Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Биологические особенности и криоустойчивость спермы собак

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Квичко, Илья Львович, Лесные Поляны

Министерство сельского хозяйства и продовольствия РФ

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ПЛЕМЕННОГО ДЕЛА (ВНИИплем)

На правах рукописи

КВИЧКО Илья Львович

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И КРИОУСТОЙЧИВОСТЬ

СПЕРМЫ СОБАК

06.02.01- Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -доктор биологических наук, профессор ЕРОХИН А. С.

Лесные Поляны, Московская область 1999

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................. 4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................ 7

1.1. Физиологические и биохимические особенности спермы собак ... 7

1.2. Механизмы повреждений сперматозоидов животных при криоконсервации................................................................................. 10

1.3. Криопротекция семени животных при замораживании................ 16

1.4. Криоконсервация спермы и искусственное осеменение собак...... 21

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ........................ 34

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ................................................... 46

3.1. Морфологические и физиологические показатели

спермы собак........................................................................................ 46

3.2. Фосфолипидный состав сперматозоидов собак .............................. 48

3.3. Жирнокислотный состав липидов сперматозоидов собак............ 49

3.4. Устойчивость спермы собак к перекисному окислению липидов .. 51

3.5. Активность антиоксидантных ферментов в нативной

и криоконсервированной сперме собак.......................................... 55

3.6. Содержание АТФ в нативной и криоконсервированной

сперме собак....................................................................................... 57

3.7. Влияние различных веществ и факторов на устойчивость

спермы собак к замораживанию ..................................................... 60

3.7.1. Влияние концентрации лактозы................................................... 60

3.7.2. Влияние концентрации глицерина ............................................... 61

3.7.3. Эффективность замораживания спермы в зависимости

от концентрации желтка............................................................... 64

3.7.4. Криопротективное влияние низкомолекулярных тиолов......... 65

3.7.5. Влияние синтетических жирорастворимых антиоксидантов ... 67

3.7.6. Протективная эффективность поверхностно-

активных веществ.......................................................................... 74

3.7.7. Криоустойчивость спермы собак в зависимости от

состава среды................................................................................ 75

3.8. Криовыживаемость сперматозоидов собак в зависимости

от температуры и способа оттаивания..................................................................................77

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..............................................................................................................80

ВЫВОДЫ..............................................................................................................91

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ..............................................................................93

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................................................94

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Искусственное осеменение животных является высокоэффективным методом улучшения породных и продуктивных качеств животных. В настоящее время метод искусственного осеменения сельскохозяйственных животных применяется во всем мире для ускорения генетического прогресса в животноводстве.

Однако, данный метод пока недостаточно широко используется в племенной работе с собаками, хота в последние годы во многих странах мира возрос интерес к проблемам их искусственного осеменения с использованием замороженной спермы.

С помощью метода искусственного осеменения можно решить ряд проблем в собаководстве. В частности, при использовании замороженной спермы, возможно её накопление от выдающихся производителей и длительное хранение в криобанке в течение многих лет. Использование крио-консервированной спермы позволяет производить её международный обмен без необходимости перевозки самих собак. При этом появляется возможность заказного осеменения сук спермой любого производителя.

Искусственное осеменение позволяет предотвращать возникновение многих заболеваний, передающихся половым путём, так как в состав синтетических разбавителей спермы обязательно вводятся антибиотики и исключается половой контакт животных.

Слабое внедрение в практику данного метода обусловлено низкой фертильностью замороженно-оттаянной спермы собак. В частности, при обычном влагалищном введении криоконсервированной спермы, опло-дотворяемость сук не превышает 30-40%.

Биологические причины данного явления изучены пока очень слабо и требуют дальнейших всесторонних исследований.

В этой связи особую актуальность приобретают вопросы изучения биологических особенностей спермы собак в связи с её криоустойчи-востью.

Кроме того, не менее важное значение имеют вопросы разработки более совершенных методов повышения устойчивости спермы собак к

глубокому замораживанию.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы является изучение биологических особенностей спермы собак и влияние ряда факторов на её устойчивость к глубокому замораживанию.

Для достижения этой цели в диссертации были поставлены следующие задачи:

- изучить биохимические особенности спермы собак;

- определить устойчивость спермы собак к перекисному окислению ли-пидов в процессе криоконсервации;

- выяснить содержание антиоксидантных ферментов в нативной и крио-консервированной сперме собак;

- определить влияние криообработки на содержание АТФ в сперматозоидах;

- изучить влияние ряда факторов на устойчивость спермы собак к глубокому замораживанию;

- исследовать криопротективное влияние низкомолекулярных тиолов, жирорастворимых антиоксидантов и некоторых поверхностно-активных веществ;

- выяснить оптимальные режимы оттаивания спермы собак в гидроот-таивателе.

Научная новизна исследований. Впервые изучено содержание антиоксидантных ферментов в сперме собак и её устойчивость к перекисному окислению липидов в процессе криоконсервации. Выяснено содержание АТФ в нативных и криоконсервированных сперматозоидах собак.

Впервые проведено сравнительное изучение влияния на устойчивость сперматозоидов к замораживанию низкомолекулярных тиолов и жирорастворимых антиоксидантов. Определено влияние некоторых факторов на криоустойчивость спермы собак. Доказана более высокая эффективность повышенных температур оттаивания спермы собак, замороженной в виде гранул.

Практическая значимость. Использование низкомолекулярных тиолов - восстановленного глутатиона и унитиола, повышает подвижность и

живучесть оттаянных сперматозоидов. Введение в состав замораживающей среды для спермы собак жирорастворимых антиоксидантов ИХФГАН-3 и БОТ, повышает криоустойчивость сперматозоидов. Оттаивание спермы собак при повышенных температурах (60-80°С) способствует повышению подвижности и живучести сперматозоидов.

Хемилюминесцентный метод определения концентрации АТФ в сперматозоидах собак может использоваться в качестве лабораторного экспресс-метода оценки биологической полноценности криоконсервиро-ванной спермы.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены

на:

- учёном совете ВНИИплем, 1998;

- научно-производственной конференции "Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения". РАМЖ. 1998;

- расширенной межотдельской конференции ВНИИплем, 1999.

Публикации по результатам исследований. По теме диссертации опубликовано 4 статьи.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1»1. Физиологические и биохимические особенности спермы собак

Эякулят у собак состоит из трех фракций (Linde-Forsberg С., 1995). В состав первой входят секреты уретральных желез и эта фракция выделяется в течение 0,5-1 минуты. Её объём достигает 1-5 мл. Вторая фракция объёмом 1 -3 мл содержит в основном сперматозоиды и выделяется в течение 1-2 х минут. Объём третьей фракции может достигать 10-30 мл и он состоит из секретов предстательной железы. Продолжительность её выделения колеблется от 5 до 30 минут.

По данным Атаяп R.P. (1986) средний объём эякулята у собак массой 10-34 кг составляет 2,4 ± 0,3 мл; 35-39 кг - 3,9 ± 0,5 мл и с массой 6084 кг - 5,4 ± 1,3 мл. При этом средняя концентрация сперматозоидов составила 209,359 и 228 млн/мл соответственно.

По данным других исследователей средний объём эякулята у собак составляет 5-10 мл, а концентрация сперматозоидов колеблется от 62 до 300 млн/мл (Boucher J.H. е.а., 1958; Stockner Р.К. е.а., 1991; Weitze K.F., 1991).

Размеры сперматозоидов собак составляют: длина головки - 6,5 микрон; ширина головки - 4 микрона; общая длина - 55-65 микрон (Милованов В.К., 1962). Это на 18-22% меньше, чем размеры сперматозоидов быка, барана и хряка.

Подвижность сперматозоидов в нормальных эякулятах собак составляет 75-85%, а число морфологически нормальных клеток достигает 80-90% (Boucher J.H. е.а., 1991; Rota А.Е. е.а., 1995).

Число сперматозоидов с морфологическими изменениям в свежепо-лученных эякулятах собак в среднем составляет 10-35% (Stochiier Р.К. е.а., 1991; Rota А.Е. е.а., 1995). Причем, на долю половых клеток с повреждениями жгутика приходится 17 %; с изменениями головки - 6 % и с повреждениями акросом - 2-10 %.

Сперматозоиды собак способны длительно переживать в половом тракте суки (Doak R.L. е.а., 1967). Например, подвижные сперматозоиды обнаруживали в матке и яйцеводах сук через 4-6 дней после спаривания.

Сперматозоиды скапливаются в железах матки.

Удельный вес семени собак составляет 1,1; депрессия точки замерзания - 0,58-0,60, a pH - 6,7-6,8 (Милованов В.К., 1962).

По данным Rota А. е.а., (1985), осмолярность семени собак достигает 316 мОсм.

В семени собак, по сравнению с другими видами сельскохозяйственных животных, содержится наибольшее количество воды - 97,6% и наименьшее сухого вещества - 2,4% (Милованов В.К., 1962; Mann Т., 1964).

В сперме собак обнаружено также повышенное содержание кальция по сравнению со спермой быков, баранов и хряков (Tash J.S., Means A.R., 1983). Например, в эпидидиальной плазме собак концентрация общего и свободного кальция составляла 1,7 и 0,88 мМ, а в семенной плазме - 1,2 и 18,6 мМ.

Сперматозоиды собак совершенно иначе, чем сперматозоиды других видов сельскохозяйственных животных, реагируют на pH, тоничность среды и её ионный состав (Wales R.G., White T.G., 1958).

У кобелей в сперме практически нет фруктозы, лимонной кислоты и сорбитола, что согласуется с даными об отсутствии семенных пузырьков у этого вида животных (King Т.Е., Mann Т., 1959). Например, в сперме собак содержится фруктозы менее 1 мг/100 мл, в то время как у баранов, быков и хряков, соответственно содержится 150, 120 и 40 мг фруктозы/100 мл спермы.

Однако, в сперме собак имеется способность к фруктолизу. Причем, дыхательная способность отмытых сперматозоидов очень высокая и она зависит от добавления фруктозы и некоторых других веществ (Bartlett D., 1962). В частности, процент увеличения величины дыхания при добавлении глюкозы к отмытым сперматозоидам составлял 119 %; фруктозы -206 %; глицерина - 118 % и молочной кислоты - 269 %.

У кобелей очень хорошо развита простата и её секрет содержит много протеолитических ферментов - фосфатаз и глюкуронидазы (Mann Т., 1964).

Уровень гиалуронидазы в семенной плазме собак очень низкий

(Swyer G.I., 1947).

По данным Conchile J. and Мшш T. (1957), в сперме собак выявлена высокая активность а-маннозидазы и (3- ацетилглюкозаминидазы.

В сперме собак обнаружена повышенная концентрация фермента муциназы (Милованов В.К., 1962).

Кроме того показано, что в сперме собак содержится липолитиче-ский фермент - монобутираза (Иванов И.И., Андреев Н.Н., 1916). Помимо вышеуказанных ферментов, по данным этих авторов, в семени собак обнаружены также фенолоксидаза, пероксидаза и каталаза.

В сперме собак, в отличии от спермы баранов, быков, хряков и жеребцов, практически нет глицерофосфорилхолина (Mann Т., 1964), зато обнаружено присутствие эрготионина.

Изучение фосфолипидного и жирнокислотного состава липидов сперматозоидов собак (Daiin-Beniiet А., е.а., 1974) показало, что они содержат большое количество фосфатидилэтаноламина, сфингомиелина и этаноламинплазмалогена, но низкий уровень - холннплазмалгена. Среди жирных кислот преобладают пальмитиновая и докозапентаеновая кислоты.

Предпринимались попытки выяснения сроков капацитации в све-жеполученных образцах сперматозоидов собак. При этом было установлено, что наиболее высокая пропорция капацитированных сперматозоидов отмечалась через 3 часа инкубации спермы (Benigni L., 1997).

По данным Rota А. е.а. (1998), спонтанная акросомная реакция, наблюдаемая сразу после капацитации, отмечалась через 2 часа инкубации образцов сперматозоидов собак in vivo.

У сперматозоидов собак, в отличии от других видов сельскохозяйственных животных, не наблюдается инфлюкс ионов кальция внутрь клеток после криовоздействия (Quinn P.J., White I.G., 1966).

Именно этим некоторые исследователи объясняют факт устойчивости сперматозоидов собак к воздействию холодового шока (White I.G., 1993).

Показано, что введение ионов кальция в инкубационную среду, ин-

гибирует наступление акросомной реакции в сперматозоидах собак (Mahi С.A., Yanagimachi R., 1978).

Имеются сообщения, что сперматозоиды собак имеют более высокую подвижность и большую скорость движения по сравнению с другими видами домашних животных (England G.C., Allen W.E., 1992). Эта биологическая особенность сперматозоидов собак необходима для более быстрого достижения спермиями цервикального канала и матки.

Сперматозоиды собак характеризуются высокой способностью к гиперактивации подвижности, что необходимо для успешного проникновения половых клеток к месту оплодотворения и для нормального проникновения через зону пеллюцида яйцеклетки (Suarez S.S., 1996).

Имеются данные, что стимуляция капацитации сперматозоидов собак достигается при их взаимодействии с секретами яйцевода или с гомологичной зоной пеллюцида (Kawakame Е. е.а.„ 1993).

Кроме того, для капацитации сперматозоидов собак, как и для спермиев других видов сельскохозяйственных животных большое значение имеет повышение концентрации бикарбоната в окружающей среде (Hewitt D. A, England G.C., 1997).

1.2. Механизмы повреждений сперматозоидов животных при криоконсервации

Выяснение причин и механизмов повреждений половых клеток в процессе криоконсервации имеет большую важность для успешной разработки и совершенствования методов глубокого замораживания спермы различных видов сельскохозяйственных животных. Уже накоплен большой материал о морфологических, биохимических и биофизических изменениях в сперме различных видов сельскохозяйственных животных, происходящих при криоконсервации.

Как известно, впервые потомство от осеменения животных спермой, замороженной до -196°С было получено в 1949 году ( Смирнов И.В., 1949; Polge С., е.а., 1949).

С тех пор предложено несколько теорий, объясняющих причины повреждений сперматозоидов при замораживании, хотя до сих пор не существует какой-то одной главной теории криоповреждений половых клеток (Милованов В.К., 1962; Кононов В.П., 1982; Курбатов А.Д. и др., 1988; Polge С., Rowson L.E., 1952).

Например, по мнению Luyet В J. and Gehenio P.M. (1940), гибель клеток объясняется образованием кристаллов льда при замораживании и механическим повреждением клеток.

Lovelock J.E. (1957) предложил липопротеидную теорию гибели клеток при замораживании, объясняющую их гибель повреждением липо-протеидов клеточных мембран концентрированными растворами солей.

Теория минимального объёма объясняет криодеструктивные повреждения клеток тем, что при дегидратации может снижаться их минимальный объём и может происходить денатурация мембранных белков (Maiyman Н.Т. е.а., 1977).

Другие исследователи объясняют гибель клеток при замораживании денатурацией белков вследствие образования дисульфидных связей при окислении SH-групп (Levitt J., 1962).

По мнению Mazur Р. (1965), в результате низких скоростей охлаждения, клетки подвергаются отрицательному воздействию гипертонических концентраций раствора. При этом неблагоприятное влияние на клетки оказывают не только гиперконцентрированные растворы, но и повышенная осмолярность раствора.

Выделяют два важных температурных интервала при криоконсер-вации, которые оказывают неодинаковое физико-химическое воздействие на половые клетки (Пушкарь Н.С. и др., 1984). Первый диапазон температур включает охлаждение от физиологических значений до 0°С. При быстром охлаждении сперматозоидов до 0°С наблюдается холодовой шок. При этом нарушается подвижность сперматозоидов и их морфологическая структура, что резко снижает их оплодотворяющую способность (Осташко Ф.И., 1964).

Кроме того, при охлаждении в данном температурном интервале, в

половых клетках отмечается разобщение дыхания и фосфорилирования, а также увеличивается их катионная проницаемость (Курбатов А.Д. и др., 1988; Woolgar А.Е., 1971).

Пусковым механизмом многих биоповреждений клеток при охлаждении является фазовый переход липидов клеточной мембраны из жидкокристаллического состояния в гелевую фазу (Белоус A.M. и др., 1987). Температура фазового перехода зависит от длины и степени насыщенности жирных кислот в липидах.

При увеличении числа двойных связей в жирнокислотных молекулах �