Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внутриклеточные механизмы сАМР-зависимого проведения регуляторных сигналов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Внутриклеточные механизмы сАМР-зависимого проведения регуляторных сигналов"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОЛШТЕТ СССР ПО НАРОДНОМУ ОБРАЗОВАНИЮ

ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ имени ПАТРИСА ЛУМУМБЫ

На правах рукописи

НЕСТЕРОВА Мария Валентиновна

УДК 577.3: 577.151: 577.152.3: 577.156

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ сАМР-ЗАВИСИМОГО ПРОВЕДЕНИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ СИГНАЛОВ

(03.00.04 — биохимия)

%

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва — 1988

Работа выполнена в лаборатории энзиматической регуляции клеточной активности Института молекулярной биологии АН СССР и в лаборатории медицинской биохимии Института прикладной молекулярной биологии Минздрава СССР.

Официальные оппоненты:

академик АМН СССР, доктор биологических наук, профессор И. П. Ашмарин,

доктор биологических наук, профессор Л. К. Старо-сельцева,

доктор медицинских наук, профессор Н. А. Федоров.

Ведущая организация— 1-й Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени медицинский институт имени И. М. Сеченова.

Защита состоится «о??" » 1989 года

в /5^*часов на заседании специализированного совета Д 053.22.02 при Университете дружбы народов имени Патриса Лумумбы по адресу. 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, медицинский корпус, к. 224.

С диссертацией молено ознакомиться в научной библиотеке Университета дружбы народов имени Патриса Луыумбы по адресу: Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан « »

198^года.

Ученый секретарь специализированного совета

В. Э. ТОРБЕК

0Б1ЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБ01Ы

-- | Актуальность проблемы», Сложны и неоднозначны тонкие ме-:1хШ1Эмы, о помощью которых многоклеточные организмы регулируют и направляют физиологические и метаболические процессы, в условиях постоянно изменяющейся внутренней и внешней среды. Далек путь от оигнала, поступающего из окружающей среды до координированного ответа организма. В ответ на внешние стимулы (химического или нейрогонного происхождения) организм синтезирует и секретирует гормоны, которые, в свою очередь, воздействуя на органы-мишени, контролируют их функциональную активность. Результатом этого могут явитьоя оинтаз а распад макромолекул, увеличение или уменьшение окорооти пролиферации и другие, самые различные изменения: физиологического состояния метки.

Известно, что внутриклеточным поородшвюм ("вторичным мессендакером") действия целого ряда гормонов служат циклические нуклеотлды, которые оказывают большое влияние на функцио-ниропанио япвого организма а целом и кавдой метки в отдельности. Изучение молекулярных механизмов сАМР-зависимого проведения гормонального сигнала представляет собой большой научный и практический интерес. Действительно, циклические нуклеотидн» являясь внутриклеточными проводниками основных координирующих систем организма (нервной и эндокринной), участвуют в регуляции фундаментальных процессов жизнедеятельности. В настоящее время предполагается, что все эффекты сАМР у эукариот опосредованы активацией сАМР-зависимой протекнкинаэы ( Кио, Сгоеп-вага , 1969 ). Таким образом, этот фермент занимает ключевую позицию в системе биологической регуляций, В связи с этим изучение механизмов контроля активности оАМР-зависимой протеинки-назы и биологии этого фэрмонта представляется исключительно важным для понимания внутриклеточных механизмов проведения ре-гуляторных сигналов. К моменту начата диссертационной работы практически отсутствовали оладония о молекулярных механизмах, сопрягающих систему сАМР-завясимого фосфорилироватм с биологической функцией клетки. Настоящая работа представляет собой перпое систематическое исследование меха1Шзмов, с помощью которых оАМР-зависимые протешшшазц участвуют в регуляции функционального состояния клетки.

Цель к задачи исследования. Основной целью работы было выяснение внутриклеточных механизмов сШР-зависимого проведения регуляторннх сигналов..

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

- изучить механизмы регуляции активности сАМР-зависимой протеинкиназы и факторы, влияющие на структурно-функциональное состояние фермента;

- исследовать закономерности транслокащш сАМР-зависимой протеинкиназы в ядро, роль сАМР в этом процессе и выявить влияние на транслокацию различных функциональных состояний клетки;

- выяснить механизмы взаимодействия субъединиц протеинкиназы со структурными элементами генома и подойти к установлению природы акцепторного участка для сАМР-зависимой протеинкиназы в ядре;

- выявить влияние сАМР-зависимой протеинкиназы и ее

. субъединиц на матричную активность хроматина, идентифицировать ядерные белки - субстраты протеинкиназы и установить влияние их фосфорилирования на матричные свойства хроматина;

■ - исследовать действие сАМР-зависимой протеинкиназы на ■ синтез ДНК, РНК и белка на примере биологических систем, обладающих различной пролиферативной активностью; выяснить последствия этого действия на функционирование клетки в целом;

- выявить белок - конечный продукт сАМР-завиоимой экспрессии генома эукариот и установить его биологическую роль;

- разработать схему функционирования сАМР-зависимой протеинкиназы II типа в клетке, показать роль связывания сАМР ре-гуляторной субъединицей и сАЫР-зависимого фосфорилирования в проведении гормонального сигнала и регуляции клеточной активности.

Научная новизна работы. Основным результатом работы явилось создание модели функционирования сАМР-зависимой протеинкиназы II типа в клетке, на основе которой продемонстрировано значение различных механизмов регуляции активности протеинкиназы для проявления биологической функции этого фермента. Показана роль связывания сАМР регуляторной оубъедшшцей и сАМР-зави-симого фосфорилирования в регуляции функционального состояния клетки.

Установлена структурная организация сАМР-зависимой проте-

инкиназц и субъедиггац фермента. Изучены механизмы, регулирующие активность протеинкиназы. Для сАМР-зависимой протеишсиназы пз мозга обнаружена реакция автофосфорилирования, что позволило отнести этот фермент к оАМР-зависпмым протеинкиназам II типа. Впервые показано, что фосфорилирование гистона Н1 и автофосфо-. ротирование происходят с участием одного и того же активного центра каталитической субъединицы; На основе этого предложена , схема реакции.

Установлено, что связывание сАМР, реакция автофосформирования, ограниченный прогеолиз регуляторной субъединицы влияют на ряд свойств протеинкиназы, связанных с проявлением ее биологической активности. К таким свойствам относятся компарт-ментализация протеинкиназы, процесс перехода фермента из цито- . плазмы в ядро, взаимодействие с окрунающимл макромолекулами, субстратная специфичность.

Получены экспериментальные доказательства роли компартмен-тализации сАМР-зависимой протепнкиназы, в частности, ее регуляторной субъедшшцы в регуляции клеточных процессов. Наруиения, возникающие при неопластической трансформации клетки, непосредственно затрагивают транслокацию регуляторной субъединицы в ядро и связывание этого бежа со структурными элементами генома; Впервые выявлена возможная природа акцепторного участка сАМР-связывавщего компонента в ядре.

Показана структурно-функциональная основа субстратной специфичности сАМР-зависимой протеинкиназы. Продемонстрирована возможность участия регуляторной субъединицы протеинкиназы в регуляции транскрипции. Впервые идентифицирован специфический белок, синтезируемый клеткой в ответ на транслокацию сАМР-свя-зывающего компонента протеинкиназы в ядро. Разработан метод выделения этого белка в гомогенном состоянии и показано его ' влияние на синтез ДНК клетками ЗТЗ.

Научно-практическая ценность работы. Результаты работы проливают свет на проблему проведения регуляторных сигналов, закладывают основу для дальнейшего изучения механизмов регуля-" ции клеточных функций и имеют не только важное теоретическое значение, но и практическое приложение. Работа служит основой для нового перспективного направления исследований биологической роли ферментов в раж ах представлешгй о каскадных механизмах функционирования систем регуляции клеточной активности.

Результаты, полученные в работе, позволили определить биохимические изменения при опухолевой трансформации сАМР-за-висшого типа и предложить возможный механизм ев регрессии. Показано, что типы опухолевых клеток различаются по способности к транслокации сАМР-завискмой протеинкиназы в ядро и акцепции этого форманта сгруктурнши элементами генома. Часть работы, посвященная изучению этого вопроса, имеет исключительно важное практическое значение. Метод гисторадиографической оценки проникновения сАМР-овязывающего компонента в ядро и взаимодействия этого белка о хромосомами, а такие результаты, полученные при его применении, могут быть использованы в дифференциальной диагностике различных опухолей,

Б связи с тем, что диссертация посвящена изучению функционирования системы регуляции клеточной активности, то результаты ее имеют не только теоретическое значение, но и слу-кат подходом к изучению патогенеза различных метаболических нарушений и их коррекции. Эти исследования открывают широкие возможности для моделирования системы гормональной регуляции и испытанию синтетических биологически активных веществ. Овладение такими, подходами позволит осуществлять направленный контроль процессов жизнедеятельности, что исключительно важно для целей практической медицины и сельского хозяйства.

Данные, полученные в работе, вошли в монографии и применяются целым рядом научно-исследовательских учреждений СССР. Отдельные разделы диссертационной работы используются при чтении курсов лекций на кафедре биохимии биологического факультета ШУ им. М.В. Ломоносова.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были долоаоны и обсукдены на III конференции ФЕБО (Дрезден, 1978), 1У Всесоюзном биохимическом съезде (Ленинград, 1979), Ш Всесоюзном симпозиуме "Циклические нуклеотиды" (Канев, 1980), научных семинарах Лаборатории клеточной активности ЧНР (Италия,Рим, 1981), 4-ом симпозиуме биохимических обществ СССР и 1ДР (Таллин, 1981), Международном симпозиуме по регуляции активности ферментов (США, Индианаподис, 1981), Украинском республиканском окшозиуые "Биохимические механизмы регуляции генетической активности" (Канев, 1982), ЗУ Всесоюзном симпозиуме "Циклические

нуклеотидн" (Минск, 1982), научной конференции Секции биохимии молекулярной и клеточной биологии Корнеллского университета (США, Итака, 1982), IX Всесоюзной конференции по биохимии нервной системы (Ереван, 1983), ХУ1 конференции ФЕБО (Москва, 1984), У1 Советско-американском симпозиуме "Метаболизм миокарда" (Баку, 1984), У Всесоюзном симпозиуме "Циклические нуклеотвды и система регуляции ферментативных реакций" (Рязань, 1985), Ш Всесоюзной конференции "Клеточный цикл растений" (Паланга,

1986), У Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), П Европейском конгрессе по клеточной биологии (Будапешт, 1986), Всесоюзном совещании "Биология клетки в культуре" (Ленинград,

1987).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Диссертация изложена на367" страницах, содержит 8 таблиц и рисунков. Список цитированной литературы включает ^/¿"наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Механизмы регуляции активности сАМР-завддвдоД

шшшшш

В связи с тем, что оАЙР-зашсимые протеинкиназы занимают одно яз кяючошх мест на путях биологической регуляции, то в клетке существует сложная система контроля активности этого фермента. Эта система определяет качественные и количественные характеристики функционнроВйния йА14Р-зависимой протеинкиназы, а шесте с этим и всей системы циклических нуклеотидов. Проявление активности, направленность действия, специфичность, компарт-ментализация сАМР-зависимой протеинкиназы и ее субъединиц определяется не только регуляторной ролью сАМР, но и шышм рядом других факторов. В частности, в настоящее время признается регулирующая роль специфического протеолиза регуляторной субъединицы, термостабильного ингибитора каталитической субъедингаш и процесс автофосфорияированля протеинкиназы, который монет влиять на свойства фермента и его субъединиц.

Среди описанных в литературе различий между двумя типами сАМР-зависимнх протеинкиназ автофосфорилярование является од-

5

ним из самих ванных. Выделенная нами ранее сАМР-зависимая про-теишишаза из мозга свиньи (Neвterova ег а1., 1975 ) по основным своим характеристикам (характер кривой элюции с ДЭАЭ-цел-лшозы, слабая диссоциация на субъединицы в присутствии сАМР, более высокий молекулярный вес регуляторной субъединицы и другим) также может быть относена к протеинкиназам II типа.

Инкубация холофермента с у-2Р-АТР в присутствии дитио-треитола и ионов Ме2+при 30° приводит к включению радиоактивного фосфата в кислотонерастворимую фракцию, что указывает на способность холофермента осуществлять автофосфорилирование, Необходимо было установить, в какую из субъединиц происходит включение фосфата. Ранее в нашей лаборатории была получена фос- ■ фоформа каталитической субъединицы, являющаяся промежуточным продуктом в фосфотрансферазной реакции. Был также идентифицирован остаток гистщщна, как акцептор фосфата в активном центре каталитической субъединицы (КосЬе «соу ег а1., 1976 ). Однако нам представлялось маловероятным образование фосфоформы каталитической субъединицы в этих условиях в качестве конечного ' продукта реакции автофо сформирования вследствие быстрого гидролиза фосфоимидазольной связи при низких значениях рН. Электрофорез в денатурирующих условиях меченого фосфохолоферманта и холофермента с ковалентно блокированным 8-азидо-%сАМР сАМР-связывающим центром показал, что акцептором фосфата в реакции автофосфорилирования является регуляторная субъединица.

Представлялось интересным изучить действие автофосфорихи -рования на связывание сАМР и активацию фосфотрансферазной реакции. В опытах по изучению реакции фосфорилирования гистона Н1 использовались эквимолярные концентрации обеих форм холофермента, так как активация холофермента зависит от его концентрации в инкубационной среде. Оказалось, что фосфохолофермент обладает большей способностью к активации под действием сАМР, особенно в диапазоне низких концентраций циклического нуклеотвда, Ка для фосфохолофермента (2-КГтД) меньше, чем Ка для дефос-фохолофермекта (8«Ю~%). Результаты по связыванию 3Н-сАМР обеими формами холофермента показали, что, как и в случае активации фосфотрансферазной реакции, фосфоформа холофермента ока-'залась более чувствительной к циклическому нуклеотиду, т.е. в данном случае обладает лучшей способностью связывать %-сАМР, чем дефосфоформа. Кй для фосфохолофермента (1«Ю~^0 меньше.

чем Kd для дефосфохолофермента (7,5 »10"%) и отражает большую чувствительность фосфоформы к cAI.IP.

Далее било необходимо установить, идентичны ли активные центры каталитической субъединицы, осуществляющие фосфотрансфе-разную реакцию и авгофосфорилирование. После инкубации Р-каталитичаской субъединицы с регуляторной субъединицей в условиях протекания реакции автофосфорилирования и последующего разделения субъодиниц на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в присутствии сAMP 3^Р-радиоактивность была обнаружена во фракциях, обладающих сАМР-связывакщей активностью. Одновременно отмечалось отсутствие радиоактивности во фракциях, обладающих фосфотранс-феразной активностью, соответствующих каталитической субъединп-це. Из этого следует, что разделению на субъединицы подвергался вновь образовавшийся холофермент, содержащий радиоактивный фосфат уже но в каталитической, а з регуляторной субъединице, т.е. при инкубации фосфоформы каталитической субъединицы с регуляторной субъединицей происходит перенос фосфата на регуля-торную субъединицу.

На основе подученных данных мояно утверздать, что фосфо-трансферазная реакция и реакция автофосфорилирования . протекают с участием одного и того яе активного центра, содержащего остаток гиствдииа, причем перенос фосфата с АТР на регуляторпуа субъедигащу может осуществляться через образование фосфоформы каталитичоокой субъединицы в состава холофермента. Регуяяторная субъедишща, являясь конечным акцептором фосфата, определяет только доступность активного центра для Mg • АТР, не влияя на механизм расщепления фосфоэфирной связи в молекуле АТР. В целом реакции автофосфорилирования можно условно разделить на несколько дискретных этапов: I) связывание АТР в активном центре каталитической субъедшшцы в составе холофермента; 2) расщепление фосфоэфирной связи в молекуле АТР и акцепция фосфата на остатке гистишша в активном центре каталитической субъединицы, при этом освобождается АДР и 3) собственно перенос фосфата с остатка гис-тидина на остаток серина регуляторной субъединицы (рис. I).

Таким образом, нами показано, что холофермент и его составные компоненты могут находиться в двух дискретных формах: фосфо-рилированной и нефосфорилированной. Переход белков из одной формы в другую сопровождается изменением их функционального состояния, в частности, изменяется способность холофермента связи-

Рис. I, Схема реакции автофосфорилирования с - каталитическая субъединица л - регуляторяая субъедшшца

вать сАМР, способность субъединиц к диссоциации под действием сАМР и к реассоциации в отсутствии сАМР. Естественным является предположение, что такое изменение свойств протеинкиназы вызвано определенными превршдашями в структуре как свободных субъединиц, так и их неактивного комплекса - холофермента. В свете представлений о возникновении конформационных превращений в молекуле белка в результате модификации какого-либо аминокислотного остатка(ов) шш связывания низкомолекулярного лигавда нами была предпринята попытка зарегистрировать и изучить конформаци-онные превращения в холоферменте и его компонентах после их фосфорилирования, а также при связывании сАМР с фосфо- и дефос-фоформами протеинкиназы. Для этой цели был использован такой высокочувствительный метод, как метод кругового дихроизма. При этом было показано, что автофосфорилированле холофермента или каталитической субъединицы не приводит к глобальным перестрой-•кам, затрагивающим вторичную структуру этих белков. Изменения во вторичной структуре наблюдаются однако, в свободной фосфори-лированной регуляторной субъединице, по сравнению с нефосфори -лированной формой этого белка. Диссоциация фосфохолофермента при связывании сАМР сопровождается прочной фиксацией сАГЛР в сАМР-

связывающем центре регуляторной оубъединицы в анти-конформации.

Нине будет показано, как связывание сАМР, реакция автофос-форилирования, ограниченный протеолиз регуляторной субъединицы' влияют на ряд свойств протеинкиназы, определяющих ее роль в проведении регуляторного сигнала.

2. Транслокация сАМР-зависимой протеинкиназы и ее оубъединиц в ядро

Описанные вше механизмы регуляции активности сАМР-зависимой протеинкиназы имеют непосредственное отношение к проявлению биологической.функции фермента, влияя на самые различные свойства белковой молекулы. В связи с тем, что активация оАМР-зависимых протеинкиназ имеет своим следствием индукцию синтеза FHK ( Chrapkiewicz et al. , 1982, Jungmann et al. , 1983), и, в конечном счете, синтеза различных белков, возникает вопрос, каков же молекулярный механизм регуляции циклическими нуклеотидами синтеза биополимеров, в частности, на уровне процессов, протекающих в ядре. В настоящее время показано, что сАМР-зависиыые протеинкиназы транслоцируются из цитоплазмы в ядро. Из этого следует, что сАМР, аналогично стероидным гормонам, транслоцируется в ядро с помощью специфического рецептора - регуляторной субъединицы сАМР-зависимой протеинкиназы. Если непосредственная функция каталитического компонента-протеинкиназы, как фактора, фосфоршшрующего белки, более или менео ясна, то биологическая роль.регуляторной субъединицы в ядра неизвестна. В настоящее время признается, что каталитические оубъединицы из разных тканей идентичны друг другу, а ре-гуллторные оубъединицы протеинкиназ различаются по своим свойствам ( Bechtel , Beavo , Kreta, 1977). В связи с этим представляется весьма вероятным, что специфика функционирования сАМР-завнсимых протеинкиназ заключена в их регуляторных субъединицах. В частности, процесс транслокации протеинкиназы и специфическая посадка фермента в соответствующем акцепторном участке хроматина может быть тленно связан с транспортом и посадкой в ядре регуляторной субъединицы. В свете современных данных, не исключена возмошюсть независимой функции регуляторной субъединицы в геноме эукариот по типу сАМР-связывающего беЛКа Е . coli ИЛИ рецепторов СТерОИДОВ ( Kailos , Lea, 1978, Conotantinou et al.. 1985 ). В связи с этим возник вопрос О

механизмах транслокации сАМР-связывающего компонента протеин-киназы в ядро и, в частности, о роли сАМР в этом процессе.

Для исследования вопроса была применена культура нормальных фибробластов мыши (Л1Н ЗТЗ ) и фибробластов со сниженным уровнем сАМР в результате вирусной трансформации ( 2У40 - ЗТЗ). На рис, 2 (А, Б) показана транслокация экзогенной,мечонвэй йодом, регуляторной субъединицы при введении ее в клетки ЗТЗ с помои5Д) теней эритроцитов , Наш также было установлено,

Ч

t

•».' <"■ ' I

Ч •'•.,/ . /

V

V ... ( S'A*}

, ▼ * • • IV * <

% • 1

I • , • • *

*

1

¡4L ' 6

Рио, 2. Микрофотографии клеток nih зтз через

6 часов (А) и 12 часов (Б), после введения_____

регуляторной субъединицы. Увеличение 2800 раз*.

что для культуры зтз наблюдается не только четкая транслокация регуляторной субъединицы в ядро, но и акцепция этого белка на метафазных хромосомах. В то же время транслокация меченой регуляторной субъединицы в ядра и акцепция на хромосомах, трансформированных вирусом sv40 клеток nih 3t3( sv40-3t3 ) практически отсутствует. Это может свидетельствовать о том, что в клетках sv40 _ зтз нарушена система транспорта протеинкиназы через мембрану. При введении в систему регуляторной субъединицы совместно с сАМР значительно восстанавливались проникновение меченого белка в ядро и акцепция его на метафазных хромосомах. Это может означать, что трансформация клеток зтз вирусом sv40 не приводит к изменению специфических мест акцепции регулятор-рой субъединицы на хроматине, а вызывает, по-видимому, изменение системы генерации сАМР, которая связана с транспортом регуляторной субъединицы в ядро. На основании этих данных можно предположить, что транслокация в ядро регуляторной субъединицы

осуществляется независимо от присутствия каталитической и зависит от специфического взаимодействия регуляторной субъедини-цн с молекулами оАМР.

В связи с такими интересными особенностями трансло- • кации. регуляторной субъединицы в ядро и влиянием на этот процесс опухолевой трансфорлации клетки было целесообразно сравнить процесо транспорта этого белка в ядро и акцепцию его на хромосомах для клеток, подвергшихся неопластическому изменению другого типа. Таким образом, были исследованы эти явления для случаев спонтанного рака (клетки КВ, НеЬа,Нер ), Оказалось, что в таких клетках регуляторная субъединица проникает а ядро, по не акцептируется хромосомами. При добавлении сАМР результаты не изменяются. Это даот основание предполагать, что взаимодействия регуляторной субъв&тщи о генетическим материалом клеток типа КВ отличается от нормальных и трансформированных вирусом клеток.

Таким образом, в клетках КВ нарушения непосредственно вы-ра-каются в изменении генетического материала в отличие от клеток 3^40 _ ЗТЗ , где нарушена система генерации сАМР, тесно связанная с транспортом регуляторной субъединпцы через ядерную мембрану.

Из приведенных данных можно предположить, что компартмен-тализация сАМР-зависимой протеинкиназы, в частности, ее регуляторной субъединицы, играет важную роль в процессе жизнедеятельности, а нарушения, возникающие при неопластической трансформации, существенным образом связаны с изменением транслокации регуляторной субъединицы в ядро и акцепции ее на структурных элементах генома.

3. Взаимодействие каталитической и регуляторной субъединиц сАМР-зависимой протеинкиназы со структурными элементами генома

В связи о изложенными в предыдущей главе результатами по транслокации протеинкиназы в ядро и акцепции субъединиц фермента метафазными хромосомами встает вопрос о механизмах действия протеинкиназы внутри ядра, в частности, о взаимодействии проте-ишшпазн с ДНК и ядерными белками, о природе акцепторных участков хроматина для сАМР-зависимой протеинкиназы. Настоящий раздел посвящен изучению этого вопроса.

Инкубация моченой ДНК о нитроцеллюлознши фильтрами, содержащими каталитическую и регуляторную субъедишщц, показала, что каталитическая субъедишща взаимодействует с ДНК из мозга, а регуляторная субъединица с ДНК не взаимодействует. Протеоли-тический фрагмент регуляторной субъединицы с молекулярной массой 35 ООО Да, акцептирующий сАМР, также не обладает способностью связываться с ДНК. Добавление в среду инкубации сАМР до концентрации 10~% не приводит к взаимодействию регуляторной оубъедишщы и ее протеолитического фрагмента с ДНК.

Для изучения взаимодействия регуляторной субъединицы с ядерными белками был использован метод белок-белкового переноса. При этом удалось установить, что регуляторная субъединица в соответствующих условиях взаимодействует с белком, схожим по электрофоретической подвижности и параметрам элюции из ядра с гистоном Ш, и тремя кислыми ядерными белками меньшего молекулярного веса. Возможно, эти белки образуют тот участок хрома. тина, который специфически акцептирует сАМР-связывающий компонент протеинкиназы. Для того, чтобы определить, как они располагаются в хроматине относительно друг друга, регуляторной . субъединицы и гистонов, мы применили метод сшивания ядер би-. функциональным реагентом метид-4-меркаптобутиримидатом после введения в них меченой регуляторной субъединицы и последующего анализа полученных белков электрофорезом в полиакрнламидном геле с додецилсульфатом натрия в двух направлениях, что дает возможность определить молекулярную массу соседствующих белковых компонентов. Результаты этих экспериментов показали, что регуляторная субъединица в хроматине вступает в контакт с белками с молекулярной массой 30 ООО Да и 15 ООО Да, а также не исключено взаимодействие с белками с Мг между этих значений. Тагам образом, можно предположить, что эти белки образуют акцепторный участок сАМР-связывавдего компонента сАМР-зависимой протеинкиназы в ядре. Важным моментом является то, что фрагмен- • ты регуляторной оубъедишщы не сшиваются с каким-либо белком хроматина, то есть они функционально не активны в ядре и не • участвуют в белок-белковых контактах.

4. Влияние сАМР-завясимой протеинкиназы на матричные

свойства хроматина

В связи с приведенными выше результатами по изучению транс-докации сАМР-зависимой протеинкиназы в ядро и взаимодействию 12

этого фермента и ого субъединиц со структурными элементами генома встает вопрос о функциональной роли этих процессов. Взаимодействие исследуемого нами фермента с ДНК и балками ядра может вести к изменению структуры генетического материала клетки. Следствием этого является, в частности, изменение матричных свойств хроматина, тем более, что в настоящее вромя известно, что действие многих горюнов связало о изменением уровня синтеза IEK клеткой. В опытах, представленных в настоящей главе, мы попытались исследовать in vitro влияние сЛМР-зависимой протеинкиназы и ее субъединиц на матричные свойства хроматина, используя различные модельные системы.

При добавлении протеинкиназы в стандартную инкубационную смесь для РНК-полшеразной реакции, осуществляемой РНК-полиме-разой на хроматине мозга свиньи, наблюдалось увеличение общей матричной активности хроматина. Еоли в качестве матрицы использовали ДНК, то эффэкта не наблюдалось. Таким образом, для проявлетш действия протеинкиназы на матричную активность хроматина необходимы ДНК-белковые и белок-белковые контакты мезду ДНК и ядерными белками, РНК-полимеразой и протеинкиназой.

В связа о тем, что сАМР-зависимая протеинкиназа состоит из двух функционально различающихся оубъединиц, при этом каждая из них проникает в ядро и взаимодействует со структурными элементами хроматина, то встает вопрос, какая именно из субъе-дшпщ вызывает приведенный вше эффект. Для выяснения этого пооледние иопытывались-по отдельности.

Так как биологическое действие каталитической субъедшшцы опосредуется фосфорилированием белков, то предварительно были выявлены субстраты сМР-зависимого фоофорилярования в ядре. Ранее было установлено ( Neaterova et ai., 1975 ), что каталитическая субъединица сАМР-зависголой протеинкиназы из мозга фосфорижрует in vitro лизин-богатые гистона - HI, Н2а, Н2Ъ,-При экстракции белков из ядра оказалось, что потенциальными субстратами для сАМР-зависимой протеинкиназы являются многие белки. Фосфорилировшгае целого ядра показало, что субстратом каталитической субъедшшцы является гистон HI. Таким образом, присутствие ДНК и образование соответствующих ДНК-белковых комплексов существенно влияет на спектр субстратов, фосфоршшруе-1.шх протеинкиназой. В пользу этого также говорят опыты по фос-форпллрованию гистонов в отсутствии ДНК и в присутствии ДНК (рис. 3).

» о

HI

,Н2Ъ >Н2а

0,1 0,2 0,3 0,4 содержание ДШ в пробе (иг/ил)

Рио. 3, фосфорилирование гистонов каталитической субъедишщей сАМР-зависимой протеинкиназы в присутствии ДНК

Дшггистона HI мы наблюдали некоторое ингибирование фосфо-' рилирования в присутствии ДНК. Для гистонов Н2а и Н2ь ингит бирование за счет ДНК, было практически полным. Таким образом, присутствие ДНК определяет доступность белковых субстратов для каталитической субъединицы протеинкиназы, которая in vitro проявляет достаточно широкую специфичность. В системе in vivo специфичность этого фермента может быть крайне ограничена аа ачет ряда факторов, в частности, взаимного расположения субстратов и самого фермента. Такие особенности фосфорилирования белков в растворе и в составе ДНК-белкового комплекса сказываются также на влиянии каталитической субъедишщы на матричную активность хроматина.

При добавлении гомогенной каталитической субъединицы в стандартную инкубационную смесь для ГНК-полимеразной реакции, где матрицей служил хроматин мозга свиньи, изменений общей матричной активности хроматина не обнаруживалось. Однако, если фосфо-ршшровали ; ядра, то матричная активность выделенного из них хроматина оказалась на 20$ больше матричной активности контрольного. Это может объяс11яться различиями в структурной организации генетического материала ядер и выделенного хроматина, что подтверждается также фосфорилированием белков в этих двух системах. Такие различия могут, в частности, сказываться в том, что in vivo протеинкиназа осуществляет более тонкую, целена-

правленную регуляцию, например, фо сформирует . только гас тон Щ, а на три гнотоиа, как в системе in vitro. Различия, полученные нами для ядор и хроматина, могут объясняться также наличием в ядрах дополнительных компонентов, необходимых для осуществления протешшшазой регулирующего влияния, т.е. некоторых факторов или посредников, теряемых в ходе выделения хроматина. Для сАМР-овязывагацего компонента протеишишази неизвестны механизмы влияния на процессы, протекающие в ядре. Иоходл из приведении* в настоящей работа данных по транслокации этого белка в ядро я шецепцлп его ядерными балками, а также данных по топоизомеразиой активности регуляторной субъедишщы ( Con-stantinou et al«, 19S5), t,M провели эксперименты по изучению влияния регуляторной субъедптзды на матричные свойотва хроматина.

Гомогенная регулягориая оубъедтаща сАМР-зашоимой протв-инкинаэы при добавлении в стандартную инкубационную смооь для РНК-полимеразной реакции, вызывала значительной увеличение об-щей_матричной активности хроматина. Чтобы выяснить, происходит ли стимуляция процесса трштршщии регуляторной еубъединицай sa счет увеличения числа огагтсякруамшс цепей РНК или за счет их более быотрого роста, проводились опыты, в которых изучалось число мест инициации РЖ-синтеза. На рис. 4 представлены две кривые титрования ЙЖ-полимеразы матрицей (хроматином): кривая I соответствует случаю без добавления регуляторной субъедишщы, кривая 2-е регуляторной субъединицей.

5

хроматин,

10 15 мкг дак

Рис. 4. Кривые титрования РНК-полимеразы матрицей

(хроматином): I - без регуляторной субъединицы, 2-е добавлением регуляторной субъединицы.

Из сравнения кривых на рис. 4 следует, что число мест инициации синтеза Н1К возросло в присутствии регуляторной субъединицы приблизительно на 50$. Таким образом, изменение общей матричной активности обусловлено изменением числа синтезируемых цепей РНК для одного и того же количества матрицы.

Эффект стимуляции транскрипции на хроматине следует признать специфичным, а но случайным, определяемым лишь кислыми свойствами регуляторной субъединицы протеинкиназы, поскольку он практически полностью снимается при фосфоршзированш регуляторной субъединицы в реакции автофосфорилирования.

5. Действие микроинъекций оубъединиц сАМР-зависимой протеинкиназы на макромолекулярные синтезы зародыша вьюна ( М18вигпцв ГоввШв Ь.)

Предыдущие.главы были посвящены механизмам активации сАМР-аависимой протеинкиназы, транслокации фермента в ядро, механизмам взаимодействия субъединиц протеинкиназы со структурными элементами генома. Однако встает вопрос, каковы «е последствия проникновения протеинкиназы в ядро и взаимодействия фермента о ДНК и ядерными белками для жизнедеятельности клетки? Выяснению этого посвящены настоящая и последующая главы работы.

Для изучения действия сАМР-зависимой протеинкиназы и ее оубъединиц на процессы синтеза ДНК, ШК и белка нами были применены различные методы введения оубъединиц протеинкиназы в клетки и.проведен анализ синтеза соответствующих макромолекул. Исследования, представленные в настоящей главе, поовящаны влиянию сАМР-зависимой протеинкиназы на быстро пролиферирующую систему - развивающийоя зародыш после оплодотворения яйцеклетки.

Проводились ыикроинъекции веществ в развивающийся зародкд вьюна на стадии 2-х бластомеров в цитоплазму одного из бласто-меров, что давало возможность отбирать для экспериментов зародыш, приступившие к нормальному развитию.

В зародышах вьюна после оплодотворения через каждый час измеряли уровень сАМР. Согласно получанным результатам, развито зародышей вьюна .сопровождается чередованием процессов спада и подъема в уровне сАМР. Таким образом, изменение уровня сАМР отражает переход клеток из одного состояния в другое - от покоя к пролиферации, от синхронного деления к асинхронному и диффо-рекцировкв, 16

Ht

-л

Бклпчение Н-тшидина

О Д CD M О1

о ч

ё s

•tí

g

u? 03 S

s

in

I. О

СО

включение %-уридина (импт1СР*/ыин на 6 зародышей)

о

включение ^Н-лейцина о

При введении регуляторной субъодшкцц в зародшш вьюна интенсивность синтеза РНК достоверно не отличается от интенсивности синтеза РНК в контрольных зародышах вплоть до 10-го часа развития. Однако после 10 часа развития интенсивность синтеза РНК у зародышей, инъецированных регуляторной субъединицей, заметно возрастает и становится вше контрольного. Таким образом, действие регуляторной субьедишзга на процессы синтеза РНК у развивающихся зародышей вьюна проявляется после 10-го часа развития (стадия гаструлы) и выражается в активации синтеза НПС. Это может быть объяснено тем, что пооло введения регуляторной субъединицы в клетки зародыша она участвует в двух процессах: во-первых, ингибирование каталитической субъединицы эндогенной сАМР-зависимой протеинкиназы, во-вторых, активация процесса транскрипции непосредственным действием на генетический аппарат клетки.

При введении каталитической субьединицу в развивающийся зародыш вьюна характер кривой синтеза белка по сравнению с контролем практически не меняется, интенсивность синтеза белка значительно снижается (рис. 5Б). У зародышей, инъецированных регуляторной субъединицей, интенсивность синтеза белка практически не отличаяаоь от контрольного уровня. Однако резкий подъем белкового синтеза, наблюдаемый в контроле после 8-го часа развития, у зародышей, инъецированных регуляторной субъединицей, шел место уне после 7-го часа развития. По-видимому, введение регуляторной субъединицы ускоряет синтез белков в период перехода зародила от стадии поздней бластулы к стадии гаструлы. Активацию синтеза белка регуляторной субъединицей на 8-ом часу развития зародышей можно объяснить способностью регуляторной оубъединицы илгибнровать эндогенную каталитическую субъединицу, либо способностью регуляторной субъединицы активировать процесс транскрипции.

Введение каталитической субъединицы приводит к резкому снижению скорости сйнтеза ДНК у развивающихоя зародышей по сравнении с контрольными (рис. 5В), У зародышей, инъецированных регуляторной субъединицей, наблюдается задержка синтеза ДНК по сравнению с контрольными зародышами, а затем резкая активация синтеза ДНК на стадии средней бластулы (8 часов развития). Полученные нами данные позволяют говорить о возможности протекания нескольких процессов о участием регуляторной субъединицы: I) ингибиро-

еание свободной эндогенной каталитической субъединицы, 2) свя-зывашга cAI.ÎP, 3) действие на процессы, связанные о синтезом ДНК. Как отмечалось вше, повышение уровня сАИР в клетке, приводящее к активации сАМР-зависимых протеинкиназ, ингибирует синтез ДНК. Таким образом, регуляторная субъединица, связывая сЖР, монет понизить уровень последнего, в клетке. Кроме того, регуляторная субъединица способна ингибировать активность свободной эндогенной каталитической субъедшшцы, В итоге эти два ' процесса могут привести к активации синтеза ДНК. С другой стороны, действие регуляторной субъединицы на процессы транскрипции может приводить к накоплению в цитоплазме белковых факторов, вызывающих активацию синтеза ДНК на определенных этапах • развития зародыша вьюна. Тот факт, что после 10-го часа развития уровень синтеза ДНК у зародышей, инъецированных регулятор- • ной субъедшшцей, падает и к 12-му часу достигает контроля, может быть объяснен, в частности, тем, что регуляторная субъединица подвержена активному протеолизу и к это!лу времени элиминируется из системы.

6. Влияние субъединиц сАМР-завискмой протеинкиназы на синтез белка клетками nih зтз

Выше бшга описаны результаты опытов по микроинъекциям субь единиц сАМР-завистаой протеинкиназы II типа в активно про-лиферирующие клетки зародыша вьюна. Настоящая глава посвящена • влиянию того же фермента на синтез белка клетками, находящимися в покоящемся состоянии в монослое. 1

На культуре клеток nih зтз в норме и при трансформации ви- I русом sv40 изучали включение С-^-аминокислот в белки до и после введения в клетки регуляторной субъединицы в составе теней эритроцитов. Анализ белкового состава цитозоля проводили методом двумерного электрофореза в полиакриламидном геле по 0'Фар- . релу ( о'Farreii, 1975 ). В случае, если в культуру клеток вводили рвгуляторную субъединицу сАМР-завиоимой протеинкиназы II типа существенных изменений в спектре синтезируемых белков через 4 часа на наблюдалось, за исключением появления одного дополнительного белкового пятна на геле после радиоавтографии. Новый белок назван PI5. Таким образом, через 4 часа после введения регуляторной субъединицы, в то время, как только начинается синтез белка на вновь индуцированных матрицах, появляется

новый специфический продукт, отсутствующий в контрольных клетках. 19

На рис. 6А показана картина двумерного электрофореза балков цятозоля глоток ЗТЗ через 15 часов после введения С'^-слщ-поглолот; В клетках, инкубированных о регуляторной субъадкни-цой, о точение 15 часов количество белка PI5 существенно возро-оло (рио# 6Б). Более того, появился еще целый ряд менее интенсивных белковых пятен. Таким образом, в ответ на введение гомогенной рогуляторцрй субъединицы оАМР-зависимой протеинкиназы • II типа, клогка синтезирует целый ряд белков, отсутствующих в контроле и, в частности, белок PI5; При введении фосфофорыы и протеолитичзс1ШХ фрагментов регуляторной субъединицы изменений в спектре синтезируемых белков не наблюдается.

Рис; 6; Белки цитозоля клеток ЗТЗ через 16 часов после введения: А) (^-аминокислот, Б) (^-аминокислот и регуляторной субъединицы

По данным двумерного электрофореза были определены некоторые физико-химические характеристики белка PI5. Молекулярная масса белка оказалась равной 15 ООО Да, а изоэлектрическал точка - 6,3,

По представленным в этом разделе данным видно, что введение в клетки регуляторной субъединицы влияет на синтез белка. Однако механизм такого действия регуляторной субъединицы остается неизвестным. 3 частности, не ясно, на каком этапе оказывается это действие, на стадии синтеза белка или уне на стадии синтеза РНК. Эксперименты о клетками, трансформированными вирусом sv40 , позволяют в какой-то мера ответить на эти вопросы. Спектр белков, синтезируемых в клетке SV40 - зтз, значительно, шире, чем в норде. Двумерный электрофорез обнаружил а области белков с низкой молекулярной массой наличие белка по своему по-, лояенкю соответствующему PI5. Изучение физико-химических свойств показывает, что его молекулярная масса равна 15 ООО Да, а изоэлектрическая точка - 6,3 (белок был назван PI5aV).

При введении в клетки sv40 - зтз регуляторной субъединицы ,в отсутствие экзогенного cAMP, а также только cAMP,' PI5CV синтезируется с той же интенсивностью, что и в контроле. В том случае, когда в культуру вводится комплекс регуляторной субъединицы и сАМР скорость биосинтеза PI5 av значительно увеличивается. Следовательно, введение регуляторной субъединицы в условиях, при которых восстанавливается транслокация этого белка в ядро, приводит к более интенсивному синтезу PI5.

С целью изучения свойств и биологической роли белка PI5 был разработан метод препаративного выделения этого белка из культуры клеток nih ЗТЗ после введения регуляторной субъединицы.

Через х5 часов после введения регуляторной субъедшищы клетки собирали и гомогенизировали в буфера, содержащем 10 ril Трис-HCI (рН-7.4), 1,5 нМ kgci2, 0,5% np-40. Затем гомогекат ■ центрифугировали в течение I часа при 100 ООО g. Супернатант подвергали ультрафклътрацни через мембранный фильтр FM3Q (Ami-con ). Прошедший через фильтр раствор содержал бешен с молекулярной массой менее ЗО.кДа. Фильтрат подвергали изоэлектрическому фокусированию в градиенте рЯ 5-7. Белок с изоэлектрической точкой 6.3 анализировали методом двумерного электрофореза по О'Фарреллу. По результатам электрофореза оказалось, что этот

белок гомогенен, обладает молекулярной массой 15 кДа и соответствует по положению на электрофореграшо белку И5.

Выделение балка PI5 в гомогенном состоянии из культуры клеток nih зтз дало возможность испытать его действие на синтез ДНК культурой этих клеток (рис. 7). Оказалось, что введение белка PI5 в культуральную среду вызывает увеличение включения %-тимвдина в кислотонераствор&\<:тс фракцию. При этом наблюдается четкая концентрационная зависимость получаемого эффекта от вводимого белка.

Таким образом, транслокация рогуляторной оубъединицы сАМР-зависиыой протеиикиназы в ядро вызывает синтез в клетке белка, связанного о синтезом ДНК и регулирующего вролифвративный ота-туо клетки.

30 г

0,05 0,1 конц.белка (мкг/мл) Рис. 7. Влияние белка PI5 на включение %-тимвдина в кислотонерастворимую фракцию клеток nih зтз.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Существование различных механизмов активации сАМР-зависимых протеинкиназ позволяет клетке осуществить тонкую направленную регуляцию действия фермента. Рассмотренные в настоящей работе процессы связывания сАМР, автофосфоршшрования, протеолиза ре-гуляторной субъединицы влияют на такие свойства протеинкиназы, как компартментализация, переход из одних клеточных структур в другие, взаимодействие с окружающими макромолекулами, а, следовательно, на способность фосфорилировать тот шш иной субстрат.

Данные по исследованию механизмов регуляции активности и

биология сАМР-зашеимой протеишашазы, представленные в настоящей работе, позволяют построить схему сАМР-зависимой регуляции клеточной активности (рис, 8). Согласно этой модели холофермент в присутствии оАГЛР и при автофосфорилировашш диссоциирует на каталитическую субъсдияицу и комплекс фосфорнлированной регуля-торной о сАМР. Свободная каталитическая субъединица, в зависимости от физиологического состояния 1слатки, от стадии клеточного цикла, может находиться в цитоплазмо и фосфорилировать там ' соответствующие белки-субстраты или транслоцироваться в ядро и фосфорилировать ядерные белки-, контролируя таким образом определенные клеточные функции. Набор белков-субстратов, представляемых клеткой протеинюшазе, определяется на только их непосредственными физико-химическими свойствами, но и типом самой клетки, компартментализацяей субстрата и протеинкиназы, макро- . молекулярным окружением и, таким образом, структурно-функциональным состоянием субстрата и фермента в комплексе.

шилих и чеокии

эффект

Рис, В, Схема действия сАМР-зависимой протеинкиназы II типа. С - каталитическая субъединица, и - регуляторная субъединица, 1кр- фосфоформа регуляторной субъединицы.

Фосфорилирование цитоплазматических белков

Судьба фосфоформы регуляторной субъедшшцы также может быть различна. Мы установили, что фосфоформа этого белка имеет значительно более низкое сродство к каталитической субъединице, чем дефосфоформа. Показано также, что фосфоформа регуляторной субъедшшцы не влияет на процесс транскрипции in vitro , транслокация ее в ядро значительно снижена по сравнению с дефосфо-формой. Таким образом, фосфоформа регуляторной субъединицы не' проникает в ялро и не связывается с каталитической, оставляя ее в овободном активном состоянии. При повышении активности специфических фосфатаз происходит дефосфорилирование фосфоформы рехуляторяой субъедишщы, что приводит, с одной стороны, к связыванию регуляторной субъединицы с каталитической, с другой стороны, к транслокацли дефосфоформы в ядро и акцепции этого белка структурными элементами генома. В результате чего начинается синтез специфической мРНК, что приводит, в конечном итоге, к синтезу специфических белков, в частности, белка PI5, о последующим выходом на определенную биологическую функцию.

У высших эукариот в связи с возникновением многоклеточнос-ти всякая, в том числе и сАМР-зависимая регуляция метаболизма, исключительно сложна. В многоклеточном организме отдельные клетки функционируют не обособленно, а соподчиненно. Это достигается существованием специализированных интегрирующих систем -нервной и эндокринной. Ответ каждой клетки на сигналы этих систем вызван заинтересованностью всего организма, а не самой клетки. Понимание функционирования системы регуляции клеточной активности важно не только с чисто научной точки зрения, но и как подход к изучению патогенеза различных метаболических нарушений и их коррекции. Человек рано или поздно научится управлять сообществами клеток, из которых складывается его организм, научится держать их под своим контролем. Он научится корректировать, подправлять работу генетического аппарата клеток, если по какой-либо причине произойдет пололка регулирующих устройств. Для этого необходимо полное понимание механизмов регуляции клеточных функций и причин, вызывающих их расстройство.

вывода

1. Исследована структурная организация сАМР-зависимой про-тошшшазы из мозга свиньи и субъединиц этого фермента. Показано, что холофермент протеинкиназы существует в растворе в виде тетрамера н2с2 с молекулярной массой 160 кДа и состоит из двух каталитических (С.Ц- =38 ООО) и двух регуляторных ( Н,'.1Г= 53 ООО) субъединиц. Регуляторная оубъединица существует в рас-' • творе преимущественно в виде димера С Мг=Ю0 ООО). Мономер регуляторной субъединицы состоит из нескольких структурных доменов и имеет протяженный экспонированный участок, чувствительный к действию протеаз, обладающих различной субстратной специфичностью. Относительное содержание л-, р- и неупорядоченной структур в каталитической субъединице составляет, соответственно, 35¿3$, 20±4# и 45±4£, а в регуляторной субъединице - 25±3%, 30±4% и 45±4#.

2. Для сАМР-зависимой протеинкиназы из мозга обнаружена реакция автофосфорилирования, которая является внутримолекулярным процессом и протекает в составе тограмарного комплекса хо-лофермента. Наличие автофосфорилирования позволило отнести исследованный фермент к сАМР-зависнмым протешшшазам II типа. Впервые исследован механизм реакции. Показано, что фосфорилиро-вание гистона Н1 к регуляторной субъединицы происходит с участием одного и того же активного центра, причем автофосформирование осуществляется через образование фосфоформы каталитической субъединицы в составе холофермента. Установлено, что только со- , вокупность процесса автофосфорилирования и связывания сАМР обеспечивает полную степень диссоциации и активации протеинкиназы.

3. Блеклые показано, что связывание сАМР, реакция автофосфорилирования, ограниченный протеолиз регуляторной субъединицы влияют на ряд свойств протеинкиназы, определяющих ее роль в проведении регуляторного сигнала. К таким свойствам относятся ком-партментализация фермента, его транслокация из цитоплазмы в ядро, взаимодействие с окружающими макромолекулами, субстратная специфичность.

4. Продемонстрирована возможность транслокации отдельных субъединиц протеинкиназы в ядро. Фосфоформа регуляторной субъединицы обладает сниженной способностью к проникновению в ядро

по сравнению о дефосфоформой, Изучена динамика распределения экзогенной регуляторной субъединицы фермента в клетках ЗТЗ. После транслокации из цитоплазмы в ядро сА!,1Р-связыващий компонент протеинкиназы локализуется в непосредственной близости от ядрышек. Доказано, что транслокация протеинкиназы в ядро является сАМР-зависимым процессом. Установлено, что компартментали-зация сАМР-зависимой протеинкигчзы и, в частности, ее регуляторной субъединицы, играет существеш1ую роль в регуляции клеточной активности. Нарушения, возникающие при неопластической трансформации, непосредственно затрагивают процесс транслокации регуляторной оубъединицы в ядро и связывание этого белка со структурными элементами генома.

5. Исследована возможная природа ядерного акцепторного участка протеинкиназы. Установлено, что каталитическая субъединица сАМР-завислдай протеинкиназы из мозга прочно связывается о гомологичной ДНК. Регуляторная субъедишща о ДНК не взаимодействует, Она входит в контакт с ядерными белками, среди которых преобладают белки о молекулярной массой 30-15 кДа.

■ 6. Изучена структурио-функцигшальная основа субстратной специфичности сАМР-зашскмой протеинкиназы. Выявлены различия в фосфорилировании белков в растворе е в составе ДНК-белковых комплексов. Установлено, что доступность белковых субстратов для протеинкиназы в ядре определяется присутствием ДНК.

7, Показано увеличение матричной активности хроматина, выделенного из ядер, предварительно фосфорилированных каталитической субъединицей протеинкиназы. Продемонстрирована возможность участия регуляторной субъединицы фермента в регуляции процесса транскрипции. Обнаружено изменение числа мест шшциации синтеза РНК в присутствии регуляторной субъединицы протеинкиназы. Фосфофорыа регуляторной субъединицы на процесс транскрипции не влияет.

8. Установлено действие сАМР-зависимой протеинкиназы на синтез ДНК, РНК и белка в биологических системах, обладающих различной пролиферативной активностью. Обнаружено влияние фермента на процессы пролиферации и развития зародыша вьюна М1В-вигпив ГоваШв ь.Введение каталитической субъединицы ингибирует синтез ДЕК, РНК и белка в клетках развивающегося зародыша. Характер действия регуляторной субъединицы зависит от стадии развития.

Впервые показано, что транслокация регуляторной субьединицы в ядро клеток NIH ЗТЗ имеет своим следствием синтез белков do novo . Первичным и непосредственным ответом клетки является синтез белка с молекулярной массой 15 кДа и изо-электрической точкой 6,3 ( белок PI5) . Разработан метод выделения гомогенных препаратов белка PI5. Показано, что этот белок стимулирует синтез ДНК и, таким образом, участвует в поддержании пролиферативного статуса клетки.

9. Разработана схема функционирования сАМР-зависимой протеинкиназы II типа в клетке, которая объясняет значение различных механизмов регуляции активности протеинкиназы для проявления биологической функции этого фермента. Обоснована ■ роль связывания сАМР и сАМР-зависимого фосфорилирования в проведении регуляторных сигналов.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Исследование структуры активного центра каталитической субъединицы гистогасиназы /Н.Н.Гуляев, В.Л.Туницкал, Л.А. Баранова и др. //Биохимия. - 1976.- Т.41.- И 8.- С.1241-1249.

2. Взаимодействие 8-замецённых производных и эфиров аденозин-3*:5'-циклофосфата с протеинкиназой мозга свппьн /Н.Н.Гуляев, В.Л.Туницкая, М.В.Нестерова и др. // Биохимия. -1975.- Т.42.- И 12.- C.207I-2078.

3. Функциональные группы сАМР-зависимой гистонкиназы из мозга свиньи /С.Н.Кочетков, Л.П.Свденко, М.В.Нестерова и др.// Советско-американский симпозиум по химии и физике белка (Рига, 1976 ) : Тез.докл. - С. 73.

4. Установление функциональной топографии активны* центров каталитической п регуляторной субъединиц гистонкиназы /М.В. Нестерова, М.Н.Кочеткова, Т.Я.Фрайкина и др.// Всесоюзн/ конф. "Структура и функции активных центров ферментов"

(Пущино, 1976 ) : Тез.докл. - С. 51.

5. Brain Hiatone Rlnaso: the structure, the substrate specificity and raechanien of action /E.S.Sever-in, H.V,Ч1е в terova, N.M.< Gulyaev, S . V.'Shlyapnikov // Advances in Enzyme Hegulati on/Ed,' G.Weber, Persaraon Press, Oxford, N.Y.«/ 1976,<- V.'AI,4- P.M07-444.'

6. Purification and soma properties of the cyclic adenosine

3 :5 -monophccphate-dependent histone kinase from pig brain " /E.S.Severin, V.Yu.Vaailiev, M.V.Nesterova, N.N.'Gulyaev //Erg. exp.Med.- 1976.- V.28.'- No.l.- P. 165-186.«

7. Фосфорилирование белков в нормальных гепатоцитах и при гепа-томе /М.В.Нестерова, И.М.Муртузаев, Т.Я.Фрайкина, Е.С.Северин // Биохимия. - 1978.- Т.43.- № 4.- С.535-538.

8. Ульмасов Х.А., Нестерова М.В., Северин E.G. Автофосфорвли-рование сАМР-зависимой протеинкиназы из мозга свиньи // Биохимия. - 1980.- Т.45,- № 4,- C.66I-668.

9. Ульмасов Х.А., Нестерова М.В., Северин Е.С. сАМР-зависимая протеинкиназа из мозга свиньи: субъединичная структура, механизм автофосфорилирования и диссоциация на субъедини-да под действием сАМР // Биохимия. - IS80.- Т.45.- № 5.-С.835-844.

10.Транслокация в ядро и влияние сАМР-зависимой протеинкиназы на процесс транскрипции /М.В.Нестерова, С.Ф.Барбашов, А.А. Ариоджанов и др. // Биохимия. - 1980.- Т.45.~ # 6.- С.979-

. 991.

11.Ульмасов Х.А., Нестерова М.В. Исследование диссоциации протеинкшаз физико-химическими методами // III Всесосзный симпозиум по циклическим нуклеотидам (Канев, 1980 ): Тез, докл.- С. 135.

12.Structure end Functions of Protein Kinases /E.S.Severin, S.N.Kochetkov, T.V.Bulargina et al.- // Enzyme regulation and mechanism of action /Eds.' P.Mildner, B.Ries, Pergamon Press, Oxford, N.Y.' / I980.:- V.60.- P. 35-46.'

13. The mechanism of action of brain cyclic АЦР-dependent protein kinase: structure of active site, mechanism of disso-tiation of the holoenzyme and possible biological role of its subunits /E.S.Severin, S.N.Kochetkov, A.G.'Gabibov et al.y/Ргос in life Sci.'/Ed.H.Holzer,Springer Verlog,Berlin, N.Y./I98I.- V.60.- P.' 44-58.'

14. The autophosphorylation reaction in the mechanism of activation of pig brain cyclic AMP-depexident protein kinase /M.V.'Neeterova, Kh.'A.Ulmasov, S.V.Shlyapnikov, E.S.Severin // Biоchim,Biophys.Acta.- I98I.-- V."660.'-No Л .'-P Л10-116

15. Huclear Translocation of cAlTP-dependont Protein Kinase /ll.V.IJeoterova, Kh.A.Ulmasov A.Abducarinov ot al. // Exp. Cell. Bos. - I9QI.- V.I32.- Ho.2. - P.' 376-373. ■

.6» Purification and some physico-chemical properties of cyclic nucleotide-independent protein Ыпгше from туяо-raycete Physaruni polycephalum /R.O.Soloaoniya, M.V.Iieste-rova, D.A.Koatyuk, E.S.Severin // Bioehea. Int.'-X98I. -V.3.- Ho.I.- P. 147-155.

:?. Neeterova M.V., Glukhov A.I., Solomoniya П.О. The effect

of cyclic AMP-dependent protein kinase on genetic activity of cells // Proc. 4-th symposium USSR-PRG " Structure and transcription of genome" J- Erevan, I93X.- P.90»'

18. Нестерова M.B., Васильев В.Ю., Северин E.C. циклические нуклеотидн в системе регуляции пролиферации и дифферент?- • ровки // Укр. биохш. жури. - 1981.- Т.53,- JS 2.- С.52-62.

[9. Анализ спектров кругового дихроизма сАМР-сависимой про-теянкияазы из мозга свиньи /Х.А.Ульмасов, М.В.Нестерова, А.И.Полетаев, Е.С.Северин // Биохимия. - 1981,-'T.4S.-№ 9.- С. I609-I6I4.

20. Нестерова М.В., Соломония P.O., Северин Е.С. Циклические нуклеотиды в регуляции клеточного деления // Успехи биол. хш. - 1982.- Т.22.- С. 63-75.

21. Severin E.S., Nesterova M.V. Effect of cyclic AMP-dependent protein kinase on gene expression // Advances in enzyme regulation / Ed. C.Weber, Pergaaon Press, Oxford, N.Y./h 1982.- V.20.'- P.' 167-193.' !

22. Nesterova M,V., Glukhov A.I., Severin E.S. Effect of the regulatory subunit of cAMP-dependent protein Цпааё on the genetic activity of eukaryotic cells // Mol. Cell. Biochem.-1982,- V.42.- No.T.- P. 53-61 „' . ,

23. Role of cAUP in the regulation of genone expression of eutoryotes /E.S.Severin. H.V.Hesterova, A.V.Itkeo et al. // Prog, in Clinical and Biological Rob. / Eds.G.'Akoynoglu,

A.E.Evangalopulos et al., Alan R.Idea, Inc., Kew York / 1982.- V.I02.- P. 225-238.'

24. Северин E.C., Буларгина Т.В., Нестерова М.В. Роль адена-латкиназной системы в регуляции нейрохимических процессов // 9-ая Всесоюзная конференция по биохимии нервной системы Ереван, 1983 : тез.докл. - С. 24-25.

25. Нестерова M.В., Глухов А.И., Костхж Д.А. сАМР-зависимая регуляция генетической активности клеток эукариот // 16 Конференция ФЕБО (Москва, 1984 ) : Тез. докл.- С.519.

26. Effect of microinjections cAMP-dependent protein kinase eubunits on macromolecular synthesis in loach Uisgurnus fossilis L. embryos /A.I-Glulchov, A.O.Benumov, M.V.NeBte-rova et al. // Biochem. Int/- 1984.- Y. 9.- No.!.- P. 8391.'

27. Role of secondary messengers in the regulation of cell functions /E.S.Severin, M.V.Nesterova, T.V.Bulorgina et al. // Proc. Iб-th FEBS Meeting.- lloecow, 1985.- Part А,-P.' 177-182.

28. Проблемы регуляции клеточной активности посредством вторичных мессендаеров /Е.С.Северин, Б.О.Глотов, С.М.Дудкия и др. // Мол. биол.- 1985.- Т.19.- tó I.- С.248-267.

29. Нестерова М.В. Роль сAMP в регуляции экспрессии генов // 5 Всесоюзный биохимический съезд (Киев, 1985) :Тез.докл - T.I.- С.68-69.

30. Нестерова М.В. сАМР-зависимая регуляция генетической активности клеток эукариот // 5 Всесоюзный симпозиум "Циклические нуклеотиды и система регуляции ферментативных реакций" (Рязань, 1985): Тез.докл. - С.16.

31. Глухов А.И., Нестерова М.В. Взаимодействие субъединиц сАМР-зависимой протеинкиназы с ДНК и белками хроматина // 5 Всесоюзный симпозиум "Циклические нуклеотиды и система регуляции ферментативных реакций" ( Рязань, 1985 ) : Тез. докл. - С.50.

32. Влияние микроинъекций субъединиц сАМР-зависимой протеин-• киназы на развитие, пролиферацию и синтез РНК у ранних

зародышей вьюна /А.И.Глухов, А.О.Бенюмов, М.В.Нестерова и др. // Биохимия. - 1985.- Т.50.- Jí 12,- С.2048-2055.

33. Изучение взаимодействия субъединиц сАМР-зависимой протеинкиназы со структурными элементами ядра /А.И.Глухов, В.Л.Цухман, М.В.Нестерова, Е.С.Северин // Биохимия.-1986.- Т.51.- № I.- C.I03-III.

34. Severin E.S.', Nesterova M.V.' Cyclic AMP and the regulation of the eukaryotic genome // Proc. II European Congress on Cell Biology.' - Budapest, 1986.- P.' 123.

35. Severln E.S.', Kochetkov S.N.',' Hesterova I.I.V. Mechanism of action and biologycal role of cAbIP-dependent protein kinase // 6-th USSR-USA Simp.' on i.fyocardial metabolism (Baku, 1984) / B.Smirnov, A.Katz eds.', Sov.Med.Rev.'Supple-ment Ser. Cardiology Harwood.< Acad.' Publ.Y 1987."- P.* 663673.'

36. Hesterova U.V.', Severin E.S.' Hole of cAMP-Binding Proteins in the Regulation of Cell Activity // life Chemistry Reports. - 1987.- V.4.- P. 391-465.

37. Ядерные белки - субстраты сАМР-зависимой протеинкиназы Д.В.Нестерова, А.И.Глухов, А.Г.Априкян, Е.С.Северин // Биохимия.- 1987.- Т.52.- J* 7,- С.П50-П53.

38. Связывание холофермента и субъединиц сАМР-зависимой протеинкиназы с ядрами /А.Г.Априкян, М.В.Нестерова, А.И.Глухов, Е.С.Северин // Биохимия.- 1987,- Т.52,- № 8.-C.I300-I306.

39. Нестерова М.В., Северин Е.С. цАМР-зависимая протеинкиназа как регулятор процессов пролиферации и днф^еренцировкп клеток в культуре // Цитология.- 1987.- T.XIIX.- И 9.-

С. 1095-1096.

40. Нестерова М.В., Априкян А.Г, Изучение динамики распределения регуляторной субгединицы сАМР-завлскмой протеия-киназы II типа при введении в клетки ЗТЗ с применением '

теней эритроцитов // 6 Всесоюзный симпозиум "Роль циклических нуклеотидов п вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций" (Петрозаводск, 1988 ): Тез. докл.-С, 84.

41. Aprikyan А .'О.1, Hesterova U.V., Severin E.S.' Dynamic distribution of the regulatory subunit of cAMP-dependent protein kinase type II in HIH 3T3 cell3.7/Biochem. Int.4- 1988.'- -ТЛ6;- No. 4.- P.- 601-604.'

/¿C 6 S e/-"^-