенной жидкости осуществляли тремя способами: в термостате при температуре 37°С, в холодильнике при 8°С и при комнатной температуре.

Для стимуляции подвижности спермиев применяли следующие химические активаторы: растворы эпина 10"6 и Ю^мг/л, циркона 10"4 мг/л, Na2C03 0,7%, NaHC03 0,7%, селенактива, метилтестостерона, глюкозы 0,7%, MgS04 0,7% , К2НР04 0,7%, KCl 0,7%, СаС12 0,7%, аскорбиновой кислоты 0,7%, а-токоферола 0,7%, сыворотка эмбриональная телячья. Для стимуляции двигательной активности спермиев на предметное стекло рядом с каплей семенной жидкости наносили каплю раствора стимулятора, быстро смешивали ее со спермой и микроскопировали, фиксируя

количество активных спермиев в процентах, время подвижности, а также характер движения. Контролем служила семенная жидкость, которую активировали водопроводной водой.

Осеменение икры севрюги дефростированной семенной жидкостью осуществляли полусухим способом. В связи с использованием дефростированных спермиев, подвижность которых была значительно ниже нативных, семенную жидкость севрюги разводили водой в 10 раз. Оплодотворение осуществляли в течение 20 мин, из расчета 30 мл спермы на 300 икринок. Икру обесклеивали тальком в течение 10 мин. Развитие икры происходило в инкубационных аппаратах. В качестве контроля служили аппараты с нативной икрой.

Осеменение икры речного окуня осуществляли мокрым способом. Для этого икру размещали в чашки Петри по 100 штук, далее приливали речную воду, вносили порцию семенной жидкости и перемешивали в течение 5 мин, после этого икру отмывали той же водой. Осеменение проводили при комнатной температуре. Инкубацию икры осуществляли в лабораторных условиях. Во время инкубации три раза в сутки меняли воду на свежую, и ежедневно регистрировали стадии развития эмбрионов под микроскопом. Наблюдения проводили в течение пяти дней после обнаружения явных признаков деструкции зародышей.

Для установления достоверности полученных данных при анализе результатов исследования все материалы были подвергнуты статистической обработке (Лакин Г.Ф., 1973; Плохинский H.A., 1980). При этом определяли средние арифметические величины (М), средние ошибки (т) и вероятность различия (р) по критерию Стьюдента (Плохинский H.A., 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты проведенного микроскопического анализа позволили выявить, ряд цитологических и функциональных особенностей у спермиев изученных нами видов рыб. Спермии осетровых видов рыб имеют удлиненную головку палочковидной формы с расширением у основания. Хвостовая часть вытянута, отчетливо видна, без признаков искривления и фрагментации (Рис. I А, Б).

По данным опубликованным в научной литературе общая длина спермиев осетровых составляет около 0,05 мм, длина головки 0,01 мм, а ширина 0,001-0,002 мм (Детлаф Т.А. с соавт., 1981). Соотношение длины головной и хвостовой части спермия составляет примерно 1:4. Сравнивая спермии различных видов рыб, указанное соотношение сохраняется. Кроме того, средняя часть сперматозоида - место соединения жгутика с

головной частью имеет незначительное утолщение (по сравнению со спермием теплокровных животных), а длина жгутика заметно больше.

Спермии белорыбицы в норме имеют округлую форму головной части со значительным расширением у основания. Хвостовая часть также вытянута и без признаков повреждения и деформации (Рис. 1 В). Спермии карповых видов рыб и речного окуня, в отличие от осетровых и белорыбицы, имеют заметно меньшие размеры. Головки спермиев округлой формы, хвостовые части короткие и изогнутые (Рис. 1 Г, Д, Е).

Сперматозоиды неподвижны в спермиальной жидкости и приобретают подвижность только в воде. При активации спермиев водой они совершают быстрые поступательные движения, которые спустя некоторое время замедляются, переходят в колебательные, и наконец, полностью прекращаются.

Время активности сперматозоидов русского осетра и севрюги в норме составляет 10-15 мин., причем время поступательного движения длится около 3 мин. Время поступательного движения спермиев белорыбицы 4570 сек, колебательная активность может длиться до 7 мин. Общее время подвижности нативных спермиев карповых видов рыб и речного окуня составляет 0,20-0,50 мин. При этом спермии совершают очень активные вращательные движения, колебательная подвижность непродолжительна.

По данным ряда авторов (Гинзбург А.С. с соавт., 1975; Детлаф Т.А. с соавт., 1981), основной структурой, обеспечивающей движение спермиев, является осевой комплекс фибрилл, который расположен в хвостовой части спермия, по бокам от этого комплекса отходят два тонких выроста, которые, как полагают авторы, обеспечивают ундуляцию жгутика. Фибриллярная структура ресничек и жгутиков свойственна всем клеткам, в том числе и сперматозоидам, имеющим в своем составе сократительный белок, близкий по своим свойствам актомиозину поперечнополосатых мышц, обладающий АТФазной активностью (Крепе Е.М., 1979). Имеются данные, свидетельствующие об открытии белка динеина, который, как полагают авторы, обеспечивает ундуляцию хвостовой части спермиев мыши (УогоЬуеу е1 а1., 2001; МсОгаШ е1 а1., 2003).

Сравнительная цитологическая характеристика спермиев осетровых, карповых видов рыб, а также белорыбицы и речного окуня представлена на рис. 1.

Таким образом, выявленные цитологические и физиологические особенности спермиев изученных нами видов рыб заключаются в различной форме и размерах головной части спермиев, длине хвостовой части, а также времени и интенсивности движения, что оказывает влияние на их криоустойчивость и характер изменений после воздействия низких температур. Как показали исследования, наиболее чувствительной к низкотемпературным воздействиям является головная часть спермиев.

в.

г.

- -

Ч»

лл- 9 ¿г - * .V , .,

-2 * . ЧТ > г ж ^«Г С - :

Д. Е.

Рис. 1. Нативная семенная жидкость русского осетра (А), севрюги (Б), белорыбицы (В), пестрого толстолобика (Г), белого амура (Д) и речного окуня (Е). Окрашивание азур-эозином по Романовскому. Ув. об. хЮО (А-В), х40 (Г-Е), ок. х8.

После дефростации при использовании различных по составу стандартных криозащитных сред у спермиев русского осетра и севрюги были обнаружены различные нарушения с явными признаками деструкции: изменение формы головок спермиев, их сморщивание или, напротив, набухание, шизоцитоз, а также разрушение хвостовой части

(Рис. 2 А). Данные нарушения удалось предотвратить, используя стандартные криозащитные среды без включения в их состав углеводов, что приводило к склеиванию морфологически полноценных спермиев друг с другом (Рис. 2 Б), а также путем разработки и использования для защиты клеток от повреждений модифицированных криозащитяых сред.

А. Б.

Рис. 2. Дефростированная семенная жидкость русского осетра, замороженная с добавлением (А) и без добавления (Б) углеводов в криозащитную среду. Окрашивание азур-эозином по Романовскому. Ув. об. хЮО, ок. х8.

При использовании модифицированных криозащитных сред различного состава удавалось сохранить без изменений головки спермиев, в то время как хвостовые части разрушались (Рис. 3). Это, по всей видимости, и явилось одной из причин снижения подвижности дефростированных спермиев.

Оценивая качественное состояние спермиев осетровых по их подвижности после дефростации, нами отмечен факт явной инактивации половых клеток во всех использованных стандартных и модифицированных криозащитных средах. Количество подвижных клеток после дефростации составляло 5-15%. Общее время подвижности дефростированных спермиев севрюги сокращалось в два раза, а русского осетра оставалось без изменений.

Рис. 3. Мазок дефростированной семенной жидкости русского осетра с добавлением модифицированной криозащитной среды. Окрашивание азур-эозином по Романовскому. Ув. об. хЮО, ок. х8.

Нарушения в виде набухания епермиев, деформации головки и потери хвостовой части были обнаружены и у дефростированных епермиев карповых видов рыб при использовании стандартных криозащитных сред (Рис. 4 А). В ряде случаев происходило гелеобразование семенной плазмы, в связи с чем, сперматозоиды не удавалось выявить микроскопически (Рис 4 Б).

А. Б.

Рис. 4. Мазок дефростированной семенной жидкости белого амура (А) и пестрого толстолобика (Б) с добавлением стандартных криозащитных сред. Окрашивание азур-эозином по Романовскому. Ув. об. х40, ок. х8.

Добавление модифицированных криозащитных сред позволило избежать данные нарушения, однако были получены противоречивые результаты при использовании в качестве коагулянта гепарина. Отсутствие в составе криозащитной среды гепарина вызывало коагуляцию семенной жидкости толстолобика после дефростации (Рис. 5 А). И наоборот, использование среды без внесения гепарина, позволило избежать коагуляции семенной жидкости амура и сохранить клетки целыми (Рис. 5 Б). В целом, семенная жидкость этих видов рыб была очень густой и спермин не имели поступательного движения, в редких случаях отдельные спермии совершали слабые колебательные движения.

Рис. 5. Мазок дефростированной семенной жидкости белого амура (А) и пестрого толстолобика (Б) с добавлением модифицированной криозащитной среды. Окрашивание азур-эозином по Романовскому. Ув. об. х40, ок. х8.

В плане обсуждения экспериментальных данных по криоконсервации семенной жидкости белорыбицы в первую очередь важно отметить, что в дефростированной семенной жидкости по скорости и по характеру движения спермии белорыбицы не отличались от осетровых. Также показана зависимость деструктивных признаков клеток белорыбицы от состава криозащитных сред. Наиболее выраженные изменения на клеточном уровне заключались в том, что спермии белорыбицы имели округлую форму, с набуханием спермиев и их хвостовой части в одних случаях (Рис. 6 А) и явными признаками разрушения спермиев в других (Рис. 6 Б).

А. Б.

Рис. 6. Дефростированная семенная жидкость белорыбицы. Окрашивание азур-эозином по Романовскому. Ув. об. хЮО, ок. х8.

Из всех изученных нами видов спермии окуня оказались наиболее устойчивыми при хранении в условиях низких и сверхнизких температур. После дефростации спермии оставались неповрежденными и сохраняли свою активность при использовании разнообразных по составу стандартных и модифицированных криозащитных сред (Рис. 7). После дефростации количество подвижных спермиев окуня снижалось незначительно. По характеру и продолжительности движения клетки окуня

также заметно превосходили спермин остальных изученных видов рыб. Возможно, такая криорезистентность спермиев окуня связана с размерами и формой их головной части по сравнению с осетровыми, а именно, чем меньше по размеру клетки, тем меньше они испытывают физическое напряжения во время замораживания. Таким образом, морфологическая целостность, высокая функциональная активность, целостность ядра спермиев окуня указывает на высокую толерантность не только клетки, но и ее генетического материала.

Рис. 7. Дефростированная семенная жидкость речного окуня. Окрашивание азур-эозином по Романовскому. Ув. об. х40, ок. хВ.

Помимо состава криозащитных сред, одну из главных ролей в практике криоконсервации играют условия замораживания и хранения биологического материала. Существуют различные технологии замораживания спермиев: замораживание в гранулах, поливиниловых соломинках, хлорвиниловых ампулах, пробирках Эпендорфа и другие. Выбор контейнера напрямую определяет способ замораживания и размораживания. Чаще всего при работе со спермой рыб применяют многоступенчатые режимы охлаждения, когда скорости его варьируют в разных интервалах температур на разных этапах замораживания. При этом во многих случаях отклонения на десятые доли градуса от оптимального температурного режима консервации чреваты критическими последствиями (Ананьев В.И. с соавт., 1998 Ь).

При криоконсервации семенной жидкости русского осетра ступенчатым способом в пробирках Эпендорфа в одном случае спермии после дефростации изменили свою форму и частично утратили хвостовую часть, в другом случае были близки к нативной. Что, по всей видимости, было связано с составом используемых криозащитных сред: в первом случае использовался стандартная среда, в состав которой входили сахароза и маннит, во втором стандартная среда без внесения углеводов.

Сверхбыстрое замораживание в гранулах с использованием тех же криозащитных сред привело к противоположному результату. Спермии, замороженные сверхбыстрым способом в гранулах с использованием стандартной среды с углеводами, морфологически более близки к нативным, в то время как спермии, замороженные с использованием

стандартной среды без углеводов, изменили свою форму и частично утратили хвостовую часть.

Таким образом, варьирование способов замораживания не позволило получить однозначного результата, что вероятно связано с различиями в криоустойчивости спермиев рыб.

Обращаясь к источникам научной информации по данной проблеме все опубликованные материалы за редким исключением, посвящаются вопросам замораживания и хранения репродуктивных клеток рыб при сверхнизкой температуре. Однако полученные нами данные показали, что в семенной жидкости русского осетра, замороженной с использованием стандартных криозащитных сред и хранившейся при -196°С и при -22°С цитоморфологически спермии не отличаются друг от друга (Рис. 8 А, Б). Замораживание семенной жидкости осетровых при низкой температуре -22°С существенно не снижает процент подвижных спермиев.

Рис. 8. Дефростированная семенная жидкость русского осетра, замороженная и хранившаяся при -196°С (А) и при -22°С (Б). Окрашивание азур-эозином по Романовскому. Ув. об. х40, ок. х8.

При резком изменении температурного режима наблюдается деформация спермиев, изменение формы и набухание головной части спермиев, разрушение хвостовой части, а также резкое снижение их числа (Рис. 9).

Рис. 9. Дефростированная семенная жидкость русского осетра, температурные условия хранения которой были нестабильными. Окрашивание азур-эозином по Романовскому. Ув. об. х40, ок. х8.

А.

Б.

Набухание и предшествующие лизису признаки, по всей вероятности, происходят в результате изменения осмотического давления плазмы и внутриклеточной жидкости. В настоящее время нет общей теории, объясняющей механизмы повреждения клеток и степени денатурации белков в процессе криоконсервации биологического материала.

Не меньшее значение для успеха криоконсервации имеет способ размораживания и последующего манипулирования дефростированной спермой. Семенная жидкость белорыбицы, дефростированная в термостате при 37°С, была очень густой, при смешивании с водой происходило гелеобразование семенной плазмы. Головки спермиев оставались без изменений, незначительная часть набухала и была деформирована. Хвостовая часть разрушалась полностью и спермин были неподвижны. При дефростации семенной жидкости медленным способом в холодильнике при 8°С происходила деструкция спермиев. В большинстве случаев головки спермиев разрушались полностью, немногочисленная часть набухала. Частично сохранялись хвостовые части спермиев. Наиболее оптимальным способом дефростации семенной жидкости оказалось размораживание при комнатной температуре. Семенная жидкость после дефростации при комнатной температуре была нормальной консистенции. Микроскопический анализ показал, что головки спермиев также остались без изменений, незначительная часть набухала. Хвостовые части спермиев также не разрушались и были отчетливо видны (Рис. 10). Однако после дефростации спермии теряли подвижность, что, возможно было вызвано агрегацией спермиев и спутыванием их хвостовых частей.

Рис. 10. Семенная жидкость белорыбицы, дефростированная при комнатной температуре. Окрашивание азур-эозином по Романовскому. Ув. об. хЮО, ок. х8.

Решая многие вопросы по проблеме криоконсервации репродуктивных клеток животных и, в частности, спермиев, основным и широко распространенным критерием качества являлась и до сих пор используется их подвижность. Вместе с тем накапливались и результаты

морфологических нарушений спермиев в результате замораживания семенной жидкости в жидком азоте, что привело в использовании результатов структурного анализа. В последующих исследованиях появилось несколько работ, в которых авторы привели данные применения оплодотворяющей способности спермиев после дефростации в качестве основного критерия функционального состояния спермиев (Ананьев В.И. с соавт., 1998 Ь; Пронина Н.Д., 2004). Связь морфологических нарушений и оплодотворяющей способности спермиев показана многими авторами (Соколовская И. с соавт., 1981; Blom Е., 1973; Saacke R.G., 1968, 1970, 1972; Sato Н. et al., 1984; Schoysman R. et al., 1985).

После дефростации семенной жидкости для осеменения икры севрюги наибольшее количество подвижных спермиев составляла 10-15 %, а скорость подвижности клеток цо сравнению с нативными была крайне низкой. Несмотря на столь низкие показатели качественной характеристики половых клеток, нами зарегистрирован факт оплодотворения и дальнейшего развития эмбрионов севрюги до выклева предличинок. Количество оплодотворенной икры (оценка на стадии гаструлы) по трем самкам колебалось и составило 11; 13; 22 %. Считая от общего количества оплодотворенной икры, заложенной на инкубацию, выклев предличинок составил лишь в одном случае на уровне около 5%. От остальных самок выклева предличинок не наблюдали, в связи с тем, что после стадий дробления и гаструляции развитие приостановилось.

Несмотря на столь низкие результаты опытов по оплодотворению икры севрюги дефростированной семенной жидкостью, полученные нами фактические данные согласуются с опубликованными работами (Ананьев В.И. с соавт., 1998 а, 1998 Ь; Савушкина С.И., 1999; Цветкова Л.И. с соавт., 1999). Для дальнейших исследований полученные данные, прежде всего, доказывают возможность практического использования криоконсервированной жидкости в рыбоводной практике, а также свидетельствуют о функциональной активности генетического материала.

Несмотря на отсутствие видимых нарушений в половых клетках окуня, оплодотворяемость в искусственных условиях практически равна нулю. Аномалии дробления-деления оплодотворенной икры окуня мы относим к несовершенству биотехники искусственного осеменения ооцитов. Биотехника искусственного осеменения икры речного окуня практически не разработана, поэтому полученные нами фактические материалы следует считать предварительными, но весьма необходимыми для совершенствования приемов и способов не только для оплодотворения in vitro, но и для разработки условий инкубации эмбрионов. Причем, как показали результаты, наиболее высокий отход икры происходит на ранних стадиях развития. Потомство осетровых видов рыб, полученное с использованием криоконсервированной спермы, по рыбоводно-биолошческим показателям не отличается от такового, полученного

традиционным способом, за исключением нескольких худших показателей на ранних стадиях зародышевого развития (Савушкина С.И., 1999).

Большое значение для достижения максимального оплодотворения икры криоконсервированной спермой имеет инициирование подвижности сперматозоидов после размораживания. Испытание различных активаторов, составленных на основе буферных растворов с разными значениями рН и водных растворов солей, Сахаров, фитогормона эпина, АТФ, аминокислот позволило определить оптимальные стимуляторы движения спермиев для каждого вида рыб.

Из всех веществ положительный эффект на дефростированные спермин русского осетра оказали метилтестостерон и раствор эпина 10"6 мг/л. Под влиянием метилтестостерона время поступательного движения дефростированных спермиев было значительно выше, чем до криоконсервации. Процент подвижных спермиев с нуля поднялся до 6,33%. Раствор эпина 10"6 активировал около 5% спермиев. Клетки начинали активные колебательные движения спустя 2,12 мин после воздействия стимулятора. При использовании раствора эпина 10"4 слабые колебательные движения были зарегистрированы у единичных клеток.

Полученные данные по воздействию различных стимуляторов на спермин русского осетра представлены в таблице 1.

Таблица 1

Влияние растворов стимуляторов на двигательную активность дефростированных спермиев русского осетра

Процент подвижных Время подвижности (мин)

М±т п 6 СУ% М±ш п 8 СУ%

Раствор эпина 10"6 4.33 ± 0.67 3 1.15 26.65 3.22 ±0.15 3 0.26 7.98

Раствор Ка2С03 0,7% 2.67 ±0.33 3 0.58 21.65 3.5 ± 0.30 3 0.53 15.05

Раствор 6.33 ±0.8$ 3 1.53 24.12 5.46 ±0.32 3 0.55 10.11

метилтестостерона

Раствор селенактива 0 - - - 0 - - -

Обсуждая полученные результаты по стимуляции подвижности спермиев белорыбицы после их хранения в жидком азоте, существенное значение оказало внесение питательных веществ. Использование сыворотки эмбриональной телячьей для активации подвижности дефростированных спермиев белорыбицы позволило повысить процент подвижных спермиев с нуля до 3,67%. Время подвижности составило пять минут, что близко к показателям нативной семенной жидкости. Составление питательных сред носит исследовательский характер из-за

недостатка фактических данных по механизму криоповреждений (Котляров Г.Ю. с соавт., 2004; Шишова Н.В. с соавт., 2004).

Сравнительные данные по активности спермиев белорыбицы после воздействия стимуляторов приведены в таблице 2.

Таблица 2

Влияние различных по составу растворов стимуляторов на двигательную активность спермиев белорыбицы после дефростации

Экспериментальные условия Процент подвижных I Время подвижности (мин)

М±т и 5 СУ % М±т п 5 СУ%

Распор эпина 10"° мг/л 3.5 ±1.19 4 2.38 68. 01 6.25 ± 4.62 4 9.2 148.02

Раствор эпина ДО* мг/л 0 - - - 0 - - -

Раствор ЫагСОз 0,7% 2.66 ± 1.45 4 2.52 93. 37 3.67 ± 2.73 4 4.73 128.88

Сыворотаа эмбриональна! телячья 3.67 ±0.67 4 1.15 31. 49 5 ± 0.58 4 1 20

Раствор метилтестостерона 0 - - - 0 - - -

Распор селеыаюгава 0 - - - 0 - - -

Таким образом, комплексное использование различных способов стимуляции подвижности в целом сводятся к процессам репарации структурных элементов, ренатурации белковых соединений и восполнению питательных веществ, необходимых для обмена веществ в процессе жизнедеятельности клеток.

На основе проведенных исследований была разработана база данных «Морфологические нарушения спермиев рыб при различных условиях замораживания» и получено свидетельство об ее государственной регистрации (№ 2008620286). База данных предназначена для систематизации и хранения информации о цитологических особенностях спермиев различных видов рыб, а также о морфологических изменениях половых клеток в зависимости от условий замораживания. В ней содержится несколько сотен фотографий с подробным описанием особенностей строения спермиев, характера и длительности подвижности, изменений в структуре клеток, а также условий их замораживания и хранения.

В доступной нам литературе нет аналогичных сведений по морфологическому описанию спермиев рыб до и после замораживания клеток. Полученные нами данные по подвижности и морфологическому описанию спермиев после их замораживания служат одним из надежных критериев, с помощью которого возможно проводить целенаправленные

исследования на важном участке разработки оптимальных условий криоконсервации генетического материала.

ВЫВОДЫ

1. Цитофизиологические особенности спермиев изученных видов рыб заключаются в различных размерах и форме головной части клеток, а также продолжительности их поступательного и колебательного движения. Так, спермии осетровых видов рыб и белорыбицы имеют значительно большие размеры головной и хвостовой частей, время их подвижности более продолжительно, в отличие от спермиев карповых видов рыб и речного окуня, имеющих меленькие головные и короткие хвостовые части, что определяет их различную криоустойчивость.

2. Для оценки качества нативных и дефростированных спермиев рыб необходимо учитывать комплекс показателей, таких как их морфологическая целостность, физиологическая активность и оплодотворяющая способность. Разработанная электронная база данных «Морфологические нарушения спермиев рыб при различных условиях замораживания» отражает изменения данных показателей в зависимости от состава криозащитной среды, условий замораживания, хранения и размораживания биоматериала.

3. Анализ морфофункционального состояния спермиев изученных видов рыб после криоконсервации семенной жидкости показал, что применение стандартных криозащитных сред приводит к смещению изоосмотичности плазмы, что и является основной причиной утраты подвижности клеток и сопровождается в различной степени мофологическими нарушениями головной и особенно хвостовой части спермиев. Использование модифицированной криозащитной среды, в состав которой входят диметилсульфоксид, глицерин и гепарин, позволяет заметно снизить степень нарушений спермиев.

4. Замораживание и хранение семенной жидкости рыб при температуре минус 22 градуса по Цельсию по морфофункциональному состоянию спермиев не уступает технике криоконсервации в жидком азоте при температуре минус 196 градусов по Цельсию, и служит приемлемым и доступным способом сохранения генетического материала ценных видов рыб.

5. Одним из способов повышения подвижности и оплодотворяющей способности дефростированных спермиев рыб является использование стимуляторов различной природы. Наиболее эффективными для спермиев осетровых видов рыб и белорыбицы оказались растворы на основе препаратов «Эпин», «Метилтестостерон», также питательные среды.

6. Дефростированная семенная жидкость после различных сроков хранения при низкой (-22°С) и сверхнизкой (-196°С) температуре в криозащитных средах стандартного и модифицированного состава может быть использована для оплодотворения яйцеклеток рыб. Низкая оплодотворяемость икры севрюги и речного окуня при использовании дефростированной семенной жидкости указывает на необходимость внести изменения в традиционную биотехнику искусственного осеменения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. На основании полученных результатов по качеству дефростированных спермиев разных видов рыб и их оплодотворяющей способности, в практике искусственного осеменения промысловых видов рыб рекомендуем увеличить объем семенной жидкости, время оплодотворения, а также испытать процесс осеменения при различных вариантах обесклеивания икры.

2. В процессе искусственного осеменения яйцеклеток рыб целесообразно применение активирующих растворов для оттаивания криоконсервированной спермы и осеменения ею икры. Активизирующие растворы, возможно, использовать и при работе с нативной семенной жидкостью, в связи с понижением жизнеспособности спермы и оплодотворяемости икры.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Акимочкина Т.И. Оплодотворяемость икры белорыбицы после криоконсервации репродуктивных клеток в условиях сверхнизкой температуры. / Г.В. Земков, М.А. Егоров, А.М. Тихомиров, Т.И. Акимочкина // Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря: материалы 8 Международной научной конференции. 11-12 октября 2005 г. / отв. ред. В.Н. Пилипенко. -Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», 2005. -С. 88-89.

2. Акимочкина Т.И. Альтернативные хладоагенты для реализации методов криосохранения репродуктивных клеток ценных видов животных. / Т.И. Акимочкина // Естественные науки. - № 3-4 (1617). - Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», 2006. - С. 26-29.

3. Акимочкина Т.И. Микроскопический анализ дефектов репродуктивных клеток русского осетра после хранения при сверхнизкой температуре. / Г.В. Земков, Т.И. Акимочкина // Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря:

материалы 9 Международной научной конференции. 10-11 октября 2006г. / отв. ред. В.Н. Пилипенко. - Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», 2006. - С. 261-262.

4. Акимочкина Т.И. Разработка методов криосохранения генеративных клеток белорыбицы. / Т.И. Акимочкина // Доклады Московского общества испытателей природы, том 38: Биотехнология - охране окружающей среды (под ред. проф. Садчикова А.П., к.б.н. Котелевцева C.B.) - М.: Изд-во «Грификон», 2006.-С. 15.

5. Акимочкина Т.И. Особенности технологии криосохранения репродуктивных и соматических клеток осетровых и белорыбицы. / Т.И. Акимочкина // Четвертый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 12-16 марта, 2007 г.). - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2007. - С. 252.

6. Акимочкина Т.И. Перспективы изучения морфологии спермиев рыб с целью оценки их качественного состояния после хранения в условиях сверхнизкой температуры. / Т.И. Акимочкина // Ветеринарная патология. - 2007. - № 4. - С. 230-231.

7. Акимочкина Т.И. Поиск оптимальных концентраций криопротекгорных веществ при замораживании семенной жидкости рыб/ Т.И. Акимочкина // Биоресурсы, биотехнологии, экологически безопасное развитие регионов Юга России: материалы Международной конференции, 3-5 октября 2007 г. / сост.: М.А. Егоров. - Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», 2007. - С. 112-115.

8. Акимочкина Т.И. Предварительные данные по изучению способов качественной оценки спермиев быка после хранения семенной жидкости при сверхнизкой температуре. / Г.В. Земков, М.А. Егоров, Г.Ф. Журавлева, Т.И. Акимочкина // Биоресурсы, биотехнологии, экологически безопасное развитие регионов Юга России: материалы Международной конференции, 3-5 октября 2007 г. / сост.: М.А. Егоров. - Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», 2007. - С. 105-108.

9. Акимочкина Т.И. Определение сравнительной криоустойчивости спермиев в зависимости от видовой принадлежности рыб. / Т.И. Акимочкина, О.П. Попов, Г.В. Земков // Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных // Материалы международной научно-практической конференции. - Дубровицы: ВНИИЖ, 2007. -С. 127-128.

Ю.Акимочкина Т.И. Исследование генетического материала криохранилшца, цитоморфологический анализ образцов из криоколлекции, содержащейся более полугода. / М.А. Егоров, В.И.

Ершова, Г.В. Земков, Т.И. Акимочкина // СПб.: ВНТИЦ, 2007. - 16 с. - № ГР 01200609511. - Инв. № 022007 04565.

11. Акимочкина Т.Н. Исследование генетического материала сельскохозяйственных животных для нужд криохранилища. / М.А. Егоров, В.И. Ершова, Г.В. Земков, Т.И. Акимочкина // СПб.: ВНТИЦ, 2007. - 17 с. - № ГР 01200609511. - Инв. № 022007 04567.

12.Акимочкина Т.И. Исследование криопротекгорных свойств различных химических соединений, используемых для замораживания и хранения клеток биообъектов. / М.А. Егоров, В .И. Ершова, Г.В. Земков, Т.И. Акимочкина// СПб.: ВНТИЦ, 2007. - 70 с. - № ГР 01200609511. - Инв. № 022007 04162.

13. Акимочкина Т.И. Морфологический анализ генетического материала. Эксперименты по дефростации и отработки режимов заморозки половых клеток осетровых рыб. / М.А. Егоров, В.И. Ершова, Г.В. Земков, Т.И. Акимочкина // СПб.: ВНТИЦ, 2007. - 20 с. - № ГР 01200609511. - Инв. № 022007 04563.

14.Акимочкина Т.И. Проведение биотехнологических исследований, сбор качественного генетического материала. Контроль развития рыбоводной продукции (эмбрионов, личинок, молоди) на каждом из технологических этапов. / М.А. Егоров, В.И. Ершова, Г.В. Земков, Т.И. Акимочкина // СПб.: ВНТИЦ, 2007. - 18 с. - № ГР 01200609511. - Инв. № 022007 04564.

15.Акимочкина Т.И. Проведение экспериментов по корректировке оптимальных значений компонентов - составных частей криопротекгоров. / М.А. Егоров, В.И. Ершова, Г.В. Земков, Т.И. Акимочкина // СПб.: ВНТИЦ, 2007. - 15 с. - № ГР 01200609511. -Инв. №022007 04566.

16.Акимочкина Т.И. Цитологический анализ генетического материала осетровых видов рыб. Характеристика выживаемости полученного потомства. / М.А. Егоров, В.И. Ершова, Г.В. Земков, Т.И. Акимочкина // СПб.: ВНТИЦ, 2007. - 20 с. - № ГР 01200609511. -Инв. № 022007 04562.

17.Акимочкина Т.И. Экспериментальный подбор криопротекгоров. Пополнение криохранилища генетическим материалом от качественных производителей белорыбицы. / М.А. Егоров, В.И. Ершова, Г.В. Земков, Т.И. Акимочкина // СПб.: ВНТИЦ, 2007. - 16 с. - № ГР 01200609511. - Инв. № 022007 04561.

18.Акимочкина Т.И. Цитоморфологические изменения спермиев после хранения их при низкой температуре. / Т.И. Акимочкина // Международная конференция "Генетика, селекция, гибридизация, племенное дело и воспроизводство рыб". - СПб. -2008. - С. 30.

19.Akimochkina T.I. The Cryoconservation Features of the Target Fish Species' Generative Cells. / T.I. Akimochkina // Biotechnology: State of

the Art and Prospects for Development. - N.Y.: Nova Science Publishers, 2008. - pp. 1-4.

20.Акимочкина Т.И. Криоконсервация эксплантов гонад рыб и их последующее культивирование как один из способов сохранения генофонда. / Т.И. Акимочкина, Д.А. Шигаев // Пятый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 16-20 марта 2009 г.). - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2009. -С. 193-194.

21.Акимочкина Т.И. Сравнительные данные количественного содержания углеводородов в природных водах дельты реки Волги и семенной жидкости русского осетра. / Г.В. Земков, Т.И. Акимочкина, О.Н. Рылина // Экология биосистем: проблемы изучения, индикации и прогнозирования: материалы II Международной научно-практической конференции (г. Астрахань, 25-30 августа 2009 г) / сост.: В.Н. Пилипенко, С.Р. Кособокова. -Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», 2009. -С. 146-148.

22.Акимочкина Т.И. Цитоморфологические и функциональные изменения спермиев русского осетра (ACIPENSER GULDENSHTADTI В.) после криоконсервации. / Г.В. Земков, Т.И. Акимочкина // Цитология. - 2009. - Т. 51. - № 11. - С. 945-952.

Подписано к печати ...05.2010 Заказ № 2177. Тираж 100 экз. Уч.-изд. л. 1,4. Усл. печ. л. 1,3

Оттиражировано в Издательском доме «Астраханский университет» 414056, г. Астрахань, ул. Татищева, 20 Тел. (8512) 48-53-47 (отдел маркетинга), 48-53-45 (магазин); тел. 48-53-44, тел./факс (8512) 4853-46 Е-таЛ: asupress@yandex.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Акимочкина, Татьяна Ивановна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. РЕТРОСПЕКТИВНЫЙ АНАЛИЗ НАУЧНОЙ ИНФОРМАЦИИ ПО ПРОБЛЕМЕ КРИОКОНСЕРВАЦИИ РЕПРОДУКТИВНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ.

1.1. Проблема сохранения генофонда исчезающих диких животных и растений и пути ее решения.

1.1.1. Способы сохранения генофонда диких и домашних животных.

1.1.2. Перспективы использования сверхнизких температур для сохранения генофонда растительного и животного мира.

1.2. Достижения в области криобиологии.

1.2.1. Основные явления, происходящие при охлаждении воды и биологических объектов.

1.2.2. Причины устойчивости и повреждаемости живых систем при криоконсервации.

1.2.3. Особенности защитного действия некоторых криопротекторных веществ на биологические объекты в процессе их криоконсервации.

1.2.4. Методы оценки качества половых клеток животных после хранения их в условиях низких температур.

1.3. Особенности воздействия низких температур на спермии хладнокровных животных.

1.3.1. Опыт криоконсервации семенной жидкости лососевых видов рыб.

1.3.2. Особенности криоконсервации семенной жидкости осетровых видов рыб.

1.3.3. Особенности криоконсервации спермы карповых видов рыб.

ГЛАВА И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объем и структура проведенных исследований.

2.2. Методы цитофизиологического анализа качества половых клеток до и после замораживания при низкой и сверхнизкой температуре.

2.3. Способы приготовления криопротекторной искусственной среды для замораживания семенной жидкости рыб.

2.4. Способы дефростации и повышения подвижности спермиев рыб после низкотемпературного хранения семенной жидкости.

2.5. Метод осеменения икры дефростированной семенной жидкостью.

2.6. Статистические методы исследования.

ГЛАВА III. МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СПЕРМИЕВ РЫБ ДО И ПОСЛЕ КРИОКОНСЕРВАЦИИ.

3.1. Цитологические и функциональные особенности спермиев ценных видов рыб Волго-Каспийского бассейна.

3.2. Зависимость криоустойчивости клеток от состава криопротекторной среды.

3.2.7. Морфофункциональная характеристика дефростированных спермиев осетровых видов рыб.

3.2.2. Изменение качества спермиев карповых видов рыб после дефростации семенной эюидкости.

3.2.3. Криоустойчивостъ спермиев белорыбицы в зависимости от состава криопротекторной среды.

3.2.4. Качественная характеристика дефростированных спермиев окуня.

3.3. Зависимость криоустойчивости клеток от скорости замораживания и условий хранения криоконсервированной семенной жидкости.

3.4. Оплодотворяющая способность дефростированных спермиев разных видов рыб.

3.4.1. Оплодотворяющая способность спермиев севрюги после дефростации.

3.4.2. Результаты оплодотворения икры семенной жидкостью окуня, после их предварительного криоконсервирования.

ГЛАВА IV. СПОСОБЫ СТИМУЛЯЦИИ ПОДВИЖНОСТИ СПЕРМИЕВ ПОСЛЕ ДЕФРОСТАЦИИ СЕМЕННОЙ ЖИДКОСТИ.

4.1. Влияние температурного режима размораживания семенной жидкости на подвижность спермиев.

4.2. Влияние компонентов различной природы как возможных стимуляторов подвижности спермиев.

ГЛАВА V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Цитологические особенности спермиев ценных видов рыб Волго-Каспийского бассейна и их изменение в зависимости от условий криоконсервации"

Актуальность проблемы

Постоянно растущее загрязнение окружающей природной среды, нерациональное использование биоресурсов, разработка новых источников полезных ископаемых, урбанизация и другие компоненты техногенной среды губительно сказываются на живых организмах, лишая их убежища, условий размножения, кормовых ресурсов т.д., что в итоге привело и продолжает негативно сказываться на численности ценных и редких видов животного и растительного царства (Васильева JI.M. с соавт., 1993; Державин А.Н., 1947; Кожин Н.И., 1953; Патин С.А., 1979).

Южный регион Волго-Каспийского бассейна продолжает развиваться в направлении расширения техногенной среды. В северной части Астраханской области (пос. Аксарайск) функционирует газоперерабатывающий комплекс, влияние которого, по крайней мере, на близлежащую от него территорию, известно. В настоящее время осуществляется нефтебуровая добыча углеводородов непосредственно в Каспийском море. Имеются опубликованные данные о превышении сульфатных соединений в почве и воде (Орлова О.В. с соавт., 2006). Уже на этапе нефтеразведки, на Каспии насчитывалось несколько ценных видов рыб, занесенных в Красную книгу (Бердичевский JI.C., 1980; Иванов В.П., 2000; Красиков Е.В., 1997).

Существующее положение вещей приводит к необходимости принятия срочных мер для сохранения существующих видов растений и животных во всем их генетическом многообразии. Из существующих в настоящее время способов сохранения генофонда наиболее перспективным в сложившихся условиях является долговременная криоконсервация генетического материала, с последующей возможностью его реализации для получения полноценных особей, как резерва восстановления численности (Вепринцев Б.Н. с соавт., 1984, 1989; Карнаухов В.Н., 1994; Багиров В.А. с соавт., 2004; Грищенко В.И. с соавт., 2004).

Сохранение генетических ресурсов редких, исчезающих и уникальных видов животных имеет значительную научную, информационную, экономическую и медицинскую ценность. Генетический материал, сохраняемый в криобанке, может быть использован для обмена им между популяциями, разводимыми в неволе, а также для обогащения резерва наследственной изменчивости свободно живущих популяций, находящихся под угрозой исчезновения в виду их малой численности. Кроме того, сохранение половых продуктов может найти широкое применение в селекционно-племенной работе, при этом появляется возможность избежать ипбредной депрессии, упрощаются получение промышленных гибридов.

В настоящее время удается замораживать и хранить в жидком азоте, при температуре -196° половые клетки, гонады, многие соматические клетки ранних зародышей и ряд органов животных, а также семена, пыльцу и меристему растений. Однако, как показали исследования, эта технология должна разрабатываться специально применительно к каждому виду и объекту. Одна из наиболее разработанных отраслей криобиологии - глубокое замораживание сперматозоидов. Это связано как с биологическими особенностями спермиев, делающими их наиболее подходящим объектом для замораживания, так и с большим практическим значением этих работ. Сперматозоиды обладают уникальными морфологическими, биохимическими и физиологическими характеристиками, резко отличающими их от остальных клеток. Разработка методов оценки качества семени животных в настоящее время чрезвычайно актуальна. Знание цитологических и функциональных особенностей спермиев даст возможность прогнозировать изменение их качества под действием различных факторов.

Аиализ научной информации по проблеме криоконсервации репродуктивных клеток животных показал, что исследования осуществляются в двух направлениях: разрабатывается состав искусственной криозащитной среды для спермиев, обеспечивающий защиту клеток от механического повреждения при замораживании; второе направление связано с реактивацией подвижности спермиев после дефростации семенной жидкости.

Несмотря на большой объем научной информации по криоконсервации семенной жидкости животных, в опубликованных работах, как правило, нет данных для сравнения эффективности криозащитных сред, различающихся между собой по составу. Одним из важных предметов исследований продолжает оставаться вопрос унификации методов по расчету качественного и количественного состава криозащитной среды

К настоящему времени накоплен обширный материал по криосохранению семенной жидкости различных пород сельскохозяйственных животных и различных диких видов млекопитающих (Курбатов А.Д. с соавт., 1988; Дьяконов Л.П. с соавт., 2004; Айбазов В.М. с соавт., 2004; Максудов Г.Ю., 2004; Жильцов Н.З. с соавт., 2007). Известно, что криоустойчивость спермиев сельскохозяйственных животных превышает таковую у рыб. Для теплокровных животных, в отличие от рыб, разработаны разнообразные методы оценки качества половых клеток как до, так и после хранения их в криосреде (Максудов Г.Ю. с соавт., 1987). Изучению цитологических особенностей спермиев сельскохозяйственных животных посвящены многочисленные работы ряда авторов (Ойвадис Р.Н., 1980, 1985; Ойвадис Р.Н. с соавт., 1984; Соколовская И. с соавт., 1981; Буров В. А. с соавт., 1985; Наук В.А., 1991; Осташко Ф.И., 1978). Работы по цитологическим особенностям спермиев рыб немногочисленны и посвящены преимущественно особенностям строения сперматозоидов осетровых видов, как наиболее важных объектов аквакультуры (Гинзбург А.С. с соавт., 1975; Детлаф Т.А. с соавт., 1981). Имеются немногочисленные опубликованные данные по химическому составу семенной жидкости и спермиев карповых видов рыб (Жукинский В.Н. с соавт., 1988).

Что касается морфологических изменений спермиев животных под влиянием низких и сверхнизких температур, и особенно в зависимости от состава криозащитных сред, то в научной литературе сведений нет. Кроме того, отсутствуют публикации, отражающие перечень криоповреждений клеток рыб на различном уровне организации. Именно цитоморфологический анализ служит вполне доступным для оценки качества спермиев на этапе разработки криопротекторных смесей, что и было положено в основу настоящей исследовательской работы.

Цель исследования

Изучить цитологические особенности спермиев некоторых ценных видов рыб Волго-Каспийского бассейна (осетровых, карповых, белорыбицы, окуня) и их изменение в зависимости от состава криозащитной среды, условий замораживания, хранения и размораживания биоматериала.

Задачи исследования:

1. Изучить цитологические и функциональные особенности спермиев разных видов рыб в нативном состоянии.

2. Изучить морфофункциональные особенности сохранения спермиев рыб после воздействия низких температур в зависимости от состава искусственных криопротекторных сред, температуры и других условий замораживания и хранения биоматериала.

4. Разработать морфологические критерии оценки качества половых клеток после размораживания и разработать базу данных морфологических нарушений спермиев рыб в зависимости от состава криопротектора, условий замораживания, хранения и размораживания биоматериала.

5. Разработать способы повышения подвижности и оплодотворяющей способности спермиев рыб после дефростации семенной жидкости

Научная новизна исследования

Разработана матрица степени морфофункциональных нарушений спермиев рыб в зависимости от различного состава стандартных криопротекторных сред и их модификаций, а также разработаны и апробированы оригинальные составы криозащитных сред, удовлетворяющих сохранению основных морфофункциональных показателей спермиев после криоконсервации.

На основании проведенных опытов по оценке оплодотворяющей способности дефростированной семенной жидкости зарегистрировано оплодотворение яйцеклеток, что указывает на необходимость дальнейших коррективных изменений в традиционную биотехнику искусственного воспроизводства рыб.

Научно-практическая значимость

Работа представляет цитологическую, функциональную характеристику половых клеток рыб в норме и на фоне низкотемпературного воздействия. Полученные данные позволяют выявить цитологические особенности строения спермиев в зависимости от ряда условий криоконсервации, а именно от состава криопротекторной среды, способа замораживания, температурных условий хранения и дефростации биоматериала.

Практическая значимость работы заключается в том, что она позволяет расширить существующие представления о механизмах и характере повреждения половых клеток в результате воздействия низких и сверхнизких температур, что рекомендуется использовать в качестве тест-критерия качественного состояния спермиев после хранения их в замороженном виде в условиях криобанка.

Положения, выносимые на защиту

Апробация работы

Результаты работы доложены и обсуждены на VIII Международной научной конференции «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря» (Астрахань, 2005); на студенческой конференции Астраханского государственного университета (Астрахань, 2006); на IX Международной научной конференции «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря» (Астрахань, 2006); в докладах Московского общества испытателей природы «Биотехнология - охране окружающей среды (Москва, 2006); на Международной научной студенческой конференции «Научный потенциал студенчества -будущему России» (Ставрополь, 2007); на Четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007); на Международной конференции «Биоресурсы, биотехнологии, экологически безопасное развитие регионов Юга России» (Сочи, 2007); на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных» (Дубровицы, 2007); на Международном конгрессе молодых ученых, студентов и аспирантов «Перспектива - 2007» (п. Эльбрус, 2007); на Международной конференции «Генетика, селекция, гибридизация, племенное дело и воспроизводство рыб» (Санкт-Петербург, 2008); на II Международной научно-практической конференции «Экология биосистем: проблемы изучения, индикации и прогнозирования» (Астрахань, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 22 работы, из них 3 в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, изложения и обсуждения результатов собственных исследований, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Акимочкина, Татьяна Ивановна

121 ВЫВОДЫ

5. Одним из способов повышения подвижности и оплодотворяющей способности дефростированных > спермиев рыб является использование стимуляторов различной природы. Наиболее эффективными для спермиев осетровых видов рыб и белорыбицы оказались растворы на основе препаратов «Эпин», «Метилтестостерон», также питательные среды.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. На основании полученных результатов по качеству дефростированных спермиев разных видов рыб и их оплодотворяющей способности, в практике искусственного осеменения промысловых видов рыб рекомендуем увеличить объем семенной жидкости, время оплодотворения, а также испытать процесс оплодотворения при различных вариантах обесклеивания икры.

2. В процессе искусственного осеменения яйцеклеток рыб целесообразно применение активирующих растворов для оттаивания криоконсервированной спермы и осеменения ею икры. Активизирующие растворы возможно использовать и при работе с нативной семенной жидкостью, в связи с понижением жизнеспособности спермы и оплодотворяемости икры

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Акимочкина, Татьяна Ивановна, Астрахань

1. Айбазов В.М., Трубникова П.В. Замораживание и использование спермы баранов производителей (рекомендации). РАСН. ГНУСНИИ ЖК. Ставрополь. - 2004. - 70 с.

2. Акимочкина Т.И. Альтернативные хладоагенты для реализации методов криосохранения репродуктивных клеток ценных видов животных // Естественные науки. № 3-4 (16-17). - Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», 2006. - С. 26-29.

3. Акимочкина Т.И. Перспективы изучения морфологии спермиев рыб с целью оценки их качественного состояния после хранения в условиях сверхнизкой температуры // Ветеринарная патология. 2007 а. - № 4. -С. 230-231.

4. Ананьев В.И. Концепция сохранения и устойчивого использования биоразнообразия с применением методов криоконсервации геномов гидробионтов // Рыбное хозяйство. Сер. Аквакультура: Информпакет / ВНИЭРХ. 1997. - Вып. 1. - С. 1 - 36.

5. Ананьев В.И., Андреев А.А., Голованова Т.С., Петропавлов Н.Н., Цветкова Л.И. Опыт криоконсервации спермы белорыбицы и белуги,

6. Рыбное хозяйство. Сер. Аквакультура. М., 1998 а. - Вып. 1. - С. 25 -32.

7. Ананьев В.И., Цветкова Л.И., Манохина М.С., Рыжков Л.П., Докина С.Б. Проблемы сохранения геномов лососевых и осетровых рыб. Рыбное хозяйство. Сер. Аквакультура. М., 1998 Ь. - Вып. 1. - С. 2-24.

8. Андреев А.А., Садикова Д.Г. Сохранение спермиев осетровых рыб методами криоконсервации. Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных // Материалы международной научно-практической конференции. Дубровицы: ВНИИЖ, 2007. - С. 136-137.

9. Баглай Е.Б. Формирование представлений о причинах индивидуального развития. М., Наука.- 1979. - 152с.

10. Бахметьев П. И. Итог моих исследований об анабиозе насекомых и план его исследования у теплокровных животных. Изв. АН СССР, Т. 27,№4, 1902.-С. 161-166.

11. Бахметьев П. И. Как я нашел анабиоз у млекопитающих. Природа, № 1, 1912.-С. 606-622.

12. Белоус А. М., Шраго М. И., Пушкарь Н. С. Криоконсерванты.— Киев : Наук, думка, 1979. 198 с.

13. Бех В.В. Криоконсервация спермы карпов украинских пород./ Материалы международной конференции «Сохранение генетических ресурсов». Ж. «Цитология», Т. 46, №9, 2004. - С. 769.

14. Биохимия мембран: Учеб. пособие для биол. и мед. спец. вузов / Под ред. А.А. Болдырева. Кн. 3. A.M. Белоус, Е.М. Гордиенко, Л.Ф. Розанов. Замораживание и криопротекция. М.: Высш. шк., 1987. - 80 с.

15. Борисов В.М. Многофакторная регрессионная модель оплодотворяющей способности спермы быков-производителей. Сб. науч. тр. Гродненского с.-х. ин-та, вып. 20, 1974. - С. 3-7.

16. Бурков И. А, Иммунные реакции в репродуктивных органах самки в связи с осеменением. Вести, с.-х. науки, 1985, № 1, с. 128-133.

17. Буров В. А., Корякина JI. В. Экспресс-метод определения выживаемости семени быков. Животноводство, № 7, 1985. - С. 43-44.

18. Васильева JI.M., Попова О.В., Хорошко В.И. Состояние загрязнения водной среды, донных отложений и гидробионтов в Волго-Каспийском районе // Биологические ресурсы Каспийского моря. Астрахань. -1993.-С. 43-46.

19. Вепринцев Б.Н., Пилиев С.А. Сохранить генофонд рыб и водных беспозвоночных. Рыбное хозяйство, 1989, № 6. С. 29-32.

20. Вепринцев Б.Н., Ротт Н.Н. Консервация генетических ресурсов: Программа исследований // Консервация генетических ресурсов. -Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 1990. С. 18-35.

21. Вепринцев Б.Н., Ротт Н.Н. О возможности восстановления исчезающих видов животных из их консервированных геномов. Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1978. - 15 с.

22. Вепринцев Б.Н., Ротт Н.Н. Предпосылки к созданию программы исследований // Консервация генетических ресурсов. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 1980.-С. 18.

23. Вепринцев Б.Н., Ротт Н.Н. Проблема сохранения генофонда. Сер. Консервация генетических ресурсов. Пущино, 1984. - 48 с.

24. Витвицкая JI.B. Эффективность использования биологически активных веществ в искусственном воспроизводстве русского осетра // Вестник АГТУ. № 2. Астрахань, 1996 Ъ. С. 71-74.

25. Витвицкая JI.B., Егоров М.А., Абтахи Б. Исследование последствий обработки икры осетровых рыб биологически активными веществами // Вестник АГТУ. Астрахань, 1997. С. 29-34.

26. Вольфензон JI. Г. Влияние низких температур на клетки рыхлой соединительной ткани кролика. 1. Изменение размеров фибробластов и гистиоцитов. В сб.: Реакция клеток на экстремальные воздействия. -М.-Л., 1963а.-С. 66-74.

27. Вольфензон Л. Г. Влияние низких температур на клетки рыхлой соединительной ткани кролика. 2. Витальное окрашивание фибробластов и гистиоцитов. В сб.: Реакция клеток на экстремальные воздействия М.-Л., 19636. - С. 75-79.

28. Гинзбург А.С., Детлаф Т.А. Осетр Acipenser guldenshtadti. В кн.: Объекты биологии развития. М.: Наука, 1975. С. 217-260.

29. Гинзбург А.С., Детлаф Т.А. Развитие осетровых рыб: созревание яиц, оплодотворение и эмбриогенез. Москва, 1969. 134 с.

30. Голдовский A.M. Анабиоз и его практическое значение. JL: Наука, 1986.- 169с.

31. ГОСТ 209.09 3-75-6-75. Сперма быков неразбавленная. Методы испытаний.

32. ГОСТ 236.81.79. Сперма жеребцов неразбавленная свежеполученная. Методы испытаний.

33. Грищенко В.И., Копейка Е.Ф., Петрушко М.П. Проблемы криобиологии и сохранение генетических ресурсов. / Материалы международной конференции «Сохранение генетических ресурсов».-Ж. «Цитология», Т.46, №9, 2004. С. 784.

34. Деревинский Б., Фоломеев В. Связь качества спермы с активностью аминотрансфераз. Свиноводство, 1975, №7.- С. 24-25.

35. Державин А.Н. Воспроизводство запасов осетровых рыб. Баку, 1947. -256 с.

36. Детлаф Т.А., Гинзбург А.С., Шмальгаузен О.И. Развитие осетровых рыб: созревание яиц, оплодотворение, развитие зародышей и предличинок. М.: Наука, 1981. 224 с.

37. Егоров М.А. О создании Международного криобанка генофонда флоры и фауны Каспийского бассейна. Материалы международной конференции «Сохранение генетических ресурсов».- Ж. «Цитология», Т.46, №9, 2004. С. 791-792.

38. Егоров М.А. Сперма осетровых как тест-объект для экспресс-оценки активности биостимуляторов // Тезисы докладов I Международной научной конференции Ассоциации Прикаспийских государств. Астрахань, 1998. С. 135-136.

39. Егоров М.А., Витвицкая JI.B. Использование биологически активных веществ в искусственном воспроизводстве осетровых Волго-Каспийского региона. Астрахань, 2002. 165 с.

40. Егоров М.А., Ершова В.И., Земков Г. В., Акимочкина Т.И. Проведение экспериментов по корректировке оптимальных значений компонентов составных частей криопротекторов. СПб.: ВНТИЦ, 2007. - 15 с. - № ГР 01200609511. -Инв. № 022007 04566.

41. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии: Учеб. пособие для высш. пед. учеб. заведений / М.: Издательский центр «Академия», 2003.- 208 с.

42. Желтоножко О.В. Криоконсервация и создание низкотемпературного банка спермы лососей Дальнего Востока // Автореф. дисс.,. канд. биол. наук: 03.00.10. Лесные Поляны, Моск. обл., 1997. - 24 с.

43. Жильцов Н.З., Голубь B.C. Метод глубокого замораживания семени мужчин. Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных // Материалы международной научно-практической конференции. -Дубровицы: ВНИИЖ, 2007. С. 137-140.

44. Жуков Е. К. О температурном парабиозе нерва в связи с колориметрическими изменениями парабиотической области. Тр. Лен. общ. естествоиспыт., 1935, Т. 64, № 3. С. 407-428.

45. Зверева Г. В., Чухрий Б. Н., Клевец Л. А. Взаимосвязь активности окислительных ферментов в сперме быков с физиологическими показателями спермиев. Докл. ВАСХНИЛ, 1978, N 4. - С. 24-26.

46. Земков Г.В., Акимочкина Т.И. Цитоморфологические и функциональные изменения спермиев русского осетра (ACIPENSER GULDENSHTADTI В.) после криоконсервации // Цитология. 2009, Т. 51, № 11. - С. 945-952.

47. Зинченко А.В., Зинченко В.Д., Копейка Е.Ф., Онищенко Е.В. О возможных факторах повреждения биологических объектов и их ДНК при криоконсервации. / Материалы международной конференции

48. Сохранение генетических ресурсов».- Ж. «Цитология», Т.46, №9, 2004. С. 796.

49. Иванов В.П. Биологические ресурсы Каспийского моря. Астрахань. -2000. - 196 с.

50. Иванова Н.Т. Атлас клеток крови рыб (сравнительная морфология и классификация форменных элементов крови рыб). М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982.- 184 с.

51. Ильинская Т., Антонюк В., Безлюдников Л., Жуковская Л. Воспроизводительная способность хряков и холодостойкость их спермы. Свиноводство, 1975, № 1. - С. 24-26.

52. Карнаухов В.Н. Проблемы и перспективы создания генетических криобанков для целей сохранения биоразнообразия. Биофизика живой клетки. Т. 6., 1994. С. 1-6.

53. Кислюк И.М. Морфологические и функциональные изменения хлоропластов при охлаждении листьев Cucumis sativus L. В кн.: Клетка и температура среды. М.-Л. (Тр. Межд. симп. по цитоэкологии, Л., 1963 г.), 1964. - С. 47-49.

54. Кожин Н.И. Итоги и задачи научно-исследовательских работ по воспроизводству рыбных запасов в южных водоемах в связи с гидростроительством // Тр. Всес. конф. по вопр. рыбного хоз-ва. М.: 1953.-С. 237-253.

55. Козлов Г. А. Камера для микроскопических наблюдений биологических объектов при температурах от +100° до -50°С. Цитология, 1963, Т. 5, № 6. С. 700-704

56. Козлов Г. А., Теодорович В. И., Равдель А. А. Об образовании центров кристаллизации при замораживании крови с защитными веществами. Биофизика, 1967, Т. 12, № 3. С. 483-488.

57. Копейка Е.Ф. Замораживание спермы осетровых Азово-Черноморского бассейна // Криоконсервация репродуктивных клеток рыб и эмбрионов: Сб. научн. тр. Харьков: АН Украины, 1992. - С. 66-72.

58. Копейка Е.Ф., Новиков А.Н. Криоконсервирование спермы рыб // Криоконсервация клеточных суспензий. Под ред. А.А. Цуцаевой. -Киев: Наукова Думка, 1983. С. 204-215.

59. Котляров Г.Ю., Кудокоцева О.В., Гордиенко А.Д., Федец О.И. Механизмы индукции и репарации нелетальных криоповреждений. «Сохранение генетических ресурсов». Матер, междун. конф. С.-П., 12-22 октября 2004г. - Ж. «Цитология». Т.46, № 9-10, 2004. - С. 879.

60. Красиков Е.В. Состояние запасов каспийских осетровых (по материалам летних траловых съемок 1991 и 1994 гг.). // Тез. докл. I Конгресса ихтиологов России, Астрахань. 1997. - М. «ВНИРО». -1997.-432 с.

61. Крепе Е.М. О путях развития эволюционной биохимии. В кн.: Руководство по физиологии. Эволюционная физиология. JL: Наука, № 1, 1979.-С. 394-426.

62. Курбатов А.Д., Платов Е.М., Корбан Н.В. Криоконсервация спермы сельскохозяйственных животных. Д.: Агропромиздат, 1988. - 255 с.

63. Кяйвяряйнен А.И. Динамическое поведение белков в водной среде и их функции. Л.: Наука, 1980. - С.270.

64. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1973. - 343 с.

65. Лозина-Лозинский Л.К., Заар Э.И. Получение бесцветных клеток Euglena gracilis кратковременным воздействием высоких и низких температур. Цитология, Т. 3, № 1, 1961. С. 103-105.

66. Лозина-Лозинский Л. К. К вопросу о способности некоторых живых систем переносить внутриклеточное образование льда.

67. В сб.: Реакция клеток и их белковых компонентов на экстремальные воздействия, М.-Я., 1966. С. 33-50.

68. Лозина-Лозинский Л. К., Наматов Т. Микроскопическое изучение замерзания нематод Rhabditis sp. и Anguina tritici при низких и сверхнизких температурах. Зоол. журн., Т. 49, № 2, 1971. С. 210-218.

69. Лозина-Лозинский Л.К. Очерки по криобиологии. Л., Наука, 1972. -288с.

70. Лозина-Лозинский Л.К. Реакция насекомых на глубокое охлаждение. В сб.: Реакция клеток на экстремальные воздействия, М.-Л., 1963а. С. 34-53.

71. Лозина-Лозинский Л. К. Устойчивость некоторых насекомых к температуре жидкого гелия (-269°) при внутриклеточном замерзании в отсутствие антифризов. Цитология, Т. 5, № 2, 19636. С. 220-221.

72. Лысцов В. Н. Криолиз ДНК. Автореф. дисс. М., 1968.

73. Мавродина Т., Нарубина Л., Тур Б.К. Низкотемпературная консервация спермы птиц. Материалы международной конференции «Сохранение генетических ресурсов».- Ж. «Цитология», Т.46, №9, 2004. С. 814-816.

74. Максимов Н. А. О вымерзании и холодостойкости растений. СПб., 1913.-330 с.

75. Максудов Г.Ю., Артюшкова В.А., Трошко Е.В. Оценка качества семени животных. Пущино, 1987. - 42 с.

76. Максудов Г.Ю. Криобанки диких видов животных России. -«Сохранение генетических ресурсов». -Матер, междун. конф. С.-П., 12 22 октября 2004. -Ж. «Цитология», Т. 46, №9-10, 2004. - С. 816-817.

77. Маэно Н. Наука о льде. М.: Мир, 1988. - С. 96-98.

78. Методическое пособие по криоконсервации спермы карпа, лососевых и осетровых рыб. М., 1997.

79. Милованов В.К. Биология воспроизведения и искусственное осеменение животных. М.: Сельхозгиз, 1962. 659 с.

80. Мороз JI. Г., Шапиев И. Ш., Корбан Н. В. Способ оценки качества спермы сельскохозяйственных животных, преимущественно хряков. Авт. свид. СССР № 938990. БИ, 1982, № 24. - С. 42.

81. Мурзамадиев А. М., Домбровский Н. Н., Джиенбаева Р. С. Капацитация сперматозоидов млекопитающих. Изв. АН КазССР, сер. биол., 1985, № 1. - С. 11-20.

82. Мушкамбаров Н. Н. Биохимия сперматогенеза. Успехи соврем, биол., 1981, т. 96, вып. 1(4).-С. 101-116.

83. Наук В.А. Структура и функция спермиев сельскохозяйственных животных при криоконсервации / отв. ред. Ф.И. Фурдуй; АН СССР Молдова, Инст-т зоологии и физиологии. Кишинев: Штиинца, 1991. -197 с.

84. Ойвадис Р.Н. Методические рекомендации по иммунологии воспроизведения. Дубровицы, 1985. 78 с.

85. Ойвадис Р.Н. Методические рекомендации по оценке качества спермы хряков при низкотемпературной консервации. Ленинград, ВНИИРГЖ, 1980.-61 с.

86. Ойвадис Р.Н., Соколовская И.И., Абилов А.И. Морфология гамет самцов сельскохозяйственных животных как критерий биологической полноценности. В кн.: Морфологические исследования в практике здравоохранения и животноводства. М.: Наука, 1984. - С. 144-148.

87. Орлова О.В., Алыков Н.М. Содержание сульфатов в воде и почвах Астраханской области. «Эколого-биологические проблемы Каспийского моря. Матер. 9-ой междун. конф. 10-11 октября 2006. -Изд. дом «Астраханский университет», 2006. - С. 66-69.

88. Осташко Ф.И. Разработка вопросов теории и практики глубокого охлаждения и длительного хранения спермы производителей. Автореф. дисс. Харьков, 1968.

89. Осташко Ф.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спермы производителей. 2-е изд. доп. и пераб. - Киев: Урожай, 1978. -255 с.

90. Патин С.А. Влияние загрязнения на биологические ресурсы и продуктивность Мирового океана. М.: Пищевая промышленность. -1979.- 189 с.

91. Персов Г.М. Учет осетроводных работ в связи с применением гипофизарных инъекций. В кн.: Метод гипофизарных инъекций и его роль в воспроизводстве рыбных запасов. Л.: Изд-во ЛГУ, 1941. С. 4250.

92. Петропавлов Н.Н., Андреев А.А., Каранова М.В. Биофизика живой клетки. Т. 6. - Пущино, 1994. - С. 62-64.

93. Плохинский Н.А. Алгоритмы биометрии // М.: МГУ, 1980. 150 с.

94. Пронина Н.Д. Оценка качества криоконсервированной спермы рыб. Материалы междун. конф. «Сохранение генетических ресурсов». Ж. «Цитология», Т. 46, № 9-10, 2004. - С.843-844

95. Пушкарь Н.С., Белоус A.M. Актуальные проблемы криобиологии. Киев: Наук.думка, 1981. 608 с.

96. Пушкарь Н. С., Шраго М. И., Белоус А. М., Калугин Ю. В. Криопротекторы.- Киев : Наук, думка, 1978. 204 с.

97. Рэ Л. Консервация жизни холодом. М.: Мир, 1962. 155 с.

98. Савушкина С.И. Воспроизводство осетровых рыб с использованием криоконсервированной спермы. Проблемы сохранения геномов рыб. Рыбное хозяйство. Сер. Аквакультура. М., Вып. 1, 1999. - С.39-42.

99. Савушкина С.И., Цветкова Л.И. Эффективность использования дефростированной спермы при воспроизводстве осетровых рыб. -Рыбное хозяйство. Сер. Аквакультура. М., Вып. 1, 1998. - С. 33-36.

100. Самыгин Г. А. Причины вымерзания растений.- М.: Наука, 1974. -191 с.

101. Соколовская И., Ойвадис Р., Абилов А. и др. О значении акросомы в оценке семени самцов. Животноводство, 1981, № 9. - С. 45-46.

102. Справочник по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных. М.: Россельхозиздат, 1983. 272 с.

103. Тихомиров A.M. Стратегия работы Нижневоложского криобанка по сохранению биоразнообразия в регионе. Материалы международной конференции «Сохранение генетических ресурсов».- Ж. «Цитология», Т.46, №9, 2004.-С. 870-871.

104. Трошина В.П. Функциональное состояние изолированных тканей при температуре, близкой к нулю. Вестн. ЛГУ, сер. биол., № 3, 1957. -С. 111-120.

105. Трошина В.П., Штурм В.А. Действие низких температур на изолированные эпителиальные ткани белой мыши и лягушки. Бюлл. эксп. биол. и мед., № 7, 1956. С. 63-66.

106. Успенский А. Определение оплодотворяющей способности глубокоохлажденной спермы быков по активности дегидрогеназ. -Молоч. и мяс. скотоводство, 1967, № 12. С. 30-31.

107. Физиология воспроизведения сельскохозяйственных животных. Харьков: НИИ животноводства лесостепи и полесья УССР, 1971.-С. 281.

108. Хебер У. Биохимические и физиологические аспекты морозоустойчивости растений. В кн.: Клетка и температура среды. (Тр. Межд. симп. по цитоэкологии, Л., 1963 г.). М. Л., 1964. - С. 23-28.

109. Цветкова Л.И. Создание низкотемпературных коллекций геномов рыб и амфибий // Консервация генетических ресурсов: Мат. раб. совещ. Пушкино, 1996. - С. 89-93.

110. Цветкова Л.И., Докина О.Б., Пронина Н.Д., Миленко В.А. Использование криоконсервированной спермы для осеменения больших партий икры сибирского осетра. Проблемы сохранения геномов рыб. Рыбное хозяйство. Сер. Аквакультура. М., 1999 г. -Вып. 1.-С. 24-29.

111. Цветкова Л.И., Каранова М.В. Криопротективный эффект низкомолекулярных и высокомолекулярных антифризныхгликопротеинов из крови трески Gadus mothua // Биофизика живой клетки. 1994. - №6. - С. 77-80.

112. Цветкова Л.И., Савушкина С.И. Методическое пособие по криоконсервации спермы карпа, лососевых и осетровых видов рыб. М.: ВНИИПРХ, 1997.- 11с.

113. Цуцаева А.А., Аграненко В.А., Федорова Л.И. и др. Криоконсервирование клеточных суспензий / Под общ. ред. Цуцаевой А.А. Киев: Наук, думка, 1983. - 240 с.

114. Шубин Н.А., Пинаев Г.И., Блинова М.И., Николаенко Н.С. К вопросу о криоконсервации клеток морских беспозвоночных. / Материалы международной конференции «Сохранение генетических ресурсов».- Ж. «Цитология», Т.46, №9, 2004. С. 889.

115. Юрченко Т.Н., Козлова В.Ф., Скорняков Б.А., Строна В.И., Репин Н.В. Влияние криопротекторов на биологические системы. Киев, Наукова Думка, 1989. 98с.

116. Яблонский В. А. Видовые особенности обмена веществ в сперме быка, барана и хряка. Автореферат. Львовский зоовет. ин-т., 1970. С. 34.

117. Alderson R., MacNeil A.J. Preliminary investigations of cryopreservation of milt of atlantic salmon (Salmo salar) and its application to commercial fanning // Aquaculture. 1984. - V. 43. - P. 351-354.

118. Anan'ev V.I. Problems of conservation and stable employment of biological diversity with the use of deep freezing methods for hydrobionts. / Froid et Aquaculture. Refrigeration and Aquaculture. Bordeaux, France. -1996.-P. 33-42.

119. Anchordoguy T.J. Insights into the cryoprotective mechanism of dimethylsulfoxide for phospholipid bilayers // Cryobiology. 1991. - V. 28. -P. 467-473.

120. Anderson R. A. Relationship between semen characteristics and fertility in electroejaculated mice. J. Repr., 1983, v. 68, p. 1-7.

121. Asahina E. 1966. Freezing and frost resistance in insects. In: Cryobiology. Ed. H. T. Meryman, L.-N. Y.: 451—486.

122. Asahina E., Shinada K, Hisada J. A state of frozen protoplasm with invisible intracellular ice crystals obtained by rapid cooling.- Exp. Cell. Res., 1970, 59, № 4, p. 349-358.

123. Baynes S.M., Scott A.P. Cryopreservation of rainbow trout spermatozoa: the influence of sperm quality, egg quality and extender composition on post-thaw fertility // Aquaculture. 1987. - V. 66, N 1. - P. 53-57.

124. Bautron P., Kaufmann A. Stability of the amorphous state in the system water-glycerol ethylene tflycol.- Ibid., 1979, 16, JM» 1, p. 83-89.

125. Billard R. Cryopreservation of rainbow trout sperm by deep freezing // Reprod. Nutr. Dev. 1980. - V. 20. - P. 1859-1868.

126. Billard R., Cosson Y., Liuhart O., Tsvetkova L. I. Motility analysis of fresh and thawed spermatozoa in Acipenser baeri.- Italy, July, 1997.

127. Blakster J. H. 1953. Sperm storage and crossfertilization of spring and autumn sprawning herring. Nature, London, 172: 1189-1190.

128. Blanchard К. S. 1940. Water, free and bound. Cold Spring Harbor. Sympos. Quant. Biol., 8:1-8.

129. Blanco A. On the functional significance of LDG-H J. Hopkins Med. I., 1980, v. 41, N2, p. 117-192.

130. Blasco L. Clinical tests of sperm fertilizing ability. Fertil. Steril.,1984, v. 41, N 2, p. 177-192.

131. Blazac W., Overstreet J., Hanson F. A competative in vitro assay of human sperm penetration into the human zona pellucida and zona-free hamster eggs using contrasting fluorescent markers. Biol. Repr.,1980, v. 22, suppl. 1, p. 45.

132. Blom E. The ultrastructure of some characteristic sperm defects and a proposal for a new classification of the bull spermatozoa. Nord. Vet. Med., 1973, v. 25, p. 383.

133. Bobichou H., Bajolle F., Andet J. Detection dactivities enzymatiques du spermatozoide human en microscopie electronique a balayage. Biol, cell, 1982, v. 44, N1, p. 25.

134. Boell E. J., Burkus J. K. Oxygen consumption and motility of mouse sperm as affected by oxidizable substrates and oxygen tension. Carlsberg Res. Comm., 1984, v. 49, N 2, p. 147-154.

135. Bower R. E., Pace M. M., Crabo B. G., Graham E. F. Effects of dilution and glicerol on the release of glutamic-oxaloacetic transaminase from boar spermatozoa. J. Anim. Sci., 19,73, v. 36, N 2, p. 319-324.

136. Cameron A. T. a. Brownlee T. 1.1913. The effect of low temperature an the frog. Proc. Roy. Soc., Canada, 7, sect. 4: 107-124.

137. Chaffield P.O., Battista A.F., Lyman G.P. a. Garcia J.P. 1948. Effects of cooling on nerve conduction in a hibernator (golden hamster) and nonhibernator (albino rat.). Amer. J. Physiol., 155, 1-3: 179-185.

138. Chandler J.E., Ruiz C.F., Adkinson R.W., Koonce K.L. Reletionship between final temperature, thaw rate and quality of bovine semen. J. Dairy sci., 1984, v. 67, N 8, p. 1806-1821.

139. Cheng San-Pao. Using DAPI-fluorescence as a radio vital stain test for the viability of the unfixed mouse sperm. Proc. 5-th World conf. Anim. Prod. (Tokyo), 1983. v. 2, p. 173-174.

140. Corteed G. M. Effects du plasma seminal sur la survie et la fertilite des spermatozoides conserves in vitro. Repr. nutr. develop., 1980, v. 20, N 4a, p. 1111-1123.

141. Cosentino M. J., Emilson L., Cockett A. Prostaglandins in semen and their relationship to male fertility: a study of 145 man. Fertil. Steril., 1984, v. 41, N1-2, p. 88-95.

142. Coulter W. H. Hight speed automatic blood cell counter and cell analizer. Proc. Nat. Elec. Conf., 1956, v. 12, p. 1034.

143. Dixit M. K., Agarwal S. Seasonal variations in sperm levels of thiroid hormones and their relation with seminal quality and libido in buffalo bulls. Theriogenology, 1984, v. 22, N 5, p. 497-502.

144. Dorsey N. E. 1948, цит. no: Meryman H. T. 1966. In: Cryobiology Ed. В. T. Meryman. London — N. Y. : 1-114

145. Dowell L. G. a. Rinfrei A. P. 1960. Low-temperature forms of ice, as studied by x-ray diffraction. Nature, 188, 4757 : 1144-1148.

146. Drokin S. I., Kopeika E. F. Motility of and Phospholipid Content in Cryopreserved Spermatozoa of Three Sturgeon Species // Sturgeon Quarterly. Oct.- 1996.- V. 4, №4.- P. 8-10.

147. Erdahl A.W., Erdahl D.A., Graham E.F. Some factors affecting the preservation of salmonid spermatozoa // Aquaculture. 1984. - V. 43. - P. 341-350.

148. Ericsson R., Buthala D. A fluorescence staining method for studing sperm membranes. Biol. Repr., 1970, v. 3, N 1, p. 8-14.

149. Evenson D. P., Darzyncewicz Z., Melamed M. K. Simultaneous measurement by flow cytometry of sperm cell viability and mitochondria I membrane potential related to cell motility. J. Histochem., Cytochem., 1982, v. 30, N 3, p. 279-280.

150. Fan-ant J. General observation on cell preservation / Low-Temperature Preservation in Medicine and Biology. Eds. M.J. Ashwood-Smite and J. Farrant. Pitman, Bath., UK. 1980. - P. 1-19.

151. Farrant J., Woolgar A. E. Cryoprotective additives and hypertonic hemolysis.- Cryobiology, 1970, 7, № 1, p. 56-60.

152. Fietta P., Spisni A., Lindler L., Masotti L. Antioxidant activity of bull semen in relation with aging. Boll. soc. ital. biol. sper., 1982, v. 58. N 17, p. 1079-1085.

153. Foster M., Smith W., Lee W. Selection of human spermatozoa according to their relative motility and their interection with zona-free hamster eggs. Fertil. Steril., 1983, v. 40, No 5-6, p. 655-660.

154. Foulkes G.A., Watson P.A. Hyaloronidase activity in seminal plasma as a method of assessing bull sperm integrity. J. Repr. Fert., 1975, v. 43, N 2, p. 394-353.

155. Fredrich F. Spermakonservierung bel Salmoniden // Z. Binnenfischerei DDR. 1984. - Bd. 31, N 1. - S. 24-31.

156. Gallant R. K., Richardson G. F., McNiven M. A. Comparison of different extenders for the cryopreservation of Atlantic salmon spermatozoa // Thermogenology.- 1993.- V. 40, №3.- P. 479-486.

157. Goodpasture J. C., Zavos P. M. Effect of various conditions of semen storage on the acrosin system of human spermatozoa. J. Repr. Fert., 1981, v. 63, N 2, p. 397-405.

158. Gorke H. 1906. Uber chemische Vorgange beim Erfrieren der Pflanzen. Land. Vers. Stat., 65: 149-160.

159. Graham E. F., Shmehl M. K. L. Some physical and chemical methods of evaluating semen. Proc. 3rd Techn. conf. Art. Ins. Repr. N. А. А. В., 1970. p. 44-49.

160. Graham E. F., Crabo B. G., Shmehl M. K- L. Utilization of enzyme assay in developing techniques for freezing semen VHIth Int. Simp, zootechn. Milan, 1973, p. 95-111.

161. Halangk W., Bohnensack R. A quick test for the simultaneous determination of intactness and concentration of spermatozoa. Actabiol. et med. Germ., 1982, v. 41, N 10, p. 899-905.

162. Halangk W., Bohnensack R. Effect of various substrates on mitochondria! and cellular energy state of intact spermatozoa. Biomed. Biochim. Acta. 1985, v. 44. N 3, p. 411-420.

163. Hammerstedt R.H. Monitoring the metabolic rate of germ cells and sperm. In: Reproduction process and contraception. N.Y., Plenum Publ. Corp., 1981, p. 353-391.

164. Harvey B. Salmon gene banking. A conservation opportunity. A review and Analysis of Salmonid gene banks for DFO // MTI Biotech. Ltd.-Internat. Fishes Gene Bank. 1996. - P. 36-52.

165. Heilbrunn L.V. 1924. The colloid chemistry protoplasm. 3. The viscosity of protoplasm at various temperatures. Amer. J. Physiol., 68, 3: 645-648.

166. Heiss R. 1933. Untersuchungen uber Kaltebedarf und aus gefroseren Wassermengen beim schnellen und beim langsamen Gefrieren und Lebens ' mittelen. Zeitschr. Ges. Kalte Industrie, 39, 7 : 97-108.

167. Hill A. 1931. Adventures in Biophysics. London.

168. Holtz W., Schmidt-Baulain R., Meiners-Gefken M. A simple saccharide extender for cryopreservation of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) // 4th International Symposium on Reproductive Physiology of Fish. Norwich, July, 1991. - P. 25-252.

169. Jeulin C., Seres C., Jouannet P. The effects of centrifugation, various syntetic media and temperature on the motility and vitality of human spermatozoa. Reprod. Nutr. Developp., 1982, v. 22, Nla, p. 81-91.

170. Jeyendram R.S., Graham E.F., Schmehl M.K.L. Fertility of dehydrated bull sperm. Cryobiology, 1981, v. 18, p. 292-300.

171. Johnson L., Berndtson W., Pickett B. An improved method for evaluating acrosomes of bovine spermatozoa. J. Anim. Sci., 1976, v. 42, N 4, p. 951-954.

172. Karow A. M., Abouna Jr. G., Humphries A. L. Organ preservation for transplantation.- Boston : Little Brown and со, 1974. 429 p.

173. Kusunoki H., Tsukase I., Seisiro K., Sunao K. Identification of acrosom reacted goat spermatozoa by a symplified triple-staine technique. -Japanese J. of Zootechn. Sci., 1984, v. 55, N 11, p. 832-837.

174. Lacy D., Pettit A., Pettit J., Martin R. Application of scanning electron microscopy to semen analisis of the subfertile man utilizing date obtained by transmission electron microscopy as an aid to interpretation. Micron, 1974, v. 5, p. 135-173.

175. Larson E.V., Graham E.F. Fertility of freeze-dried bovine spermatozoa. Proc. 8th Int. congr. on Anim. repr. Art. Ins (Kracow), 1976, v. 4, p. 822-825.

176. Legendre M., Billard R. Cryopreservation of rainbow trout sperm by deep freezing // Reprod. Nutrit. Devel. Paris. 1980. - V. 20, №6. - P. 18591868.

177. Levitt J. 1962. A sulfhydryl-disulfide hypothesis of frost injury and resistance in plants. J. Theor, Biol., 3, 3: 355-391.

178. Levitt J. 1967. The role of SH and SS in the resistance of cells to high and low temperatures. In: The Cell and Environmental temperature.

179. Ed. A. S. Troshin. Pergamon Press: 269-274.

180. Levitt J. 1966. Winter hardiness in-plant. In: Cryobiology. Ed. H. T. Meryman. London N. Y.: 495-561.

181. Liakatas J., Williams A., Hargreave T. Scoring sperm morfology using the scanning electron microscope. Fertil. Steril., 1982, v. 38, No 1-2, p. 227-232.

182. Linford E., Stewart D.L. The relationship between evaluation methods and fertility in the bull. J. Repr. Fert., 1976, v. 47, p. 283-291.

183. Lovelock J.E. 1957. Denaturation of lipidprotein complexes as a cause of damage by freezing. Proc. Roy. Soc., ser. Biol., 147: 427-433.200. . Lovelock J. E. 1954. Physical instability and thermal shock in red cells. Nature, London, 173: 659-661.

184. Lovelock J. E. 1953. The haemolysis of human red blood-cells by freezing and thawing. Biochim. et Biophys. Acta, 10:414.

185. Lozina-Lozinsky L. K. 1965. Survival of some insects and cells following intracellular ice formation. Fedei*. Proc., 24, 2, pt. Ill: 206-212.

186. Lunstra D., Echternkamp S.E. Puberty in breef bulls: acrosom morfology and semen quality in bulls of different breds. J. Anim. sci., 1982, v. 55, N. 3, p. 638-648.

187. Luyet B. J. 1960. On various phase transitions occurring in aqueous solutions at low temperatures. Ann. N. Y. Acad. Sci., 85: 549-569.

188. Luyet B. J. 1962. Recent developments in cryobiology and their significance in the study of freezing and freeze-drying of bacteria. Proc. Low temp, microbiol., Symp. Camden, 1961: 63-87.

189. Luyet B. J. 1966. Anatomy of the freezing process in biological materials. In: Cryobiology. Ed. H. T. Meryman. London—N. Y.: 115-137.

190. Luyet B.J. a. Gehenio P.M. 1940a. Life and death et low temperatures. Biodynamica. Missouri.

191. Maisse G. Cryopreservation of fish semen; A review. Froid et Aquaculture. Refrigeration and Aquaculture. Bordeaux, France. 1996. - P. 443-450.

192. Mahadevan M. M., Trounson A. O. The influence of seminal characteristics on the success rate of human in vitro fertilization. Fert. Steril., 1984, v. 42, No 3-4, p. 400-405.

193. Makler A. Simultaneous differentiation between motile, nonmotile, live and dead spermatozoa by combining the supravital staining and the МЕР method.- Int. J. Androl., 1979, v. 2, No 1, p. 32-42.

194. Makler A., Jacobi P. Factors, affecting sperm motility. V. Washing and resuspension of human spermatozoa in various artifical media. Fertil. Steril., 1981, v. 35, N 4, p. 442-446.

195. Makler A., Fisher M., Murillo O. Factors, affecting sperm motility. IX. Survival of spermatozoa in various biological media and under different gaseous compositions. Fertil. Steril., 1984, v. 41, N 3, p. 428-432

196. Mazur P. Cryobiology. The freezing of biological systems.- Science, 1970, 169, N5135, p. 939-949.

197. Mazur P. Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and likehood of intracellular water.- J. Gen. Physiol., 1963,47, p. 347—369.

198. Mazur P. The freezing biological systems.- Cryobiology, 1970, 16, № 8, p. 939-949.

199. Mazur P. Theoretical and experimental effects of cooling and warming velocity in the survival of frozen and thawed cells.- Cryobiology, 1966, 2, N4, p. 181-192.

200. Mellish O., Baker R. D. Marcing boar spermatozoa with fluorochromes for evaluating spermatozoan transport within giltis. J. Anim. Sci., 1970, v. 31, N 5, p. 917-922.

201. Menkveld R., Van Zyl J. A statistical comparison of three methods for the counting of human spermatozoa. Andrologia, 1984, v. 16, N 6, p. 554558.

202. Mercado-Richardo E., Dominquez-Aquilar R. Intrinic fluorescence on intact and washed and metabolically active human spermatozoa. Arch. Invest. Med., 1982, v. 13, N 14, p. 225-229.

203. Meryman H.T. Review of biological freezing. In: Cryobiology. / Ed. H.T. Meryman. London - N.Y.: Acad, press, 1966, p. 55-90.

204. McGrath J., Somlo S., Makova S., Tian X., Brueckner M. 2003. Two populations of nobe monocilia initiate left-right asymmetry in the mouse. Cell. 114: 61-73.

205. McNiven M.A., Gallant R.K., Richardson G.F. Dimethyl acetamide as a cryoprotectant for rainbow trout spermatozoa // Theriogenology. 1993. -V. 40.-N5.-P. 943-948.

206. Mitcell K., Hansen R.D., Fleming W.H. Utilizing differential interference contrast microscopy for evaluating abnormal sperm. Proc. 6th Teshn. conf. on Art Ins. Reprod. N.A.A.B., 1978, p. 20-21.

207. Molisch H. 1897. Untersuchungen fiber das Erfrieren der Pflanzen. Jena.

208. Moran T. 1929. Critical temperature of freezing. Proc. Roy. Soc., ser. Biol., 105:177-195.

209. Munkittrick K.R., Moccia R.D. Advanced in the cryopreservation of salmonid semen and suitability for a productionscale artificial fertilization program // Theriogenology. 1984. - V. 21. - N 4. - P. 646-659.

210. Nash T. Chemical constitution of compounds which protect erythrocytes against freezing damage.- J. Gen. Physiol., 1962, 46, № 1, p. 167-175.

211. Pace M. M., Graham E. F. The release of glutamic oxaloacetic transaminase from bovine spermatozoa as a test method of assessing semen quality and fertility. Biol. Repr., 1970, v. 3, N 2, p. 140-146.

212. Pace M. M., Graham E. F. Fundamentals of assay of spermatozoa. -9th Int. Congr.on Anim. Repr. Art. Ins., (Madrid), 1980, p. 133-147.

213. Parkes A.S., Radiation sensitivity ovarian tissue at -79°C. Nature, London, 176. 1955, p. 1216-1217.

214. Parkes A.S., Smith A.U. Regeneration of rat ovarian tissue grafted after exposure to low temperature. Proc, Roy. Soc., ser. Biol., 140. 1953, p. 455-470.

215. Parkinson T. Seasonal variation in semen quality of bulls and correlations with metabolic and endocrine parameters. Vet. Rec, 1985, v. 117, N12, p. 302-307.

216. Pickett B. W., Berndtson W. E.Sullivan J. I. Techniques for processing and packading bovin semen. Proc. 6th Techn. conf. on Alt. Ins. and Repr. N. А. А. В., 1976, p. 34-50.

217. Piironen J. Cryopreservation of sperm from brown trout (Salmo Trutta M. Lacustris L.) and arctic charr (Salvelinus Alpinus L.) // Aquacultire. -1993. - V. 116, N 2-3. - P. 275-285.

218. Piironen J. Report on cryopreservation of fish eggs and sperm / Nordic Council of Ministers, Copenhagen. 1992. - 28 p.

219. Polge C. Freezing of spermatozoa. In: Low-Temperature Preservation in Medicine and Biology. Eds. M.J. Ashwood-Smite and J. Farrant. Pitman, Bath.,UK. 1980. -P. 45-65.

220. Polge C. 1957. Low temperature storage of mammalian spermatozoa. Proc. Roy. Soc., ser. Biol., 147: 498-508.

221. Polge C., Lovelock Т.Е. Preservation of bull semen at -79°C. Vet. Rec., 64.- 1952. p. 396-398.

222. Pushkar N. S, Itkin Yu. A., Bronstein V. L. et al. On the problem of dehydration and intracellular crystallization during freezing of cell suspension.- Ibid., 1976, 13, N 2, p. 147-152.

223. Renard J.P. Genetics, reproduction and refrigeration. Conf. Mond., Paris, 18-20 Juin, 1986. F. Froide dev., Paris. - 1996. - P. 254-271.

224. Reslei J., Gaspar R., Szabo G., Matyus L., Damjanovich S. A him ivarsejtec fertilisanak biofizikaianalize.— Madyar Allatorvosok lapja, 1983, v„ 38, No 1, p. 38-41.

225. Robinson W. 1927. Water-binding capacity of colloides as definite factor in winter hardiness of insects. J. Econ. Ent., 20: 80-88.

226. Robinson W. 1928. Determination of the natural undercooling and freezing point in insects. J. Econ. Ent., 21: 37.

227. Rostand J. 1946. Glycerine et resistance du sperme aux basses temperatures. C. r. Acad. sci. Paris, 222: 1524-1525.

228. Roussel G. D., Stallcup О. T. Parallelism between semen characteristic and glutamic oxaloacetic, glutamic pyruvic acetic transaminase activities. J. Dairy Sci., 1965, v. 48, N 12, p. 1684-1687.

229. Saacke R.G., Amann R.R., Marshall C.E. Acrosomal cup adnormalities of sperm from sub fertile bulls. J. Anim. sci., 1968, v. 27, N 5, p. 1391-1400.

230. Saacke R.G. Morphology of the sperm and its relationship to fertility. Proc. 3rd Techn. cont. on Art. Ins. Repr. N. А. А. В., 1970, p. 17-30.

231. Saacke R.G. Semen quality test and their relationship to fertility. -Proc. 4rd Techn. cont. on Art. Ins. Repr. N. А. А. В., 1972, p. 22-28.253. , Saacke G. Semen quality in relation in semen preservation. J. Dairy Sci, 1983, v. 66, N 12, p. 2636-2644.

232. Salt R. W. 1955. Extent of ice formation in frozen tissues and a new method for its measurement. Canad. J. Zool., 33, 6 : 391-403.

233. Salt R. W. 1959. Survival of frozen fat body cells in an insect. Nature, London, 184: 1426.

234. Sato H., Landthaler M., Haina D., Scill W.B. The effect of laser light on sperm motility and velocity in vitro. Andrologia, 1984, v. 16, N 1, p. 23-25.

235. Schoysman R., Khan I., Yandroosendaal E., Schoysman-Deboek A. A la recherhe du pouvoir fecondant du sperm. Rev. Med. Bruxelles, 1985, v. 6, N9, p. 633-637.

236. Scott A.P., Baynes S.M. A review of the biology, handling and storage of salmonid spermatozoa // J. Fish Biol. 1980. - Y. 17. - P. 707739.

237. Sjager S., Kuiken J., Kremer J. Comparison of two supravital stains in examination of human semen and in tests for cytotoxic antibodies to human spermatozoa. Fertil. Steril., 1984, v. 41, N 2, p. 294-297.

238. Shimada K., Asahina E. Visualization of intracellular ice crystals formed in very rapidly frozen cells at -27°C.- Ibid., 1975, 12, N 3, p. 209218.

239. South F.E. 1961. Phrenic nerve diaphragm preparation in relation to temperature and hibernation. Amer. J. Physiol., 206, 3: 565-571.

240. Smith A.U. 1954. Effects of low temperature on living cells and tissues. In: Biological application of freezing and drying. N.Y.: 9-90.

241. Smith A.U., Smiles J. 1953. Microscopic studies of mammalia tissue during cooling to and rewarming from -79°C. Roy. Micr. Soc., 73: 134-139.264. (Smith А.) Смит A. 1963. Биологическое действие замораживания и переохлаждения. М.

242. Steffens W., Yahnichen Н., Fredrich F. Possibilities of sturgeon culture in Central Europe // Aquaculture. 1990. - V. 89. - P. 101-122.

243. Stein H., Bayrle H. Cryoconservation of the sperm of some freshwater leleosta. Ann. biol. anim., biochim., biophys., 1978, 18, N 4, p. 1037-1076.

244. Stoss J., Holtz W. Cryopreservation of rainbow trout (Salmo gairdneri) sperm. I. Effect of thawing solution, sperm density and intervalbetween thawing and insemination // Aquaculture. 1981 a. - V. 22. - P. 97104.

245. Stoss J., Holtz W. Cryopreservation of rainbow trout (Salmo gairdneri) sperm. II. Effect of pH and presence of a buffer in the diluent // Aquaculture. -1981 b. V. 25. - P. 217-222.

246. Stoss J., Holtz W. Cryopreservation of rainbow trout (Salmo gairdneri) sperm. III. Effect of proteins in the diluent, sperm from different males and interval between sperm collection and freezing // Aquaculture. -1983 a. -V. 31.-P. 275-282.

247. Stoss J., Refstie T. Short-time storage and cryopreservation of milt from Atlantic salmon and Sea trout // Aquaculture. 1983 с. - V. 30. - P. 229-236.

248. Sueldo R., Berger Т., O'Brien Т., Hetzky O. Correlation of transferrin concentration and sperm fertilizing ability. Amer. J. Obstet. Gynecol., 1984, v, 150, N 5, p. 528-531.

249. Sundquist C., Lucola A., Valtonen M. Relationship between serum testosterone concentrations and fertility in male mink. J. Repr. Fert., 1984. v. 70, N2, p. 409-412.

250. Talbot P., Chacon R. A new procedure for rapidly scoring acrosome reactions of human sperm. Gamete Res., 1980, v. 3, N 3, p. 211-216.

251. Talbot P., Chacon R. A triple staine technique for evaluation normal acrosome reactions of human sperm. J. Exp. Zool., 1981, v. 215, N 2, p. 201-208

252. Tammann G. 1903. Kristallisierea und Schmelzen. Leipzig, 274 p.

253. Tammann G. 1925. The states of agregations. N. Y. 132 p.

254. Terner С. Evaluation of salmonid sperm motility for cryopreservation I I Progres. Fish Culturist. - 1986. - V. 48. - P. 230-232.

255. Thom F., Matthes G. Remarks on ice formation in binary aqueous solytions of ethylene glycol and dimethylsulfoxide // Ciy о letters. 1990. -V. 2.-P. 13-26.

256. Thorgaard G.H., Wheeler P.A., Cloud J.G. In press. Status and potential value of sperm banking for snake river salmon.

257. Topfer-Petersen, Heissler E., Scill W B. The kinetic of acrosome reaction an additional sperm parameter. - Andrologia, 1985, v. 17, N 3, p. 224-227.

258. Vorobjev I., Malikov V., Rodionov V. 2001. Self-organization of a radial microtubule array by dynein-dependent nucleation of microtubules. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 98: 10160-10165.

259. Wheeler P.A., Thorgaard G.H. Cryopreservation of rainbow trout semen in large straws // Aquaculture. 1991. - V. 93, N 1. - P. 95-100.

260. Wolf D. P., Inone M. Sperm concentration dependency in the fertilization and zonae sperm binding properties of mouse eggs insemination in vitro.— J. Exp. Zool., 1976, v. 196, No 1, p. 27-37.

261. Wong W. Т., Dhaliwal G. K. Observation on semen quality of dogs in tropics. Vet. Res., 1985, v. 116, No 12, p'. 313-314.

262. Wolley D. M. A test of functional significance of the quantity of mitochondria in the spermatozoa in mice. Gen. Res., 1970, v. 16, p. 225228.

Информация о работе

Акимочкина, Татьяна Ивановна
кандидата биологических наук
Астрахань, 2010
ВАК 03.03.04

Диссертация

Цитологические особенности спермиев ценных видов рыб Волго-Каспийского бассейна и их изменение в зависимости от условий криоконсервации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы