Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярное моделирование механизма активации протеинкиназы A Ia

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярное моделирование механизма активации протеинкиназы A Ia"

На правах рукописи

РОГАЧЕВА Ольга Николаевна

МОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ МЕХАНИЗМА АКТИВАЦИИ ПРОТЕИНКИНАЗЫ А 1а

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 6 МАР 2015

005561209

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2015

005561209

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Стефанов Василий Евгеньевич

Научный консультант:

кандидат химических наук Щеголев Борис Федорович

Официальные оппоненты: Розенгарт Евгений Викторович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова Российской академии наук, руководитель группы функциональной биохимии беспозвоночных.

Петухов Михаил Геннадьевич, доктор физико-математических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова, Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт", ведущий научный сотрудник отделения молекулярной и радиационной биофизики.

Ведущее научное учреждение: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук.

Защита состоится 14 мая 2015 г. в 18.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.232.10 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет» по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд. 90.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. А. М. Горького Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет» (г. Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9) и на сайте www.spb.ru.

Автореферат разослан « .» марта 2015 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук л Ляксо Елена Евгеньевна

с/А-е^ч

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Протеинкиназа А (ПКА) - ключевой белок множества сигнальных каскадов. Ее ферментативную активность обеспечивают каталитические субъединицы (С-субъединицы), а неактивное состояние С-субъединиц достигается путем образования комплексов с рядом пептидов и белков. Наиболее изученными и, видимо, наиболее распространенными являются RC комплексы - комплексы С-субъединиц с белками, известными как регуляторные субъединицы ПКА (R-субъединицы). RC комплекс, образованный с участием Ría изоформы R-субъединицы, носит название ПКА la.

Важное свойство всех RC комплексов состоит в том, что они диссоциируют в присутствии внутриклеточного мессенджера циклического аденозин-3':5'-монофосфата (цАМФ) на свободные R- и С-субъединицы, что приводит к активации ПКА. Причина цАМФ-зависимой диссоциации RC комплексов заключается в том, что в состав всех изоформ R-субъединиц входят два цАМФ-связывающих домена (A-домен и В-домен), каждый из которых может существовать в двух конечных конформациях: цАМФ-связанной В-конформации и реализующейся в составе RC комплекса Н-конформации. При связывании цАМФ оба домена претерпевают переход из Н- в В-конформацию, благодаря чему контакты между R- и С-субъединицами ослабевают. Понимание механизма конформационных изменений цАМФ-связывающих доменов важно для решения ряда биологических задач.

Так, циклические нуклеотиды играют ключевую роль в терапии различных заболеваний. Известно, что аналог цАМФ, Rp-uAMOS1, и его производные являются эффективными ингибиторами ПКА la, а следовательно могут использоваться для лечения патологических состояний, при которых путь цАМФ/ПКА la гиперактивирован. Одним из примеров таких состояний являются ВИЧ-инфекции. В данном случае гиперактивация ПКА la приводит к угнетению Т-клеточного ответа, а введение Rp-uAMOS и его производных восстанавливает пролиферацию Т-клеток. Понимание процесса цАМФ-индуцированной активации ПКА la могло бы не только ускорить получение клинического препарата, но и позволило бы сделать его максимально эффективным.

Кроме того, известно, что Ría субъединица, помимо поддержания неактивного состояния ПКА, участвует в инактивации цитохромоксидазы, образует комплексы с mTOR киназой, рибосомальной S6 киназой 1 (RSK1) и Smad3/Smad4 комплексом, контролирует транспорт факторов транскрипции (PATZ1) и репликации (RFC40) в ядро, причем некоторые из этих процессов

1 Яр-цАМФЗ (обратный агонист) и Бр-цЛМФБ (агонист) - серузамещенные аналоги цАМФ. Атомом серы замещены соответственно экваториальный или аксиальный экзоциклические атомы кислорода.

регулируются цАМФ. Установление механизма конформационных переходов R-субъединицы лежит в основе описания структуры и объяснения функционирования этих белковых комплексов, а также прогнозирования взаимодействия R-субъединицы с другими белками.

Наконец, цАМФ-связывающие и родственные им домены широко представлены в протеомах разнообразных организмов. Они входят в состав транскрипционных факторов прокариот (в том числе активируемых не нуклеотидами), HCN каналов (собственно HCN и spIH), CNG каналов, белков ЕР АС, протеинкиназ А и Г. Описание конформационного перехода любого из этих доменов существенно для понимания функционирования всех названных белков, а также для решения практических задач, связанных с регуляцией их активности.

На сегодняшний день расшифрованы кристаллические структуры цАМФ-и Яр-цАМФБ-связанных R-субъединиц (в том числе и отдельного цАМФ- и Rp-цАМФЗ-связанного А-домена Ría), свободного А-домена Ría и каталитически неактивного комплекса R- и С-субьединиц. Методом ЯМР продемонстрировано, что изолированные цАМФ-связывающие домены в отсутствие внешних факторов находятся в состоянии динамического равновесия между Н- и В-конформациями. Способность ряда белков и низкомолекулярных соединений (в том числе цАМФ) влиять на положение искомого равновесия и скорость его достижения лежит в основе выполнения всех биологических функций цАМФ-связывающих доменов.

Для объяснения механизма перехода этих доменов (и в частности А-домена Ría) из одной конформации в другую были предложены модели двух «переключателей»: электростатического (R209-D170-R226) и гидрофобного (L203-Y229). Модель гидрофобного «переключателя» подтверждена экспериментально, но остается неизвестным механизм, посредством которого этот «переключатель» приводится в действие связыванием цАМФ. Модель электростатического «переключателя», напротив, объясняет, каким образом информация о связывании цАМФ передается за пределы цАМФ-связывающего сайта, однако логике этой модели противоречит факт активации ПКА с мутационными заменами R209 и D170.

Методы молекулярного моделирования являются перспективным подходом исследования конформационных переходов белков. Тем не менее эти методы ни разу не были применены для подтверждения моделей электростатического и гидрофобного «переключателей». А единственная попытка показать конформационный переход цАМФ-связывающего домена не принесла желаемого результата, так как белок все время моделирования оставался вблизи исходного энергетического минимума.

Цель работы. Для объяснения механизма активации ПКА прежде всего надо расшифровать механизм перехода А-домена Ría из Н- в В-конформацию, что и стало целью работы. В рамках поставленной цели были выделены следующие задачи, решаемые методами молекулярного моделирования.

Задачи исследования:

1) расшифровать механизм, посредством которого связывание цАМФ запускает конформационный переход А-домена Ría;

2) определить роль электростатического «переключателя» R209—D170-R226 в конформационном переходе А-домена Ría;

3) установить роль гидрофобного «переключателя» L203-Y229 в конформационном переходе А-домена Ría;

4) описать наиболее вероятный путь перехода А-домена Ría из Н- в В-конформацию.

Методологическая основа исследования. При работе над диссертацией применялась совокупность методов молекулярного моделирования. Основные результаты были получены методами молекулярной динамики. Вспомогательную роль играли квантово-химические расчеты и лиганд-белковый докинг.

Научная новизна работы. В диссертации впервые расшифрованы все этапы механизма перехода А-домена Ría из Н- в В-конформацию и предложена модель электростатического «переключателя» цЛМФ(Об) - A202(N-H)-G199(C=0), посредством которого цАМФ передает информацию о своем связывании на гидрофобный «переключатель» L203-Y229 и этим запускает конформационный переход А-домена. Подтверждена и дополнена существующая модель гидрофобного «переключателя» L203-Y229. Впервые установлено, что движущей силой поворота В/С-спирали, происходящего при его переключении, является на первых этапах сохранение взаимодействия между Y229 и L203, а затем повышение энергии взаимодействия Y229 с р-субдоменом в целом. Впервые показано, что для функционирования гидрофобного «переключателя» в А-домене Ría необходимо смещение N3A-мотива. Продемонстрировано, что инвариантность остатка аргинина в положении 209 не связана с его участием в электростатическом «переключателе» R209-D170-R226, а определяется рядом других функций.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) цАМФ запускает переход А-домена регуляторной субъединицы ПКА la из Н- в В-конформацию посредством электростатического «переключателя» цАМФ(06)-А202(!Ч-Н)-0199(00), передающего информацию о связывании цАМФ на гидрофобный «переключатель» L203-Y229.

2) В переходе А-домена регуляторной субъединицы ПКА la из Н- в В-конформацию не задействован электростатический «переключатель» R209-D170-R226. Однако аминокислотный остаток в положении 209 выполняет ряд важных функций, как-то: (а) фиксация лиганда в связывающем сайте; (б) поддержание конформации р2р3-петли; (в) создание стерически благоприятных условий для размещения А202 в положении, характерном для В-конформации, и стабилизация этого положения путем образования взаимодействия с боковой цепью А202. Аргинин в положении 209 наилучшим образом совмещает

выполнение всех перечисленных функций, что является причиной его инвариантности во всех цАМФ-связывающих доменах.

3) Переход А-домена регуляторной субъединицы ПКА 1а из Н- в В-конформацию происходит в три последовательных этапа. На первом этапе в ответ на связывание лиганда В-конформацию принимает фосфаг-связывающая кассета. На втором этапе происходит смещение ЫЗА-мотива, поворот В/С-спирали и формирование в ее структуре витка я-спирали. На третьем, заключительном, этапе на месте витка я-спирали образуется излом, который разделяет В/С-спираль на отдельные В- и С-спирали.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты настоящего исследования важны для фундаментальной биохимии, так как они объясняют механизм конформационного перехода А-домена Ria как представителя большого семейства цАМФ-связывающих и родственных им доменов. Практическая значимость работы связана с тем, что белки, содержащие эти домены, выполняют важные функции в клетках, и изменение их активности часто сопровождает собой патологические состояния или приводит к ним. В этой связи полученные данные могут быть использованы для направленного поиска новых эффективных блокаторов и активаторов цАМФ-связывающих белков для дальнейшего их использования в медицине.

Апробация результатов исследования. Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях: Политехнический симпозиум «Молодые Ученые - промышленности Северо-Западного региона» (Санкт-Петербург, 2006); Двенадцатая Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2007); The Second Saint-Petersburg International Conference on NanoBioTechnologies NanoBio'08 (St. Petersburg, 2008); Научное наследие академика JI. А. Орбели. Структурные и функциональные основы эволюции функций, физиологии экстремальных состояний. Всероссийская конференция, посвященная 125-летию со дня рождения академика Л. А. Орбели (Санкт-Петербург, 2008); Тринадцатая Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2008); 6-ая Всероссийская конференция «Молекулярное моделирование» (Москва, 2009); Moscow conference on computational molecular biology MCCMB'09 (Moscow, 2009); «Современная химическая физика» XXI симпозиум (Москва-Туапсе, 2009); Third International NanoBio Conference (Zürich, 2010); XXI Съезд Физиологического общества имени И. П. Павлова (Москва-Калуга, 2010); Пятнадцатая Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2010); 7-ая Всероссийская конференция «Молекулярное моделирование» (Москва, 2011); Первая Международная Интернет-конференция «Математическое и компьютерное моделирование в биологии и химии. Перспективы развития» (Казань, 2012); Международная конференция «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012); The First International Conference «Quantitative imaging and spectroscopy in neuroscience» (St. Petersburg, 2012); FEBS Congress (St. Petersburg, 2013);

Moscow conference on computational molecular biology MCCMB'13 (Moscow 2013).

Публикации. Результаты диссертации опубликованы в 22 работах, в том числе в 5 статьях, 4 из которых опубликованы в журналах по перечню ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, списка литературы и трех приложений (А, Б и В). Работа изложена на 141 странице печатного текста, содержит 7 таблиц и иллюстрирована 21 рисунком. В списке цитируемой литературы приведено 112 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Все расчеты проводились на основе структур цАМФ-связывающих доменов, полученных методом рентгеноструктурного анализа и доступных в базе PDB. Н-конформация: А-домен - 3FHI (для докинга) и 3PVB (для моделирования), В-домен - 2QCS с обратной мутацией K333R, возвращающей дикий фенотип. В-конформация: оба домена - 1NE6.

Докинг лигандов цАМФ, Rp-uAMOS и 8р-цАМФ8 осуществлялся в связывающие сайты обоих доменов в обеих конформациях с помощью программы Quantum 3.3.0. Квантово-химические расчеты были проведены с использованием пакета программ Gaussian методом Харгри-Фока Рутаана в базисе 6-31+G(d), без учета влияния среды, Т= 0 К.

Моделирования методом молекулярной динамики (МД) проводились с использованием программы NAMD при следующих условиях: силовое поле CHARMM27, периодические граничные условия, водная среда, учет электростатики методом РМЕ (Particle Mesh Ewald). Нативное положение ß2ß3-петли во всех моделированиях поддерживалось при помощи наложения внешних сил.

Динамика ß-субдоменов белка дикого типа (в присутствии и отсутствие цАМФ) и с мутационными заменами R209I, R209E, R209G, R209K исследовалась в NVE ансамбле при средней температуре около 310 К. Отказ от учета а-субдомена был вызван необходимостью уменьшить время расчетов. Длительность траекторий для каждой из рассматриваемых систем составила 80 - 150 не. Для выявления отдельных конформаций ß-субдомена было отобрано восемь коллективных переменных. По ним проводилась кластеризация.

Для моделирования перехода А-домена из Н- в В-конформацию была предложена оригинальная методика. На первом этапе комплекс, представляющий собой A-домен в Н-конформации с цАМФ в связывающем сайте, нагревался до температуры близкой к 350 К, а затем моделировался в NVE ансамбле до перехода цАМФ-связывающего сайта, представленного фосфат-связывающей кассетой (ФСК), в В-конформацию. На втором этапе методом классической МД моделировались события, относящиеся к работе

гидрофобного «переключателя». Как только последние можно было считать совершившимися, начинался третий этап моделирования, отличающийся от второго применением ускоренной МД. Цель этого этапа состояла в получении тс-спирального фрагмента в составе В/С-спирали. Четвертый этап моделирования проводился методом классической МД и длился до тех пор, пока на границе В- и С-спиралей не начинал формироваться излом. Перед пятым этапом моделирования мы производили мутационные замены К240А и R239A, устраняющие препятствия к быстрому переходу А-домена в В-конформацию. Моделирование на этом этапе также осуществлялось методом классической МД. Последние четыре этапа моделирования были предприняты в NVT ансамбле при температуре 300 К, поддерживаемой постоянной с использованием динамики Ланжевена. Всего было получено тринадцать траекторий - путей перехода А-домена из Н- в В-конформацию (из них двенадцать для домена белка дикого типа и одна для домена с мутационной заменой R209K). В рамках предложенной методики среднее время перехода А-домена из Н- в В-конформацию составляло приблизительно 30 не. Для описания механизма этого перехода было отобрано двадцать шесть коллективных переменных. Их изменения во времени исследовались последовательно методами факторного и кросскорреляционного анализов.

Результаты и обсуждения

Анализ взаимодействия лигандов со связывающими сайтами А- и В-доменов ПКА 1а. В соответствии с предпринятыми исследованиями было установлено, что:

1) цАМФ-связывающий сайт А-домена Ría доступен для лигандов, даже если R-субъединица связана с С-субъединицей. цАМФ, Sp-uAMOS и Rp-цАМФБ связываются с цАМФ-связывающими доменами, находящимися как в В-, так и в Н-конформации, причем комплексы всех названных лигандов с доменами в В-конформации характеризуются большей устойчивостью. Этот факт (в совокупности с тем, что в RC комплексе A-домен находится в Н-конформации) говорит в пользу преимущественного протекания активации ПКА la по пути индуцированного соответствия. Механизм обратного агонизма Rp-uAMOS при этом должен заключаться в блокировании перехода А-домена из Н- в В-конформацию.

2) при связывании лигандов с А-доменом, находящимся в Н-конформа-ции, реализуются все водородные связи, известные по данным рентгено-структурного анализа, кроме связи между экзоциклическим экваториальным атомом лиганда и амидной группой А202. Причина отсутствия этой связи заключается в большом расстоянии между участвующими в ее образовании тяжелыми атомами. На этом основании предложено, что именно смещение амидной группы А202 должно приводить к изменению структуры ФСК, а следовательно запускать конформационный переход всего домена. Возможный

механизм обратного агонизма Кр-цАМФБ лежит в создании препятствия смещению данной амидной группы.

3) для водородной связи между экзоциклическим атомом кислорода цАМФ и амидной группой белка характерны энергия -7,7 ккал/моль и длина 3,0 А (данные квантово-химических расчетов). Яр-цАМФЗ образует аналогичную водородную связь, энергия которой -4,7 ккал/моль, а длина 3,9 А.

Моделирование перехода Р-субдомена А-домена из Н- в В-конфор-мацию. По результатам исследования показано, что:

1) амидная группа А202 в Н-конформации входит в остов Зю-спирали ФСК и образует водородную связь с карбонильной группой в 199. При этом по результатам докинга расстояние между атомом азота амидной группы А202 и экзоциклическим экваториальным атомом кислорода цАМФ составляет ~5,2 А. Переход в В-конформацию инициируется процессом образования водородной связи с участием этих двух атомов. В результате остаток А202 смещается, связь А202(Ы-Н)- 0199(0) разрушается, и спираль ФСК переходит из 310- в а-форму. Достигнутое положение спирали ФСК закрепляется образованием водородной связи А202(0)-Т207(Ы-Н). Разрыв и образование указанных связей показан на рисунке 1.

А - Н-конформация; Б - В-конформация.

Рисунок 1 - цАМФ-связывающий сайт А-домена Ría, представленный фосфат-связывающей кассетой (ФСК)

2) Г<р-цАМФ8 препятствует смещению амидной группы А202, что следует из установленной в главе 3 длины водородной связи между атомом серы Rp-цAMФS и амидной группой белка, а также обнаруженных методом докинга различий в положениях Rp-цAMФS и цАМФ в связывающем сайте А-домена. В таком случае поведение Rp-цAMФS как обратного агониста

подтверждает ключевую роль смещения амидной группы А202 при переходе А-домена из Н- в В-конформацию.

3) переход Зю-спирали ФСК в a-форму приводит к смещению остатка L203 и «упаковыванию» его боковой цепи в гидрофобный карман, образованный р2р3-петлей. В соответствии с литературными данными это событие является начальной стадией работы гидрофобного «переключателя» L203-Y229.

4) в В-конформации образуется ионная связь между боковыми цепями D170 и R209. Однако активное участие электростатического «переключателя» R209-D170-R226 в конформационном переходе А-домена проведенные нами расчеты не подтверждают.

Динамика (3-субдомена белка дикого типа и с мутационными заменами остатка R209. С использованием кластерного анализа выявлено шесть конформаций, принимаемых Р-субдоменом: В, Bl, В2 и ВЗ -конформации В-типа и Н, Н1 - конформации Н-типа. Две из них, а именно Н и В, характерны для любого цАМФ-связывающего домена, независимо от мутаций в Р-субдомене и присутствия а-субдомена. Показано, что природа остатка в положении 209 и лиганд в связывающем сайте не оказывают влияния на структуру выявленных конформаций, однако сказываются на их заселенности. Соотношение конформаций для разных Р-субдоменов составляет:

1) Р-субдомен белка дикого типа (+цАМФ): В - 25%, В2 - 74% и Н - 1%.

2) р-субдомен белка дикого типа (-цАМФ): В - 16%, В2 - 79% и Н - 5%.

3) R209I (+цАМФ): В - 54%, В2 - 43% и Н - 3%.

4) R209E (-цАМФ): В - 39%, В1 - 6%, В2 - 7%, Н - 48%.

5) R209G (-цАМФ): В - 26%, В1 - 8%, В2 - 22%, Н - 44%.

6) R209K (-цАМФ): В - 14%, В1 - 12%, В2 - 24%, Н1 - 22%, Н - 28%.

7) R209K (+цАМФ): В - следовые количества, В2 - 72%, Н - 28%.

8) R209K2 (+цАМФ): В - 13%, ВЗ - 40%, В2 - 47%.

На основании полученных данных сделаны следующие выводы:

1) В-конформация р-субдомена выгодней Н-конформации примерно на 2,9 кДж/моль. Это отличает Р-субдомен от целого А-домена, у которого свободные энергии образования этих конформаций примерно равны, и свидетельствует в пользу участия а-субдомена в смещении равновесия в сторону Н-конформации. Тем не менее это влияние умеренно, и р-субдомен может быть использован в качестве модели для изучения конформационной динамики соответствующего цАМФ-связывающего домена.

2) электростатический «переключатель» R209-D170-R226 не задействован в конформационном переходе А-домена из Н- в В-конформацию. В пользу

2 В этом эксперименте положение боковой цепи К209 поддерживалось близким к нативному положению боковой цепи 11209 при помощи наложения внешних сил.

и

отсутствия у него такой функции свидетельствуют: а) переход в В-конформацию домена с мутационной заменой R209I; б) восстановление способности домена с мутацией R209K к Н—>В конформационному переходу как результат фиксации положения р2рЗ-петли и боковой цепи К209. Согласно нашим представлениям роль электростатического «переключателя» R209-D170-R226 сводится к дополнительной стабилизации В- и Н-конформаций А-домена с помощью водородных связей R209-D170 и R226-D170 соответственно.

3) остаток в положении 209 выполняет ряд важных функций, не связанных с его участием в электростатическом «переключателе» R209-D170-R226. К этим функциям относятся: (а) фиксация лиганда в связывающем сайте; (б) поддержание конформации р2рЗ-петли; (в) создание стерически благоприятных условий для размещения А202 в положении, характерном для В-конформации, и стабилизация этого положения путем образования взаимодействия между боковыми цепями А202 и R209. R209 наилучшим образом совмещает выполнение всех перечисленных функций, что способствует появлению устойчивого энергетического минимума, соответствующего В-конформации. Другие рассмотренные нами остатки оказываются неспособными к выполнению той или иной из обозначенных функций, вследствие чего В-конформация становится менее устойчивой. Сила их дестабилизирующего влияния на В-конформацию в присутствии цАМФ увеличивается в ряду I<K<E(G), а в отсутствие цАМФ - в ряду I<E<G<K. Сопоставление этих рядов с экспериментальными данными по активации ПКА 1а дает основание полагать, что склонность к формированию В-конформации определяет биологически корректное функционирование как отдельных цАМФ-связывающих доменов, так и целого белка.

Механизм перехода А-домена Ría из Н- в В-конформацию. На основании данных, полученных методом молекулярной динамики и обработанных с помощью факторного и кросскорреляционного анализов, предложена схема наиболее вероятного пути перехода А-домена из Н- в В-конформацию, представленная в виде частично детерминированной последовательности выделенных нами событий: 1) Б, 2) В1, Г1,3) Д, 4) Г2[В2], Е, 5) И.

Очередности пунктов приведенной схемы соответствует реализация процесса конформационного перехода во времени. События, указанные в одном пункте, могут наступать в произвольной последовательности, в том числе одно на фоне другого. Напротив, для событий, указанных в разных пунктах, действует определенный порядок: каждое из событий последующего пункта может наступать одновременно с событиями предыдущего пункта, но не ранее их.

Событие Б (рисунок 2) представляет собой переход ФСК из Н- в В-конформацию, включая упаковывание боковой цепи L203 в гидрофобный карман. Главным участникам этого события: амидной группе А202,

карбонильной группе в 199 и экваториальному атому кислорода лиганда - мы дали название электростатического «переключателя» цАМФ(06)-А202(1Ч-Н)-С199(С=0). Посредством этого «переключателя» цАМФ передает информацию о своем связывании на гидрофобный «переключатель» Ь203-У229 и запускает таким образом конформационный переход А-домена.

Событие В (рисунок 3) заключается в смещении N3 А-мотива в сторону от ФСК, событие Г - в повороте В/С-спирали (рисунок 4), а событие Д - в увеличении энергии взаимодействия остатка У229 с (3-субдоменом (рисунок 4). События В и Г, вследствие большой длительности, имеют тенденцию осуществляться в два этапа, для указания на которые введены метки "1" и "2". На втором этапе протекание события Г определяется событием В, что обозначено как Г2[В2].

Ь203

А - Н-конформация; Б — В-конформация. Лентой оранжевого цвета выделена ФСК, лентой фиолетового цвета — р2рЗ-петля. Лиганд не показан.

Рисунок 2 - Событие Б. Переход ФСК в В-конформацию

А - Н-конформация; Б - В-конформация. Лентой желтого цвета выделена ФСК, фиолетового - |32|33-пегля, розового - ЮА-мотив, пурпурного - фрагмент В/С-спирали. Стрелкой указано направление смещения №А-мотива.

Рисунок 3 - Событие В. Смещение N3 А-мотива от ФСК

А - Н-конформация; Б - конформация, реализовавшаяся после завершения событий Г и Д.

Цветовые обозначения надвторичных структур А-домена те же, что и на рисунке 3.

Рисунок 4 - События Г и Д. Поворот В/С-спирали и увеличение энергии взаимодействия остатка У229 с р-субдоменом

Совокупность событий Б, Г1 и Д соответствует переключению гидрофобного «переключателя» Ь203-У229 в состояние, характерное для В-конформации, что подтверждает его ключевую роль в конформационном переходе А-домена. Тем не менее существующая модель гидрофобного «переключателя» не является полной. На основании данных, полученных в ходе моделирования, мы внесли в нее следующие дополнения:

1) смещение боковой цепи Ь203 происходит вследствие переключения взаимодействий в описанном нами электростатическом «переключателе» цАМФ(06)-А202(]М-Н)-0199(С=0);

2) движущей силой поворота В/С-спирали является на первых этапах сохранение взаимодействия между остатками У229 и Ь203, а затем повышение энергии взаимодействия остатка У229 с Р-субдоменом в целом;

3) частичное смещение ЫЗА-мотива по направлению от ФСК является обязательным условием поворота В/С-спирали, без выполнения которого снятие блока с гидрофобного «переключателя» не является полным. Это дополнение справедливо для всех цАМФ-связывающих доменов, кроме доменов белка ЕР АС, у которых №А-мотив в Н- и В-конформации занимает одно и то же положение относительно ФСК и не блокирует поворот В/С-спирали.

Завершающие переход события Е и И специфичны для А-доменов протеинкиназ А и В-доменов белков ЕРАС. В основе события Е (рисунок 5) лежит переход фрагмента В/С-спирали из а- в тс-форму, сопровождаемый поворотом боковой цепи Ь233 к №А-мотиву, а боковой цепи М234 к ФСК, что приводит к увеличению энергии взаимодействия между этими структурами. Событие И (рисунок 6) заключается в образовании излома В/С-спирали на месте фрагмента Л-спирали, а также в фиксации этого излома с помощью электростатического взаимодействия Я241-Е200 и в меньшей степени -вандерваальсового взаимодействия Ь238-1204.

А - фрагмент А-домена перед совершением события Е; Б - фрагмент А-домена после совершения события Е. Серым цветом выделен виток В/С-спирали, претерпевающий переход в л-форму. Остальные обозначения те же, что и на рисунке 3.

Рисунок 5 - Событие Е. Переход фрагмента В/С-спирали в л-форму

А. Б.

А - А-домен перед совершением события И; Б - А-домен после совершения события И (В-конформация). Лентой бирюзового цвета показана часть р-субдомена, не участвующая в Н<->В переходе. Остальные обозначения те же, что и на рисунке 3.

Рисунок 6 - Событие И. Формирование излома В/С-спирали на месте фрагмента л-спирали

Путь перехода в В-конформацию А-домена с мутационной заменой Я209К отличается от путей перехода доменов белка дикого типа не более, чем последние различаются между собой, что полностью исключает участие электростатического «переключателя» [<209 0170-11226 в конформационном переходе А-домена. Подтверждает этот вывод и отсутствие электростатического «переключателя» 11209-0170-11226 во всех цАМФ-связывающих доменах, кроме А-доменов протеинкиназ А. Последний факт выявлен в ходе анализа третичных структур цАМФ-связывающих доменов, размещенных в базе РОВ.

1 Положение боковой цепи К209 поддерживалось постоянным, как описано выше.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами данные позволили выделить электростатический «переключатель» qAM<D(06)-A202(N-H)-G199(C=0), посредством которого цАМФ передает информацию о своем связывании на гидрофобный «переключатель» L203-Y229 и этим запускает конформационный переход А-домена. Предположение о ключевой роли данного «переключателя» в переходе А-домена из Н- в В-конформацию согласуется с предложенным нами механизмом функционирования Rp-цАМФБ в качестве обратного агониста ПКА1а.

Проведенное исследование не подтвердило участие электростатического «переключателя» R209-D170-R226 в конформационном переходе А-домена, однако установило, что остаток в положении 209 влияет на склонность домена к формированию В-конформации. Замены аргинина в этом положении на любой другой остаток приводят к уменьшению стабильности В-конформации и, как следствие, к увеличению значений константы активации ПКА 1а, что отмечено в экспериментальных работах.

Простым описанием установленного механизма перехода А-домена Ría из Н- в В-конформацию может служить представление его в виде трех последовательных этапов. На первом этапе (пункт 1 приведенной выше схемы) в ответ на связывание лиганда В-конформацию принимает ФСК. На втором этапе (пункты 2 - 4), благодаря смещению №А-мотива и упаковыванию боковой цепи L203 в гидрофобный карман, поворачивается В/С-спираль, а в ее структуре, вследствие стремления остатков L233 и М234 к более выгодному гидрофобному окружению, формируется виток гс-спирали. На третьем, заключительном, этапе (пункт 5) в результате сближения боковых цепей R241 и Е200 на месте витка л-спирали образуется излом, который разделяет В/С-спираль на отдельные В- и С-спирали.

Последовательность событий, положенная нами в основу перехода А-домена Ría из Н- в В-конформацию, является первым приближением к пути минимальной свободной энергии (ПМСЭ) этого перехода. Его уточнение и построение профиля свободной энергии вдоль уточненного ПМСЭ является задачей дальнейших исследований.

Выводы

1) цАМФ запускает переход А-домена регуляторной субъединицы ПКА la из Н- в В-конформацию посредством электростатического «переключателя» hAM®(06)-A202(N-H)-G199(C=0), передающего информацию о связывании цАМФ на гидрофобный «переключатель» L203-Y229.

2) Электростатический «переключатель» R209-D170-R226 не задействован в переходе А-домена регуляторной субъединицы ПКА la из Н- в В-конформацию. Однако аминокислотный остаток в положении 209 выполняет ряд важных функций, к которым относятся: (а) фиксация лиганда в

связывающем сайте; (б) поддержание конформации р2р3-петли; (в) создание стерически благоприятных условий для размещения А202 в положении, характерном для В-конформации, и стабилизация этого положения путем взаимодействия с боковой цепью А202. Аргинин в положении 209 наилучшим образом совмещает выполнение всех перечисленных функций, что является причиной его инвариантности во всех цАМФ-связывающих доменах.

3) Гидрофобный «переключатель» Ь203-У229 представляет собой обязательный элемент механизма, лежащего в основе перехода А-домена регуляторной субъединицы ПКА 1а из Н- в В-конформацию. Движущей силой поворота В/С-спирали, происходящего при его переключении, является на первых этапах сохранение взаимодействия между У229 и Ь203, а затем повышение энергии взаимодействия У229 с |3-субдоменом в целом. В А-домене ПКА 1а, как и в ряде других цАМФ-связывающих доменов, для перехода гидрофобного «переключателя» в состояние, соответствующее В-конформации, необходимо смещение ЮА-мотива от фосфат-связывающей кассеты.

4) Переход А-домена регуляторной субъединицы ПКА 1а из Н- в В-конформацию происходит в три последовательных этапа. На первом этапе в ответ на связывание лиганда В-конформацию принимает фосфат-связывающая кассета. На втором этапе происходит смещение ЮА-мотива, поворот В/С-спирали и формирование в ее структуре витка л-спирали. На третьем этапе на месте витка л-спирали образуется излом, который разделяет В/С-спираль на отдельные В- и С-спирали.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В изданиях из списка ВАК

1. Рогачева, О. Н. Сравнительный анализ структуры и энтальпии гидролиза молекул цАМФ и цГМФ методами квантовой химии / О. Н. Рогачева, В. Е. Стефанов, Б. Ф. Щеголев // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. Биология. 2007. Вып. 2. С. 86-92.

2. Рогачева, О. Н. Термодинамическая оценка активации протеин-киназы А 1а / О. Н. Рогачева, А. В. Попов, Е. В. Савватеева-Попова,

B. Е. Стефанов, Б. Ф. Щеголев // Биохимия. 2010. Т. 75, № 2. С. 286-296.

3. Рогачева, О. Н. 3':5'-АМР-индуцированный конформационный переход регуляторной субъединицы протеинкиназы А 1а запускается ключевыми остатками А202 и А326. Ч. I / О. Н. Рогачева, Б. Ф. Щеголев, В. Е. Стефанов, Г. А. Захаров, Е. В. Савватеева-Попова // Биохимия. 2012. Т. 77, № 5.

C. 568-577.

4. Рогачева, О. Н. 11р-3':5'-АМР8 блокирует начальные стадии конфор-мационного перехода регуляторной субъединицы протеинкиназы А 1а. Ч. II / О, Н. Рогачева, Б. Ф. Щеголев, В. Е. Стефанов, Е. В. Савватеева-Попова // Биохимия. 2012. Т. 77, № 5. С. 578-582.

В других изданиях

1. Рогачева, О. Н. Расчет структуры молекул циклических нуклеотидов / О. Н. Рогачева // Политехнический симпозиум «Молодые ученые - промышленности Северо-Западного региона»: матер, конф., декабрь 2006 г., Санкт-Петербург. СПб: Изд-во Политех, ун-та, 2006. С. 199-200.

2. Рогачева, О. Н. Изучение механизма диссоциации регуляторной и каталитической субъединиц протеинкиназы А 1а (ПК А 1а) / О. Н. Рогачева //

12-я С.-Петерб. ассамблея молодых ученых и специалистов: ан. работ. СПб.: Изд-во Рос. гос. гидрометеоролог, ун-та, 2007. С 44.

3. Рогачева, О. Н. цАМФ и АТФ как природные регуляторы активации ПКА la / О. Н. Рогачева, А. В. Попов, Б. Ф. Щеголев, Е. В. Савватеева-Попова // Научное наследие академика JI. А. Орбели. Структурные и функциональные основы эволюции функций, физиологии экстремальных состояний: матер. Всерос. конф. 19-20 ноября 2008 г. Санкт-Петербург. СПб.: ВВМ, 2008. С. 136-137.

4. Рогачева, О. Н. Исследование методами молекулярного моделирования роли связывания цАМФ и АТФ в процессе активации ПКА la / О. Н. Рогачева //

13-я С.-Петерб. ассамблея молодых ученых и специалистов: ан. работ. СПб.: Фонд «Гаудеамус», 2008. С. 45-46.

5. Рогачева, О. Н. Термодинамическая оценка активации протеинкиназы А 1а (ПКА 1а). Анализ роли стэкинг-взаимодействия в связывании цАМФ регуляторной субъединицей ПКА la / О. Н. Рогачева, А. В. Попов, Б. Ф. Щеголев, Е. В. Савватеева-Попова // Молекулярное моделирование: тез.

6-й Всерос. конф. 8-10 апреля 2009 г. Москва / РАН. Отд. наук о Земле. Ин-т геохимии и аналит. химии им. В. И. Вернадского. Моск. гос. ун-т. М., 2009. С. 102.

6. Рогачева, О. Н. Особенности взаимодействия Rp-uAM®S и Sp-цАМФЗ с цАМФ-связывающим сайтом В-домена протеинкиназы А 1а (ПКА 1а) / О. Н. Рогачева // Современная химическая физика: сб. тез. XXI симп. 25 сентября - 6 октября 2009 г. Туапсе. М.: Парк-медиа, 2009. С. 239.

7. Рогачева, О. Н. Квантово-химический анализ ингибирования протеинкиназы А 1а Rp-цАМФБ / О. Н. Рогачева, Е. В. Савватеева-Попова, Б. Ф. Щеголев // XXI съезд Физиол. об-ва им. И. П. Павлова: тез. докл. 19-25 сентября 2010 г. Калуга. М.-Калуга: БЭСТ-принт, 2010. С. 517-518.

8. Рогачева, О. Н. Исследование механизма активации протеинкиназы А 1а / О. Н. Рогачева // 15-я С.-Петерб. ассамблея молодых ученых и специалистов: ан. работ / Правительство С.-Петербурга. Комитет по науке и высшей школе. 2010. С. 98.

9. Рогачева, О. Н. Моделирование конформационных переходов цАМФ-связывающих доменов протеинкиназы А 1а (ПКА 1а) / О. Н. Рогачева, Е. В. Савватеева-Попова, Б. Ф. Щеголев // Молекулярное моделирование: тез.

7-й Всерос. конф. 13-15 апреля 2011 г. Москва / РАН. Отд. наук о Земле. Ин-т геохимии и аналит. химии им. В. И. Вернадского. Моск. гос. ун-т. М., 2011. С. 131.

10. Рогачева, О. Н. Моделирование конформационного перехода А-домена регуляторной субъединицы протеинкиназы А 1а / О. Н. Рогачева // Математическое и компьютерное моделирование в биологии и химии. Перспективы развития: труды междунар. конф. 28-30 мая 2012 г. Казань / Казан. (Приволжск.) федер. ун-т, 2012. С. 135-140.

11. Рогачева, О. Н. Построение модели конформационного перехода А-домена регуляторной субъединицы протеинкиназы А 1а / О. Н. Рогачева, Б. Ф. Щеголев, В. Е. Стефанов, Г. В. Михайлов, Е. В. Савватеева-Попова // Биология - наука XXI века: матер, междунар. конф. 24 мая 2012 г. Москва. М.: МАКС Пресс, 2012. С. 772-774.

12. Rogacheva, О. N. Molecular modeling study of protein kinase A la (PKA la) and cyclic adenosine monophosphate (cAMP) interactions / O. N. Rogacheva, A. V. Popov, E. V. Sawateeva-Popova, B. F. Shchegolev // 2-nd St.Petersburg Intern. Conf. on NanoBioTechnologies NanoBio'08: abstr. June 16-18, 2008. St.Petersburg. SPb.: Publ. House of Polytech. Univ., 2008. P. 126-127.

13. Stefanov, V. E. Computer simulation and quantum chemistry calculations in the analysis of the physical mechanism of the biologically significant activity of nucleotides / V. E. Stefanov, O. N. Rogacheva, A. A. Tulub // 4-th Mosc. conf. on comput. molecular biology MCCMB'09: abstr. July 20-23, 2009. Moscow / Mosc. State Univ. (dept. of Bioeng. and Bioinform., Biol. dept.). State Sci. Centre GosNIIGenetika. Inst. Inform. Transmis. Probl. The Sci. Council on Biophys. Engelhardt Inst, of Molec. Biol. M., 2009. P. 339-340.

14. Rogacheva, O. N. A brief view into protein kinase A la activation process / O. N. Rogacheva // Eur. Cells and Mater. 2010. V. 20., Suppl. 3. P. 215.

15. Rogacheva, O. N. Theoretical modeling of protein-protein and ligand-protein interactions in silico. Molecular mechanism for protein kinase A la A-domain activation / O. N. Rogacheva, V. E. Stefanov, B. F. Shchegolev, E. V. Sawateeva-Popova // Quantitative imaging and spectroscopy in neuroscience: abstr. 1-st Intern, conf. Sept. 17-19, 2012. St. Petersburg - Koltushi / Pavlov Inst. Physiol. RAS, 2012. P. 33-34.

16. Stefanov, V. E. A-domain of protein kinase A la. Molecular dynamics study / V. E. Stefanov, O. N. Rogacheva, B. F. Shchegolev, E. A. Vershinina // FEBS J. 2013. V. 280. Suppl 1. P. 158-159.

17. Stefanov, V. E. Understanding cAMP-induced conformational transition of protein kinase A la A-domain. Role of the invariant R209 / V. E. Stefanov, O. N. Rogacheva, B. F. Shchegolev, E. A. Vershinina, G. V. Mikhailov, E. V. Sawateeva-Popova // Mosc. conf. on comput. molec. biol. МССМВЧЗ: abstr. July 25-28. 2013. Moscow/ Mosc. State Univ. (dept. of Bioeng. and Bioinform., Biol. dept.). Inst. Inform. Transmis. Probl. Engelhardt Inst, of Molec. Biol. Vavilov Inst, of Gen. Genetics. NP "Bioinformatics seminar". The Sci. Council on Biophys. Режим доступа: http://mccmb.belozersky.insu.ru/2013/abstracts/l 76.pdf

18. Rogacheva, O. N. Role of arginine 209 in the conformational transition of the protein kinase A la A-domain / O. N. Rogacheva, V. E. Stefanov, B. F. Shchegolev, E. A. Vershinina, E. V. Sawateeva-Popova // J. Bioinform. Comput. Biol. 2014. V. 12, N2. 1441005.

Подписано в печать 02.03.2015 Формат 60x84 Vie Цифровая Печ. л. 1.0 Тираж 110 Заказ №09/03 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2, Сайт: falconprint.ru)