Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование диализа для криоконсервации спермы жеребца

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Использование диализа для криоконсервации спермы жеребца"

РГб од

1 б ЯИВ 1505

Всероссийский нлучно-нссдедог.атедьек'нй институт

консводстнл

Ни правах рукописи НАУМЕНКОВА Валентина Алексеевна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДИАЛИЗА ДЛЯ КРИОКОНСЕРВАЦИИ СПЕРМЫ ЖЕРЕБЦА

03.00.13 — Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дивово-1994 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте коневодства

Научный руководитель - кандидат вет.наук. Авдрюпшн В.В.

Официальные оппоненты:

• Володин В.А. доктор ветеринарных наук, профессор

• Бобков В.Н.,кандидат биологических наук, с.н.с

Ведущее предприятие - Всероссийский научно-исследовательскии институт животноводства

Защита состоится « & » 1995 года в 9 часов

на заседании диссертационного совета К.020.55.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте коневодства.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ коневодства.

Автореферат разослан 1994 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, С.С.Сергиенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Искусственное осеменение ,;чо-роженно-оттаянной спермой" прочно пошло в прлк7!!к\' коневодства. Метод криоконсервации спермы жереинл позволяет получать приемлемый процент злжереоляе-мости кобыл. Однако масштабы его применения продолжают оставаться низкими из-за ряда причин. Одна из них - это большая гибель спермиев после замораживания -оттаивания, другая-большие объемы разовых доз охлажденной спермы, что не позволяет использовать современное криогенное оборудование. Большой расход дорогостоящего хладоагента - жидкого азота затрудняет транспортировку и делает экономически не выгодным хранение замороженной спермы.

Для снижения объема спермы основным методом сгущения является центрифугирование с последующим удалением части плазмы (Ошида и др., 1967, Мартин и др., 1979, Кохран и др., 1984, Пальмер и др., 1984, Фомина Е.Л., Мирошникова К.И., 1989). Многие исследователи для этой цели применяют фракционное получение эякулята (Бадеридр., 1966, Краузеидр., 1967, Докхорнидр., 1971, Тишнер и др., 1974)."По этим направлениям были достигнуты определенные успехи, но неудовлетворенность полученными результатами заставила искать новые подходы к решению данной проблемы.

Одним из методоз, позволяющим воздействовать на сперму без увеличения объема с одновременным введением защитных веществ в плазму, является диализ. Сообщения о попытках применения этого метода для обработки спермы появились в 40-60 годах. В основном авторы использовали диализ с целью приближения условий существования спермиев «in vitro» к условиям организма.

На новом этапе исследований по криоконсервации спермы жеребца и разработке высокоэффективных защитных сред большой интерес представил диализ, как метод снижения объема спермы для замораживания за счет ликвидации процедуры разбавления. Введение криопротективных веществ в сперму происходит через полупроницаемую мембрану, не увеличивая ее в объеме; при этом соответственно уменьшается потребность в криогенных емкостях и хладоагентах.

Целью исследований послужило стремление усовершенствовать метод криоконсервации спермы с помощью

.диализной обраоотки, позволяющей повысить эффективность использования в коневодстве заморо-•же.нпой спермы ценных жеребцов.

Основные задачи исследований:

1. Установление оптимальных условий для диализа спермы жеребца.

2. Изучение динамики компонентов среды в процессе диализа.

3. Определение качества диализированной спермы.

4. Изучение влияния добавок молока в диализную среду на криоустойчивость спермиев,

5. Определение оплодотворяющей способности спермы, обработанной методом диализа перед замораживанием.

Научная новизна:

Разработан способ подготовки спермы жеребца к замораживанию с помощью диализа, который предусматривает введение в сперму криопротективных веществ через полупроницаемую мембрану. В результате отпадает процедура разбавления спермы и, соответственно, не происходит увеличение ее объема. При диализе спермы с ЛХЦЖ средой достигнуто дополнительное сгущение спермы на 35% от первоначального объема зякулята. После завершения процесса диализа объем дозы спермы для замораживания уменьшен в 5 раз без применения специальных методов концентрации спермиев.

Отработаны оптимальные условия и режим диализа спермы жеребца, позволяющие достичь постепенного насыщения плазмы криозащитными компонентами среды в количествах, равноценных внесению их при разбавлении.

Диализный метод введения защитных веществ в сперму дает возможность сохранять подвижность и переживаемость спермиев после замораживания-оттаивания на высоком уровне. Оплодотворяющая способность оттаянной спермы жеребца, прошедшей диализную обработку перед замораживанием, находится на уровне, приемлемом для практики.

Практическая ценность работы:

Обработка спермы жеребца методом диализа позволяет снизить объем дозы спермы для замораживания с 25 мл до 5 мл без применения других специальных мето-

ггсапзппЛргдяагсс;и-::'1 спсссб псдгогсл.'сл сперми :: :фпохоцсервациг1 псзполлст полудать стаоплыдое -Баулйтаты п р:; ссег-г^пенгш г;сбнл. Эта прзпг-хущестпп являются ссооеан© ксшкми прп транспортир озгсе генетического г.^згерпаяа на дальние расстояния п длптель-пом его храиеппп, псгышад еозмогшсстя пламенной работы в гсопегодстсг.

Осногмкг погопе:™^ защиту:

Способ обработки спермы жеребца перед замораживанием путем диализа, позволяю пош проводить насыщение плазмы криозащитными веществами, создавать благоприятные условия для перевода спермиев в малоактивное состояние перед их консервацией, не прибегая к традиционным методам разбавления.

Диализ как метод сгущения спермы и сплпегпкг объема дозы для замораживания без применения специальных методов концентрации спермиев.

Сохранение на высоком уровне криозащитных свойств ЛХЦЖ среды при сведении ее в плазму спермы через полупроницаемую мембрану с помощью диализа без сшшения качествае спермы после замораживания-оттаивания и ее ошгодотворя&щей способности.

Апробация работы:

Материалы диссертации доложены на научной конференции молодых ученых во ВНИИ коневодства в 1990 году «Состояние исследований и пути совершенствования методов селекция я технологии коневодства».

Объем работы:

Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и содержит 25 таблиц и 2 графика, состоит из введения, четырех глав, выводов, предложений. Список литературы содержит 270 источников, из них 76 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Лабораторные исследования были проведены в отделе физиологии размножения ВНИИ коневодства. Получение спермы жеребца, ее оценку, замораживание и оттаивание проводили по общепринятым методикам. Све-жевзятую сперму делили на две части, одну использовали для контроля после разбавления ее ЛХцЖ средой по

ГОСТ другую - длл оараОот::;: мстодо;:

диализа. Диализ спермы просодшш и диализатора, сс^поящем из двух камер, разделенных полупроницаемой мембраной- Во внутреннюю камеру помещали сперму п опускали по внешнюю камеру, где находилась диализная среда, с качестве которой так;:се использовали Л ХЦ/^ среду. После диализнои обработки сперму заморен вали в парах жидкого азота в алюминевых пакетах объемом 5 мл. Контрольная сперма имела объем 25 мл. Перед осеменением опытную сперму оттаивали и доразбашшлп стерильным кобыльим молоком до объема 25мл.

Для изучения оптимальных параметров диализа спермы жеребца были проведены опыты по установлению необходимого соотношения объемов спермы и среды, продолжительности процесса, оптимальной концентрации компонентов диализной среды, высоты слоя спермы на мембране, режима встряхивания, сравнены различные мембраны.

Для установлейия скорости диализных процессов проводили определение насыщения спермы компонентами ЛХЦЖ среды через полупроницаемую мембрану. Поступление глицерина в сперму устанавливали с помощью рефрактометрических измерений, лактозы -иодометоическим методом (справочник по ред. Костина Я.И., 1981),кислотно-гбуферных компонентов-по изменению показателя рН спермы.

Оценку качества спермы, обработанной методом диализа проводили в сравнении с контрольными образцами разбавленной спермы по подвижности спермиев в баллах до и после замораживания, переживаемости в часах при 0°С после оттаивания, бактериальной загрязненности разовой дозы спермы. Контролировали объем и концентрацию спермы в процессе диализа.

Проверку оплодотворяющей способности спермы, обработанной перед замораживанием методом диализа, проводили в производственных условиях четырех конных заводов. Кобыл разделяли на 2 группы - опытную и контрольную и осеменяли только в одном половом цикле. По мере прихода кобыл в охоту поочередно проводили осеменение опытной или контрольной спермой.

„ Изучаемые показатели подвергались биометричес-кои обработке с использованием методов вариационной статистики по Плохинскому Н.А. (1969).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛСД0ВЛН11П Установление оптимальных условий диализа спермы

В первом опыте определяли он гимальное соотно-шснис ооъсмов спермы и срслы при диализе, что имеет важное значение для выжинасмости спермиев' пне организма. Лучшая выживаемость спермиев гстановлена при соотношении объемов спермы и среды Ы. Но всех дальнейших опытах эта пропорция была использована как оптимальная. Такое же соотношение спермы и срслы используется и при разбавлении спермы.

По существующей в настоящее время технологии криоконсервации сперму жеребца выдерживают в течение 2-х часов при нулевой температуре. Для диализа этого времени оказалось недостаточно. Мы применили дополнительную выдержку спермы в диализаторе при комнатной температуре, учитывая, что процессы диффузии ускоряются при повышении температуры..

Таблица I

Выживаемость спермы при диализе в зависимости от соотношений объемов спермы и среды (п=10)

Соотношение объемов Начальная подвижность спермиев а баллах Переживаемость спермиев в часах при комн. Т*

1:1 4,0±0,17 20+2,0

1:2 4,2±0,16 38±2,8

1 :3 4,2+0,18 68+3,6

1:4 4,2+0,1? 75±4,8

1:5 . 4,2+0,16 72±4,2

1:6 4,2+0,16 65±3,5

Г: 7 4,2+0,16 52±3,0

1:8 * 4,2+0,17 48+3,0

1:9, 4,2+0,17 40±2,5

1:10 4,0±0,1 38±2,1

В 'опыте, представленном в таблице 2, испытывали время выдержки спермы при комнатной температуре, инкубацию спермы при 0°С не изменяли, так как это время необходимо для постепенной адаптации спермиев в зоне критических температур. Лучшая подвижность и

перехшсаемость спермиев наблюдалась при двух часовой выдержке спермы в диализаторе при комнатной температуре. В итоге, общее время диализа спермы составило 4 часа, из них 2 часа при комнатной температуре и 2 часа приО°С.

В установленном нами режиме диализа шло постепенное снижение температуры в самой сперме: за первые 2 часа — с 37"С до 19°С и последующие 2 часа — до 2°С.

Такой режим диализа способствует охлаждению спермы в равномерно-замедленном темпе. Как сообщают многие авторы — Милованов В.К., Нагорный Е.П., Столяров Я.МД1939); Паршутин Г.В.(1946), Платов Е.М.(1972) и др. спермин при таком режиме становятся менее чувствительны к перепаду температур, что благоприятно сказывается на подготовке спермы к замораживанию.

Таблица 2

Выживаемость спермиев после замораживания и оттаивания в зависимости от времени диализа спермы при комнатной температуре (п«8)

Показатели Время диализа спермы при комн. температуре, в часах

0 1 2 3 4

Первоначаль-ная.подвижн.спермиев 4,8+0,3 4,8±0,3 4,8+0,3 4,8+0,3 4,'8+ОД

Подвижность спермиев после диализа 4,0±0,3 4,6±0,3 4,8+0,3 4,8±0,3 4,3+0,3

Подвижность спермиев после оттаивания 1,0±0,1 1,9+0,1 2Д+0Д 2,0+0,1 2,0+0,1

Переживаемость при 0°С после оттаивания в часах 62±8 121+12 140+22 132±18 105+19

Температура спермы 'С ■ 37 24 19 10 2

Как известно, скорость диализных процессов, основанных на законах диффузии, в большой мере зависит от градиента концентрации: чем выше разность концентраций вещества по обе стороны мембраны, тем быстрее проникают молекулы или ионы из р; v opa с большей концентрацией в раствор с меньшей концентрацией. Опираясь на это положение,мы предприняли попытку

ускорять процессы дялллзд отевмг! за с-:сг у-уппсиия хопцентргщгш гсогшопептоз ЛлЦ*л срздм.

В пашем опыте позишснпе концентрацпи одного или нескольких вещесто среды Стабл.З) не принесло улучшения качества спермы после замораживания и оттаивания (табл.4). Во всех случаях наблюдали снижение подвигшости и перезхиваемости спермиев по сравнению с контрольным вариантом, а котором все компоненты среды находились в обычной концентрации.

Вранном опыте мы выяснили, что при диализном способе введения защитных компонентов в¡сперму, так же как и при оиычном разоавлении. большую ролъ нграет концентрация компонентов среды или ее бсмомоЛяр-ность. Повышение концентрации компонентов среДы привело к увеличению осмотического давленняраозора, чТо неблагоприятно отразилось на качестве спермы после ее диализноиобработки.

На скорость диализных процессов оказывают влияние такйе факторы как высота стоя диалнзируемои жидкости на поверхности мембраны и режим встряхивания.

Таблица 3

Варианты ЛХЦЖ-среды для диализа

№ варианта Лактоза, г Хела-тонх Натрия биаарбо- нат <4,2%р-р) мл Цнтрзт натрия (35,7% Р Р) М!Л Желток,г

I-контроль 11 0,1 0,2 0,25 1,6

2 11 0,2 - 0,4 0,5 1,6

3 11 0,4 0,8 1,0 1,6

4 13 0,1 0,2 0,25 1,6

' 5 13 0,2 0,4 0,5 1,6

6 13 0,4 0,8 1,0 1,6

7 15 0,1 0,2 0,25 1,6

8 15 0,2 0,4 0,5 1,6

9 11 0,1 0,2 0,25 4,0

10 И 0,1 0,2 0,25 3,0

AJ CiíJÜr-'.ZJU.'J.^l^ 1/íU.Uu bJL/.J ¿ i-J ----

выживаемость сосршш:; посла самоуаш^аппи ь оттаивания была и том случае, если с~сога ела.: спср:.ш на пленке не превышала 10 ыы. Встряхисахше диализатора достаточно проводить не рс;;:с I pasa с 10-15 i,лшут.

Во всех вышеперечисленных опытах с качестве полупроницаемой мембраны мы использовали гидрат-целлюлозную пленку АБ-20. В дальнейшем была испытана еще одна мембрана с размером пор не более белковой молекулы - плешах типа «купрофан», применяемая в аппарате «искусственная почка». Исследование показало, что при диализе спермы жеребца с равным успехом можно использовать обе эти мембраны.

Таблица 4

Вьшиваеыость спгршгез пасла оттшешшя б гаеискмасги от соя-" центрзцш! еошюкшгоз диализной ергдн (с-10)

Na варианта среды Подвагкость сперилез в баллах ПерЗЕшгаг-ксстьпраО'Св часах !

пергдзамо-{шатанием П0СЛ2. еттгяпапшг

1-контроль 4,7*0,3 2,310,17 ióS±I6

2 4,6+0,12 2,Ш21 150+15

3 4,6±j0.18 2,0+0(27 134+13

4 4,0+0,57 1,610,23 104+12

5 3,0t0,24 1,2¿0,32 9ó±10

6 3,0+0,24 1,0+0,12 78+8

7 4,3+0,52 1,0±0,02 76+6

8 2,5*0,14 0,5+0,14 36+4

9 4,Q±0,32 1,5*0,18: 108±11

10 4,1±0,25 1,7+0,24 124+12

Изучение динамики еошшкентов среды в процессе диализа

На следующем этапе исследований по диализу спермы жеребца была проведена серия опытов по определению скорости диффузии компонентов среды в сперму через полупроницаемую мембрану. С целью уточнения условий диализа устанавливали какие компоненты среды

Г» I 'Г'Г

За 1С0% ППСПЩ2ППЯ спстмп б:ш> щппггго тг.ггс.; чолнчсстзо,.гщссп:а, шз:х :;отором па(шодалссь_рзвпо-песпе по обе стоггопы'мемор^пы. ьыли устапсгалепп отиссптелыше и абсолютные гшпшш для каддого гсом-аоиеита.

В первую очеседь еплщелплп проникновение

аидко, что. наивысшая скорость' поступлеетш ла:сгозы п сперму насщрдалзсь^з первыи час диализа.!! составила з среднем э57Г от общего поступления. На следующих этапах диализа скорость проникновешш этого сахара снижалась. К. концг 4 часа диализа равновесие еще не пало, но количество лактозы вг сперме составило /0 от ошдего поступления, или 7,4 г на ТОО мл. Такое шчество лактозы добавляется в сперму при ее разбавлении ЛХЦЖ средой в соотношении 1:3.

Скорость диффузии еокпсгггатсз пз среды в сперму а процессе дваяяза

спермы 100 90

70

60 50 40 30 20 10 о

4 час

Условные обозначение Лактоза— -

Глицерин- — • —

рн- ---

График 1

При определении количества глицерина установили, что скорость проникновения этого трехатомного спирта в сперму уже за первый час диализа составила 96% от его

общего поступления. К концу диализа .количество, криопротектора и в среде, п сперме составило 2,3 %. Такое же количество глицерина добавляется в сперму, при ее разбавлении ЛХЦЖ средой в соотношении 1:4. ,

Таким образом, при диализе происходит насыщение спермы сахаром - лактозой и криопротектором -глицерином в количестве, достаточном для проявления их защитных свойств.

Такие компоненты среды как бикарбонат натрия, цитрат натрия, хелатон (трилон Б) создают кислотный буфер с рН 6,35. О проникновении этих компонентов в сперму судили по изменению показателя концентрации водородных ионов. -

Свежеполученная сперма жеребца имеет щелочную реакцию. В наших опытах значение рН составило в среднем 7,4. В процессе диализа мы наблюдали постепенное подкисление спермы. К концу обработки рН спермы имело значение 6,5. Такое же показание рН отмечалось одновременно и в среде.

При диализе так же, как и при разбавлении спермы, создается слабокислая реакция, переводящая спермии в малоактивное состояние, что способствует повышению их устойчивости к воздействию холода.

В следующем опыте (табл.5) была испытана проникающая способность компонентов желтка через поры диализной мембраны. В литературе имеются противоречивые данные относительно места введения желтка куриного яйца при диализной обработке спермы. Ван Де-марк (1959) добавлял желток в диализную среду. Кононов В.П. и др. (1987), Галич В.И.0 989) вводили желток непосредственно в сперму. Нами апробированы оба варианта. Кроме того, добавляли желток и в сперму и в среду одновременно.

Из таблицы 5 видно, что введение желтка только в диализную среду снижало устойчивость спермиев к замораживанию по сравнению с контролем, в котором желток находился непосредственно в сперме. Увеличение • желтка в диализной среде до 15-20% хотя и улучшало показатели выживаемости спермиев после замо-.раживания - оттаивания, но они не достигали уровня контроля. Наилучший результат выживаемости спермиев после криоконсервации был в том случае, когда желток добавляли одновременно и в сперму ив среду в количестве 1,6-2, О г на 100 мл.

• Низкий криопротективный эффект пои введении желтка только в диализную среду объясняется тем. что основными защитными свойствами обладают высокомолекулярные компоненты желтка-фосфолипиды (Мило-ванов В.К., Семенова В.А., 1985), которые не могут попасть в сперму через поры полупроницаемой мембраны.

Снижение защитного действия желтка при введении его только в сперму можно объяснить тем, что низкомолекулярная часть желтка переходит через поры мембраны в другую камеру, уменьшая защитное действие цельного желтка.

Таблица 5

Действие желтка при диализе на выживаемость спермиев после

оттаивания

Кол-во желтка (г) на 100 мл Подвижность спермиев, баллов Пережнваемость при 0'С в пасах

в среде в сперме до замораживания после оттаивания

— 2,0 4,2+0,3 2,2+0,1 150+16

1,6 2,0 4,2±0,3 2,4+0,2 162±11

1,6 — 4,0±0,2 1,3+0,1 96±10

4,0 ■ — 4,0+0,3 1,5+0,2 108+1I

8,0 — 4,1+0,2 1,7+0,2 132+12

15,0 — 4,2+0,3 2,0±0,2 138+11

| 20,0 — 4,1+0,3 2,0±0,1 | 114+18

В данном опыте были подтверждены наблюдения многих авторов (Блекшоуидр. 1957, Мартин 1963. Платов Е.М., Шевцова А.А.,1967, Милованов В.К., Семенова В.А., 1985), что живучесть спермиев в средах с цельным желтком значительно выше, чем в средах с компонентами, извлеченными из желтка.

При обобщении опытов по диффузии необходимо отметить, что все защитные компоненты ЛХЦЖ среды, кроме желтка, свободно проходят через поры диализной мембраны в сперму, создавая криопротективный эффект, как при обычном разбавлении. Разница между этими двумя способами заключается в скорости поступления защитных веществ в сперму.

Определение качества диалнзированнон спермы

В сравнительном опыте (табл.6) было установлено что сперма после диализной обработки имела ус .тойчивость к воздействию низких температур на уровш не ниже контрольной спермы, разбавленной такой же средой. Подвижностьспермиев до и после замораживания не отличалась в опытных и контрольных образцах. Отмечено некоторое повышение переживаемости диализированной спермы после замораживания-оттаивания по отношению к разбавленной сперме.

- Таблица 6

Выживаемость спермы после оттаивания в зависимости от способов обработки ее перед замораживанием (п=40)

Обработка спермы Подвижность спермиев в баллах Переживае-мость при 0'С в часах

перед замораживанием после оттаивания

Диализом 4,0+0,3 2,0±0,16 98+10

Разбавлением (контроль) 4,0+0,2 . 2,0+0,18 88+8,8

Таким образом, в результате диализной обработки удалось сохранить высокие качественные показатели спермы после замораживания-оттаивания, не прибегая к разбавлению и, тем самым, не увеличивая объема спермы.

Кроме того, после диализной обработки было отмечено дополнительное загущение спермы на 35 % от первоначального объема эякулята. Причем, степень сгущения спермы увеличивалась при повышении концентрации лактозы в диализной среде, однако лучшая выживаемость спермиев наблюдалась при обычном содержании лактозы (11 %).

Процесс диализа приводил к частичному обезвоживанию спермы за счет оттока жидкой части плазмы. При этом, соответственно, повышалось количество спермиев в единице объема. В итоге происходило концентрирование спермы без применения других специальных методов. Диализная обработка спермы жеребца позволила снизить объем дозы спермы для замораживания с 25 мл до 5 мл, то есть в 5 раз за счет ликвидации процедуры разбавления, и дополнительного сгущения спермы.

Заллим'пог'.аттеле:! пг.нсстпп с.цуу.-м слу::::;т г'пгсрсбпап аагттзпсппссп,. Прл могггролс оагстсриалыюи сбсеменешюстл зыпашлссь. что "ол.чпсстгго мпгсрсор-ганнзмол з 1 .чл спермы, обработанной методом дналмза, уменьшаюсь по сраонепшо со ссепепзптоп спермой, хоти и произошло зап/шенпе объема. В ¡ггоге оощео содержание баетерпГ; з дозе диалмзпропашюй спермы оказалось з дпа раса шгле, нем а дозз рзсблзлешюп спермы (табл.7).

Тгблшхз 7

Мгпфс^язя есгггз^ЗПЦЛЗ сгггргпл <гг»12)

Обработка спсркы Кол-со Еякрс&газ тедвмд СЗгсмдогы ил М1Пфс5пая за-фззнгикостъ дозы, М.Т.

Спер«а С2влг-получеаяаа 1392±2Сб

перед замо- ра^нгаапем 1638+192 5 3190

• посте . оггапзаняя 1418+192 5 7090

Сперма разбавленная по ГОСТ (кентро.ть)

перед замораживанием 7*1+74____- 25 18775

после оттаивания 613±!03 25 15325

Изучение влияния на криоустойчпасстт» спгршгез добавок молока в диализную ергду

Несмотря на высокие защитные свойства ЛХЦЖ среды, около 50% спермиев погибает в процессе замораживания-оттаивания. Поэтому перед нами стояла еще одна задача —повышение криоустойчивости спермиев. Для этого в состав диализной среды было введено молоко, основываясь на его высокой биологической ценности. Молоко вводили, в среду, полностью или частично заменяя раствор лактозы. Как видно из таблицы 8, повышение устойчивости спермиев к замораживанию за счет молочных добавок в среду не было достигнуто. Напротив, при

сперм:::» ъогга кззетг^

концешргараг Ездзрздаыя кокос с срцдк^дш: дахлгга оказалось, что кололо сденг&л© рй б щзггочнуш

сторону. Это отрщатешгзэ езшеедэ ез Е^^з^гкогть спермиев.

Содержание молока в среде, % рН среды Поз^гж^гк» сш^Ежгаз- Б Пгргззпзйе-г^сгть при 0'С в часах

пгргд згмо-раикзгякзл кгглг О А* «1

0-конт-роль 6,4 ЗШЛ адьзд П2+9

10 6,4 3,8+0,1 2ДН&.1 116+15

20 6,6 3,8+0,2 1,8+0,2 96+16

30 6,8 3,8+0,1 1,710,1 85+13

50 7,0 3,7±0Д 84±14

100 7,3 3,6±0,2 1,5+0,1 82+16

Определение ошгадотаорззощзй спосо6шсга спермы жеребца,

обработанной нгтодога дйэлшз вг|ЗДза&ора2ашщием

Первый предварительный опыт по осеменению был поставлен на кобылах экспериментальной конюшни ВНИИ коневодства еще в 1988 г. Были осеменены 2 кобылы спермой жерЛакмуса, диализярованной перед замораживанием, обе зажеребели.

Основной опыт был проведеав 4-х конных заводах на 55 кобылах. В опытной группе зажеребляемость составила 44,4%, в контрольной - 35,7% (в одном половом цикле).

Как следует из данных таблицы 9 в целом показатели ошюдотворяемости кобыл в опыте были несколько выше (на 8,7 %), чем в контроле. Вместе с тем общий результат по зажеребляемости был невысок из-за качества спермы жеребцов, намороженной в конце случного сезона.

В 1992 году было продолжено осеменение кобыл з производственных условиях в Александровском кпнноч заводе спермой, Анализированной перел анморахнваннем от жер.Сиднея. Зажереоляемость кобыл окапалась дале выше, чем в предыдущие годы и составила 50';;, (из 14 осемененных кооыл 7 жеребых)

Таблица Ч

Результаты осеменения кобыл

Конный завод Кличка жеребца Опытная группа Контрольная группа

осей, кобыл заже-ребе-ло %же-ре-бых осем. кобыл заже-ребе-ло % жеребых

Гомельский Регби Стар 7 3 42,8 7 2 28,5

Уфимский Регби Стар 3 1 33,3 3 1 33,3

Александровский Регби Стар 10 4 40,0 11 4 36,3

им.Будениого Изюм 7 4 57,0 7 3 43,0

Итого 27 12 44,4 28 10 35,7

Таким образом, обработка спермы жеребца методом диализа перед замораживанием позволяет сохранить оплодотворяющую способность на уровне, приемлемом для практики.

ВЫВОДЫ

1. В результате проведенных исследований разработан диализный способ подготовки спермы к замораживанию , способствующий повышению эффективности использования в коневодстве криоконсервированной спермы ценных жеребцов-производителей.

2. Введение криозащитных веществ в сперму с помощью диализа позволяет сохранить устойчивость спермнев к замораживанию на уровне спермы, разбавленной по ГОСТ.

3. При диализной обработке возрастает концентрация спермиев за счет сгущения ее первоначального объема на 35%.

4. Использование диализа даст возможность сократить объем дозы спермы жеребца для замораживания в 5 раз без применения специальных методов.

5. Оптимальный режим и условия проведения обработки спермы методом диализа заключается в использовании ЛХЦЖ среды обычной концентрации б пропорции 1:4 общей продолжительности процесса в течение 4-х часов.

6. Диффузия защитных компонентов среды при диализе идет в количествах, достаточных для крмозащиты спермиев.

7. С помощью диализной обработки достигнуто снижение бактериальной загрязненности дозы спермы в 2 раза, в сравнении с разбавленной спермой.

8. Добавление молока в диализную среду не способствовало повышению устойчивости спермиев при замораживании.

9. Оплодотворяющая способность диализированной перед замораживанием спермы жеребца сохраняется на уровне, приемлемом для практики.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для Производства подготовлены м утверждены методические рекомендации по диализному способу обработки спермы жеребца перед замораживанием.

Снижение объема дозы спермы жеребца для замораживания в 5 раз соответственно позволяет уменьшить потребность в дорогостоящих хладоагёнтах и криогенных емкостях. При этом повышается экономическая эффективность хранения и транспортировки консервированной спермы. Такое преимущество обеспечит более широкое использование гдубокозамороженного семени жеребца для ' решения задач племенной работы. ,

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОХПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ . *

1. Андрюшин В.В., Науменкова В.А. Использование диализа при замораживании спермы жеребца//Ин-

2. Наумепхоза З.А. Диффузгзп лзстозд прп дпэлшз спермы тхергбцп//Ссстоаш!С нссяедопшшй п путл соггр-шеистпопапип методов селекции я тсхпологпп яснеподет-ва/Тезпсы докладов конференции молодых учепнх. ТВНИИК, 1990.-С.45-47.

1 3. Науменкова В .А. Некоторые сопрссы крподро-текции при диализе спермы леребца//Hönes п те:шсъ логаи коневодства а коннозаводства/Сб.пауч.тр.™ ВНИИК, 19S0.-C.70-75.

4. Науменкова В.А. Сгущение семени иеребцэ с помощью диализа//Путп повышения племенных» спортивных, рабочих п продуктивных качеств лошадей/С^.научлр.-ВНИИК,-1992.-С. 126-130.

5. Андрюшии В.В., Науменкова В.А. Влияние молока на спермин зеребца при введения в диализную среду перед заморашгоатгем//Пути повышешш племенных, спортивных, рабочих н продуктивных качеств яоша-ден/Сб.науч.тр.-ВНИИК, 1992.-С. 122-125.

6. Науменкова В.А.Методические подходы к вопросу уменьшения объема дозы при крноковсервацин спермы жеребца//Проблемы племенной работы и экологически чистых технологий в коневодстве/ Сб.науч.тр.~ ВНИИК,-1994.-С.296-305.