Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние факторов криоконсервирования на генетический аппарат спермиев рыб

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние факторов криоконсервирования на генетический аппарат спермиев рыб"

Р Г 6 од

АКАДВДИЯ НАУК УКРАИНЫ _ у [¡¡¡МЮТЭД^ ПРОБЛЕМ КРИОБИОЛОГИИ И КРКСМВДИЦИШ

На правах рукописи

БИБЕНКО ОЛЬГА ВИКТОРОВНА

ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ НА ГЕНЕТИЧЕСКИ! АППАРАТ СПЕРМИЕВ РЫВ

(03.00.22 - криобиология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Харьков - 1993

Работа выполнена в Институте проблем криобиология и кряо-мвдицинн АН Украины,

Научные руководитвли-академик АН Украшш, доктор медицинских наук«

профессор, лауреат Государственных премий СССР и Украины В.И. Гриценко

академик. Академии Естественных Наук России, доктор биологических наук, профессор A.A. Нэйфах

Официальные оппоненты -доктор биологических наук, лауреат Государственной премии СССР М.И. Шраго,

Ведущая организация - Институт гидробиологии АН .Украины

на заседании специализированного совета Д 016,60.01 при Институте проблем криобиологии и криомедицины АН Украшш (г. Харьков, ул. Переяславская, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

доктор биологических наук, профессор В.Г. Шахбазов

Защита состоится

1993 года в " '-> " часов

Автореферат разослан

И 91

19ЭЗ года.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук

А.Н. Гольцев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМУ. Загрязнение водной среды, бесконтрольный видов рыб, строительство плотин и разрушение нерестилищ сильно уменьшают количество рыб в различных популяциях, приводят к инбридингу, вырождению и даже к гибели многих видов. В Красную книгу МСОП (1973) внесено 168 видов (около I % мировой фауны) и 25 подвидов риб, находящихся под угрозой исчезновения. В Красной книге СССР (1984) била 9 видов (3,5 % общего числа пресноводных форм), а в 19Э0 г. этот список вырос ужэ до 35 видов рыб.

Не лучше обстоят дела и в странах: Европа, где значительная часть риб (52,3 %) находятсо под угрозой исчезновения, а 53,5 % популяций всех промысловых рыб полностью истощены и запрещены к вылову (A.B. Яблоков, С.А. Остроумов, IS85).

В связи с этим во многих странах мира ведутся исследования по криоконсервации спермы рыб, и в некоторых странах (ФРГ, США, Канада) уже созданы низкотемпературные банки. Главная цель таких работ - сохранение генома криоконсервпровашшх спермиав с последующим их использованием для воспроизведения видов, подвидов и пород и восстановление исчезающих генотипов рыб. Но вопрос о состоянии генетического аппарата спершев, закладываемых на долгосрочное хранение, степени его сохранности, несмотря на его первостепенное значение для данных работ, до сих пор не изучен. Имеется большое количество исследований, посвященных разработке способов криоконсервации спе-'рмы риб и выяснению механизмов криоповревдений, но практически отсутствуют исследования по изучению состояния генетического аппарата спершев рыб на разных этапах криоконсервации. В литературе имеются лишь единичные сообщения о массовой гибели эмбрионов, полученных с использованием криоконсервмровэнной спермы (В.Н. Жукин-СКИЙ и др., 1931; М. Koldrae, K.Bieniark, 1987), а также о суммарном' влиянии факторов криоконсервации на геном рыб (A.A. Найфах и др. 1981). После этих работ однако оставалось неясным, на каком из этапов криоконсервации происходят повреждения генетического аппарата. Гибель эмбрионов на критических стадиях развития может свидетельствовать о.повреждении доминантных генов. Но, вероятно, что при криоконсервации также могут возникать повреждения рецессивных генов, которые будут проявляться в следующих поколениях.

Можно заключить, что выяснение возможности повреждений генетического .'аппарата спермиав рыб на различных этапах криоконсервации является первостепенной задачей исследователей, работающих, в области сохранения генофонда рыб с использованием методов криокон-

сервации.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Целью работы била изучить возможны ли повревде- ■ нпя генетического аппарата спврмиэв рыб при воздействии на них криопротекторов и глубокого охлаждения. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

-изучить смертность диплоидных и андрогенетических гаплоидных эмбрионов, полученных с использованием нативной спермы:

. а) выдержанной разное время (5, 25, 30 и 60 мин) в средах о различной концентрацией (0; 2,5; 5,0; 10,0 7. г. ) разных криопротакторов: зтилвнглшюля (ЭГ), диметилсульфоксида (ДМСО), глицерина (Гл) и метилового эфира этиленгликоля (Мц) и при нескольких температурах (О °С, 5 °С, 15 °С и 21 °С);

б)и сперли после замораживания-оттаивания; -определить стадии эмбриогенеза, на которых происходит максимальная гибель эмбрионов ("критические стадии");

-изучить китоткческую активность и наличие хромосомных аберраций в клетках эмбрионов рыб, полученных при • оплодотворении яйцеклеток сперкиями поело разных этапов криоконоервации. НАУЧНАЯ НОВИЗНА ПОЛУЧИШЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. ■ Впервые установлено, что: -максимальная гибель эмбрионов осетровых (севрюга) и костистых (карп, вьюн) рыб» полученных с использованием спермиев при разных условиях криоконсервационноЯ предобработки, происходит в период начального фототипического проявления функции генома на ранних стадиях эмбриогенеза между поздней бластулой и гаструлой, а на последующих стадиях развития эмбрионов различия в доле живых зародышей между опытом и контролем сохраняются на постоянном уровне;

-эквилибрация спермиев карпов и вьюнов в средах с Юм крио-протекторов ЭГ, ДМСО, Гл и Мц приводит к увеличению смертности эмбрионов, полученных с использованном этой спермы;

-процессы замораживания и оттаивания спермаэе увеличивают смертность эмбрионов рыб, полученных с использованием этой спермы. Причем, этот показатель существенно зависит от используемого крио-протектора и его концентрации?

-различия¡в выживаемости диплоидных и андрогэнетических гаплоидных зародышей увеличиваются, если ош получены с помощью крио-консервированной сперш, или эквюшбрированной в средах с 10 х криопротакторов. Зто позволяет заключить, что факторы криоконоервации вызывают поврекдения как.доминантных, так к рецессивных генов ;

-смертность эмбрионов, зависит от генотипических и физиологических характеристик самки, от которой получены яйцеклетки:

-эквилибрация слермиев с криопротекторами влияет на количество аберраций и митотический индекс клеток эмбрионов карпов и вьюнов.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Теоретическое значение работы заключается в установлении возможности мутагенного и селективного влияния факторов криокоиоврвп-ции на генетический аппарат спармиев рыб. Установленные факты расширяют представления о механизмах криоповреждений и криозащиты клеток, о роли ядерно-цитоплаэматических взаимоотношений в обеспечении жизнеспособности клеток и о механизмах реализации функции генов в раннем развитии.

Полученные результаты позволяют при оценке качества материала, закладываемого на долгосрочное хранение, и при оптимизации способов криоконсервации, рекомендовать обязательную оценку состояния генетического аппарата гамет рыб по гибели эмбрионов. Они такта позволяют внести коррективы при определении количества образцов, закладываемых на хранение, и, таким образом, предупредить потерю ценного, коллекционного материала из-за вероятности инбридинга и вырождения.

Установление факта влияния факторов криоконсервации на генетический аппарат спершев рыб позволяет селекционерам проводить работы по направленной селекции.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ. Использование для осеменения спермы карпов и вьюнов, эквилиб-рированной или криоконсервированной с высокими концентрациями (10 %) криопротекторов ЗГ, ДМСО, Гл и Мц, вызывает:

в)повшиение гибели диплоидных и андрогенетических гаплоидных эмбрионов начиная со стадии поздней бластулы (начало фвноти-ттического проявления работы генома) до стадии гаструлы, зависящее от вида криопротектора, а также от генотипических и физиологических характеристик самяи, от которой получены яйцеклетки;

б)появлени8 хромосомных аберраций, что очевидно является следствием повреждения генетического аппарата в спермиях рыб.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертационной работы докладывались и обсувдались на Международной конференции под эгидой ЮНЕСКО "Достижения и перс-

пектига развития криобиологии и криомедищшн" (Харьков, 1988), школе по криобиологии (Харьков, 1990), заседании Координационного * совета по программе ПШТ СССР "Криобанк рыб" (Пущино, 1990) и на Международном рабочем совещании по криоконсервации и хранению гамет и эморионов водных организмов (Франция, Марли Рой, 1992).

ПУЕШК.А11ИИ. По теме диссертации опубликовано 4 работы.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материала и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на ПО страницах машинописного текста, включает 33 рисунка и 9 таблиц. В работе использовано 159 источников литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Объектами исследований служили яйцеклетки, спермии, эмбрионы и эмбриональные клетки вьюна (Misgurnus foc?silis Ъ.) карпа (Cupri-nus oarpio L. ) И севрюги (Aoipenser Btellatue). -

Спермии и яйцеклетки севрюги, карпов и вьюнов получали после предварительного стимулирования гаметогенеза гояадотропным гормоном или гипофизом. Севрюгам и карпам инъецировали раствор ацетони-рованных гипофизов осетровых и карповых рыб (Гинзбург A.C., 1968; Пулина Г.А., 1974) .Вьюнам инъецировали раствор хорионического . го-надотрошша по методу модифицированному А.А-. Нэйфахом (Костомарова A.A., 1975).

Для криоконсервации спермы карпа, севрюги и вьюнов использовали защитные среды, разработанные Е.Ф. Копейкой (1981, 1936).

Криоконсервации спермы карпа проводили в пластиковых контейнерах емкостью I мл с помощью стационарного программного устройства охлаждения УОП-6 производства СКТБ с.ОП ИЖ и К АН Украины. Сперму рыб после охлаждения в холодильнике до 4 °С разбавляли I:I изотермической защитной средой с криопротекторами (ЭГ, ДМСО, Мц или Гл) таким образом, чтобы в коночной среде концентрация крио-протоктора была равна 10 % об/об. Завышенная концентрация криопро-тектора была нами взята сйециально для выявления 'всех возмохных последствий этого воздействия. Обычно, при криоконсервации спермы карпов и осетррв используют более низкие концентрации криопротек-торов (Копейка Е.Ф.,1986). Сперму охлаждали по трехэтапной програ--юле: I этап - от О °С до минус 15 °С со скоростью 1-2 град/мин;

2 этап -от минус 15 °С до минус 70 °С со скоростью 15-20 град/мин

3 этап -от минус 70 °С до минус 196 °С (погружение в жидкий азот).

Сперму вьюна и севрюги криоконсервировали по приведенной про-

грамма с регистрацией режима на микровольтампарметре НЗЭ9, поместив над поверхностью азота.

После эквилибрации спермиев с криопротекторами и особенно после криоконсервации и размораживания погибала значительная часть спермиев. Но при осеменении икры мы это практически не учитывали и почти всегда давали одинаковое количество спермы в опыте и контроле. Такое искусственное занижение количества спермиев на одну яйцеклетку в опыте было необходимо нам для уменьшения конкуренции между спермиями и повышения возможности реализации потенций всех поврежденных клеток. Это приводило к снижению выживаемости эмбрионов. По разнице в количестве погибши эмбрионов, пол ученных с использованием нативной спермы и эквшмбрированной в средах с крио-протектоторами или замороженной и размороженной судили о повреждениях генетического аппарата спврмиэв. После осеменения яйцеклеток карпов и вьюнов на,стадии ранней бластулы (начало работы генома) удаляли всю неошгадотворенную, активированную и погибшую икру. Оставшиеся эмбрионы принимали за 100 ■/. и исследовали их гибель на последующих стадиях. У севрюги эту операцию проводили на стадии 2-4 бластомеров. Оставшиеся эмбрионы инкубировали в термостате при температутуре,¡8 °С, периодически удаляя погибшие, и, заменяя воду. Через каждые 12 часов после осеменения проводили учет и удаление погибших эмбрионов во всех чешках. Отбор проводили на 5-6 стадиях развития.

Об оплодотворяющей способности спермиев осетровых судили по доле эмбрионов, достигших стадий двух-чегырех бластомеров. Об оплодотворяющей способности спермиев карпов и вьюнов судили по доле развивающихся зародышей на стадии ранней бластулы и выражали эту величину в процентах как | х 100, где а - количество оплодотворенных клеток; в - общее количество эмбрионов. О повреждениях доминантных генов спермиев судили по доле диплоидных эмбрионов, погибших после стадии средней-поздней бластулы. О повреждении рецессивных генов судили по разнице ' в долях погибших эмбрионов между диплоидными и пндрогенетическими гаплоидными зародышами.

Так как у диплоидных эмбрионов была возможность компенсации поврежденных генов спермия материнским геномом яйцеклетки, то для выявления всех возможных повреждений генетического аппарата спермиев все наши опыты повторили на андрогенетических гаплоидах._ -

Для получения андрогенетических гаплоидов необходимо было осеменить инактивированше яйцеклетки. Радиационную инактивацию яйцеклеток проводили по методике A.A. Нейфаха (1959) на терапавти-

ческих ренгедавских аппаратах РУМ-П и РУМ-17 (двухтрубочное облучение) в течение 17 мин 19 сек. Сила тока на установках. РУМ-17 и РУМ-11 была соответственно 10 мА и 7 мД, напряжение - 200 м и 195 ку. Облучение проводили без фильтра и со снятым тубусом. Расстояние от объекта до анода трубки было 9 см. Общая доза облучения яиц при этих условиях составляла 23 тыс. Рад. Эта доза обеспечивает практически полную инактивацию генома, но еще не повреждает заметным образом цитоплазматичвскиэ структуры яйца (Нейфах, 1959).

Для получения андрогенетических гаплоидных зародышей облученные яйцеклетки осеменяли нативлой спермой, обработанной защитной' средой с криопротекторами, а также замороженно-оттаянной.

Для определения митотического индекса и выявления, хромосомных аберраций зародышей карпа и вьюна фиксировали в жидкости Кар-нуа (Волкова О.В., Елецкий Ю.К.,1971), соответственно на о-9 стадии (поздняя бластула - ранняя гаструла) и на 9-10 стадии (поздняя бластула- ранняя гаструла), а также перед вылуплением.

Для хромосомного анализа готовили давленные препараты из фиксированных зародышей, предварительно окрашенных ацето-кармином.

Для .уменьшения ошибки, повышения качества и достоверности исследований мы проводили многофакторные эксперименты. Статистическая обработка результатов проводилась в вычислительном центре ИИ и К АН Украины.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В первых экспершэнтах на гаметах севрюги мы разбавляли сперму средой с ДМСО и замораживали ее. Конечная концентрация криопро-тектора была равна 10 г. об/об. Размороженной спермой осеменили яйцеклетки и на стадии 2-4 бластомеров удалили все неоплодотворен-ные и погибшие. Оставшиеся эмбрионы принимали за 100 7. и учитывали их гибель на последующих стадиях развития. Было установлено, что смертность эмбрионов севрюги, полученных с использованием криоконсервированной спермы на стадии поздней бластулы значитель»-но выше, чем при использовании нативной спермы. Таким образом, в втом эксперименте было устатановлено, что последствия криоконсервации сдармиев могут проявляться не только у карпов, как было известно из литературы (Жукмнский В.Н. и др. 1981; и. -Гиигв*, 1987), но и у других видов рыб.

Такие же эксперименты, но с разными криопротекторами, были поставлены нами на карпах и вьюнах. Как видно из рис. I, эквилиб-рация спермиев карпов в средах с 10 •/. криопротекторов приводила к достоверному снижению выживаемости эмбрионов между контролем и

. ОПЫТОМ (Р=0,95).

Кол-во живых эмбрионов, <¡6 Рис. ,Л. Выживаемость эм- гао— -брионов карпов, полученных с использованием спермы, еквилибрированной о и: криопротекторами СИЗ или криоконсервированной вя . (I - контроль, 2 - Мц , » 3 - ДМСО, 4 - ЭГ). 0,

16 к гг 1:2 га Стадии развития, V При этом оказалось, что выживаемость зависила от вида крионротек-тора. При использовании криоконсервированной спермы различия в выживаемости эмбрионов становились Солее значимыми, но имели' другую направленность. Так, после криоконсервации спермиев с ЭГ смертность эмбрионов оставалась почти такой же, как и до криоконсервации. Из результатов представленных на рис. I следует, что криоэа-щитные эффекты, ДМСО и Мц выражены в меньшей степени, в сравнении о ЭГ и количество выживших ембрионов, было значительно ниже, чем после осеменения яйцеклеток нативной спермой (Р=0,95), или только ■ эквилибрированной с этими криопротекторпми (Р=0,Э5). Анализ рэзу-' льтатов по влиянию на спермш • карпов криопротекторов до и после криоконсервации свидетельствует о том, что ДМСО обладает самой низкой криопротекторной активностью. Полученные результаты не противоречат имеющимся в литературе данным о более высокой криопротекторной активности ЭГ в сравнении с ДОСО при криоконсервации спермы карпа (Е.Ф. Копейка, 1986).

На спермиях вьюнов также исследовали влияние криопротекторов (ЭГ, ДМСО, Мц, Гл) в различных концентрациях (I0,0; 5,0; 2,5 и 0 % об/об). Было установлено (Рис. 2), что только после эквилибрации спермиев в средах с 10 % криопротекторов выживаемость •эмбрионов была .достоверно ниже, чем при использовании нативной спермы (Р=0,ЭЭ).. Использование спермиев энвилябрированных в средах с 2,Ь% или 5 % криопротекторов практически не сказывалось на вшзгсаомости эмбрионов. Подобная зависимость выживаемости эмбрионов от концентрации криопротектора в среде эквилибрации спермиев была установлена и для карпов (Рис. 3). Только экшлибрация спермичв н растворе •с 10 % криопротекторов достоверно снижала выживаемость эмбрионов

карпов. Эквилибрация спермы, в защитной среде или в той же среде, Но с 2,5 % нриолротектора не влияла на выживаемость эмбрионов. Кол-во живых_ Кол-во живых

эмбрионов, % эмбрионов, %

\

N \ —«-

- - Д -----

40 Ю ВО 100 120 " 2.5 % а.О » 10-0 »

Рис^2. Влияние экЕИлибрации спермы вьюнов с разными концентрациями криопротекторов на выживаемость эмбрионов.

Рис.3. Влияние эквилибрации спермы карпов с защитной средой и криопротекторами на выживаемость эмбрионов (0-срэда, Н -контроль).

• Установлено, что выживаемость эмбрионов карпов и вьюнов очень сильно варьирует у различных самок (Рис. 4, 5). Разная выживаемость эмбрионов, полученных с использованием нативной спермы, эквилибрированной с криопротекторами или криоконсервированной, обусловлена различиями в физиологических и генетических потенциях икры.

Таким образом, б результате проведенных экспериментов на нескольких видах рыб (севрюга, карп, вьюн) было установлено, что эк~ вилибрация спермиев в средах с 10 % криопротекторов; или криокон-сервация увеличивают смертность эмбрионов. Кроме того, как видно на всех представленных рисунках, гибель эмбрионов значимо (Р=0,Э5) различалась между исследуемыми стадиями. Максимальная гибель эмбрионов и различия в выживаемости при варьировании различных факторов достигали максимума между поздней бластулой (момент первого проявления морфогенетической активности генома) и гаструлой, а затем сохранялись на одном уровне. Эта закономерность отмечалась на

25

Ю

эмбрионах трех видов рыб и1 четко прослекивалась во всех опытах. Кол-во живых Кол-во живых

эмбрионов, $ эмбрионов,"»

51 ?2 66

Стадии развития,

Самки а - 4)

V

-..........'---{

--5--— 1

...........\..... ~~~-----»-'-»

-----

Рис.4. Выживаемость эмбрионов карпов разных самок, полученных с использованием спермы, эквилибрированной с криопро-текторами сЗ или криоконсер-вированной 153 .

Стадии развития, т Самки Рис. Б. Выживаемость эмбрионов вьюнов разных самок, полученных с использованием спермы, эквилибрированной в средах с криопро-текторами.

Можно предположить, что факторы криоконсервации вызывают хотя и в небольшом числе, но только крупные повреждения хромосом, которые затрагивают большое число генов и поэтому проявляются уже на первых стадиях проявления функции генов. Мелких же хромосомных повреждений .оказывается мало и они фактически не проявляются в виде гибели эмбрионов на поздних стадиях.

В диплоидных клетках повреждения рецессивных генов одного из родителей не будут проявляться, гак как они могут компенсироваться геномом второго. Поэтому следует ожидать, что в исследуемых нами эмбрионах реализуются не все поврежденные гены спермиев, т.к. они могут компенсироваться женским геномом. В отсутствии этих компенсаторных эффектов гибель эмбрионов, обусловленная повреждениями генома спермиев должна быть еще выше. Для выявления всех возможных повреждений генетического аппарата спермиев, т.е. и доминантных и рецессивных генов мы получали андрогвнэтические гаплоидные зародыши. Для этого осеменяли яйцеклетки с ядром, предварительно инакти-вированным радиацией. Осеменение проводили тремя видами спермы: нативной, эквилибрированной с криопротекторами или же криоконсер-

л -1

вированной.

Известно, что гаплоидные зародыши и личинки рыб живут до определенной стадии и погибают при явлениях гаплоидного синдрома. Поэтому в качестве контроля были взяты андрогенетические гаплоиды с использованием нативной спермы. При использовании спермы, екви-либрированной с криопротекторами, выживаемость гаплоидных и диплоидных эмбрионов вьюнов достоверно (Р=0,Э5) различалась (Рис. в).

Рио.6. Влияние эквилибрации .спермы с криопротекторами на выживаемость диплоидных и андрогенетических гаплоидных эмбрионов вьюнов.

Увеличение гибели андрогенетических гаплоидов в сравнении с диплоидами свидетельствует о повреждении рецессивных генов, которые не проявляются в первом поколении у диплоидов. Причем, самая высокая смертность эмбрионов была, при использовании спермы, эквилибрированной с ЭГ. Этот факт был подтвержден и в последней серии экспериментов на вьюнах, которая была поставлена в соответствии с матрицей (таблица I).

Таблица 1

Схема опыта по получению гаплоидных и диплоидных эмбрионов вьюнов

Облученная икра Необлученная икра

Сперма после эквилибрации Сперма после замораживания Сперма после эквилибрации Сперма после замораживания

5? № 2? ЗР 4Р 1Р 2Р ЗТ 4Р 1Р 31? 4Р 1Р 2Г ЭР 4Р

К

дасо

эг

Мц

Как и в предыдущих'экспериментах было показано, что основная гибель эмбрионов происходила на начальных стадиях эмбриогенеза (Рис. 7).

\г

Кол-во живых эмбрионов,, %

100 -,-

70

I

1 2 --Шюидность-

Эффекты эквилибрации спермы с криопротекторами и собственно замораживание оказывали достоверное влияние (Р=0,ЭБ) на выживаемость эмбрионов (Рис. 8). Все исследуемые криопротекторы также оказывали достоверное влияние (Р=0,Э5) на выживаемость эмбрионов (Рис. 9). Кол-во кивых эмбрионов I-*-

79 -,-----,-

69 Ь9 49 39

гэ Е-

19

-•-..I-

I т

Кол-ьо живых эмбрионов, %

*Ч !

51

■I

_lL

Кол-во живых эмбрионов, £ т-1-Г

•|46

41

■?(-

31

26 21

I :

4-i-t-\ ; -i

Стадии развития

Рис.8. Влияние вкви-вилибрации (1) и крио-консервации спермы (2) о криопротекторами на выживаемость диплоидных и вндрогенетичес-ких гаплоидных эмбрионов вьюнов.

дасо ЭГ К Мц Криопротекторы Рис.9. Влияние кри-опротекторов на выживаемость эмбрионов вьюнов, полученных с использованием спермы эквили-брированной о крио-протектором и крио-консервированной.

Рис. 7. Выживаемость гаплоидных и диплод-ных эмбрионов выадов на разных стадиях развития, полученных с использованием эк-вилибрированной с криопротекторами и криоконсервиров анной спермы. .

Выживаемость эмбрионов, полученных с использованием размороженной спермы, была достоверно ниже (Р=0,9Э), чем выдержанной с криопротекторами (Рис. 10). Из этого следует, что в процессе замораживания также возможны повреждения генома спермиев, ведущие к гибели эмбрионов. По, так как криоконсервация спермы рыб без криопротек-торов невозможна, то степень этих повреждений, а следовательно, и выживаемость эмбрионов, может быть различна в зависимости от используемого криопротектора и плоидности (Рис. II).

Как видно из результатов, основные повреждения спермиев, выдержанных с дасо или Мц, происходят в процессе криоконсервации, тогда как с ДГ спермин в основном повреждаются на первом этапе ~ в процессе эквилибрации и в меньшей степени при криоконоервации.

Таким образом, в завершающем эксперименте были подтверждены

наши предположения о том, что гибель андрогенетических гаплоидов, иолученных о использованием спермы разбавленной средами с -криолро-такторыми или криоконсервировынной будет еще выше, чем у диплоидных эмбрионов, и выше, чем в гаплоидном контроле. Причиной повышенной гибели андрогештичаскик гаплоидов может быть полное отсутствие компенсации шврежденных участков генома самца генами самки, а также проявлением скрытых повреждений генома спермиев.

Кол-во киьнх эмбрионов, %

■■ I ■■

4 А :

1.....V..... / \

: 2

; : . .1.. 2 ... . ;

; А Г, 1. л : Б

Кол-во живых эмбрионов,

69 1 ' ' I 1 ■ ■'"( т гт г"' Г

55

19

I

: «у-!-:

1......: VI:

12

■V 2

1 к

I

.С. . . Л .

Рис.Ю. Влияние.кршротекторов (1-даСО, 2-ЭГ, З-Кон'гроль, 44 Мц> и условий обработки сперма (А-эквилибрация с криопротек-торами и Б-криоконсервация) на выживаемость гаплоидных и диплоидных эмбрионов вьюнов.

Рис.11-.Выживаемость „эмбрионов вьюнов в зависимости от шюид-ности (1-гаплоида, 2-дишюиды) и криоиротекторов (А - ДОСО, В - ЭГ, С - контроль, Д - Мц), иснильнуемых при эквилибрацим и криоконсервации спермы.

Для окончательного подтверждения предположения о связи гибели эмбрионов с повреждением генетического аппарата нами были проведены эксперименты по определению числа хромосомных аберраций в эмбриональных клетках, полученных с использованием спермы, выдержанной с криопротекторами и криоконсервированной. Как видно из результатов, представленных на рис. 12 и 13, у карпов была отмечена тенденция к повышении количества аберраций при использовании спермы, выдержанной с ЗГ. По количеству аберраций эмбрионы, полученные от использования спермы, эквилибрированной с ДОС О, ЗГ и Гл не отличались между собой. Достоверные .отличия (Р=0,ЭБ) по этому показателю были только, между ЭГ и Мц. В эмбриональных клетках вьюнов, полученных с использованием спермы, выдержанной с ЗГ и ДМСО, по количеству хромосомных аберраций не было отличий, тогда как у эм-

брионов, полученных с использованием cn9pi.ni, эквилибрированной с Гл и Мц число аберраций было меньше (Р^О,95).

Кол-во аберрантных клеток,-

Кол-во аберрантных клеток, </ое

260 230 200 170 140 110

Л-

5..

1(0 1»

I

I 1

Г

Рис. 13. Влияние эквилибрации спермы вьюнов с криопротекто-рами на частоту аберраций в клетках эмбрионов (1-ДМС0, 2-ЭГ, З-Гл, 4-Мц, 5-Контроль).

Рис. 12 * Влияние эквилибрации спермы карпов с криопротекто-рами на частоту аберраций в клетках эмбрионов (1-ДМС0, 2-ЭГ, З-Гл, 4-Мц, 5-Контроль).

Таким образом, в результате этих экспериментов было получено подтверждение того, что гибель эмбрионов на стадиях после бласгу-лы-гаструлы является следствием повреждений генетического аппарата спермиев рыб.

ВЫВОДЫ

1. При использовании спермы, эквилибрированной с криопротекторнми или криоконсервированной', основная гибель эмбрионов происходит со стадии поздней бластулы (начала феноФипического проявления работы генома) до.стадии гаструлы.

2. Выживаемость эмбрионов карпов и' вьюнов, полученных с использованием нативной, эквилибрированной с криопротекторами или криоконсервированной спермы, зависит от генотипа или физиологического состояния самки. (Механизм этого йф1*экта требует специального исследования).

3. Гибель андрогвнетических эмбрионов, полученных при использовании криоконсервированной спермы или эквилибрированной с криопротекторами выше, чем при использовании нативной спермы.

4. Использование спермы, эквилибрированной в средах.с'10 крио-иротектор'-'й или криокинеервированной с ними, сникает выжккые-

мость эмбрионов. При меньших концентрациях криопротектора этот эффокт на обнаруживав тся.

5. Количество выживших эмбрионов зависит от вида криопротектора, в котором находилась сперма до и при замораживании.

6. Экьилибрация спермиев в солевой среде не влияет на выживаемость эмбрионов.

7. Использование для осеменения спермы, вквилибрированной с высокими концентрациями криопротекторов (Ю %) пли криоконсервиро-ванной, вызывает

а) значительную гибель диплоидных, эмбрионов начиная с поздней ■ бластулы (качало фенотипического проявления работы генома) и до

стадии гаструлн;

б) повышенную гибель андрогенетичвскга. вибрионов;

в) появление хромосомных аберраций.

Все эти факты свидетельствуют о том, что определенные отрицательные последствия криоконсервации являются следствием повреждения генетического аппарата спермиев рыб. Этот эффект, однако, может быть существенно снижен путем подбора оптимальных условий криоконсервации (концентрация и вид кржлгротекторов и др.).

СПИСОК-РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ•ДИССЕРТАЦИИ.

1. Е.Ф, Копейка, С.И. Дрокин, O.B. Бибенко, A.A. Найфах и др. Повреждения сперматозоидов рыб при криоконсервации. / Тез. докл. Межд. конф. Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины, Харьков, 1938, с. 69 - 70.

2. Е.Ф. Копейка, Л.И. Цветкова, В.Я. Катасонов, В.В. Черепанов, С.И. Очкур, О-В. Бибенко, С.И. Дрокин. Формирование коллекции низкотемпературного банка спермы карпа. / Сб. научн. трудов. Вопросы селекции, генетики и племенного дела. 1989, М, Б8, с. 66-68.

3. О-В. Бибенко, Е.Ф. Копейка. Влияние криоконсервации спермы карпа Oypi-inus Carpió на эмбриогенез. Сб. науч. трудов. /В.И. Гри-щьнко. Криокоясервирование репродуктивных клеток и эмбрионов, Харьков, 1992, е..3-8.

4. O.V. Bibenko. The efíeot oí extreme faofcore orypreservation on genome. Workshop on gamete and embryo storage and oryopreserva-tiorv in aquatio organisms, Pranoe, Marly le Roy, 1992, p. 52.

•' AJlt

/ -