Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие гликогенфосфорилазы и креатинкиназы из скелетных мышц кролика

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие гликогенфосфорилазы и креатинкиназы из скелетных мышц кролика"

РГб Ой

, АКАДЕМИЯ НАУК РОССИИ

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. Н. БАХА

______

' ' На правах рукописи

УДК 577.152.2.

ХАКИМОВА Аида Хатифовна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГЛИКОГЕНФОСФОРИЛАЗЫ И КРЕАТИНКИНАЗЫ ИЗ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ КРОЛИКА

03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Вульфсон П. Л.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Курганов Б. И.

доктор биологических наук Муронец В. И.

Ведущая организация: Кардиологический научный центр РАМН.

Защита диссертации состоится -/ /Ъ&^ё/и) 1994 г. в час. на заседании Специализированного Совета

К 002. 96.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А. Н. Баха РАН (117071, г. Москва, Ленинский проспект, 33, кор. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (117071, г. Москва, Ленинский проспект, 33, кор. 1).

Автореферат разослан 5994 г

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук

М. И. Молчанов

ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В процессах жизнедеятельности клетки значительная роль принадлежит ферментативным реакциям, протекающим под действием фермент-ферментных комплексов. Изучению подобных комплексов в настоящее время уделяется особое внимание. Функционирование ферментов в клетке связано о их локализацией на клеточных структурах. Образование компартментов, в которых сосредоточены необходимые ферменты и пулы метаболитов, приводит к протеканию ферментативных процессов с наибольшей эффективностью.

Трансформация энергии в мышечной тквни обеспечивается обратимой ассоциацией ферментов на миофибриллярных белках. К такой группе ферментов . следует отнести креатинкиназу, выполняющую структурную и ферментативную функции. Обе. функции связаны с обеспечением мышечного сокращения энергией и ресинтеза АТФ. Скорость креатинкиназной реакции зависит как от отношения АТФ/АДФ, так и от отношения - креатинфосфат/неорганический фосфат (КрФ/Ф„). Быстрое использование Ф„ может повысить

Л Н

вффективноеть действия креатинкиназы. Утилизация Фн происходит в ключевой реакции гликогенолиза, катализируемой

гликогенфосфорил азой.. Локализация' креатинкиназы и гликогенфосфорилазы на одних и тех же мышечных белках, в частности, на М- и I- линиях^ миофибрилл создает благоприятны® условия их ассоциации. Мойно предположить, что образование комплекса между етой парой ферментов способствует согласованному действию всех систем, контролирующих оптимальное функционирование мышц* Поэтому получение новой хшформэция о

фермент-ферментных комплексах в мышечной клетке, об условиях их образования и распада, представляется актуальным направлением исследований в внзимологии.

Цель работы. Цель исследования состояла в том, чтобы выяснить возможность образования комплекса указанных ферментов с помощью физико-химических и кинетических методов, а также охарактеризовать его свойства. В соответствии о поставленной целью наше внимание было уделено решению следующих задач.

1. Изучить возможность образования комплекса гликогенфосфорилазы Ъ с иммобилизованной на ВгСИ-сефарозе хреатинкиназся.

2. Исследовать влияние различных физиологических факторов (ионной силы, рН, субстратов и эффекторов гликогенфосфорилазы Ъ) на ассоциацию ферментов.

3. Получить меченую флуоресцирующим соединением гликогенфосфорилазу Ъ и охарактеризовать ее взаимодействие со свободной креатинкиназой.

4. Выяснить область локализации креатинкиназы на молекуле гликогенфосфорилазы.

Научная новизна и практическая значимость работы. В последний период времени накоплено достаточно много информации о значении белок-белковых взаимодействий для функционирования клетки. Однако о способности к ассоциации таких функционально связанных ферментов, как креатинкиназа и гликогенфосфорилаза, ничего не было известно.

Активность гликогенфосфорилазы, катализирующей пусковую реакцию распада гликогена, лимитируется концентрацией неорганического фосфата, основным источником которого служит

*

креатинфосфат (КрФ). Синхронизация креэтинкинззной и фосфорилазной реакций, повышение их вффективности, возможны, по-видимому, в случае ассоциации ферментов. В диссертационной работе при помощи ряда методов впервые получены сведения об образовании комплекса между гликогенфосфорилазой и креатинкиназой. Использование иммобилизации креатинкиназы на ВКДО-активированной сефарозе 4В позволило установить, что гликогенфосфорилаза способна взаимодействовать как со свободной, так и с иммобилизованной формами креатинкиназы. Применение методов аффинной фронтальной хроматографии, распределительного равновесия, флуориметрического титрования, кинетического анализа позволило охарактеризовать комплекс, изучить условия его образования и влияние субстратов и вффекторов гликогенфоефорилазы Ь на ассоциацию ферментов. Анализ экспериментальных данных позволяет полагать, что специфический участок связывания креатинкиназы расположен на аллостерическом домене субъединицы гликогенфоефорилазы Ъ.

Результаты диссертационной работы расширяют наш знания о функционировании креатинкиназы и гликогенфоефорилазы в мышечной клетке. (

Материалы диссертации могут быть использованы в лекционных спецкурсах, читаемых на кафедре- биохимии Биологического факультета МГУ, а также в научной работе кафедры, института биохимии им.А.Н.Баха РАН и др.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на кафедре биохимии Биологического факультета МГУ.

Публикации. По теме диссертации опубликована работа, одна работа в печати.

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 153 страницы машинописного текста, 10 таблиц, 25 рисунков. Список литературы включает 177 источников.'

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Выделение и измерение активности ферментов. Гликогенфосфорилазу Ъ и креатинкиназу выделяли из скелетных мышц кролика по ранее описанным методам (PiBhei»,Krelis,1962, "Практикум по биохимии", изд. МГУ, 1989). Определение активности гликогенфосфорилазы Ь проводили по реакции синтеза гликогена, измеряя количество образовавшегося неорганического фосфата. Активность глшсогенфосфорнлазы b выражали в мкмолях Ф„/мин мг

XX

белка. Активность креатинкиназы определяли рН-метрическим методом по поглощению протона в реакции образования АТФ (Белоусова и др., 1937). Активность креатинкиназы выражали в г-экв Н+/мин мг белка.

2. Получение и измерение активности субфрагмента S1 миозина. Субфрагмент S1 миозина получади а-химотриптическим протеолизом миозина (Weeds, Pope, 1977). Определение активности субфрагмента S1 проводили по реакции гидролиза AT®, измеряя количество освободившегося неорганического фосфата.

3.Иммобилизация креатинкиназы на BrCN-сефарозе. Сефэрозу

б

4В активировали бромцианом (1-30 мг бромциана на мл осевшего геля), затем быстро отмывали гель г последовательно 0,1М бикарбонатным буфером (рН 9,0), водой, 10 мМ Na-фоофэтным бугром о 1 мЫ ЯДТА (рН Й,0). Срапу не проводили ремздаю присоединения белка (Biokerstaíf, Мое, 1976). Для блокирования оставшихоя реакционноепоообшх груш использовали 0,1М раствор глицина (рН 8,0). Контрольный препарат получали обработкой активированной бромцианом сефарозы 4В раствором глицина. Концентрацию иммобилизованного белка определяли по модифицированному методу Брэдфорд (Asryants et al., 1985 ). Активность иммобилизованной креатинкиназы определяли рН-метрическим методом, а также в сопряженной системе, состоящей из гексокиназы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы в присутствии НАДФ+, восстановление , которого регистрировали

спектрофотометрически при 34D нм.

4.Фронтальная хроматография. Колонку (0,6x12 см), заполненную иммобилизованной на BrCN-сефарозе креатшшшазой, уравновешивали буферои (25 мМ ICES. 0,5 мМ дитиотреитол, рН 6,8). Гликогенфосфорилазу Ъ и еффекторы растворяли в этом же буфере, наносили на колонку и сразу же начинали измерять объем алюата. Скорость влшрования составляла 1,8-2,2 мл/чео, объем фракций -0,2 мл. Элюирование проводили до достижения равенства концентраций исходного и выходящего о колонки раствора гликогенфосфорилазы. Профили влюции строили по данным активности выходящей гликогенфосфорилазы шш по количеству выходящего белка. Объем влшрования определяли как среднее сечение восходящего участке кривой.

5.Распределительное равновесие. В пробирки помещали

аликвоты суспензии иммобилизованной креатинкиназы, добавляли различные количества гликогенфоофорилазы и вЗфекторов в буфере (25 мМ MES, 0,5 мМ дитиотреитол, pH 6,8). После 30-минутной инкубации при постоянной перемешивании (20°0) и последующего оседания геля в надосадочной иидкости измеряли количество свободной гликогенфоофорилазы, при втом учитывали внутренний объем геля. Концентрацию адсорбированной гликогенфоофорилазы вычисляли по разности мезду исходной и конечной концентрациями фермента.

6. Модификация гликогенфоофорилазы b N-0-пиренил)-малеимидом. Перед модификацией фермент освобождали от АМФ, пропуская раствор гликогенфоофорилазы через колонку, заполненную смесью активированного угля (Norit А) с целлюлозным порошком (1:1). К раствору фермента добавляли рассчитанное количество 1,2 мМ раствора реагента в абсолютном спирте. Через 20 часов инкубации (4°С) раствор диализовали против 10 мМ буфера MES,pH 6,8. Небольшое количество агрегировавшего белка удаляли центрифугированием. Количество включенной метки определяли спектрофотометрически, используя ков®£мциент молярного поглощения £344=13 600 М~1см~1 (ОгаоеИа, Lehrer, 1980).

7. Определение количества SH-групп. Для титрования свободных SH-rpyim модифицированной гликогенфоофорилазы • Х> ■■ использовали 5,5'-дитиобис-нитробензойную кислоту (ДТНБ).Титрование белка (20 мкЫ) ДТНВ проводили в буфере, оодериагцем 25 ММ MES, 1 мМ ЗДТА, 0,5 M KOI (pH 6,8). Конечная концентрация ДТНВ составляла 0,85 Ы.

8. &луориметрнческое титрование меченой гликогенфоофорилазы Ь. Спектра флуоресценции...,0,4 мкМ раствора

модифицированной гликогенфосфорилазы Ь снимали в области 375-490 нм при длине волны возбувдаюцего света 344 нм. Флуориметричеекое титрование модифицированной гликогенфосфорилазы Ь креатинкиназой и эффекторами проводили до относительной стабилизации флуоресценции.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Свойства гликогенфосфорилазы Ь в присутствии

креатинкиназы.

Исследование влияния креатинкиназы на свойства гликогенфосфорилазы Ъ показало, что в зависимости от количества креатинкиназы, привнесенного в реакционную среду, гликогенфосфорилаза Ь активируется на 20-30%. Обнаруженная активация гликогенфосфорилазы Ь под действием кревтинкиназы в отсутствие АМФ составила около 2056. В связи о этим можно было предположить, что креатинкиназа оказывает влияние на регуляторные свойстве гликогенфосфорилазы Ъ.| При изучении зависимости активности фермента от концентрации АМФ оказалось, что в присутствии креатинкиназы Б-образная кривая превращается в гиперболическую, коэффициент Хилла (пд) уменьшается от-1,4 до

1. Снятие кооперативное™ АМФ-связывающих центров под действием креатинкиназы сопровождается, по-видимому, информационными изменениями молекулы гликогенфосфорилазы Ь. На такую возможность указывает также стабилизирующее влияние креатинкиназы на активность гликогенфосфорилазы при терыоинактивации.

Кинетические параметры гликогенфосфорилазы Ъ по отношению к субстратам (глюкозо-1 -фосфату, гликогену) в присутствии креатинкиназы не изменялись.

2. Изучение взаимодействия гликогенфоофорилазы с креатинкиназой.

Предполокение о возможном взаимодействии

гликогенфосфорилазы и креатинкиназы основывается на том, что оба фермента, как известно из литературы, локализуются на одних и тех же отруктурах миофибрилл. Имеются експериментальные данные, указывающие на присутствие гликогенфосфорилазы и креатинкиназы на М- и 1-линиях в оаркомерах поперечнополосатых мышц (Подлубная П.А., 19fl7, Hc1f.mann, Kppcrtbcr>gcr>, 197Я, Maruyama et al.,1985).

В процессе мышечного сокращения креятинкиназа,сопряженная о ииозиновой АТФазой,обеспечивает образование АТФ и неорганического фосфата.Количество свободного неорганического фосфата в покоящейся мышце очень мало (1,5-2 мМ) (Chanoe et al.,1936). Поскольку гликогенфосфорилазы для ®н равна 5-15 мМ ( Helirtreloh, Corl,1964),то фериент практически неактивен.Увеличение скорости гликогенолиза под действием гликогенфосфорилазы в сокращающейся мышце возможно, при повышении количества в>н,основным источником которого является креатинфосфат.Таким образом,креатинкиназа обеспечивает связь нейду сокращением мышц и скоростью гликогенолиза. Можно полагать,что взаимодействие креатинкиназы и гликогенфосфорилазы приводит к более вффективному снабжению внершей работающей мышцы.

Для изучения ассоциации креатинкиназы и

гликогенфосфорилазы мы использовали различные методические подходы, ■ применяемые при исследовании белок-белковых взаимодействия (ЩоЬо1 ег а1.,1974, Винзор, 1989, Такгата, 1986, Кава1, 1еМ1, 1975). Использование хроматограф:«! на колонке, заполненной иммобилизованной на ВгСИ-сефарозе креатинкиназой, позволило установить, что гликогенфосфорилаза Ъ значительно задерживается при проховдении через колонку по сравнению с контрольным опытом, в котором колонку заполняли дезактивированной ВгСИ-сефарозой (без креатинкиназы). Удерживание гликогенфоофорилазы Ъ на колонке с иммобилизованной креатинкиназой определяется концентрацией раствора фермента, экспериментальным параметром служили величины объемов влюирования, наиболее точно определяемые методом фронтальной хроматографии. На рис.1 показаны профили елшрования гликогенфосфорилазы Ъ, полученные при различных концентрациях фермента. Как видно, с • увеличением концентрации удерживание ослабляется и объем влюирования приближается к контрольному. Эти данные свидетельствуют о взаимодействии свободной гликогенфосфорилазы Ь о иммобилизованной креатинкиназой. Количественный анализ результатов (МоЬо! et а!., 1974) позволил оценить аффективную концентрацию иммобилизованной креатинкиназы и константу диссоциации комплекса, Кд«' 0,49 шМ. Величина Кд указывает не относительную прочнооть образувдегося комплекса.

Объем елшрования, мл Рио.1. Фронтальная хроматография гликогенфосфорилазы Ъ на колонке' о иммобилизованной на ВгСК-оефарозе креатинкинвзой. 2,3,4 и 5 - профили элшрований различных концентраций ферменте (1,0 мкМ, 0,6 мкМ, 0,25 мкМ и 0,1 мкМ соответственно), 1 -профиль елшрования гликогенфосфорилазы Ъ в отсутствие связывания (колонка без креатинкинвзы).

Для того, чтобы установить, повлияла ли иммобилизация на способность ' креатинкиназы взаимодействовать о

глнкогенфоофорилазой, мы применили конкурентный метод аффинной хроматографии. Было исследовано поведение хроматографмческой системы, содержащей свободную гликогенфосфорилазу и две форда

креатинкиназы - свободную и ковалентно связанную, которые конкурировали за связывание с гликогенфосфорилазой. В данном случае наблюдали зависимость объемов елшрования от концентрации свободной креатинкиназы при постоянной концентрации гликогенфоефорилазы. Результаты опытов показали, что обе формы креатинкиназы - иммобилизованная и свободная, взаимодействуют с гликогенфосфорилазой Ь, их комплексы имеют близкие значения Кд (0,49 и 0,19 мкМ соответственно). При этом на фосфорилазе, находящейся в комплексе о иммобилизованной креагинкиназой, связывается одна молекула свободной креатинкиназы. Полученные результаты позволяют заключить, что стехиометрия связывания гликогенфоефорилазы Ъ о иммобилизованной креатинкиназой равна 1:1.

Рио.2. Взаимодействие гликогенфоефорилазы Ъ с иммобилизованной креатинкиназой. Изотерма адсорбции, полученная методом. распределительного равновесия.

[ГФЬ] мкМ

связ.• 0,4

0,3 .

0,2 .

0,1 .

[ГФЬ]

свой.

,мкМ

Образование комплекса между фосфорилазой и иммобилизованной креатинкинаэой было показано также методом распределительного равновесия. Изотерма адсорбции представлена на рис.2. Константу равновесия рассчитывали преобразованием изотеры адсорбции в линейную форму по уравнению Сквтчарда. При иепользоптпго в кпчостпп контрольного препарата полностью дезактивированной BrCN-сефарозы адсорбцию не обнаруживали. Рассчитанная величина равна 0,69+0,19 мкМ.

Как упоминалось выше, креатинюшаза является не только ферментативным, но и структурным компонентом в мышечном компартменте (Подлубная З.А., 1937). Известно, что креатинкиназа связывается с миозином (Mani, Kay, 1976). Мы исследовали поведение субфрагмента S1 миозина, а также лактатдегидрогеназы, по отношению к иммобилизованной крееишкиназе. Результаты, полученные методом аффинной хроматографш, указывают на

образование комплексов белков о иммобилизованной креатинкинаэой.

2+

Комплекс с субфрагментом миозина S1 в отсутствие ионов Ca характеризуется величиной Кд 1,48 мкМ. Лактатдегидрогеназа образует более прочный комплекс, Кд=0,33 МкМ.

3. Влияние ионной силы и на взаимодействие ферментов.

Для того, чтобы выяснить возможность существования биферментного комплекса в мышечной клетке, провели анализ связывания белков в зависимости от ионной силы и рН, используя методы фронтальной хроматографии и распределительного равновесия. Хроматографический експеримент заключался в

елщрований гликогенфосфорилазы Ь, связанной е иммобилизованной креатинюшазой, градиентом раствора НаС1 (0-0,5 М). Из рис 3 видно, что гликогенфоефорилаза освобождается из комплекса при 0,15-0,20 м N801. Площадь пика соответствует количеству белка, связанного на колонке.

[гаъ ], 0,2-

мкМ

[НаС1},

„ 12

бъем елюирования, мл

Рис.3. Десорбция гликогенфосфорилазы Ь с колонки, заполненной иммобилизованной на ВгСИ-сефарозе креатинкяназой, градиентом ионной силы (0,5М МаС1-0,5мк.М ГФЬ).

Методом распределительного равновесия показано, Что-адсорбция фосфорилазы • на иммобилизованной креатинкиназе происходит вплоть до 0,5М КС1. Следовательно, при физиологической ионной силе мотет существовать комплекс между креатинюшазой и гликогенфосфорилазой Ь.

Зависимость связывания ферментов от рН представлена на

рис.4. Для каждого значения рН методом распределительного равновесия были получены изотермы адсорбции и рассчитаны величины Кд. Из рисунка видно, что наиболее прочный комплекс с иммобилизованной креатинкиназой образуется при физиологических значениях рН.

17

Рис.4. Влияние рН на взаимодействие- гликогбнфосфо-рилазы Ь с -"иммобилизованной креатинкиназой.

д*

мкМ

г -

I .

рн

4.Влияние аллостеричеокого активатора гликогенфосфори-лазы Ъ - АШ> - на взаимодействие .ее с креатинкиназой.

АМФ активирует гликогенфосфорилазу . Ъ, связываясь в аллоотерическом центре каждой субъеданицы фермента. В кинетических опытах мы обнаружили, что креатинкиназа способна активировать гликогенфосфорилазу Ъ. Чтобы попытатьоя выяснить, в чем заключается причина сходства их действия на фермент, мы иооледовада хроматографгаёское поведение сиотеш, состоящей из

гликогенфоофорилаэы b, иммобилизованной креатинкиназы и АМФ.

Через колонку о иммобилизованной креатинкиназой пропускали раствор фосфорилазы (0,5 мкМ), содержащий различные концентрации АМФ ( от 0,02 до 0,5 мМ). По мере повышения концентрации АМФ объемы елшрования фосфорилазы уменьшались, приближаясь к объему влшрования в отсутствие связывания.

Результаты этих опытов позволили определить константу диссоциации комплекса ГФЪ-АМФ (Kasai, Ishii, 1976), Кд=20 мкМ, а также оценить связывание гликогенфоофорилаэы b с иммобилизованной креатинкиназой в присутствии АМФ. Изменение концентрации АМФ от 0,02 до 0,15 мМ сопровождается изменением Кд биферментного комплекса от 1,59 до 9,63 мкМ, что указывает на ослабление связывания ферментов. В присутствии 0,5 мМ АМФ взаимодействие креатинкиназы. и фосфорилазы полностью прекращается.

Анализ полученных данных согласно теории мультивалентного связывания (Kyprlanou, Yon, 1978) показал, что на фермент-ферментном комплексе связывается одна молекула АМФ. Эти результаты можно объяснить ассоциацией креатинкиназы на аллостерическом домене гликогенфосфорилазы Ь, в результате чего ета субъединица, по-видимому, заблокирована иммобилизованной креатинкиназой и недоступна для АМФ..

5.Влияние эффекторов на взаимодействие гликогенфосфорилазы и иммобилизованной креатинкиназы.

Влияние ©ффекторов гликогенфосфорилазы на взаимодействие ферментов изучали методами аффинной фронтальной хроматографии

и распределительного равновесия. Проведя хроматографические експерименты по лиганд-зависимому влюированию фосфорилазы с аффинной колонки, мы обнаружили, что аденозин и Г-1-Ф не влияют на скорость прохождения фосфорилазы через колонку, а ИМФ и Г-6-Ф ускоряют влюирование. Показана зависимость влияния еф$ектора от его локализации на белке (табл.1). Так, вффектор, связывающийся в ингибиторном центре (аденозин), на ассоциацию не влияет; Г-1-Ф и глюкоза, евязываяоь в каталитическом центре, незначительно влияют на ассоциацию; нуклеотиды (АМФ, ИМФ, АДФ, АТФ) И Г-6-Ф, связывающиеся в аллостерическоы участке, ухудшают ввязывание ферментов.

Таблица 1

Влияние еффекторов на ассоциацию гликогенфосфорилазы Ь и иммобилизованной креатюдашазы.

Эффектор Концентрация Константа

вффектора, диссоциации,

мМ МКМ

аденозин 0,5 . 0,49

Г-1-Ф .1,0 0,52

глюкоза 2,0 0,78

АТФ . 1,26

АДФ 0,5 2,06

Г-6-Ф . 1,0 2,59

ИМФ • 1,0 4,03

б.Изучение белок-белковых взаимодействий методом включения флуоресцентной метки.

В молекулу гликогенфосфорилезы Ъ вводили флуоресцентную метку, Л-(1-пиренил)малеимид, специфически модифицирующий БН-группы. Условия модификации были подобраны таким образом, чтобы модифицированный белок сохранял свои ферментативные и регуляторные свойства. Препараты гликогенфосфорилезы Ъ, модифицированные по одной БН-группе (в расчете на субъединицу фермента), удовлетворяли втим требованиям, сохраняя 60 % ферментативной активности и кооперативность АМФ-связываюших центров ( коэффициент Хилла пн=И,25).

Используя модифицированную гликогенфоофорилазу Ь, мы исследовали ее взаимодействие с креатинкиназой, аллостерическими еффекторэми, а также влияние креатинкиназы на связывание эффекторов. На рис.5 представлены спектры флуоресценции модифицированной гликогенфосфорилазы Ь в отсутствие и в

присутствии креатинкиназы и Г-6Ч&.__________________________________________

Г I

Рио.5- Спектры флуорес- 2\

ценции модифицированной I / з\\

гликогенфосфорилазы Ь в от- ///— \\\

сутствие тушителей (1), в /и \\

присутствии Г-6-Ф (2), в (и

присутствии креатинкиназы (3). / ^^

' ■......I "» 1 •

380 400 420 Дягаа волны, нн

При добавлении в реакционную среду креатинкиназы наблюдали, как видно из рио 6, тушение флуоресценции метки при сохранении характеристик спектра. Максимальное тушение .рассчитанное из графика ¿У-1 от [КрК]-1, составляло 48,?+2,бЯ5. На рис.6 показана зависимость изменения интенсивности флуоресценции от концентрации креатинкиназы. Связывание креатинкиназы с гликогенфосфоршшзой Ъ оценивали по данным изменения флуоресценции, используя уравнение, предложенное Б.И.Кургановым. Величина Кд для связывания креатинкиназы с модифицированной гликогенфосфорилазой Ь равна 0,71+0,15 мкМ. График, построенный в соответствии о втим уравнением, имеет линейный характер, что указывает на стехиометрию связывания, равную 1:1.

гота* %

Рис 6. (Ьлуориыетрическое титрование модифицированной ЮО гликогенфосфорилазы креатин-киназой. 90

I I

0,12 0,4 0,6 шй

В следующей серии опытов мы проверили влияние эффекторов

гликогенфоефорилазы Ь на интенсивность флуоресценции метки. Из таблицы 2 следует, что нуклеотиды (АЫФ, ИМФ, АДФ, АТФ), а также Г-6-Ф, вызывали тушение флуоресценции модифицированной гликогенфоефорилазы Ь. В то время как аденозин и субстрат фосфорилазы - Г-1-Ф, никакого влияния на флуоресценцию не оказывали. Эти данные свидетельствуют о том, что окружение метки чувствительно только к таким изменениям конформации белка, которые вызывают соединения, связывающиеся на аллостеричееком центре модифицированной гликогенфоефорилазы Ъ. На связывание субстрата в активном центре и ингибитора в близлежащем от активного центра ингибиторном участке метка не реагирует. По результатам тушения флуоресценции определили параметры связывания еффекторов с модифицированной гликогенфосфорилазой Ь, используя уравнение, предложенное в литературе {Яагщ, 1Ие1тап, 1976).

Таблица 2 ■

Влияние эффекторов на флуоресценцию метки и параметры их связывания о модифицированной гликогенфосфорилазой ь.

Эффектор* Максимальное ту- Константа дис- Коэффици-

шение. социации. ент Хилла

% от Р^ о мМ ПН

АМФ 58,3 0,77

. ИМФ 16,5 0,1 1.25

АДФ 20,2 0,43 1,26

АТФ 11.3 3,3 1,66

Г-6-Ф 14,6 0,5 1.15

* использовались концентрации еффекторов на уровне Кт

В одедуш&й серии опытов исследовали влияние креатинкинаэы на связывание нуклеотидов в аллостерическом центре гликогенфосфо-рилазы Ъ, для етого в пробу, содержащую креатинкиназу и модифицированную фосфорилазу, добавляли вффекторы. В таких случаях креа-тинкиназа препятствовала связыванию нуклеотидов (Кд для комплексов: ГФЪ-АМФ -4,0 ММ, ГФЪ-ИМФ -3,33 мМ). На основании описанных результатов мы полагаем, что креатинкинвза связывается в области аллостерическоГо домена гликогенфосфорилазы Ь.

Вывода.

1. Изучено взаимодействие гликогенфосфорилазы Ь о иммобилизованной на ВгСН-сефарозе и свободной креатинкиназой. Показано, что между фосфорилазой и иммобилизованной креатинкиназой происходит образование комплекса о Кд 0,49 мкМ (4°0) и 0,69+0,19 мкМ (20°0) при рН 6,8. ДЛя комплекса свободных ферментов Кд*0,19 мкМ (4°С) при рН 6,8.

2. Показано образование комплекса гликогенфосфорилазы Ь, меченной Н-(1-пиренил)малеимидом, со свободной креатинкиназой. Константа диссоциации в отсутствие, эффекторов равна 0,71+0,15 мкМ при рН 6,8. - ■ "' ■

3. Прочность комплексов гликогенфосфорилазы Ь о иммобилизованной и свободной креатинкиназой ослабляется в присутствии нуклеотидов (АМФ, ¡ШФ, АДФ, АТФ) и Г-6-Ф. Связывание субстрата (Г-1-Ф) и ингибитора (аденозина) не влияет на образование комплекса.

4. Методом кинетического анализа выявлено действие креатинкинаэы на кооперативный еффект гликогенфосфорилазы Ъ по

отношению к АМФ. Коеффициент Хилла при этом уменьшается от 1,4 до 1,0.

5. Полученные результата позволяют считать, что специфический участок связывания креатинкиназы расположен на аллостерическсм домене гдикогенфосфорилазы Ь,

Список работ, опубликованных по теме диссертации,

1.А.Х.Хакимова, Л.К.Сколшева, С.А.Шур, П.Л.Вуяьфсон. Образование комплекса между гликоренфоефорияазой и креатшшинезой скелетных мышц кролика. Доклада Российской Академии Наук, 1993. т.328, N 1, с.112-115.

2.А.Х.Хакимова, Л.К.Сколышева, С.А.Шур, П.Л.Вульфсон. Взаимодействие меяду гликогенфоофорилазой Ъ и креатинкиназой скелетных мышц кролика. Баохяшя, 1994, в печати.

МП «Пети. 3