Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование конформационных изменений Ф-актина при его взаимодействии с головкой миозиновой молекулы методом поляризационной микрофлуориметрии

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование конформационных изменений Ф-актина при его взаимодействии с головкой миозиновой молекулы методом поляризационной микрофлуориметрии"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 577.353.2

ХОРОШЕВ Михаил Игоревич

ИССЛЕДОВАНИЕ КОНФОРМАЦИОННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ Ф-АКТИНА ПРИ ЕГО ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С ГОЛОВКОЙ МИОЗИНОВОЙ МОЛЕКУЛЫ МЕТОДОМ ПОЛЯРИЗАЦИОННОЙ МИКРОФЛУОРИМЕТРИИ

Специальность: 03.00.25 — Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1992

Диссертационная работа выполнена в Группе по изучению молекулярных механизмов клеточной подвижности Лаборатории биохимической цитологии и цитохимии Института цитологии РАН.

Научный руководитель — доктор биологических наук 10. С. Боровиков.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, профессор А. Д. Браун; кандидат биологических наук И. Е. Красовская.

Ведущая организация — Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН.

Защита состоится «26 » 1<-МЖ«-!) 1992 г. в О часов на заседании Специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан « 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат биологических наук

Л. Н. Писарева

@ Институт цитологии РАН

ХАРАКТЕРИСТИКА РЛЕО'Ш

Актуальность проблемы. На молекулярном уровне, мышечное сокращение является результатом циклического взаимодействия между "поперечным мостиком" (миозиновой голсвкоп), отходящим от толстой нити, и тонкой нитыо, состоящей, главным образом, из актина, что приводит к скольжению миозиноеых и актнчошх нитей друг относительно друга (Huxley, 1969). Окергия для работы одиночного "мостика" в течения цикла его прикрепления к Ф-актину, генерации силы и отсоединения черпается из химической энергии, высвобождаемой при пшроаизе АТФ (Lymii, Taylor, 1971 ), при этом происходит чередование отличных по аффинности форм связывания (основными являются "сильная" и "слабая") миозиновой головки с Ф-акгином (Eisenberg, Hill, 1985). В скелетных мышцах позвоночных регулпш-го актин-киози-нового взаимодействия осуществляет тропонин-тропомиозиновый комплекс тонких нитей (Ebashi, 1974). Остается, что насыщение Са2+-связыБачзщих центров тропонина С приводит к каскаду конформационных изменений как н тропонине С, так и н остальных белках-компонентах регуляторного комплекса: тропонине I, тропонине Т и тропомиозине, что снимает иншБлторнсэ влияние тропонина I (Zot, Potter, 1987). В гладка •миеч;'нх клетках также существует связанны'.! с тонкими нитями механизм регуляции сокращения, включающий в себя ингиОипонгаше» в отсутствие ионов Са2+ актин-миозкнопого рзчтоюлечетвип .-сонплексом кальдесмон-тропомиозин, причем кальлссисн т.ппяется, каг. предполагаот, аналогом коипяакса тропонина Т и тропэшча I скелетных мышц (Biryukov et al., 1SS0). Н^с-да^и ионики Ca2t кальмодулин снимает такое ингибкруицее возлейстг.че кальдесмона (Sobue et al., 1942).

К настоящему времени накоплено значительнее колкчестно данных о том, что в мономерах Ф-актлна в промессе сокращения и при его регуляции происходят конфоргатгатше изменения трехмерной упаковки полипеп гид:'on шли ( Yanmda, Por^/a, 1978, 1980; Боровике.в и др. , IS7G; Borovilcov. Onsev, Ш83). В соответствии с рептгеноструктуршмн данными !ябч " лр.

(КаЬесь ег а1., 1980"», молекула актина состоит из 4 субдоме-ноа. Вопрос о тол, отражают ли конфориационные изменения ак-тяноеого мономера в областях локализации флуоресцентных зондов изменения во взаимном расположении субдоменов актиновой молекулы и являются л;; такие изменения функционально важными, остается малоизученным.

Использование теневых №«иечных волокон (лишенных ииози-на, тропо!пюзина и тропонина) для сборки в их составе различных комплексов сократительных белков (в т.ч. флуоресцентно- мечешх) или их протеолитических фрагментов, а, в перспективе, белков, подвергнутых сайт-направленному мутагенезу, открывает новые возможности дня исследования процесса генерации силы на молекулярной уровне.

Цель и задачи исследования. \ ) изучение конформационных изменений в различных областях мономера Ф-актнна, вызываемых "слабой" и "сильной" формами связывания головки миозиновоя молекулы, при моделировании различных стадий цикла гидролиза АТФ; 2) исследование влияния скеяетнозышечного и гладкомы-шечного регуляторных белков тропонина I и кальдесмона на характер изменении конформзции Ф-актина, индуцируемых "сильной" формой связывания миозиновои головки; Л) выявление областей ииозиноной головки, ответственных за образование "слабой" и "сильной" форм ее связывания с Ф-актнном; 4) Использование теневых мшечных волокон для сборки в их составе различных комплексов сократительных белков или их протеолитических Фрагментов для исследования двигательного аппарата иьшечных и немышечных клеток.

Научная новизна и практическая значимость работы. 0 помоцьа методик ограниченного протеопиза и метода поляризационной никрофлуориметрии впервые получено подтверждение предположения о тон, что области головки миозиновой молекулы, ответственные за образование "слабой" и "сильной" форм ее связывания с Ф-актином, расположены, соответственно, в протеолитических Н-концевом фрагменте с Мг 75 кДа и С-конце-вом фрагменте с Мг 20 кДа головки. Показано, что присоедине-

ние этих фрагментов к актиновоя нити вьсывзет п ее мономерах различные конформационные изменения, выратяссцнеся в разнонаправленном изменении ориентации, относительно оси тонкой нити диполей излучения и степени подвижности флуорофороя зондов, расположенных в различных областях (субдоменах) мономера Ф-актшга.' Высказывается предположение о той, что такие коиформационные изменяя отражают изменения во взаимной ориентации различных областей актиновых мономеров.

Обнаружено, что наличие реконструированных в телег ом мышечном волокне регуляторных белков троионина I и кальдес-мона уменьшает размах конаюрмацнониых изменеичп в различных областях мономеров Ф-актина при "сильном'' форме связывания миозиновой головки. Высказано предположение о тс«, что регу-ляторная функция этих белков выражается в ингиби)к>иании изменении ориентации различных областей актиновсго мономера при такой форме связывания головки миознновои молекул.!.

Выявлено сходство в характере конфоркзпионных изменений в С-концевых областях мономеров нитей мышечного и кемычечно-го актина, собранных в теневом иьиечноч волокне, пронслодп-ших при "сильной" форме связывания ииозшювоп гон-ркн.

Дальнейшее развитие получили мгтодихи сйсрки в теневом мышечном волокне кролика белков-компонентов (или их протполитических Фрагментов), в т.ч. модиФиттрошниых о».чуорасд;-гкт-ными зондами, сократительного аппарата скелетнондогчгегх, глздконышечиых и немышечкых клеток. Использование т~'К01 о подхода открывает новые возможности дня ннг.ч'лпп иехличз.'п функционирования актоикозикозого шнгатеяьмс» о г.пп.лрлтл гг-мышечноя клетки на молекулярном уровне.

Апробация работы. Результата работы Сыпи допоарнч на VIII Всесоюзном симпозиуме "Биофизика и биохимия Риошгачес-кой подвижности" (Пущино, 1987), Всесоюзном совещании "Актуальные вопросы клеточной биологии" (Ленинград, 1РЗЗ), XVIII-XX Европейских конференциях по мышечному сокри'ч^пго и клеточной подвижности ( 1389, Люнтерен, Голландия; 1930, Брюссель, Бельгия; 1991, Оксфорд, Англия), VI Конференции Цито-

скелетного Клуба (Фугясосентрет, Дания, 1990).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, списания методов исследования, изложения результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит ... страницы машинописного текста, .. таблиц и .. рисунков. Список литературы включает ... источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. Материалы и методы исследования.

Методы получения бопков. Миозин и актин выделяли из скелетных иьвиц кролика (Ивзноо, Юрьев, 1881; Spudich, Uatt, 1971), а немышечный актин - из тромбоцитов свиньи (Rosenberg at al., 1881; Королев, Боровиков, 1891). Субфрагмент 1 (Cl) получали при переваривании киозинасх-хи;:отрипспнои (Wagner, Weeds, 1977), в модификации Оканото, Секине (Okanoto, Seki-ne, 1985). В., исследовании были использованы также беяки, полученные соавторами Новак Е. и Щчесноя Д. (Институт экспериментальной биологии, Варшава, Польша): скелетнонышечная и гладкотлшечная нзоформы тропомиозина, тропониновыи комплекс, тропонин I, кальдесмон и тяжелый меромиозИн ( ТММ ) ( с дефсс-форилированной легкой цепью 19 кДа ) из скелетномылечного миозина, имевший "сшивки", полученные с помощью H,H'-phenyle-nedimaleimide (pPDM), между 1]ис-697 и Цис-707, TMM(SH1-SH2), а также между Цис-697 и Цис-540, ТШ( SH2-SH540 ). В работе был использован также пептид 608 (Keane et al., 1990).

Лечение аминокислотных остатков актина. Модификацию Цис-374 Ф-актина флуоресцентными красителями N-( 7-dimethyl-amino-4-methyl-3-coumarinyl )maleimide (DACM), f luorescein-5-maleimide (Flu-Mal), 5-(2-(( iodoacetvl )amino')ethyl)amino)na-phthalene-l-sulfoníc acid ( 1,5-IAEDANS), 1,8-IAEDANS, 5-io-doacetamidof luorescein (5-IAF), te trame thylrhodam ine-5-(and-6 Kmaleimide (Rh-Mal) или нефлуоресцентным реагентом N-

ethylmaleimide (НЕМ) проводили, как списано ранее Боровиковым и др. ( 1988). Кечение Лиз-373 Ф-актина, нченчего блокированную НЕЙ тюлевую группу Цис-374, осудествпяпи с помощью зонда 4-chloro-7-nitrobenz-2-oxa-l,3-diazole (HED-C1) в сходных услових при молярном соотношении красителя с актином, равном 10:1. Модификацию Цис-Ю актина, имевшего блокированный МЕИ Цис-374, проводили в условиях, сходных с приведенными Древес, Фаулстич (Drewes, Faulstich, 1Э91 ), при молярных соотношениях Flu-Mai, 1,5-IAEDAHS, 5-IAF и NEM с актином, соответственно, 2:1, 10:1, 3:1 и 2:1. Мэчеиие Лиз-61 актина с помесью fluorescein-5-isothiocyanate (FITO "Изсмер I") проводили, как предложено Инки < M i К i, 1987).

Получение протеолитическнх препаратов 01. Получение препаратов 01, содержащих два протеояитических надреза, (С1т), между фрагментами 27 ¡(Да и 50 кДа, а также 50 хДа и 20 кйа, или один надрез, (С1а/т), мехду Фрагментами 50 кДа и 20 кДа, было проведено в соответствии с Иоке и др. (Mornet et al., 1979). Препараты Cl'(75) и С1м/т, с протео-литически удаленными фрагментами 20 кЛа или 50 кДа, были получены согласно Бурке, Сиварамакришнан (Burke, Sivaramakri-Ehnan, 1966) и Окакото, Секине (Okamoto, Sekine, 1907), соответственно, с очисткой гель-фильтрацией (Борориксв и ЛР- , 1988; Borovikov et al., 1391). Са2+-АТФ-азная и актин-акти-

nimnfiwrt M 2 Л —I 1 ~~К Т —i/Ч'I iní I'41— -TI t pi ГПГлЛГ^ гт—•_

(rrif-íy tí'C'TJ 11VJ — n¡4 J Irl 11 j-'C t Ю | ГП iOrj \J 1 \-Ч I f_ 'Í.J i A'-Г J i —

лись, как описано ранее (Borovikov et al. , 199J ).

Методы получения глицеринизнрованных и теневых мышечных волокон. Глицеринизированные мышечные волокна получали из т. psoas кролика (Rome, 1972). Окстракшго из гяишричизирсЕан- , ных волокон миозина, тропоииозина и тропоиина для получения теневых волокон проводили по ранее описанной методике ( Borovikov, Gusev, 1983). Модификация Цис-374 Ф-актина теневых мышечных волокон осуществляли с помощью 1,5-lAL'DAÎ!S (Боровиков и др., 1988 ). Большинство экспериментов было выполнено на моделях теневых кьшечных волокон, содержащих реконструированные тонкие нити. Методики сборки в волпкч? нчтеи пктн-

на, предварительно модифицированного различными красителями, являются предпочтительными в сравнении с методиками модификации собственных тонких нитей теневого мьшечного волокна, поскольку•они обладают большей специфичностью мечения тонких нитей (отсутствует модификация сократительных белков, оставшихся в теневой волокне) и, так как модификация некоторых аминокислотных остатков (Цис-10 и Лиз-61) может быть проведена эффективно лишь для актина, находящегося в мономерной форме (Drewes, Faulstich, 1991; Miki, 1987). Сборку актино-еых нитей проводили в соответствии с методикой, описанной Бороникошм и др. (198В). Реконструкцию нитей актина, модифицированного FITC по Лиз-61, осуществляли полимеризацией актина в теневом мышечном волокне присутствии фаллоидииа (Miki, 1987). Собственные и реконструированные нити теневого мьшечного волокна модифицировали родамин^фаллоидином (Kakol et al., 1987), с предварительной обработкой фаллоидином теневого волокна, в последнем случае. Сборку новых тонких нитей в теневом мышечном волокне контролировали измерением показателя его двулучепреломления (Yanagida, Qosawa, 1978; Хорошев, Боровиков, 1931) и электрофоретически (при сборке нитей флуоресцентно-меченого актина).

Исследование конфориационного состояния Ф-актина методом поляризационной микрофлурринетрии. Устройство поляризационного кикрофлуориметра было описано ранее (Иоффе и др., 1974). Регистрировались четыре составляющих света флуоресценции ( ||1ц , 11 | , | 1|| ). Значок слева от I означает параллельное ( || ) и перпендикулярное (J_) направление поляризации возбуждающего света, а те же значки справа от I -направления поляризации света флуоресценции зондов. Вычисление степеней поляризации флуоресценции (Р) при ориентации волокна параллельно (Р|| ) и перпендикулярно (Р_|_> плоскости поляризации возбуждающего света и математическое моделирование проводили так, как было описано ранее (Kakol^et al., 1987). Согласно модели, осцилляторы поглощения (А) и изяуче-ния (Е) красителя образуют с осью Ф-актина углы ФА и ФЕ ,

соответственно (Рис. 1). Разница между углами ФА и ФЕ составляет угол ^ и является постоянной величиной для флуоро-форов зондов, связанных с молекулой белка. Относительное число хаотически ориентированных флуорофоров отражается величиной Н, дзацей информацию о степени подвижности флуорофоров зондов. Угол 0 представляет собой угол между осью мышечного волокна и осью актиновой нити.

При изучении спектров излучения флуорофоров использовавшихся зондов не было обнаружено их сдвига по длине волны (данные не приводятся). Ото свидетельствует в пользу того, что изменения направления осцилляторов излучения и подвижности флуорофоров зондов вызываются кокформациснными изменениями белков, характерными для актин-миозинового взаимодействия, а не изменениями условий микрэокружения Для таких флуорофоров.

II. Результаты и обсуждение.

Изменения конформационного состояния в различных областях мономера Ф-актина при "сильной" форме связывания ниози-новоя головки. Сборка новых актиновых нитей из мономерного актина (модифицированного флуоресцентными зондами или не мо-

Рис. {. Диаграмма, объясняющая вычисление параметров поляризованной флуоресценции (Уапад1с1а, Оозаыа, 1978; Како! ег а1., 1987). О - угол между осью Ф-актина ОМ и осыо 1 отечного волокна 02 при параллельном. ( Ц ) и перпендикулярном (_1_) направлении возбуждающего света. ФА , ФЕ - углы между осш Ф-актина и направлением диполя поглощения (А) и диполя излучения (Е) флу-эрофоров, связанных с Ф-актином, соответственно. ^ - угол чежду (А) и <Е).

X

дифицированного) в теневой мышечном волокне приводила к увеличению его дпулучепреломления на 60+5%. Ото означает, что актинозыэ нити кишечного волокна удлиняются, либо в волокне образуются новые филаменты. Формирование новых нитей представляется более вероятным, поскольку Илшвата и Фунатсу (1ЕЬгиа1:а, Рипагзи, 1585) не обнаружили удлинения тонких нитей в близких зксперинентальных успоБиях. Об упорядоченном расположении реконструированных нитей актина параллельно оси ньидечного волокна свидетельствуют также близкие по абсолютной величине степени поляризации Рц и Р_]_ флуоресценции 1,5-1АЕ0АН5 и родамнп-фаллоидина, связанных с собранными нитями или тонкими нитями теневого мышечного волокна. Реконструированные нити актина сохраняли способность взаимодействовать с С1. Об этом свидетельствуют изменения степеней поляризации Р|| И Р^ флуорофоров этих зондов при "сильной" форме связывания ниозиновой головки.

С помощью математического моделирования (Како1 е1: а1., 1387) были оценены величина углов ФЕ и значение N (при использовании красителя родамин-фаллоидинэ - величина б1п20 , характеризующая гибкость тонкой нити). При связывании 01 с реконструированными нитями и собственными тонкими нитями теневого мышечного волокна наблюдались изменения ведичик угла для зондов, расположенных в различны* областях актино-вых мономеров (Рис. 2). Сходство таких изменений для различных зондов, связанных с одним н тем же аминокислотным остатком актина (Цис-10 или Цис-374), свидетельствует в пользу того, что изменения ориентации осцилляторов излучения н подвижности флуорофоров зондов отражают изменения ориентации достаточно протяженных областей мономера относительно оси тонкой нити, вызванные присоединением С1. Для зондов, расположенных в субдокене 1 (связанных с Цис-10, Лкз-373 и Пис-374), набяодалось увеличение углов ФЕ. Для зондов же, локализованных в других областях мономера актина - в субдомене 2 (Лиз-61) н в межпоменнсн пространстве (родамнн-фалло-идина, находящегося между субдоменом 1 и субдоменом 3), от-

мечалось уменьшение углов ФЕ (Рис. 2). Следует отметить, что изменения угла ФЕ , сходные с его изменениями в случае рода-мин-фаллоидина, отмечались ранее для зонда е-АЛФ, также расположенного в междоменной области, при связывании ТМИ (Yanagida, Oosawa, 1978) или С1 (Borovikov et al., 1982). На основании полученных данных, можно предположить, что "сильная" форма связывания миозиновой головки приводит к изменению ориентации субдомена 1 мономера тонкой нити относительно остальной части молекулы актина.

Локализация областей "сильной" и "слабой" форм связывания Ф-актина в головке миозиновой молекулы. Уровень актнн-активируемоя 11д2+-АТФ-азной активности интактного G1, С1а/т и С1т возрастал з присутствии Ф-актина, соответственно, н 15, 14 и 3 раза, в то время как для препаратов СЧм/т и СГ. (75) не наблюдалось такого увеличения активности, что соответствует данным литературы (Mornet et al., 1979. 1981; Burke et al., 1S86), за исключением препарата СГ (75) (Oka-noto, Sekine, 1987). Потеря препаратами С1м/т и С1'(75) способности к увеличению своей Мд2+-АТФ-азной активности в присутствии Ф-актина объясняется, по-видимому, потерей препаратом С1м/т фрагмента 50 кДа, участвующему в гидролизе АТФ

10

Рис. 2. Изменения углов ©Е ФлуороФоров зондов, расположенных в различных областях мономера Ф-актина, при "сильной" форме связывания Cl. Обозначения: 1, 2-Flu-Mal, 5-IAF (Цис-10); 3-

NBD-C1 (Лиз-373); 4-9- 1,8-IAEDANS, DACM, Rh-Mal, Fin-lia!, 1,5-IAEDANS, 5-IAF

(Лиз-61 );11- роламин-фалпо-ииин (междоменная область ).

Таблица 1. Изменения характеристик поляризованной флуоресценции (/хРц , , ДФЕ и ДБШг0 ) родамин-фаллоидина, связанного.с Ф-актинон теневого мыиечного волокна, при присоединении к тонким нитям протеолитических фрагментов миозина 01. С1а/т, С1т, С1м/т, С1'(75), ТМЖ5Н1-8Н2), ТМЖ5Н2-БН540) и пептида 608. Обозначения: см. "Материалы и методы".

Препарат ДР||(отн. ед. ) АР[(отн.ед. > ДФЕ< °) Дет2©

01 +0,039+0,003 -0,039+0,002 -1,5+0,1 +0,004

С1а/т +0,042+0,003 -0,022±0,003 -1,7+0,1 +0,014

С1т +0,048+0,002 -0,025+0,002 -1,9+0,1 +0,016

С1м/т +0,044+0,003 -0,038+0,002 -2,0+0,1 +0,017

ТМЖ5Н2-8Н540)+0,006+0,002 +0,018+0,004 -0,8±0,1 +0,017 пептид 608 +0,010+0,007 -0,014+0,003 -1,5+0,2 +0,005 01'(75) -0,020+0,003 +0,011+0,002 +0,6+0,1 -0,003

Ш(8Н1-ЗН2) -0,005+0,003 +0,028+0,003 +0,8±0,1 -0,002 Примечание. Представлены изменения (А) средних величин и их стандартных шибок, полученных для 55-100 измерений в каждом варианте опыта (а также в других таблицах). стандартные шибки величины Б1пгв для всех препаратов равны +0,001.

(Mahmood, Yount, 1984), и актин-связывающей области между фрагментами Я) кДа и 20 кДа (Chaussepied, Morales, 1989; Yainamoto, 1989, 1990), а препаратом СГС75) - актин-связыва-ющего участка, расположенного во фрагменте 20 кДа (Katoh et al., 1984). В исследовании, :помимо протеолитических препаратов 01, были использованы препараты ТИМ, имеющие химические "сшивки" (см. "материалы и методы исследования") (Боровиков и др., 1990). Считается, что миозиновая головка, содержащая "сшивку" SH1-SH2, связывается с Ф-актином в "слабой" форме, моделируя стадию цикла гидролиза АТФ актомиозиновым комплексом Ф-актин-миозин-АТФ (Ф-актин-миозин-АДФ-Фн) (Uells,

Уоипг, 19В2), а головка со "сшивкой" ЗН2-5Н540 образует разновидность "сильной" формы связывания с тонкой нитью, иоде-лируя стадно Ф-актин-миозин-АДО (СЬаиБзер1ес1 et а1., 19В8).

При связывании с теневым мышечным волокном препаратов миозиновой головки наблюдались изменения поляризованной флуоресценции родамин-фаллоидина, причем для препаратов С1а/т, С1т, С1м/т и интактного 01 отмечалось возрастание абсолютных значения Рц и Р|_ , а для препарата С1'(75) - их уменьшение (Табл. 1). Различие между этими препаратами было обнаружено также с помощью математического моделирования при оценке углов Ф и значения э1п20 для данного зоила: в случае препарата С1'(75) угол ФЕ увеличивался, значение эШ20 уменьшалось, в то время как для остальных препаратов наблюдались противоположные по характеру изменения этих параметров (Табл. 1).

Присоединение препаратов С1, С1м/т и С1'(75) к нитям Ф-актина, модифицированного по Цис-374 1,5-1АЕ0АНЗ, вызывало изменения параметров поляризованной флуоресценции этого зонда (Табл. 2). При связывании С1 и С1м/т наблюдались уменьшение степени поляризации Р|| , величины N. а тагсге увеличение и угла ФЕ. Для препарата же С1'(75) отмечались противоположные по характеру изменения значений ФЕ и N и аналогичные - Рц и Р^ , однако размах изменения последних был значительно • меньшим по величине (Табл. 2).

Изменения параметров поляризованной Флуоресценции рода-мин-фаллоидина и 1,5-1АЕ0АН5, набяодаемые при присоединении ТИМ( 5Н2-5Н540), были в большей степени сходна с изменениями, отмеченными для 01 и С1м/т. В свсю очередь, похожие по характеру изменения таких параметров были отмечены для • ТМЖ5Н1-ЗН2) и 01' (75) (Табл. 1 и 2). Из данных следует, что связывание С1м/т нызывает в Ф-актине конформациоиные изменения, аналогичные по характеру тем, которые наблюдаются при присоединении интактного С1 и ТМЖ 5Н2-5Н540). Это означает, что фрагмент 20 кДа, находящийся в составе препарата С1м/т ответственен за конформационные изменения в мононерзх Ф-ак-тина в области расположения зондов родэмин-фзлпоидина и 1,5-

IAEDANS, происходящие при "сильной" форме связывания миози7 новой головки. Связывание же препарата 01'(75) вызывает кон-формационные изменения Ф-актина, свойственные для "слабой" форш связывания головки, и, следовательно, фрагмент 75 кДа содержит область полипептидной цепи, ответственную за такие конфоркационные изменения. Следует заметить, что при элект-рофоретическом исследовании связывания СГ (75) с Ф-актином •теневых мышечных волокон было обнаружено, что при протеоли-тической деградации Cl'(75) до фрагмента с Мг меньшей на 2-3 кДа, такой фрагмент перестает связываться с мылечным волокном. Участок полипептидной цепи, подверженный такому протео-лизу находится, в соответствии с данными литературы (Bertrand et al., 1989; Yamamoto, 1989, 1990), в области соединения фрагментов 50 кДа и 20 кДа ( т. е. в ближней к С-концу тяжелой цепи области фрагмента 75 кДа ), причем в ней находится участок цепи, ответственный, как предполагается, за образование "слабой" формы связывания головки с Ф-актином (Chaussepied, 1989). В связи с этим, можно предположить, что такой актин-связывающий участок расположен в С-концевой области фрагмента 75 кДа.

Интересно также отметить, что пептид 608 (Keane et al., 1990), представлявший собой аминокислотную последовательность, аналогичную участку фрагмента 20 кДа, содержащего SH1 и SH2 группы, вызывает сходные с препаратом Cl м/т изменения параметров поляризованной флуоресценции родамин-фаялоидина: степеней поляризации Р|) и . угла ФЕ и значения sin29 (Табл. 1 ), Значения Р|| , Р_[_ , ФЕ и N для зонда Flu-Mal, связанного Цис-374 Ф-актина, реконструированного в теневом мьюечном волокне, изменяется при присоединении пептида 608 аналогичным по характеру образом (хотя и в значительно меньшей степени) со значениями этих параметров при связывании интактного Cl, а также со значениями параметров для зонда 1,5-IAEDANS, связанного Цис-374 Ф-актина теневых мьшечных волокон, в случае присоединения интактного Cl и С1м/т (Табл. 2). Ото позволяет сделать предположение о том, что актин-

Таблица 2. Изменения характеристик поляризованной флуоресценции (АРц , ДР_]_ , ° ДФЕ и АИ) зонда 1,5-1АЕ0АНБ, связанного с Цис-374 Ф-актнна теневого мышечного • волокна, при присоединении к тонким нитям протеояитических фрагментов миозина С1, С1м/т, С1'(75), ТММ(5Н1-ЗН2), ТМЖЗН2-ЗН540), или зонда Р1и-Ма1 - в случае пептида 608. Приведены также изменения углов (Д(^), причем для фрагментов миозина - угла ^ = ФЕ (1,5-1АЕПАНБ) - ФЕ (родамин-фаллоидин), а для пептида 608 приведены изменения угла|^2 = ФЕ (Р1и-Ма1) - ФЕ (родамин-фаллоидин) (углы ФЕ для родамин-фаллоидина см. Табл. 1). Обозначения: см. в "Материалах и методах".

Препарат ДР||(отн.ед. ) ДР|_< отн. ед. ) ДФЕ (°) ДЖотн.ед. ) Д^'С)

С1 -0,104+0,003 +0,040+0,002 +2,9+0,1 -0,244+0,009 +4,4+0,1

С1м/т -0,054+0,003 +0,042+0,001 +3,3+0,1 -0,287+0,011 +5,3+0,1

ТМЖ 5Н2-БН540) -0,002+0,002 +0,007+0,001 +0,6+0,3 -0,099+0,025 +1,2+0,3

пептид 608 -0,009+0,007 +0,018+0,003 +0,9+;0,2 +0,003+0,012 +1,4+0,2

С1' (75) -0,005+0,003 +0,013+0,002 -0,5+0,1 +0,067+0,009 -1,1+0,1

ТМЖ8Н1-8Н2) +0,005+0,003 +0,014+0,002 +0,4+0,2 +0,041+0,015 -0,4±0,2

связывающий участок (или, по крайней мере, часть его) в Gl, вызывающий конформационные изменения Ф-актина, характерные для "сильной" формы связывания миозиновой головки, находится в фрагменте 20 кДа в районе локализации SH1 и SH2 групп. Полученные данные экспериментально поддерживают это предположение, выдвинутое ранее в работах Мориты с соавторами (Katoh et al., 1934; Eto et al., 1990), а также данные, полученные . Keane и др. (Keane et al., 1990) и Беттаче и др. (Bettache et al., 1992).

Так как использовавшиеся метки родамин-фаллоидин и 1,5-IAEDANS (или Flu-Mal, в экспериментах с пептидом 608) были локализованы в различных областях мономера Ф-актина, а также в связи с тем, что изменения углов ФЕ для этих зондов были противоположны по характеру при моделировании как "сильной", так и "слабой" формы связывания препаратов миозина (Табл. 1 н 2), было сделано предположение, что участки полипептидной цепи актина в областях локализации данных зондов изменяет свое взаимное расположение при присоединении миозиновой головки. Разница между величинами углов ФЕ для таких красителей была использована в качестве показателя (угла ^ , или угла [^2 - в экспериментах с пептидом 608) изменения взаимной ориентации между этими областями мономера Ф-актина, происходящих при связывании головки миозиновой молекулы. При присоединении интактного С1 и С1н/т угол увеличивался на 4,4° и 5,3°, соответственно (Табл. 2). Для препарата ТМЖSH2-SH540), образующего "сильную" форму связывания с Ф-актином, также наблодалось возрастание угла^ : на 1,2°. Необходимо также заметить, что изменение угла fj,2 между направлением диполей излучения флуорофоров Flu-Mal и родамин-фаллоидина, вызванное связыванием пептида 608, было сходным с изменениями, отмеченными для 01, С1м/т и Tiffl( SH2- SH540): угол увеличивался на 1,4°(Та6л. 2). При присоединении же С1' (75) и ТШ( SH1-SH2), образующего "слабую" форму связывания миозиновой головки, набшдалось уменьшение угла на 1,1° и 0,4", соответственно (Табл. 2).

• Следовательно, для препаратов С1м/т и СГ<75) набяода-лнсь противоположные по характеру изменения угла ^ , причем они были сходны с изменениями, вызываемыми препаратами ТМЖSH2-SH540 ) и ТМИ( SHI-SH2 ), связывающихся с Ф-актинои в "сильной" и "слабой" форме, соответственно. Ото дает основания считать, что С1м/т и СГ (75) вызывают при своем связывании разнонаправленные, относительно оси Ф-актина, изменения области субдомена 1 и остальной части актинового мономера. Можно заклочить поэтому, что за такие изменения ориентации субдомена I, относительно остальной части молекула актина, отвечают, соответственно, участок(ки) тяжелой цепи миозина, расположенный в ее фрагменте 20 кДа, и участок(ки), находящийся в фрагменте 75 кДа. В пользу участия Н-концевых и С-концевых областей полипептидной цепи молекулы актина, расположенных в ее субдомене 1, в связывании с миозиновой головкой свидетельствуют данные литературы, полученные с использованием "сшивок" («omet et al., 1981; Sutoh, 1982; Bertrand et al., 1988), метода ЯНР (Hoir et al., 1986, 1987), пептидов ( Van Eyk, Hodges, 1991) и антител ( Mejean et al., 1986, 1987; Miller et al., 1987; DasGupta, Reisler, 1989; DasGupta et al., 1990). Полученные данные поддерживают также ранее высказанное предположение ( Borovikov et al., 1989, 1990) о том, что взаимное расположение различных областей актинового мономера зависит от ковформационного состояния присоединяющейся миозиновой головки (т.е. от состояния ее актин-связываквдих участков) при моделировании различных стадий цикла гидролиза АТФ актомиозином.

Влияние регуляторных белков на конфорнацио Ф-актина при связывании головки миозиновой молекулы. Тропонин I и каль-десмон снижали уровень характерного для "сильной" формы свя-элзания Cl уменьшения угла ФЕ ориентации диполя излучения родамин-фаллоидина - на 11% и 88%, соответственно, и вызывали ингибирование изменения величины sin2G , отражаакей гибкость тонкой нитн - на 65% и 47%, соответственно ( Табл. 3 ). Скелетный и гяадкомыпечный тропомиозин усиливали этот эф-

Таблица ,3. Значения угла ФЕ и sin2G для флуорофоров родамин-фаллоидина, связанного с Ф-актином теневого мьшечного волокна, в отсутствие и в присутствии 01, тропомиозина, тропони-на I и кальдескона. Обозначения: TH-I- тропонин I, КД- каль-десмон, ТМс и ТМг- скелетномьшечныи и гладкомышечный тропо-миоэин, соответственно; см. также "Материалы и методы".

Лобавка 01 ФЕ<°> sin20* Добавка 01 ФЕС) sin2©*

39,9+0,1 0,051 39,9+0,1 0,051

- + 39,0+0,1 0,068 - + 39,0t0,1 €,068

TH-I - 39,4+0,1 0,069 КД - 39,3+0,1 0,050

TH-I + 38,6+0,1 0,075 КД + 39,1+0,1 0,059

ТМс - 41,7+0,2 0,036 ТМг - 39,8+0,1 0,055

ТМс + 40,5+0,1 0,067 ТМг + 38,6+0,1 0,073

ТМс- TH-I - 40,9+0,3 0,052 ТМг- КД - 39,3+0,1 0,062

ТМс- TH-I + 39,7+0,2 0,047 ТМг- КД + 39,6+0,1 0,070

Примечание. »- стандартные ошибки величины бШ29 во всех вариантах эксперимента составляли +0,001.

Фект. В присутствии тропомиозина уровень изменения гибкости тонкой нити (величины 5Шг6 ), содержащей кальдесмон, инги-бнруется на 56%, а изменения угла ФЕ - полностью (с небольшим обратным эффектом). При исследовании комплекса Ф-актина с тропомиозином и тропонином I наблюдалось даже падение величины 5шг0с 0,052 до 0,047 (Табл. 3). Следовательно, тропонин I и кальдесмон оказывают сходное влияние на характер изменения гибкости тонких нитей и ориентации флуорофоров родамин-фаллоидина, связанного' с Ф-актином, при присоединении 01.

Об аналогичном ингибиругацем эффекте тропонина I и кальдескона свидетельствуют данные по величинам углов ФЕ , характеризующих ориентацио осцилляторов излучения флуорофоров 1.5-1АЕ0АНЗ, связанного с.Цис-374 Ф-актина,относительно оси

Таблица 4. Значения угла ФЕ и величины N для флуорофоров 1,5-1АЕ0АМЗ, связанного с Цнс-374 Ф-актина теневого мькечного волокна, а такие угла^ = ФЕ (1,5-1АЕ0АК5) - ФЕ (родамин-фаляоидин) (углы ФЕ для родамин-фаллоидинз см. в Табл. 3), в отсутствие и в присутствии 01, тропокиозина, тропоачиа I и кальдес-

4*птп ПйппцигАтп/а« Т-1Й« 7

пипа. "хсппл. Ьп • 1 ош 1. ч^

"М —> »Г-глглтг—» т

пел ьт^упат

п ПСГ X

Добавка С1

ЫСотн.ед. > (° ) Добавка С! ФЕ( ° ? Ж отн. ед. ) ^ ( ° )*

ТН-1

ТН-1

ТКс

ТИс

ТМс-

ТКс-

ТН-1 ТН-1

52,955,7 53,5

сии , и

53,1 чс п

\J\Jf и

53,4 53,9

0,503+0,006 0,320+0,012 0,44910,005 0,353+0,003 0, -45/тО , слЗ^ 0,353+0,003 0,468+0,003 0,526+0,003

13,010,1 16,7+0,1 14,1+0,1 17,0+0,1 11,4+0,2

1О,иту,1

12,5+0,3 14,2+0,2

КД

КД

ТИг

ТМг

"ГМг-

ТКг-

52,9

55.7

52.8 54,3

0,503+0,008 0,320^0,012 0,462+0,008 0,360+0,008 0,

ппа

Примечание.

+ 56,4 0,255+0,010

КД - 54,2 0,346+0,009

КД + 55,7 0,289+0,009

углов фц- и бо вслэх йариз

13.0

16.7 13,5 15,2

11 а

а-,и

17.8

14.9

16.1

данной серим эксперимента (столбца) составляли +0,1°.

тонкой нити (Табл. 4). Тропонин I, в отсутствие и в присутствии скелетномышечного тропомиозина, снижает уровень увеличения угла ФЕ , вызываемого "сильной" формой связывания 01 на 25% и 83%, соответственно. Кальдесмон вызывает аналогичное ингибирующее воздействие, которое характеризовалось сле-дующимнми величинами: 46% и 61%, в отсутствие и в присутствии глалко!;ышечного тропомиозина, соответственно. Связанные с Ф-актином теневого мышечного волокна тропонин I и кальдес-мон снижали также размах уменьшения величины Н, как в присутствии соответствующих изоформ тропомиозина - на 100% (с заметным обратным эффектом) и 35%, так и в нх отсутствие -на 51% и 44%, соответственно (Табл. 4).

Таким образом, "сильная" форма связывания миозиновой головки с Ф-актином вызывает увеличение угла , представляющего собой разницу между значениями углов ФЕ для 1,5-1АЕ0ЛК5 и родамин-фаллоидина, связанных с Ф-актином, что было интерпретировано как изменение взаимной ориентации субдомена 1 и остальной части актинового мономера (см. выше в "Результатах и обсуждении"). Данные Табл. 4 свидетельствуют о том, что размах такого увеличения угла (с 13,0° до 16,7 ), наблюдавшегося при связывании С1, значительно уменьшался в присутствии тропонина I (на 22%) и кальдесмона (на 54%). В присутствии скелетномышечного и гладкомышечного тропомиозина Ееличина такого ингибирующего эффекта тропонина I и кальдесмона возрастала, соответственно, до 59% и 76%. Для регулируемых тонких нитей, содержащих тропомиозин-тропо-ниновып или тропомиозин-кальдесмон-кальмодуликовый комплексы, характер изменений конформационного состояния актина, происходящих при связывании миозиновой головки, зависит от концентрации Са2+ 1Са2+1 . Так, при низких [Са2+1 , в присутствии кальдесмона, не отмечалось изменений угла ФЕ , происходящих при "сильной" форме связывания С1 с Ф-актином, а уровень уменьшения угла ФЕ в присутствии тропонина I составлял 60% от уровня изменений, наблюдавшихся при высоких 1Са2+1.

. Таким образом, регуляторный эффект тропонина I и каль-десмона объясняется, по-видимому, их способностью уменьшать размах изменений во взаимной ориентации различных областей мономера актина (в первую очередь, субдомена 1), вызываемые связыванием миозиновой головки (Borovikov et al., 1989, 1991) и, следовательно, ингибировать подвижность различных субдокенов молекулы актина. Имеющиеся в литературе данные говорят о том, что области мономера актина, входящие в состав ее субдомена 1, помимо миозиновой головки, связываются также с тропонином I (Johnson, Blazyk, 1978; Grabarek, Ger-gely, 1987; Levine et al., 1988) и кальдесмоном (Patcheil et al., 1989; Adams et al., 1990; Bartegi et al., 1990; Levine et al., 1990; Crosbie et al., 1991; Graceffa, Janeso, 1991). В пользу того, что тропонин I и кальдесмон уменьшают подвижность таких областей актинового мономера, говорят данные Табл. 3, касающиеся уменьшения в присутствии этих белков величины возрастания гибкости тонкой нити в целом (величина sin20 ), вызываемого связыванием С1. Следует заметить, что Мики (Miki, 1990, 1991 ), на основании данных по измерению расстояний между зондами, связанными с актиновым мономером или регулятеркыми белками, высказал близкие к выаеизложенным предположения о том, что регуляция актин-миозинового взаимодействия тропонин-тропомиозиновыи комплексом сопровождается движением друг относительно друга доменов (или субдоменов) актинового мономера.

Представленные данные свидетельствуют о том, что изменения степени подвижен ости и взаимной ориентации различных областей эктиноеого мономера могут сопровождать регуляцию тропонином I и кальдесмоном "сильной" формы связывания . миозиновой головки с тонкой нитью.

Конформационные изменения немышечного Ф-актина при связывании миозиновой головки. В экспериментах использовалась смесь Jb и ^ изоферм кекышечкого актина из тромбоцитов свиньи. Вызванные присоединением С1 изменения степеней поляризации P|j и Pj_ флуоресценции зонда 1,5-IAEDANS, связанно-

Таблица 5. Характеристики поляризованной Флуоресценции (Р]_ , Рц , ФЕ и N) 1,5-1ЛЕ0А1!5, связанного с Цис-374 Ф-актина теневого мышечного волокна или с собранными в волокне нитями скелетнонышечного и немыцечного актина, в отсутствие и в присутствии 01. Обозначения: Т.в. - теневое мыыечное волокно; ФАмыш. и ФАнем. - нити, соответственно, мышечного и не-мьаиечного актина, реконструированные в теневом мышечном ео-локне; остальные обозначения см. в "Материалах и нетодах".

Вариант Рц(отн. ед. ) Р|^(отн. ед. ) ФЕ ( ° ) N (отн. ед. ) опыта

Т. в.

То же + С1 Т. в. —ФАмьяи, То же + 01 Т. в. -ФАнем. То же + 01

0,164+0,002 0,060+0,004 0,142+0,005 0,122+0,031 0,193+0,006 0,070+0,005

0,092+0,001 0,132+0,002 -0,034+0,001 0,146+0,003 0,042+0,002 0,148+0,003

53,8+0,1 56,7+0,2 51,4+0,3 55,2+0,1 52^+0,1 56,9+0,2

0,333+0,008 0,08310,007 0,196+0,006 0,066+0,007 0,295+0,016 0,131+0,014

го с иынечным и немышечным Ф-актином, собранным в теневом мышечном волокне, являлись сходными по характеру: Р|| уменьшалась, Р_[_ увеличивалась (Табл. 5).

Аналогичными по характеру были также изменения этих параметров для реконструированных тонких нитей и актиновых нитен волокна. С помощью математического моделирования были оценены значения углов ФЕ между направлениями диполей излучения олуорофоров 1,5-1АЕВАН5, связанного с реконструированным иьаиечным н немышечным Ф-актином, и осями таких нитей. Изменения таких углов были также сходны по характеру и близки по величине: они увеличивались на 3,8° и 4,6°, соответственно (Табл. 5). Для нитеи неныпечного актина, как и для реконструированного мышечного Ф-актина, отмечалось характерное для "сильной" формы связывания ниознновой головки уменьшение относительного числа хаотически ориентированных флуорофоров

1,5-1АЕ0АНЗ, выраженное изменениями величины Н: ее уменьшением, соответственно, на 0,164 отн. ед. и 0,130 отн. ед. (Табл. 5). Это говорит о том, что при связывании 01 происходило практически одинаковое по величине падение уровня подвижности флуорофоров зонда, расположенного в С-кониевых областях мономеров мьшечного и немышечного актина.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют а пользу того, что в немышечном Ф-актине при связывании головки миозинсвои молекулы происходят конформационные перестройки аналогичные тем, которые имеют место в нитях скелетномы-шечного актина в процессе генерации силы.

ВЫВОДЫ

1. Теневые мышечные волокна были использованы для сборки в их составе комплексов сократителыых белков (в т.ч. флуоресцентно-меченых) или их протеолитических фрагментов при исследовании конформационных изменений в Ф-актине при его взаимодействии с головкой миозиновои молекулы. Применение таких методик реконструкции сократительного аппарата ске-летномышечных, гладкомышечных и немьшечных клеток открывает новые возможности для исследования механизма генерации силы.

2. Присоединение протеолитического С-концового фрагмента 20 кДа головки миозиновои молекулы вызывает в Ф-актине конформационные изменения, характерные для "сильной" формы связывания миозиновои головки с актином, в то время как Ы-концевой фрагмент 75 кДа принимает участие в "слабой" форме связывания миозиновои головки с тонкой нитью.

. 3. При моделировании "слабой" и "сильной" форм связывания миозиновои головки с Ф-актином выявлены различные по характеру изменения ориентации относительно оси Ф-актина диполей излучения и степени подвижности флуорофоров зондов, расположенных в субдомене 1 мономера Ф-актина (связанных с аминокислотными остатками Цис-10, Лиэ-373 к Цис-374), по сравнению с наблодавшимися изменениями для

зондов, локализованных в остальной части зктинового мономера (зонда, связанного с Лиз-61, или зонда, находящегося в междоменной области).

4. Присутствие реконструированных в теневом мышечном волокне скелетномышечиого и гладкомьшечного регуляторных белков

( тропоннчэ 1 и кальдесмона ) ингибирует кошюрмационные изменения Ф-актина, вызываемые "сильном" формой связыва- . имя миозиновои головки. Соответствующие изоформы тропоми-озина усиливали такое ингибирушее влияние тролонина I и кальдесиока.

5. Разпичие п характере изменения направлении ориентации (относительно оси Ф-актина) осцилляторов излучения флуо-роФоров зондов, расположенных в субдомене 1 актинового мономера, и зоядон, локализованных в других его областях, свидетельствует в пользу изменения ориентации субдонена 1 относительно остальной части актиновой молекулы при присоединении миозииовой головки. "Сильная" и "слабая" формы свлзчпання головки миозииовой молекулы вызывают противоположим-:? по характеру изменения взаимной ориентации таких областей мономера Ф-актина. Предполагается, что тро-понин I и кальцесмон оказызаот сходное регулирующее воздействие, которое заключается в уменьшении размаха изменении оо взаимной ориентации субдомена I актинового моно-

• мера и его остальной части, по крайней мере, при "сильной" Форма связывания миозиновэи головки.

8. В С-концевых областях мономеров нитей немышечного н скелетномышечиого актина, собранных в составе теневого мышечного волокна, при "сильной" форме связывания миозииовой головки происходят близкие но характеру конформацион-ные изменения, что указывает на возможность существования принципиально сходного'механизма генерации силы актомио-зином в цикле гидролиза АТФ в шеечных и немышечных клетках.

лимит/- npurrouuv dactit ■-лшспмрпялшл.п/ ПП Tt?!*tT лшу^отднми

wiinwon yjwil.,1 ,'i.¡J-i nuU 1, uiijufiiiuuijnniiuj\ Liu 1E.I1C1 inUtili

1. Хорошев И. И., Вдовина И. Б. , Кулева Н. В., Боровиков ¡0. С. Влияние протеолиза ниозиновых головок на конфориационные перестройки в Ф-актнне // VIII Всесоюзный Симпозиум ''Биофизика и биохимия биологической подвижности". Тезисы докладов. - Пущина: 1887. - С. 39.

2. Боровиков Ю. С. , Кулева Н. В., Хорошев М. И. , Вдовина й. Б. Влияние протеолиза ниозиновых головок на индуцируемые ими структурные перестройки Ф-актнна // Биохимия. - 198В. -

Т. 53, Н 10. - С. 1754-1757.

3. Хорошев М. И. , Кулева Н. В. , Боровиков Ю. С. Влияние субфрагмента 1 инозина на структуру актина из скелетных мьюц

1> ^«.Сг.,,,,»™ // (C.QQ Т "71 U О О 1 (

N i i^V/rawUitrt i WO // ilHIWJUIiin, — iuuo. — 1 . v^ I , 11 о — 1 Ю.З

( Тезисы докладов Всесоюзного Совещания "Актуальные вопросы клеточной биологии", Ленинград, 1989).

4. Borovikov Vu.S., Kuleva II. У., Khoroshev 111., Udovina

I.В., Kirillina V.P. The interaction of myosin head with actin in muscle fibre. A polarized microfotometry investigation // Xyillth European Conference on muscle and motility. - Lunteren, The Netherlands: 1989. - P.32.'

5. Боровиков Ю. С., Щчесна Д., Хорошев М.И., Конколь И. Исчезновение зависимости актнн-ииозинового взаимодействия от фосфорилирования легких цепей миозина при "замораживании" структуры тяжелого мероииозина бифункциональным реагентом // Цитология. - 1990. - Т. 32, N 5. - С. 481-488.

6. Боровиков Ю. С., Новак Е. , Хорошев М.И., Дабровска Р. Кальдесмон и субфрагмент-1 миозина по-разному влияют на структурное состояние модифицированного 1.5-1AEDAH3 тро-помиозина в теневых мышечных волокнах. // Биохимия. -1990. - Т. 55, N 7. - С. 1294-1297.

7. Borovikov Yu. S. , Udovina I. В., Khoroshev 111. , Kirillina V.P. The orientation of fluorescent probes attached to actin and myosin subfragment-1 at the strong and The weak binding of these proteins in ghost fibre // J. Muscle Res. Cell Mot. - 1991. - Vol.12, Ml. - P. 104 (Abstracts

oi the XiXth European conference or. muscle contraction and cell motility. - Brussels, Belgium, 1990).

8. Khoroshev ill., Borovikov Yu.S. The conformational changes in nnnmuscle F-actin induced by myosin subfragment 1 binding // УI th fleeting of Cytoskeleton Club. - Fuglso-centret, Denmark: 1990. - P.33.

9. Хорошев M.И., Боровиков Ю.С. Теневое мышечное волокно с . реконструированными из немышечного актина тонкими нитями

- модель для изучения иитоскелета с помощью поляризационной микрофлуориметрии // Цитология. - 1991. - Т. 33, Н 3.

- С. 76-79.

10.Borovikov Yu.S, , Nowak Е., Khoroshev М. I. , Dabrowska R. Ca?+-dependent effects of myosin subfragment-1 on the structure of 1,5-IAEDANS-labeled tropomyosin in regulated thin filaments of ghost fibers // XXth European conference on muscle contraction and cell motility. - Oxford, U.K.: 1991. - P. 13.

11.Nowak E. , Borovikov Yu.S., Khoroshev M. I. , Dabrowska R. Troponin I and caldesraon restrict alterations in actin structure occuring on binding of myosin subfragment 1 // FEB3 Lett. - 1991. - Vol.281, К 1. - P.51-54.

12. Borovikov Yu.S., Kulova N. V. , Khoroshev H.I. Polarization microfluorimetry study of interaction between myosin

.head and F-actin in the muscle fibers // Gen. Physiol. Blophys. - 1991. - Vol. 10, H 5. - P. 441-459.

Pm.TVn. Si:?. Зхк. 3*3. Tn p. I CD, IЦ. v; М.ЬеспллтнО.