Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ отечественных и зарубежных подходов к проблеме замораживания спермы жеребцов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ отечественных и зарубежных подходов к проблеме замораживания спермы жеребцов"

На про зах рукописи

акг

ВАСИЛЬЕВА Ольга Валонгииокша

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ОТЕЧЕСТВЕН« ЫХ И ЗАРУБЕЖНЫХ ПОДХОДОВ К ПРОБЛЕМЕ ЗАМОРАЖИВАНИЯ СПЕРМЫ ЖЕРЕБЦОВ

03 00.13 — физиология

ООЗОБЭОТЗ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Рязань - 2007

003059073

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийское шучно-исследовательском институте коневодства Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Наумеикова Валентина Алексеевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, доцент

Баковецкая Олыга Викторовна

кандидат биологических наук Адамковская Марина Викторовна

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Московская

юс/дарственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им К И Скрябина»

Защита состоится мая 2007 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 220 057 01 при Рязанской государственной (елъскохозяйственной академии имени п рофессора П А Костычепа по адресу: 590044, г Рязань ул Костычспа, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Рязанской государственной сел[.скозсозяйственной академии им профессора П А Кослы-чева

Автореферат разослан .тречя 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Н И Морозова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБО ГЫ

Актуальность исследований В последние I оды ] юссийские ко-невладельцы все чаще стали использовать криоконсервированнуго сперму жеребцов, ввезенную из западных стран, и покупать дорогостоящее оборудование для ее замораживания Это даег возможность получить потомство от высококлассных жеребцов, нахо дящихся в Европе или Америке и замораживать сперму российски?; жеребцов по зарубежной технологии, в т ч и по Ьооппя Р , 1983 Это наиболее типичная технология замораживания спермы жеребцов, которая используется за рубежом Кроме того, привлекает простота и удобство перевозки спермы в миниобъемах (0,5 мл) Хранение такой спермы также не требует больших расходов дорогостоящего хладоаген га

В нашей стране, несмотря на разработку способов замораживания спермы в малых объемах (5 мл), до сих пор широко используется метод криоконсервации в больших объемах (20 мл) Этот метод хорошо зарекомендовал себя в практике в связи с простотой исполнения, недорогим оборудованием, получением стабильных результатов Но его недостатком являются большие обьемы спермодоз, неудобные при хранении и перевозках, и затраты на дорогостоящий хпадоагент Актуален вопрос в чем состоит суть различий этих технологий, и какая из них предпочтительнее с точки зрения результативности, простоты исполнения и экономии затрат

Представленная к защите диссертационная работ .1 выполнена в соответствии с тематическим планом ГНУ ВНИИ коневодства по программе отделения зоотехнии Россельхозакадемии (тема 06 02 02 01, номер государственной регистрации 15070 7815014664 06 8 005 4)

Цель и задачи исследований. С целью выявлении наиболее эффективной технологии, провести сравнение трйх методов замораживания спермы жеребцов (одного зарубежного и двух отечественных), а также изыскать возможность унификации технологии :,амораживания спермы в малых объемах

Для достижения цели были поставлены следующтк ■ задачи

1 Сравнить факторы и приемы на этапах (разбавления, удаления надосадочной жидкости, разными способами фасовки) при использовании трех технологий замораживания спермы, позволяющие получить максимальную активность и выживаемость сперма1- озоидов после оттаивания

2 Изучить морфологию сперматозоидов, находящихся в разных фракциях после центрифугирования спермы

3 Сравнить оплодотворяющую способность спермы жеребцов, замороженной по разным технологиям (отечественной технологии Науменкова А И, Романьковой НК, 1971 и зарубежной технологии Ьооггиб Р, 1983)

4 Испытать новые варианты и технологические приемы замораживания спермы и малых объёмах, в сравнении с технологией по Фоминой ЕЛ , 1988г иЬоопш; Р , 1983г

5. Выявить возможность уменьшения объема дозы по отечественной технологии замораж1шания спермы жеребцов (Науменков А И , Романькова Н К , 1971)

6 Провести сравнительный анализ экономической эффективности рглных технологий замораживания спермы жеребцов

Научная новизна. Впервые было проведено сравнение отечественных и зарубежной технологии замораживания спермы по качественным показателям спермнев, по оплодотворяющей способности и экономической эффективности

Впервые получены данные по морфологии спермиев различных фракций цешрифугата

Вперьые выявлена взаимозаменяемость различных приемов и разбавителей при использовании отечественной и зарубежной технологии.

Впервые проведён опыт осеменения кобыл разными по объему дозами замороженной спермы 5-10мл и 20мл (по отечественной технологии Науменкова А И , Романьковой Н К , 1971)

Теоретическая и практическая ценность работы. При сравнительной оценке отечественных и зарубежной технологий замораживания спермы жеребцов выявлены отрицательные и положительные стороны этих технологий Изучена морфология сперматозоидов, находящихся в разных фракциях центрифугата

После сравнительного анализа экономической эффективности выявлены преимущества отечественных технологий замораживания спермы жеребцов

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научной конференции во ВНИИ коневодства (2005г ), в Костанае (Казахстан, 2006г), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов в РГСХА им Костычева П А (2006г) По материалам диссертации опубликовано 7 статей Положении, выносимые на защиту:

1. Качественные показатели спермы, оплодотворяющая способность и экономическая эффективность отечественных и зарубежной технологий замораживания спермы жеребцов

2 Морфологическая характеристика сперматозоидов б осадке и надосадке после центрифугирования спермы

3 Возможность взаимозамены разлишых приемов и разбавителей в отечественной и зарубежной технологиях

4 Объём осеменения разными дозами замороженной спермы в отечественной технологии

Структура и объём работы. Материал изложен на 120 страницах компьютерного текста, содержит 17 таблиц, 13 рисунков, 2 схемы и 2 фотографии Диссертационная работа включает следующие разделы введение, обзор литературы, материал и методика, результаты собственных исследовании и их обсуждеггие, выводы, практические предложения Список литературы содержит 168 источников, в гом 1,испе 98 на иностранных языка>

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальные исследования по теме диссертации проведены в лабораторигг физиологии размножения ВНИИ коневоде гва, Ло-котском конном заводе Брянской области, ООО «Русь» Липецкой области, Рязанском конном заводе и в отделе биологии воспроизводства ВНИИГРЖ (г Пушкин, Ленинградской области) в период с 2004 по 2006гг

В опытах была использована сперма жеребцов-производителей, содержащихся на экспериментальной конюшне ВНИИ коневодства и жеребца-производителя Локотского конного завода Кормление гг содержание жеребцов-производителей соответствовало установленным нормам и требованиям к выращиванию племенных лошадей

Сперму от жеребцов бргшгг два раза в неделю на искусственную вагину, в соответствии с «Инструкцией по искусственном'1/ осеменению кобыл» (1969)

Для разбавления спермы замораживаемой по отечественным технологиям (технология Науменкова А И , Романьковой 11 К., 1971 и технология Фоминой ЕЛ, 1988) использовали лактоза-хелато цитратно-желточную среду (ЛХЦЖ) в соотношении объемов 1 3

Для разбавлеггия спермы замораживаемой по зарубежной техно лопш (по Ьоопш Р , 1983) использовали два разбавителя по центри фугирования (глюкозо-ЭДТА) и после центрифугированич (глюкозо ЭДТА с лактозой) в соотношении объемов 1 1

Проведено сравнение трех технологий замораживания спермы жеребцов

-зарубежной технологии по Ьоопнб Р , 1983г (предварительное разбавление спермы перед центрифугированием 1 1, центрифугирование при 3000 об/мин в течение 7-8 минут и удаление 90% надосадка, второе разбавллгае спермы 1 1, фасовка в соломины по 0,5 мл ),

- отечественной технологии по Фоминой Е Л , 1988г (центрифугирование без предварительного разбавления спермы при 1500об/мин в течение 15 минут и удаление 50-60% надосадка, разбавление спермы ГЗ и фасовка в алюминиевые тубы по 5-6мл),

- отечественной технологии по Науменкову А И , Романьковой Н К, 1971 г (без центрифугирования, разбавление спермы 1 3, фасовка в алюминиевые тубы по 15-20 мл)

Сравненге проводили по показателям активности и выживаемости сперматозоидов после оттаивания 1-ый этап - разбавление, 2-ой этап - удален»; надосадочной жидкости, 3-ий этап - способы фасовки

Хранили замороженную сперму в жидком азоте при температуре -196°С

Исследовали морфологшо сперматозоидов в разных фракциях центрифугата ,Цля этого после проведения процедуры центрифугирования спермы и разделения центрифугата на 2 фракции - надосадочной жидкости (плашы) и самого осадка сперматозоидов - проводили исследование сперматозоидов по подвижности, выживаемости и морфологии клеток (подсчитывали процент нормальных и патологических форм) При уч( те патологических сперматозоидов отдельно подсчитывали различные виды нарушений клеток, такие, как целостность акро-сом, количество патологических головок, нарушение в хвостовой части сперматозоидов и отсутствие хвостов Качественные показатели сперматозоидов надосадочной жидкости и осадка сравнивали между собой в процентном отношении

В опыте по сравнению оплодотворяющей способности спермы жеребца, замороженной по разным технологиям, для осеменения отобраны группы I инекологически здоровых, проверенных по пподовито-сти кобыл тра б.ененской породы Кормление и содержание опытных животных соответствовало зоотехническим нормам 6 кобыл осеменены по отечесп ¡енной технологии Науменкова А И , Романьковой Н К и 5 кобыл но зарубежной технологии Ьоопнб Р На осеменение кобыл расходовали одну дозу спермы, замороженной по отечественной технологии (15-20мл) или несколько соломин (6-12) по 0,5мл спермы, замороженной по зарубежной технологии

Результат зажеребляемости определяли ректальным методом через 45-60 дней после овуляции

Отрабатывали новые технологические приемы замораживания спермы в малых объемах на основе двух комбинаций, в !ятых из отечественной технологии по Фоминой ЕЛ , 1988г и зарубежной технологии Ьоопнз Р., 1983г

По показателям активности и выживаемости после оттаивания поставлено 2 опыта.

Схема 1

В опыте по сравнению результативности разных объемов замороженной спермы по отечественной технологии Науменкова А И , Ро-маньковой Н К , для осеменения подобраны группы гинекологических здоровых кобыл русской тяжеловозной породы Кобылы были разделены на две группы по принципу аналогов (по 4 кобылы в каждой группе) В первой группе осеменение проводили спермой, расфасованной по 5-10 мл, во второй группе - по 20 мл Осеменение кобыл начинали при 3-ей стадии созревания фолликула и продолжали до овуляции, через каждые 12часов

Учег зажеребляемости кобыл проводили методом вымывания эмбрионов на 8 день после овуляции

Биометрическую обработку полученных данных проводили по Плохинскому Н А (1978)

В дальнейшем технологии замораживания спермы жеребцов будут обозначайся сокращенно

Технология но Науменкову А И, Романьковой НК (1971) — (Н) Технология по Фоминой Е Л (1988) - (Ф) Технология по Ьоопнб (1983) - (Ь )

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Сравнение разных технологий замораживания спермы жеребцов Сравнение при подготовке спермы к замораживанию проводили поэтапно (разбав пение, удаление надосадочной жидкости, способы фасовки) по показателям активности и выживаемости сперматозоидов после оттаивания

1-ми этап - разбавление

Данные по влиянию степени разбавления спермы на ее показатели после оттаивания представлены в таблице 1

Таблица 1

Влияние степени разбавления спермы на ее показатели после ______оттаивания (п~=10) ___

Технология заморажиЕания Ьсопш Р, 1983 Фомина 1988 Наумен-ков 1971

Среда для разбавления глюкозо-ЭДТА с лактозой ЛХЦЖ

Степень разбавления 1 1 1 2 1:3 1 4 1 3 1 3

Показатели спермы после оттаивания

Активность (баллы) 2,0± 0,15** 2,?± 0,16 2,5± 0,18** 2,5± 0,17 2,6± 0,18** 2,6± 0,19**

Выживаемость (часы) 104± 10*** 144± И 178± 16*** 154± 12 175± 15 *** 169± 13 ***

'**•* р >0,999 по выживаемости, ** Р >0,99 по активности

Из таблицы 1 видно, что по зарубежной технологии (Ь) показатель активности спермы после оттаивания соответствует 2 баллам, а выживаемость 104 часам, если сперма разбавлена после центрифугирования средой ггаокозо-ЭДГА с лактозой 1 1 Самый высокий показатель активности спермы после оттаивания по зарубежной технологии равен 2,5 баллам, а выживаемость 178 часам, здесь степень разбавления соответствует 1 3 Разница достоверна по активности спермы (Р>0.49) и высокодостоверна по выживаемости (Р>0,999) При степени

разбавления 1 4 показатель активности спермы остался на том же уровне, а выживаемость снизилась на 24 часа, т е на сутки

На этапе разбавления отечественные технологии замораживания спермы (Ф) и (Н) по показателям активности достоверно (Р>0,99) и выживаемости высокодостоверно (Р>0,999) превосходят зарубежную технологию

2-ой этап - удаление надосадочной жидкости Кроме влияния степени разбавления спермы, на результат замо раживания, мы определили влияние удаления разного количества на досадочной жидкости (таблица 2)

Таблица 2

Влияние удаления разного количества надосадочной жидкости спермы после центрифугирования на её покаттели после от-

таивания (п=10)

Количество уда- Активность Активность Вьысивгс мость

лённой надосадоч- перед замора- после оттаива- после оп айв шия

ной жидкости -(%) жив (баллы) ния 1 баллы) (часы)

ЗАРУБЕЖНАЯ ТЕХНОЛОГИЯ (ЬОО!\Ш Р )

90 4.0 2,2й±0,19 144±11>**"

80 4,0 2,25±0,18 162&12**"

70 4,0 2,25±0,21 142±11

60 4,0 2,12±0,22 113-1:14

50 4,0 2,12±0,23 107.Ы 1

ОТЕЧЕСТВЕННАЯ ТЕХНОЛОГИЯ (ФОМИНА ЕЛ )

90 40 2,3'Ш),13 240±22

80 4,0 2,3''±0,13 259^26

70 4,0 2,37±0,13 258±27

60 4,0 2,4±0,11 2б0±2 5***

50 4,0 2,4±0,11 270±20**"

ОТЕЧЕСТВЕННАЯ ТЕХНОЛОГИЯ (НАУМЕНКОВ А И., РОММИ.КОВА IIК )

- 4,0 2,4±0,15 270±19***

***Р>0,999 по выживаемости

По результатам нашего опыта (таблица 2), оптимальным являет ся удаление 80% надосадочной жидкости При удалении 80% надоса дочной жидкости по зарубежной технологии (Ь), активность спермы посте оттаивания составила 2,25 балла, а выживаемость 162 часа А при удалении 90% надосадка. как рекомендуют зарубежные авторы,

активность cocí авила также 2,25 балла, но выживаемость снизилась до 144 часов, теш 18 часов

По отечественной технологии замораживания семени в малых объёмах (Ф ) рекомендуется удалять до 50-60% надосадка Наши опыты подтвердил!i эти рекомендации При удалении 50-60% надосадка, активность спермы после оттаивания в данном опыте составила 2,4 балла А выживаемость спермы после оттаивания при удалении 60% составила 260 часов, а при удалении 50% - 270 часов

Технология (Н) по показателям активности и выживаемости спермы после оттаивания составила 2,4 балла, а выживаемость 270 часов

Из табли] [ы 2 видно, что по зарубежной технологии (L) с увеличением удаления надосадка увеличиваются и показатели спермы после оттаивания, за исключением 90% удаления надосадочной жидкости В отечественной технологии по (Ф), наоборот, при уменьшении удаления надосадочной жидкости увеличиваются показатели спермы после оттаивания Это говорит об экономичности отечественной технологии с малым объёмом

Сравнивав технологии между собой по показателям активности и выживаемое? а спермы после оттаивания на этом э гапе (таблицы 2), видно, что отечественные технологии замораживания спермы превосходят зарубежную технолоппо Разница высокодостоверна по выживаемости спермы (Р>0,999) По активности разница не достоверна

Далее мы определили количество удаленных с надосадком сперматозоидов в технологиях (Ф ) и (L ) Начальная концентрация спермы жеребца 400млн/мл Эти данные представлены в таблице 3

Таблица 3

Определение % удаленных сперматозоидов при удалении разного количества надосадка по отечественной и зарубежной технологии.

п=10

Количество удалённого надосадка-% Количество спермиев в удаленном надосадке, (млн/мл / %)

по Фоминой по Loomis

90 54/12 78/30

80 38/8 53/20

70 28/5 45/15

60 26/4 31 / 10

50 16/2 26/6

В таблица 3 показано, что при подсчете концентрации сперматозоидов надосадочной жидкости в камере Горяева оказалось, что по зарубежной технологии замораживания спермы (Ь) при удалении 90%

надосадка удаляется 30% сперматозоидов По результатам нашего опыта, при оптимальном удалении по технологии (Ь ) П0% надосадка удаляется 20% сперматозоидов По отечественной технологии (Ф ) при удалении 60% надосадка удаляется 4% сперматозоидов А при удалении 50% надосадочной жидкости удаляется 2% сперматозоидов

Во всех 5 вариантах при удалении надосадка по зарубежной технологии (Ь) удаляется в два раза больше сперматозоид >в, чем по отечественной технологии (Ф) По результатам этого опита можно судить об экономичности отечественной технологии замораживания спермы жеребцов по (Ф)

3-ий этап - способы фасовки Следующий этап - сравнение различных способов фасовки спермы. Данные по сравнению различных способов фасовки спермы представлены в таблице 4

Таблица 4

Сравнение различных способов фасовки спермы (п=10)

Технология замораживания Ьоогшэ, 1983 Фомина, 1988 Науменков Романькова, 1971

Фасовка спермы тубы Сотом тубы Солом тубы Солом

Объём (мл) 5 0,5 5 0,5 20 0,5

Показатели спермы после оттаивания

Активность 3,3± 3,35± 3,42± 3,48-1= 3,32± 3,22±

(баллы) 0,35 0,36 0,38 0,38 0,37 0,31

Выживаемость 241± 246± 260± 268± 252± 247±

(часы) 21 23 26 27 24 22

При сравнении различных способов фасовки спермы в тубах и соломинах (таблица 4) оказалось, что показатели спермы после оттаивания в рамках одной технологии сходны Можно криоьонсервировать сперму как в тубах, так и в соломинах в каждой отдельно взятой технологии Активность спермы после оттаивания по зарубежной технологии (Ь ) в соломинах равна 3,35 балла, а в тубах 3,3 балла Выживаемость спермы после оттаивания по (Ь) составила 246 ч асов, а в губах 241 час. В отечественной технологии замораживания спермы по (Ф.) активность после оттаивания составила в тубах 3,42 балла, а в соломинах 3,48 балла Выживаемость спермы после оттаивания составила в тубах 260 часов, в соломинах 265 часов По отечественной технологии замораживания спермы (Н) активность спермы после оттаивания со-

ставила в тубах 3,32 балла, в соломинах 3,22 балла, а выживаемость 252 часа и 247 часов соответственно Активность и выживаемость спермы улучшилась при фасовке в соломины по технологии (Ф) и (Ь ), разница статистически недостоверна По отечественной технологии (Н ) показатели спермы после оттаивания лучше при фасовке в губы, разница статистически не достоверна

Изуче ние морфологии различных фракций спермы жеребцов

после центрифугирования После поэтапного сравнения разных технологий замораживания спермы жеребцов, мы изучали морфологию различных фракций спермы в зависимости от технологической обработки Это необходимо для гого, чтобы выяснить, какого качества сперматозоиды находятся в осадке, которые мы в дальнейшем криоконсервируем, и какие сперматозоиды уваляются с надосадком по технологиям с центрифугированием. Данные по этим исследованиям представлены в таблице 5

Таблица 5

Качеет во спермы в зависимости от технологической обработки

(п=3)

Качественные показатели спермы

Фракция Активность, баллов Выживаемость, часов % Нор- % Паточоги-

спермы мальных спермиеа ческих егтермиев

Натииная 5,5 - 67,1 32,9

Зарубежная гсхнотогия Ьо.огшз Р (1983)

Надосадок 5,5 120 64,3 35,7

Осадок 5,5 132 60,0 40,0

Отечественная технология Фоминой Е Л (1988)

Надосадок 5,5 108 61,1 38,9

Осадок 5,5 144 57,5 42,5

Отечественная технология На\менкова А И, Романьковой Н К (1971)

Без центр 5,5 144 67,1 32,9

Из таблицы 5 видно, что больше всего нормальных сперматозоидов содержится в нативной сперме и в сперме замороженной по отечественной технологии (Н) (эта технология без центрифугирования) Проиент нормальных сперматозоидов составил 67,1%, а патоло-1 ических 32,9% В зарубежной технологии по (Ь ) этот показатель состава! 60% нормальных сперматозоидов и 40% патологических В сперме по отечественной технологии (Ф ) содержится 57,5% нормальных и 42,5 % патотогических сперматозоидов В надосадке после подготовки по зарубежной технологии в сперме содержится больше нор-

мальных сперматозоидов (64,3%), чем в нацосадке, полуденном по отечественной технологии (61,1%) После центрифугирован™ как в верхних, так и в нижних частях центрифугата появляется больший процент патологических сперматозоидов по сравнению с нативной спермой и спермой, замороженной по отечественной технологии (Н )

Кроме качества спермы в зависимости от технологнче! кой обработки, мы определили уровень и характер нарушений морфологии сперматозоидов по каждой технологии Данные представлены в таблице 6

Таблица 6

Уровень и характер нарушений морфологии сперматозоидов в зависимости от технологической обработки.

Обработка Нормальн Патолог Патопог Нарушен Отсутствие

спермы клетки, % акросо-мы,% головки,% в хвостовой части хвоста, %

Жеребец Малыш

Нативная 73,7 14,7 1Л 7,8 2,7

Зарубежная технология Ьоопш Р П983)

Надосадок 77,Ъ 14,3 1.0 6,9 0,5

Осадок 66,2 19,3 0,9 12,1 1,5

Отечественная технология Фоминой Е Л (1988)

Надосадок 67,4 20,4 1,4 8,6 2,2

Осадок 59,1 17,3 1,0 20,0 2,6

Отечественная технология Науменкова А И , Романысовой Н К (1971)

Бечцентр 73,3 14,8 2,0 7,4 2,5

Жеребец Нарзан

Нативная 60,9 10,2 0,5 26,5 1,9

Зарубежная технология Ьоопш Р (1983)

Надосадок 53,9 15,1 0,5 30,0 0,5

Осадок 52,2 15,8 0,5 31,0 0,5

Отечественная технология Фоминой Е Л (1988)

Надосадок 54,6 12,6 0,5 31,4 0,9

Осадок 57,0 13,8 0,5 26,0 2,7

Отечественная технология Науменкова А И , Романьковои Н К (1971)

Без центр 1 61,0 15,7 1 0,5 ! 21,45 1.35

При анализе уровня и характера нарушений морфологии сперматозоидов выявлено (таблица 6), что нарушения чаще всего встречаются в акросоме и хвостовой части С применением центрифу] ирования по технологиям (Ф ) и (Ь ) процент этих нарушений возрастает

В осадке центрифугированной спермы (у жеребца Малыша) по зарубежной технологии (Ь) выявлено 66,2% нормальных спермато-

зондов, а в надосадке 77,3% Значит, в надосадке соответственно встречается меньше патологий, чем в осадке

В осадке спермы, замороженной по отечественной технологии (Ф ), у этого жеребца 59,1 % нормальных сперматозоидов, а в надосад-ие 67,4% По отечественной технологии (Ф ) выбрасывается с надосад-юм на 2,8% нормальных сперматозоидов меньше, чем по зарубежной техно погни (Ь )

В осадке центрифугированной спермы (у жеребца Нарзана) по зарубежной технологии (Ь ) выявлено 52,2% нормальных сперматозоидов, а в надосадке 53,9%

В осадке по отечественной технологии (Ф ) у этого жеребца 57% нормальных сперматозоидов, а в надосадке 54,6%

При подготовке спермы по отечественной технологии (Н) без применения центрифугирования не выявлено изменений в уровне и характере нарушений морфологии сперматозоидов по сравнению с нативиой спермой

Сравнение оплодотворяющей способности спермы, криоконсерви-рованпой по разным технологиям. На следующем этапе исследоваггий мы проверили оплодотво-ряюш}то способность спермы жеребца, так как она является основным критерием качества спермы В таблице 7 представлены результаты искусственного осеменения кобыл спермой, замороженной по разным технологиям

Таблица 7

Эффективность осеменений кобыл спермой, замороженной но разным технологиям.

Технология замораживания Всего осеменено голов Результат осеменений

Холостых (гол/%) Жеребых (гот/%)

Науменкова А И, Ромашковой Н К 6 2/33 4/67

Ноопиб Р 5 3/60 2/40

Всего 11 5/45 6/55

В группе из 6 кобыл, осемененттых замороженной спермой по отечественной тех-нологии (Н), зажеребело 4 В группе из 5 кобыл, осемен£цны к спермой по зарубежной технологии (Ь ), зажеребело 2

Результаты этого опыта свидетельствуют о некотором преимуществе отечественной технологии замораживания спермы жеребцов, которая повысила оплодотворяемость кобыл на 27%

Разница по осеменению кобыл спермой, замороженной по разтгым технологиям, не достоверна

Испытание новых вариантов технологических npmeviOB замораживания спермы в малых объёмах После проверки оплодотворяющей способности, мы испытали новые варианты и технологические приемы замораживания спермы жеребцов в малых объемах Для этого были поставлены 2 опыта

Первый опыт замораживания спермы. После взчтия сперму разбавляли средой глюкозо-ЭДТА в соотношении 1 1, разливали в пробирки и центрифугировали Затем удаляли из пробирок надосадоч-ную жидкость в количестве 90-80%, а осадок разбавляли лактозо-хелато-цитратно-желточной средой (ЛХЦЖ) в соотношениях 1 1,1 2,1 3,1 4 Сперму после второго разбавления фасовали в 5мл тубы и замораживали

Второй опыт замораживания спермы. Нативную сперму разливали в пробирки и центрифугировали с последующим удалением 5060% семенной плазмы, разбавляли лактозо-ЭДТА—желточной средой 1 1,1 2,1 3,1 4 Затем сперму разливали в 5мл тубы и замораживали

Данные по унификации технологии замораживания спермы в малых объемах представлены в таблицах 8, 9

В первом опыте при разбавлении спермы 11,14 (таблица 8) получены низкие показатели спермы после оттаивания Активность спермы составила 2,37 балла, а выживаемость 72 часа и 90 часов соответственно Высокие показатели спермы после оттаиванля в перьом опыте получены при разбавлении I 2, 1 3 Активность спермы составила 2,8 балла, а выживаемость 112 часов и 114 часов соответственно По зарубежной технологии (L) активность спермы после оттаизания составила 2,33 балла, а выживаемость 88 часов По отечественной технологии (Ф) показатели спермы после оттаивания составили активность 2,37 балла, а выживаемость - 112 часов

Если сравнивать активность спермы после отташания ме>кд> технологиями, то, как видно из табтицы 8, в опытной технологии №1 этот показатель при степени разбавления 1 2 и 1 3 улучшился нд 0,43 балла по сравнению с отечественной технологией по (Ф ) и 0,47 балл;:, с зарубежной технологией по (L ) Разница не достоверна

Если сравнивать выживаемость спермы после оттаизашст мехду технологиями, как видно из таблицы 8, в опытной технологии №1 этот показатель при степени разбавления 1 3 улучшился в среднем на 2 часа по сравнению с отечественной технологией по (Ф ) и на 25 часов по

сравнении > с зарубежной технологией по (Ь) Разница статистически не достоверна

Таблица 8

Сравн ение опытного варианта №1 замораживании спермы с исходными технологиями по (Ф.) и по (Ь.) по ее показателям после

оттаивания (п-10)

Технология Первый опыт Фомина, 1,ООГП15,

замораживания 1988 1983

Среда для разбавления Лактозо-хелато-цитратно-желточная (ЛХЦЖ) ЛХЦЖ Лактозо-ЭДТА-жел-точная

Степе иь разбавления 1 1 1 2 1:3 1 4 1 3 1 1

Показатели спермы после оттаивания

Активность 2,37± 2,8± 2,8± 2,37± 2,37± 2,33±0,24

(баллы) 0,2 0,3 0,3 0,2 0,2

Выживае «ость 72±8 112± 114± 90± 112± 88±9

(часы) 12 12 10 12

Таблица 9

Сравнение опытного варианта №2 замораживания спермы с исходными технологиями по (Ф.) и по <Ъ.) по ее пока ттслям после ____оттаивания (п=10)___

Технология Второй опыт Фомина, Ьоопш,

замораживания 1988 1983

Среда цля разбавл гния Лактозо-ЭДТА-желточная ЛХЦЖ Лактозо-ЭДТА-жел-точная

С] епень разбавления 1 1 1 2 1-3 1 4 1 3 1 1

Показатели спермы после оттаивания

Активность 2,0± 2,27-Ь 2,37± 2,3± 2,3± 2,2±0,22

(баллы) 0,21 0,23 0,24 0,23 0,23

Выживаемость 120± 174± 206± 186± 216± 196±20

(часы) 10 18 22 20 24

Из данной таблицы видно, что активность и выживаемость сперматозоидов повышается, если сперму разбавляют в 3 раза лактозо-ЭДТА- желточной средой после центрифугирования Активность спермы после оттаивания составила 2,37 балла, а выживаемость 206 часов

Более низкие показатели спермы после оттаивания получаются при разбавлении средой лактозо-ЭДТА- желточной 1 • 1,1 2,1 4 Активность спермы составида 2,0 балла, 2,27 балла и 2,3 балла соответст-

венно А выживаемость составила 120 часов, 174 часа и 186 часов соответственно.

В результате сравнения второго опыта замораживания спермы с другими технологиями выяснилось, что данный прием улучшил активность на 0,07 балла в сравнении с технологией по (Ф) и на 0,17 балла - с технопогией по (Ь) Выживаемость не повысилась по сравнению с технологией по (Ф), а по сравнению с технологией по (Ь) улучшилась на 10 часов Разница не достоверна

Результаты проведенных исследовании свидетельствуют о возможности унификации замораживания спермы жеребцов Особенно перспективной, по нашим данным, является опыт №1 В этом опыте мы более щадяще воздействуем на спермин в связи с тем, ч I о предварительно разбавляем сперму перед центрифугированием Кроме того, можно пользоваться как отечественным разбавителем, так и отечественной фасовкой для замораживания спермы

Сравнение результативности разных объемов замороженной спермы при осеменении кобыл После определения новых вариантов и технологических приемов замораживания спермы в малых объемах, была изучена возможность максимального снижения объема осеменения в отечественной технологии криоконсервации спермы жеребцов по (Н)

В опыте из 4-х кобыл, осемененных замороженной спермой в объёме 5-10 мл, не зажеребела ни одна

Из 4-х кобыл, осемененных в объёме 20 мл, 3 кобыл; .1 зажере-бели. у 2-х из них были вымыты эмбрионы, а у третьей эмб рион был зафиксирован на экране ультразвукового сканера в возрасте 30 дней

В опыте было задействовано небольшое количество побыл Но предварительный результат говорит о снижении результативности осеменений кобыл при уменьшении объемов дозировок замороженной спермы до 5-10 мл

Сравнительный анализ экономической эффективности разных технологий замораживания спермы жеребцов Заключительный этап сравнения - сравнительный анализ экономической эффективности разных технологий замораживания спермы жеребцов (одной зарубежной и двух отечественных) складывается из 3-х составляющих.

1 Потери спермодоз после центрифугирования спермы по разным технологиям

2 Расход хладоагента для замораживания спермы по разным технологиям

3 Стоимость дополнительного оборудования, необходимого для замораживания спермы по разным т ехнологиям

1. Потери спермодоз.

По зарубежной технологии (Ь ) удаляется 30% спермодоз ценного генетического материала (спермы)

По отечественной технологии (Ф) удаляется 3% спермодоз цен-нош г« нетического материала

По отечественной технологии (Н ) нет потерь спермы, т к эта технология не предусматривает ценгрифугирование

Таким образом, потери спермодоз по отечественным технологиям на 27-30% меньше, чем по зарубежной технологии

2. Расход хладоа! ента.

По зарубежной технологии в среднем на одну дозу осеменения необходимо '5-6 соломин, по отечественной технологии (Ф ) - 1 туба по 5 мл, во отечественной технологии (Н) — 1 туба по 15-20 мл По объему 1 туба по 5 мл занимает такой же объем, как 5 соломин

Расход хладоагента в 4 раза больше по отечественной технологии (Н), чем по зарубежной технологии и отечественной технологии по (Ф).

Уровень зажеребляемости кобыл по технологии (Н ) на 27% выше по сравнению с зарубежной технологией (Ь ) (таблица 7) и нет потерь спермы Это компенсирует затраты на расход хладоагента по отечественной технологии (Н )

3. Стоимость дополнительного оборудования, необходимого для эаморажнвания спермы по разным тешологиям, представлена в таблице 10, без учёта затрат на основное оборудование, которое необходимо по всем трем технологиям

Таблица 10

Стоимость дополнительного оборудования для разных тех-

нологий замораживания спермы жеребцов"

Статьи затрат Технологии замораживания спермы жеребцов

ЬоогтэР Фоминой Е Л Науменкова А И, Романьгсовой Н К

Стоимость оборудования 1 Полуавтоматическая фасов очно-укупорочная (истема, тыс руб 202,0

2 Центрифуга, тыс руб _ 112,0 20,0 -

Итого 314,0 20,0 -

* без учета затрат на основное оборудование

Из данных таблицы 10 видно, что самой дешевой технологией замораживания спермы жеребцов по стоимости дополнительного обо-

рудования является отечественная 1ехнологня, разработанная (Н), тк эта технология замораживания спермы жеребцов не предусматривает центрифугирование и фасовку спермы в соломины (не требует затрат на дополнительное оборудование)

По отечественной технологии (Ф) из дополнительного обор у до вания необходима центрифуга Отечественную центрифугу можно приобрести за 20 тыс руб (По данным за 2005 юд)

По зарубежной технологии (Ь ) из дополнительно! о оборудова ния необходима полуавтоматическая фасовочно-ухупорочная система для замораживания спермы жеребцов, которая стоит 202 тыс руб (А.в томатическая фасовочно-укупорочная система стоит 905 тыс руб) Стоимость зарубежной центрифуги -112тыс руб (По данным за 2007 год)

Затраты на дополнительное оборудование в отечественны< тех нологиях в 15-300 раз меньше, чем в зарубежной технологии

ВЫВОДЫ

1 На этапе разбавления отечественные технологии заморажива ния спермы превосходят зарубежную технологию Степень ра;баг,ле ния 1 3, принятая в отечественных технология к, оказывает блатопри ятное воздействие на сперму после замораживания и по зарубежной технологии

2 При удалении 90% надосадка после центрифугирования по зарубежной технологии (Ьоопш Р , 1983) теряется 30% сперматозоидов По отечественной технологии (Фоминой Е Л, 1988) при удалении 50% надосадка теряется лишь 2% сперматозоидов

3 При сравнении различных способов фасовки спермы (в тубах и соломинах) показатели спермы после оттаивания в рамках одной технологии сходны

4 В процессе центрифугирования спермы не происходит разделения морфологически нормальных и патологических сперматозоидов на фракции как по отечественной технологии (Фоминой ЕЛ, 1938), так и по зарубежной технологии (Ьоопнб Р , 1983) Центрифугирование приводит к увеличению процента патологических сперматозоидов по сравнению с технологией без центрифугирования (Науменкова А И, Романьковой Н К , 1971)

5 В результате использования отечественной технологии вмораживания спермы по Фоминой Е Л , 1988г с применением центрифугирования, с надосадком удаляется меньшее количество морфологиче-

ски нормальных сперматозоидов, чем при использовании зарубежной технолоши по Ьоопнб Р , 1983 г

6. В процессе центрифугирования как по отечественной технологии (Фоминой Е Л , 1988), так и по зарубежной технологии (Ьоопнб Р , 1983), основные нарушения морфологии сперматозоидов происходят в акросоме и хвостовой части

7. Результативность осеменений кобыл спермой, замороженной по отечественной технологии (Науменкова А И., Романьковой НК, 1971), свидетельствует о некотором преимуществе по сравнению с зарубежной! технологией (Ьоопнэ Р, 1983)

8 Осеменение кобыл замороженной спермой по отечественной технологии Науменкова А И , Романьковой Н К (1971) в объеме 20 мл дает лучший результат, чем при объеме 5-10 мл

9 Сравнительный анализ экономической эффективности показал, что от ечественные технологии превосходят зарубежную технологию по 3-м составляющим

- потери спермодоз при использовании отечественных технологий на 27-30% меньше, чем в зарубежной технологии,

- расход хладоагента по отечественной технологии (Ф) находится на уровне зарубежной технологии по (Ь), но в 4 раза меньше, чем по технологии (Н), в которой экономия спермодоз перекрывает дополнительный расход хладоагента,

- стоимость дополнительного оборудования в отечественных технологиях в 15-300 раз дешевле, чем в зарубежной

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1 Для тех хозяйств, которые не в состоянии приобрести импортное оборудование, но хотят замораживать сперму жеребца в малых объёмах, можно рекомендовать отечественную технологию Фоминой ЕЛ (1983), которая не уступает зарубежной технологии Ьоопш Р.(1983)

2. Замораживание спермы жеребцов как по отечественной технолоши Фоминой Е Л (1988), так и по зарубежной технологии Ьоолш Р. (1983) можно проводить как в тубах, так и в соломинах

3 При замораживании спермы жеребцов можно пользоваться опытной технологией №1, как имеющей тенденцию к увеличению показателей активности и выживаемости спермы после оттаивания по сравнению с технологией по Фоминой ЕЛ (1988) и по Ьоогтэ Р (1983)

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 .Науменкова, В А Различные подходы к решению проблем искусственного осеменения кобыл замороженным семенем / В А Науменкова, О В Васильева // Искусственное осеменение лошадей — истоки биотехнологии в животноводстве - Дивово,2004 -С 21-23

2 Васильева, О В Изучение возможности снижения объема замороженной спермы для искусственного осеменения кобыл / О В Васильева, В А Науменкова // Сб научн трудов Рязанской ГС ХА - Рязань, 2005 -С 488-491

3 Васильева, О В Сравнение разных технологий замораживания спермы жеребцов /О В Васильева, В А Науменкова, М М А трощенко // Новое в науке о коневодстве материалы международной научной конференции к 75-летию проф Рождественской Г А - Диво ею, 2006 -С 160-164

4. Васильева, О В Результат осеменения кобыл спермой, замороженной по отечественной и западной технологии / О В Васильева // Повышение генетического потенциала лошадей Казахстана с использованием отечественного и мирового генофонда II международная научно-практическая конференция - Костанай, 2006 - С 205 -207

5 Науменкова, В А Сильные и слабые стороны разных технологий криоконсервации спермы жеребцов / В А Науменкова, О В Васильева// Коневодство и конный спорт -2006 -№5 -С 15-¡7

6 Васильева, О В Результат осеменения кобыл спермой, замороженной по отечественной и зарубежной технологии / О В Васильева, Бабушкин ПН// Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии сб науч тр молодых ученых -М,2006 -Вып 3 -С 136-П8

7 Васильева, О В Сравнительная характеристика разных технологий замораживания спермы жеребцов / О В Васильева // Практик -2007 - №1 - С 50-55

8 Васильева, О В Сравнительная оценка отечественных и зарубежных технологий замораживания спермы жеребцов / О В Васильева // Инновации молодых ученых в решении вопросов национал ыюй программы возрождения села Материалы Всероссийской науч - практич конф , Рязань, 2007 (в печати)

Подписано в печать 20 04.2007

Формат 60x84 1/16

Печ л 1.2 Тираж 70 экз Заказ № 26

Участок печати ГНУ ВНИИ коневодства Рыбновский район, Рязанская область

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Васильева, Ольга Валентиновна

ВВЕДЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Появление и развитие искусственного осеменения лошадей и других с/х животных.

1.2. Развитие методов введения спермы при искусственном осеменении лошадей и других с/х животных.

1.3. Влияние дозы вводимой спермы на зажеребляемость кобыл.

1.4. Факторы, которые влияют на оплодотворяющую способность спермы жеребцов после замораживания - оттаивания.

1.5. Методы замораживания спермы жеребцов.

1.5.1. Методы замораживания спермы жеребцов с использованием центрифугирования.

1.6. Методы замораживания спермы жеребцов в России.

1.6.1. Технология замораживания спермы в больших объёмах (15-20мл).

1.6.2. Технология замораживания спермы жеребцов объёмом 5-6мл с применением центрифугирования.

1.6.3. Технология замораживания спермы жеребцов объёмом 5мл с применением диализа.

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Методика получения, оценки, разбавления и подготовки спермы к замораживанию.

2.2. Сравнение разных технологий замораживания спермы.

2.2.1. 1 этап - разбавление.

2.2.2. 2 этап - удаление надосадочной жидкости.

2.2.3. 3 этап - способы фасовки.

2.3. Изучение морфологии сперматозоидов разных фракций центрифугата.

2.4. Сравнение оплодотворяющей способности спермы жеребцов, замороженной по разным технологиям.

2.5. Испытание новых вариантов и технологических приёмов замораживания спермы в малых объёмах.

2.6. Сравнение результативности разных объёмов в осеменении кобыл.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Сравнение разных технологий замораживания спермы жеребцов.

3.1.1. 1 этап - разбавление.

3.1.2. 2 этап - удаление надосадочной жидкости.

3.1.3. 3 этап - способы фасовки.

3.2. Изучение морфологии сперматозоидов разных фракций спермы жеребцов после центрифугирования.

3.3 Сравнение оплодотворяющей способности спермы, криоконсервированной по разным технологиям.

3.4. Испытание новых вариантов и технологических приёмов замораживания спермы в малых объёмах.

3.5. Сравнение результативности разных объёмов в осеменении кобыл.

3.6. Сравнительный анализ экономической эффективности разных технологий замораживания спермы жеребцов.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительный анализ отечественных и зарубежных подходов к проблеме замораживания спермы жеребцов"

Замораживание спермы жеребцов-производителей с эффективностью можно использовать в селекционно-племенной работе. Причём этот эффект заключается не только в рациональном использовании генетического потенциала наиболее ценных животных. Большое значение этот метод приобретает в связи с тем, что ряд пород и линий находится под угрозой исчезновения.

В коневодстве метод замораживания позволяет создавать запасы спермы от ценных жеребцов, сохранять её десятки лет, транспортировать на любые расстояния и получать потомство даже после смерти производителей. Кроме того, открываются возможности обмена спермой жеребцов высокого класса с зарубежными странами.

Практическое применение замороженной спермы жеребцов невелико из-за нестабильности результатов, трудоёмкости и дороговизны метода. Кроме того, устойчивость к замораживанию спермы часто зависит от индивидуальных особенностей производителей и варьирует в больших пределах. Сперма отдельных жеребцов совершенно не выдерживает замораживания.

В нашей стране и за рубежом разработано несколько технологий по замораживанию спермы жеребцов.

Российские и зарубежные технологии замораживания спермы жеребцов при многих общих элементах, имеют и значительные различия. Основным таким отличием является объём дозы осеменения. Зарубежные исследователи пошли по пути, аналогичному осеменению крупного рогатого скота. Они рекомендуют проводить осеменение кобыл в миниобъёмах, но при этом уделяют большое внимание количеству подвижных сперматозоидов в дозе.

Российские учёные подходят к решению данного вопроса иначе. Учитывая, что для кобыл физиологичен большой объём спермы, как это происходит при естественной случке. Они рекомендуют проводить осеменение в больших объёмах с меньшим количеством сперматозоидов в дозе.

Актуальность исследований:

В последние годы российские коневладельцы всё чаще стали использовать криоконсервированную сперму жеребцов, ввезённую из западных стран, и покупать дорогое оборудование для замораживания спермы. Это даёт возможность получить потомство от высококлассных жеребцов, находящихся в Европе или Америке, и замораживать сперму российских жеребцов по зарубежной технологии, в т.ч. и по Loomis Р., 1983. Это наиболее типичная технология замораживания спермы жеребцов, которая используется за рубежом. Кроме того, привлекает простота и удобство перевозки спермы в миниобъёмах (0,5 мл). Хранение такой спермы также не требует больших расходов дорогостоящего хладоагента.

В нашей стране, несмотря на разработку способов замораживания спермы в малых объёмах (5 мл), до сих пор широко используется метод криоконсервации в больших объёмах (20 мл). Этот метод хорошо зарекомендовал себя в практике в связи с простотой исполнения, недорогим оборудованием, получением стабильных результатов. Но его недостатком являются большие объёмы спермодоз, неудобные при хранении и перевозках, и затраты на дорогостоящий хладоагент. Актуален вопрос: в чём состоит суть различий в этих технологиях, и какая из них предпочтитетельнее с точки зрения результативности, простоты исполнения и экономии затрат.

Цель исследований:

С целью выявления наиболее эффективной технологии - провести сравнение трёх технологий замораживания спермы жеребцов (одной зарубежной и двух отечественных), а также изыскать возможность унификации технологии замораживания спермы в малых объёмах.

Задачи исследований:

1. Сравнить факторы и приёмы на этапах (разбавления, удаления надосадочной жидкости, способах фасовки) при использовании разных технологий замораживания спермы, позволяющие получить максимальную активность и выживаемость сперматозоидов после оттаивания.

2. Изучить морфологию сперматозоидов, находящихся в разных фракциях после центрифугирования спермы.

3. Сравнить оплодотворяющую способность спермы жеребцов, замороженной по разным технологиям (отечественной технологии Науменкова А.И., Романьковой Н.К., 1971 и зарубежной технологии Loomis Р., 1983).

4. Испытать новые варианты и технологические приёмы замораживания спермы в малых объёмах.

5. Выявить возможность уменьшения объёма дозы в отечественной технологии замораживания спермы жеребцов (Науменков А.И., Романькова Н.К., 1971).

6. Провести сравнительный анализ экономической эффективности разных технологий замораживания спермы жеребцов.

Научная новизна:

Впервые было проведено сравнение отечественных и зарубежной технологии замораживания спермы по качественным показателям спермиев, по оплодотворяющей способности и экономической эффективности.

Впервые получены данные по морфологии спермиев различных фракций центрифугата.

Впервые выявлена взаимозаменяемость различных приёмов и разбавителей при использовании отечественной и зарубежной технологии.

Впервые проведён опыт осеменения кобыл разными по объёму дозами замороженной спермы 5-10мл и 20мл (по отечественной технологии Науменкова А.И., Романьковой Н.К., 1971).

Теоретическая и практическая ценность работы

При сравнительной оценке отечественных и зарубежной технологий замораживания спермы жеребцов выявлены отрицательные и положительные стороны этих технологий. Изучена морфология сперматозоидов, находящихся в разных фракциях центрифугата.

После сравнительного анализа экономической эффективности выявлены преимущества отечественных технологий замораживания спермы жеребцов.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на научной конференции во ВНИИ коневодства (2005г.), в Костанае (Казахстан, 2006г.), и Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и специалистов в РГСХА им. Костычева П.А. (2006г.). По материалам диссертации опубликовано 8 статей.

Положения, выносимые на защиту:

1. Качественные показатели спермы, оплодотворяющая способность и экономическая эффективность отечественных и зарубежной технологий замораживания спермы жеребцов.

2. Исследование морфологии сперматозоидов в осадке и надосадке после центрифугирования спермы.

3. Возможность взаимозамены различных приёмов и разбавителей в отечественной и зарубежной технологиях.

Объём осеменения разными дозами замороженной спермы отечественной технологии.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Васильева, Ольга Валентиновна

Выводы:

1. На этапе разбавления отечественные технологии замораживания спермы превосходят зарубежную. Степень разбавления 1:3, принятая в отечественных технологиях, оказывает благоприятное воздействие на сперму после замораживания и по зарубежной технологии.

2. При удалении 90% надосадка после центрифугирования по зарубежной технологии (Loomis Р., 1983) теряется 30% сперматозоидов. По отечественной технологии (Фоминой E.JL, 1988) при удалении 50% надосадка теряется лишь 2% сперматозоидов.

3. При сравнении различных способов фасовки спермы (в тубах и соломинах) показатели спермы после оттаивания в рамках одной технологии сходны.

4. В процессе центрифугирования спермы не происходит разделения морфологически нормальных и патологических сперматозоидов на фракции как по отечественной технологии (Фоминой E.JL, 1988), так и по зарубежной технологии (Loomis Р., 1983). Центрифугирование приводит к увеличению процента патологических сперматозоидов по сравнению с технологией без центрифугирования (Науменкова А.И., Романьковой Н.К., 1971).

5. В результате использования отечественной технологии замораживания спермы по Фоминой E.JL, 1988г. с применением центрифугирования, с надосадком удаляется меньшее количество морфологически нормальных сперматозоидов, чем при использовании зарубежной технологии по Loomis Р., 1983г.

6. В процессе центрифугирования как по отечественной технологии (Фоминой E.JL, 1988), так и по зарубежной технологии (Loomis Р., 1983), основные нарушения морфологии сперматозоидов происходят в акросоме и хвостовой части.

7. Результативность осеменений кобыл спермой, замороженной по отечественной технологии (Науменкова А.И., Романьковой Н.К., 1971), свидетельствует о некотором преимуществе по сравнению с зарубежной технологией (Loomis Р., 1983).

8. Осеменение кобыл замороженной спермой по отечественной технологии Науменкова А.И., Романьковой Н.К. (1971) в объёме 20мл даёт лучший результат, чем при объёме 5-10мл.

9. Сравнительный анализ экономической эффективности показал, что отечественные технологии превосходят зарубежную по 3-м составляющим:

- потери спермодоз при использовании отечественных технологий на 2730% меньше, чем в зарубежной технологии;

- расход хладоагента по отечественной технологии (Ф.) на уровне зарубежной технологии по (L.), но в 4 раза меньше, чем по технологии (Н.);

- стоимость дополнительного оборудования (отечественные технологии в 15 - 300 раз дешевле зарубежной).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1 Для тех хозяйств, которые не в состоянии приобрести импортное оборудование, но хотят замораживать сперму жеребца в малых объёмах, можно рекомендовать отечественную технологию Фоминой E.JL (1988), которая не уступает зарубежной технологии Loomis Р.(1983).

2. Замораживание спермы жеребцов как по отечественной технологии Фоминой E.JI. (1988), так и по зарубежной технологии Loomis Р. (1983) можно проводить как в тубах, так и в соломинах.

3. При замораживании спермы жеребцов можно пользоваться опытной технологией №1, как имеющей тенденцию к увеличению показателей активности и выживаемости спермы после оттаивания по сравнению с технологией по Фоминой Е.Л. (1988) и по Loomis Р. (1983).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Васильева, Ольга Валентиновна, Дивово

1. Айбазов, М.М. Результаты внутриматочного осеменения овец с использованием метода лапараскопии / М.М. Айбазов // Роль и значение метода искусственного осеменения с.-х. животных в прогрессе животноводства XX и XXI веков. Дубровицы, 2004.-С.155-169.

2. Андрюшин, В.В. Вопросы искусственного осеменения / В.В. Андрюшин // Коневодство и конный спорт.-1991 .-№7.-С.8-11.

3. Андрюшин, В.В. Сперматогенез и устойчивость спермы жеребцов к замораживанию в связи с уровнем стероидных гормонов /

4. B.В.Андрюшин, Е.Л.Фомина, Л.М.Кошарова и др. // Пути ускорения НТП в коневодстве: сб. науч. тр. ВНИИ коневодства, 1986.-С.112-121.

5. Багиров, В.А. Метод внутритрубного осеменения свиноматок/ В.А.Багиров, Н.П.Закунов, В.П.Кононов и др. // Роль и значение метода искусственного осеменения с.-х. животных в прогрессе животноводства XX и XXI веков. Дубровицы, 2004.-С.149-150.

6. Боярский, В.М. Влияние глубины введения замороженного семени баранов на результативность ягнения овец / В.М. Боярский // Разведение и кормление животных: сб. науч. тр. Ульяновск, 1985.1. C.68-71

7. Гельфонд, Е.М. Искусственное осеменение кобыл /Е.М. Гельфонд // Коневодство.-1937.-№5.-С.10-13.

8. ГОСТ 24168-80 «Сперма жеребцов замороженная». -М.,1980. 6 с.

9. Длительное хранение спермы жеребца путем замораживания. Разработка метода сохранения спермы жеребца в твердой углекислоте при температуре -78 . Т.4, тема 5, разд. 2: Отчет о

10. НИР / ВНИИ коневодства; Руководитель Г.В.Паршутин. Инв.№ 80. -М., 1956. - С.18-27. - Отв. исполн. А.Н.Буйко, Е.С.Кружкова.

11. Енишерлов, Н.П. Результаты опытов искусственного осеменения кобыл и влияние первого оплодотворителя на последующие приплоды / Н.П. Енишерлов // Коннозаводства.-1898.-№1. С.147.

12. Животков, X. Искусственное осеменение лошадей в сочетании с ветеринарно-зоотехнической гинекологией/ Х.Животков, И.Краков, С.Антоненко // Коневодство.-1939.-№1.-С.28.

13. Животков, Х.И. Глубокое введение спермы при искусственном осеменении лошадей/ Х.И.Животков, П.Н.Скаткин //Коневодство.-1941 .-№2.-С.6.

14. Животков, Х.И. Опыт искусственного осеменения лошадей/ Х.И.Животков, Н.Зданович //Коневодство.-1938.-№3.-С.16-20.

15. Жильцов, Н.З. Микрокапсулирование семени быка / Н.З.Жильцов, Ю.П.Фомичёв, И.Е.Дамрина // Роль и значение метода искусственного осеменения с.-х. животных в прогрессе животноводства XX и XXI веков. Дубровицы, 2004.-С.98-99.

16. Жмурин, Л.М. К вопросу о сохранении в замороженном состоянии семени жеребца / Л.М. Жмурин // Коневодство.-1959.-№4,-С.24-27.

17. Иванов, И.И. Искусственное осеменение у млекопитающих /И.И. Иванов//С-Пб, 1907.- 51с.

18. Изучение связи между возрастом жеребцов, свойствами семенных клеток и качеством потомства Т.З, тема 5, разд.З: Отчет о

19. НИР / ВНИИ коневодства; Руководитель Г.В.Паршутин. Инв.№ 25. -М., 1952. - С.520-524. - Отв. исполн. П.П.Печников.

20. Ильинская, Т.П. Влияние некоторых факторов на устойчивость спермы жеребца к замораживанию при температуре -70°С / Т.П. Ильинская // Коневодство.-1956.-№2.-С.32-35.

21. Инструкция по искусственному осеменению кобыл спермой жеребца, сохранённой при температуре -196°С. ВНИИК, 1987.-24 с.

22. Инструкция по искусственному осеменению кобыл. М.: Колос, 1969.-24 с.

23. Казеев, Г.В. Обоснование выбора оптимального времени искусственного осеменения коров / Г.В. Казеев // Роль и значение метода искусственного осеменения с.-х. животных в прогрессе животноводства XX и XXI веков. Дубровицы, 2004.-С.176.

24. Кононов, В.П. Факторы плазмы спермы повышающие устойчивость спермиев при замораживании / В.П.Кононов,

25. B.А.Семёнова, А.С.Ерохин // С.- х. биология.-1986.-№10.-С.98-101.

26. Корбан, Н.В. Влияние глицерина на акросомные ферменты сперматозоидов хряка при замораживании оттаивании / Н.В.Корбан, Л.А.Белкина, Н.И.Беззубцева // Бюлл. ВНИИРГЖ.-1978.-Вып.З.-С.25-28.

27. Кудряшов, С.А. Искусственное оплодотворение кобыл /

28. C.А. Кудряшов // Коневодство на северном Кавказе. Москва, 1930. -С.61-82.

29. Милованов, В.К. Биология воспроизведения и искусственное осеменение сельскохозяйственных животных / В.К. Милованов //М.-1962.-696 с.

30. Милованов, В.К. Физические свойства мембран липидов и устойчивость живчиков при глубоком охлаждении / В.К.Милованов,

31. В.П.Кононов, О.А.Азизова, А.Г.Максина // Вестник с.-х. науки.-1984.-№2.-С.93-100.

32. Науменкова, В.А. Использование диализа для криоконсервации спермы жеребца: дисс. . канд. биол. наук. Дивово, 1994.- 132 с.

33. Ормонд. Биология чистокровных лошадей / Ормонд // Коннозаводство.-1902.-№10.-С. 1-5.

34. Паршутин, Г.В. Зависимость зажеребляемости кобыл от переживаемости сперматозоидов жеребца / Г.В.Паршутин, П.Н.Скаткин // Вестник животноводства.-1940.-№2.-С. 155-159.

35. Паршутин, Г.В. Искусственное осеменение и случка кобыл / Г.В.Паршутин, П.Н Скаткин. М., 1944.-С.65-67.

36. Паршутин, Г.В. Качество спермы жеребцов при повторных садках. / Г.В. Паршутин // Коневодство.-1940.-№1.-С.15.

37. Паршутин, Г.В. Новое в искусственном осеменении лошадей / Г.В. Паршутин // Коневодство.-193 8.-№1.-С.27.

38. Паршутин, Г.В. Современная техника и организация искусственного осеменения и случка кобыл / Г.В. Паршутин // Коневодство.-1946.-№6-7.-С.9-14.

39. Патрушев, В.И. Искусственное осеменение лошадей / В.И. Патрушев // Коневодство.-1935.-№5.-С. 19-25.

40. Печников, П.П. Влияние режима использования производителей на биологические и физико-химические свойства спермы / П.П. Печников, Г.В. Паршутин // Работы по физиологиилошади: сб. науч. тр. / ВНИИ коневодства. М.,1961. - Т.23. - СЛ19-135.

41. Платов, Е.М. Длительное хранение спермы жеребца / Е.М.Платов, Е.С.Пустовая, В.А.Котягина, Н.К.Романькова // Ветеринария.- 1970.-№10.-С. 103-111.

42. Плохинский, Н.А. Математические методы в биологии /Н.А. Плохинский // М., 1978. 265 с.

43. Повышение плодовитости лошадей. Искусственное осеменение кобыл длительно сохраненной спермой. Тема 3, разд.4: Отчет о НИР / ВНИИ коневодства. Руководитель Г.В.Паршутин. -Инв.№ 15. - М., 1950. - С.449-458. - Отв. исполн. А.Н.Буйко.

44. Радченков, В.П. Сравнение эффективности использования различных технологий криоконсервирования спермы производителей в полимерных соломинках / В.П. Радченков // Зоотехния.-2006.-№2.-С.32.

45. Разработка метода хранения семени жеребца в замороженном состоянии. Т.2, тема 11: Отчет о НИР / ВНИИ коневодства. Руководитель П.Н.Скаткин. Инв.№48. - М., 1954. -С.227-242. - Отв. исполн.П.Н.Скаткин, В.А.Румянцева.

46. Рекомендации по подготовке и расфасовке спермы для замораживания в малых объёмах (5-6мл). ВНИИК, 1990. - 7 с.

47. Романькова, Н.К. Дозирование спермы жеребца / Н.К.Романькова, А.И.Науменков // Пути ускорения научно-технического прогресса в коневодстве: сб. науч. тр.-ВНИИК.-1986.-С.91-104.

48. Романькова, Н.К. Совершенствование методов хранения семени жеребца: дисс.канд. биол. наук. Дивово, 1972. - 184 с.

49. Ромбе, С.М. Длительное хранение спермы жеребца при глубоком замораживании /С.М. Ромбе // Коневодство в опытах: сб. науч. тр. / ВНИИ коневодства. М.,1967.-Т.24, Ч.1.-С.215-238.

50. Румянцева, В.А. Разработка метода замораживания спермы жеребца при температуре -79°С с малым количеством глицерина / В.А. Румянцева // Бюллетень научно-технической информации. М., 1959.-№4-5.-С.39-42.

51. Скаткин, П.Н. Некоторые вопросы теории и техники искусственного осеменения лошадей / П.Н. Скаткин // Коневодство,-1950.-№4-С.19-23.

52. Скаткин, П.Н. О разбавлении спермы жеребца / П.Н. Скаткин // Труды Всесоюзного научно-исследовательского института коневодства-М., 1950. Т. 18. - С.227-235.

53. Совершенствование метода длительного хранения семени жеребца. Т.З, тема 5, разд. 4.: Отчет о НИР / ВНИИ коневодства; Руководитель Г.В.Паршутин. Инв.№ 25. - М., 1952. - С.525-530. -Отв. исполн. П.Н.Скаткин, А.Н.Буйко,Е.Ю.Румянцева.

54. Совершенствование методов искусственного осеменения лошадей. Разработка способов длительного хранения спермы жеребца. Т.2, тема 9, разд. 1: Отчет о НИР / ВНИИ коневодства; Руководитель Г.В.Паршутин. Инв.№ 97 - М., 1958. - С.363-364. - Отв. исполн.

55. A.Н.Буйко, Л.М.Жмурин, П.П.Печников.

56. Титова, В.А. Возможности использования технологии микрокапсулирования спермы сельскохозяйственных животных/

57. B.А.Титова, А.И.Абилов // Современные технологические и селекционные аспекты развития животноводства России. Дубровицы, 2005.- Т.2.-С.273.

58. Фомина, Е.Л. Влияние кормления на уровень и качество сперматогенеза у жеребцов-производителей / Е.Л.Фомина,

59. C.Т.Угадчиков, К.И.Мирошникова // Интенсификация коневодства: сб. науч. тр. ВНИИК, 1985. - С.56-65.

60. Фомина, Е.Л. Воспроизводительная функция орловских и русских кобыл в условиях Дубровского конного завода / Е.Л.Фомина, К.И.Мирошникова, И.А.Валк // Интенсификация селекции и технологии выращивания лошадей: сб. науч. тр. ВНИИК, 1988.-С.190-201.

61. Фомина, Е.Л. Новое в технологии криоконсервации спермы жеребца в малых объёмах / Фомина Е.Л., Мирошникова К.И. // Пути ускорения научно-технического прогресса в коневодстве: сб. науч. тр. -ВНИИК, 1989.-С.65-66.

62. Чернышов, И.Л. Пути совершенствования отбора и осеменения кобыл-доноров эмбрионов: дисс. . канд. биол. наук. -Дивово, 1990.- 122 с.

63. Шапиев, И.Ш. Совершенствование методов замораживания и оценки спермы хряков: автореф. дисс. . д-ра биол. наук. Пушкин, 1998.-38с.

64. Advena, I. Deep frozen storage of stallion semen; comparison of the flattstraw and the macrotube methods in relation to their effects on the motility and acrosome integrity of the spermatozoa: thesis. Hannover, 1990. - S.124-128.

65. Aehnelt, E. Das Sperma Hengstes irnter Berucksichtigung von Umwelt und Vererbung. Hannover, 1950. 211 s.

66. Amann, R.P. Effects of age and frequency of ejaculation on sperm production and extraqonadal sperm reserves in stallions. / Amann R.P., Thompson D.L., Squires E.L., Pickett B.W. // J. Reprod. Fertill. -1979.-Suppl.27.-P.l-6.

67. Anderson, J. The examination of semen and the relationship to fertility // Proc. 2nd Int. Congr. Phys. Path. Anim. Reprod. A.I. -Copenhagen, 1952. Vol. 3.-P.7-34.

68. Aurich, J.E. Seminal plasma effects membrane intergrity and motility of equine spermatozoa after cryopreservation / Aurich J.E., Kuhne A., Hoppe H., Aurich C. // Theriogenology. 1996. - Vol.46. - P.791-797.

69. Backman, T. Pregnancy rates of mares inseminated with semen cooled for 18 hours and the frozen /Bachman Т., Bruemmer J.E., Graham J.K, Squires E.L. //J. Anim. Sci. 2004. - Vol.82. - P.690-694.

70. Bader, H. Fraktionierte ejakulatgewinnung beim hengst / Bader H., Huttenrauch O. // Dtsch. tierarztl. Wochenschr. 1966. - Bd.73. - S.547-548.

71. Bader, H. Weitere Erfahrungen uber die Tiefgefrierung von Hengstsperma.//Zuchthygiene. 1970. - Vol.5. - P.87.

72. Bader, H. Zur Tiefgefrierung von Hengstsperma nach der Pelletmethode. // 6. Internat. Kong. Tier. Fortpfl. Haustierbes. Paris, 1968. - Vol.2. - P.985-988.

73. Barker, C.A. Pregnancy in a mare resulting from frozen epididymal spermatozoa / Barker C.A., Gandier J.C. // Can. J. Сотр. Med.-1957.-Vol.21. P.47-51.

74. Batellier, F. Advances in cooled semen technology // Animal Reproduction Sciense. 2001. - Vol.68. - P.181-190.

75. Baumgartl, C. Lich-und elektronenmikroskopische Untersuchungen uber Veranderungen der Plasmamembran und Akrosomstruktur von Pferdespermien: diss. Hannover, 1980. -216 s.

76. Bedford, J.M. Ultrastructural changes in the sperm head during fertilization in the rabbit // Am. J. Anat. 1968. - Vol.123. - P.329-358.

77. Bielanski W., Kunstliche Besamung beim Pferd // Verlag Enke.-Stuttgart,1982.-S.464-490.

78. Bielanski, W. Artifical insemination of hourses. 3. Properties of stallion semen frozen at various times of the year. / Bielanski W., Kosinak K. // Anim. Breed. Abstr. -1971. Vol.39. - P.438.

79. Bielansky, W. The evaluation of stallion semen in aspects of fertility control and its use for artificial insemination // J. Reprod. Fertil. -1975. Vol.23.-P. 19-24.

80. Boyle, M.S. Artificial insemination in the hourse //Ann Zootech.-1992.-Vol.41 .-P.311-318.

81. Buttle, H.R.L. Sterile boars with "knobbed" spermatozoa / Buttle H.R.L., Hancock J.L. // J. agric. Sci. 1965. - Vol.65. - P.255-260.

82. Сагу, J.A. A comparison of electroejaculation and epididymal sperm collection techniques in stallions / Cary J.A., Madill S., Farnsworth K., Hayna J.T., Duoos L., Fahning M.L. // Can. Vet. J. 2004. - Vol.45. -P.35-41.

83. Cristanelli, M. Fertility of stallion semen processed, frozen and thawed by a new procedure / Cristanelli M., Squires E.L., Amann R.P., Pickett B.W. // Theriogenology. 1984. - Vol.22, №1. - P.39-45.

84. Delius, D. Untersuchungen zur Tiefgefrierkonservierung von Pferdesamen im 0,5 ml Volumenenheiten mit Hilfe computogesteurter Einfrierprogramme: thesis. -Hannover, 1985. 124 s.

85. Ellery, J.C. Artificial insemination of pony mares with semen frozen and stored in liguid nitrogen / Ellery J.C., Graham E.F., Zemjanis R. //Am. J. vet. Res.-1971.-Vol.32, №11.-P.1693-1698.

86. Equine AI and the Use of Frozen Stallion Semen in the British Isles //-Режим доступа: http://www.Sporthorse-Bredeer.com.

87. Garner, J.L. Immunoflurescent localization of acrosin in mammalian spermatozoa / Garner J.L., Easton M.P. // J. exp. Zool.-1977.-Vol.200.-P. 157-162.

88. Gebauer, M.R. Reproductive physiology of the stallion. Chemical characteristics of seminal plasma and spermatozoa / Gebauer M.R., Pickett B.W., Faulkner L.C., Remmenga E.E., Berndtson W.E. // J. Anim. Sci.-1976. Vol.43, №3. - P.626-632.

89. Gotze, R. Besamung und Unfruchtbarkeit der Haussaugetiere -Hannover, 1949.- 132 s.

90. Guay, P. Effect of glycerol on motility, viability, extracellular aspartate aminotransferase release and fertility of stallion semen before andafter freezing / Guay P., Rondeau M., Boucher S. // Eq. Vet. J.-1981.-Vol.13. P.177-182.

91. Haard, M. Use of frozen stallion semen in Europe // Acta. vet. scand.-1992.-Suppl.88.-P. 123-127.

92. Harrison, R.A.P. Aspects of the enzymology of mammalian spermatozoa//J. Anim. Sci. 1975 - Vol.42, №3.-S.301-316.

93. Healey, P. Effect of freezing on the ultrastructure of the spermatozoon //J. Reprod. Fertil.-1969.-Suppl.l8.-P.21-27.

94. Hendrikse, J. The morphology of live and dead spermatozoa. / Hendrikse J., Van Der Hoist W., Best A.P. // 8 Internat. Kongr. Tier. Fortpfl. Haustierbes.-Krakow, 1976.-P. 106.

95. Hess, R. Versuche zur Pelletierung von Hengstsperma / Hess R., Schafer W., Schmidt D., Baum W. // Fortpfl. Bes. u. Aufz. der Haust.-1968.-Bd.4.-S.207-214.

96. Horsten, D. Von. Tiefgefrierversuche an Hengstsperma, Einflub von Glyzerin-konzentration, Pelletgrobe und Auftraumedium auf die Spermienuberlebensrate: diss. Hannover, 1972.- 154 s.

97. Julienne, P. Artificial insemination with fresh semen from French trotter stallions and with frozen semen from French saddle stallions at a stud farm //13 eme journee de la recherche. Paris, 1987. - P. 12.

98. Katila, T. Sperm-uterine interactions: a review. // Anim. Reprod. Sci.-2001.-Vol.68. P.267-272.

99. Klug, E. Besamungsstation im Landgestut Celle-Ergebnisbericht aus der Saison.-1978. / Klug E., Martin J.C., Brede D. // Hann. Pferd. 1979. - Bd.53. - S.58-59.

100. Klug, E. Besamungsstation im Landgestut Celle-Ergebnisbericht aus der Saison.-1979. / Klug E., Martin J.C., Kluge G. // Hann. Pferd.-1980.-Bd.54.-S.62-63.

101. Klug, E. Untersuchungen von Hengsten zum Einsatz in der instrumentellen Samenubertragung mit Tiefgefriersperma. / Klug E., Gunzel

102. A.-R., Merkt H., Krause D. // Dtsch. tierarztl. Wochenschr.-1977.-Bd.84.-S.236-238.

103. Klug, E. Untersuchungen zur klinischen Andrologie des Pferdes. Die Bedeutung andrologischer Befunde am Hengst fur den Zuchteinsatz: diss. Hannover, 1982. 176 s.

104. Krause, D. Depfreezing of jackass and stallion semen in concentrated pellet form / Krause D., Grove D. // J. Reprod. Fertil.-1967.-Vol.l4.-P.139-141.

105. Krause, D. Untersuchungen an Bullensperma unter Berucksichtigung der fertilitatsdiagnostischen Bedeutung der Befunde: diss. -Hannover, 1966.- 136 s.

106. Lindsey, A.C. Low dose insemination of mares using non-sorted and sex-sorted sperm /Lindsey A.S., Bruemmer J.E., Squires E.L. //Animal Reproduction Science -2001. Vol.68.-P.279-289.

107. Loomis, P.R. Fertility of unfrozen and frozen stallion spermatozoa extended in EDTA-lactose-egg yolk and packaged in straws / Loomis P.R., Amann R.P., Squires E.L., Pickett B.W. // J. Anim. Sci.-1983.-Vol.56, №3.-P.687-693.

108. Loomis, P.R. Frozen semen management in equine breeding programs / . Loomis P.R., Squires E.L. // Theriogenology. 2005. - Vol.64, №3. - P.480-491.

109. Loomis, P.R. The equine frozen semen industry // Animal Reproduction Sciense.-2001. Vol.68.-P. 191-200.

110. Love, C.C. Comparison of pregnancy rates achieved with frozen semen using two packaging methods / Love C.C., Loch, W.L. Bristol F., Garcia M.C., Kenney R.M. // Anim. Reprod. Sci.-1989. Vol.31, №3.-P.613-621.

111. Luning, I. Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen an Pferdespermien: diss. Hannover, 1980.- 122 s.

112. Magistrini, M. Influence of season and frequency of ejaculation on production of stallion semen for freezing / Magistrini M., Chanteloube P., Palmer E. // J. Reprod. Fert.-1987.-Suppl.35.-P.122.

113. Magistrini, M. Interactions between sperm packaging, gas environment, temperature and diluent on fresh stallion sperm survival / Magistrini M., Couty I., Palmer E. // Acta vet. scand.-1992. Suppl.88. -P.97-110.

114. Marten-Rosse, W. Monte en liberte dans Ies troupeanx ouverts de juments Iourdes / Marten-Rosse W., Russe E. // CRZV INRA Bull, techn.-1985 .-№61 .-P.21-30.

115. Martin, J.C. Centrifugation of stallion semen and its storage in large volume straws / Martin J.C., Klug E., Gunzel A.-R. // J. Reprod. Fertil.-1979.-Vol.27.-P.47-51.

116. Martin, J.C. Einflub der Zentrifugation auf die Motilitat von Hengstsperma im Thermoresistenz- und Tiefgefriertest / Martin J.C., Papa F.O., Krause A., Klug E. //Zuchthygiene.-1980.-Bd.15.-S.93.

117. Martin, J.C. Synchronization of oestrus cycle in the mare / Martin J.C., Klug E., Brede D. // 9. Internat. Kongr. Tier. Fortpfl. Haustierbes.-Madrid, 1980.-Vol.3.-P.91.

118. Martin, J.C. Zur Samenubertragung beim Pferd-Spermakonservierung in Kunststoffrohrchen / Martin J.C., Klug E. // Prakt. Tierarzt.-1979.-Bd.3.-S. 193-204.

119. Merkt, H. Equine artificial insemination // Veter. Record.-1976.-Vol.24, №99.-P.69-71.

120. Merkt, H. Tiefgefrierspermaversuche mit Equidensperma unter Anwendung des sog. Pellet-Verfahrens / Merkt H., Krause D. // Dtsch. tierarztl. Wochenschr.-1966.-Bd.73.-S.267-268.

121. Morris, L.H. Hysteroscopic uterotubal insemination of mares with low numbers of spermatozoa /Morris L.H., Allen W.R. //Animal Reproduction Sciense -2001. Vol.68.-P.290-298.

122. Morton, D.B. Acrosomal enzymes: Immunochemical localization of acrosin and hyaluronidase in ram spermatozoa // J. Reprod. Fertil.-1975.-Vol.45.-P. 375-378.

123. Muller, Z. Fertility of frozen equine semen // J. Reprod. Fertil.-1982.-Vol.32.-P.47-51.

124. Nagase, H. Pelleted semen: Comparison of different extenders and processes on fertility of bovine spermatozoa / Nagase H., Graham E.F. // 5. Internat. Konr. Tier. Fortpfl. Haustierbes.-Trient, 1964.-Bd.5.-S.387-391.

125. Nagase, H. Studies on the freezing of stallion semen. 1. Fertility results of stallion semen in concentratred pellet form / Nagase H., Soejima S., Niwa Т., Oshida H., Sagara Y., Ishizaui N., Hoshi S. // Jap. J. Anim. Reprod.-1966.-Vol. 12.-P.48-51.

126. Newcombe, J.R. Practical evaluation of the fertilising capacity of frozen-thawed horse semen // Veterinary Record.-1999.-Vol.145.-P.46-47.

127. Nishikava, Y. Studies on deep freezing of horse spermatozoa / Nishikava Y., Waide Y., Shinomiya S. // 6. Internat. Kong. Tier. Fortpfl. Haustierbes.-Paris, 1968.-Vol.2.-P. 1589-1590.

128. Nishikava, Y. Studies on the preservation of raw and frozen horse semen //J. Reprod. Fertil.-1975.-Vol.23.-P.99-104.

129. Nishikawa, Y. Freezability of horse semen collected during the non breeding season. / Nishikawa Y., Shinomiya S. // 7 Internat. Kongr. Tier. Fortpfl. Haustierbes.-Munchen, 1972.-S. 1539-1543.

130. Oliveira, M.A.L. Einflub verschiedener Aufbereitungsverfahren auf Motilitat und Akrosinaktivitat in der Thermoresistenzprufimg und auf das Befruchtungsergebnis von tiefgefrorenem Pferdesamen: diss.-Hannover, 1982.- 133 s.

131. Oshida, H. Studies on the freezing storage of stallion semen. 3. Freezing of pellet frozen semen preserved in liguid nitrogen / Oshida H.,

132. Mikawa Т., Horiuchi S., Takahashi H., Tomizuka Т., Nagase H. // Jap. J. Anim. Reprod.-1967.-Vol. 13.-P. 136-140.

133. Pace, M.M. Effect of timing of insemination, numbers of spermatozoa, and extender components on the pregnancy rate in mares inseminated with frozen stallion semen / Pace M.M., Sullivan J.J. // J. Reprod. Fertil.-1975.-Vol.23.-P.l 15-121.

134. Palmer, E. Factors affecting semen survival and fertility // Proc. 10th ICARAI.-Urbana-Champaign, 1984.-Vol.3. P.377.

135. Pickett, B.W. Effect of centrifugation and seminal plasma on motility and fertility of stallion and bull spermatozoa / Pickett B.W., Sullivan J.J., Byers W.W., Pace M.M., Remmenga E.E. // Fertil. Steril.-1975 .-№26.-P. 167-174.

136. Pickett, B.W. Effect of month and stellion on seminal characteristics and sexual behavior / Pickett B.W., Faulkner L.C., Sutherland T.M. //J. Anim. Sci.-1970.-Vol.31.-P.713-728.

137. Pickett, B.W. Factors affecting quality and qantity of stallion spermatozoa. / Pickett B.W., Voss I.L., Squires E.L. // The compendium on continuing education.-1983 .-Vol.5 .-P.259-267.

138. Pickett, B.W. Reproductive Physiology of the stallion. Effect of freguency of ejaculation on seminal characteristics and spermatozoal output. / Pickett B.W., Sullivan I., Seidel G. // J. Anim. Sci.-1975.- Vol.40, №5,-P.917-922.

139. Pickett, B.W. Reproductive physiology of the stallion. Seminal and behavioral characteristics. / Pickett B.W., Faulkner L.E., Seidel G.E., Berndtson W.E., Voss J.L. //J. Reprod. Fertil.-1976.-Vol.23.-P.95-98.

140. Platov, E.M. Freezing stallion semen in horsebreeding of the USSR / Platov E.M., Fomina E.L. // Proc. 8th. ICARAI.- Krakov, 1976.-P.320.

141. Polge, C. Fertility in the pig and horse // Fertil. Steril.-1968.26p.

142. Pursel, V.G. Loss of boar sperm fertilizing capacity associated with altered acrocome morphology during in vitro storage / Pursel V.G., Johnson L.A., Schulma L.L. // 7. Internat. Kongr. Tier. Fortpfl. Haustierbes.-Munchen, 1972.-2.-S. 1595-1560/

143. Rajamannan, A.N.J. Film freezing of semen / Rajamannan A.N.J., Graham E.F. // 6. Internat. Kong. Tier. Fortpfl. Haustierbes.-Paris, 1968.-Vol.2.-P.l 141.

144. Rigby, S.Z. Advances in cooled semen technologies: semenal plasma and semen extender // Animal Reproduction Sciense.-2001. -Vol.68.-P.171-180.

145. Saacke, R.G. Morphology of sperm and its relationship to fertility // Proc. 3. Techn. Conf. Anim. Reprod. Artif. Insem. Nat. Assoc. Anim. Breed.-Chicago, 1970.-P. 17-30.

146. Smith, A. Storage of bull spermatozoa at low temperatures / Smith A., Polge C. //Veter. Rec.-1950.-Vol.9.-P.62.

147. Smith, A. Survival of spermatozoa at low temperatures / Smith A., Polge C. //Nature.-1950.-Vol.166.-P.4225.

148. Squires, E.L. Effect of successive ejaculation on stallion seminal characteristics. / Squires E.L., Pickett B.W., Amann R.P. // J. Reprod. Fertill.-1979.-Suppl.-27.-P.7-12.

149. Stambaugh, R. Identification and subcellular localization of the enzymes effecting penetration of the zona pellucida by rabbit spermatozoa / Stambaugh R., Buckley J. // J. Reprod. Fertil.-1969.-Vol.l9.-P.423-432.

150. Tischner, M. Equine artificial insemination in Central and East Europe // Acta vet. scand.-1992.-Suppl.88.-P. 111-115.

151. Tischner, M. Evaluation of deep frozen semen in stallions 11 J. Reprod. Fertil.-1979.-Vol.27.-P.53-59.

152. Tischner, M. Results of artificial insemination of horses in Poland in the post-war period // J. Reprod. Fertil.-1975.-Vol.23.-P. 111-114.

153. Tishner, M. Problems of semen preservation and artifical insemination in horses // Proc. 11 Inter. Cong. Anim. Reprod. and at all. -Dublin,1988.-P.354-362.

154. Treu, H. Auswertung von TG-Besamungsergerebnissen auf einer Versuchsweize eingerichteten Pferdebesamungsstation in einern Landgestut / Treu H., Hillman K., Heinze H., Klug E. // Zuchthygiene.-1974.-Bd.9.-S.91.

155. Van Der Hoist, W. A study of the morphology of stallion semen during the breeding and non breeding seasons. // J. Reprod. Fertill.-1975.-Vol.23.-P.87-89.

156. Varner, D.D. Effects of cooling rate and storage temperature on equine spermatozoal motility parameters / Varner D.D., Blanchard T.L., Love C.L., Garcia M.C., Kenney R.M. // Animal Reproduction Sciense.-1988.-Vol.29, №5.-P. 1043-1051.

157. Vieira, R.C. Akrosinbestimmung an Pferdespermien unter Berucksichtigung bestimmter andrologischer Fragestellungen: diss.-Hannover, 1980.-127 s.

158. Weitze, K.F. Untersuchungen zur Tiefgefrierkonservierung von Kaninchensperma: diss. Hannover, 1977,- 142 s.

159. Wockener, A. Untersuchungen zur Kryokonservering von Hengstsperma / Wockener A., Papa F.O., Bader H., Leps H., Schmitz R. // Pferdeheilkunde.-1989.-Bd.5.-S.333.

160. Yohanson, L. Age-zelated chaiges in the leydig cell population and spermoduction in stallion. / Yohanson L. Neavce W.B. // Biol. Reprod.-1981.-Vol.24, №3.-P.703-712.

161. Zaneveld, L.J.D. Inhibition and seminal plasma trypsin inhibitors / Zaneveld L.J.D., Robertson R.T., Kessler M., Williams W.L. // J. Reprod. Fertil.-1971.-Vol.25.-P.387-392.