Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ГЛИКОГЕНФОСФОРИЛАЗА МЫШЦ КРОЛИКА — ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА И РЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ГЛИКОГЕНФОСФОРИЛАЗА МЫШЦ КРОЛИКА — ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА И РЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА"



На правах рукописи

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. Д. И. БАХА

ЛИВАНОВА

Наталья Борисовна

ГЛИКОГЕН ФОСФОР ИЛ АЗА МЫШЦ КРОЛИКА — ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА И РЕГУЛЯ ТОРНЫЕ СВОЙСТВА

03.00.04 —биологическая химия Диссертация написана на русском^ языке

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва — 1975

АКАДЕМИЯ НАУК СССР Ордена Ленина Институт биохимии ии. А.Н.Баха

. На правах рукописи ,

ЛИВАНОВА Наталья Борисовна

ГЛШОГВНФОСФОРИЛАЗА ШШЦ КРОЛИКА - ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА И Р2ГУ1ЯТ0РШЕ СВОЙСТВА

# 03.00.04 - биологическая хшця I

Диссертация написана на русской языке

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктор^, биологических наук

■ .^ац'а;:!/.!.. 1..'...■I •• -У--■

Москва - 1975

Работа выполнена а Группе биохимии движения Ордена Ленина Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР ^директор - академик А,И.Опарин}.

Научные консультанты:

доктор биологических наук,профессор Ы.Н.Дюбимова-Энгельгардт доктор биологических наук Н.А.Киселев

Официальные оппоненты;

доктор биологических наук, профессор Е.Л.Розенфельд доктор биологических наук А.И.Петрова

доктор биологических наук О.Л.Полпновский

Работа направлена «а официальный отзыв на кафедру биохимии животных Московского Государственного Университета им. Ломоносова.

Автореферат разослан м К ^975

Защита диссертации состоится " ^ и 1975 г.

на заседании Ученого совета Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР по адресу: Москва 117071, Ленинский проспект 33. С диссертацией «окно ознакомиться в библиотеке Института.

Ученый секретарь кандидат биологических наук

Ш.Н.Дьячков)

ВВЕДЕНИЕ

Универсальным аккумуляторов энергии, необходимой для протекания различные процессов жизнедеятельности яивого организма, в частности, процесса мышечного сокращения,является ATO (.Энгельгардт и Любимова, 1939). Уровень АО» в клетке поддерживается, в основной за-счет окислительного и гли ко ли ти ч е ско го превращения углеводов.

Клшчевая реакция метаболизма углеводов в ишцах -'это фосфоролитйческое расщепление главного резервного полисахарида гликогена, катализируеиое ферментом гликсгенфосфр-ралазой d- -1,4-гшкац:ортофосфат-глюкозилтрансфераза). Но ваяну» роль фосфорилазы в обмене веществ указывает ■ почти универсальное распространенно этого Фермента в природе: он обнаружен у большинства организмов, от простейших одноклеточных до млекопптаэдих и человека.

Узловое полокение, которое занимает фосфорилаза в цепи превращении углеводов в мыице, определяет наличие f слокнейшей системы регуляции ее активности. Сосфорилаэа относится к классу регуляторных ферментов, обладающих \ , четвертичной структурой. Она содержится в ыиацах в виде двух взаимопревращающихся форм - фосфорилазы Б и фосфорилазы А. Фосфорилаза В - нефосфорилирозанная форма фермента, проявляющая активность только'в присутствии АЫФ. Фосфорилаза А - фосфорилировашшя форма, активная без всяких добавок. Эти две формы одинаковы по своей каталитической Функции и специфичности, но обладают различной способностью к ассоциации в тетраиер и различными аллостерически-ии свойствами.

Изучение структуры и регулиторных свойств фосфорилазы уае в течение почти четырех десятилетий, начиная с открытия фосфорилазной активности шшц Кори и Парнасом, привлекает к себе внимание исследователей в раде ведущих -

энзимологических лабораторий мира (.таких, как лаборатории Кора, Скиера, Кребсз, Грейаса в США, Мадсена а ,Канаде, Хельырайха в ФРГ, Бвка во Фракции, Бота* в Венгрии, С.Е. Северина в СССР и др.).

Не случайно, именно фосфорилаза оказалась ферментом, при изучении которого был сделан ряд крупнейих открытий в области энзиыологяи, Так, фосфорилаза била первым ферментом, на которой била выявлена возможность обратимой диссоциации-на субъединицы при блокировании ¿ш -групп; у фосфорилазы впервые бил обнаружен такой ванный способ регуляции .активности, как козалентпая модификация или взаимопревращение двух форм фермента - фосфорилазы А и Б; фосфорилэзабыла первый ферментом, на котором была открыта возможность активации АМФ - эффекторои, не имеющим структурною сходства с субстратом и присоединяющимся не к активному, а к регулг.торноыу центру - такая регуляция, названная аллостерпческой, поэке развилась в самостоятельную область энзимологии.

Высокое содержание фосфорилазы в мышцах от растворимых белков) и сравнительная легкость получения фермента в кристаллическом состоянии создали возможность использования практически всего современного арсенсиа физических, химических и физико-хииических методов для изучения фосфорллазы. С другой стороны, особенности структуры (.каг-дая субъедииица состоит более чем из 800 аминокислотных остатков и содернит-несколько существенных для активности и регулпции центров), склонность субъединиц фермента к обратимсЦ ассоциации-диссоциации и наличие чрезвычайно сложной системы регуляции активности создавали серьезные трудности для работающих в этой области исследователей и послунали, по-шдииоиу, причиной того, что до сих пор еще нет ясности во многих существенных аспектах структуры и механизма действия фосфорилазы.

Исследование структурных и Функциональных особенностей гликогевфоофорилазы имеет важное теоретическое и практическое \начекй<П~Теоретическая значимость вытекает

на того обстоятельства, что исследование фосфорилзэы.включает б себя почт» все основные вопросы современной энзино-логаи на молекулярном уровне. Практическое значение исследования структуры и регуляции активности фосфорилазы обусловливается то11 ролью, которую этот фермент играет в организме. Известно, например, тяжелое наследственное заболевание, болезнь Мак-Ардля, при которой фосфорилаза в мышцах отсутствует и гликоген не мсцет использоваться. В организме существует сложная система регуляции активиости фосфорилазы путей ковалентной нодификации, включающая в себя ряд ферментов и метаболитов; эта система подвержена гормональной регуляции и связана с процессом мышечного сокращения; функциональные нарушения на любой ступени этой каскадной системы приводят к тяиелии недугам, ^лечение которых невоэыокно без глубокого познания структуры и ме- . ханизма действия узлового фермента системы - фосфорилазы . гликогена.

Настоящая.работа является частью проводимых нами в течение ряда лет в Лаборатории баохиши движения (.зав. профессор Н.Н. Любимова-Фиге ль гардт) Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР исследований структуры и регулятор-ных свойств мышечных гликогенфосфорилаэ Б и А.

Б настоящей исследовании ставились, в основном, следующие задачи.

1. Изучение условий диссоциации фосфорилаз Б и А из мышц кролика на субъедивкцы с целью получения дополнительной информации о четвертичной структура фермента, свойствах субъединиц и характере связей между ними.

2. Выяснение вопроса об участии пиридоксаль-Б^фосфз-та в поддержании четвертичной структуры фосфорилазы.

8. Исследование четвертичной структуры фосфорилаз Б и А с помощью метода электронной микроскопии.

4. Изучение кинетики аллостерического ингибирования фосфорилазы Б.

5* Выяснение вопроса о пространственной раэделенно-сти центров связывания различных лигандов в фосфорилазе Б.

6. Исследование возиокиостей получения гибридов фос-форилаз Б и А и особенностей их регуляции. ;

Диссертация состоит из обзора литературу и экспериментальной части. В обзоре литературц освецепы вопроси, касащщ1еся структуру и ыеханизиа действия шечш глико-генфосфорилаз, роли огдельник групп белковой иолекулы в функционировании фермента, особенностей регуляции активности фосфорилаз как на очнаёншх препаратах ферыанта так и в условиях» приблиаааидехся к таковым in vivo.

Ниже изложено основное содержание экспериментальной части диссертации.

ИССЛЕДОВАНИЕ чзтвзртлчноэ СТРУКТУРУ

гликогбноосфорклаз б в а

Исследование регуляторних свойств олигоаераих ферментов теснейииа образом связано с изучением их четвертичной структуры: условий диссоциации на субвединицы, характера связи цезду субъединицами в олигоцере, пространственного расположения и форщ субъединиц, зозмонких перестроек четвертичной структуры поя деиствкеи лигандоз.

Все ферменты, имеющие регуляторние £?у шсции, т.е. функции, связаннее с поддержанием требуемых скоростей реакций, относятся к классу регуляторных Оелков. Именно на уровне четвертичной стру/тури появладтсд такие новис возможности регуляции, кок регуляция активности путей ел-лоотерулюсгл'х взинисдеМсукп! и регуляция путем обропшой ассоцисцки-диссоцкецци субъединиц фермента.

В настоящее время исследование четвертичной структуры белков проводится с поцощью целого арсенала физических 1 и физико-химических иетодов, таких, как релтгеноструктурной анализ, рассеяние рентгеновских лучей под иалыми угла-■ ми, электронная шк рос к опия, светорассеяние, поляризация-■■-шошшисценция, гель-хроматогрэфия, гель-электрофорез»кинетические метода. Наиболее достоверна результаты, полученные сочетанием нескольких иетодов.

В лaim ей работе анализ четвертичной структуры ыкоеч-ных фосфоридаз Б и А проводился с помочью методов седиментации в ультрацентрифуге и электронной микроскопии. Для выяснения вопроса об участии пирмдоксаль-Б'-фосфате в соединении субъедкниц фосфоридвзы, а такие для получения не-, которых сведений об элементах вторичной структуры фериен-то бш[ использован иетод дисперсии оптического вращения и циркулярного дихронзиа.

ИССЛВДШАНМЗ ДИССОЦИАЦИИ Ф0СФ0РИЛАЗ Б и А

НА суеданш

Известно, что в растворе при достаточно высокой концентрация .белка фосфорилаза Б существует в.виде даиера'.с цоиенулнрнш весом 200 ООО, а фосфорилаза А в виде тетра-иера с молекулярный весои 400 ООО. Классические исследования Модсена и Кори показали, что фосфорииеза D и фоефори-дазэ А диссоциируют соответственно на 3 и 4 роавда еубъ-единицы при обработке п-ХУБ в нейтральной среде Hudson, Oori, 1956;). Уо-dv и Грейвс обнаружили, что фоефорилаза А распадается на дамери в присутствии 3 U M&pi, при до- f бавлении глюкозы или при повышении температуры до 34° ( w traf;, a raves, 1963 ). К точу времени, когда ыы начинали, свои исследования, других способов диссоциации фосфорилаз на субъодиницы известно не било.

В первуа очередь ш предприняли ошты по изучений ' ирезроцений фосфорулаз Б и А в кислой к цепочной среден Для наблюдении за диссоциацией фосфорилаз использовали аналитическое ультрацентрифугирование в ульграцентрифуге Сиинко иодель Б со " tSciilieren 11 оптикой.

В эа'см разделе работы принимали участие сотрудник^ Института биологической и медицинской химии АМН СССР профессор В.О.Шшкитер, канд.биол.наук А.Д.Ыорозкик и аспирант В.Я.Пихелгас.

А /

/ ч

/ \

/

\

4 6 8 5 Фассрарилаза В

го 2.5 3,0 4.0 6.5 9.3 Й5 7(5

/ V) /

* *

) С"

у J \

/ — \

J ■ч

а е е о 5 Фосфоралаза Л

■3.34.3 6-0

Рис.1. Схеми седине н г зци о и ни х днаграии фосфорилаз Б и А и продуктов их превращений в кислой и щелочной среде. Концентрация белка 6 ыг в ыл, температура 20°, седиментация слева направо. Каждая из вертикальных линий соответствует указанному под ней коэффициенту седиментации

4>

На рисЛ представлены схемы седииентационных диа-грема, Полуниных при у ль т раце шг ри фу ги ро в а нии растворов фосфорилазы и А при различных рН. Как видно» исходные ■ препараты ф-зфорилаэ Б и А при рН, близкой к нейтральному, дают сииыет;..!чные'емки с характерными для этих форм фермента коэфф;:.чиентеш1 седиментации I и у,«, соответственно) „

В пределах рН от 5,0 до 9,5 никаких изменений коэффициентов сегментации фосфорилаз Б и А не наблюдается. Эта область структурной устойчивости фермента совпадает о 1 хорошо известной "зоной стабильности*' спектров поглощения и белковой фл^тресценции фосфорилазы»

При' рН 3,;>*4,0 и 10,5-11,0 наблюдается образование

I

полидисперсных агрегатов, что, по-видимому, связано с.

отщеплением пи ри док с а ль-Р от фосфорияазы при этих значениях рН и освобождением реакционноепособных групп полапептидных цепей» взаимодействие которых приводит к сильной ассоциации частиц в растворе.

За пределам этих зон при рН низе S»0 и вше 11,0 фос форилаза Б и фосфоралаза А превращаются в компоненты с коэффициентами седиментации ад и 5,53. Попытки определить молекулярные веса этих компонентой не увенчались успехом, вследствие их нестабильности а склонности к агрегации.

Диссоциация фосфорилаз Б и А при рН нияе 4,5 и выше 10,5 необратима: нейтрализация как щтзи постепенного добавления соответствующего буферного раствора, так и путчем диализа неизменно приводила к выпадению фермента в осадок и к полной■потере активности.

Mosho было полагать, что компонента с коэффициентом седиментации ^ представляют собой продукты дальнейшей-диссоциации субъедшшц с молекулярным весом 100 ООО. Однако, накопленные к настоящему времени дашше позволяют считать, что субъеданицы фосфорилазы с молекулярный весом 100 ООО состоят из одной полипептидной цепи t Fisooer, Pooitor, Suari, 1Э?0

Появление при рН ниие 3,0 и выше 11,0 компонентов с коэффициентом седиментации ча ыоано объяснить следующим образом: при этих крайних значениях рН в белке ионизированы полностью либо основные (.при рН 3,0), либо кислые (.при рН XI,0) группы, ионизация же, противоположно зарязенных групп подавлена, что приводит к возникновению сильного.1' электростатического отталкивания и вследствие этого к плавлению отдельных участков ©С-спиралей и сильному вытягиванию субьеднниц. Таким образом, коэффициент седиментации уменьшается не вследствие снижения молекулярного веса, а вследствие изменения форма молекулы.

Особый интерес представляет зона рН 9,5-10,0, в которой фосфорилаза Б дает компонент с а = а фосфорилаза А превращается в компонент с s = 8-J tpac.SK

- хо -

Ж.

Ж

ее« в в и 5

$л ;.

7,0

Рис.2. Схемы седиментационных диаграмм обратимой диссоциации фосфорилаз Б и Л*

1 - субъединиц'ы фосфорилазы Б при рН 9,8;

2 - реассоциированная из субъединиц фосфори-

лаза Б;

.3 - субъединицы фосфорилазы А при рН 9,8; 4 - реассоциированная из субъединиц фосфорила-зз А; реассоциацию осуществляли путей нейтрализации растворов кислым глициновым буфером до рН 7,0. Концентрация белка В мг в мл, температура £0°, седиментация слева направо. Каждой вертикальная линия соответствует указанному под ней коэффициенту седиментации.

Определение молекулярных весов фосфорилазы Б и фосфо-рилаэы А при рН 10,0 показало, что в этих условиях фосфо-рилаза Б распадается на мономеры с молекулярным весом 100 ООО, а фосфора лаза А на димеры с молекулярным весом — 200 ООО.

Процент распавшихся молекул зависит от величины рН; при рН 10,0 в растворе почти уяе не остается исходного фермента. Стационарное состояние, судя по седииентационным диаграммам, достигается довольно быстро и сохраняется по крайней маре в течение четырех часов.

Превращения фоофорилаз в зоне рН 9,8-10,0 полностью обратимы; при нейтрализации наблюдается реассоциация в исходную форму как в случае фосфорилазы-Б, так и А 1рис.2>,

при этой практически полностьо восстанаэдинается активность фсриецта.

Поведение фосфорилазы А при рН 9,5-10,0 существенно облачается от поведения фосфорилазы Б при этих значениях рН. Так, при рН 9,8 фосфорилаза Д. распадается но динары» фосфоридазо Б кэ при рН 9,6, на ходуле 5!, в основном, в фор-иэ мономеров с чолекуляриим весен 100 ООО (.Рис.Й). Отсюда цоипо с делать заключение, что в фосфорплазе Л связи мекду мацомерзан неравноценны - мономеры э составе стеров связаны прочнее, чем дшлерц в тетрауерз (.Ливанова, Пихалгао, ¡Нвикитер, 1555; Ливанова и,др., 1966)* Этот вывод согласуется и с данными других авторов.

диссоциация фосфорилазы Б но иоиоиеры при рН 10,0" становится, необратгаой, если к раствору субъединиц добавить формальдегид до конечно!! концентрацин В результате такой обработки субъедишцы терпит способность к ■ реассоциоциш в исходный фермент при нейтрализации. После диализа против 0,1 Ц глицинового буфера рИ 7,0 картина се- . димен-гации такие не изменяется, Действие формальдегида, по-видамоиу, связано с тем, что он легко реагирует о В -зшнотрупнами белкой, как при нейтральной, так и при ад- ? лочнои рН, образуя в присууствин глицина производные типа 6 - N - (.нети- К -глкцни). \ ,

Итак, исследование диссоциации фосфорилэз £ с А л кислой и щелочной среде показало, что зона устойодноста четвертичной структуры ферцента ^рН от 5,0 до 9,5) совпадает о "зоной стабильности" спектров поглощения и белка-, вой флуоресценции фосфорилазы. г Неследованно диссоциации фосфоралаз В к А при рН

9,5-10,0 позволило пршетй к выводу, что в фосфорнлазе А' имеется два типа связей: один тип иезду мономерами в диуе-" * ре, устойчивей в рассматриваемой области рН, и другой -иезду дниерада в тетраиере; евпзи второго типа, так ке, как и связи иезду иономераии фосфорилазы Б, рвутся при рН 9,5-10,0. Суда по характеру диссоциации фосфорилазы В а А а области рН 9,5-10,0, связи иезду моноцераци в даме-

ре фосфорилазы Б и мекду димерами в тетрамере фосфорилазы А имеют электростатическую природу. '

] " ЦИРПМНРОД ДЙХРШЗМ И 'ДИСПЕРСИЯ оптического ■ ВРАЦВНИН (ШЕЧНШ ФОСФОРИЛАЗЫ Б

Применение методов измерения дисперсии оптического вращения 1Д0В) и циркулярного дихроизма позволило полу- . чить цешшз сведения относительно структуры рода ферментов и исследовать конфориациошше переходы белковых молекул в растворе при различных воздействиях.

Анализ плавных кривых дисперсии оптического вращения ферментов в видииои и ультрафиолетовом свете и измерения аномальной ДОВ и циркулярного дихроизма в полосах шэгло¿нанял пептидных групя дают информацию о содержании еС-спн-ралсй и й -структур в молекуле белка и об изменении ксш-фораации молекулы а растворе. Исследование аномалий ДШ и циркулярного дихроизма в полосах поглощения связанных с белком коферментов или ионов металлов позволяет сделать определенные выводи о конфорнация ективнцх центров ферментов и об их изменении под влиянием субстратов и эффекторов, а такле о характере связи кофзрмента с о'елком.

Фосфорниаза, как известно, содергсит ковалентио связанный с белком [шридоксаль-Р, но одной молекуле на мономер фермента ( ПИнеадог^! в* 1953 >*

Парадоксаль-Р .необходим для поддержания четвертичной структуры фосфорылази и для проявления каталитической активности: удаление кофактора деле при очень мягких условиях приводит к диссоциации фосфорилазы на ионоиеры и к полной потере активности; добавление ПЛФ к апоферменту восстанавливает структуру и активность.

До сих пор еще нет полной ясности в вопросе о том, как связан Ш1Ф с белкой и какова конкретная роль его в фосфорилаза. В период же, когда мы начинали эту работу, подобного рода сведения были очень скудны, поэтому имела серьезное эначеине~Ж<Тая информация,касающаяся характера

связи пиридоксаль-Р с ; »осфорнлазой, участия пирадоиааяь-Р в поддержании четверти шой структуры фермента и т.?;.

Сяшохрячная шле^ула' свободного пиридоксаль-Р с ПО'себе оптически не ал-ивна. По аналога:-! с трансс?.::;;: аз ой iic;aio бс.'ю полагать, ч:о связывание кофаккора с &:юфосфо-рнлазой индуцирует act; г-атрическш; сдвиг в злектре;:цсч1 структуре ПЛФ и появление вследствие этого циркулярного дихроизма в-полосе поглощения связанного с белкой 1ШО.

Эта часть исследовании била выполнена совместно с доктором бнол.наук ЮЛ.1 Лорчинекии и аспирантов В.Я.П::;:ел- * госом в Институте поде :уляшой биологии АН СССР.

При нейтральной р I фоефорплиза nueот максимум поглощения при 333 им, «бус ювлешшй связанном с белком плри-док саль-Р; при иаиснеии i pH в клелуз (.нике 4,S) влн щелочную сторону (.шше 3.0,0;, а так:.(и иод деНствкеи детергентов наблюдаемся появление ; :елти[; окраски и timicnuji-iíi iíovлощения при 415 ни, характерного для ¡Ш^овмх основан:^ в водной среде I Kent, iir е <.□, i s с Но i-,195а ; - Hp e дет з в ля; ■ о ш гге -рес выяснить, о5ла;:айт ли указанные формы фосфорилазы индуцированной оптичоскоi активностью в полосах поглощения 1Ш. (.рис.3).

На рис.3 представлены результаты намерений £03 л циркулярного дихроизма фосфорилазы Б в области 400-300 ш при pH 7,0. Как видно ;;з рисунка (.нишшп часть), на вой дисперсии вращения в полиса поглощения cü:iaa¡i;ic¡re с фермент: пиридоксиль-!' (, ií0;Cq. = 323 нм) четки jase иного эффекта КоVтон:i не обнарухйтзастся. Ощноко сильное увеличение крутизнп кривой ДОЗ в о той облости спектра позволило предполагать наличие невольного аффекта Коттолл.зз-цаекнровашюго оптпчсс.:им вращением а по фар пен та. íive :>ред-полояенпо-было'Т10дг_'зер;:депэ путем измерения циркульного дихроизма раствора фо со pi: лаз и Б при рИ ?,0. Как в:; ли и из верхней части рисунка Ii, в полосе поглощения связанного с белком пнридоксаль-Р наблюдается положительный циркулярный дихроизм. У аподоegoрилази циркулярный дихроизм в aïoli области спектра отсутствует.

згр 3S0 нм

-wo-

-2Q0

Рис.3. Кривые циркулярного дахроизка .-и аномальной дисперсии оптического вращения в полосе поглощения связанного с фосфорилазой Б пиридоксоягР (.рН 7,0).

1 - дисперсия вращеимя,из-керенная экспериментально;

2 - циркулярный дихроизи;

3 - аномальная дисперсия вращения, рассчитанная из значений циркулярного дихроизма. По оси ординат слева - удельное вращение I еО ).

-300

По данный Даонсона и Грейвса (. Johnson,Gravas, 1966) фосфор:лаза А дает такие se кривые циркулярного дихроизма, как фосфорнлаза Б*

Рассчитанный наш фактор анизотропии полосу поглощения, т.е. отношзиие û£/£ i. ût -разность молярных коэффициентов экстннкции левого и правого циркулнрао-поляризованного света, £ -молярцыЗ коэффициент экстннкции) равен 0,088; эта величина близка к величине полученной позае " ДЯОНСОНОМ и Грэйвсои ; JOBH8üH,Grave3,1966> для фосфорила-I зы Б и А.

На рис.3 '.верхняя часть) приведена такие теоретическая кривая аномальной дисперсии вращения, рассчитанная из значений циркулярного дахроизиа t '¿orciiinsjo1 ,Livanova,

picbeigas,19°5•Торчинекий, Ливанова, Пйхелгос, I2S7).

При подкисленни раствора фосфорилззы Б до рН 4,4 ш наблюд«ли появление полосы поглощений прп 415 нм и одновременное резкое снижение высоты ыаксииуиа поглощении и циркулярного дихроизма при 833 ни* В полосе поглощения 415 ня циркулярный дихроизм не обнаруживается, что свидетельствует об иэиенении непосредственного окружения пири-доксаль-Р в фосфорилазе при подкиолешш раствора фермента.

1.

fi/m/'/f^У км к \íí

-Nif г. Ч. s.

Н А>/////////Л

ззз«* мн «а

N X

СН CH¿ СИ

н*

290«*« 333 ни

333 лм

Рис.4. Возыотыо структурные переходы пиридоксэль-Рт связанного с фосфорилазой 1 Joànson et al., 19?0).

До 1970 г. большинство исследователей принимало гипотезу Фшира и др. (.КеаЪ.йгаьз, î?ischi>r, 195S) , ласно которой максимум поглощения фосфорилезы при 333 ни ípH 7,0) обусловлен пиридоксаль-Р» присоединенный к фер- .

иенту в виде замещенного альдамина (.форма I иа рие.4);при подия еле кии раствора фосфорилази шгее 4,4, при подцелачи-вании выше рН 10,0 или под действием детергентов связь мееду углеродным атомом карбонильной группы пиридоксаль-Р, и неизвестной Х-грунной белка рвется, и альдамин переходит в форму ШиЗфоза основания (внутримолекулярного альдимина), поглощающего при 415 ни (.форма 2 на рмс.4).

В связи с этии ранее ш связывали исчезновение дихроизма в полосе поглощения пмридоксаль-Р прп пидкислешш до рН 4,4 с переходом замещенного альдамина шридоксаль-Р в ольдамин VíorctilnskyjLivaiiova, PiklaelgaJ, 1965; Торчин-ckhií, Ливанова, Пихелгзс, 1967; Торчиискиü и др., 1957). В настоящее время есть серьезные основания считать, что максимум поглощения при 333 ни растиора фосфор;: л азы при нейтральном рН обусловлен не занесенным альдоиином, а Ииф-фовыи основанием. пиридоксаль-Р, погруженного в гидрофобный карман (.нейтрального таутомерного ольдишно - форма 3 на рпс.4) (Jotmson ut al., i9;o;yiiiil1;iel,cortijo, 1970). Сдвиг максимума поглощения от 333 нм к 415 нм при подкислен»« и исчезновение оптической активности связаны, по-видимому, с перемещением пиридоксэль-Р на поверхность молекулы фермента и с изменением состояния ионизации отдельных групп в а льдинке пира док саль -Р (.переход из форш 3 в форму 2 иа рис.45, а не с переходом альдамина пиридок-сель-Р в альдинин.

Поскольку почти ничего не было известно относительно взаимодействия центра присоединения пиридоксаль-Р в фосфо-рилазе с центрами связывания субстратов и активатора АШ*, нзки были предприняты опыты по изучению влияния этих ли-гандов на циркулярный дихроизм фосфорилазы Б. Однако при ' добавлении к фосфорилазе Б при рН 7,0 AMO (.0,2 ufj) или АУФ (.0,2 иМ), глюкозо-1-фосфата (.25 мМ) и гликогена (.0,1%) не наблюдалось никаких изменений на кривой циркулярного дихроизма. Таким образом, иоифориациошше изменения, индуцируемые активатором и субстратами фосфорилазы, не затрагивают непосредственного асимметрического окружения

пиридоксаль-Р, ответственного за появление' оптической активности.

Исследованиями Торчинского и Кореневой, Фозелло и Хзммеса и др. было показано, что индуцированные аномалии дисперсии вращения и циркулярный дихроизм асиартат-змшю-трансферазы очень чувствительны к разрыву или модификации отдельных свпзеЦ шшду плридокеаль-Р и белкой. Исходя из этого, иозно было полагать, что если ¡придоксаль-Р каким-то образом участвует в соединении субьедаииц фосфорнлазы или хотя бы расположен в зоне их контакта,: то диссоциация фосфорнлазы ца мономеры в мягких,условиях (.при сохранения связи пиридоксаль-Р с белком) долапа сказаться из. величине или знаке индуцированной оптической активности в области 333 ни.

Удобным для этой цели способом диссоциации фосфорнлазы Б но мономеры было обнаруженная нами диссоциация при изменении рН среды до 10,0 (.Ливанова, Пихолгас, Шпикнтер, 1955). Как показала результаты седимонтациоиного анализа, при подщелачпванни раствора фермента 0,2 И гкщшювшх'бу-фзрои до рН 9,8-10,0 от 50 до 90/» фосфорилази Б диссоцииро вало на иономерц, При этих значениях рН снектрйлыше свойства фосфорилази Б не меняются, максимум поглощения находится при 333 им, ппридэксаль-Р остается прочно связанный с ферментом, С'-Сабл.!).

Цы паили, что диссоциация фосфорилази Б на мономеры но сопровождается заметным изменением величины циркулярного дихроизма и силы врацеция полосы пиридоксаль-Р; Фактор анизотропии это££ полосы такие оставался практически без изиенсни'.! ^см.табл.1). Этот факт указывает на то, что диссоциация фосфорилази Б на но нон ер и при р1! 10,0 но со-провоадаотся изменением характера связи пиридоксаль-Р с белком или непосредственного асимметрического окруаения пиридоксаль-Р. По-видимому, тако;! результат шиот быть, получен только в том случае, если кирпдоксоль-Р но участвует в связывании мономеров фосфорилазы и расположен в пределах каждого мономера, а не в зоне их контакта..

Таблица X

Влияние рН, цистейна и н-^З на четвертичную структуру фосфорялазы Б и индуцированную оптическую активность в полосе поглодают связанного с фосфори-лазо2 шрпдоксаль-Р Л ца[гс>ВЗЗ ни)

Условия.онытол

РН

Реагент

¡инк... ¡часы '

л е.

¿6/е.

%

N

-4-

¡Дпсоо-

гЦИОЦИЛ

¡на ыа-I ной* еры

Р т_

7,0 - 8,6 10050 0,085 27 0

9,8-101,0 1,5-2 8,3 ■9050 0,092 27 50-90

10,0 цистеин.З^Д 1,5 7,4 - 24 100

10,0 цистеин,30(лУ I 4,0 9000 0,044 10 100

7,0 П-ХНБ, 0,2м.1,1 2 6,7 3900 0,03В 22 83

7,0 о,зма 3 5,6 9800 0,057 17 -

7,0 0,4111! 3,5 5,4 9800 0,055 17

7,0 * 0,8иМ 3 5,У 9300 0,054 1С 100

Л £ -рааность «олярних коэффициентов экстйнкции левого и правого цнркулярно-полпризоватшого света, £ - молярный коэффициент экстинкцпи, лс/& - фактор анизотропии полосы поглощения, /н _7 - приведенная сила вращения соответствующего электронного перехода.

й Преинкубацию фермента при рН 10,0 проводили при 0°; преинкубаций с гс-ЙДЗ - при 22°.

Степень диссоциация фермента на ыоноыеры рассчитывали по площади пиков на седииентационних диаграы-- ыах.

Добавление цистеина (.30 облегчает диссоциацию ■фосфорилазы на нонойери при р!4 9,8-10,0, но одновременно заметно скитается сила вращения и фактор анизотропия полосы поглоазния пирндокеаль-Р (,табл.1). Это монет объясняться специфический влиянием цистеина на структуру фериента.

■ Например, по дашша Грейвса и сотр. цистеин ускоряет инактивацию фосфорилазы на холоду, г по в спиц дашши, он ускоряет тепловуо ее денатурации. Кроме того» возможно, что при рН 10 цистеин частично вытесняет пиридоксаль-Р из связи с белком.

Как известно, диссоциация фосфоридазц Б на ноноиери ыозно вызвать добавлением п-Ж5 в нейтральной среде (.^ай-зеп.Сог!, 1956). После 3-3,5 часов преиякубзции фосфоридазц Б с различными концентрациями п-ХМБ картина седшен-тации выявила 80-100^ диссоциации'фосфорилазы Б на мономеры; одновременное измерение циркулярного дихроизма показало уменьиение силы вращения _7 и фактора апизотрошш д£/б полосы поглощения гш ридоксаль-Р (.табл.!). По-види иону, блокирование при помощи п-ИБ ¡¿и -групп фосфорилазы вызывает изменение характера асимметрического окружения пиридоксаль-Р. Этог-вивод представляется вполне вероятным, особенно с учетом данных Ыавтиела и сотр., согласно которым две" йН- —группы в мономере фосфорилазы находятся в непосредственной близости к цеитру присоединении пиридоксаль-Р,

Полученные наии дащще о тон» что диссоциация фосфорилазы Б на цонамеры при рН 10 не влияет на циркулярной дихроизм фермента в полосе поглощения пирндоксаль-Р (.показатель, весьма чувствительный к изменению блиаайаего окру-веииа хромофора в белке), одиозначно свидетельствуй! как против непосредственного участия пиридоксаль-Р в соединении мономеров, так и против располоаения гшридоксаль-Р в зоне контакта мономеров ^последней предположение было высказано в 1971 г. Д^онсоа ц Коуглллом)».Результаты других авторов тате у казн в тот на то, что пиридоксаль-Р погружен в гидрофобный карийн в' каадоц мономере, а не располагается в области мезду мономерами.

Исследование ЛОВ в далеком ультрафиолете, в полосах поглощении пептидных групп позволило нам получить некоторые сведения о вторичной структуре фосфорилазы. На рис.5 представлена кривая дисперсии вращения фосфорилазы Б в области спектра мезду 220 а 270 ни. На этой кривой имеется

перегиб при 230 им, соответствующий впадине отрицательного эффекта Коттона.

Рис.5. Диспзрсия оптического вращения фосфорилазы Б при рН 7,0

По данным Изука и Янга Игила.гопе^ЭБб ), впадина при этой длине волны обусловлена наличием в белке -спиралей. Приблизительный расчет содернаиня ©С-спиралей в фосфорилззе В дал величину Ща (.ТорчинскиИ,Ливанова, Пихел-гас, 1967). Удельное враусике онофосфорнлазы Б при 230 им разно 3700°, холофосфорклази - 3950°. Таили образоа, по-видаиому, ало- я холофериент мало отличаются по вторичной структуре и содержат приблизительно одинаковое количество Л -спиралей, т.е. конфориациошше изменения в молекуле фосфорнлози Б при отцепленил кофактора ограничиваются не-большо;4 область» молекулы. Этот результат вполне согласуется с полученными независимо и одновременно данными Джонсона и Грейвса (..хоппзоп, С-г^ез, 196&

исследование чшардгасй структуры фосоориллз Б и д с пшшвд метода электролной микроскопии

Нотодой электронной кикроскотглу Сила исследована четвертичная структура рада белков, имсащих молекулярный вес выше 200 ООО,

В большинство случаев для злектропио-гашроскопическо-го исследовании структуры белков нрпиешзат метид "негативного" контрастирования урацилацетатом, уранилфоРинатом или фосфорнопольфрамовой кислотой. При током способе контрастировании белковые чсстицы хорошо видны па темнаи фоне бесструктурного контрастеро, сильно рассеивающего элекгроцц. Негативное контрастирование применяют как для анализа частиц из раствора, так и кристаллических белковых образований. При благоприятных условиях контрастирования на микрофотографиях гияалякшги детали структуры с разрешениеи 10-20 Я.

Кроце подбора условий фиксации, другой сложностью электропцо-иикроскэпического анализа структуры белков является интерпретация изображений. Только визуальна» оцешча микрофотографий оказывается недостаточно объективной. В настоящее сресн дли изучения изображений но ипкрофотографиях разработан ряд Этически:: и математических методов, среди которых наиболее широко применяется методы оптической дифракции и фильтрования изображения. Метод фильтрования позволяет получить изобранение, очищенное от фона, о при анализе изобрамешШ някладивавЕИхся друг на друга слоев моле- ■ кул выделить изображение одного слоя.

Надо отметить, что физические и математические истоды обработки применяются» в основном, для анализа объектов с периодической структурой (слоев, труб, кристаллов), в связи с этик возио;шоет;г мотода электронной микроскопии при исследовании белковых Частиц из раствора несколько иеньпе. Нам удалось подобрать такие условии кристаллизации мышечных фосфорплэз Ь' и A U присутствии иизкоыолекулярн ого'основного белка иротамина), при которых образовывались кристаллы в форме труб, очень удобные для анализа ыетодзми оптической дифракции и фильтровании.

Элеитронно-иикроскопичесвое исследование препаратов фосфора л аз и анализ изображен;!!! методом оптической дифракции и фильтрования проводились з Лаборатории структуры бол-? ka Института кристаллографии АН СССР под руководством доктора биол.наук Н.А.Киселева.

С поиоцьв метода электронной микроскопии мы рассчитывали получить сведения о фор?ле и взаиморасположении с у бъ единиц фосфорилазы как в тетрамерной, так и в дкмеркой форме, выяснить вопрос^ одинаковы ли субьединицы, формирующие оли-гоиер каздой из форм фосфорилази, о такие выявить возможные различия в структуре фосфорилаэ Б и А.

Препараты трехмерных кристаллов, труб и слоев ы;доечных фосфорнлзз Б и A, a такие раствори фермента в дни ер и olí и тетраиерной форме готовили, как описано в иьших статьях ^Киселев, Лернер, Ливанова, 1971; Kxaelev .J^rnor^ivunova, 1974). Фосфорилазу Б из печени кролика выделяли по методу Апплеыана и др., фосфорилазу А печени получали но методу Вольфа и др. Полученные"препараты фосфорнлзз были гомогенными при анализе в ульграцентрнфуге и давали одну полосу при электрофорезе на полиакрилашдном геле.

Образцы для электронной микроскопии готовили методой негативного контрастирования, как описано в статье ^Киселев Лернер, Ливанова, 19?I). Уикрофотографии получали на электронном микроскопе и jüü-iooü (.увеличение 50 ООО, ускоряющее напряжение 80 ко). Был использован горизонтальный оптический дифроктоиетр, с к он с труи ров а н ньШ и изготовленный в Институте кристаллографии АН СССР, с гелий-неоновым лазером в качестве источника света.

■ , Электронная микроскопия тетпаморов мышечной фосфорилази Б из раствора

При исследовании негативно контрастировании* препаратов фосфорилази Б из раствора с добавлением проташно и -АМФ, т.е. в условиях максимального образования тзтраиеров, било выявлено, в основном, два различных типо частиц: частицы, ииекщае полукольцо с одной стороны и перекрестие, или букву " v " с другой (.cu.рис.8, теневые картины от

ыодели прз повороте от 20° до 60° или от 12СР до IG0°); частицы второго тина напоминают деформированную цифру "8" leu.рис.8, теневые кортшш при повороте от 5 до 10° или от 170 до 175°). Кроыо того, изредка встречаются частицы в виде "триплетов" tpiic.7, угол поворота CP или 180°).

Частицы с полукольцом и перекрестна! кйеют размеры I15-12О Й к 90-120 Я, частицы ей, похожие аа цифру "6",uue-ит длину XI5-I20 S, о ширину 70-80 8. На электронных микрофотографиях при концентрации белка в растворо 0,4 иг/ил,наряду с основной uoccoit незакристаллнзовавлихся молекул,при-сутстадюг небольшие участии кристаллических образовании. В тех случаях, когда концентрацию белка сникали до 0,1 úr/ил, кристалшчесша оо'раоовагшй вообще не наблюдалось.

Седимеитациоиний и но виз препаратов фосфорилпзи Б (.при концентрации белка 1-3 иг/мл) с нроташшои и AMO показал,что приблизительно 7ОД белка находится в форие тетраиера и 30¿ в форме дямера, более высокомолекулярных агрегатои выявлено не-било. По-вндишшу, описанные частицы фосфорилазы б представляют собой молекулы в тетрамерной форме.

Электронной кикроокопчя кристалгпчоскпх обпазо-вап;Ш мшечной йооТдрллази Б

При электраинй-цикроокогшческои исследовекни негативно -контрастировашшх препаратов фосфорилазы Б с протаиинои, а такие с протэшиои <.0,1 иШ и KIä U и\1) или /J¿5 Ц кУ) било обнаружено 3 тина кристаллических образование!: плоские слои частиц, длинные трубы ц трехиерше кристаллы. Трехмерные кристаллы выявляются такзо в препаратах с добавлением 30 uU цистешш, I мМ ШФ и 10 uU tCHgCQOJgHg без проточина; трубчатые кристаллы образуется только в присутствии про-хшиии. Последний, по-видимоиу, играот здось роль "морфопоз-тического" фактора, инициирующего образованно кристаллов с_ определенной упаковкой молекул.

Плоскиеислои. Плоские слои молекул фосфорилазы Б часто наблюдаются в разбавленных препаратах ферцонго СО,1-0,3 иг в ил) с протамаком (.0,1 мШ. Обычно эти слом состоят из 2-4 рядов, катали из которых содержит 12-20 частиц*

рис.6. Участок плоского слоя Ю) фБ, картина оптической дифракции с зтс го у часта а и изсйракепие того ь;а участка после филь^роваиинОз). Но картину оптической дифракции с правой итороки нанесена обратная решетка. На изображениях елок белок черный, х 460 ООО.

Ряды смещены друг,относительно друга по длине слоя. Структура частиц, формирующих слои, не всегда отчетливо видка, но в составе сдоя ионио найти частицы с полукольцом с одной стороны и перекрестной, или буквой " V и с другой, похожие но то, которые встречаются среда иезакристаллизовакаихся . частиц.

Слои несколько иного типа встречазтеп в препаратах с протЕШНои, приготовленных в условиях, благо прият ствуосих кристаллизации, т.о. при более высокой концентрации беша. Микрофотография участки такого слоя приведена но рис.С. В верхцой частл фотографии дана картина оптической дифракции этого участка. С правой стороны иа нее нанесена обратная решетка, в узлах которой находятся рефлексы, свизашше с периодачоской структурой слоя. "

Чтобы устранить фои ц сделать составляйте слой частицы болео отчетливо ьидншии, бил приисаен иетод филирования. Дли этого в плоскости дифракции оптическою дифра'кто-^ метра помещали маску с прореэяш в местах рефлексов. При , этом в дифрсктомотро формировалось пзебрзеение, очщеииое от фона. Результаты фильтрования .представлеиы на рие.6 (.справа внизу). После фильтровании структура часищ выявляется более отчетливо, чем на первоначальном.изобранетш. Видно, что частицы имеют полукольцо с одной стороны 1: перекрестие с другой. По-видаиоцу, частица в целом представляет собой тетрамер фосфорилазы Б, а полукольцо и перекрестие -димери, составленше какдый из двух одинаковых субъеди&щ бананообразноИ форщ. ,

Труби. Основная часть белка фосфорилазы Б в присутст-111И протампна кристаллизуется в труба двух типов: труби, с одно ело Шшил стенкош ц труби с двойными стешссил. Диаметр труб с одиночный» стенками 320 З.тол^шо стенок 60 Й.

Изобретение труб с однослойными стенками на кпкрофото-графии является двусторонним, в результате.налокенин друг на друга изображений верхней и ншшей стешш. .Для того,чтобы получить раздельное изобращение каядой стенки, бил использован метод фильтровании, причем в плоскоста дифракции

помещали пески, пропускайте рефлексы только oi одного слоя .трубы. Результаты фильтрования труб представлены на рис. 7.

1 г ; С г

щ i

■■■л

Л-Г:

■Ч

' --¿'г Л • М: : •

Рис.7. Электронная микрофотография и профильтрованные-изображения труб фосфорилэзы Б t х 300 ООО), белок темный.

Отчетливо видны частицы, формирующие стенку трубы. Сред« этих частиц легко найти такие, которые очень похожи на частицы из раствора и в слоях, а именно,на имевшие полукольцо с одной стороны и перекрестие с другой. В основной, частицы такого типо располагаются-блике к латеральной части трубы, причем на противоположных концах трубы частицы повернуты друг относительно друга на 180°, так что "перекрестия" и "полукольца" ориентированы в противоположных направлениях. Это обусловлено поворотом частиц по отношению к наблюдателю, что связано с кривизной трубы.

Микрофотографии труб с двойными стенками представляют собоИ результат наложения изображений четырех стенок. Для таких труб дифракционные картины очень слоты и получить ^раздельное изображение стенок не удается. Внешняя труба, ;по-видимому, формируется па поверхности внутренней, поскольку трубы с однослойными стенками всегда равны по диаметру внутренним трубам. Иногда формируются труби, стенки которых состоят из большего количества слоев, чем двз.

Трехмерные кристаллы. Трехмерные кристаллы наблюдаются в препаратах фосфорилазы Б, полученных как присутствии

Д}.5Ф* Не2*» и цистеина» ток и протопи на. Ношю выделить два тина изобраяений кристаллов: кристаллы первого типа построены из гексагонально уложенных частиц, имеющих форму вытянутых шестигранников;- кристаллы второго типа, возиокко, представляют собoil другу» проекцию кристаллов первого тина.Упаковка частиц и размеры решетки в кристаллах обоих типов близки к таковым в плоских слоях.

Электронная микроскопии тетпемепов мышечной фосв.0рилазы А из раствора

Известно, что введение-фосфатного радакола и молекулу фосфорилазы существенно влияет на физико-химические свойство фермента, в частности, на способность к ассоциации в тетрамор и к кристаллизации. В отличие от фосфорилази Б, фосфорплаза А существует в растворе без всяких добавок при концентрации белка выые.0,01 мг в ид в виде тетрзмера, □ при понижении температуры и увеличении концентрации белка легко кристаллизуется. Представляло интерес выяснить, существуют ли какие-нибудь видимые различии в структуре тетраме-ров фосфэрилаэ Б и А, а таксе а характере кристаллических образовании двух форм фермента.

В препаратах фосфоршшзы А как с добавлением нротамина, так и без него, при концентрации белка пике I иг в ил ш на--блюдали наряду с некоторым количеством кристаллического материала и незокри стаяли зов ашиесн частицы. Среди них мокло выделить несколько характерных типов изображений.

1. Частицы, иыеащио полукольцо о одной стороны и букву

" V " или порскрестио с другой (.соответствуйте теневым картинам от модели тетрауера при повороте на угол от 20° до 60° и оз 120° до IGO° на р;к;.8). Длина частиц II0-II5 Я, ширина 70-100 Й. На концах субъедишщ, формирующих букву "V " иногда ыокио видеть расширения 25-30 Й.

2. Частицы, иапоминсюцис деформированную цифру,"8" (.соответствующие тенсвыы картинам от модели при повороте от 5° до 10° и от 170° до 175° ва рис.8). Их дайна IIO-XI5 8, аирина 50-70 ä.-На одном конце цифры "3" иногда и сан о bu-, деть два темных пятнышка с маленькой цельо иеаду кипи.

.3» Частицы., похожие ко короткие палочки, сформированные из трех колец (,сц.теневые картины от модели в положении 0° и 180° на рис.8). Длина таких "триалетов" ii0-i20 Я, ширина 50 2. '.

Таким образом, длина частиц всех наблюдаемых типов практически одинакова. Чаще всего встречаются частицы первого типа. Одни а те г.в типы частиц встречаются в препаратах без протамйна и о протгэмяшж.

Электронная микроскопия кристаллических образований 1,:ыяечиой йосфорилазы Л

Среди кристаллических образований фосфорилазы Л с про-тданном, ток ее, как и в случае фосфорилазы Б, поено выделить 3 вида образований: плоские слои, трубы и трехмерные ■ кристаллы. Так аз» как и в случае фосфорилазы Б, трубы фосфорилазы Л формируются только в присутствии иротамина; трехмерные кристаллы мояно видеть как в препаратах с про-тамшзои, так и без него. Кристаллизация фосфорилазы А производилась при концентрации протаммна на порядок меньшей, чей фосфорилазы Б tO,OI "ufi) •

Плоские слол. В препаратах фосфорилазы А с протаминок выявляется 3 типа слоев.

■ I. При концентрации белка менее I мг в мл наблюдаются небольшие островки плоских слоев. Частицы, фориирукнцие эти слои, похош на частицы первого типа из растлора - с полукольцом с одной стороны и буквой " v 11 с другой. Частицы в соседних рядах ориентированы в противоноложных направлениях и сдвинуты приблизительно на половину длины одной частицы. Этот тип слоев очень похок на слои фосфорилазы Б-

S-. Во многих препаратах фосфорилазы А с протаминои на-1 блэдзщтон слои другого типа. В них упаковка частиц близка , 1 к ортогональной. Такие слои состоят, в основном, из частиц \типа "триплетов", иногда встречаются участки частиц, похожих на цифру "3". Изображения слоев как первого, так и второго типов никогда не накладываются друг на друга, отдельные участки слоев очень близко иршшкают друг к другу* Мов-. но думать, что эти слои формируется непосредственно на поддонке.

3. Третий тип слоев наблюдается в основном на свонеприготовленных препаратах фермента. Слои такого типа имеит ступенчатую структуру, состоят из рядов по 19-25 частиц, сдвинутых друг относительно друга приблизительно во 1000 Я. Интересно, что по ходу одного ряда частицы меняют свою конфигураций.. Просматривая эти слои, мм шяем видеть все три типа изображений частиц tчастицы с полукольцом и перекрестием, . цифру "8м и "триплеты").

Трубы. В препаратах фосфорилазы Л с протамином обнаруживаются трубы только двух типов - с однослойными и с. двойными стенками. Нередко в- поле зрения ионшо наблюдать пачки труб, в которых однослойные и двуслойные трубы улоне-ни вплотную друг к другу. Вероятно, в форме таких "па^акрис-таллов" белок находится во взвеси в буфере. Ширина труб 325-400 Й, толщина стенок 50-S5 й.

Так ае, как и в случае фосфорилази Б, изображение .труб является двусторонним, т.е. представляет собой результат наклонения изобрапениУ двух стенок. Для того, чтобы получить изобракение каздой стенки в отдельности, был применен метод фильтрования, tía профильтрованных. изображениях отчетливо видны частицы, формирующие стенку труби. Как и в случзе фосфорилазы Б, частицы до кроям труб характеризуются полукольцом с одной стороны и перекрестием с другой, т.е. напоминают частицы первого типа из раствора.

Частицы у противоположных краев труби, так ке, как и в трубах фосфорилази Б, ориентированы в противоположных направлениях, что связано с поворотом частиц по отношению к наблюдателю из-за кривизны стенок трубы.

Модель коле нули фос^орилаз Б я А в тетра-меоной тор»о

На основании электронно-микроскопического исследования изобрааений труб, плоских слоев и трехмерных кристаллов'фос-форилаа Б и Л, а такие молекул фермента из раствора в условиях образования тетрамеров, и сопоставление результатов • анализа с данными, полученными другими методами, в частности, методом седиментационного анализа, нами была предлоне-

на модель молекулы фосфорылазы в тетрамерной форме. Оказалось, что на данном уровне разрешения структура тетрамероз и фосфорилазы В и фосфорилазы Л модет"успешно трактоваться с помощью одной и той не модели, состоящей из,четырех вытя-нуты.'С изогнутых субьединиц с расширениями на концах, расположенных с симметрией 222 в вершинах удлиненного тетраэдра (рис.8) (, Kisoluv, Ijornor, Livanova, 1974 ).

Для того, чтобы лучые оценить правильность предлоцен-ной модели, изображения частиц в плоских слоях, трубах, трехмерных кристаллах, а так;ке частиц нз раствора сровниза-ли с теневыми картинами от модели-в различных поворотах. Мы исходили из того, что вариабельность формы частиц зависит от угла поворота их но отцоаенна к наблюдателю. Б этом случае, если модель выбрана правильно, то теневые картины от нее при различных углах поворота додшш соответствовать форме частиц, наблюдаемых в различных кристаллических образованиях фосфорилаз Б и Л и в препаратах из раствора.

Модель вращали вокруг оси второго порядка, освещай пучком параллельных световых луче!! перпзнлшулнрно оси. Могло думать, что эта ось ориентирована вдоль трубы, тогда перпендикулярный ой пучок, света имитирует пучок электронов в микроскопе. Теневые картины от модели, появляющиеся при разных углах поворота, фотографировали (.рис.8), Видно, что при повороте на равные углы в сторону от позиции 0° или 90°, те-незые изображения зеркально повторяются. Частицы в слоях фос-форилазы Бив слоях первого и третьего типа фосфорилозы А пэхоан на теневые картины от модели, повернутой на 40-60°. Среди изображений частиц из раствора таете встречаются сходнее с теневыми кзртинаип от модели в этом ракурсе.

При переходе от одного края трубы к другому изображение частиц меняется зеркально, исследование изображений в "средней часта трубы показывает, что этот переход осуществляется через положение 90°. Частицы в средней части трубы, в основном, соответствуют теням от модели при повороте на 70-90°; толщина стенок трубы - 70 хорошо согласуется с размерами частиц в этом положении.

Рис.8. Модель молекулы фоефорилазы Б и А в тетраиерной форме 1а), теневые картины от модели при повороте вокруг одной из осей.второго порядка (.6), и вдоль этой оси (.с).

Îshcbsh картина о? модели в полоае:п1И 0° .очень похода на частица фосфорплаз Б u А третьего типа из раствора и в слоях фосфорплази Л второго типа - "триплеты"»1 Частицы в виде деформированной цифры "8" соответствуй! теневш кар-тшам при повороте шмели на 3-10°. Частицы первого тына, ииеыцие полукольцо с оц;:ой стороны и перекрестно или букву "V "с другой, соответствую? теневым картиной от модели в большом диапазоне углов поворота - от 20° до 60°. Эти можно объяснит^ тот фант, что такого рода частица чаще всего встречается на микрофотографиях как различных.кристаллических образований фосфорилаз, так и препаратов тетраыеров из ■ раствора.

Анализ изображений кристаллов методами оптической дифракции « фильтрования'позволяет предполагать, что частицы-единицы укладки в них такие se, как в слоях и трубах. Например, в кристаллах фосфэрилези Б первого типа эти частицы более всего соответствуют теновнм картинам от модели при повороте на 70° или ÏIсР.

Согласно предложенной нами чодоли, тетрамери фосфора-лазы киеют размера <50-55 §) ^ <93-100 Îîi x(IIQ-I20 Й), т.е. 41:2:2,2). Эти данные хорошо согласуются с размере«« тетро-мероз фосфорилазы Б, вычисленными на основании исследования методом рассеяния рентгеновских лучей под малыыи углеш -55 Я х 110 Й х 123 Й <1:2:2,24) (pucJiwoin ot al-, 1970).

Наличие симметрии 222 предусматривает возможность наличия в тетри.*еро двух типов связей - более прочных иекду цономерами в дилере и некое прочных меаду дайергаи в тетра-мере, что согласуется с предложенной нами схемой диссоциации фосфорнлаз на да мери и иокоцеры (.Дгзансша, Шхелгас, Шпикптер, XSS5; Ливанова и др., 1836).

На данной уровне разрешения не обнару икается различий мевду мономерами в составе олигоиера каждой из форм фосфорилазы, нот видныих различии такке в структуре фосфо-рилаз Б и А. Несомненно однако, что введение фосфатных радикалов в молекулу фосфюрилоои Б существенно меняет свойства фермента. Эта различия мезду двумя формами фосфорилазы проявляется в характере взаимной агрегации частиц в плоских сдоях и в параметрах сдаральной укладки молекул в трубах .

Кристаллизация в форме груб не является уникальным свойством фосфорилазы. Образование трубчатых нристаллон било показано для катанэзи и глюкоэооксидази. Катализа образует труби в присутствии сернокислого аммония; молекулы кс фосфорилазы приобретают способность кристаллизоваться в трубы только в присутствии притаилиа, который, ■ слязызоясь с белкой, по-видмиоиу, определенный образом иен нет его кои-формацию, создавая предпосылки для специфической агрегации тетрамеров ферменту в труби.

Ранее било известно, что протамин совместно с инозин-5-монофоефатсм индуцирует переход неактивных дниеров фосфорилазы Б в акшвнуэ к он формацию (. ¿гоЬа, 195^ ), которая при температуре 0-20° и повшешш концентрации белка ассоциирует в .тетромеры, способные агрегировать в трубы {.Киселев, .Лефнер, ЛизониваДЭ'?!).

Молярное соотношение фосфорилаза:протзмин при использованных нами концентрациях гсротамегпа, по-видимому, состав^ ляет Х:1 кгеов,1950, таким образом, хотя в трубах мы им®-еи комплекс фосфорилазы с протаиином, молекулярный вес и, следовательно, разиери молекул фосфор*.! л ази в этой комплексе практически не отличаются от такоетх без протаиииа. Об зтЛл свидетельствует и наши данные, что тетрамерц фосфорилаз Б и А в присутствии протэшна уорфологически не отличаитея от тетраыеров, полученных в других условиях.

Злект;>аш10-г.1'.П(роско1:ичес1;иИ анализ диковин* цопп ,

¿юсДррпяази ко раствора: ь'-ьгл очной поспорилаз» Б и а.о с? оои л аз & и Б из печени ксо.-.ика

Известно, что активной формой фосфорилазы является ди-церноя, поэтому Сило принципиально ваз'.]о ьуяснить, как рос-шлоиени ¡¡ки ера в иожекуае тетраиера и г.аглЦ вид уп.'.еют -индивидуальные шлеиулы дииерзв. Поскольку в состава кристаллических образований фосфорилаза всегда находится в тетра-мерной форме, получить димеры возможно только в растворе, что значительно услоЕНяет злектронно-цякроскопичоский анализ. Применить методы оптической дифракции и фильтрования при . элекгрокно-ыикроскопкчэском исследовании частиц из раствора

нельзя, поэтому трактовка результатов в данном случае менее объективна. ■ . » .

Мы лсслоговоли три типа длиеров фосфорилазы - днмеры шдечной фосфорилаэы Б и даыеры фосфоридаз Б и Á- из печени кролика. Фос^орнлаза печени, так гш, кзк и мышечная, существует в двух формах: неактивной дефосфорилироваиной форма фосфоридазы Б и активиой фосфорллировапной форме фосфорала-зи А. Однако, в отличие от ишечного фермента, фосфорилаза ■ А и фосфорилаэа Б печени являются димерами (.молекулярный вес 200 000J; в кристаллачаском виде ни фосфорилаэа Б, га фосфорилаза А печени не получены.

ftuicpii fio с<!юрилазн Б из мои кролика. В препарате да-меров фосфорилазы Б из ыицц (.при разбавлении фермента до концентрации белка 0,1 мг в мл 40 uU глицсрофосфатним буфером рН 7,0 с 40 иМ меркаптоэтанолои в растворе практически присутствуют только димерные фории фосфорилазы Б> наряду с другими можно видеть частицы из двух улозепных бок о бок "палочек", по-видимому, мономеров, сдвинуты:: друг относительно друга на 1/2-2/3 длины. Длина одной "палочки" 90110 й, длина всей частици 125-150 8, вирина частицы 50-60 Й. Сравнение электронно-микроскопических изобрзконпй димеров пышечной фосфорилазы Б с модель» фермента в тетрамерной форме поззолало идентифицировать расположение хуторов в модоли тетрамера С один димер состоит из двух верхних субъединиц тетрамера, другой - из двух'никних, рис.8). U.ioel@Y,Leraor,

bivonova, 197*0.

Лчмеоныо froimi фоейорклаз ид печени. Электронно-микроскопический анализ негативно контрастировать препаратов фосфорнлаз А и Б из печени кролика выявил довольно большое разнообразие частиц, в частности, иногда мопно было наблюдать образование неспецифических неупорядоченных агрегатов. По-видимому, образование таких агрегатов происходит при фиксации. Однако тцателышй анализ микрофотографий позволил выявить димори в различной ориентации и предлоаить предварительную модель иоиокулы фосфорилазы печени в димерной .форме. Видимых различий ыевду димерами фосфорилазы А и Фосйошлезц Е обнаотаихъ не удается.

Дниеры фосфоридазы Л и Б из печени кролика состоят из удлиненных субъодиниц, соединенных иеаду собой в средней части. Длинные осп этих субъедишщ образуют угол ~ С5°. Такое расположение субъедшшц характеризуется точечной группой симметрии й£2. Длина дниера 85 Й, ширина 50-50 Й.

Различные проекции этой кодели соответствуют главным типам частиц, различаемый на микрофотографиях: крестообразным частицам, частицам из двух палочек, уложенных бок о бок а т.д.

По донный электронно-шк ро с к о пиче с к о го исследования димеров фосфорилазы из раствора мокно полагать,, что дииерц фосфорилазы почени похош на дяиеры фосфорялазы мшц. Разумеется, о деталях структуры здесь говорить не приходится, вопрос этот требует дальнейшего исследования.

РЯГШЦИЯ АКТИВНОСТИ ГЛЩОГШЙОСФОРШ1АЗ

ринетическиtt анализ оллостешческого ицгибкпо-вапия активности фосфорилазы Б

Фант активации фосфорилазы АШ - эффектором, не имеющим структурного сходства с субстратом и, следовательно,при-соединнадимсн не к активному, а к другому центру, по более поздней терминологии "еллостерическоау", бил открыт Кори еще в 1938 г. Cori, Colonics, Cori, 1958

В ря7;е последующих работ был выявлена -образный характер кривих зависимости начальной скорости реакции, катализируемой фосфорилозой Б, от концентрации субстратов, активатора АКЗ и от концентрации ингибитора, АИ. Ешо также показано, что но только зависимость начальной скорости ферментативной реакции от концентрации ЛШ> и Рн, но и функция связывания этих лирандов имеет сигмоидный характера -образный характер функции связывания А!Й (к»н= ) однознач--но свидетельствовал в пользу наличия двух центров связывания АМФ на дшере фосфорилазы Б. Поскольку димер фосфорилазы Б состоит из двух идентичных субъединиц, у каждой из которых имеется по одному активному центру и по одному центру

связывания активатора, есть все основания полагать, что

а -образный характер зависимости скорости от концентрации субстратов и активатора обусловлен'кооперативный взаимодействием соответствующих центров.

Значительно менее била изучена кооперативная кинетика ингабпроваккн уосфорнлазы Б. Известно, что ингибиторами фосфоралазы Б является ряд нуклеотидов, например, ATi, АДФ, УМ, ПЙ, аденян и аденозии, а такие глюкоза и некоторые ее производные - глюкозо-5-фосфат, уридиндлфосфатглюказа и б-фосфоглюконат.

Ранее в работе Си л о повой и Ли сов ci:oil (.1967) было обнаружено, что ингибиторы ¡¿осфорилозы £ (сденин, аденозин,ЛТ$, глюкоза и глвкозо-6-фосфат) вызывают диссоциацию тетрацера фосфорилазы Б, образованного в присутствии ЛМФ, цистеина и на дниеры. По-в шиш ому, связывание этих ингибиторов

индуцирует в субъединицах определенные копформацпонные изменения, приводящие к диссоциации тетра^ерной формы на ди-, меры. Следует отметить, что нефизиологический ингибитор фосфорилазы, флоридзин не влияет на положение равновесия между диаером и тетраиером.

flpsдетавлидо интерес более детально изучить кинетику ингибирозанин фосфорилазы Б-перечкелонними ингибиторами. Кроме того, исследование совместного действия двух эффекторов на активность фермента открывало возможности длн выяснения вопроса о наличии гетеротропних взаимодействий мецду центрами связизания различных ингибиторов, а также вопроса о пространственной разделеиности центров связывания инга-батороз.

Работу ¡¡ро водили с 4-кратно нерекристаллизоваиными препаратами фосфорилазы Б, реакцию, катализируемую фосфори-лазол, прослеживали в направлении синтеза гликогена по методу Цлл'.шгворс и Кори, При оценке степени ы -образ[¡ости кривых зависимости скорости фосфорилазной реакции от концентрации субстрата Г-I-P мы использовали, народу с методом Хилла, разностный метод, предложенный Кургановым (.Силонова, Ливанова, Курганов, I9S9). Преимущество разностного метода Курганова по сравнению о методом Хилла сое-

тсит в той, что оц не требует знаки» величини V а это

вакно в тех случаях, коода ¥ ц0ИС не монет бить оценена иа-за отсутствия данных о величине скорости реакции при бользих концентрациях субстрата, а такзе в случае подавления активности ферыента высокими концентрациями субстрата. Дня количественной оценки взаимодействия мекду центрами связывания двух разных ингибиторов ыы применили предложенный Кургановым параметр 3 (.Силонова, Ливанова, Курганов, 1959).

Гоаотрзтше кооперативные взаимодействия центров связывания субстрата Г-Х-Р а присутствии ингибиторов. В отсутствие ингибиторов зависимость скорости ферментатибноЗ реакции о? концентрации субстрата Р-1-Р для фосфорилизы Б является гиперболической, экспериментальные данные спрямляются в координатах Лайнуивера-Берка. В присутствии ингибиторов (.глшозы, аденина и аденоэина) максимальная скорость ■ фосфорилазной реакции снимается, а гиперболические кривые зависимости V от ¿~Ь_7 превращаются в а -образные. Зто ■ свидетельствует о том, что перечисленные ингибиторы способствуют выявлены» гомотропннх кооперативных взаимодействий субстрат-связываших центров.

Расчет коэффициентов кооперативности с помоев разностного метода Курганова показал, что при концентрациях глюкозы, одонина и зденозина, равных 20 иМ, для Г-1-Р равен приблизительно 2 1табл.2). По-видимому, это максимально возможная величина коэффициента кооперативное™, поскольку димэр фосфорилазы Б содержит 2 центра связывания Г-1-Р. Флорлдэии, снявон величину V ма(;о дли фосфорилазы Б, но влияет на кооперативность по субстрату - коэффициент кооперативности для Г-1-Р в присутствии флоридзша равен I (табл.2).

Для нахо^ения V цокс и 5 экспериментальные

данные спрямляли в координатах I/* Ч I/ п. Рассчи-'

танные значения V ишм и приведены в таблице 2.

Из таблицы видно, что угнетение всеми исследованными ингибиторами связано как с уменьшением сродства фермента к субстрату, тэк и с уменьшением V иаке.

' . ,„ Таблице 2

Параметры кривых зависимости V от ¿~ а>7 в отсутствие ц в присутствии ингибиторов (.буфер 40 мМ глицерофосфат натрия рН 6,8, I мМ А1ЛФ, 0,255® гликоген, концентрация фоейорилазы Б 5-10 мкг в ил, температура 30°)

-!—

Ингибитор { и

н

* маке \г* ■ш-е/иш ¡<ила 10з

» ; при = I

— 1.0 0,53 С,0

Глюкоза, 20 мУ 2,2+ 0,2 0,38 ,11,0

1,0 0,38 4,7

Аденин, 20 иУ 1,9+ 0,2 0,22 15,3

- 1,0 0,43 5,0

Аденозин, 20 2,5+ 0,2 0,25 10,0

-, 1.0 0,51 ■6,6

Флоридзин, 2,5 мЫ 1,0+ 0,1 0,32 12,8

Гомотропшле кооперативные взаимодействия центров связывания ингибиторов. Исследование зависимости скорости ■фосфорилазной реакции от концентрации ингибиторов <глщ:о-зы, ЛТФ, сдеиина н аденозина) показало, что. эта зависимость , носит сигноидный характер. Значение пн и д(,/~1_7о 5

■у— концентрация ингибитора, при которой vi= <>д- уПр)/а) определяли спряклением в координатах 1с ¿~{ v0 - ^ ^

(.рис.9). В этих координатах наклон прямой равен величине , а концентрация ингибитора, при которой - VI)/- 0, - величине д.

Снизалось, что для глюкозы и АК> коэффициент коопера-тивноста зависит от концентрации субстрата Г-1-Р: с ростом концентрации субстрата пц , растет, приближаясь к 2 <рие.9К Дли аденииа и аденозина Ее коэффициент кооперативно ста оказывается независимым от концентрации Г-1-Р (. в изученных пределах его концентраций - от 2 до, 16-20 и.У). При всех испытанных концентрациях Г-1-Р значение для аденила равно 1,4, для аденозина - 1,5 (.рис.Э).

\

с

-3 -г ¿^[глюкоза] 3 -2 ЯДАТФ}

Рд {аденин] (д [аЭенозим]

Рис.9. Зависимость скорости фосфорилаэпой реакции от концентрации глюкози, АТЗ, адешша и адеиозина в координатах у0 - позволяющих рассчитать коэффициент коопераТкзности. Прямые получена при раз-* личных концентрациях субстрата. Концентрации ингибиторов выраиены в У.

Рете»отроп;шз взаимодействия центров связывания ннпг-битопьв. гиШонт синергизма в сзвгюотноц ^смстдии пар ииги-биаоооз. Сравнение индивидуального ¡шгкбирувщого действии адешша, аденозина и А НО с ингибнрушцпм эффектом этих соединений, добавленных 'попарно в разных сочетаниях (.адсиин +адспозин, адешш+ЛВ&,адеиозии+й1С>) показало, что эти ингибиторы действуют независимо (.параметр а » х ) (табл.3)-» Аналогичная картина наблюдается при совместной ингиОирова— нии аденином, адеиоаином или ЛТ5, с одной стороны, и фло-ридзином, с другой (.табл-ЗК.

В то не время при совместном ингабировании фосфорила-зы аденином,-аденозином или АТС>, с одной стороны, и глоко-

зоЙ или" глюнозо-6-фссфатом, с другой, ноблвдается,эффект синергизма, т.е. совместное действие этих нар больше рассчитанного, исходя из "независимого" вкладз'каждого ингибитора ( 3 = 1,3-1,5) (.табл.3). Более подробное изучение действия пора ингибиторов, глюкоза+адеиозин показало, что с увеличением концентрации глюкозы сродство фермента к аде-нозину растет. Таким образом, причиной синергизма является зззпмодействпе центров связывания двух различных ингибиторов - при связывании одною из ингибиторов на своем центре повышается сродство другого центра ко второму эффектору. Наличие синергизма а действии на фосфорилозу Б МО, адеиина и аденозкиз, с одной стороны, и глюкозы или глюкозо--5-фосфата, с другой, а такие наличие синергизма в совместном иигибировании фермента глюкозой и Г-С-Р (.табл.З) позволяет предполагать, что центр связывании АЮ, аденипа и аде-нозина, а такне центр связывания глюкозы не совпадают с центром связывания гл-жоэо-З-фосфата.

Надо отметить, что в присутствии мочевины чувствительность фермента к действию кендого из ингибиторов повидается, а синергнзи в действии двух ингибиторов практически исчезает, что говорит о снятии гстеротрошшх взаимодействий центров связывания ингибиторов (.табл.4). Снятие в присутствии мочевины гетеротропишевзаимодействии цеигрол связывания ингибиторов иокио рассматривать как разновидность десенсибилизации. Известно, например, что модификация фосфорилозы Б глутаровым альдегидом приводит к образованию формы фермента, лишенной гомотропиих взаимодействий, но сохранившей способность к гетеротропным. Описаны и другие способы частичной десенсибилизации фосфорилазы. В наших опыта:: обработка фосфорилазы Б 0,5 М раствором мочевины приводила к образованию формы фермента, у которой сняты гетеротропиые взаимодействия ысаду центрами связывания ингибиторов; эти взаимодействия проявляется у нативного фермента так^м образом, что совместное действие двух ингибиторов оказывается значительно более сильным, чем мояно было бы ожидать в той случае, если бы каждый ингибитор действовал независимо Эффект синергизма).

Таблица 3

Совместное действие двух ингибиторов на фоефорн.чаиу 13 . (.концентрация Г-1-Р - 1С иИ; АТ;> - 20 мМ; фшоридзипа -- 2,5 мМ; остальных ингибиторов - 10 ыМ)

Ингибитор (Д) + ми- ¡Степень торыо^е-г 1

гибитор М !-Щ2-,-; | ^

_I _

Аденин + аденозин 0,46 0,28 0,61 0,57

Аденин + АТС 0,47 0,32 0,СЗ 0,64 0,99

Аденозин + А1Ч> 0,31 0,34 0,52 0,54 0,96

Адепин + флоридзии 0,40 0,37 0,53 0,б2 ' 1,17

Аденозин г флоридзин 0,30 0,47 0,00 0,63 0,95

АТ& + флоридзин 0,31 0,43 0,03 , 0,61 1,03

Аденин + глюкоза 0,44 0,25 0,83 0,58 . 1,52

Аденозин + глюкоза 0,33 0,27 0,78 0,51 ' 1,53

АМ + глюкоза 0,30 0,23 о,сэ 0,48 '. 1,44

Аде аа и + Г-С-Р 0,44 0,25 0,83 0,59 1,41

Аденозин + Г-6-Р 0,37 0,25 0,73 0,53 1,33

АЮ + Г-6-Р 0,30 0,25 0,63 0,48 1,31

Глюкоза + Г-6-Р 0,24 0,26 0,72 0,44 Ц64

- индивидуальные стенони тормоксения (Д=1-^А0 ; и - скорости ферментативной реакции в отсутствие и в присутствии ингибитора, соответственно), , 11 2 - экспериментально наблюдаемая степень тормомения при совместном присутствии двух ингибиторов,

- степень торможения при совместном действии двух ингибиторов, рассчитанная, исходя из предположении, что ингибиторы действуют независимо.

Значение , представляют собой среднее

арифметическое величин, полученных в 4-6 опытах.

Те блице.4

Влияние 0,5 М мочевины на синергизм действия аденина и аденозика с одной стороны, и глюкозы; с другой (.концентрация Г-1-Р 16 иМ; аденика и аденозика 10 мУ).

¡Степень тормоает

Ингибитор (.1) + ингибитор 12)

! 1

ТчГ

Аденян + глюкоза

Аденин + глюкоза + мочевина

Аденозин + глюкоза

Аденозин + глюкоза + ночеыша

0,45 0,24 0,87 0,58 1,50

0,52 0,43 0,63 0,73 , 1,14

0,24 0,25 0,69 0,43 1,60

0,38 0,42 0,72 0,63 1,14

Обозначения те ке, что в таблице 3. Значения и

± 2 представляют собой среднее арифметическое величин,полученных в трех опытах.

КссдеЕовение пространственной разделенности центров, связь'згюэдих специфические лиганды, в йосйорилаэа В

Квиетический анализ совместного действия двух лигсПгдов на фертлевтативиув активность, описанный в предыдущем разделе, дает возможность установить пространотвеннуй разделен-ность центров связывания двух эффекторов, оказывающих однозначное действие на активность. Для анализа пространственной разделенноста из только центров связывания двух ингибиторов, но и активного и аллостеричсских центров, а такие аллостешческнх центров, связаваюиих полонительшй и отрицательный оффектср, нами был использован другой прием.

Ыузбек и др. Сэаоа, 1968;

' [¿изаоек^Шиец!, НТО) обнаружили, что глюкоза, глвкозо-6-фосфат, А20 и А2$ скияают скорость расщеллег/ип фосфорила-зы Б трипсином. Э1И ве авторы показали, что в ходе переваривания фосфор::лазы Б трипсином происходит постепенное уменьшение интенсивности флуоресценции фермента.

Ми исследовали совместное защитное влияние двух лиган-дов на скорость падения интенсивности флуоресценции при переваривании фосфорилазы Б трипсином. При этом ш исходили из того, что изменение устойчивости фосфорилазы Б к расщеплению трипсином происходит вследствие изменения кон формации белка-субстрата при связывании с ним лигэидов; следовательно, изменение скорости трипсинового гидролиза фосфорилазы Б в зависимости от концентрации лиганда делано отракзть связывание лиганда с белком. Использование двух лигэидов в такой системе позволяет выяснить вопрос о взаимном влиянии лигандов на их связывание с белком и, в связи с. этим, .вопрос о пространственной разделенности центров связывания этих лигандов.

Эта часть исследования прозодмлаеь нами совместно с сотрудниками Всесоюзного научно-исследовательского витамин-, ного Института канд.хим.неук Б.И.Кургановым и канд.биол. наук Н.П.Лисовской.

Приготовление растворов фосфорилазы Б и условия трипсинового гидролиза фосфорилазы онисапи в нешей статье (.Курганов, Лисовскзя, Иванова, 1972). За процессом гидролиза следили но снижению интенсивности флуоресценции фосфорилазы Б при 335 ям (.возбуждение светом с длиной волны 230 нм>

Для обкарунения синергизма или антагонизма в совместном действии двух лигандов на скорость снижения флуоресценции в процессе переваривания фосфорилазы Б трннсинои, в достаточно большом интервале концентраций лигандов подбирали такое их молярное соотношение» при котором индивидуальные степени снинеиия или увеличения скорости гидролиза одинаковы. Сопоставление кривых зависимости скорости гидролиза от концентраций отдельных лигандов с кривыми зависимости скорости гидролиза от суммарной концентрации двух лигандов, взятых в подобранном молярном соотношении, позволило выявить эффекты синергизма и антагонизма в действии ряда лигандов. *

Рис.10. Зависимость относительной скорости снижения интенсивности флуоресценции фосфорилазч Б в процесса трипсино-вого гидролиза от концентрации глю:газо Ц), глюкозо-С-фосфата (.2) и глюкозы+глюкозо-6-фоофат в молярной отношении 1:ИЗ).

Рис,II. Зависимость относительной скорости сникения интенсивности флуоресценции в процессе триненнового гидролиза ■ фосфорнлази Б от логарифма шлярних концентраций ДО <Д), ' А ТО (.2) и Л1Й+А1*5 в молярном отношении 1:52 (.3).

На рис.Ю представлены данные по влиянию ш/гибиторов фосфорилазы Б» глюкозы и Г-С-Р но скорость сшшенкя интенсивности флуоресценции в процессе расщепления фермента трипсином» Й глюкоза, и ГЧЗ-Р уменьшают скорость сштения интен-. сивности флуоресценции. Заздиное действие гкюкози и гквкозо-~в-фосфата оказалось практически одинаковым (.кривые 1,2 на рис.Ю), поэтому для изучения совместного действии их использовали в молярно« отношении 1:1. Из рисунка видно, что глюкоза и гд»козо~6осфат, добавленные вместе (.кривая 3), оказывают более сильное стабилизирующее действие, чем эти эффекторы, добавленные в соответствующих концентрациях порознь. Синергизм в совместном действии глюкозы а Г-6-Р указывает на то, что эти ингибиторы присоединяются к различным центрам в молекуле'фосфорилазы Б. Аналогичный вывод был сделан при исследовании совместного иигибирувщего действия глюкозы и г-6-р ца активность фосфорилазы Б (СилоновЬ, Ливанова, Курганов, 1969).

Структурное сходство активатора фосфорилазы Б ЛЙО и* ингибитора АТФ, а такае конкурентный характер яишбкротйщ-А5Ф по отношений я ЛКФ позволяют предполагать, что эти зф-*' фекторы связываются в одном центре. Ояыты по совместному действию АШ и А® на триясиновый гидролиз фосфорилазы подтверждают это предположение. Каи так и kTV оказывают стабилизируйте действие, однако, для получении одинакового эффекта концентрация АТФ долина в 32 раза прешла«, концентрацию АУФ. Коэффициент S2 подучен совмещением кривых зависимости скорости снижения интенсивности флуоресценции от логарифмов молнрних концентраций AÍI'S и путем сдвига кривых по оси абсцисс (.рис.11). Из рисунке видно, что совместное действие ЛШ> и ATÍ>, молярное отношение который составляет 1:32, практически совпадает с индивидуальным, их действие« tipa соответствующем выборе концентраций этих лигандов. Этот результат указывает на то, что АМФ й АЯ? связываются в одном центре»

В совместном звадетном действии АЗ®-, а гиокозы был обнаружен синергизм, а в совместной действии АУФ и Г-6-Р.-- антагонизм.

- 4S -

3íit дзкные указав аш; нз пространственную разцаяешюсть центров, свнэиа£ЭД1Х глюкозу и гко к о з о-3-фоофа т.

Особый интерес представляет вопрос о пространственной разделепности центров, связцваазэдх субстрат - глюкозо-1-фосфат н ингибиторы - глюкозу и глюкозо-в-фосфат. В отличие от и ксследовшних ингибиторов Г-I-P ускоряет падение интенсивности флуоресценции при тринсшювом гидролазе ¿осфоридаза. Ускоряв»ее действие Г-1-Р било изучено наци нз ^оне высоких концентраций НО u'ií глакозы и Г-6-Р. Вкни глюкоза или Г-в-Р связываются на то« ке центре, что а Г-I-P, то ио:-шо было огадать, что ускоряющее действие Г-I-P будет проявляться в значительно ионьшсИ степени. Однако оказалось, что но фоне высоких концентраций глюкозы и глшозо-G-фосфата Г-I-P ускоряет снижение интенсивности флуоресценции фосфорилазы Б в такой ке степени, как в отсутствие добавок. Так, без добзвок Г-1-? в концентрации 20 Ш ускоряет сникеиие интенсивности флуоресценции при тришшовом гидролизе фосфорилазы в 1,5 раза, а в присутствии 10 и'Л глюкозы или Г-G-F - в 2,1 и в 1,8 раза, соответственно. По-видимому, этот результат указывает но то, что глшозо-I-фосфат, глюкоза и глвкозо-6-фосфат связываются в различных участках молекулы фермента.

Получении к свойства гибридов цосйошлаз Л и Б

Исследования последних лет показали, что vivo, кроме тю;; пастью фосфоршигровашой (.фосфора л аза Л) и полностью дефоафорилкрованной форм фосфорилазы существуют и неполностью фосфорилирозашшз, так позываемые "гибридные" í-opí.oi фосфорилазы. Такие фосфо-дефосфошбриди обладают несколько меньшим сродством к.субстрату Г-I-P, чем фосфо-рялеаа А, но большим, чем фосфорилаза Б и очень чувствительны к де$:с?вию оллостерического ингибитора Г-6-Р (, Uurd, Xellor,

Все предприняты© до сих пор попытки выделить фосфо-де-фосфогибрпды из раствора сказались неудачными, по-видимому, вследствие их термодинамической нестабильности.

ФельдМШШ И ДР* С Ь'91<1жа1:1П.т2в1з«1,ШХ[11Гв1с1а,197^) ОГИ-сали получение стабильных гибридов фоспорилаз А и Б, присоединенных к активированной сефарозе. Однако свойство таких иммобилизованных гибридов оказались сильно измененными: удельная активность существенно умеиьшона, а аллостеричее-кие вэейнодействия у них не выявлялись.

1Аы поставили перед собой задачу получить гибридные формы из смеси мономеров фосфорклаэ А и Б в растворе и попытаться их отделить от исходных фосфоршшз путей сорбции на ДЭЛЭ-целлюлозе и специфической эдюции растворе« ингибитора Г-6-Р. ...

Оказалось, что при реассоциации смеси мономеров фо,сфо-рилаз А и Б ^полученных в присутствии п-ХМБ) в исходные ферменты в растворе наряду с полностью фоефорилировашюй и полностью дефосфорилированной формами образуются и фосфо- де-фосфогибриды фосфорилазы (.Ливш<овэ,1.'р01шиа,силонова,1972; Силонова,Еронвиа,Ливанова,1974). О наличии гибридных днуеров в реассоциированпой смеси ш судили по двум тестам:во-нервых, по сдвигу равновесия димер-тетрамер, выявляемому методом седиментации в удьтрэцентрифуге, в сторону тетрамера в присутствии Г-1-Р и в сторону димера в присутствии Г-6-Р (.известно, что гибриды легче меняют состояние агрегации под действием этих фосфорных зфиров,чей исходные формы);и, во-вторых, по активации гибридов высокими концентрациями Г-1-Р и ипгибиро-вани» Г-£-Р.

Убедившись,что смесь фосфюрилаз д и Б после диссоциации на мономеры и реассоциации содержит частично фосфорилировэнные гибридные формы,ш попытались отделить их от исходных с тем,чтобы иметь возможность исследовать регуляторные свойства гибридов.Длл этой цели использовали метод сорбции на колонке ДЭАЭ-целлюлозы с последующей специфической эмоцией гибридов раствором ингибитора Г-6-Р. Било получепо четкое разделение реоссоциированной смеси на три белковых пика.Пор- . вый пик элшировался исходным буфером,второй - 10 мМ раствором Г-6-Р и,наконец, третий пик элюировался I М раствором ИаСД. (.рис.12).

Анализ активности фосфорилазы в каадом из трех пиков -показал, что исходным буфером элюируется фосфорилаза Б,проявляющая активность только в присутствии АУФ,белок во вто-

ром пике проявляет типичные для гибридов свойство:, он более активен при концентрации F-I-P 100 ulí, чем 18 uS, приблизительно в 2 раза активируется АУФ и сильно угнетается 5 иМ Р-6-Р. Третей пик, судя по активности, содержит -фосфорила-зу А. 3 контрольном эксперименте при нанесении на колонку ' ДЭАЭ-целлалозы исходной снеси фосфорилаз А и Б второй пик, эляируемый 10 раствором Г-6-Р, полностью отсутствует.

Рис.12. Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе сие си фосфорилаз А'и Б после гибридизации.

ffj U 8 /2

3 *>Ы глицеро- 10 мМ

тоырат, Г-6-Ф

рН7,0

i ¿v 28 номера. | Фракции

iMKa.ee

Повторное разделение на колонке ДЭАЭ-целлюлозы выделенной гибридной фракции показало, что она нестабильна и постепенно трансформируется в исходные формы. Кроме'того, как показал анализ активности белковых пиков после повторной хроматографии фргкции гибридов, а также опыты по действию кина-зы фосфоралa3i: на активность фермента в каадом пике, гибриды • меняют сзою, к ^формацию, превращаясь в форму с пониженной удельной активностью, десенсибилизированную к действии r-G-P.

Возможно» что стабильность гибридов фосфорилаз Л и Б повышается в ;словинХ in vivo, . где щосфоралаза, вероятно, находится в комплексе о другими ферментами и гликогеном. Повышенная чувствительность гибридов к изменению концентрации фосфорных эф 1ров - Г-I-P и Г-В-Р, а такие тот факт, что гибриды сильно активируется АШ>, но не чувствительны к действию АЮ, раезирлет возможности регуляции активности фосфорилазы в организм. В одной из работ венгерских авторов (. Gergoly, Bot,Kovac;, 197^ ) было убедительно показано, что in vivo

при электрической стимуляции и при введении адреналина ф-ос-форилаза Б в ыышце почти целиком переходит не в полностью фосфюрилировэнную форму А, а в частично фосфорадированную гибридную форму фосфорилазы.

выводи

X. Исследование диссоциации гликогенфосфорилаз Б и А шшц в кислой и щелочной среде показало, что зона устойчивости Четвертичной структуры фермента находится в области рН от 5,0 до 9,5 и совпадает с "зоной стабильности" спектров поглощения и белковой флуоресценции фосфорилаз. При рН 9,5-10,0 фосфорилаза Б диссоциирует на мономеры с молекулярным весом 100 ООО, а фосфорилаза А на дииери с молекулярным весом 200 ООО. Такой характер диссоциации свидетель-,, ствует в пользу наличия в тетрзмере фосфорилазы А двух типов связей: более прочных между мономерами в дамере, устойчивых при рН 9,8-10,0, и менее прочных между димероыи в тет-рамере, разрывающихся в этой области рН. Судя по характеру диссоциации фосфор'/, л аз при изменении рН среды, связи поеду мономерами в динаре фосфорилазы Б и мексду дилерами в тетра-мере фосфорилазы А имеют электростатическую природу. Диссоциация фосфорилэз при рН 9,5-10,0 полностью обратима: при нейтрализации раствора четвертичная структура и активность фермента восстанавливается.

2. Обнаружены циркулярный дихроизм и аномальная дисперсия оптического вращения в полосе поглощения связанного с фосфорилазоИ Б пири док са л ь-5'~фосфата (.при 330 ни), обусловленные ^асимметрическим окружением.кофактора, находящегося в виде тиффова основания в гидрофобном углублении на поверхности молекулы белка. Циркулярный дихроизм исчезает при переходе фермента в форму, поглощающую при 415 пм.

3. Пиридоксэль-5'-фосфат не принимает прямого участия в соединении мезду собой мономеров фосфорилазы Б в не' находится в зоне контакта мономеров, поскольку величина и знак циркулярного дихроизма (, показатели ? весьма чувствительные к непосредственному окружению кофзктора) не меняются при диссоциации фосфорилазы Б на мономеры при рН 10,0.

4. Еонформациокнне измененни в модскулэ фосфоралозы Б при отоплении пиридоксольфосфата, по-видимому, ограничиваются небольшой областью, т.к. апо- к холофермёнт язло отличаются по характеру кривых дисперсии оптического вращения

в области поглощения пептвдшх связей и, следовательно, близки по вторичной структуре.

5. Обнаружено, что в присутствии ниэкохолонулярного оснозного белка проталина фосфорпласи Б и А мышц образуют, кристаллы в форме труб.

6. Исследование четвертичной структуры фосфорилаз Б и А с помодьи электронно-микроскопического анализа труб, плоских слоев и молекул фермента из раствора показало, что тетргмеры обоих форм фосфорилазы состоит из четырех вытянутых изогнутых субъедкниц с расширениям* но концах, расположенных с симметрией 222 в вержнэх удлиненного тетраэдра. Такая модель молзкулы предусматривает возможность наличия двух типов связей з тетрауере, как это следует из характера диссоциации фосфорилаз гтрз рН 9,8-10,0. Но данным электрон но-кикроскогшческого анелкза мономеры в составе титра-меров каждой из форм фериента не имеют видкшх различий,

?. На данном уровне разрешения ^приблизительно 10 й> не обнаруживается разницы в структуре тетрзмеров фосфорилаз Б и А. Различая в структуре дзух форм фоейорилазы проявляются в характере взаимной агрегации молекул в плоских слоях и з параметрах спиральной укладки их в трубах.

8. Злектронно-^икроскошческое исследование димеров фосфорилазы Б мышц позволило получить предварительные данные об их форме и идентифицировать расположение димеров з модели тетрсмера.

9. На основании электрэгшо-шкроскопического анализа дикерних форм фосфорилаз А и Б печени предложена предварительная модель ликера фосфорилази печени. На данном уровне разрешения различий в структуре фосфорилаз А и Б печени не обнаруживается.

10. Проведен кинетический анализ аллостерического ин-гибирования цшечной^фосфорилэзы Б. Установлено, что:

а) в присутствии ингибиторов, глюкозы, аденина и аденозина выявляются кооперативные взаимодействия центров связывания субстрата, глюкозо-I-фосфата, причем коэффициент ко-оперативности для глюкозо-1-фосфата в присутствии ингибиторов приближается к двум.

б) Центры связывания ингибиторов фосфорилазы Б (.глюкозы, АГО, аденина к аденозина) проявляют способность к гомо-тротшм кооперативным взаимодействиям, причем для глюкозы и А1Ф коэффициент кооперативности с ростом концентрации субстрата растет, приближаясь к 2, а для аденина и аденозина он равен приблизительно 1,5 и не зависит от концентрации субстрата.

в) Иезду центрами связывания А3$, аденина и аденозина, с одной стороны, и глюкозы или глюкозо-G-фосфата, с другой, а такие мевду центрами связывания глюкозы и глюкозо-6-фосфата существуют гетеротропные взаимодействия, поскольку при совместном влиянии пор указанных ингибиторов на активность фосфорилазы Б наблюдается синергизи, который снимается в присутствии мочевины.

11. На основании исследоваЕшп совместного действия двух ингибиторов на активность фосфорилазы Б, а тагоге совместного действия двух лигэндов на скорость снижения интенсивности фшуоресцеицци при переваривании фосфорилазы Б трипсином установлено, что:

al активатор фосфорилазы Б, АА55 и ингибитор ATO присоединяются к одному и то:лу не центру;

б) центр связывания АМФ и АТФ не совпадает с центром связывания глюкозо-6-фосфата;

б) ингибиторы, глюкоза и глюкозо-6-фосфат, и субстрат, глюкозо-1-фосфат, по-видимому, имеют каздый свой центр связывания.

12. При реассоциации смеси мономеров фосфорилаз Би А, наряду с исходными формами, образуются частично фосфорили-рованные гибридные формы, отличающиеся особой чувствительностью к действию ингибитора - глюкозо-6-фосфата. Достигнуто разделение смеси фосфорилаз Б, А и гибридов на колонке"

с ДЭАЭ-целлюлозой путем использования специфической элюции гибридов раствором ингибитора, глюкозо-6-фосфата. Выделенные гибриды фосфорилазБ и А в растворе нестабильны и медленно превращаются в исходные формы, а такие,, по-видимому, переходят в иное конфориационное состояние с Пониженный сродством к глюкозо-6-фосфату и с пониженной удельной активностью. "

Цитированная литература

Силонова Г.В., Лисовская Н.П., 1967. ДАН СССР, 174.

718; Знгельгардт В.А., Любимова М.Н., 1939. Nature 14+ï FiscUer ¿¡.H., Jfocfcer л., üaari J.O. I 1970. iissaya in üio-c he mis try 6, 23*. Ulingv.orth. ß. et al. , 1953. Proc. Mat. Acad. Sei-"~Uoà frt, 11801 iizuka , Jang «J.T. 1966. Proc. Mat. Acad. tici. ША ll75ï.Jomson G.Г., Gravée D.O. 196> Бiосii©mistry ¿,3906: Johnson et ol. ,1970. J.iiiol. СЬеш. 2ч-5, 5560i ¿ent A.ii. , Krebs ji. G. , Fischer jii.Ji. ,1958» J.iiiol. Client. , 549ï JireDs К. G. ,1954. üiocüim. üioplys. Acta 15, 508, lu ads en H. b. , Cori С. F. , 1956. J.ßiol. Ottern. 225, 1055i ¡¿¿uyzbelc Ъ. , ' Datajanovicü. b. , Csaoa B. ,1968.¿io- . chim. Biophys. Acta 162, ииагЬок, Sümeei J. ,1970.

JSacperientia 26, 25i Pufciiwein G. et ol. , 1970. Ulochemistry 9, 4691*, Shaltiel S. , Cortijo id. , 1970. üioch. üioph. Bes. Coum. 41, Wune J.H., Graves ß.J., 1965. J.-tfiol.^Cheiü.,

238, 2586.

Список

работ, опубликованных по тёпе диссертации

1. Лив;нова Н.Б., Лисовская Н.П., Силонова Г.В. Исследование иеХ(Ийзма действия адениловой кислоты на фосфорилазу Б мышц крои.ко. Биохимия, 29, 936, 1964.

2. Лисовская Н.П., Ливанова Н.Е., Силонова Г.В. К вопросу о ыелшиэме действия фосфорилазы Б мышц. Биохимия.29. 1012, 1964.

3. Ливанова Н.Б., Пихелгас В,Я., Шпикитер В.О. Превращения фосфор.мазы Б в кислой и щелочной среде. ДАН СОСР.161. (1222, 1965.

4.'.Torch.ii\sJç/ Ju.m. ,l>ivanov& H.B. , Pifcholgaa V.Ja.The-cireular dicLrois» and anomalous rotatory dispersion of

muscle pbosplior,/laS0.Biochim-Biopbya.Acta,llO,619t1965«

- S3 -

5. Ливанова Н.Б., Морозкин А.Д., Пихелгас В.Я., Шпики-тер В,0. Диссоциация фосфорилаз А и Б из шлиц кролика. Биохимия, ЭХ, 194, Х966.

6* Ливанова Н.Б., Морозкин А.Д., Шпикитер В.О. 'Исследование четвертичной структуры мышечных фосфорилаз. Труды 2-го Международного Симпозиума по химии и биологии пиридок-салевого катализа, Москва, I9SG, стр. 569.

7. ТорчинсвиЙ Ю.М., Малахова Э.А., Ливанова Н.Б., Пихелгас B.fi. Индуцированная оптическая активность некоторых пиридоксолевых ферментов. Труды 2-го Международного Симпозиума по химии и биологии пиридоксалевого катализа. Москва, 1966. :

8. ТорчинсвиЙ Ю.М., Ливанова Н.Б., Пихелгас В.Я. Циркулярный дихроизм и дисперсия оптического вращения мышечной фосфорилазы Б. Мол. биол. 28, 1967.

9. Iiivünova И.и. , liioroztia A.B., tihpiitifcer V.U. .Dissociation о£ uiuscla phoaphor,ylases. Abstracts of VII tli-intern. Congress oí* üiocbexúíütr^, 'Tokio, F-'гЬч-, p. 81**. ■

to. Ливанова Н.Б., Морозкин А.Л,Шпикитер В.О. Исследо-1 ванне четвертичной структуры гликогенфосфорилаз А и Б мышц. Тезисы 4-Й Всесоюзной Конференции по химии и биохимии углеводов, Львов», IS67, стр. 64. * I

II,üylonova G.V., Livanova Е. íi. Aüout alZosteric regulation of muacltí ptiospboryl ase. Abstracts oi' V tu u.eetong of Fliütí, Prahu, 1968, p. 27212. Силонова Г .В., Ливанова Н.Б., Курганов Б.И. Аллосте-рическое ингибирование фосфорилазы Б из мышц кролика, йод. биол. В, 768, 1969.

13. Ливанова Н.Б., Силонова Г.В., Курганов Б.И. Аллосферическое ингибирование фосфорилэзы Б из мьглц кролика. Тезисы докладов на 2-м Всесоюзном биохимическом съезде. Ташкент, 1969.

14. Киселев H.A., Лернер Ф.Я.» Ливанова Н.Б. Электронная микроскопия мышечной фосфорилазы Б. Мол. биол.5, 642, 1971.

15. Kiselev H.A. ,Lexner F. ía. ,Livanova li.ß. ¿lectron ni с ros с op j of тизсХе Phosphorylase o. J.tiolec.üiol. 63,

537, 1971-

16. Киселев H.A., Лернер Ф.Я., Ливанова Н.Б. Электронная микроскопия мыкечной фосфорилазы Б. Тезисы докладов 8-й ( Всесоюзной конференции по электронной микроскопии. Москва, 1971.

I?. Киселев H.A., Леркер Ф.Я., Ливанова Н.Б. Электронная микроскопия мышечной фосфорилазы А. Тезисы докладов 8-й Всесоюзной конференции по электронной микроскопии. Москва, 1971.

IS.Livûïiova H.Jj. , kurganwv ü. i. , LisswviiKuga. Ы.Р. About alio st eric interaction on pho apiio rjl as a d from rao Dit muscle. JLn "iueciianisai and control properties oí piioaptto — transferases- Academic Verlag, iierlin, 1971, p..JO?.

19. Лисовская H.H., Ливанова Н.Б. Регуляция действия . мышечных фосфорилаз. В кн. "Аллостзричеекая регуляция действия ферментов" под ред. чл-корр.АН СССР В.Л.Кретовича. Москва,.1971.

20. Kiselev U.A., Lemer F, ¿a. , Livtmova iii.jj. Electron microscopy of muscle piio sp ho гу 1 as а з b and a. In "metabolic Xntereonversion of епаутез1', eds. (J.Wieland, iíelmreicñ, H.Kolzer. dprineer Verlag, jUerlin-Hôideloerg-H.ï. 1972, P*29*

SI. Курганов Б.И., Лясовская H.П., Ливанова Н.Б. К вопросу о пространственной разделенноети центров, связывающих специфические ллганды в фосфорилазе Б. Биохимия, 37,289,1972.

22. Лисовская Н.П., Ливанова Н.Б., Курганов Б.И. Изучение пространственной разделенноети центров связывания специфических лигандов в фосфорилазв Б. Тезисы докладов 5-й Все-соазной конференции по химии и биохимии углеводов. Тбилиси,

>1972, изд. "Наука", W., стр. 94.

S3. Ливанова Н.Б., Еронино Т.Е., Силоиова Г.В. Гибридизация .фосфорилаз А и Б. ДАН СССР, 207, 1482, 1972.

24. Livanova Ii.в., iironina Ï.Л. , dilonova G.V.Hjoridi-z at ion of pnosphoryl ose a and i>.F«iiJ¿¿ L^tt-jtrs , 19V¿-

23. Ливанова Н.Б. Химическая модификация ферментов как один из путей регуляции их активности. Тезисы докладов Всесоюзной конференции по регуляции биохимических процессов. Пущяно, 1972, стр.100.

Klselev К. A. , Lerner F.ïa- « Livanova H.b. Electron microscopy of musclé piiospborylase. Abstracts of the J ^Intern. Symposium on ttie idetaooiic Int ex-conversion of .Enzymes, Seattle, Washington, 1975, p.8.

37. Курганов Б.И., Лисовская H.П., Ливанове Н.5., Еро-нина Т.Е. Изучение взаимодействия фосфорилазы Б с АН№ флуо-рометрическкм методом. Биохимия, 38, 243, 1973.

28. Livanova N.B. , ¡¿ilonova G.V. , Kronlna T.d. ,Lemer F.ïa. , Kiselav N. A- Babbit liver glycogen phosphoryl as e; til© kinetic ptopertiea and quaternary structure. Abstracts of tha joint US-UeiSR symposium on biological Fyridoxal catalysis, Leningrad, 197S P-85-

Э9- liiselev N.à. „ Leraer F.xa. .Livanova 1UB. KLectroa microscopy of muscle phospJiorylaae a. J-iJolec.iJiol. 86, 587, 1974-.

30. Силонова Г.В., Еронина Т.Б., Ливанова H.Б. О'нестабильности гибридов фосфорилаэ А и Б из мышц кролика в растворе. Биохимия, Щ, 1246, 1974.

31. Лисовская Н.П., Ливанова Н.Б. Регуляция действия # мышечных фосфорилаэ. Б сб. Итога науки, Аллостерическая регуляция действия ферментов, под ред. чл,-корр.АН СССР В.Л. Йретовича, M., 1975» стр.ПО.

Сокращения, встречающиеся в тексте авторефератам

фА - фосфорилаэа А

фБ - фосфорилаза Б

АТ5 - адеиозинтрифосфат

У1Ф - уридиитрифосфат

И1Ф - иноэинтрифосфат

АД<? - аденозандифосфат

АМФ - аденозин~5'-монофосфат

ИМФ - инозин-5-монофосфат Пиридоксаль-Р - пиридоксаль бЦосфат

п-ХМБ - пара-хлорнеркурибензоат

Г-I-P - глюкозо-1-фосфат

Г-6-Р - глюкозо-6-фосфат

Рн - неорганический фосфат

ДОВ - дисперсия оптического вращения

D25Bí-5_5£:iz.-.í2¿í!:-í32§-ti_______________рак. 78»______.Уид.^гОО

Типография X03Û Госплана СССР