Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение белков и надмолекулярных комплексов методом дифференциальной сканирующей калориметрией

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение белков и надмолекулярных комплексов методом дифференциальной сканирующей калориметрией"

Московский Государственный Университет имени М.В.Ломоносова

Биологический факультет г, ^ На правах рукописи

ОРЛОВ Виктор Николаевич

ИЗУЧЕНИЕ БЕЛКОВ И НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ МЕТОДОМ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ СКАНИРУЮЩЕЙ КАЛОРИМЕТРИИ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2000

Работа выполнена в отделе физических методов измерений НИИ ФХБ им. А.Н.Белозерского.

Научные руководители: доктор биологических наук Левицкий Д.И.

кандидат физ.-мат. наук Драчев В.А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Болдырев A.A.

доктор биологических наук Макаров A.A.

Ведущая организация: Институт биохимии имени А.Н.Баха РАН

Защита состоится 29 мая 2000 года в 15^ на заседании диссертационного совета Д.053.05.32 по адресу: 119899 Москва, Воробьевы Горы, Московский Государственный Университет имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, аудитория ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского Государственного Университета.

Автореферат разослан _ апреля 2000 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук ЦдаЛ/ Медведева М.В.

'On.^tMlf; 0

Общая характеристика работы

Актуальность темы исследования. Изучение структуры макромолекул занимают центральное место в биохимических и биофизических исследованиях. Одним из основных направлений таких исследований является решение проблемы сворачивания полипептидной иепи белковой молекулы. Современные представления о структуре белковых молекул основываются в основном на информации, получаемой из двух независимых источников - химических исследований последовательности аминокислотных остатков в полипептидных цепях белков (первичной структуры) и кристаллографических исследований трехмерного расположения аминокислотных остатков (третичной структуры). Однако до сих пор не совсем ясно, что заставляет полипептидную цепь свернуться вполне определенным образом. Ясно только, что для понимания процесса сворачивания белка необходимо иметь информацию не только о топологии молекулы, но и о ее термодинамических параметрах. Однако термодинамические данные не могут быть однозначно выведены из структурных данных, они должны быть получены путем прямых измерений энергии дезорганизации нативной структуры белка. Это можно сделать с помощью сканирующей микрокалориметрии, созданной специально для таких целей.

Метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) позволяет изучать процесс тепловой денатурации белков, а изменения характера этого процесса отражают ¡сонформационные изменения в белковой молекуле. В последнее время этот метод все чаще применяется для регистрации и исследования структурных перестроек, происходящих в белках в результате сайт-направленного мутагенеза, специфических химических модификаций и воздействия различных низкомолекулярных лигандов. В то же время возможности применения метода ДСК еще далеко не исчерпаны. Так, например, этот перспективный подход пока еще крайне редко применяется для изучения конформационных перестроек, происходящих в белках, взаимодействующих друг с другом с образованием белковых комплексов или сложных надмолекулярных структур. На наш взгляд, применение метода ДСК предоставляет новые возможности для решения ряда задач современной физико-химической биологии, многие из которых нередко трудно решить другими методами.

Цель н задачи исследований. Цель настоящей работы состояла в том, чтобы оценить возможности исследования методом ДСК конформационных изменений, происходящих в белках под влиянием различных факторов, в результате взаимодей-

ствия белков с низкомолекулярными лигандами и белок-белковых взаимодействий. Среди задач исследования можно выделить следующие:

- исследование механизма необратимой тепловой денатурации креатинкиназы из скелетных мышц кролика и уридинфосфорилазы из Е. coli К-12 с кинетическим анализом данных.

- исследование влияния кофактора на характер тепловой денатурации альдегид-дегидрогеназ на примере фосфорилирующей D-глицеральдегид-З-фосфатдегидро-геказы из Bacillus stearothermophilus (GAPD) и нефосфорилирующей D-глицер-альдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPN) из Streptococcus mutans.

• исследование влияния пяридоксальфосфата (ПЛФ) и различных специфических лигандов - как активаторов, так и ингибиторов, на характер тепловой денатурации гликогенфосфорилазы b из скелетных мышц кролика.

- изучение структурных изменений, происходящих в изолированной головке молекулы миозина (субфрагмент-1 миозина, S1) при образовании комплексов с аналогами неорганического фосфата, моделирующих различные промежуточные состояния АГРазной реакции миозина.

-изучение влияния на тепловую денатурацию тропомиозика и субфрагмента-1 миозина (S1) их взаимодействия с другим мушечным белком - F-актином.

- сравнительное исследование целых вирусов табачной мозаики и белка, образующего вирусную оболочку.

Научная новизна. Впервые получены данные по тепловой денатурации ряда ферментов, ранее не исследовавшихся методом ДСК - креатинкиназы и гликогенфосфорилазы b из скелетаых мышц кролика и уридинфосфорилазы из Е. coli К-12. Предложены модели, описывающие механизм этого процесса с оценкой кинетических параметров отдельных стадий.

Впервые методом ДСК изучено влияние кофактора на тепловую денатурацию фосфорилирующей D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы из Bacillus stearothermophilus и нефосфорилирующей D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы из Streptococcus mutans. Исследовано влияние различных точечных мутаций на термостабильность этих ферментов в отсутствие и в присутствии кофактора. Показано, что связывание кофактора вызывает значительные структурные перестройки в молекуле

фермента, изменяя характер взаимодействий между его каталитическим и кофактор-связывающим доменами.

Показано, что метод ДСК позволяет отчетливо регистрировать структурные изменения, происходящие в изолированной головке молекулы миозина при моделировании различных промежуточных состояний АТРазной реакции миозина. На основании этих данных предложен новый калориметрический тест для анализа конформа-ционных изменений, происходящих в миозиновых головках в процессе АТРазной реакции.

Метод ДСК был впервые применен для изучения комплексов Р-актина из скелетных мышц кролика с другими мышечными белками - тропомиозином и изолированными головками миозина (субфрагмент-1 миозина, 81). Показано, что взаимодействие с Р-актином значительно увеличивает термостабильность данных белков, причем связывание Б! с Р-актином заметно увеличивает термостабильность связанного с Р-актином тропомиозина. На основании этих данных предложен новый калориметрический тест для анализа конформационных перестроек, происходящих в миозиновых головках и в тропомиозине при их взаимодействий с филаментами Р-актина.

С помощью метода ДСК проведено сравнительное исследование целых вирусов табачной мозаики и белка, образующего вирусную оболочку. Показано, что полимеризация белка оболочки приводит к резкому увеличению его термостабильности, а взаимодействие этого белка с вирусной РНК приводит к дополнительной стабилизации структуры вируса.

Теоретическая и практическая ценность. Решение поставленных в диссертационной работе задач позволило разработать новые методические подходы и представить ряд практических рекомендаций, полезных при исследовании методом ДСК сложных комплексных систем. Созданы необходимые предпосылки для дальнейших исследований методом ДСК комплексов различных белков с низкомолекулярными лигандами и с другими белками. Помимо этого, разработано программное обеспечение для компьютерной записи и первичной обработки калориметрических данных, которое в настоящее время успешно используется в НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 25-м Европейском Мышечном Конгрессе (Монпелье, Франция, 1996), на Втором съезде Биохимического Общества (Москва, 1997), на Международном симпозиуме «Структура, стабильность и фолдинг белков: фундаментальные и медицинские

- 3 -

аспекты» (Москва, 1998), на Международном симпозиуме «Биологическая подвижность: современные методы исследований» (Пущино, 1998), на 43-м Конгрессе американского биофизического общества (Балтимор, США, 1999), на 28-м Европейском Мышечном Конгрессе (Йорк, Великобритания, 1999), на II Съезде биофизиков России (Москва, 1999), на Российско-Итальянском рабочем совещании 1ЯСА\У-99 «Новые достижения в калориметрии и их применение», (Италия, 1999) и на Гордоновской научной конференции «Мышца: сократительные белки» (Ныо Лондон, США, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы , описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их

обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы ( _ источников). Работа

изложена на_страницах машинописного текста, иллюстрированного_рисунками.

Краткое содержание ракоты

Во Введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, охарактеризована научная новизна полученных результатов.

Глава I. Обзор литературы. В этой главе рассмотрены современные представления о механизмах тепловой денатурации белка и о применении метода ДСК для регистрации этого процесса. Подробно описаны различные подходы, применяемые для анализа калориметрических данных. Рассматриваются также имеющиеся в литературе данные о променении метода ДСК для исследования тепловой денатурации различных белков.

Глава И. Материалы и методы. В этой главе дано краткое описание используемых материалов и калориметрических экспериментов, которые проводились на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4 (Институт биологического приборостроения РАН, г.Пущино) с капиллярными платиновыми ячейками объемом 0,47 мл. Измерения проводились при скоростях нагрева 0,125-1,0 градус в минуту в диапазоне температур от 20 до 100°С. Для предотвращения возможного дегазирования растворов при повышении температуры во всех экспериментах в ячейках калориметра поддерживалось избыточное давление в 2 атмосферы. Базовую линию записывати, помещая в рабочую и контрольную ячейки используемый в опыте буфер. После охлаждения ячеек до 2,5°С из рабочей ячейки отбирали буфер и

помещали в нее препарат белка в том же буфере. Для проверки обратимости тепловой денатурации исследуемых белков каждый образец подвергали повторному прогреву непосредственно после первого прогрева и последующего охлаждения. Для обработки и анализа кривых теплопоглощения изученных белков использовали пакеты программного обеспечения "Origin 1.16" и "Origin 3.73" фирмы "MicroCal Inc." (США).

Глава Ш. Результаты и их обсуждение. Эта глава состоит из 4 разделов,

расположенных в порядке усложнения изучаемых объектов.

¡.Применение ДСК для изучения механизма необратимой тепловой денатурации белков

Хорошо известно, что тепловая денатурация большинства белков является необратимой из-за ряда сопровождающих ее процессов (например, агрегации денатурированных молекул). В ходе калориметрического эксперимента необратимость выявляется по отсутствию пика теплопоглощения при повторном прогреве образца. Использование методов равновесного термодинамического анализа, успешно применяемых для обратимых тепловых переходов, часто становится неприемлемым для интерпретации экспериментов с необратимо плавящимися белками. Анализ таких данных требует применения иных подходов, которые интенсивно разрабатываются в последние годы. Одним из таких подходов является кинетическое рассмотрение процесса теловой денатурации. Однако, кинетический подход основывается на той или иной модели процесса и требует трудоемкого математического анализа как принятой модели, так и соответствия данной модели полученным экспериментальным данным. К настоящему времени для нескольких простейших моделей проведен теоретический анализ, но вследствие сложности анализа реальных данных пока еще не накоплен достаточный эксперимент&пьный материал для подтверждения универсальности такого рода анализа и широкого его использования. Поэтому в настоящей работе был проведен кинетический анализ необратимой тепловой денатурации двух ферментов, ранее не исследовавшихся методом ДСК - креатинкиназы из скелетных мышц кролика и >'ридинфосфорилазы из Е. coli К-12.

Креатинкиназа - один из главных ферментов энергетического метаболизма скелетных и сердечных мышц. Молекула этого фермента представляет собой димер с молекулярной массой 84 кДа, состоящий из двух идентичных субъединиц. На рис. I представлены кривые теплопоглощения креатинкиназы, полученные при разных скоростях нагрева - от 0, ¡25 до 1,0 градуса в минуту. Как видно, эти кривые заметно схсадеогся ко шкале температур в зависимости от скорости прогрева препарата, что

свидетельствует о кинетически контролируемом процессе тепловой денатурации. Был проведен кинетический анализ данных с использованием трех различных моделей необратимой тепловой денатурации - одностадийной модели, модели Ламри-Эйринга с быстрой обратимой первой стадией и модели, включающей две последовательные необратимые стадии. Показано, что наиболее точно тепловая денатурация креатин-киназы описывается простейшей одностадийной моделью необратимой денатурации. Определена энергия активации процесса, равная 461 ± 0,7 кДж/моль.

Рис.1. Термограммы креатинкиназы, полученные при разных скоростях нагрева (цифры около кривых в °С/мии). Концентрация белка 2.4 мг/мл.

Аналогичные эксперименты были проведены с другим ферментом - уридинфосфорилазой из Е. coli К-12. катализирующей

45 50 55 Температура, 'С

фосфоролиз уридина с образованием рибозо-1-фосфата к урацила. Молекула этого фермента представляет собой гексамер, состоящий из идентичных субъединиц с молекулярной массой каждой субъединицы 27 кДа, образующих три симметрично расположенных димера. Для этого фермента также была обнаружена выраженная зависимость температуры максимума кривой теплопоглощения от скорости нагрева.

Экспериментальные данные также были проанализированы с использованием трех указанных кинетических моделей. Показано, что наиболее точно денатурация уридинфосфорилазы из Е. coli описывается моделью, включающей две последовательные необратимые стадии.

Таким образом, исследование необратимой тепловой денатурации белков методом ДСК при разных скоростях нагрева с последующим кинетическим анализом полученных данных позволяет в ряде случаев получать исчерпывающую информацию о механизме процесса денатурации и оценивать кинетические параметры отдельных стадий этого процесса.

2. Применение ДСК для изучения взаимодействий белков с низкомолекулярными лигандами

В качестве объектов данного исследования были использованы следующие ферменты: фосфорилирующая D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа из Bacillus siecirothermophilus (GAPD), нефосфорилируюшая D-глицеральдегид-З-фосфатдегидро-геназа (GAPN) из Streptococcus mutans, гликогенфосфорилаза b из скелетных мышц кролика, а также субфрагмент-1 миозина (S1) из скелетных мышц кролика, представляющий собой изолированную головку миозиновой молекулы, сохраняющую главные свойства миозина - АТРазную активность и способность взаимодействовать с актином,

Фосфорилирующая D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа (GAPD). Этот фермент, выделенный из В. stearothermophilus, является тетрамерным белком общей массой 144 кДа, состоящим из одинаковых субъединиц, каждая из которых способна связывать одну молекулу кофактора (NAD+)' В отсутствие добавленного кофактора фермент имеет пик теплопоглощения с максимумом при ~78°С (рис. 2а).

1500

1000 500 ~ О

е*

^ зооо

-а

3 2000

Z

i юоо et

и <

о 800

400

j ' 1 ' 1 1 1 ' i я

1 . 1 . 1 . 1 . 1 , 1 . 1 , 1 .

- б ^ 1 4 3Л/1 2Д |

+-Г—'"'I I I ■■-Ь Л1 ■ ■ I ■ 1——t—'

" 8 /л2 „ S

/Ы 4 /л • JJAXsX \

"1 , i , 1 . ! . ,1

60 65 70 75 80 85 90 Температура, °С

95

Рис. 2. Влияние добавок кофактора (NAD+) на тепловую денатурацию нативной GAPD (а) и ее мутантов CI49S (б) и H176N (в). Цифрами обозначены: (1)-белок без добавок,

(2) - с добавкой 0.1 мМ NAD,

(3) - 0.3 мМ NAD, (4) - 1 мМ NAD, (5) - 3 мМ NAD.

Добавление кофактора приводит к резкому увеличению термостабильности белка - в зависимости от концентрации добавленного NAD+ максимум кривой теплопоглощения смещается на 9-15°С в сторону более высокой температуры, при этом

значительно увеличивается энтальпия теплового перехода (площадь под кривой теплопоглощения) и его кооперативность (пик становится заметно уже). Это

свидетельствует о глобальных конформационных изменениях, происходящих в молекуле фермента при связывании кофактора.

Аналогичные эксперименты были проведены с мутантами GAPD с одиночными заменами определенных аминокислотных остатков. На рис. 26 приведены данные экспериментов с мутантным белком, в котором остаток цистеина в положении 149 был заменен на серин. Известно, что каждая субъединица в молекуле фермента состоит из двух автономных функциональных доменов - каталитического и NAD-связывающего. причем остаток Cys-149 находится на границе между этими доменами. Замена этого остатка на остаток серина значительно усиливала эффекты, вызываемые связыванием кофактора - в присутствии NAD+ энтальпия и особенно кооперативность теплового перехода увеличивались в случае мутанта C149S значительно сильнее, чем в случае GAPD дикого типа (рис. 2а,б). Иной эффект наблюдали в случае GAPD, в которой His-176, расположенный в каталитическом домене фермента, был заменен на аспарагин (мутант Hl 76N). Эта одиночная мутация приводила к резкой дестабилизации белка - температура максимума теплового перехода снижалась почти на 15°С по сравнению с GAPD дикого типа (рис. 2в). Вместе с тем мутант H176N сохранял способность взаимодействовать с кофактором и подвергаться при этом конформацион-ной перестройке, которая в данном случае выражалась в заметном увеличении термостабильности белка, но не кооперативное™ теплового перехода (рис. 2в). Таким образом, иследование методом ДСК тепловой денатурации мутантов GAPD позволяет прояснить значение отдельных аминокислотных остатков для стабилизации всей молекулы белка и их роль во внутримолекулярных перестройках, происходящих при взаимодействии фермента с кофактором.

Нефосфорилируюшая D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа (GAP.V).

Этот фермент, выделенный из Streptococcus mutans, принадлежит к семейств> альдегиддегидрогеназ и не имеет аналогий по первичной структуре с GAPD. Фермент катализирует необратимое окисление глицеральдегид-3-фосфата в 3-фосфоглицсрат: его молекула с общей массой 204 кДа состоит из четырех идентичных субъединиц, с каждой из которых связывается кофактор - NADP.

В отсутствие NADP на термограмме препарата GAPN, абсолютно гомогенного пс данным SDS-электрофореза, наблюдаются два хорошо различимых отдельных тепловых перехода с максимумами при ~46°С и при ~70°С (рис. За). При добавлении возрастающих количеств NADP высокотемпературный пик (стабильный компонент: исчезает, а низкотемпературный (лабильный компонент) растет. При этом темпераг) рг

максимума (t,aax) стабильного компонента не меняется, a tmax лабильного возрастает. Очевидно, что связывание кофактора со стабильной формой фермента приводит к его переходу в лабильную форму. В то же время лабильная форма тоже может взаимодействовать с кофактором, поскольку при повышении концентрации NADP низкотемпературный пик заметно смещается в сторону более высокой температуры (на~5°С).

При высоких концентрациях NADP (около 3 мМ) в условиях данного эксперимента (50 мМ калий-фосфатный буфер, рН8.0) высокотемпературный пик, отражающий плавление стабильного компонента белка, полностью исчезает, и на термограмме наблюдается лишь низкотемпературный пик, соответствующий лабильной форме белка (рис. За).

-1-—I-'-1->-Г-'-1-

Рис. 3 Тепловая денатурация нефосфо-рилирующей глицеральдегид-З'-фос-фатдегидрогеназы (GAPN) в отсутствие и в присутствии кофактора (NADP) яри различных его концентрациях. (а) - нативный белок, (б) - мутант Е268А. Концентрации добавленного кофактора указаны около кривых. Вертикальная метка соответствует 100 кДж-моль"'трад

Сходные эффекты наблюдались и для препарата ОАРЫ, в котором остаток глутаминовой кислоты в положении 268, находящийся на границе между каталитическим и кофактор-связывающим доменами фермента, был заменен на аланин (мутант САРИ Е268А) путем сайт-

20 30 40 50 60 70 80

Температура. °С

направленного мутагенеза. Для этого мутантного белка также показано наличие двух дискретных форм с разной термостабильностью, переход между которыми контролируется связыванием ЫАОР (рис. 36). Из этого рисунка видно также, что фермент сохраняет способность взаимодействовать с ЫАВР. Более того, стабилизация полного" компонента более выражена, чем в случае нативного фермента.

-9-

Однако переход стабильной формы фермента в лабильную требует в этом случае значительно более высоких концентраций ЫАБР и еще очень далек от завершения даже в присутствии 3 мМ ЫАВР (рис. 36). Это указывает на важную роль остатка 01и-268 в осуществлении взаимодействия между каталитическим и кофаггор-связывающим доменами фермента.

Полученные данные прямо указывают на то, что в зависимости от присутствия или отсутствия КАГ)Р фермент может существовать в одной из двух дискретных форм, резко различающихся по термостабильности. Для проверки этого предположения был проведен эксперимент по "последовательному отжигу" этих форм белка, который состоял в следующем - ЭАРК без добавок кофактора был прогрет до 55°С (кривая 5 на рис. 4), т. е. до температуры, при которой происходит полная необратимая денатурация лабильной формы фермента. При повторном прогреве этого образца на термограмме наблюдался лишь высокотемпературный пик при 72°С, а низкотемпературный пик при 46°С полностью исчезал (кривая 4 на рис. 4). Однако если такой же предварительно прогретый до 55°С образец повторно прогревали в присутствии 3 мМ ИАБР, то на термограмме наблюдался лишь низкотемпературный пик (кривая 5 на рис. 4). Эти данные полностью подтверждают предположение о том, что молекула йАРК может существовать в виде двух дискретных форм, и переход из одного структурного состояния в другое контролируется связыванием кофактора с ферментом.

<

20 30 40 50 60 70 80 90 Температура, °С

4

5

Рис. 4. Последовательный отжиг двух дискретных состояний ОАРК. (1) - ОАРИ в отсутствие ЫАБР, (2) -ОАРИ в присутствии 3 мМ Ь'АОР. Препарат ОАРК без добавок прогревали до 55°С (кривая 3). После охлаждения и инкубации 10 часов при 20°С этот же образец был прогрет до 90°С в отсутствие К'АОР (кривая 4) или в присутствии 3 мМ ЫАОР (кривая 5).

Вертикальная метка соответствует 100 кДж'М0ль"'трад'',

Можно предположить, что в бактериальной клетке ало-вАРИ также существует в форме с очень высокой термостабильностью, и связывание NADP переводит ее в гораздо менее стабильную форму.

Глнкогенфосфоршмза b из скелетных мышц кролика. Этот фермент с молекулярной массой 188,8 кДа состоит из двух идентичных субъединиц (842 остатка в каждой), причем каждая субъединица содержит одну молекулу прочно связанного пиридоксаль-5'-фосфата (ПЛФ). Мы провели сравнительные калориметрические исследования нативного белка и белка, не содержащего ПЛФ. Как видно из рис. 5, удаление пиридоксальфосфата приводит к значительному снижению температуры денатурации фермента (с 56,7°С до ~48°С) и к существенному изменению формы кривой теплопоглощения. Поскольку удаление ПЛФ проводится в несколько стадий, можно предположить, что наблюдаемые изменения обусловлены не столько самим удалением ПЛФ, сколько повреждающим действием такой обработки на белок. Однако оказалось, что это не так - встраивание ПЛФ в активный центр приводило к полному восстановлению термостабильности белка (кривая 3 на рис. 5). Таким

образом, наличие связанного пиридоксальфосфата играет важную роль в стабилизации нативной структуры молекулы гликогенфосфорилазы Ь.

Рис. 5. Тепловая денатурация гликогенфосфорилазы Ъ. (1) - нативный фермент (0.7 мг/мл), (2) - фермент после удаления ПЛФ, (3) - реконструированный фермент.

30 35 40 45 50 55 60 65 70 t х

Поскольку гликогенфосфорила-

Температура, "С

за b является ферментом со сложной аллостерической регуляцией активности, возникает вопрос о влиянии различных эффекторов на термостабильность этого фермента.

Па рис. 6 представлены кривые теплопоглощения гликогенфосфорилазы b в присутствии насыщающих концентраций следующих лигандов - глюкозо-1-фосфата (субстрат), АМФ (аллостерический активатор), глюкозы (конкурентный ингибитор), глюкозо-6-фосфата и ФМН (аллостерические ингибиторы). Как видно, все изученные

лиганды в той или иной мере оказывают стабилизирующее действие на гликогекфосфорилазу Ь.

Таким образом, проведенные методом ДСК исследования глнкогенфосфо-рилазы Ь из скелетных мышц кролика показали, что алоформа фермента имеет существенно меньшую термостабильность, чем нативный фермент, что подтверждает важную роль кофактора в стабилизации нативной структуры белка. Кроме того, показано, что все исследованные специфические лиганды гликогенфосфорилазы Ь повышают ее термостабильность.

Рис. б. Тепловая денатурация гликогенфосфорилазы Ь в присутствии насыщающих концентраций различных эффекторов. (1)-без добавок, (2) - глюкозо-1 -фосфат, (3)-АМФ, (4) - глюкоза, (5) - глюкозо-б-фосфат, ^ (7) - ФМН. Вертикальная метка соответ-

ствует 200 кДж-моль'трад"1.

Помимо этого, было проведено комплексное исследование тепловой денатурации гликогенфосфорилазы Ь методом ДСК в сочетании с другими методами (термоинактивация, светорассеяние, седи-

Температура, °С

ментационныи анализ), в результате которого был предложен двухстадийный механизм этого процесса, включающий обратимую стадию предденатурационной диссоциации фермента на субъединицы с последующей их необратимой денатурацией.

Субфрагмент-1 миозина (SI). S1 представляет собой изолированную головку молекулы миозина, которая полностью сохраняет основные свойства миозиновой молекулы - АТРазную активность и способность связываться с актином. В процессе многостадийной М^-АТРазной реакции миозина образуется целый ряд промежуточных состояний (таких, kskSI-ATP, S1-ADP-P, и S1-ADP), переходы между которыми сопровождаются значительными структурными перестройками в миозиновой головке. Эти перестройки играют ключевую роль в молекулярном механизме мышечного сокращения и потому подвергаются в последнее время самому интенсивному изучению.

Температура, °С

Для структурных исследований таких перестроек часто используются стабильные аналоги промежуточных состояний АТРазной реакции миозина, которые представляют собой тройные комплексы S1 с ADP и аналогами неорганического фосфата -ортованадатом фторидом бериллия (BeFx) или фторидом алюминия (A1F4). К настоящему времени известно, что эти комплексы являются стабильными аналогами разных интермедиатов АТРазной реакции S1: комплекс Sl-ADP-BeF, имитирует состояние 81-АТР(до гидролиза АТР), тогда как комплексы S1-ADP-V, и S1-ADP-A1F4 соответствуют интермедиату S1-ADP-P, (после гидролиза АТР).

Рис. 7. Тепловая денатурация субфраг-мента-1 миозина (SI) в отсутствие нуклеотидов (1), в присутствии ADP (2) и тройных комплексов Sl-ADP-BeFx (3) и S1-ADP-V) (4).

На рис. 7 показаны кривые тепло-поглощения S1 в отсутствие нуклеотидов (кривая I), в присутствии ADP (кривая 2), а также стабильных тройных комплексов Sl-ADP-BeFx (кривая 3) и S1-ADP-V, (кривая 4), Как видно, добавление ADP почти не влияет на темперагуру максимума кривой теплопоглощения Si. но увеличивает коолеративность денатурационного процесса. Образование же тройных комплексов Sl-ADP-BeFx и S1-ADP-V, приводит к резкому увеличению как термостабильности белка (увеличение температуры максимума), так и кооперативное™ тепловой денатурации. Из рисунка видна также некоторая разница между комплексами Sl-ADP-BeFx и S1-ADP-V,, имитирующимими разные интермедиа™ АТРазной реакции S1.

Таким образом, метод ДСК позволяет гораздо эффективнее, чем большинство других методов, регистрировать глобальные конформационные перестройки, происходящие в головке миозина в процессе АТРазной реакции. Это преимущество метода ДСК уже интенсивно используется для всестороннего исследования механизма таких перестроек. Так. например, было показано, что модификация некоторых остатков в молекуле SI (Cys-707, Lys-83), не препятствуя образованию стабильных тройных комплексов Sl-ADP-BeFx и S1-ADP-V,, в значительной степени препятствует передаче структурных изменений от активного центра АТРазы на всю молекулу S1.

- 13-

Суммируя изложенное в этом разделе, можно заключить, что применение метода ДСК предоставляет широкие (а в ряде случаев - уникальные) возможности для регистрации и последующего всестороннего исследования структурных перестроек, происходящих в молекулах самых разных ферментов в результате их взаимодействия с низкомолекуляркыми лигандами - коферментамн, аналогами субстрата, ингибиторами и т. д.

3. Применение ДСК для изучения белок-белковых взаимодействий

Нами впервые был применен метод ДСК для изучения взаимодействий Р-актина с мышечными белками - тропомиозином и изолированными головками миозина (81). Хорошо известно, что эти специфические взаимодействия лежат в основе молекулярного механизма и регуляции мышечного сокращения.

Р-актин. Актин присутствует во всех эукариотических клетках и выполняет самые разнообразные функции. Это глобулярный белок (й-актин) с молекулярной массой 42 кДа. Он способен к полимеризации с образованием длинных филаментов фибриллярного актина (Р-актин). Метод ДСК позволяет регистрировать изменения, происходящие с актином а результате его полимеризации, т.е. при превращении в-актина в Р-актин - при этом значительно возрастает термостабильность белка, энтальпия и кооперативность тепловой денатурации актина.

Известно, что один из компонентов яда бледной поганки, циклический гепта-пептид фаллоидин, специфически связывается с Р-актином, стабилизируя его фила-менты. При этом происходит значительное увеличение термостабильности Р-актина, который в присутствии фаллоидина плавится в области ТО-БО^С. Это дает большое преимущество при исследованиях взаимодействия Р-актина с такими мышечными белками, как Б1 и тропомиозин, имеющими тепловые переходы в интервале 40-60°С. Поэтому для описанных ниже исследований взаимодействия Р-актина с этими мышечными белками был использован Р-актин, стабилизированный фаллоидином.

Взаимодействие Р-актина с 81. На рис. 8а показаны термограммы свободного ЭК свободного Р-актина, стабилизированного фаллоидином, и их комплекса, полученного при молярном отношении 51 '.актин, равном 1:2. На термограмме комплекса хорошо видны разрешенные пики 51 и Р-актина. Видно, что их взаимодействие практически не сказывается на тепловой денатурации Р-актина. но существенно увеличивает термостабильность 5!, сдвигая максимум его теплового перехода на ~5°С в более высокотемпературную область. Этот сдвиг максимума кривой теплопоглощения

- 14-

SI (рис. 86) в настоящее время интенсивно используется как тест на способность миозинобой головки подвергаться структурным перестройкам при связывании с F-актнном (например, при различных модификациях S1).

Рис. 8. (а) - Термограмма комплекса S1 (9,6 мкМ) с F-актином (14 мкМ), стабилизированным фал лоид ином (14мкМ) (сплошная линия). Пунктиром показаны термограммы свободных S1 и F-актина. Условия: 15мМ Hepes-KOH (рН 7,3), 2 мМ MgCl2, 1 мМ ADP. Скорость нагрева 1°С/мин. (б) - Кривые теплопоглощения S1 в присутствии (сплошная линия) и в отсутствие (пунктир) F-актина (область плавления стабилизированного фаллоидином F-актина здесь не показана).

Так, было показано, что внесение в тяжелую цепь S1 единственного разрыва между остатками Arg-23 и Ие-24 почти полностью предотвращает структурные изменения в молекуле S1 при взаимодействии с F-актином. Такой расщепленный трипсином препарат S1 хотя и взаимодействовал с F-актином, но не подвергался при этом конформационной перестройке, регистрируемой методом ДСК по индуцируемому актином сдвигу кривой теплопоглощения. Поскольку участок расщепления находится в молекуле S1 весьма далеко (на расстоянии более 4 нм) от актик-связывающих центров, на основании этих данных было высказано предположение, что индуцируемый актином сдвиг кривой тепло-поглощения S1 отражает глобальную структурную перестройку всей молекулы S1, включающую передачу конформацконных изменений между участками, расположенными в миозиновой головке далеко друг от друга.

Взаимодействие F-актина с тропомиозином. Тропомиозин (ТМ) специфически взаимодействует с актнновыми филаменгами во всех типах мышц и играет важную роль в регуляции мышечного сокращения. ТМ представляет собой длинную палочкообразную молекулу, состоящую из двух полипептидных цепей, образующих двойную «-спираль (coiled coil). Каждая молекула ТМ образует связи по типу "голова к хвосту"

60 80 Температура, °С

а.

и

Z 200

с; о

Й 100

о

■ AT =5.7 "С аТ , m .,1 б

■ - F-actin / 1 + F-actin

40 45 50 55 60 65 Температура, °С

О

с двумя другими молекулами ТМ, формируя длинную нить, которая укладывается в бороздку актинового филамента.

Тепловая денатурация ТМ обр.чтимз, тогда как Р-актик плавится необратимо. Поел г прогрева комплекса до %СС и »«лц/эдяо -..лличдеим (IV сегг- ло с. ¡с ас--шей .-'•:обра'.'к>.*'>и дензгурадии жгиш) а а.- сьлзаайого ТV «счезае. вмес:е '

'.ч.яло!. аерех^лои Г-лспша. Прд пегоорют« «ч-л. рее.* «лея

лолько один як-:, соогвен?ву кмдмГ: сиоСодым*? ТМ ^ рк^. •-»Зразом, формирование комплекс*. ТМ о ?-аь<:>ном злияег только на г.) ды-чт) •

пвшио ТМ (но не р-актина), что выражается в сдвиге теплового перехода ТМ кг "

Рис. 9. Взаимодействие тропомиозина (ТМ) с Р-актином. (1) - ТМ; (2) - Р-актии, стабилизированный фаллоидином: (3) ■ комплекс ТМ с р-актнно.ч при молярном отношении !:2; (4) - поьторный прогр-.-комъпекса ТМ с Р-актп^ом после нагрев?, до 90°С и последующего охяаздения.

Известно, что в мышечных тканях экспрессируются две изоформы ТМ - а и р. Соответственно, димерные молекулы ТМ могут быть представлены как гетеродкмерами «¡3. так и гомодимерамь аа или (3{3. Выделяемый из гладки* мышц ¡«фракционированный ТМ представлен почти исключи гелыгс оф-гетеродимерами.

Надо отметить, что представленные выше результаты были получены на («фракционированием аР-гетеродимере ТМ. Интересно было выяснить характер денатурации гомодимеров ТМ в комплексе с Г-актином.

Сначала мы изучили тепловую денатурацию гомодимероа ТМ. а так;ке их эквимолярной смеси, в отсутствие Р-актина. Неожиданным явилось то, что в отличие от высококооперативного теплового перехода гетеродимера ТМ с максимумом при 4!°С оба гомодимера имели широкие теплозые переходы с низкой кооперативностью

(рис. 10а). Значсяиа м;иол.г,':лг.з -ли^п сч^о.п.'г^ерлч др-.-,- ..

в сторону оолее высокой температуры.

30

ТМ + Р-актин, второй прогрев

л...

40 50 60 70 80 Температура,°С

а также от гетеродимера. Так. аа-томодимер был гораздо менее термостабилен (г,„ = 37.4°С). чем рр-гомодимер (гп = 44,6°С). Таким образом, аа- и рр-гомодимеры ТМ значительно отличались друг от друга и от аР-гетеродимера по характеру тепловой денатурации.

Для эквимолярной смеси гомодимеров ТМ наблюдалась сложная кривая тепло-поглощения (рис. 10а), которую нельзя получить простым суммированием кривых аа-и РР-гомолимеров. Примерно до 32°С такой препарат плавится как аа-гомодимер, однако после 33°С, когда начинает денатурировать рр-гомодимер, на термограмме появляется экзотермический пик, который после 39°С переходит в узкий эндотермический пик с максимумом при 41,5°С. Наиболее вероятно, что эта экзотерма отражает процесс обмена полипептидными цепями между гомодимерами ТМ с образованием гетеродимеров, а эндотермический пик с максимумом при 41,5°С - тепловую денатурацию вновь образованных гетеродимеров ТМ. Экзотермический пик полностью исчезает при повторном прогреве (рис. 10а), что говорит о полном завершении обмена цепями между гомодимерами ТМ в процессе первого нагревания.

Рис. 10. Кривые теплопоглощения а(3-гетеродимера ТМ, аа и РР гомодимеров, и их эквимолярной смеси (аа + РР) в отсутствие (а) и в присутствии (б) Р-актика, стабилизированного фаллоидином. Пунктиром показаны кривые, полученные при повторном прогреве образцов. Область температур выше 65°С, соответствующая плавлению стабилизированного фаллоидином Р-актина, не показана. Вертикальная метка соответствует 100 кДж'Моль"1 град"'.

Таким образом, мы показали, что метод ДСК позволяет отчётливо регистрировать обмен полипептидными цепями между гомодимерами ТМ в процессе нагревания их смеси,

с£ го о.

л ц

о 2

Й

а

О

30 40 50

Температура, °С

ведущий к образованию гетеродимеров ТМ.

-17-

Интересно отметить, что подобный эффект мы наблюдали и в присутствии Р-актина. На рисунке 106 показаны калориметрические кривые тепловой денатурации сса- и (Зр-томодимеров ТМ в присутствии Р-актина. Пунктиром показаны кривые, полученные при повторных прогревах исходных проб после полной необратимой денатурации Р-актина при первом нагревании до 95°С. Эти кривые очень сходны с кривыми, полученными при тепловой денатурации гомодимеров ТМ в отсутствие актина (рис. 10а) и, таким образом, они отражают денатурацию свободных от актина гомодимеров ТМ и могут быть использованы для выявления эффектов, вызываемых актином. Видно, что взаимодействие с Р-актином отражается на характере тепловой денатурации гомодимеров ТМ значительно слабее, чем а случае гетеродимера ТМ. При денатурации эквимолярной смеси гомодимеров ТМ в присутствии Р-актина (рис. 106) была получена картина, очень сходная с денатурацией смеси гомодимеров в отсутствие актина (рис. 10а). Наличие экзотермического пика свидетельствует о том, что и в присутствии Р-актина имеет место обмен полипептидными цепями между гомодимерами ТМ. После 40°С этот пик переходил в острый эндотермический пик с максимумом при 44,1°С, характерный для тепловой денатурации связанного с Р-актином сф-гетеродимера ТМ. При повторном прогреве смеси гомодимеров экзотер-ма полностью исчезала, что свидетельствовало о завершении обмена цепями между гомодимерами ТМ - на калориметрической кривой второго прогрева виден только пик при 41.5°С, характерный для свободного от актина а[3-гетеродимера ТМ (рис. 106). Исходя из этих данных, можно сделать вывод, что обмен полипептидными цепями при нагревании эквимолярной смеси гомодимеров ТМ имеет место как в отсутствие, так и в присутствии Р-актина.

Изучение методом ДСК тройного комплекса Р-актина с ТМ и Б1. Проведя исследования взаимодействия Р-актина с ТМ и с Б1 по отдельности, мы применили метод ДСК для изучения более сложного тройного комплекса Р-актин-ТМ-Б!. На рисунке 11 показаны термограммы комплекса Р-актин-ТМ в отсутствие и в присутствии 81. Молярное отношение ТМ:актин составляло 1:6; при этом практически весь ТМ был связан с актином (наблюдался лишь небольшой пик свободного ТМ при 41°С). Добавление к комплексу Р-актин-ТМ при молярном отношении Б1 к актину, равном 1:2, приводит к полному исчезновению на термограмме пика при 45,5°С, соответствующего тепловой денатурации связанного с актином ТМ (при этом концентрация ТМ в образце была такой же, как и в отсутствие Б1); остается лишь небольшой пик свободного ТМ при 41°С. Наблюдающийся при этом тепловой переход

- 18-

с максимумом при 54,5 " С соответствует денатурации связанного с актином 51. Можно предположить, что взаимодействие 31 с Р-актином значительно увеличивает термостабильность связанного с актином ТМ. В таком случае, видимо, пик связанного с актином ТМ находится под пиком Б1, совпадая с ним по положению.

высокотемпературную область по сравнению с ТМ, связанным с актином в отсутствие 51. Эти данные говорят о том, что в присутствии 81 пик связан ого с актином ТМ смещается в область более высокой температуры, причем тем сильнее, чем выше концентрация БК что может быть обусловлено возрастанием стерических затруднений для распада комплекса актин-тропомиозин.

Таким образом, заключая этот раздел, следует отметить, что применение метода ДСК представляется перспективным для изучения даже достаточно сложных белковых комплексов.

4. Применение ДСК для изучения надмолекулярных струкур на примере вируса табачной мозаики

С помощью метода ДСК оценен вклад различных факторов, определяющих стабильность частиц вируса табачной мозаики (ВТМ), На рис. 12 показаны термограммы изолированного белка оболочки (БО) ВТМ. который при рН 8,0 существует в виде мелких агрегатов (а), а при рН 5.6 полимеризуется с образованием частиц, подобных оболочке вируса (б) и цельных вирусов (в). Видно, что при рН 8.0 денатурация белка в составе вирусных частиц происходит с температурой максимума около 70°С, тогда как п составе мелких агрегатов (при рН 8.0) белок оболочки вируса характеризуется весьма низкой термостабильностью - температура его денатурации составляет всего 41°С

Для проверки этого предположения концентрация 81 была снижена в 4 раза (молярное отношение 81:актин составило при этом 1:8). Таким образом нам удалось разделить пики Б1 и ТМ - пик связанного с актином ТМ наблюдался в этом случае при 48°С, т.е. он был сдвинут на 2,5°С в более

Рис. 11. Термограммы комплекса Р-актин-ТМ в присутствии и в отсутствие 81.

30 40 50 60 70 80 90 Температура, "С

(рис. 12а). Иными словами, включение субъединиц БО в состав вирионов приводит к повышению их термостабильностн при рН 8,0 примерно на 30°С.

Термогра.ммы белка оболоч-кл е«р>си таОачкой моиики (а), сг--пилимера (&) ;г ксльиых вирноноь (5). Верти каш тл метка соси веч-сгиую кДлС-моль''-грал

При рН з,6 БО В1М поличе-рнзуется с образованием вирусоподобных спиральных агрегатов. Как видно из рис. 126, температура плавления субъединиц БО в составе таких частиц составляет ~73°С. то есть более чем на 30°С выше, чем при рП ;>,0. но примерно чл 15°С ниже, чем у цельных вирионов в тех же условиях. От вирусов эти спиральные агрегаты отличаются только отсутствием з них РНК. Таким образом, представленные данные позволяют сделать вывод, что внутривирусная РНК вносит существенный вклад в стабилизацию структуры вирионов.

Подводя итог, можно сказать, что чрезвычайно высокая стабильность вирионов ВТМ целиком определяется межсубъединичными белок-белковыми и РНК-белковыми взаимодействиями.

Заключение

Приведенные данные наглядно демонстрируют возможности, которые предоставляет метод ДСК для исследования самых разных объектов - от простых белков до достаточно сложных белковых комплексов и высокоорганизованных надмолекулярных структур. Разработка новых подходов, основанных на применении этого метода, открывает, на наш взгляд, перспективное направление в решении ряд?

-1—I—|—.—г

!\ рнз.о Г!

и

<3

г\ рН 5.6 / \

_1_I_I_I_1.1.1.1,<

30 40 50 60 70 80 90 Температура. °С

а

б

задач современной физико-химической биологии, многие из которых трудно решить

другими методами.

Выводы

1. Методом ДСК проведено исследование необратимой тепловой денатурации креатинкиназы из скелетных мышц кролика и уридинфосфорилазы из Е. coli Х-12 при разных скоростях нагрева с последующим кинетическим анализом полученных данных. Установлено, что наиболее точно тепловая денатурация креатинкиназы описывается простейшей одностадийной моделью необратимой денатурации, а денатурация уридинфосфорилазы из Е. coli - моделью, включающей две последовательные необратимые стадии. Найдены кинетические параметры соответствующих стадий.

2. При исследованиях фосфорилируюшей D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы из В. stearothermophilus (GAPD) показано, что взаимодействие фермента с кофактором (NAD*) приводит к значительным конформациоккым перестройкам в молекуле белка, которые выражаются в существенном повышении его термостабильности.

3. При исследованиях нефосфорнлиругещей D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогена-зы (GAPN) из Streptococcus mutans показано, что фермент существует в двух дискретных формах - термолабильной (Тт = 46°С) и термостабильиой (Тт = 72°С), причем взаимодействие фермента с кофактором (NADP) приводит к дестабилизации фермента, переводя его в каталитически активную термолабипьную форму.

4. При исследовании методом ДСК гликогенфосфорилазы b из скелетных мышц кролика показано, что фермент без пиридоксальфосфата (ПЛФ) имеет существенно меньшую термостабильность, чем нативный фермент, это подтверждает важную роль ПЛФ в стабилизации нативной структуры белка. Показано также, что связывание гликогенфосфорилазой b специфических лигандов - как активаторов, так и ингибиторов, приводит к увеличению термостабильности фермента.

5. Показано, что метод ДСК позволяет эффективно регистрировать структурные изменения, происходящие в изолированной головке молекулы миозина (субфрагмент-1 миозина. S1) при моделировании различных промежуточных состояний АТРазной реакции миозина. На основании этих данных предложен новый калориметрический тест для- анализа конформационных изменений, происходящих в миозиновых головках в процессе АТРазной реакции. При помощи этого теста в миозиновой головке выявлены аминокислотные остатки, не входящие

в активный центр АТФазы, но важные для распространения конформационных изменений от активного центра АТФазы на всю молекулу S1.

6. Методом ДСК исследованы комплексы F-актина из скелетных мышц кролика с другими мышечными белками - тропомиозином и изолированными головками миозина (S1). Показано, что взаимодействие этих белков с F-актином не оказывает существенного влияния на тепловую денатурацию актина, но значительно увеличивает термостабилыюсть как тропомиозина, так и S1, причем связывание Si < F-актином заметно увеличивает термостабильность связанного с F-актином тропо миозина. На основании этих данных предложен новый калориметрический тест дл анализа конформационных перестроек, происходящих в миозиновых головках и тропомиозине при их взаимодействии с филаментами F-актина.

7. Методом ДСК наглядно продемонстрировано, что при нагревании смеси гомодям< ров тропомиозина между ними происходит обмен цепями с образованием гетерод! меров. Этот эффект наблюдался даже в том случае, когда гомодимеры тропомиоз1 на были связаны с F-актином.

8. С помощью метода ДСК проведено сравнительное исследование целых вируо табачной мозаики и белка, образующего вирусную оболочку. Показано, что бело белковые взаимодействия, происходящие при полимеризации белка ооолочу приводят к резкому увеличению его термостабилькости, а взаимодействие эте белка с вирусной РНК приводит к дополнительной стабилизации структуры вирус

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1.Goütsina N.L., Bobkov A.A., Dedova I.V., Pavlov D.A., Nikoiaeva O.P., Orlov V. Levitsky D.I., Differential scanning calorimetric study of the complexes of modified myc subfragment 1 with ADP and vanadate or beryllium fluoride, i! J. Muscle Res. and ( Motility, 1996, v.17, № 4, p.475-485

2. Nikoiaeva O.P., Orlov V.N., Dedova I.V., Drachev V.A., Levitsky D.I., Interaction of my subfragment 1 with F-actin studied by differential scanning calorimetry. // Biochemistry Molecular Biology International, 1996, v.40, №4, p.653-661

3. Корнилаев Б.А., Курганов Б.И., Ливанова Н.Б., Еронина Т.Б., Орлов В.Н., Черняк I Поглазов Б.Ф., Термическая стабильность мышечной гликогенфосфорилазы присутствии специфических лигандов. // Доклады Акаде.иии Наук, 1997, т.352, с.256-258

4. Корнилаев Б.А., Курганов Б.И., Еронина Т.Б., Чеботарева Н.А., Ливанова Н.Б., Орлов В.Н., Черняк В.Я., Механизм тепловой денатурации мышечной гликогенфосфорилазы b. И Молекулярная биология, 1997,т.31,№1, с.98-107

5. Nikolaeva О.Р.. Bobkov А.А., Oilov V.N., Levitsky D.I. Thermal stability of myosin subfragmem 1 dramatically decreases upon tryptic cleavage in the N-termina! region of myosin heavy chain. // Journal of Muscle Research and Cell Motility, 1997, v. 18, №2, p.258

6. Чеботарева НА., Сугробова Н.П., Корнилаев Б.А., Орлов B.H., Курганов Б.И., Ливанова Н.Б., Сравнительное изучение апо- и холоформ гликогенфосфорилазы Ь. Второй съезд Биохимического Общества, 19-23 мая 1997г., Москва, Тезисы стендовых сообщений, 4.1.1-76, с. 76-77

7. Росткова Е.В., Орлов В.Н., Теплова М.В., Моисеева Л.Н., Николаева О.П., Гусев Н.Б., Левицкий Д.И., Калориметрический подход к изучению взаимодействия F-актина с тропомиозином. Второй съезд Биохимического Общества, 19-23 мая 1997 г., Москва, Тезисы стендовых сообщений, ч.П, VII-57. с.352-353

8. Левицкий Д.И.. Николаева О.П., Орлов В.Н., Павлов Д.А., Пономарев М.А., Калориметрический подход к изучению двигательных белков. Второй съезд Биохимического Общества, 19-23 мая 1997 г., Москва, Тезисы симпозиалъных докладов, с.61-62

9. Левицкий Д.И., Николаева О.П., Орлов В.Н., Павлов Д.А., Пономарев М.А., Росткова Е.В., Дифференциальная сканирующая калориметрия миозина и актина. // Биохимия, 1998. т.63. вып.3.c.381-394

10. Любарев Д.Е., Курганов Б.И., Бурлакова А.А., Орлов В.Н., Поглазов Б.Ф., Изучение необратимой тепловой денатурации уридннфосфорилазы из Escherichia coli К-12 методом дифференциальной сканирующей калориметрии. // Доклады Академии Наук, 1998, т.358, №6, 830-832

11.Lyubarev А.Е., Kurganov B.I., Burlakova А.А., Orlov V.N., Irreversible thermal denaturation of uridine phosphorylase from Escherichia coli K-12. H Biophys. Chem., 1998, v.70, №3, 247-57

12. Kurganov B.!., Komilaev B.A., Livanova N.B., Chebotareva N.A., Eronina T.B., Orlov V.N., Heat denaturation of muscle glycogen phosphorylase b. Abstracts of International Symposium «Protein Structure, Stability anil Folding. Fundamental And Medical Aspects», Moscow, Russia. 1998. p.47

13. Levashov P.A., Bulatnikov t.G., Orlov V.N., Muronetz V.I., Nagradova N.K., D-glyceraidehyde-3-phosphate dehydrogenase: differential scanning calorimetry study of the enzymes isolated from rabbit muscle, E. coli and B. stearothermophilus. Abstracts of International Symposium «Protein Structure. Stability and Folding. Fundamental And Medical Aspects», Moscow, Russia, 1998, p.60

14. Orlov V.N., Rostkova E.V.. Nikolaeva O.P., Moiseeva L.N., Teplova M.V.. Drachev V.A., Gusev N.B., Levitsky DI, DSC study of interaction of smooth muscle tropomyosin with F-actin. Abstracts of International Symposium Protein Structure, Stability and Folding. Fundamenta! And Medical Aspects», Moscow, Russia, 1998, p. 143

15. Orlov V.N., Krivosheev V.P., Dobrov E.N., Drachev V.A., The comparative differential scanning calorimetry study of thermal stability of tobacco mosaic coat protein molecules in small aggregates and in the virus particles. Abstracts of International Symposium «Protein Structure, Stability and Folding. Fundamental And Medical Aspects», Moscow, Russia, 1998, p. 144

16. Kornilaev B.A., Chebotareva N.A., Sugrobova N.P., Orlov V.N., Livanova N.B., Kurganov B.I., Role of pyridoxal S'-phosphate in stabilization of phosphorylase b structure. Abstracts of International Symposium «Protein Structure, Stability and Folding. Fundamental And Medical Aspects», Moscow, Russia, 1998, p. 144

17. Andreeva I.E., Makeeva V.F., Orlov V.N., Lyubarev A.E., Livanova N.B.. Kurganov B.I., The study of thermostability of phosphorylase kinase from rabbit skeletal muscle by method of differential scanning calorimetry. Abstracts of InternationaI Symposium «Protein Structure, Stability and Folding. Fundamental And Medical Aspects», Moscow, Russia, 1998, p. 146

18. Levitsky D.I., Nikolaeva O.P., Orlov V.N., Pavlov D.A., Ponomarev M.A.. Rostkova E.V.. The use of the differential scanning calorimetry to studies on myosin and actin. Abstracts of International Symposium «Biological Motility: Modern Methods For Studying», Pushchino, Russia, 1998,p.83-85

19. Orlov V.N., Rostkova E.V., Nikolaeva O.P., Mioseeva L.N., Teplova M.V., Gusev N.B., Levitsky D.I., Interaction of smooth muscle tropomyosin with F-actin studied by differentia! scanning calorimetry. Abstracts of International Symposium «Biological Motility: Modern Methods For Studying, Pushchino, Russia, 1998, p.104-105

20. Orlov V.N., Rostkova E.V., Nikolaeva O.P., Drachev V.A., Gusev N.B., Levitsky D.I., Thermally induced chain exchange of smooth muscle tropomyosin dimers studied by differential scanning calorimetry. // FEBS Lett, 1998, v.433, p.241-244

21. Orlov V.N., Kust S.V., Kalmykov P.V.. Krivosheev V.P., Dobrov E.N., Drachev V.A.. A comparative differential scanning calorimetric study of tobacco mosaic virus and of its coat protein ts-mutant. // FEBS Lett., 1998, v.433, p.307-311

22. Levitsky D.I., Nikolaeva O.P., Ponomarev M.A., Orlov V.N., Rostkova E.V. Thermal unfolding of myosin head fragments and tropomyosin bound to F-actin. (Abstracts of 43-th Annual Meeteng ofBiophysical Society). // Biophys. J., 1999, v.76, № I, Pt.l, p. A166

23. Levashov P, Oriov V, Boschi-Muller S, Talfournier F, Asryants R, Bulatnikov !, Muronetz V, BranlantG, NagradovaN. Thermal unfolding of phosphorylatir.g

D-gIyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase studied by differential scanning calorimetry. II Biochim. Biophys. Acta, 1999, v. 1433, №1-2, p.294-306

24. D.Levitsky, O.Nikolaeva, O.Kaspieva, V.Orlov and M.Ponomarev. Actin-induced structural changes in the myosin head studied by differential scanning calorimetry. Abstracts of XXVIII European Muscle Congress (The University of York, York, UK, 4-7 September 1999), abstract SI7, pp.43

25. Lyubarev A.E, Kurganov B.I, Orlov V.N, Zhou H.M. Two-state irreversible thermal denaturatioti of muscle creatine kinase. II Biophys. Chem., 1999, v.79, №3, p.199-204

26. Пономарев M.A., Николаева О.П., Орлов B.H., Островская М.В., Левицкий Д.И. Изучение тепловой денатурация комплексов миозиновой головки с F-актином методом дифференциальной сканирующей калориметрии. // Тезисы докладов II Съезда биофизиков России, 23-27 августа 1999 г. Москва. V.55, стр.358

27. Kurganov B.I., Lyubarev А.Е., Orlov V.N., BeSousova L.V., Mitskevich L.G., Fedukina N.V. and Zhou H.-M. Thermal denaturation of muscle creatine kinase. Abstracts of «IRCAW-99: New Trends in Calorimetry and its Applications». (11 Ciocco (Barga), Italy, October 31 -November 03, 1999). abstract 1V-40

28. Levitsky D., Nikolaeva O., Orlov V.. and Ponomarev M. The use of the differential scanning calorimetry to studies on the interaction between myosin and actin. Abstracts of «1RCAW-99: Sew Trends in Calorimetry and its Applications». (Ii Ciocco (Barga), Italy, October 31 -November 03, 1999), abstract IV-41

29. Levitsky D.I., Rostkova E.V., Orlov V.N., Nikolaeva O.P., Moiseeva L.N., Teplova M.V., and Gusev N.B. Complexes of smooth muscle tropomyosin with F-actin studied by differential scanning calorimetry. // Eur. J. Biochem., 2000, v.267, №6, pp.1869-1877

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Орлов, Виктор Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Техника сканирующей калориметрии.

1.2. Калориметрические измерения.

1.3. Анализ результатов.

1.3.1. Влияние времени ответа (инерционности) калориметра.

1.3.2. Термодинамический анализ данных ДСК.

1.3.3. Кинетический анализ данных ДСК.

Влияние медленного равновесия на обратимые переходы

Одностадийная модель необратимой денатурации

Модель Ламри-Эйринга.

1.3.4. Денатурация белка, взаимодействующего с лигандом.

1.3.5. Анализ термограмм мультидоменных белков.

1.3.6. Некоторые примеры анализа калориметрических данных.

Примеры термодинамического анализа.

Примеры кинетического анализа.

Анализ термограмм мультидоменных белков.

Анализ термограмм белков, взаимодействующих с низкомолекуляными лигандами или с другими белками.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объекты и материалы.

2.2. Методы исследований.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Применение ДСК для изучения механизма необратимой тепловой денатурации белков.

3.2. Применение ДСК для изучения взаимодействий белков с низкомолекулярными лигандами.

3.3. Применение ДСК для изучения белок-белковых взаимодействий.

3.4. Применение ДСК для изучения надмолекулярных структур на примере вируса табачной мозаики.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение белков и надмолекулярных комплексов методом дифференциальной сканирующей калориметрией"

Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) существует уже 35 лет, но ее возможности все еще мало известны широкому кругу исследователей, поскольку до сих пор сканирующие микрокалориметры довольно дороги. Кроме того, многие препараты (большинство белков, в частности) при нагревании изменяются необратимо, что требует весьма больших препаративных затрат и дает преимущество неразрушающим методам анализа. Тем не менее, возможность непосредственного измерения важнейших термодинамических параметров -теплоемкости, энтальпии и энтропии в виде функции от температуры весьма заманчива для исследований, прямо или косвенно связанных с проблемами стабильности биополимеров, с меж- и внутримолекулярными взаимодействиями макромолекул.

В последнее время интерес к калориметрическим исследованиям растворов биополимеров неуклонно растет. Это связано, во-первых, с возникновением ряда задач в физико-химии макромолекулярных растворов (например, фолдинг белков, механизмы прионовых инфекций, агрегационные эффекты), которые нельзя решить, не располагая непосредственными данными о тепловых эффектах температурного воздействия, и, во-вторых, с ростом методических возможностей и с удешевлением измерительной техники.

Представления о структуре белковых молекул основываются в основном на информации, получаемой из двух независимых источников: химических исследований последовательности аминокислотных остатков в полипептидных цепях белков (первичной структуры) и кристаллографических исследований трехмерного расположения аминокислотных остатков (третичной структуры).

Понятно, что упорядоченность белковой структуры достигается сворачиванием полипептидной цепи в уникальную пространственную структуру. Однако до сих пор не совсем ясно, что заставляет полипептидную цепь свернуться таким определенным образом. Ясно только, что структура белка - явление не только топологическое, но и термодинамическое, и что нельзя продвинуться в понимании структуры белка без информации о ее энергетике [1]. Эта информация не может быть однозначно выведена из структурных данных. Она может быть получена лишь путем прямых измерений энергии дезорганизации нативной структуры белка. Разрушить нативную структуру можно изменением целого ряда параметров, таких как температура, давление, рН, концентрация денатурантов и т.д. [1,2]. Ясно, что именно варьирование температуры предпочтительнее остальных денатурирующих воздействий, т.к. температура и внутренняя энергия (энтальпия) являются сопряженными параметрами, определяющими состояние системы. Функциональная зависимость этих двух сопряженных параметров содержит в себе всю термодинамическую информацию о макроскопических состояниях системы и позволяет проследить процесс разрушения нативной структуры белка или обратный ему процесс формирования данной структуры. Температурная функция энтальпии может быть определена путем прямых измерений тепловой энергии, поглощаемой при прогреве объекта. Это осуществляется с помощью техники сканирующей микрокалориметрии, созданной специально для этих целей.

Цель настоящей работы состояла в том, чтобы оценить возможности исследования методом ДСК конформационных изменений, происходящих в белках под влиянием различных факторов, в результате взаимодействия белков с низкомолекулярными лигандами и белок-белковых взаимодействий. Среди задач исследования можно выделить следующие:

- исследование механизма необратимой тепловой денатурации креатинкиназы из скелетных мышц кролика и уридинфосфорилазы из Е. coli К-12 с кинетическим анализом данных.

- исследование влияния кофактора на характер тепловой денатурации альдегиддегидрогеназ на примере фосфорилирующей D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы из Bacillus stearothermophilus (GAPD) и нефосфорили-рующей D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы (GAPN) из Streptococcus mutans.

- исследование влияния пиридоксальфосфата (ПЛФ) и различных специфических лигандов - как активаторов, так и ингибиторов, на характер тепловой денатурации гликогенфосфорилазы Ъ из скелетных мышц кролика.

- изучение структурных изменений, происходящих в изолированной головке молекулы миозина (субфрагмент-1 миозина, S1) при образовании комплексов с аналогами неорганического фосфата, моделирующих различные промежуточные состояния АТРазной реакции миозина.

- изучение влияния на тепловую денатурацию тропомиозина и су б фрагмента-1 миозина (S1) их взаимодействия с другим мышечным белком -F-актином.

- сравнительное исследование целых вирусов табачной мозаики и белка, образующего вирусную оболочку.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Орлов, Виктор Николаевич

выводы

1. Методом ДСК проведено исследование необратимой тепловой денатурации креатинкиназы из скелетных мышц кролика и уридинфосфорилазы из Е. coli К-12 при разных скоростях нагрева с последующим кинетическим анализом полученных данных. Установлено, что наиболее точно тепловая денатурация креатинкиназы описывается простейшей одностадийной моделью необратимой денатурации, а денатурация уридинфосфорилазы из Е. coli - моделью, включающей две последовательные необратимые стадии. Найдены кинетические параметры соответствующих стадий.

2. При исследованиях фосфорилирующей D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогена-зы из В. stearothermophilus (GAPD) показано, что взаимодействие фермента с кофактором (NAD+) приводит к значительным конформационным перестройкам в молекуле белка, которые выражаются в существенном повышении его термостабильности.

3.При исследованиях нефосфорилирующей D-глицеральдегид-З-фосфатдегидро-геназы (GAPN) из Streptococcus mutans показано, что фермент существует в двух дискретных формах - термолабильной (tm = 46°С) и термостабильной (tm = 72°С), причем взаимодействие фермента с кофактором (NADP) приводит к дестабилизации фермента, переводя его в каталитически активную термолабильную форму.

4. При исследовании методом ДСК гликогенфосфорилазы Ъ из скелетных мышц кролика показано, что фермент без пиридоксальфосфата (ПЛФ) имеет существенно меньшую термостабильность, чем нативный фермент; это подтверждает важную роль ПЛФ в стабилизации нативной структуры белка. Показано также, что связывание гликогенфосфорилазой Ь специфических лигандов - как активаторов, так и ингибиторов, приводит к увеличению термостабильности фермента.

5. Показано, что метод ДСК позволяет эффективно регистрировать структурные изменения, происходящие в изолированной головке молекулы миозина (субфрагмент-1 миозина, Б1) при моделировании различных промежуточных состояний АТРазной реакции миозина. На основании этих данных предложен новый калориметрический тест для анализа конформационных изменений, происходящих в миозиновых головках в процессе АТРазной реакции. При помощи этого теста в миозиновой головке выявлены аминокислотные остатки, не входящие в активный центр АТФазы, но важные для распространения конформационных изменений от активного центра АТФазы на всю молекулу Б1.

6. Методом ДСК исследованы комплексы Р-актина из скелетных мышц кролика с другими мышечными белками - тропомиозином и изолированными головками миозина (81). Показано, что взаимодействие этих белков с Р-актином не оказывает существенного влияния на тепловую денатурацию актина, но значительно увеличивает термостабильность как тропомиозина, так и 81, причем связывание 81 с Р-актином заметно увеличивает термостабильность связанного с Р-актином тропомиозина. На основании этих данных предложен новый калориметрический тест для анализа конформационных перестроек, происходящих в миозиновых головках и в тропомиозине при их взаимодействии с филаментами Р-актина.

7. Методом ДСК наглядно продемонстрировано, что при нагревании смеси гомодимеров тропомиозина между ними происходит обмен цепями с образованием гетеродимеров. Этот эффект наблюдался даже в том случае, когда гомодимеры тропомиозина были связаны с Р-актином.

8. С помощью метода ДСК проведено сравнительное исследование целых вирусов

С 1 • ' табачной мозаики и белка, образующего вирусную оболочку. Показано, что белок-белковые взаимодействия, происходящие при полимеризации белка оболочки, приводят к резкому увеличению его термостабильности, а взаимодействие этого белка с вирусной РНК приводит к дополнительной стабилизации структуры вируса.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю сердечную признательность своим научным руководителям д.б.н. Д.И.Левицкому и к.ф.-м.н. В.А.Драчеву за чуткое руководство и всестороннюю поддержку, а также проф. Б.И.Курганову и д.б.н. Е.Н.Доброву за доброжелательное отношение и помощь в работе, за постоянное внимание и поддержку.

Хочу также выразить глубокую благодарность проф. В.И.Муронцу, проф. Н.К.Наградовой и П.В.Калмыкову за помощь в работе, поддержку и сотрудничество, а также всем друзьям и коллегам, без помощи которых написание диссертации было бы невозможным.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Приведенные данные наглядно демонстрируют возможности, которые предоставляет метод ДСК для исследования самых разных объектов - от простых белков до достаточно сложных белковых комплексов и высокоорганизованных надмолекулярных структур. Разработка новых подходов, основанных на применении этого метода, открывает, на наш взгляд, перспективное направление в решении ряда задач современной физико-химической биологии, многие из которых трудно решить другими методами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Орлов, Виктор Николаевич, Москва

1. Привалов П.Л. Энергетика структуры белковых молекул. // Биофизика, 1985, т.ХХХ, вып.4, стр. 722-733

2. Rice S.A., Wada A., Geidushek Е.Р. Some comments on the theory of denaturation. // Discussions of the Faraday Society, 1958, v. 25, p.130-137

3. Privalov P.L., Potekhin S.A. Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. // Methods Enzymol., 1986, v. 131, 4-51

4. Sturtevant J.M. Some applications of calorimetry in biochemistry and biology. // Annu. Rev. Biophys. Bioeng., 1974, v.3, p.35-51

5. Wadso I. Microcalorimeters. // Q. Rev. Biophys., 1970, v.3, №4, p.383-427

6. Privalov G., Kavina V., Freire E., and Privalov P.L. Precise scanning calorimeter for studying thermal properties of biological macromolecules in dilute solution. /'/ Analitical Biochemistry, 1995, v.232, 79-85

7. Privalov P.L., Khechinashvili N.N. A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study. II J. Mol. Biol., 1974, v.86, №3, p.665-84

8. Ptitsyn O.B. Molten globule and protein folding. I/Adv. Prot. Chem., 1995, v.47, 83-229

9. Privalov P.L. Stability of proteins: small globular proteins. II Adv. Prot. Chem., 1979; v.33, 167-241

10. Privalov P.L., Tiktopulo E.I., Venyaminov S.Y., Griko Y.V., Makhatadze G.I. and Khechinashvili N.N. Heat capacity and conformation of proteins in the denatured state. II J. Mol. Biol., 1989, v.205, p.737-750

11. Sturtevant J.M. Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins. U Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v.74, №6, p.2236-2240

12. Velicelebi G., Sturtevant J.M. Thermodynamics of the denaturation of lysozyme in alcohol-water mixtures. // Biochemistry, 1979, v. 18, №7, p. 1180-1186

13. Sanchez-Ruiz J.M. Differential scanning calorimetry of proteins. //Subcellular Biochemistry, Volume 24. Proteins: Structure, Function, and Engineering, edited by B.B.Biswas and Siddhartha Roy. Plenum Press, New York, 1995, pp. 133-176

14. Murphy K.P. and Gill S.J. Group additivity thermodynamics for dissolution of solid cyclic dipeptides in water. // Termochim. Acta, 1990,v.l72, p.l 1-20

15. Murphy K.P., Gill S.J. Solid model compounds and the thermodynamics of protein unfolding. // J. Mol. Biol, 1991, v.222, №3, p.699-709

16. Brandts J.F., Hunt L. The thermodynamics of protein denaturation. 3. The denaturation of ribonuclease in water and in aqueous urea and aqueous ethanol mixtures. // J. Am. Chem. Soc., 1967, v.89, №19, p.4826-4838

17. Филимонов B.B., Потехин C.A., Матвеев C.B., Привалов П.Л. Термодинамический анализ данных сканирующей микрокалориметрии. 1. Алгоритмы деконволю-ции сложных кривых теплопоглощения. // Молекулярная биология, 1982, т. 16, вып.З, стр. 551-562

18. Dinner A.R., Abkevich V., Shakhovich E.S., and Karplus M. Factors that affect the folding ability of proteins. II Proteins: Structure, function and genetics, 1999, v.35, p.34-40

19. Privalov P.L. Stability of proteins. Proteins which do not present a single cooperative system. П Adv. Protein Chem., 1982, v.35, p.1-104

20. Ahern T.J., Klibanov A.M. The mechanisms of irreversible enzyme inactivation at 100C. // Science, 1985, v.228, №4705, p.1280-1284

21. Zale S.E., Klibanov A.M. Why does ribonuclease irreversibly inactivate at high temperatures? 11 Biochemistry, 1986, v.25, №19, p.5432-5444

22. Потехин C.A., Ковригин E.JI. Влияние кинетических факторов на тепловую денатурацию и ренатурацию биополимеров. II Биофизика, 1998, т.43, вып.2, с.223-232

23. Lopez-Mayorga О. and Freire Е. Dynamic analysis of differential scanning calorimetry data. // Biophys. Chem., 1987, v.87, p.87-96

24. Potekhin S.A., Privalov P.L., Co-operative blocks in tropomyosin. U J. Mol. Biol., 1982, v.159, №3, p.519-535

25. Sturtevant J.M. Biochemical applications of differential scanning calorimetry. // Ann. Rev. Phys. Chem., 1987, v.38, p.463-488

26. Ginsburg A. and Zolkiewski M. Differential scanning calorimetry study of reversible, partial unfolding transitions in dodecameric glutamine synthetase from E. coli. I I Biochemistry, 1991, v.30, №39, 9421-9429

27. Manly S.P., Matthews K.S., Sturtevant J.M. Thermal denaturation of the core protein of lac repressor. II Biochemistry, 1985, v.24, №15, pp.3842-3846

28. Takahashi K., Sturtevant J.M. Thermal denaturation of streptomyces subtilisin inhibitor, subtilisin BPN', and the inhibitor-subtilisin complex. II Biochemistry, 1981, v.20, №21, p.6185-6190

29. Privalov P.L. Thermodynamic problems of protein structure. // Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 1989, v.18, p.47-69

30. Tamura A., Kimura K., Takahara H., and Akasaka K. Cold denaturation and heat denaturation of Streptomyces subtilisin inhibitor. l.CD and DSC studies. ¡/Biochemistry, 1991, v.30, №47, 11307-11313

31. Privalov P.L., Griko Yu.V., Venyaminov S.Yu., Kutyshenko V.P. Cold denaturtion of myoglobin. II J. Mol. Biol., 1986, v. 190, №3, p.487-498

32. Griko Y.V., Privalov P.L., Sturtevant J.M., Venyaminov S.Yu. Cold denaturation of staphylococcal nuclease. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, v.85, №10, p.3343-3347

33. Azuaga A.I., Galisteo M.L., Mayorga O.L., Cortijo M., Mateo P.L. Heat and cold denaturation of p-lactoglobulin B. IIFEBSLett., 1992, v.309, №3, p.258-260

34. Damaschun G., Damaschun H., Gast K., Misselwitz R., Muller J.J., Pfeil W., Zirwer D. Cold denaturation-induced conformational changes in phosphoglycerate kinase from yeast. //Biochemistry, 1993, v.32, №30, p.7739-7746

35. Gursky O., Atkinson D. High- and low-temperature unfolding of human high-density apolipoprotein A-2. // Protein Sci., 1996, v.5, №9, p.1874-1882

36. Ibarra-Molero B., Makhatadze G.I., Sanchez-Ruiz J.M. Cold denaturation of ubiquitin. // Biochim. Biophys. Acta, 1999, v. 1429, №2, p.384-390

37. Sanchez-Ruiz J.M., Lopez-Lacomba J.L., Cortijo M., Mateo P.L. Differential scanning calorimetry of the irreversible thermal denaturation of thermolysin. // Biochemistry, 1988, v.27,№5, p. 1648-1652

38. Guzman-Casado M., Parody-Morreale A., Mateo P.L. and Sanchez-Ruiz J.M. Differential scanning calorimetry of lobster heamocyanin. II Eur. J. Biochem., 1990, v.188, p.181-185

39. Galisteo M.L., Mateo P.L., and Sanchez-Ruiz J.M. Kinetic study on the irreversible thermal denaturation of yeast phosphoglycerate kinase. 11 Biochemistry, 1991, v.30, №8, p.2061-2066

40. Conejero-Lara F., Mateo P.L., Aviles F.X., and Sanchez-Ruiz J.M. Effect of Zn2+ on the thermal denaturation of carboxypeptidase B. I/ Biochemistry, 1991, v.30, №8, p.2067-2072

41. Freire E., van Osdol W.W., Mayorga O.L., Sanchez-Ruiz J.M. Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions in proteins. // Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 1990, v.19, p.159-188

42. Vogl T., Jatzke C., and Hinz H-J. Thermodynamic stability of annexin VE17G: equilibrium parameters from an irreversible unfolding reaction. II Biochemistry, 1997, v.36, №7, p. 1657-1668

43. Kurganov B.I., Lyubarev A.E., Sanchez-Ruiz J.M., Shnyrov V.L. Analysis of differential scanning calorimetry data for proteins. Criteria of validity of one-step mechanism of irreversible protein denaturation. // Biophys. Chem., 1997, v.69, p.125-135

44. Lepock J.R., Rodahl A.M., Zhang C., Heynen M.L., Waters В., and Cheng K-H. Thermal denaturation of the Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum reveals two thermodynamically independent domains. IIBiochemistry, 1990, v.29, №3, 681-689

45. Lumry R., and Eyring H. Conformation changes of proteins. // J. Phys. Chem., 1954, v.58, p.110-120

46. Sanchez-Ruiz J.M. Theoretical analysis of Lumry-Eyring models in differential scanning calorimetry. // Biophys. Journal, 1992, v.61, 921-935

47. Любарев A.E., Курганов Б.И. Моделирование процесса необратимой тепловой денатурации белка при переменной температуре. I. Модель, включающая две последовательно протекающие необратимые стадии. //Биохимия, 1998, т.63, вып.4, с.516-523

48. Lyubarev A.E., Kurganov B.I., Burlakova A.A., Orlov V.N. Irreversible thermal denaturation of uridine phosphorylase from Escherichia coli K-12. // Biophys. Chem., 1998, v.70, №3, p.247-257

49. Любарев A.E., Курганов Б.И. Моделирование процесса необратимой тепловой денатурации белка при переменной температуре. II. Полная кинетическая модель Ламри-Эйринга. // Биохимия, 1999, т.64, вып.7, с.990-997

50. Fukada H., Sturtevant J.M., Quiocho F.A. Thermodynamics of the binding of L-arabinose and of D-galactose to the L-arabinose-binding protein of Escherichia coli.ll J. Biol. Chem., 1983, v.258, №21, рЛ 3193-13198

51. Edelman G.M. The covalent structure of a human gamma G-immunoglobulin. XI. Functional implications. // Biochemistry, 1970, v.9, №16, p.3197-3205

52. Rao S.T., Rossmann M.G. Comparison of super-secondary structures in proteins. II J. Mol. Biol., 1973, v.76, №2, p.241-256

53. Rossmann M.G., Argos P. Protein folding. И Annu. Rev. Biochem1981, v.50, p.497-532

54. Новохатный В.В., Медведь Л.В., Кудинов С.А., Привалов ПЛ. Доменная организация молекул Lys-плазминогена. II Молекулярная биология, 1983, т.17, вып.5, с.976-982

55. Novokhatny V.V., Kudinov S.A., Privalov P.L. Domains in human plasminogen. Il J. Mol. Biol, 1984, v.179, №2, p.215-232

56. Privalov P.L., Filimonov V.V. Thermodynamic analysis of transfer RNA unfolding.

57. J. Mol. Biol., 1978, v. 122, №4, p.447-464

58. Freire E. and Biltonen R.L. Statistical mechanical deconvolution of thermal transitions in macromolecules. I Theory and application to homogeneous systems. // Biopolymers, 1978, v. 17, 463-479

59. Gill S.J., Richey B., Bishop G., Wyman J. Generalized binding phenomena in an allosteric macromolecule. // Biophys. Chem., 1985, v.21, №1, p.1-14

60. Brandts J.F., Hu C.Q., Lin L-N., Mas M.T. A simple model for proteins with interacting domains. Applications to scanning calorimetry data. II Biochemistry, 1989, v.28, №21, 8588-8596

61. Ramsay G., Freire E. Linked thermal and solute perturbation analysis of cooperative domain interactions in proteins. Structural stability of diphtheria toxin. // Biochemistry, 1990, v.29, №37, p.8677-8683

62. Freire E., Murphy K.P., Sanchez-Ruiz J.M., Galisteo M.L., Privalov P.L. The molecular basis of cooperativity in protein folding. Thermodynamic dissection of interdomain interactions in phosphoglycerate kinase. // Biochemistry, 1992, v.31, №1, p.250-256

63. Shnyrov V.L., Zhadan G.G., Akoev I.G. Calorimetric measurements of the effect of 330-MHz radiofrequency radiation on human erythrocyte ghosts. // Bioelectromagnetics, 1984, v.5, №4, p.411-418

64. Brandts J.F. and Lin L-N. Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry. // Biochemistry, 1990, v.29, №29, 6927-6940

65. Catanzano F., Graziano G., Fusi P., Tortora P., Barone G. Differential scanning calorimetry study of the thermodynamic stability of some mutants of Sso7d from Sulfolobus solfataricus. 11 Biochemistry, 1998, v.37, №29, p. 10493-10498

66. Baumann H., Knapp S., Karshikoff A., Ladenstein R., Hard T. DNA-binding surface of the Sso7d protein from Sulfolobus solfataricus. II J. Mol. Biol., 1995, v.247, №5, p.840-846

67. Burley S.K., Petsko G.A. Aromatic-aromatic interaction: a mechanism of protein structure stabilization. II Science, 1985, v.229, p.23-28

68. Yang A.S., Sharp K.A., Honig B. Analysis of the heat capacity dependence of protein folding. II J. Mol. Biol., 1992, v.221, №3, p.889-900

69. Makhatadze G.I., Privalov P.L. Energetics of interactions of aromatic hydrocarbons with water. // Biophys. Chem., 1994, v.50, №3, p.285-291

70. Tanaka A., Flanagan J., Sturtevant J.M. Thermal unfolding of staphylococcal nuclease and several mutant forms thereof studied by differential scanning calorimetry. // Protein Sci, 1993, v.2, №4, p.567-576

71. Johnson C.M., Cooper A., Stockley P.G. Differential scanning calorimetry of thermal unfolding of the methionine repressor protein (MetJ) from Escherichia coli. 11 Biochemistry, 1992, v.31, №40, p.9717-9724

72. Rafferty J.B., Somers W.S., Saint-Girons I., Phillips S.E. Three-dimensional crystal structures of Escherichia coli met repressor with and without corepressor. // Nature, 1989, v.341, p.705-710

73. Wassenberg D., Welker C., Jaenicke R. Thermodynamics of the unfolding of the cold-shock protein from Thermotoga maritima. IIJ. Mol. Biol., 1999, v.289, №1, p.187-193

74. Welker C., Bohm G., Schurig H., Jaenicke R. Cloning, overexpression, purification, and physicochemical characterization of a cold shock protein homolog from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima. II Protein Sci., 1999, v.8, №2, p.394-403

75. Myers J.K., Pace C.N., Scholtz J.M. Denaturant m values and heat capacity changes: relation to changes in accessible surface areas of protein unfolding. II Protein Sci., 1995, v.4, №10, p.2138-2148

76. Fujita S.C., Go N., Imahori K. Melting-profile analysis of thermal stability of thermolysin. A formulation of temperature-scanning kinetics. // Biochemistry, 1979, v. 18, №1, p.24-28

77. Voordouw G., Milo C., Roche R.S. Role of bound calcium ions in thermostable, proteolytic enzymes. Separation of intrinsic and calcium ion contributions to the kinetic thermal stability. // Biochemistry, 1976, v. 15, №17, p.3716-3724

78. Le Bihan T., Gicquaud C. Kinetic study of the thermal denaturation of G actin using differential scanning calorimetry and intrinsic fluorescence spectroscopy. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1993, v.194, №3, p.1065-1073

79. Davoodi J., Wakarchuk W.W., Surewicz W.K., Carey P.R. Scan-rate dependence in protein calorimetry: the reversible transitions of Bacillus circulans xylanase and a disulfide-bridge mutant. II Protein Set, 1998, v.7, №7, p. 1538-1544

80. Шныров B.JI., Левицкий Д.И., Веденкина H.С., Николаева О.П., Хворов Н.В., Пермяков Е.А., Поглазов Б.Ф. Доменная структура субфрагмента 1 миозина. // Доклады АН СССР, 1989, т. 304, №6, с.1497-1499

81. Levitsky D.I., Khvorov N.V., Shnyrov V.L., Vedenkina N.S., Permyakov E.A., Poglazov B.F. Domain structure of myosin subfragment-1. Selective denaturation of the 50 kDa segment. // FEBSLett., 1990, v.264, №2, p.176-178

82. Левицкий Д.П., Николаева О.П., Орлов В.Н., Павлов Д.А., Пономарев М.А., Росткова Е.В., Дифференциальная сканирующая калориметрия миозина и актина. // Биохимия, 1998, т.63, вып.З, с.381-394.

83. Levitsky D.I. Domain Structure of the Myosin Head. Soviet Scientific Reviews / Section D Physico-chemical Biology, Harwood Acad. Publishers GmbH, 1994, vol.12, Part 1, p.53

84. Левицкий Д.И. Структура миозиновой головки. II Биохимия, 1991, т.56, № 9, с.1539-1566

85. Rayment I., Rypniewski W.R., Schmidt-Base К., Smith R., Tomchick D.R., Benning M.M., Winkelmann D.A., Wesenberg G., Holden H.M. Three-dimensional structure of myosin sub fragment-1: a molecular motor. // Science, 1993, v.261, p.50-5 8

86. Tanaka A., Fukada H., Takahashi K. Differential scanning calorimetric studies on the domain structure of Aspergillus glucoamylase. II J. Biochem., 1995, v. 117, №5, p.1024-1028

87. Donovan J.W., Ross K.D. Iron binding to conalbumin. Calorimetric evidence for two distinct species with one bound iron atom. II J. Biol. Chem., 1975, v.250, №15, p.6026-6031.

88. Beardslee R.A., Zahnley J.C. A simple preparation of (3-trypsin based on a calorimetric study of the thermal stabilities of a- and (3-trypsin. 11 Arch. Biochem. Biophys., 1973, v.158, №2, p.806-81 1

89. Sutherland J.W. Disagreement between calorimetric and van't Hoff enthalpies of assembly of protein supramolecular structures. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v.74, №5, p.2002-2006

90. Sturtevant J.M., Velicelebi G., Jaenicke R., Lauffer M.A. Scanning calorimetric investigation of the polymerization of the coat protein of tobacco mosaic virus. II Biochemistry, 1981, v.20, №13, p.3792-3800

91. Jecht M., Tomschy A., Kirschner К., Jaenicke R. Autonomous folding of the excised coenzyme-binding domain of D-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase from Thermotoga maritima. II Protein Sei., 1994, v.3, №3, p.411-418

92. Skarzynski Т., Wonacott A.J. Coenzyme-induced conformational changes in glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus. IIJ. Mol. Biol., 1988, v.203,№4, p. 1097-1118

93. Titani K., Koide A., Hermann J., Ericsson L.H., Kumar S., Wade R.D., Walsh K.A., Neurath H., Fischer E.H. Complete amino acid sequence of rabbit muscle glycogen Phosphorylase. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1977, v.74, №11, p.4762-4766

94. Nakano К., Hwang P. К., Fletteric R. J. Complete eDNA sequence for rabbit muscle glycogen phosphorylase. // FEBSLett., 1986, v.204, №2, p.283-287

95. Barford D., Johnson L.N. The allosteric transition of glycogen phosphorylase. // Nature, 1989, v.340, p.609-616

96. Barford D., Johnson L.N. The molecular mechanism for the tetrameric association of glycogen phosphorylase promoted by protein phosphorylation. I/ Protein Sci., 1992, v.l, p.472-493

97. Johnson L.N., Snape P., Martin J.L., Acharya K.R., Barford D., Oikonomakos N.G. Crystallographic binding studies on the allosteric inhibitor glucose-6-phosphate to T state glycogen phosphorylase b. II J. Mol. Biol., 1993, v.232, p.253-267

98. Hernandez-Arana A., Rojo-Dominguez A., Altamirano M.M., Calcagno M.L. Differential scanning calorimetry of the irreversible denaturation of Escherichia coli glucosamine-6-phosphate deaminase. /У Biochemistry, 1993, v.32, №14, pp.3644-3648

99. Корнилаев Б.А., Курганов Б.И., Еронина Т.Б., Чеботарева Н.А., Ливанова Н.Б., Орлов В.Н., Черняк В.Я., Механизм тепловой денатурации мышечной гликогенфосфорилазы Ъ. II Молекулярная биология, 1997, т.31, №1, с.98-107

100. Lowey S., Slayter H.S., Weeds A.G., Baker H. Substructure of the myosin molecule. I. Subfragments of myosin by enzymic degradation. II J. Mol Biol., 1969, v.42, №1, pp. 1-29

101. Taylor E.W. Chemistry of muscle contraction. // Annu. Rev. Biochem., 1972, v.41, №10, pp.577-616

102. Weeds A.G., Taylor R.S. Separation of subfragment-1 isoenzymes from rabbit skeletal muscle myosin. // Nature, 1975, v.257, p.54-56

103. Butler P.J. The current picture of the structure and assembly of tobacco mosaic virus. II J. Gen. Virol., 1984, v.65, Pt.2, p.253-279

104. Saito T., Meshi T., Takamatsu N., Okada Y. Coat protein gene sequence of tobacco mosaic virus encodes a host response determinant. // Proc. itfatl. Acad. Sci. USA, 1987, v.84, №17, p.6074-607

105. Culver J.N., Dawson W.O. Tobacco mosaic virus coat protein: an elicitor of the hypersensitive reaction but not required for the development of mosaic symptoms in Nicotiana sylvestris. II Virology, 1989, v. 173, №2, p.755-758

106. Culver JN, Stubbs G, Dawson WO. Structure-function relationship between tobacco mosaic virus coat protein and hypersensitivity in Nicotiana sylvestris. II J. Mol. Biol., 1994, v.242, №2, p.130-138

107. Taraporewala ZF, Culver JN. Identification of an elicitor active site within the three-dimensional structure of the tobacco mosaic tobamovirus coat protein. // Plant Cell, 1996, v.8, №2, p.169-178

108. Srinivasan S., Lauffer M.A. Reconstitution of tobacco mosaic virus: calorimetric and related studies. 11 Biochemistry, 1970, v.9, №10, p.2173-2180

109. Mutombo K., Michels B., Ott H., Cerf R., Witz J. Scanning calorimetric studies of the stability of tobacco mosaic virus and aggregates of its coat protein. II Eur. Biophys. J., 1992, v.21, №1, p.77-83

110. Dobrov E.N., Abu-Eid M.M., Solovyev A.G., Kust S.V., Novikov V.K. Properties of the coat protein of a new tobacco mosaic virus coat protein ts-mutant.// J. Protein Chem., 1997, v.16, №1, p.27-36