Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мутационный анализ возможных сайтов фосфорилирования транспортного белка вируса табачной мозаики

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Каргер, Елена Мировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА ВТМ И ВИРУСНЫЙ ЦИКЛ

ПЛАЗМОДЕСМЫ И ТБ ВТМ

ТБ-ОБУ С ЛОВ ЛЕННЫЙ ТРАНСПОРТ ВИРУСНОЙ РНК

КЛЕТОЧНЫЕ КОМПОНЕНТЫ,УЧАСТВУЮЩИЕ В ТАНСПОРТЕ

Роль телец включения

Роль микротрубочек

Роль микрофиламентов

ДРУГИЕ ХОЗЯЙСКИЕ ФАКТОРЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В 21 ИНФЕКЦИИ

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ДОМЕНЫ ТБ ВТМ

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ В РАСТЕНИЯХ

РАТИТЕЛЬНЫЕ МАП КИНАЗЫ

Общая характеристика

51РК и WIPK-кинaзы, участвующие в ответе на стресс

РАСТИТЕЛЬНЫЕ КАЗЕИНОВЫЕ КИНАЗЫ I И II (КК1 и КК2)

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ТБ ФИТОВИРУСОВ

Фосфорилирование ТБ ВТМ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

АНАЛИЗ ПЕПТИДОВ

Кинирование белков и получение триптических пептидов

Двумерное картирование пептидов и фосфоаминокислотный анализ

Анализ аминокислотной последовательности пептидов

ВЫДЕЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ РАЗЛИЧНЫХ КЛЕТОЧНЫХ 40 ФРАКЦИЙ

Получение препарата фракции клеточных стенок

Получение препарата фракции Р

Получение микросомальных фракций

АНАЛИЗ МИКРОСОМАЛЬНЫХ ФРАКЦИЙ

Кинирование in vitro

Анализ влияния двухвалентных катионов на киназную 41 активность

Анализ присутствия BiP

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ IN VITRO

Протеинкиназа С

Фракция клеточных стенок

КИНИРОВАНИЕ В ГЕЛЕ

ПОЛУЧЕНИЕ РНП-КОМПЛЕКСОВ

АНАЛИЗ РНП НА НИТРОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ ФИЛЬТРАХ

ВЫДЕЛЕНИЕ И ЗАРАЖЕНИЕ ПРОТОПЛАСТОВ

КОНСТРУИРОВАНИЕ ПЛАЗМИД

Получение конструкций с С-концевыми мутантами

Получение конструкций с мутациями в положении

ТРАНСКРИПЦИЯ, ЗАРАЖЕНИЕ РАСТЕНИЙ И АНАЛИЗ 46 ЗАРАЖЕНИЯ

Формирование РНП

Измерения с помощью АСМ

РАБОТА С АГРОБАКТЕРИЯМИ

Трансформация агробактерий

Агроинфильтрация

ИЗУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ БЕЛКОВ

ПОЛУЧЕНИЕ АНТИТЕЛ К BiP

КРУГОВОЙ ДИХРОИЗМ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ С-КОНЦА ТБ ВТМ НА СВОЙСТВА РНП

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСОВ РНК-ТБ ВТМ 53 МЕТОДОМ АСМ

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ С-КОНЦЕВЫХ АМИНОКИСЛОТ ТБ В 58 ТРАНСПОРТЕ ВТМ

ХАРАКТЕРИСТИКА КИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ЭР- 60 ОБОГАЩЕННЫХ ФРАКЦИЙ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ САЙТОВ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ТБ ВТМ 62 МИКРОСОМАЛЬНОЙ ФРАКЦИЕЙ

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ТРЕОНИНА В ПОЛОЖЕНИИ 104 НА 66 ТРАНСПОРТНЫЕ СВОЙСТВА ТБ ВТМ

ИЗУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ МУТАНТНЫХ ТБ

ВЫВОДЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Каргер, Елена Мировна

1. Установлено, что делеция 11 или 33 С-концевых аминокислот в ТБ ВТМ, также как замена четырех потенциальных сайтов фосфорилирования в С-конце, приводит к неспособности таких мутантных белков формировать инфекционные комплексы с вирусной РНК.

2. Впервые изучена структура комплексов РНК-ТБ ВТМ, сформированных in vitro, методом ACM. На основе данных атомно-силовой микроскопии высказано предположение о структуре этих комплексов. Показано, что фосфорилирование ТБ ВТМ протеинкиназой С дестабилизирует комплекс, делая РНК доступной для РНКазы А и подверженной разрушению в слабой ионной силе.3. Использование инфекционных РНК-транскриптов ВТМ позволило выявить, что мутации ТБ ВТМ по С-концевым сайтам фосфорилирования не оказывают влияния на ближний транспорт мутантных вирусов.4. Охарактеризована ТБ ВТМ-специфичная киназная активность, присущая ЭР-обогащенным микросомальным фракциям. Показано, что треонин в положении 104 ТБ ВТМ фосфорилируется in vitro микросомальной фракцией.5. Замещение треонина 104 на аланин не приводит к нарушению транспорта, в то время, как его замена на аспарагиновую кислоту сильно снижает способность белка осуществлять транспортные функции, возможно, за счет его дестабилизации.