Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СТР-связывающие белки легких, взаимодействующие с адекилатциклазой, рецептором АNP и актином

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "СТР-связывающие белки легких, взаимодействующие с адекилатциклазой, рецептором АNP и актином"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ ИВДШ&ШСКНХ НАУК КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧШИ ЦЕНТР

На правах рукописи

СТАРИКОВА Марина ГвШ1адьовна

СТР-СВЯЗЫВАИШИЕ БЕЛКИ ЛЕГКИХ, ЬЗАИУОДЕИСТК/Т||Ш С АДЕНШТЦШШЗОЙ, РЕЦЕПТОРОМ АКР M АКТИНОМ

03 30.04 - Биологическая химия

Авторёферат диссертации на соискание учоной степени кандидата биологически* наук

Диссертацяоная работа выполнена в лаборатории молекулярной яндокринологии Института экспериментальной кардиологии КНЦ РАМН.

'Науч-иЯ руководитель: Научные консультанты:

Официальны» ойпойенты:

кандидат биологических наук, старший . научный сотрудник М.П.Панченко

доктор биологических наук, профессор В.А.Ткачук, доктор биологических наук, старший научный сотрудник С.А.Хорева

доктор биологических наук, профессор А.С.Соболев, Кандидат биологических Наук, старший научный сотрудник И.А.Гривенников

Ведущее учреждение: Институт Эволтционой Физиологии и

Биохимии им.И.М.Сеченова

Защита состоится » 1Ш: ¡М 1992 года часов на

.заседании Специализированого Совета К 001.22.02 . в Кардиологическом научном центре РАМН по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., 15а.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Кардиологического центра РАМН. .

Автореферат разослан "__ 1992 г-, •

.Ученый секретарь Специализировано™ Совета, кандидат биологических наук

п

9Л<>

Л " т/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблем». Роцептори многих гормонов (пгонисш а- и 0-адренергичвских, мускарипових холинергических, оерчтошшо-вых, гистаминових и др. рецепторов) сопряжешьв мвмбрпне с семейством GTP-Связиваиаих белков (G-бОЛКОВ), которио модул]фу!ит активность внутриклеточных оЭДекторних систем, таких как адонилптнпк-лаза (АС), .{осфолипаои С и Ag, иошшгз каналы, сСУР-зявисимпя Joe-йодиэстораза и др. {¡Blnibaumer, Abrajnowltn, Brow, 1990]. G-белки «мают гетеротришрную структуру. а-Субъединицп G-Оелкя обладает GTP-связывощим участком и СТРазноП активностью, р~ и у-субъвдиници обоеггачнвяют пзакмодоАстпио G-оолка с рвцнгттором. Связывание гормона или агонистн со специ|.ичоским рецептором визы-boot обмен {¡DP па GTP в нуклоотидсвязиващем цонтро (¡-болк-i, сопряженного с этим рецептором. При этом, геторогримор С с'олкп диссоциирует на а-GTP и ру-комилекс. Сиобздняя а-'Л'Р взаимодействует

С £>W»JKTOpoM , ШЗНВОЯ ПОрвХОД ЭТОГО &W«KTOpa Л ПОРОЙ |ункЩ!0-'ИНЛЬНОО СОСТС. 'ШО. Гидролиз ОГР до СИР и Р 1гринодит К ДИСТОНИН-iunf я-СРР от o.}ijoKTopHon снегмго и р''"".\:оциэ!иш а~субт единицу о.

комплексом. В рчпультчто пр^исх \mu' опрпповшше или допрялаикя ршрвчччк «ос)г>лчйК'.м»: сАМГ, c<;vp, прдунтсч» ^оефоияозптлдного (к'мгио, вход « клотку и.'ч!'.ю(5нл.и«ция с'нл * .

В клоткчх 1-укяриот оксп^^'-'.'ирустся <1<!леп р.0 прздетошпелчй с'.'нопствп 1тякомо.1"1>у.чяр»ух ПТ!'-с.-1'>1:ч.».:-мчих бч.т'о» (SVi-^vr""'*-') «. молекулярной мпссой ~ 20-ПО кЛг» [Barbae id, 1гиУГ). Помимо «".'нмия молекулярной массы, хлрактерш/м отличном 3MG-от г\-<ч*и;п

Я»У»Я«ТСЯ ОТСУТСТВИЙ мудьтисуби'линччной ClpVKTypU я ппобхолнм чуть ДРИачиИТСЛЬИОГО Колки ДЛЯ проявления ПРЯЗНОЯ /)Kr«n(<OfTl5.

Г-M'.I • белки РОПЛРЧОНМ » OforiW'tPHK" ток ИД КЛОТоЧН"* 1И*Л».'СОВ как ро"т, дИ^'рениировкп, ьпзикулирииЛ трянсперт и п-r; «!«»>ч «Г.«««? et a].. l?88)k во мехяни:>чч рэгулянии нгпх нром'чч-ов :'V

ДО СИХ пор но -РЯСИИ'^ЮВПН»!.

• ФуИКЦИ'ЧЮЛНЮР С01!ряж>?ни>.» О- И "МП -беЛКО!) Г"Н?П Г"р-

рф^кторнуи'л системами клетки иямтютгл при nepTijvflnnR кепочного НИТОСНОЛПга - МП,'|К)ГрубоШ;К T\f6y.1"Mn и nimiHCWIX Wp<-1<!4<)-

ментов. В ово»> очередь, сборке и »«'Крчгру'^чпк p.»ry.-m-

.руотся С- и БМО-белками ¡^ап^, Наееп1ск, 199Ц . Однако, как показывает анализ дашшх литературы, вопросу взаимодействия 0- и йМЗ-Оолков с белками цитоскелета требуют дальнейшего изучения.

В предварительных исследованиях, мы обнаружили на~ичие в- м йМО-Оилкэв не только в мембранной, .;о .и в цитоэольной фракциях легких. При этом, функциональная роль цитозольных белков изучена недостаточно.

В легких млокопит ада выявлены рецепторы для саботируемого предсердиями атриалыюго натрийуретического пептида (АКР), гормона, который стимулирует активность гуанклатциклазы (СС) во многих тканях. Однако, как было показано на гладкомшючшх клотках, 'клетках коры надпочечников и кардиомиоцитах, АИР способен на только стимулировать активность ОС, но и ■СТР-эависимым образом ингиоировать активность АС [£пап1-3г1уав1ауа, 1986].

Цель работы. Целью нашей работы было исследование» структурно-функциональных свойств С- и БМО-белков легких. В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) идентифицировать и оценить количества й- и ЯМО-болков вкспроссируэдихся в легочной ткани;

•2) оценить распределение дашшх белков между цитоэольной и мембранной фракциям! клетки; выявить условия, приводшдие к перераспределению в--и 5М0-белков меиуг' мембраной и цитоплазмой;

3) выявить возмолюе взаимодействие цитозольных С- и ¿МО-белков с белком цитоскелета актином;

4) проверить участие мембранных С-бзлкоа в механизме ингиоиросания адешиштциклазы легких атриальным натрийуретипескш пептидом но примере альвеоцитов второго порядка (А2П) -секреторных клеток легких.

Научная новизна и ттракти'-.иская значимость работы. Б ризульта-те Гфоведо иного исследования показано, что некоторые С- и БНа-белки могут паимодействовать с актьдошм цитоскелетом. Выявлены два вффокторные системы - адешлйтциклазо и гуанилатцшел'лза, участвующие в реализации регуляторного' сигнала АКР в альвеоцитах второго порядка. Нестоящая работа является еще одним ¡лагом в развитии современныхпредставлений о структурно-функциональной орга-

газации G- и ЗНС-белок-управляешх сигналышх систем юштки. Полученные данные позволяют прогнозировать изменения в гормональной чувствительности вукариотичаской клетки при патологических состояниях, а также при применении локарственнихпрепаратоп.

• Апробация работы. Результата работы были представлены на VI Всесоюзном симпозиуме "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций" (Петрозаводск, ' '1988), Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989), Советско-японском симпозиуме "Рецепторы: структура и функции" (Москва, 199Я), Всемирной конференции по легким (Boaton, 1990).,

Публикации. По теме тщссортации опубликовано 7 работ» Структура i объем работ». Диссертационная работа состоит из введения, обзора диторатури, описотш методой, и объектов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов ¿( списка цитируемой литература ( ссылок).. Работа излокчна на стран \ах машинописного текста, иллюстрирована . рисунками и таблицами.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ'

Материалы и метода

Выделение плазматических мембран и цитозоля из легких свинья

проводили, кйк описано в работе.Tkaehuk с соавт. (19Ú9).

Первичные культуры эндотолиалышх клеток из сосудов аорта

человека били любезно 'предоставлены A.C. Алтоноин» (Ш(Ц,

Москва). ' 32

I_Р1 АРР-рибозшшровакие G^ и SMG-белков бактериальными

ADP-рибозилтрансферазами проводили в теч»нн<) (Ю кии в {(f) мил. среда, содержащей 50 мМ. Tpitú-HCl (pH 7.6), 1 мМ ПДТА, 2 мМ 10 ММ ДИТИОТрОЙТОЛ, 10 UM ТИМИД1Ш, 10 ККЫ HAß, I mW НАГ'Р, I M ATP, 2 мкКи t3aPl!fAD, 100 мкМ ry яшмового нук.пеотнАа, 60 мкг/мл холерного токсина, 20 мкг/мл коюввдого токсина, или 6 мкг/мл бо-тулинического С3 экзоформента, 5 - 100 мкг белка мембран или цитозоля.

Обработку клеток.коклплним или холерным токсинами проводили при 37"С в течение 120 мин в среде, .содержащей холарнмй шр кок-

- t> -

лхшшй токсшш в концентрациях 1 мкг/мл или 0.5 мкг/мл соответственно.

Измеранив внутриклеточного содержания сАМР и cGMP. Клетки вкс-^ягировшш 1 мл горячего раствора - этанол:вода (2*1). Экстракт упаривали, растворяли в 100 мкл Трис-ЭДТА буфера и использовали для определения еАМР и cGMP. с помощью наборов фирмы "Ameraham".

Определение актш чости адинилатциклазы проводили в сраде (коночный объем 60 мкл), содержащей: 50 мМ Трис-HCl (pH 7.5 при 37*0), 120 мМ NaCl, 1 мМ сАЫР, 10 мМ креатинфосфат, 0,25 мг/мл краатишинааы, 0.5 мМ З-изобутил-1-метилксантин, 5 мМ Mg01£, 1 мМ 'дитиотрейтол, 0.1 мМ АТР, 2 мкКи [азгР1 ATP и 10-15 мкг мембранного белка. Пробы инкубировали 10-20 мин при 37°С.

F- актин-зависимое гелеобразоваше. в цитозольной фракции проводили по Pollard, Cooper (1982).

Тритон X-100-зависимую экстракцию клеток проводили по методу Oöbom, Weber (1977).

Ишуно~ или Ca3gPl GTP блоттинги с G- и SMG-болквми проводили посла их разделения электрофорезом в 12% ПААГ в присутствии DS Na и электронереноса на нитроцеллюлозу по методу Towbln о соавт. (1979).

Высвобождение G^ и SHG-белков из мембран проводили в течение 60 мин при 37°С в буферных растворах с низкой ионной силой {pH 7.5) в отсутствие и в присутствии 5 мМ WgCl£, как описано в работе Панчинко с соавт. (1992).

РЕЗУЛЬТАТЫ'И ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификация G- и SMG-белков в легких, юс взаимодействие с актином. Некоторые G- и SMO-болки обладают спс-чбностью подвергаться химической модификации бактериальными АБР-рибозилтрансферазами, которая заключается в переносе ADP-рибозы с NAD на G-белок. Используя СзгРШБ и различные токсшш можно идентифицировать . чувствительные к этим токсгашм GTP-связываювдие белки.

В плазматической мембране и цитозоле легких холерный токсин •(XT) выс.авьат АБР-рибозилирование 42 и 45 кДа форм а-субьединицы

Ов-белка (рис.1). Кромо того, в цитозо.-о XT АВР-рибозилируот также белки с молекул,-; ними массами 55-57 кДа.

В этих же препаратах коклюшный точсин (КТ) вызывает . ADP-рибозилирование- 40 кДа а-субъэдиниц Соболков (рис.1).

Анализ XT- и КТ-чувствительных белков иммуно&яоттмнгом указывает на наличие в. мембранах и цитозоле легких , двух изоформ а-субъедашцы 0 --белка: 42 и 45 КДа, а также выявляет а-субъедкнивд трэх известных О^-Селков: 41 кДа а^, 40 кДа al2 и 41 .кДа atg. По денным иммуноблоттинга в легких не выявляется a-оубъедюшцо С0-белка - основного КТ-чувствнтельнаго G-белка головного мозга. И в мембранах и в цитозоле - присутствует.

-субъединица с молекулярной массой 36 кДа. рг-Субъедшицз (35 .Jin) выявляется лишь в мембранной-фракции (рис .1).

а-Субъадиници и Со-бвлков могут быть АБР-рибозялировяга коклюшным токсином только после сопряжения этих белков с ^-комплексом [Oilman, 198Т; Blrnbaumer, 1990]. Такие гуаниловие нуклеотида, как GDP и его стабильный аналог GDPpS, стабилизирующие гвторотртвр G-болзса, усиливают ADP-рибозилироввние, а негид-родазуомыэ аналоги GTP - Gpp(Jffl)p и GTP7S/ вызывающие диссоциацию гвтеротршора, ослабляют эту модификацию" G^белков.Потенщпфова-штз КТ-зависимого ADP-рябозилировяния о^-субъедшиц под действием GDPpS и ослабление ого в присутствии GTPyS (рис.!) указывает не Функциональное сопряжение а1- убъодиниц с ^-комплексом. В пользу существования этого сопрякения в цитозоле говорит и тот факт, что екзогешшй ^-комплекс' не усиливает КТ-зависимого ADP-рибозильрования.

Ботулшшчедкий вкзофермент С3 (БС3) й мембранах и цитозоле легких ДЮР-рибозщп'фует 24 я 26 кДа SKG-белки, относящиеся к семейству rho/гас-белков. Методом GTP-блоттинга как в мембранной, ток и в цитозольаой фракциях-легких выявляются 19-26 ■ КДа SMG-бэлки, связывающие GTP на нитроцеллюлозе, (белки нитроцеллюлозного связывания). Методом иммуноблоттинга выявляются гаа-, Gp-, AEF-' и. гас-белки. SMG-белок вес4, регулирующий в дрожлсах образование' секреторных' везикул, ' в легких т обнаруживается (рис.2).

- 8 -

АПР -рисзознлировайие Я'

Ш;М(1рйШ1

А1

(Л Ш

I Г& а & а е

I I о ё о сУ и

у:'-. ••■:г"V;-- --.',5,.':•■..Г'..,^-

. • ■, .. >•; ж** ш» ряР

-хг

-у—

-кХТ

Питозоль

кОа

55 43

36

.....I ,,

-ХГ

+Х.Т

*АИР-рибознлироианиа К'Г

¡Лет,к5 раня

Цито ЗОЛЬ

"V-

■Й

о

-КТ

1

& СЭ

+КТ

55 43

36

Ймиуноблотттп'

«V "к

I

-кг

+КТ

кРа

55 43 -

36 .

б^а \га ара V1 Ор, '

1 2 ' 1 2 .1,2 .12

^.'.•«л'иу'.';. i

1.'. 2. . ».1 .2 .. ,

I - мсмбршш, 2 - ПИТОзоль.

рио.1. И,1("НттТикания а~бе.У.ов в лпгкпх овпмш.

ADP-pilClûBH--

■лирЬвание fíC^

(1TÏ-(1/iOTtl!lir

1

ib.O.VjnOÖMT'MHV

KDa 29 -

10 _ 12 -

'2-5

ARP

rao

aac4

5Г:-'» №. • Г^Ж

г'

y.ti. V. , - : • J t i . ■ • -■•

JH^-.'t ШМ

г i

a r

2 !

ГГ У ' >, i и > '

nr..

и; -

'M

ш. г -,

2 I 2

T - мемЛршш, 2 - mTO-Wï.. Pito.2'. ИдентлГикаи»« зко~пплкпп п'когкпх свиньи*.

В альвеоцитах второго-порядка, .выделенных из легких крысы, выявляются: 42-45 кДи дублет а-- -'бъединицы С.в~белка ' (ADP-рибозилированием ХТ и иммуноблоттингом); 40-41- кДа al2*- и • al3 субъодиници (но не а^-субъедащща) (^-белков (АГР-риСопилированиом КТ и ■' имм. лоблоттингом) и 36 кДа р^субъодшица G-белков (иммуноблоттингом).

Можно полагать, что выявление G- . и SMG-белков как в мембранной, так и в i итозольной. фракциях легких в определенной степени отряжает распределение вгих белков, -существующее в кивой : клетке. _

'Как известно, субклеточная локализация G- и SMG-белиов ' зависит от . посттронсляциотшх модификаций этих белков -мприетоилиро1?ание по Н-концу а-субъедашдн и изопренилирование по С-концу "ук'убъединнцн С-белков, а также полиизопронилироввние и" метилирование по С-концу SMG-Озжов' приводит к■'их-переходу из пшоплазмн в плазматическую мембрану, tsternwele, 1990; Hall, ■ t»j|, Частичтю- высвобождение сс-суОгодиниц из ' белка мажет происходит.при стимуляции G-белков гормонрецеггторными комплексами fIV>db»ll, I985J. Для некоторых SMG-белкрв показана диссоциация из мембран после фосфорилирования протеинкиназгш [lapeИла, 1989]. ■ Высвобоппоние а-, но не р-субъедишш и Со-белков из 'мембран б раствор происходит при Wg2 '^-зависимой стимуляции мембранных G-белков под действием негидролизуемых аналогов . G1T -- Gjip(Nl!)p и OTP7S (рис.3).

Наличие - в исходном цитозоле . логких а- к р-субъединиц.' О белков, a также различных SMG-белков указывает на возможность оув.ос1ясчг)ния и другого механизма высвобождения G- и SMG-белков из мембран п ' цигозоль. ■ Функциональное сг-гряжеше а^- с р-субелянщей в цитозоле . ■ продполагает, Что этот механизм шсв^йокдоняя ■ G-белков непосредственно ■ не связан, с U(f* -ОТР-зшшеимЛ диссоциацией . мз«,оранного гетеротримора.

Экстракция плазматически* мембран раствором низкой иешюй силы, содержании 1 мМ ЭДТА, вызнбавт высвобождению из мембран в раствор не только 40 кДа и 36 кЛа р*субъедишщ, ' но и 43 кДа ' актина (рис.4). Вероятно,- ь-мембране выбелок способен, взаимодей-

- 11 -И-лмулоблоттннг

г

Осадок

С.у(г"н!г;)танг

М

tcu

"У- 5

Ш oj

ю со.

.

Ч.

Рч i

^ & ■ а ■ в е ^ & & & • &

J_ CJ О О. о* | О g С5 go

I ' ' f ^

-г,

Рис,П. 1'идушровокно0 ногидролизуймнми аналогами GTP высвобождение кз мембран в раствор а,- и р-субгодитщ с.-белков. 'Среда штубешик .мембрпл содержала 5 г/! ВеЛг. Условия инкуба-щпг мембран: I мг/мл белка, Д'/'С1, ЯО глш, рН 7.5.

ствовать с акишовышг филаменгамм, а дополшэри.зшцм связяшшх о мзмбраной яктйяовнх филамвнтов (переход Р-актинв л О-октич) сон-рововдается. ви^вобождвхотвм из мембран 01-болкп.

Окрапка 0-250

] Ъмуноб.'ю ттппг

Актин

Г 2

а1 —

Pt ~

«ад

ш

ш

таг?!

Pire .4. Высвобождение пктинп я с'убг^чпш o-болка из мембран в twoTi'op под, доптгяисг,: нкако? конисЯ окл». 1 гг 2. - осядок i: •с.упс.рватант, по'лучттчо после ;>т:стппжгл ИСХОДШХ Г.'Р^бтПИ рпотвотом НИЗКО? ' ЙОШГ0Я СЯЛЧ. С r.t'í ЦйГА;' Уатояяя- гтппбогяи ыомбраИ: I '.т/мл Оелга, З'/'а, 60 "in;, Ы1 7.-Г),.

Ка основании втого можно было предположить, чтя полимеризация О-актиаа в Р-актин приведет к тому, что цитозольннй .'0 -бедок и Р-актии при ультрацентрифугировашга цитозоля будут. соосаждаться. Действительно,

'МаС12+КС1-индуцировашюе образование Р-актюга в цитозола, полученном из легкого свиньи, сопровождается соосаадением при ультрацентрифугировании • 40 кДа с^- и 36 кДа (^-субъеданиц С-божа (рис.5). С У-актшюм соосашдавтся также белки актинового

Окраска Кушзси.' о - 2СО Миозин—- «=тд<®5

Вимснгин — ■ Актин —«

■г-?

авр-риб6зилироьа>'ии' КГ и БО^

К?

Ло/гао _

'М аь «ч л

ш х

I 2 3 4 Б

ЙНШ,' -о. . -1 2 3 4 !>

Гг.мунпО.'юттанг

л-®

29 кВи

18 Ми,

СГР-бЛОТТП;

I

1® г.

4 5

Рис.й.. Г-акТ1:и5а.л:скмие риоаредвдише цитозолышх "о- я ■ быв-белков.

I - лаход1я;П пптозо.чь; 2 и 3 - оутчрнггтнт' я осадок на • 100,ШОй Кгиубац'ш ггнтояоая н отсутт'ине ИвС12+КС1/

4 и 5 - сугшрнцтаит и с садок на Н'О.ШОв посла инкубации пито золя в пмш.у ¡готики 6 м.1*>«с1а*1ш кМКС1;

цитоскелета - 200 кДа миозин и 55 кДа виментин. ■ Вместе о Р-актином количественно соосаадаются и цитозолыше SMG-болки, выявляете •' GTP-блоттингом. Напротив, БС3-чувсты[толышо Солки цитозоля в гораздо меньшей степени взаимодействует с .Р-шспном: лишь около 2С№" атих белков обнаруживается во Фракции Р-шстшш. Контрольное прогревание логичного цитозоля (в отсутстьиа индукторов полимеризации G-актшш). не ГфИводит ни к образованию ■ актиновых филаментов, ни к ссаедешш перечисленных белков.

Еще одно подтверждение. возможного взаимодействия С- и SMG-белков с белками циторкалота .могло быть тлучано в модальном; эксперименте по' экстракции клеток тритоном X-1QQ, которая позволяет селективно соли/чшшровать содержимое клетки, оставляя нерастворимым Ol цитоскелет [Oobom, Weber, 1997). Для атих опытов наиболее'удобными оказались культивируемые андотояиалышо _ клетки из аорты человека. В тритон Х-100 нираствориной части клетки выявляются маиорныо цитоскелетпыо белки: актин, виментин, миозин, Околс 20%, содержащихся в ¡эндотелии а - и ß-субгодшшц G-белков, а таюао SMG-белков, выявляемых СТР-блоттиигш, ■содержится в тритон Х-100 нерастворимой фракции. В с пай очередь БС3-чунсгвительныа белки не выявляются в связанном с «¡¿типовым цитоскелетом состоят«! (рис.6).

Таким образом, полученные 'экспериментальные данные свидетельствупт, что сс"ержащие',я в цитозоле легких й1-белки и SMG-болки нитроцеллюлозноГо связывания способны взтшо.«1',Потшпать • с актиновым цитосколотсм. Можно предполагать, что нзанмодейстиие цитоэольннх белков с F-актином может шшять на сопряжение данных белков с &Jif»iK'ropai,oi '(например, фхДо.тилаявнн С или к ) пли регуляторннми'белками, стинулирущпми CDP/GTP обмен или ЯГГйг'ну» активность G- и SMG-белков'.

Окраска К,умас(П! с. -2Г/3 кОа

67

43 . 36 -

29 . 24

20

г-

«—»-Внмонтии

I

''А

а^'-рибозилирование КГ

а*""*?. ••

1 К,'п.

ИмМ.упоблоттинг

• I 2

С1Т-бЛОТТКИГ

КБа .

29

18

1

х г

авр -риб03!Ш1р0Н0ШШ ИОд

гЪо/гвс

X

Рис.6. Содерганио о- л зко-белков в тритон Х-ТОО рао'тпорймой' и норггстворимой фракциях эндотелия аорты. I - тритон Х-1Ш' -'раотио'рклш!••фракция;' . ■ . '

й - тритон Х-1Ш нораствогтдая Фракция.

■ 01-белок-опоср8довашгоо проведение ингибмторного сигнала АИР

15 адекилатциклазу в альшоцитах второго порядка (А2П).. Активность АС в мембранах, изолировании* из А2П, . ри действии простаг-явндина Е1 'повышается в 2.5, .¡3-агокиста квогтротеренолп - . 4'и {орсколгаа - в 25 раз. Лтризлышй натрийуретичоский пептид (АНР) вызывает достоверное 30$ ингнбировашо агснист-стимулироввнной, но не базальной активности АС. Как стимуляция, тек и торможение активности АС под дойств1.зм Гормонов происходят только в присутствия активатора 0-болков - СТР и подавляются в присутствии ингибитора 0-белков, стабильного аналога ПР - СГР^З. Форснолин-стимулкрованлая активность АС менее чувствительна к шгибиторному воздействию .СБРрЗ (тзблЛ).

. - Таблица 1

Влияние'АИР, изопротеренола, простоглзндшгя Е1 и форскслина на активность адекклаил'-клазц в мембранах А?Л

НтЖюоть ЛИ

Добавки _(толь сАА!Р/мин на мг белка)______

без добавок 50 мкМ изо-' • 10 «кМ 10 мк?* форо-протеренол проста- колин __гл8чдия Е1 _

Без добавки 7.70±0.85 32.4+1.3 18.5+0.7, ¡ВО.0+4.0

5мкММР 5.70+0.75 23.1+1.4* 13.3+0.4* 135.0+4.0*

100 мкМ • .

СВРрБ 5.30±0.30 5.62±0.54 Б.Б0*0.35 ПР.О±Б.О

5 мкМ АНР+

100 мкМ $.41+0.55 5.90+0.35 • 6.35+0.45' 123.0+6.0 ОВРрЗ

__I

Активность АС определял!'в стандартной среде ишкубт)г:1, соде г»«- . щей 10 мкМ СТР. * - указывает на .достоверность различай в присутствий и в отсутствие АКР; *Р <'0.01.

/

Ингибйрукщй эффект АКР на кзопротярешл- п 'Горсий'лчтг-■ стимулированную активность мембранной АО устраняется после обработки А2Л КОКЛШ1ШМ токсгагоч, котороий, АГР-рибозпдируя

'а--суб'ьйдишшу О^йвлкм, переводит его в неактивное состояние.

Модификации а -балка под действием холерного токсина, которой поре водят дишшй белок в необратимо активированное состояние, не устраняет ингибиторное влияние АКР на активность мембранной АО (табл.3). ' .. . .

Таблица 2

Влияние коклюшного (КТ) или .холерного (ХТ) токсинов на чувстви-телыю'сть ■ адешлатциклазы к АИР •

актйъность au

(пмоль сАМР/мин на мг белка)

без добавок

50 мкМ изо- 10 мкМ форс-протеренол ко. .in

Контрольные клетки

Клетки, обраббтан-ш о КТ

Клотки, обработанные XT

Коз АИР 5 Midi AÎJP

Веа ANP •

5 мкМ AI IP Без AN?

Б мкМ ANP

10.2±1.0 0.75±0.1

17.3+1.4

16.7*1.0 63.0t0.5

43 ,ltl.5*

42,7il .6

30.3*0.1*

59.014'. G

54.5H.0 64.0*3.5

¿47.0*9.0 178.0*3.0*

354.0±13.0

360.0tlG.0 500.0*45.0

•45.510.6* 409.0120.0'

* означает достоверность (*P < 0.001) ингибиторного рф&экта АКР на изопротеренол-, Фороколин- или ХТ-стимулировннную активность АС.

Ингибирумее влияние ANF на активность мембранной AG п А2П коррелирует с ANP-зависим--ч понижением уровня сАМР в отих клетках. Повышении концентрации aNP приводит к зависимому от"концентрации гормона 2-х кратному снижении изопротеренол-стимудироь итого уровня сАМР ь А2П; концентрации ANT, вызывающая полумпксймаль-ннй ингибируюдий аф}'юкт равняотся Ю.нМ. Обработка клеток'коклюшным токс/чом устраняет АЫР-зивисимое'снижение концентрации сАМР в A2ÏÏ, Иншбирукщий вф1«кт ANP не проявляется на базальном уровне внутриклеточного САМР (рис.7).

- j7

250 г

g 225j

ю 200

o

v

175

o 150-

B 125 /

oC-/-

H30tipaTñJKiHüJI í"0 M!<M

11 10 9 8 7 8 -log (AWP),M

Püo.7. AMP -::aíi.*citT!o" азм^коние шг/тпиклеточной

концентрации oAMP E —и —^—в— - iuií,TK¡! , ца nórnóornuwití KT; —о—~о~ - v.Ti'TK!:, иОр.ч'ютаннпв- КТ.

В настоящее вромя видален и охарактеризован один из роцепто-'ров ANP, "который обладает. гушшлатниклазной активностью (Leltman, Murad, 1986]. Повышение концентрации ANP до 10*5 М приводит к 10-кратному увеличении внутриклеточнойконцентрации cGMP в А2.П. В отличив от АО, активность GC не опосредуется активацией G-белков, в соответствии с чем изопротерчнол и коклпщннй токсин Ш изменяют способности ANP повышать внутриклеточную концентрации сСМР в АГП (рис.8). Вероятно, иягибирущий ?-№кт МР

3.6 -

ё з.о-^ 2.5-

•ъ

Й 2.0 \

1.5 Н 1.0

0.5 -

I

о

+ иэопротерен 50 мкМ

-г-

1 1 10

I

9

В

7

—г~ 6

б

-1од (АМР), М

'Рис:.Р,. аыр-зависимое изменение внутриклеточной' концентрации г ОКР в Л2П.

—¿х—¿г- и --в—- клетки, не. обработанные КТ; ——о— - клетки, обработанные кТ.

на активность мембранной АС опосредуется ие известным рецептором, обладавши?.! . гуанилатциклазной активностью, а идам рецептором АНР, относящимся к ■ тг'чу 0-:белок-завистшх .р эцэпторов.. Согласно нашим данным, в А2П АКР ингибирует вденилаТциклззу с. помощью Отбелка, и вто ипгибирование осуществляется только на фоне стимуляции фермента 0 -белком, .в

вывода

1. В мембраино! и цатоэольной фракциях, выделенных иа легкого свиньи, выявлены и охарактеризованы сигнал-проводящив б-белки: 42 кДа (мажорный белок) и 45 кДа '(минорный белок) *ормн а-субъедишщ ' ХТ-чувствительного Оз~бэлка; а-субъединща Нечувствительных 0х1 - 41 кДа (минорный), Gl2 - 40 кДа (мажорнцй) и Gl3 - 41 кДа (шторный) белков; ^ -'38 кДа (маморная) и р, - 35 кДа (минорная) субтедшгита G-белкоп. В этих же фракциях легких проанализирован качественный и количественный состав SMG-белков. Обнаружены 21 кДа ras- и гас-белш; 25 кДа Gíf;K (0 ) белок; 19 кДа - AKF-белок; РА нДа (мажорные) и 26 кДа (мжторнне) Б03-чувствительные rho/rac-белки, а также 19-26 кДа БЧО-белки, которые • после электрофореза а присутствии DS 11ч й переноса на нитроцеллюлозу, сохраняют способность связывать GTP.

2. Обнаружено, что в легких С1-белки и БМО-белкя, обладающие способность» связывать GTP после электрофореза в присутствии Ш lía и переноса на нитроцеллюлозу (белки нитк ".целлюлозного связывания), способны взаимодействовать с Р-октином.

3. Показано, что в среде, содержащей Mg2* и GTP, из мембран легких высвобождаются а~субъединицц G - и Оз-бвлкоп. Под действием низкой ионной силы из этих же .мембран могут диссоциировать как а1-, так и 0-зубъодиницн О-белков.

4. Установлено, что в мс .бранах вльвооцитов второго порядка С1-бежи, чувствительные к коклюшному токсину, •представлен» а-субъодиница'ш G^-белка (40 кДа, мажорный; белок) и Й^-белкэ (41 кДа, минорный белок). В состав этих белков входит

' (З^субьедЕпащз о молекулярной массой 36 кДа.

б. «Атриалышй иатряйуретическиЙ ггоптид (АИР) при одних к тех' же кашдатрациях (10~9 - 10~б М) повитает'внутриклеточный уровень cGMP и подавляет гормопстимулировашгое повышение внутриклеточного уровня сАМР в вльвеоцитах второго порядка - секреторных эпителиальных клетках легких. Показано,, чтс снижение внутриклеточного уровня сАМР в' альвеоцитах второго порядка опосредуется ANP-зависимим ингдбированием активности адотматцктсласш с участием чувствительных к кочдипному токсину П..-белков.

с1шс0к публикаций по тек® диссертации

1. Старикова Ы.Р., Ланченко М.П.. Растворимый GTP-связыващий белок (G-белок) в легких млекоггитавдих, - Гезйсы докладов .VI Всесоюзного симпозиума "Роль циклических нуклеотидов и вторичных нос^бд(Мков^в регуляции фэрментативншс реакций", Петрозаводск,

2. litachuk V.A,, Hoffenber« S.I., Starlkova M.G., Panchenko M.P. Sigrial-transducirtg G-proteina of heart and lung. J. Hoi. Cell. Cardiol., 1989, v.21, p.91-95.

3. i'kachuk V.A., Hoiienberь' S.I., Starlkova M.G., Panchenko M.P., Danllenko M.P., Volno-Yaoenetskaya T.A., Nupenko E.V., Rybin V.O. Involvement of guanine nu':leotide~blnding regulatory proteins Into the process of hortnunai regulation of .signal transducing systems In mammalian cells. International Symposium "Molecular organisation of biological structures*. Abst. Book, v.t. Moscow, 1989. p.114. • • .

4. ikfichuk V.A., HoTienberg S.I., Starlkova M.G., Panchenko M.P., Danllenko M.P.- Chai^acterlsatlon of guanine nucleotW^-blndlng regulatory proteins in heart and lung. Sovlet-Janan oymposlum "Heceptors: structure and Junction'1, Abstracts, iu'oscow, t989, p.23.

s. Panchenko M.P., Starlkova M.O.,. Rubins .J.В., Levlne R.A. Dlckoy b.F. Inhibitory regulation of the adenylyl cyclase complex In rat alveolar type 2 epithelial cello by atrial natriuretic factor. World Coniference on Luna Health,. Abstracte, Boston. 1990. v.141, p.635. .

6.Panchenko M.P., Joyce-Brady M., Starlkova M.C., Dickey B.P., Brody J.S. Atrial natriuretic peptide Induces signal transduction by modulation oi adenylyl and guanylyl cyclasee and la a developmentally-regulated autocrine factor In pulmonary alveolar type 2 cells. J. Clin. Invest, 1992, в печати.

7. Панчеико M.П., Старикова М.Г., Гришин А.В.,- Копенко Е.В., Кабаева Н.В., Романов Ю.А., Антонов а.С., Ткачук В. а. Сигнал-нроводяпде и иизкомолекулярн-ые GTP- связиващие белки легких и эндотелия: локализация в мембранах и цитоволе,-взошодпйсгви9 с F-актином. Биохимия, 1992, в печати.