Молекулярные механизмы регуляции тропомиозином актин-миозинового взаимодействия

Карпичева, Ольга Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные механизмы регуляции тропомиозином актин-миозинового взаимодействия
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы регуляции тропомиозином актин-миозинового взаимодействия"

На правах рукописи

□□3485815

КАРПИЧЕВА Ольга Евгеньевна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ТРОПОМИОЗИНОМ АКТИН-МИОЗИНОВОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

03.00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2009

- 3 ДЕК 2009

003485815

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии

РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук, проф.

Юрий Сергеевич Боровиков Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. Владимир Иосифович Воробьев

Институт цитологии РАН

доктор биологических наук, проф. Дмитрий Иванович Левицкий

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Ведущая организация: Институт биологии моря

им. A.B. Жирмунского ДВО РАН

Защита состоится 18 декабря 2009 года в 15 ч. на заседании Диссертационного совета Д 002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

Сайт института: www.cytspb.rssi.ru

Адрес электронной почты института: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института цитологии

РАН.

Автореферат разослан 17 ноября 2009 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Р Е.В.Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Молекулярные механизмы мышечного сокращения являются предметом интенсивных исследований многих лабораторий. Актуальность этих исследований обусловлена тем, что, несмотря на огромный объем имеющихся данных, многие фундаментальные аспекты мышечного сокращения и его регуляции остаются до сих пор невыясненными. Кроме того, при различных заболеваниях сердечных и скелетных мышц, таких как дилятационная и гипертрофическая кардиомиопатии, немалиновая миопатия, обнаружены мутации в генах сократительных и регуляторных белков, приводящие к серьезным функциональным нарушениям. Выяснение молекулярных механизмов нарушения сократительной функции мышц может иметь существенное значение для ранней диагностики и генной терапии мышечных болезней.

Известно, что в основе мышечного сокращения лежит циклическое взаимодействие головок миозина с актином, сопровождаемое гидролизом аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). В скелетных и сердечных мышцах основная регуляция взаимодействия миозина с актином осуществляется Са2+-зависимым образом тропонин-тропомиозиновым комплексом (ТН-ТМ), расположенным на актиновой нити. Наиболее популярная в настоящее время модель стерического блокирования предполагает, что регуляция мышечного сокращения осуществляется движением ТН-ТМ на поверхности актиновой нити относительно областей взаимодействия миозина с актином [1, 2]. Считается, что связывание ионов Са2+ тропони-ном индуцирует структурные перестройки ТН-ТМ, вследствие которых тропомиозин, смещаясь к центру тонкой нити, открывает области взаимодействия миозина с актином. В гладких мышцах функцию тропонина, вероятно, выполняют кальдесмон (СаР) и Са2+-связывающие белки [3, 4]. Активация сокращения гладких мышц, также как и поперечнополосатых мышц, сопровождается движением тропомиозина на тонкой нити. Однако в гладких мышцах при низкой концентрации Са2+тропомиозин не закрывает потенциальные области связывания миозина на актиновой нити [5]. Различие в расположении тропомио-зиновой молекулы относительно актина в разных мышечных системах становится не столь существенным, если предположить, что кальдесмон в гладких мышцах и тропонин в поперечно-полосатых мышцах во взаимодействии с тропомиозином способны изменять структурное состояние актина [б]. Возможно, что регуляция тонкой нити осуществляется не только в результате механического блокирования тропомиозином областей взаимодейст-

вия миозина с актином, но также аллостерически - вследствие сложных конформационных изменений всего ансамбля мышечных белков. Возможность такого способа регуляции поддерживается биохимическими данными (см. обзор: [7]) и может разрешить многие противоречия модели стерического блокирования актин-миозинового взаимодействия. Однако механизмы аллостерической регуляции мышечного сокращения остаются малоизученными. Таким образом, актуальность изучения молекулярных механизмов регуляции тро-помиозином актин-миозинового взаимодействия, и, в частности, конформационных изменений сократительных и регуляторных белков, не вызывает сомнений.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении молекулярных механизмов регуляции скелетным и гладкомышечнымтропомиозинами актин-миозинового взаимодействия. В задачи исследования входило:

1. Исследовать конформационные перестройки актина и миозина, происходящие в мышечном волокне в цикле гидролиза АТФ.

2. Изучить молекулярные механизмы регуляции тропонин-тропомиозиновой и каль-десмон-тропомиозиновой регуляторными системами актин-миозинового взаимодействия.

3. Исследовать влияние точечных мутаций Glu117Lys и Gln147Pro тропомиозина, связанных с немалиновой миопатией, на регуляцию взаимодействия миозина с актином в АТ-Фазном цикле.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В цикле гидролиза АТФ существует несколько промежуточных структурных состояний ансамбля мышечных белков (актина, миозина и тропомиозина), находящихся в динамическом равновесии. Эти состояния отличаются друг от друга конформацией головок миозина и мономеров актина, характеризующейся различной пространственной организацией и подвижностью SH1 спирали миозина и субдомена 1 актина. Каждому промежуточному состоянию актомиозина соответствует определенное структурное состояние тропомиозина, характеризуемое различной позицией и подвижностью этого белка на поверхности актиновой нити.

2. Регуляция актин-миозинового взаимодействия ТН-ТМ может осуществляться взаимозависимыми конформационными перестройками актина, миозина и тропомиозина. При низкой концентрации Са2+ ТН-ТМ ингибирует актин-миозиновое взаимодействие, смещая тропомиозин к периферии тонкой нити, огранивая миозин-зависимые движения тропомиозина и фиксируя актин в «выключенном» состоянии, при котором миозиновые головки,

связанные с актином, не способны генерировать силу. При высокой концентрации Са2+ тропонин сдвигает тропомиозин ближе к центру тонкой нити при формировании сильной формы связывания миозина с актином и дальше к периферии тонкой нити при слабом связывании этих белков, таким способом увеличивая амплитуду внутримолекулярных движений тропомиозина и актомиозина в цикле гидролиза АТФ, что может приводить к увеличению эффективности работы миозиновых поперечных мостиков.

3. В гладкомышечной регуляторной системе дефосфорилированный кальдесмон ин-гибирует актин-миозиновое взаимодействие, сдвигая тропомиозин к периферии тонкой нити, ограничивая миозин-зависимые движения тропомиозина и фиксируя конформацию актина в «выключенном» состоянии и головки миозина в слабой форме связывания с актином.

4. Мутации Glu117Lys и Gln147Pro тропомиозина, связанные с наследственной немалиновой миопатией, вызывают смещение тропомиозинового тяжа к периферии тонкой нити и ингибируют движения тропомиозина на поверхности актина в цикле гидролиза АТФ, что может вызвать нарушение согласованной работы ансамбля мышечных белков, сдвигая равновесие сократительной системы к слабосвязанному структурному состоянию.

Научная новизна исследований. Впервые показано, что в мышечном волокне в АТФазном цикле существует несколько структурных состояний актомиозиновой системы, отличающихся друг от друга подвижностью и пространственной организацией SH1 спирали миозина и субдомена 1 актина. Каждому промежуточному состоянию актомиозина соответствует определенное структурное состояние тропомиозина, характеризуемое различной подвижностью и позицией этого белка на поверхности актиновой нити. Получены приоритетные данные о том, что регуляция актин-миозинового взаимодействия в скелетных и гладких мышцах может осуществляться взаимозависимыми конформационными перестройками актина, миозина и тропомиозина. Показано, что тропонин и Са2+ способны модифицировать влияние нуклеотидов на структурное состояние ансамбля актина, миозина и тропомиозина, что может быть причиной активации гидролиза АТФ при высокой концентрации Са2+ и ингибирования гидролиза при низкой концентрации Са2\ Обнаружено, что дефосфорилированный кальдесмон, фиксируя тропомиозин на периферии тонкой нити, ингибирует смещение субдомена 1 актина к периферии тонкой нити и SH1 спирали миозина к центру тонкой нити и подавляет формирование сильных форм связывания актомиозина, что может приводить к ингибированию гидролиза АТФ. Впервые показано, что

одной из причин ослабления сократительной функции скелетных мыщц при немалиновой миопатии является ингибирование движения тропомиозина по поверхности тонкой нити в цикле гидролиза АТФ.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют и углубляют представления о молекулярных механизмах клеточной подвижности и могут быть использованы при чтении курсов лекций по цитологии, клеточной биологии, биофизике, биохимии и физиологии. Впервые обнаруженное нами ингибирование движения скелетного тропомиозина по поверхности тонкой нити в цикле гидролиза АТФ, вызванное мутациями С1и1171-у5 и С1п147Рго тропомиозина, имеет большое значение для выяснения молекулярных механизмов ослабления сократительной функции скелетных мышц при наследственной немалиновой миопатии. Результаты работы могут быть полезны при разработке методов диагностики некоторых болезней мышечной ткани.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 9 статей в рецензируемых изданиях и 13 тезисов. Материалы диссертации были представлены на 32-й, 33-й, 34-й, 36-й и 37-й Европейских мышечных конференциях (Монпелье, Франция, 2003; о. Эльба, Италия, 2004; Дебрецен, Венгрия, 2005; Стокгольм, Швеция, 2007; Оксфорд, Великобритания, 2008), на международном симпозиуме "Биологическая подвижность" (Пущино-на-Оке, 2004) и на научных семинарах лаборатории Молекулярных основ клеточной подвижности ИНЦ РАН.

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты № 01-04-49310, № 05-04-48812а, № 08-04-00960), Программы «Ведущие научные школы РФ» (НШ-9396.2006.4; НШ-1961.2008.4), ФАНИ (Госконтракты № 02.445.11.7338 от 09.06.2006 и № 02.512.11. 2108 от 01.06.2007 г.), ИНТАС (проект 01-0516), стипендии Федерации Европейских биохимических обществ (РЕВБ) и гранта Администрации г. Санкт-Петербурга.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 249 источников. Иллюстративный материал представлен 25 рисунками и 4 таблицами.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе рассмотрены структура и функции мышечных белков: актина, миозина, тро-помиозина и кальдесмона. Особое внимание уделено описанию имеющихся в литературе данных о молекулярных механизмах регуляции тропомиозином актин-миозинового взаимодействия в скелетных и гладких мышцах. Приведены данные исследований влияния точечных мутаций в тропомиозине, связанных с различными наследственными заболеваниями, на структуру и функцию этого регуляторного белка. В заключение представлены результаты изучения механизмов мышечного сокращения, полученные с помощью метода поляризационной флуориметрии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы. Работа выполнена на одиночных «теневых» мышечных волокнах скелетных мышц кролика, в которые были инкорпорированы скелетный тропомиозин и тро-понин или гладкомышечный тропомиозин и кальдесмон, и субфрагмент-1 миозина [8, 9]. В некоторых экспериментах в теневые волокна инкорпорировали G-актин. Гладкомышечный тропомиозин и кальдесмон получали из мускулатуры желудка утки или курицы [10]. Миозин и актин выделяли из скелетных мышц кролика [11,12]. Субфрагмент-1 миозина получали перевариванием миозина а-химотрипсином в весовом соотношении 1:300 [13]. Концентрацию белков определяли с помощью спектрофотометра СФ-46, используя известные коэффициенты поглощения. Тропомиозин и тропонин скелетных мышц человека экспресси-ровали в клетках BL21 (DE3)pLysS Escherichia coli (Novagen') [14]. Точечные мутации Glu117Lys и Gln147Pro встраивали в нормальную последовательность ДНК тропомиозина методом сайт-направленного мутагенеза. Образцы ДНК были сиквенированы в Отделе биохимии Университета г. Оксфорда. Белки очищали методом ионообменной хроматографии. Для сборки тропонинового комплекса субъединицы С, Т и И смешивали в равном молярном соотношении и диализовали в несколько этапов с постепенным снижением ионной силы. Полученные препараты мышечных белков визуализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) [15].

Окрашивание мышечных белков флуоресцентными красителями. Цис707 суб-фрагмента-1 миозина и Цис374 G-актина специфически окрашивали Ы-йодоацетил-Ы'-(5-сульфо-1-нафтил)этилен-диамином (1,5-IAEDANS) [16, 17]. F-актин теневых волокон метили

с помощью фаллоидина, связанного с флуоресцеин-5-изотиоцианатом (FITC) или тетраме-тилродамин-изотиоцианатом (TRITC) [18]. Связывание TRITC-фаллоидина к актину теневого волокна контролировали с помощью конфокального микроскопа TSC2 (Leica). Рекомби-нантный ß-тропомиозин, содержащий в своей структуре один цистеиновый остаток ЦисЗб, окрашивали 5-йодоацетоамидо-флуоресцеином (5-IAF) [20]. Мечение ЦисЗб и Цис190 глад-комышечноготропомиозина осуществляли без диссоциации а- и ß-субъединиц с помощью 1,5-IAEDANS и 5-IAF, соответственно. Специфичность окрашивания препаратов определяли методом SDS-электрофореза в ПААГ с последующей визуализацией гелей в ультрафиолетовом свете.

Метод поляризационной микрофлуориметрии. Флуоресцентные зонды, связанные с белками мышечного волокна, повторяют строго упорядоченное пространственное расположение этих белков и аминокислотных остатков, с которыми они связаны. Анизотропное расположение флуорофоров приводит к появлению поляризованной флуоресценции, анализ которой позволяет выяснить, как в среднестатистической молекуле белка расположены флуоресцентные зонды и какова их подвижность. При анализе результатов настоящей работы использовали модель-зависимый метод [21-25]. Предполагали, что, элементарные акты поглощения и излучения света осуществляются линейными диполями поглощения (А) и излучения (Е), жестко связанными с молекулой флуорофора. Углы ориентации диполей поглощения ФА или излучения ФЕ, а также относительное количество хаотически расположенных флуорофоров N вычисляли, измерив интенсивности четырех компонентов поляризованной флуоресценции зонда при ориентации мышечного волокна параллельно (||1ц, ¡¡и и перпендикулярно (Ji, |ll() плоскости поляризации возбуждающего света [21,25,26]. Регистрацию интенсивностей поляризованной флуоресценции производили с помощью поляризационного флуориметра [27]. Флуоресценцию акрилодана, 5-IAF, FITC-и TRITC-фаллоидина регистрировали в области 500-600 нм после возбуждения при 437+5 нм. Для 1,5-IAEDANS длина возбуждающего света составляла 365 ±5 нм.

Поскольку поляризованная флуоресценция красителя чувствительна к изменению конформации белка, с которым он связан, а присутствие красителя не оказывает существенного влияния на свойства белка [16, 20, 28, 29], то изменения параметров поляризованной флуоресценции красителя можно рассматривать как свидетельство конформационных перестроек белка, происходящих при мышечном сокращении. Изменение значений ФЕ (или Фа) и N интерпретировали как изменение в ориентации участка полипептидной цепи

относительно оси мышечного волокна в области локализации зонда и изменение подвижности этого участка, соответственно. Характер изменения ФА, как правило, совпадал с характером изменения Фе и поэтому при анализе результатов работы представлены значения только одной из этих величин. Изменения параметров поляризованной флуоресцении зондов были обратимы во всех экспериментах. Статистическую достоверность изменений оценивали с помощью критерия Стьюдента 0,05%.

Измерения осуществляли в растворе, содержащем 10 мМ KCI, 3 мМ MgCI2, 6,7 мМ фосфатный буфер, рН 7,0, 4 мМ этиленгликольтетраацетат (EGTA) (рСа 2 7) или 0,1 мМ СаС12 (рСа S 5). Моделирование промежуточных структурных состояний актомиозинового комплекса осуществляли с помощью нуклеотидов или их аналогов: 5 мМ МдАТР, 25 мМ MgATPyS или 15 мМ MgAMPPNP для симуляции слабых форм связывания и 2,5 мМ MgADP или в отсутствие нукпеотида для моделирования сильных форм связывания миозина с актином [30-32].

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние скелетного тропомиозина, тропонина и Са2+ на структурное состояние субфрагмента-1 миозина и актина в АТФазном цикле.

Согласно современным представлениям, генерация силы миозиновым поперечным мостиком осуществляется при изменении ориентации регуляторного домена головки миозина в процессе гидролиза АТФ [33]. Актиновая нить рассматривается как относительно пассивный компонент сократительной системы. Результаты настоящей работы существенно дополняют эти представления, указывая на то, что в цикле гидролиза АТФ происходят многоступенчатые и взаимозависимые структурные перестройки моторного домена головки миозина и актина, которые, по-видимому, определяют эффективность работы актомиозинового мотора (рис. 1). Регуляция взаимодействия миозина с актином реализуется не только стерическим блокированием тропонин-тропомиозиновым комплексом сайтов связывания миозина на актине, а также аллостерически - с помощью сложных конформаци-онных перестроек ансамбля мышечных белков (актина, миозина и тропомиозина).

Как следует из рис. 1, а, б, каждой моделируемой стадии цикла гидролиза АТФ соответствует определенная ориентация и подвижность зондов 1,5-IAEDANS, связанных с Цис707 в области 5Н1 спирали субфрагмента-1 миозина (S1-AEDANS). Согласно интерпретации, предложенной ранее (см. обзоры: [34], [35]), изменение угла

С 50

У;

Актан-51 # * Й й

а ш

Акгин-АЕ0А№5

Значения ФЕ и N для 51-АЕОАМ5 (а, б) или ак-тин-АЕ0АМ5 (в, г) при моделировании в теневом волокне промежуточных стадий АТФазного цикла в отсутствие ТМ [белые колонки) и в присутствии ТМ (зеленые и синие колонки). Символами * показаны недостоверные изменения значений относительно данных для теневых волокон, которые не содержали ТМ [белые колонии), в остальных случаях эти изменения достоверны, р<0,05.

Рисунок 2

51-АЕСАМ5

Ж.

£ «

Актин-АЕРАМЗ

# т."

# г"

Влияние ТМ, ТН и Сэ!' на амплитуду изменений Ф{ для 51-АЕОАМ5 (а) или эктин-АЕОА^ (б), наблюдаемых при моделировании перехода экгомиозинз и; слабой а сильную форму связывания. За контроль принято значение ДФЕ при переходе акто-миозинз из слабой в сильную форму связывания в теневом волокне, декорированном 51, в отсутствие ТН и ТМ.

С и

.1.1

Рисунок 3

51-АЕ0А№

Актин-АЕ0АМ5 г

& ъ?

Влияние ТН и Сэ1' на значения Фг и N для 51-АШАМ5 (а, б) или актин-АЕ0АМ5 [в, г) при моделировании промежуточных стадий АТФазного цикла в теневом волокне, содержащем ТМ и 51 (зеленые и синие колонки) или ТМ, и ТН при низкой и высокой концентрации С а1* (соответственно желтые и красные колонки). Символами * показаны недостоверные изменении значений относительно тонких нитей, не содержащих ТН (зеленые или синие колонки), в остальных случаях эти изменения достоверны, р^0,05.

ориентации диполей ФЕ S1-AEDANS свидетельствует о наклоне SH1 спирали, содержащей краситель, относительно оси волокна, а величину подвижности N можно рассматривать как показатель сродства S1 к актину. При моделировании перехода актомиозина из слабой (в присутствии АТФ) в сильную (в отсутствие нуклеотида) форму связывания значения ФЕ и N для S1-AEDANS постепенно уменьшаются на 6° и 0,13 отн. ед. (на 32%), соответственно. Следовательно, в цикле гидролиза АТФ происходит многоступенчатый наклон SH1 спирали моторного домена миозина по направлению к оси тонкой нити и иммобилизация головок миозина, связанных с актином. Поскольку считается, что SH1 спираль участвует в передаче конформационных изменений от активного центра на регуляторный домен миозина [36], то наблюдаемые изменения параметров флуоресценции S1-AEDANS отражают, по-видимому, конформационные перестройки всего моторного домена миозина.

Изменения в активном центре головки миозина передаются не только на SH1 спираль миозина, но также на актин, вызывая нуклеотид-зависимые изменения ориентации и подвижности субдомена 1 актина в тонких нитях (рис. 1, в, г). Изменение угла ориентации зондов 1,5-IAEDANS, связанных с Цис374 актина (актин-AEDANS), мы интерпретировали как вращение всего субдомена 1 актина, поскольку ранее было показано, что зонды, расположенные в разных областях субдомена 1, изменяют свою ориентацию относительно оси волокна однонаправлено, что указывает на движение всего субдомена 1 актина, как жесткого тела [27]. Переход актомиозина из слабой в сильную форму связывания вызывает увеличение ФЕ для актин-AEDANS на 7° (рис. 1, в) и снижение N на 0,12 отн.ед. (на 30%) (рис. 1, г), что свидетельствует о вращении субдомена 1 актина от оси тонкой нити на периферию и о его иммобилизации при сильном связывании S1 [27].

Таким образом, в цикле гидролиза АТФ каждому промежуточному конформацион-ному состоянию головки миозина соответствует определенная пространственная организация и подвижность субдомена 1 актинового мономера. Самые заметные изменения ориентации и подвижности субдомена 1 актина происходят при переходе от слабой формы связывания актомиозина в присутствии AMPPNP или ATPyS к сильной форме в присутствии ADP, то есть на тех стадиях АТФазного цикла, на которых, вероятно, происходит генерация силы [37], и соответствуют наибольшему сдвигу и изменению подвижности SH1 спирали миозина.

Присоединение скелетного тропомиозина к актину вызывает значительные изменения ФЕ и N для S1-AEDANS или актин-AEDANS (рис. 1), что позволяет предположить, что этот

регуляторный белок индуцирует изменения пространственной организации SH1 спирали миозина и субдомена 1 актина. В присутствии тропомиозина значения ФЕ зондов, связанных с миозином или актином, в целом характерны для более сильной формы связывания миозина с актином. При этом амплитуда движения SH1 спирали и субдомена 1 актина при переходе из слабой в сильную форму связывания увеличивается соответственно на 22 и 12% (рис. 2). Поскольку считается, что изменение конформации активного центра миозина передается на регуляторный домен при участии SH1 спирали, что играет ключевую роль в развитии силы [37-39], то увеличение амплитуды движения SH1 спирали в АТФазном цикле может указывать на то, что тропомиозин увеличивает эффективность работы каждого мио-зинового поперечного мостика.

Тропонин Са2*-зависимым образом модифицирует влияние тропомиозина на структурное состояние 51 миозина и актина в цикле гидролиза АТФ (рис. 3). При моделировании сильных форм связывания миозина с актином в присутствии Са2+ (рСа £ 5) тропонин усиливает влияние тропомиозина на взаимодействие актина с миозином, стимулируя формирование более сильных структурных состояний актомиозина. Это, по-видимому, обусловлено увеличением стереоспецифичности взаимодействий между актином и миозином вследствие изменения позиции тропомиозина на тонкой нити (см. раздел 3). При этом амплитуда движений SH1 спирали и субдомена 1 актина при переходе из слабой в сильную форму связывания увеличивается на 71% и 19%, соответственно (рис. 2). Наоборот, при низкой концентрации Са21" (рСа > 7) тропонин оказывает противоположное влияние на ФЕ и N для S1-AEDANS и актин-AEDANS, что свидетельствует, по-видимому, об ослаблении актин-миозинового взаимодействия. Интересно отметить, что амплитуда движений SH1 спирали при трансформации актомиозина из слабой в сильную форму связывания не изменяется (рис. 2, а), тогда как амплитуда движения субдомена 1 актина ингибирована на 5% (рис. 2, б). Это указывает на то, что тропомиозин и тропонин при низких концентрациях Са2+ способны разобщить согласованные конформационные изменения головки миозина и актина в АТФазном цикле. Похожие нарушения согласованной работы актина и миозина обнаружены нами при исследовании механизмов регуляции АТФазного цикла гладкомышечным тропомиозином и кальдесмоном (см. раздел 2).

2. Влияние гладкомышечного тропомиозина и кальдесмона на структурное состояние субфрагмента-1 миозина и актина в АТФазном цикле.

Достаточно оснований считать, что кальдесмон играет важную роль в регуляции сокращения гладких мышц, связанной с тонкими нитями [4, 9, 41, Pronina (Karpicheva) et al„ 2007а]. В настоящей работе мы показали, что актиновые нити, содержащие дефосфорили-рованный кальдесмон, практически теряют свою способность изменять структурное состояние в цикле гидролиза АТФ (рис. 5, а, б), в то время как S1 миозина в этих экспериментальных условиях сохраняет способность изменять свою конформацию (рис. 5, в, г).

Чтобы продемонстрировать влияние кальдесмона на структурное состояние актина, мы окрашивали актин теневых волокон FITC-фаллоидином, который связывается с тремя соседними мономерами актина [42]. Специфичность связывания красителя к актину демонстрирует фотография теневого волокна, содержащего меченый актин (рис. 4), на которой можно наблюдать избирательное окрашивание красителем тонких нитей [Pronina (Karpicheva) et al„ 2007а].

Согласно интерпретации, предложенной ранее [43], изменения ФЕ и N актин-FITC-фаллоидина свидетельствуют об аксиальном вращении актиновых мономеров относительно оси волокна и об изменении их подвижности, соответственно. Связывание гладкомышечного тропомиозина и S1 с актином в отсутствие нуклеотида вызывает уменьшение Фе и увеличение N для актин-РИС-фаллоидина (рис. 5, в, г), что можно интерпретировать как поворот актиновых мономеров по направлению к оси волокна и увеличение их подвижности [Borovikov, Pronina (Karpicheva) et al., 2006]. В присутствии ADP этот эффект усиливается. В противоположность этому, при моделировании слабых форм связывания миозина с актином происходит увеличение Фе, что указывает на вращение актиновых мономеров от оси мышечного волокна. Похожие изменения мы наблюдали для SH1 спирали миозина, окрашенной 1,5-IAEDANS (рис. 5, а). Данные показывают, что активация актиновой нити при сильном связывании S1 сопровождается синхронным однонаправленным аксиальным вращением SH1 спирали миозина (рис. 5, а) и мономеров актина (рис. 5, в) к оси мышечного волокна. При этом субдомен 1 актина движется в противоположном направлении - от оси мышечного волокна на периферию (рис. 1, в).

Связывание кальдесмона с тонкой нитью оказывает заметное влияние на значения ФЕ и N зондов, связанных с актином или S1 миозина (рис. 5). При этом характер этих изменений

Фотография теневого волокна, содержащего актин, окрашенный Ш НС-фа л лои дин ом.

Рисунок 5

51-АЕРА|\)5

Значения ФЕ и N для 51-АЕОА(ч'5 (а, 6) или актин-РИС-фалл о иди на (в, г} при моделировании промежуточных стадий АТФазного цикла в теневом волокне, содержащем ТМ и 51, в отсутствие СэО (зеленые и синие колонки) и в присутствии СаИ (желтые колонки). Белые и бордовые колонки представляют значения для гонких нитей в отсутствие и в присутствии ТМ, соответственно. Символами * показаны недостоверные изменения значений относительно данных для тонких нитей, не содержащих СэО (зеленые или синие колонки), в остальных случаях зти изменения достоверны, ре0,05.

в АТФазном цикле для 51-АЕОАЫ5 и актин-РГГС-фаллоидина различается. Параметры флуоресценции актин-Р]ТС-фаллоидина при моделировании АТФазного цикла в присутствии кальдесмона изменяются слабо. Если в отсутствие кальдесмона наблюдали многоступенчатые изменения наклона и подвижности актиновых мономеров, то актиновые нити, содержащие кальдесмон, практически теряют свою способность изменять структурное состояние при связывании 51 с различными нуклеотидами. Амплитуда изменений ФЕ актин-Р1ТС-фаллоидина при перекоде из слабой в сильную форму связывания актом поз и на в присутствии кэльдесмона снижается на 52%, Следовательно, кальдесмон переводит актин в состояние, при котором резко ингибируется способность актина к конформзционным перестройкам [Вогоу1коу, Ргоп1па (КагркЬеуа) е( а!., 2006).

В противоположность актину, в присутствии кэльдесмона сохраняет в значительной степени способность изменять свою конформацию при моделировании промежуточ-

ных стадий цикла гидролиза АТФ. Согласно рисунку 5, а, связывание кальдесмона к актину вызывает увеличение ФЕ для БЬАЕРАМБ на каждой моделируемой стадии АТФазного цикла, что характерно для перехода структурного состояния головки миозина в слабую форму связывания с актином. Кальдесмон уменьшает амплитуду изменений ФЕ для БЬАЕОАЫБ при переходе из слабой в сильную форму связывания актомиозина на 14%. Увеличение N в присутствии кальдесмона для БЬАЕОАМБ и актин-Р1ТС-фаллоидина указывает на то, что свойства актин-миозинового комплекса в присутствии кальдесмона близки к свойствам, характерным для слабой формы связывания миозина с актином, и отражает, по нашему мнению, снижение сродства Б1 к актину, которое может являться следствием уменьшения области контакта головки миозина с актиновой нитью [38].

Поскольку актин и головка миозина испытывают согласованные и взаимосвязанные конформационные изменения (рис. 5), то эффект кальдесмона на структурное состояние Б1 можно объяснить стабилизацией структуры актина в выключенном состоянии, при котором нарушается согласованность конформационных перестроек миозина и актина и головка миозина в АТФазном цикле работает неэффективно. Тропомиозин в этом случае, по-видимому, играет важную роль в передаче конформационных изменений актиновых мономеров вдоль тонкой нити. Подобное разобщение работы актомиозина мы наблюдали в теневом волокне, содержащем Б1, ТМ и ТН при низкой концентрации Са2+ (рис. 3). Возможно, что для различных мышечных тканей существует похожий аллостерический механизм регуляции актомиозинового мотора в цикле гидролиза АТФ.

3. Конформационные перестройки скелетного и гладкомышечного тропомио-зинов в цикле гидролиза АТФ.

Ранее было предположено, что тропомиозин изменяет свою позицию относительно актина, сдвигаясь или «перекатываясь» по поверхности тонкой нити при её активации [44]. Данные, полученные в настоящей работе с использованием скелетного и гладкомышечного тропо-миозинов, меченных флуоресцентными зондами, указывают на то, что тропомиозин действительно изменяет свою позицию на актине, «перекатываясь» по поверхности тонкой нити в АТФазном цикле [КиПкоуа, Ргопта (КагркНеуа) е1 а1„ 2006].

Согласно рисунку б, каждому структурному состоянию миозинового поперечного мостика соответствует определенное значение ФЕ и N для зондов 5-1АР, связанных с ЦисЗб скелетного тропомиозина (ТМ-АР). Мы рассматривали вращение диполей красителя к оси

мышечного волокна (уменьшение ФЕ) как сдвиг тропомиозина по поверхности тонкой нити к внешнему домену актина (на периферию), тогда как вращение диполей от оси мышечного волокна (увеличение Фе) как смещение тропомиозина по направлению к внутреннему домену актина (к центру нити). Такая интерпретация подтверждается корреляцией между изменениями величины ФЕ, наблюдаемыми в наших экспериментах, и данными электронной микроскопии о движении тропомиозина по поверхности тонкой нити [45, 46]. Так, трансформация актомиозина из слабой в сильную форму связывания сопровождается увеличением ФЕ (рис. 6, а), что свидетельствует о постепенном сдвиге тяжа тропомиозина к центру тонкой нити. При этом величина N снижается (рис. 6, б), что можно объяснить увеличением сродства тропомиозина к актину при формировании сильных форм связывания актомиози-нового комплекса [КиКкоуа, Ргопюа (КагркЬеуа) е1 а1„ 2007].

Тропонин Са2+-зависимым образом модифицирует структурное состояние тропомиозина в АТФазном цикле. При высокой концентрации Са2+ тропонин уменьшает значение ФЕ ТМ-АР при моделировании слабых форм связывания актомиозина, и увеличивает значение этого параметра при симуляции сильных форм. Следовательно, в присутствии тропонина и Са2+ тяж тропомиозина сдвинут дальше к периферии тонкой нити при формировании слабой формы связывания актомиозина и ближе к центру нити при сильном связывании миозина с актином. При низкой концентрации Са2+ тропонин инициирует снижение значений Фе для ТМ-АР на каждой стадии АТФазного цикла, указывая на смещение ре-гуляторного белка к периферии тонкой нити. Амплитуда изменений ФЕ для ТМ-АР при переходе из слабой в сильную форму связывания миозина с актином снижается на 23% при низкой концентрации Са2+ и, наоборот, увеличивается на 23% при высокой концентрации Са2+. Мы предположили, что структурное состояние тропомиозина и его позиция на поверхности тонкой нити, обусловленная этой конформацией, играют решающую роль в ин-гибироеании АТФазы миозина, поскольку при низкой концентрации Са2* даже при моделировании сильных форм связывания тропомиозин занимает позицию, характерную для слабосвязанного состояния (рис. б), амплитуда движений тропомиозина снижается, а акто-миозин формирует слабую форму связывания (рис. 3). По-видимому, разобщение согласованных конформационных изменений в миозине и актине и стабилизирование актина в «выключенном» состоянии происходит вследствие блокирования миозин-зависимых движений тропомиозина в цикле гидролиза АТФ.

Похожее ингибирование движений тропомиозина мы наблюдали для гладкомышеч-ной изоформы белка в присутствии дефосфорилированного кальдесмона. Оказалось, что гладкомышечный тропомиозин также изменяет свою позицию на актиновой нити в АТФаз-ном цикле. Данные, полученные с помощью специфического окрашивания С- или N-концевых областей белка 5-IAF или 1,5-IAEDANS, соответственно, указывают на то, что тропомиозин, возможно, «перекатывается» по актиновой нити.

Согласно рисунку 7, характер изменений Фд для зондов 5-IAF и 1,5-IAEDANS, связанных с гладкомышечным тропомиозином (smTM-AF и smTM-AEDANS), в АТФазном цикле различается. Так, если при переходе актомиозина из слабой в сильную форму связывания значение Фд smTM-AF увеличивается, что указывает на вращение диполей красителя от оси волокна, то значение Фд smTM-AEDANS, наоборот, уменьшается, что свидетельствует о наклоне диполей к оси мышечного волокна. Амплитуда изменений Фа для smTM-AF и smTM-AEDANS составила соответственно 2,2° и 1,6°. Полученные данные указывают на то, что в цикле гидролиза АТФ зонды, расположенные в С- или N-концевой областях тропомиозина, движутся в противоположных направлениях. Такие изменения в ориентации зондов можно объяснить «перекатыванием» тяжа тропомиозина по поверхности актина [Kulikova, Pronina (Karpicheva) et al., 2006]. Это предположение согласуется с данными FRET, указывающими на то, что при связывании S1 расстояние между актином и красителем в N-концевой области гладкомышечного тропомиозина увеличивается, а расстояние между актином и красителем в С-концевой области тропомиозина, наоборот, уменьшается [47].

Присоединение дефосфорилированного кальдесмона к актину теневого волокна, содержащего гладкомышечный тропомиозин и S1 в отсутствие нуклеотида, вызывает уменьшение Фд для smTM-AF (рис. 7, а) и увеличение Фд для smTM-AEDANS (рис. 7, в). Подобные изменения ориентации зондов, связанных с С- и N-концевыми областями тропомиозина, характерны для слабого связывания миозина с актином. При этом подвижность зондов, связанных с С- и N-концевыми областями тропомиозина, значительно увеличивается соответственно на 0,10 и 0,25 отн. ед. (на 29 и 53%), что, вероятно, указывает на то, что кальдесмон уменьшает сродство тропомиозина к актину.

При переходе из слабого в сильное состояние связывания миозина с актином мы наблюдали ингибирование кальдесмоном изменений ориентации зондов, связанных с С- и N-концевыми областями тропомиозина соответственно на 73 и 50%. По-видимому, каль-

десмон ограничивает движение тропомиозина, индуцируемое головкой миозина в АТФаз-ном цикле и таким способом ингибирует актин-миозиновое взаимодействие.

Полученные данные указывают на то, что кальдесмон в гладких мышцах и тропонин в поперечно-полосатых мышцах играют важную роль в позиционировании тропомиозина на актине, что подтверждает возможность стерического блокирования взаимодействия головок миозина с актином. Вместе с тем, вышеизложенные результаты, на наш взгляд, свидетельствуют о существовании также аллостерического механизма регуляции, согласно которому во время АТФазного цикла миозин-индуцируемый сдвиг тяжей тропомиозина от периферии к центру тонкой нити, влияя на конформацию актина, увеличивает область сте-реоспецифических и гидрофобных связей между головкой миозина и актиновой нитью (рис. 8). Это, в свою очередь, приводит к увеличению эффективности взаимодействия миозина с актином. Тропонин модулирует этот эффект тропомиозина Са2+-зависимым образом. При высокой концентрации Са2+ тропомиозин под влиянием тропонина сдвигает субдо-мен-1 актина к периферии тонкой нити, и, увеличивая область стереоспецифических и гидрофобных взаимодействий актомиозина, способствует образованию более сильных форм связывания актомиозина и таким образом увеличивает эффективность работы акто-миозинового мотора. При низкой концентрации Са2+ ТН-ТМ, наоборот, ингибирует работу актомиозинового мотора, ограничивая миозин-зависимые движения тропомиозина и фиксируя конформацию актина в состоянии, типичном для слабой формы актин-миозинового взаимодействия [Вогоу1коу, КагркЬеуа е1 а1,2009]. Дефосфорилированный кальдесмон, так же, как и тропонин при низкой концентрации Са2+, ингибирует внутримолекулярные движения актомиозина в АТФазном цикле, ограничивая миозин-зависимые движения ТМ и фиксируя структуру актина в выключенном состоянии [ВогоуЖоу, РгоЫпа (КагркЬеуа) е1 а1., 2006; КиПкоуа, Ргогипа (КагркИеуа) е1 а1„ 2006].

Определенный характер и последовательность конформационных изменений во всех компонентах ансамбля мышечных белков в цикле гидролиза АТФ, скорее всего, играют важную роль в высокоэффективном механизме работы актомиозинового мотора [Вогоу1коу, КагркИеуа е1 а1„ 2009].

ТМ-АР

АМР-РНР АТРуЪ АТР

АРР ЛМр-РМР А№г$ АТР

Значения Фе (а) и N (б) для ТМ-АГ при моделировании промежуточных стадий АТФазного цикла в теневом волокне, содержащем ТМ и 51, в отсутствие ТИ (красные колонки) и в присутствен ТН при низкой и высокой концентрации Са2+ (соответственно желтые и бардовые колонки) Символами * показаны недостоверные изменения значений относительно данных для тонких нитей, не содержащих ТН (красные колонки), в остальных случаях эти изменения достоверны, р<0,05.

Рисунок 7

■ актин 5тТМ-АР

1 с

ОМг

Ж шш

- а-цепь

- р-цепь

ьтТМ-АЕРАМБ

- Актин-ТМ-51

! : = тСаО

£ 0.6 о

II I

Рисунок 8

Актин-51 Актин-ТМ-51

Субдомен-1 ^^^^^

Актин-ТМ-55-ТН +Сэг+

Актин-ТМ-5?-ГН

*5§ £ ^

- а-цепь

- р-цепь

Рис 7, Значения Ф( и N для бгпТМ-АР (а, 6) и (в, г) при моделировании промежуточных стадий АТФазного цикла в теневых волокнах, содержащих ТМ и 51. в отсутствие СэО (зеленые и синие колонки} и в присутствии СаО (желтые колонки). Символами ' показаны недостоверные изменений значений относительно данных для теневых волокон, не содержащих СаО (зеленые или синие колонки), в остальных случая): эти изменения достоверны, р<0г05. Справа показаны фотографии препаратов ТМ, полученные с помощью 505-электрофореза, визуализированных е ультрафиолетовом свете.

Рис. е. Схема, показывающая изменения ориентации моторного домена миозина, субдомена 1 актина и тяжа тропомиозина, наблюдаемые при переходе из слабой а сильную форму связывания миозина с актином.

■ log [[несвязанный ТМ|),

' ч......a"". ч "

"7 6S 6 is

- log ([несвязанный TMl). цМ)

Сравнение фракции связанного с актином ТМ в отсутствие и в присутствии мутаций Е117К Сэ> или 0147Р [б) после соосажде-ния комплекса актин-ТМ. Синие символы обозначают данные для ТМ дикого типа, зеленые и красные символа - для ТМ с мутациями Ш7Ки(3147Р, соответствен но.

a J s

5 »

е £

Дикий ТМ

—'Е117КТМ / :

Дикий/Е117к/ L л н

1/ /'

р .г'

f _ _ ____. <■11 - та.

рСа'

Сравнение АТФазноЙ активности ак-томиоэина в присутствии тропомио-зина дикого типа (синие символы), с мутацией Е117К (зеленые символы) и смеси белков в соотношении 1 (желтые символы).

а «

WTTM-AF

I ТМ.ТН . Са3*

В "

ADP ЛТР

Рисунок 11

Е117KTM-AF

Jli_ SlMjfli

АОР ATP

Д "

Q147PTM-AF

JIMjl

ADP ATP

V 0,45 0,40 <y 0,35 J O.JO

1« 0.20 0.1 S

« TM-TH +S1 * Ca4' J ТМ-ТИ +si

rii ill

■ ADP ATP

1 P.4S

(US 0J0 MS И» 0.1 s

e o,<s

0.44 0.3S O.JO O.JS 0.20 Q.I5

ADP ATP

- ADP AT?

Влияние мутацян E117K и Q147P в ТМ на значения и N TM-AF в теневых волокнах в отсутствие и в присутствии ТН, Сэ3*, SI и нуклеотидоо. Белые колонки представляют данные для теневых волокон, содержащих TWI, Красные и синие колонки обозначают данные для теневых волокон, содержащих ТМ и ТН соответственно при низкой и шсокой концентраций Са!*. Згпены^ и 'желтые котил™ обозначают данные для тенеаых волокон, содержащих ТМ, ТН и S1 при низкой и высокой концентрации Са^, соответственно, без нуклеотидз или в присутствии АОР или АТР. Символами * показаны недостоверные изменения значений относительно данных для мышечных волокон, содержащих ТМ дикого типа (а, б), в остальных случаях эти изменения достоверны. р<0,05.

4. Влияние мутаций в скелетном тропомиозине Glul 17Lys и Glu147Pro, связанных с немалиновой миопатией, на его структурно-функциональные свойства.

Опираясь на вышеизложенное, можно предположить, что даже точечные мутации тропомиозина могут вызвать нарушение регуляции актин-миозинового взаимодействия. Для подтверждения этого предположения мы экспрессировали в Escherichia со// скелетный (5-тропомиозин человека с нормальной последовательностью (ТМ «дикого» типа) и с мутациями Glu1l7Lys (Е117К) и Gln147Pro (Q147P), связанными с развитием немалиновой мио-патии, и изучили эффект этих мутаций на вторичную структуру белка, АТФазную активность актомиозина в присутствии помиозина, сродство тропомиозина к актину и конформацион-ные перестройки тропомиозина в теневых мышечных волокнах при моделировании цикла гидролиза АТФ.

Вторичную структуру дикого и мутантных тропомиозинов оценивали с помощью метода кругового дихроизма. Несмотря на то, что пролин очень резко изгибает полипептидную цепь и в норме отсутствует в структуре суперспиральных белков, включение в последовательность тропомиозина этого аминокислотного остатка при мутации Q147P не вызывает значительных изменений в спектре кругового дихроизма и термостабильности молекулы (результаты не показаны). Такой же эффект наблюдали и для тропомиозина с мутацией Е117К. Эти данные свидетельствует о том, что мутации Q147P и El 17К не оказывают заметного влияния на вторичную структуру белка. Однако при соосаждении комплекса ак-тин-тропомиозин оказалось, что мутация Q147P резко снижает способность тропомиозина связываться с актином (рис. 9, б). Тогда как мутация El 17К не влияет на сродство белка к актину, но уменьшает кооперативность его связывания с актином (рис. 9, а) и существенно ингибирует АТФазную активность актомиозина в растворе (рис. 10).

Для того чтобы объяснить уменьшение сродства к актину тропомиозина с мутацией Q147P и ингибирование АТФазной активности актомиозина в присутствии тропомиозина с мутацией Е117К, мы сравнивали способность дикого и мутантных тропомиозинов изменять свою пространственную организацию в теневых мышечных волокнах при добавлении тро-понина, Са2+, 51 и нуклеотидов с помощью флуоресцентного зонда 5-IAF, связанного с ЦисЗб тропомиозина (TM-AF).

Как следует из рис. 11, а, в, д, обе мутации вызывают уменьшение угла ориентации диполей излучения ФЕ TM-AF, связанного с актином теневых волокон. Согласно интерпретации, предложенной в разделе 3, можно предположить, что под действием м-.тлций тро-

помиозин смещается к периферии тонкой нити, т.е. к блокирующей позиции, типичной для слабого связывания миозина с актином. Значение N для E117К ТМ практически не отличалось от ТМ дикого типа, тогда как мутация Q147P увеличивала значение этого параметра на 60% (с 0,20 до 0,32 отн. ед.) (рис. 11, б, г, е), что указывает на заметное уменьшение сродства к актину для Q147P ТМ и хорошо согласуется с данными о снижении способности связывания этого тропомиозина к актину в растворе (рис. 9, б).

При связывании тропонина значения ФЕ и N изменяются Са2*-зависимым образом для всех тропомиозинов (рис. 11). Следовательно, тропонин в зависимости от концентрации Са2+ способен изменять конформацию и позицию как дикого, так и мутантного тропомиозинов.

Присоединение S1 к тонким нитям, содержащим тропомиозин и тропонин, вызывает изменения ФЕ и N при моделировании АТФазного цикла (рис. 11). Однако для мутантных тропомиозинов величина ФЕ была меньше, чем для ТМ дикого типа. Это означает, что му-тантные тропомиозины, связываясь с актином теневого волокна в присутствии S1, как и в отсутствие S1, располагаются ближе к периферии тонкой нити по сравнению с ТМ дикого типа.

При моделировании перехода актомиозина из слабой (в присутствии АТР) в сильную форму связывания (в отсутствие нуклеотида или в присутствии ADP) значения ФЕ для всех TM-AF постепенно увеличиваются как при низкой, так и при высокой концентрации Са2+ (рис. 11, а, в, д), указывая на смещение тропомиозина к центру тонкой нити. Однако мутации не позволяют этому белку занимать позиции на тонкой нити, характерные для сильного связывания актомиозина. Кроме того, значения N мутантных тропомиозинов в целом выше, чем для тропомиозина дикого типа, что указывает на уменьшение сродства этих тропомиозинов к актину. Мутация Q147P вызывает наибольшее снижение сродства этого белка к актину, что согласуется с данными, полученными при соосаждении комплекса ак-тин-тропомиозин (рис. 9). Наиболее значительное уменьшение ФЕ наблюдали для Q147P ТМ. Таким образом, структурное состояние мутантных тропомиозинов в цикле гидролиза АТФ характерно для слабых форм связывания актина с миозином.

Мутации Е117К и Q147P уменьшают амплитуду изменений ФЕ при переходе актомиозина из слабой в сильную форму связывания на 33 и 46% при высокой концентрации Са2+ и на 11 и 33% при низкой концентрации Са2+, соответственно, по сравнению с ТМ дикого типа. Снижение амплитуды изменений ФЕ для El 17К ТМ коррелирует с ингибированием

АТФазной активности актомиозина в присутствии этого мутантного белка в растворе (рис. 10).

Возможно, механизм действия мутаций связан с тем, что замены Е117К и 0147Р происходят в позиции е гептоповторов тропомиозина и способны нарушать образование солевых мостиков между аминокислотными остатками в позициях ей д различных субъединиц тропомиозина. Нарушение формирования солевых мостиков может дестабилизировать суперспираль тропомиозина и приводить к изменению актин-тропомиозинового взаимодействия. Кроме того, мутация Е117К может локально инвертировать отрицательный поверхностный заряд тропомиозина, поскольку при этой мутации происходит замена отрицательно заряженного остатка глютамина на положительный остаток лизина [48]. Принимая во внимание электростатическую природу взаимодействия тропомиозина с актином, локальное изменение заряда способно вызвать смещение мутантного тропомиозина относительно Р-актина в другое равновесное положение.

Как было показано ранее ([44], также см. раздел 3), тропомиозин может «перекатываться» по поверхности актиновой нити в цикле гидролиза АТФ. Этому способствует наличие в тропомиозине псевдоповторов, состоящих из а- и р-областей, которые взаимодействуют с актином в разных состояниях тонкой нити. Аминокислотные остатки в позициях 117 и 147 располагаются в (3-участках псевдоповторов молекулы тропомиозина, которые, как было предположено, участвуют во взаимодействии с актином при сильном связывании головок миозина с актином. Локальное изменение конформации тропомиозина в (З-участках может объяснить природу ингибирования движения тропомиозина при трансформации актомиозина из слабой в сильную форму связывания.

Недостаточная активация тонкой нити тропомиозином, содержащим аминокислотные замены Е177К и 0147Р, на наш взгляд, может приводить к нарушениям в характере и последовательности взаимозависимых конформационных перестроек всего белкового ансамбля сократительной системы мышечной клетки и может быть одной из причин ослабления сократительной функции мышечной ткани [РгоЫпа (КагркЬеуа) е1 а1., 20076], наблюдаемой в патологически измененных скелетных мышцах при немалиновой миопатии.

выводы

1. В мышечном волокне в цикле гидролиза АТФ происходят многоступенчатые изменения конформации актина и миозина, которые сопровождаются изменениями в ориентации и подвижности SH1 спирали миозина и субдомена 1 актина. Каждому промежуточному состоянию актин-миозинового комплекса соответствует определенное структурное состояние и позиция тропомиозина на тонкой нити.

2. Регуляция актин-миозинового взаимодействия в цикле гидролиза АТФ осуществляется взаимозависимыми конформационными перестройками актина, миозина и тропомиозина. При высокой концентрации Са2+ тропонин смещает тропомиозин к центру тонкой нити и субдомен 1 актина к периферии тонкой нити и таким способом активирует формирование сильных форм связывания актомиозина. Тропонин при низкой концентрации Са2+ и дефосфорилированный кальдесмон ограничивают миозин-зависимые движения тропомиозина и фиксируют конформацию актина и миозина в состоянии, типичном для слабых форм актин-миозинового взаимодействия.

3. Мутации Glu117Lys и Gln147Pro втропомиозине смещают тропомиозин к периферии тонкой нити и ограничивают миозин-зависимые движения тропомиозина в цикле гидролиза АТФ, что может быть одной из причин мышечной слабости, наблюдаемой при немалиновой миопатии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Borovikov YS, Karpicheva ОЕ. Avrova SV, Robinson P, Redwood CS. (2009) The effect of the dilated cardiomyopathy-causing mutation Glu54Lys of alpha-tropomyosin on actin-myosin interactions during the ATPase cycle. Arch. Biochem. Biophys. 489:20-4.

2. Borovikov YS, Karpicheva OE, Chudakova GA, Robinson P, Redwood CS. (2009) Dilated cardiomyopathy mutations in alpha-tropomyosin inhibit its movement during the ATPase cycle. Biochem. Biophys. Res. Commun. 381:403-6.

3. Borovikov YS, Karpicheva OE. Avrova SV, Redwood CS. (2009) Modulation of the effects of tropomyosin on actin and myosin conformational changes by troponin and Ca2+. Biochim. Biophys. Acta 1794:985-94.

4. Pronina OE, Makuch R, Wrzosek A, D^browska R, Borovikov YS. (2007) Caldesmon inhibits both force development and transition of actin monomers from "OFF" to "ON" conformational state by changing its position in thin filaments. Int. Cell. Biol. 31:394-404.

5. Kulikova N, Pronina OE. Dabrowska R, Borovikov YS. (2007) Caldesmon inhibits the actin-myosin interaction by changing its spatial orientation and mobility during the ATPase activity cycle. Biochem. Biophys. Res. Commun. 357:461-6.

6. Kulikova N, Pronina OE. Dabrowska R, Borovikov YS. (2006) Caldesmon restricts the movement of both C- and N-termini of tropomyosin of F-actin in ghost fibers during the acto-myosin ATPase cycle. Biochem. Biophys. Res. Commun. 345:280-6.

7. Borovikov YS, Kulikova N, Pronina OE, Khaimina SS, Wrzosek A, Dabrowska R. (2006) Caldesmon freezes the structure of actin filaments during the actomyosin ATPase cycle. Biochim. Biophys. Acta 1764:1054-62.

8. Пронина OE, Копеланд О, Марстон С, Боровиков ЮС. (2006) С-концевые сайты каль-десмона управляют циклом гидролиза АТФ, сдвигая промежуточные состояния актомио-зина к слабым формам взаимодействия миозина с актином. Цитология 48:9-18.

9. Пронина ОЕ, Вржосек А, Дабровска Р, Боровиков ЮС. (2005) Влияние нукпеотидов на ориентацию и подвижность субфрагмента-1 миозина в теневом мышечном волокне. Биохимия (Москва) 70:1382-8.

Тезисы докладов:

1. Karpicheva OE. Berestovoy MA, Chudakova GA, Borovikov YS, Redwood CS. (2008) The effect of dilated cardiomyopathy-causing Glu40Lys and Glu54Lys mutations on a-tropomyosin movement in ATPase cycle. In Abstracts of XXXVII European Muscle Conference, Supplement, Oxford, United Kingdom, J. Muscle Res. Cell Motil. 29:282.

2. Borovikov YS, Karpicheva OE. Avrova SV, Redwood CS. (2007) Force generation is regulated via conformational changes of actin and myosin initiated by changes in position and mobility of troponin-tropomyosin on thin filaments. In Abstracts of XXXVI European Muscle Conference, Supplement, Stockholm, Sweden, 58.

3. Karpicheva OE. Robinson P, Borovikov YS, Redwood CS. (2007) Nemaline myopathy-causing mutations El 17K and Q147P of ß-tropomyosin impair its function. In Abstracts of XXXVI European Muscle Conference, Supplement, Stockholm, Sweden, 34.

4. Pronina OE, Robinson P, Borovikov YS, Redwood CS. (2007) Alteration of ß-tropomyosin function by nemaline myopathy-causing mutations El 17K and Q147P. In Abstracts of 51th Annual Meeting of Biophysical Society, Baltimore, MD, USA, Biophys. J., Supplement, poster B342.

5. Chudakova GA, Pronina OE. Kulikova N, Wrzosek A, Dabrowska R, Borovikov YS. (2006) Movement of smooth muscle tropomyosin on F-actin in ghost fibers during the actomyosin ATPase cycle. In Abstracts of International Symposium "Biological Motility: Basic Research and Practice", Pushchino, Russia, 20.

6. Khaymina SS, Pronina OE, Dabrowska R, Wrzosek A, Borovikov YS (2005) Changes in axial tilting of cross-bridges (myosin heads and actin monomers) at intermediates of ATPase cycle in the absence or presence of caldesmon. In Abstracts of 49th Annual Meeting of Biophysical Society, Long Beach, CA, USA, Biophys. J. 88: poster B488.

7. Savkin DY, Chudakova GA, Mikhailov GV, Pronina OE, Kulikova N, Wrzosek A, Dabrowska R, Borovikov YS (2005) Caldesmon inhibits myosin-induced movement of smooth muscle tropomyosin during the actomyosin ATPase cycle. In Abstracts of XXXIVEuropean Muscle Conference, Hortobagy, Hungary, J. Muscle Res. Cell Motil. 26:70.

8. Borovikov YS, Pronina OE, Khaimina SS, Marston SB, (2004) Change in orientation of smooth muscle tropomyosin in response to different intermediates of myosin ATPase cycle in ghost muscle fibers. In Abstracts of XXXIII European Muscle Conference, Elba Island, Italy, J. Muscle Res. Cell Motil. 25:260.

9. Pronina OE, Wrzosek A, Dabrowska R, Borovikov YS. (2004) Orientation and mobility of intermediates of 1.5-IAEDANS-labeled subfragment-1 in ghost muscle fibers. In Abstracts of XXXIII European Muscle Conference, Elba Island, Italy, J. Muscle Res. Cell Motil. 25:247-248.

10. Pronina OE. Wrzosek A, Dabrowska R, Borovikov VS. (2004) Myosin subfragment 1 orientation and mobility at intermediates of ATPase cycle. In Abstracts of Structural Mechanisms in Muscle Conference, London, United Kingdom, 22.

11. Pronina OE, Wrzosek A, Dabrowska R, Borovikov YS. (2004) Effect of nucleotides on orientation and mobility of subfragment 1 in ghost fibers. In Abstracts of International Symposium "BiologicalMotility", Pushchino, Russia, 16.

12. Borovikov YS, Pronina OE, Khaimina SS, Copeland N, Marston SB. (2003) Influence of cal-desmon fragments H1, H2, H12 and 658C on orientation and mobility of S1 in the presence and absence of nucleotides. In Abstracts of XXXII European Muscle Conference, Montpellier, France, J. Muscle Res. Cell Motil. 24:325.

13. Pronina OE. Wrzosek A, Dabrowska R, Borovikov YS. (2003) Effect of caldesmon and nucleotides on the binding between S1 and actin in ghost fibers. In Abstracts of XXXII European Muscle Conference, Montpellier, France, J. Muscle Res. Cell Motil. 24:330.

Список цитированной литературы

1. Huxley HE. (1972) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 37:361-76. 2. Haselgrove J. (1972) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 37:341-52. 3. Marston SB, Redwood CS. (1991) Bio-chem. J. 279:1-16. 4. Sen A, Chalovich JM. (1998) Biochemistry 37:7526-31. 5. Vibert P, Craig R, Lehman WJ. (1993) Cell Biol. 123:313-21. 6. Perry SV. (2001) J. Muscle Res. Cell Motil. 22:5-49. 7. Squire JM, Morris EP. (1998) FASEB J. 12:761-771. 8. Borovikov YS, Gusev NB. (1983) Eur. J. Bio-chem. 136:363-9.9. Nowak E, Borovikov YS, Dabrowska R. (1989) Biochim. Biophys. Acta 999:28992.10. Bretscher (1984) J. Biol. Chem. 259:12873-80.11. Иванов ИИ, Юрьев BA. (1961) Медгиз, Ленинград. 12. Spudich J A, Watt S. (1971) J. Biol. Chem. 246:4866-71.13. Okamoto Y, Sekine T. (1985) J. Biol. Chem. 98:1143-5.14. Mirza M. et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:28498-506.15. Laern-mli UK. (1970) Nature 227:680-5.16. Borejdo J, Putnam S. (1977) Biochim. Biophys. Acta 459:57895.17. Miki M, dos Remedios CG, Barden JA. (1987) Eur. J. Biochem. 168:339-45.18. Gatazkiewicz B, Borovikov YS, Dabrowska R. (1987) Biochim Biophys Acta. 916:368-75. 19. Szczesna D. et al.

(1994) Biochemistry 33:6716-20. 20. Lamkin M, Tao T, Lehrer SS. (1983) Biochemistry 22:3053-8. 21. Yanagida T, Oosawa F. (1978) J. Mol. Biol. 126:507-24. 22. Andreev OA, Takashi R, Borejdo J.

(1995) J. Mus. Res. Cell Motil. 16:353-67.23. Irving M. (1996) Biophys. J. 70:1830-5. 24. Каулин АБ. (1968) Цитология 10:123-5. 25. Tregear RT, Mendelson RA. (1975) Biophys. J. 15:455-67. 26. Kakol I. et al. (1987) Biochim. Biophys. Acta 913:1-9. 27. Borovikov YS. et al. (2004) Biophys. J. 86:3020-9.28. Prochniewicz-Nakayama E, Yanagida T, Oosawa F. (1983) J. Cell Biol. 97:1663-7.29. Borovikov YS. et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1478:138-51. 30. Goody RS, Hofmann W. (1980) J. Muscle Res. Cell Motil. 1:101-15. 31. Roopnarine O, Thomas DD. (1996) Biophys. J. 70:2795-806. 32. Lymn RW, Taylor EW. (1971) Biochemistry 10:4617-24. 33. Cooke R. (1997) Physiol. Rev. 77:67197. 34. Borovikov YS. (1999) Int. Rev. Cytol. 189:267-301. 35. Borejdo J. et al. (2006) Biochim. Biophys. Acta 1763:137-40. 36. Onishi H, Morales MF. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:12714-9. 37. Geeves MA, Holmes КС. (2005) Adv. Protein Chem. 71:161-93. 38. Rayment I. et al. (1993) Science 261:58-65. 39. Holmes K.C. (1997) Curr. Biol. 7:R112-8. 40. Geeves MA. (1991) Biochem. J. 274:1-14. 41. Marston SB, Fraser IDC, Huber PAJ. (1994) J. Bioi. Chem. 269:32104-9. 42. Oda T, Namba K, Maeda Y. (2005) Biophys. J. 88:2727-36. 43. Borejdo J. et al. (1982) J. Molec. Biol. 158:391-414. 44. Holthauzen LMF., Correa F, Farah CS. (2004) J. Biol. Chem. 279:15204-13. 45. Lehman W, Craig R, Vibert P. (1994) Nature 368:65-7. 46. Vibert P, Craig R, Lehman W. (1997) J. Mol. Biol. 266:8-14. 47. Bacchiocchi C, Graceffa P, Lehrer SS. (2004) Biophys. J. 86:2295-307. 48. Olson TM. et al. (2001) J. Mol. Cell Cardiol. 33:723-32.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 16.11.2009. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. иеч. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 5157Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812)550-40-14 Тел./факс: (812)297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Карпичева, Ольга Евгеньевна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Актин.

1.2. Миозин.

1.3. Области взаимодействия актина и миозина.

1.4. Тропомиозин.

1.4.1. Структура тропомиозина.

1.4.2. Взаимодействие тропомиозина с актином

1.4.3. Изоформы тропомиозина.

1.4.4. Мутации тропомиозина, связанные с наследственными заболеваниями мышц.

1.4.5. Регуляция тропомиозином актин-миозинового взаимодействия.

1.5. Кальдесмон.

1.5.1. Структура кальдесмона.

1.5.2. Регуляция кальдесмоном актин-миозинового взаимодействия.

1.7. Применение метода поляризационной микрофлуориметрии для изучения мышечного сокращения.51>

Глава 2. Материалы и методы.I.

2.1. Получение глицеринизированных мышечных волокон.

2.2. Получение теневых волокон.

2.3. Получение С-актина и реконструкция актиновых нитей в теневом волокне.

2.4. Получение субфрагмента-1 миозина.

2.5. Получение гладкомышечного тропомиозина и кальдесмона.

2.6. Связывание мышечных белков с Р-актином теневых волокон.

2.7. Получение рекомбинантного тропомиозина.

2.7.1. Клонирование последовательности ДНК, кодирующей тропомиозин.

2.7.2. Экспрессирование белка.

2.8: Получение рекомбинантного тропонина.

2.9. Измерение концентрации белков.

2.10. Электрофорез в полиакриламидном геле.

2.11. Измерение АТФазной активности актомиозина.

2.12. Определение способности связывания скелетного тропомиозина с актином.

2.13. Измерение спектров кругового дихроизма.

2.14. Окрашивание мышечных белков флуоресцентными красителями.

2.15. Метод поляризационной микрофлуориметрии.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Влияние нуклеотидов на структурное состояние субфрагмента-1 миозина в АТФазном цикле.

3.2. Влияние субфрагмента-1 миозина на структурное состояние актина в АТФазном цикле.

3.3. Влияние скелетного тропомиозина на структурное состояние субфрагмента-1 миозина и актина в АТФазном цикле.

3.4. Влияние субфрагмента-1 миозина на структурное состояние скелетного тропомиозина в АТФазном цикле.

3.5. Влияние тропонина и Са2+ на конформационные изменения актина, миозина и тропомиозина в АТФазном цикле.

3.6. Влияние кальдесмона и гладкомышечного тропомиозина на структурное состояние субфрагмента-1 миозина и актина в АТФазном цикле.

3.7. Движение Ы- и С-концевых областей гладкомышечного тропомиозина в цикле гидролиза АТФ.

3.8. Влияние мутаций С1и117ЬуБ и С1п147Рго в скелетном тропомиозине на его структурно-функциональные свойства.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные механизмы регуляции тропомиозином актин-миозинового взаимодействия"

Актуальность исследования.

Известно, что в основе мышечного сокращения лежит циклическое взаимодействие головок миозина с актином, сопровождаемое гидролизом аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). В скелетных и сердечных мышцах регуляция мышечного сокращения осуществляется Са2+-зависимым образом тропонин-тропомиозиновым комплексом (ТН-ТМ), расположенным на акти-новой нити. Исследования, выполненные с помощью структурных и биохимических методов, показали, что при низкой концентрации Са2+ ТН-ТМ стериче-ски блокирует места связывания головок миозина на актине, тем самым инги-бируя мышечное сокращение [см. обзор: Gordon et al., 2000]. Считается, что связывание ионов Са2+ тропонином приводит к азимутальному смещению тропомиозина от блокирующей позиции к центру актиновой нити, в результате чего головка миозина способна слабо взаимодействовать с актином. Изомеризация актомиозина в сильную форму связывания индуцирует дальнейшее смещение тропомиозина к центру актиновой нити. Таким образом, тро-помиозин может находиться в трех различных позициях на актине: «блокирующей» (при низкой концентрации Са2+), «закрытой» (при высокой концентрации Са2+) и «открытой» (вследствие сильного связывания миозина с актином). Эта модель регуляции получила название механического, или стериче-ского, блокирования и предполагает важную роль позиционирования тропо-миозина относительно областей взаимодействия миозина с актином [Huxley, 1972; Haselgrove, 1972].

В гладких мышцах функцию тропонина, вероятно, выполняют кальдес-мон (CaD) и Са2+-связываюицие белки [Marston, Redwood, 1991; Sen, Chalovich, 1998]. Кальдесмон, взаимодействуя с актином, обладает способностью обратимо ингибировать актин-активируемую АТФазную активность миозина и подвижность /л vitro [Huber et al., 1996]. В присутствии тропомиозина ингиби-рующий эффект кальдесмона усиливается [Dabrowska et al., 1985; Marston, Redwood, 1993]. Активация сокращения гладких мышц, также как и поперечно-полосатых мышц, сопровождается движением тропомиозина на актиновой нити [Vibert et al., 1993]. Так, метод дифракции Х-лучей выявил две позиции тропомиозина в присутствии кальдесмона, соответствующие ингибированной. и активированной АТФазе актомиозина [Huxley, 1972; Vibert et al., 1993]. •

Однако модель стерического блокирования не может объяснить некоторые аспекты регуляции мышечного сокращения. Так, например, в гладких мышцах при низкой концентрации Са2+ тропомиозин не закрывает потенциальные области связывания миозина на актиновой нити [Vibert et al., 1993]. Различие в расположении тропомиозиновой молекулы относительно актина в разных мышечных системах становится не столь существенным, если предположить, что кальдесмон в гладких мышцах и тропонин в поперечнополосатых мышцах во взаимодействии с тропомиозином способны изменять структурное состояние актина [Perry, 2001]. Возможно, что регуляция мыше-ечного сокращения осуществляется не только в результате механического блокирования тропомиозином областей связывания миозина на актиновой нити, но также аллостерически - вследствие сложных конформационных изменений всего ансамбля мышечных белков. Возможность такого способа регуляции поддерживается биохимическими исследованиями [см. обзор: Squire, Morris, 1998] и может разрешить многие противоречия модели стерического блокирования актин-миозинового взаимодействия. Однако на настоящий момент аллостерические эффекты регуляции мышечного сокращения остаются малоизученными. Таким образом, актуальность исследования молекулярных механизмов регуляции тропомиозином актин-миозинового взаимодействия, и, в частности, конформационных изменений сократительных и регуля-торных белков, не вызывает соменений.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы состояла в изучении молекулярных механизмов регуляции скелетным и гладкомышечными тропомиозинами актин-миозинового взаимодействия. В задачи исследования входило:

2. Изучить молекулярные механизмы регуляции тропонин-тропомиозиновой и кальдесмон-тропомиозиновой регуляторными системами актин-миозинового взаимодействия.

3. Исследовать влияние точечных мутаций Glu117Lys и Gln147Pro тропо-миозина, связанных с немалиновой миопатией, на регуляцию взаимодействия миозина с актином в АТФазном цикле.

Основные положения, выносимые на защиту 1. В* цикле гидролиза АТФ существует несколько промежуточных структурных состояний ансамбля мышечных белков (актина, миозина и тропомио-зина), находящихся в динамическом равновесии. Эти структурные состояния ансамбля отличаются друг от друга конформацией головок миозина и мономеров актина, характеризующейся различной подвижностью и пространственной организацией SH1 спирали миозина и субдомена 1 актина. Каждому промежуточному состоянию актомиозина соответствует определенное структурное состояние тропомиозина, характеризуемое различной подвижностью и позицией этого белка на поверхности актиновой нити.

2. Регуляция актин-миозинового взаимодействия тропонин-тропомиозиновым комплексом может осуществляться взаимозависимыми конформационными перестройками актина, миозина и тропомиозина. Модификация структурных состояний моторного домена миозина, субдомена 1 актина и тропомиозина при связывании нуклеотидов с миозином и Са2+ с тро-понином может нарушать равновесное состояние ансамбля этих мышечных белков, приводя к переходу системы в другое равновесное состояние. Так, при низкой концентрации Са2+ ТН-ТМ ингибирует актин-миозиновое взаимодействие, смещая тропомиозин к периферии актиновой нити, ограничивая миозин-зависимые движения тропомиозина и фиксируя актинь в состоянии, при котором поперечные миозиновые мостики, связанные с актином, не способны генерировать силу (в «выключенном» состоянии). Наоборот, при высокой концентрации Са2+ тропонин сдвигает тропомиозин ближе к центру актиновой нити при формировании сильной формы связывания миозина с актином и дальше к периферии актиновой нити при слабом связывании этих белков, таким способом увеличивая амплитуду внутримолекулярных движений актомиозина в цикле гидролиза АТФ, что может приводить к увеличению эффективности работы поперечных миозиновых мостиков.

3. В гладкомышечной регуляторной системе дефосфорилированный каль-десмон ингибирует актин-миозиновое взаимодействие, сдвигая тропомиозин к периферии актиновой нити, ограничивая миозин-зависимые движения тропомиозина и фиксируя конформацию актина в «выключенном» состоянии и головки миозина в слабой форме связывания с актином.

4. Мутации Glu117Lys и Gln147Pro тропомиозина, связанные с наследственной немалиновой миопатией, вызывают смещение тропомиозинового тяжа к периферии актиновой нити и ингибируют движения тропомиозина на поверхности актина в цикле гидролиза АТФ, что может вызвать нарушение согласованной работы ансамбля мышечных белков, сдвигая равновесие сократительной системы к слабосвязанному структурному состоянию.

Научная новизна исследований

Впервые показано, что в мышечном волокне в АТФазном цикле существует несколько структурных состояний актомиозиновой системы, отличающихся друг от друга подвижностью и пространственной организацией SH1 спирали миозина и субдомена 1 актина. Каждому промежуточному состоянию актомиозина соответствует определенное структурное состояние тропомиозина, характеризуемое различной подвижностью и позицией этого белка на поверхности актиновой нити.

Получены приоритетные данные, указывающие на то, что регуляция ак-тин-миозинового взаимодействия в скелетных и гладких мышцах может осуществляться взаимозависимыми конформационными изменениями актина, миозина и тропомиозина. Показано, что тропонин и Са2+ способны модифицировать влияние нуклеотидов на структурное состояние ансамбля актина, миозина и тропомиозина, что может быть причиной активации гидролиза АТФ при высокой концентрации Са2+ и ингибирования гидролиза при низкой*, концентрации Са2+. Обнаружено, что дефосфорилированный кальдесмон, фиксируя тропомиозин на периферии актиновой нити, ингибирует смещение субдомена 1 актина к периферии тонкой нити и SH1 спирали миозина к центру тонкой нити и подавляет формирование сильных форм связывания акто-миозина, что может приводить к ингибированию гидролиза АТФ.

Впервые показано, что одной из причин ослабления сократительной функции скелетных мыщц при немалиновой миопатии является ингибирова-ние движения тропомиозина по поверхности тонкой нити в цикле гидролиза АТФ.

Теоретическое и практическое значение работы

Полученные данные расширяют и углубляют представления о молекулярных механизмах клеточной подвижности и могут быть использованы при чтении курсов лекций по цитологии, клеточной биологии, биофизике, биохимии и физиологии. Впервые обнаруженное нами ингибирование движения скелетного тропомиозина по поверхности тонкой нити в цикле гидролиза АТФ, вызванное мутациями С1и1171у5 и 01п147Рго тропомиозина, имеет большое значение для выяснения молекулярных механизмов ослабления сократительной функции скелетных мышц при наследственной немалиновой миопатии. Результаты работы могут быть полезны при разработке методов диагностики некоторых болезней мышечной ткани

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Карпичева, Ольга Евгеньевна

Выводы

2. Регуляция актин-миозинового взаимодействия в цикле гидролиза АТФ осуществляется взаимозависимыми конформационными перестройками актина, миозина и тропомиозина. При высокой концентрации Са2+ тропонин смещает тропомиозин к центру тонкой нити и субдомен 1 актина к периферии тонкой нити и таким способом активирует формирование сильных форм связывания актомиозина. Тропонин при низкой концентрации Са2+ и дефосфо-рилированный кальдесмон ограничивают миозин-зависимые движения тропомиозина и фиксируют конформацию актина и миозина в состоянии, типичном для слабых форм актин-миозинового взаимодействия.

3. Мутации Glu117Lys и Gln147Pro в тропомиозине смещают тропомиозин к периферии тонкой нити и ограничивают миозин-зависимые движения тропомиозина в цикле гидролиза АТФ, что может быть одной из причин мышечной слабости, наблюдаемой при немалиновой миопатии.

Заключение

Суммируя вышеизложенное, можно заключить, что использование реконструированных мышечных волокон и метода поляризационной флуори-метрии позволили получить приоритетные данные о конформационных перестройках актина, миозина и тропомиозина при моделировании различных промежуточных стадий цикла гидролиза АТФ.

В результате исследований впервые было обнаружено, что при переходе актомиозина из слабой в сильную форму связывания происходит многоступенчатое вращение SH1 спирали моторного домена миозина по направлению к оси тонкой нити и иммобилизация головок миозина, связанных с актином. Более того, оказалось, что изменения в центре связывания нукпеотида в миозине передаются не только на SH1 спираль миозина, как считалось ранее [Holmes, Geeves, 2000], но также на актин, вызывая нуклеотид-зависимые изменения в структурном состоянии субдомена 1 актина в тонких нитях. При этом каждому промежуточному структурному состоянию головки миозина в цикле гидролиза АТФ соответствует определенная пространственная организация и подвижность субдомена 1 актинового мономера. Самые заметные изменения подвижности и ориентации субдомена 1 актина соответствуют наибольшему сдвигу и изменению подвижности SH1 спирали миозина. Таким образом, АТФазный цикл сопровождается многоступенчатыми и взаимозависимыми изменениями структурного состояния головки миозина и субдомена 1 актина, которые, по-видимому, определяют эффективность работы актомио-зинового мотора [Borovikov, Karpicheva et al., 2009].

В работе показана важная роль тропомиозина в регуляции взаимодействия миозина с актином при сокращении гладких и скелетных мышц. Оказалось, что этот регуляторный белок модулирует изменения пространственной организации SH1 спирали миозина и субдомена 1 актина в АТФазном цикле [Borovikov, Karpicheva et al., 2009]. Поскольку считается, что изменения конформации активного центра миозина передаются на регуляторный домен с возможным участием SH1 спирали, что играет ключевую роль в развитии мышечной силы [Geeves, Holmes, 2005; Rayment et al., 1993; Holmes, 1996; 1997], то увеличение амплитуды движения 5Н1 спирали в АТФазном цикле, обнаруженные в работе, может указывать на то, что тропомиозин увеличивает эффективность работы каждого поперечного миозинового мостика.

Результаты настоящего исследования позволяют предложить молекулярный механизм регуляции тропонин-тропомиозиновой системой актин-миозинового взаимодействия в цикле гидролиза АТФ, согласно которому во время АТФазного цикла миозин-индуцируемый сдвиг тяжей тропомиозина от периферии к центру тонкой нити, влияя на конформацию актина, увеличивает область стереоспецифических и гидрофобных связей между головкой миозина и актиновой нитью (рис. 25). Это, в свою очередь, приводит к увеличению эффективности взаимодействия миозина с актином. ТН модулирует этот эффект тропомиозина Са2+-зависимым образом. При высокой концентрации Са2+ тропомиозин под влиянием тропонина сдвигает субдомен-1 актина к периферии тонкой нити, и, увеличивая область стероспецифичных и гидрофобных взаимодействий актомиозина, способствует образованию более сильных форм связывания актомиозина и таким образом увеличивает эффективность работы актомиозинового мотора. При низкой концентрации Са2+ тропонин-тропомиозиновый комплекс, наоборот, ингибирует работу актомиозинового мотора, ограничивая миозин-зависимые движения тропомиозина и фиксируя конформацию актина в состоянии, типичном для слабой формы актин-миозинового взаимодействия [Borovikov, Karpicheva et al., 2009].

Актин-51 Актин-ТМ-Б 1

Актин-ТМ-БЬТН Актин-ТМ-Б1 -ТН

Са2+ -Са2+

Рисунок 25. Схема, показывающая изменения ориентации моторного домена миозина, субдомена 1 актина и тяжа тропомиозина, наблюдаемые при переходе из слабой к сильной форме связывания миозина с актином при низкой и высокой концентрации ионов Са2+ (объяснения смотрите в тексте).

Полученные данные указывают, кроме того, на то, что модификация конформации моторного домена миозина при связывании нукпеотидов, а также пертурбация структурного состояния тропомиозина и тропонина при изменении концентрации Са2+ нарушают равновесное состояние ансамбля актина, миозина и тропомиозина, приводя к переходу актомиозиновой системы в другое равновесное состояние. Таким образом, нарушение равновесного структурного состояния всего белкового ансамбля сократительной системы мышечной клетки лежит в основе молекулярного механизма регуляции актин-миозинового взаимодействия тропонин-тропомиозиновой системой.

Впервые показано, что кальдесмон, так же, как и тропонин при низкой концентрации Са2+, ингибирует внутримолекулярные движения актомиозина в АТФазном цикле, ограничивая миозин-зависимые движения тропомиозина и фиксируя структуру актина в выключенном состоянии [Вогтллкоу, Рготпа (КагркИеуа) е1 а1., 2006; КиПкоуа, Ргопта (КагркЬеуа) е1 аК, 2006]. Возможно, что для различных мышечных тканей существует похожий аллостерический механизм регуляции актомиозинового мотора в цикле гидролиза АТФ.

Полученные результаты демонстрируют также то, что регуляция тропо-миозином работы поперечных миозиновых мостиков в поперечно-полосатых и гладких мышцах реализуется не только через механическое блокирование областей связывания миозина при движении тяжей тропомиозина по поверхности тонкой нити, но также через сложный аллостерический механизм, в котором участвуют все компоненты ансамбля мышечных белков. По-видимому, регуляторные белки (тропомиозин, тропонин, кальдесмон) вызывают такие конформационные изменения актина, которые приводят к изменению конфигурации миозин-связывающего сайта на актине. Определенная последовательность конформационных изменений во всех компонентах ансамбля мышечных белков в цикле гидролиза АТФ, скорее всего, играют важную роль в высокоэффективном механизме работы актомиозинового мотора [Вогтллкоу, КагркЬеуа е! а!., 2009].

В работе показано, что мутации в тропомиозине С1и1171у$ и 61п147Рго, ассоциированные с развитием немалиновой миопатии, приводят к смещению тропомиозина к периферии тонкой нити и ингибированию движений тяжа тропомиозина по поверхности актина. Такое структурное состояние тропомиозина может разобщать согласованные конформационные изменения ак-томиозина и привести к падению эффективности работы актомиозинового мотора, что может быть одной из причин мышечной слабости, наблюдаемой при немалиновой миопатии [КагркИеуа ег а!., 2007].

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Карпичева, Ольга Евгеньевна, Санкт-Петербург

1. Барский И.Я., Розанов Ю.М., Черногрядская Н. А., Шифферс Л. А., Шудель М. С. (1968) Поляризованная флуоресценция микроструктур биологических объектов. Известия АН СССР 32:1546-7.

2. Боровиков Ю.С., Шудель М.С., Черногрядская H.A., Розанов Ю.М., Барский И.Я. (1971) Об изменении азимутальных характеристик поляризованной ультрафиолетовой флуоресценции одиночных мышечных волокон при растяжении и сокращении. Доклады АН СССР 196:962-4.

3. Боровиков Ю.С., Розанов Ю.М., Барский И.Я., Шудель М.С., Черногрядская H.A. (1972) Исследование поляризованной ультрафиолетовой флуоресценции гигантских мышечных волокон Baianus Rostratus. Цитология 14:953-60.

4. Боровиков Ю.С., Черногрядская H.A., Розанов Ю.М. (1974) Изучение структурных изменений миозиновых и актиновых нитей в мышечном волокне поляризационным методом ультрафиолетовой флуоресцентной микроскопии. Цитология 16:977-82.

5. Боровиков Ю.С., Левицкий Д.И., Кириллина В.П., Поглазов Б.Ф. (1981) ДТНБ-легкая цепь миозина управляет конформационными перестройками Ф-актина, индуцированными субфрагментом-1 миозина. Докл. АН СССР 259:732-5.

6. Боровиков Ю.С., Конколь И., Левицкий Д.И. (1986а) Сшивка SH-групп в головках миозина изменяет характер конформационных перестроек Ф-актина, индуцированных субфрагментом 1 миозина или тяжелым меромиози-ном. Биохимия 287:216-9.

7. Боровиков Ю.С., Конколь И., Щчесна Д., Кириллина В.П., Левицкий Д.И. (19866) Фосфорилирование легких цепей миозина из скелетных мышц кролика влияет на характер конформационных изменений Ф-актина, индуцированных тяжелым меромиозином. Биохимия 51:691-4.

8. Боровиков Ю.С., Добровольский 3., Дабровска Р. (1988) Тропомиозин и субфрагмент-1 миозина индуцируют в тонких нитях мышечного волокна разные по характеру конформационные перестройки С-концевого участка полипептидной цепи актина. Цитология 30:1014-7.

9. Боровиков Ю.С., Вротек М., Лебедева H.H., Конколь И. (1989) Влияние фосфорилирования легких цепей миозина и Са2+ на конформацию Ф-актина при сокращении скелетных мышц. Биохимия 54:161-б.

10. Боровиков Ю.С., Новак Е., Дабровска Р. (1990) Влияние кальдесмона и тропомиозина из гладких мышц на подвижность головки миозина в теневом мышечном волокне Биохимия 55:1498-502.

11. Иванов И.И., Юрьев В.А. (1961) Биохимия и патобиохимия мышц. Медгиз, Ленинград.

12. Иоффе В.А., Боровиков Ю.С., Барский И.Я., Розанов Ю.М. (1974) Двухка-нальный поляризационный микрофлуориметр. Цитология 16:112-6.

13. Каулин А.Б. (1968) Поляризованная флуоресценция акридинового оранжевого в мышечных волокнах в норме и при повреждении. Цитология 10:123-5.

14. Каулин А.Б., Гольфанд К.А. (1970) Поляризованная флуоресценция окрашенных мышечных волокон. IV. Изменение ориентации акридинового оранжевого в глицеринизированных волокнах при действии АТФ. Цитология 12:172-7.

15. Кроленко С.А. (1975) Т-система мышечных волокон: структура и функция. Ленинград, Наука.

16. Кремнева Е.В., Николаева О.П., Гусев Н.Б., Левицкий Д.И. (2003) Биохимия 68:802-9.

17. Левицкий Д.И., Боровиков Ю.С., Николаева О.П., Голицына HJ1, Поглазов Б.Ф. (1990) Влияние щелочных легких цепей миозина на взаимодействие субфрагмента 1 миозина с актином в растворе и в теневом мышечном волокне. Биохимия 55:1690-9.

18. Левицкий Д.И., Голицына Н.Л., Николаева О.П., Боровиков Ю.С. (1991) Взаимодействие изоформ субфрагмента-1 миозина, содержащих флуорсцент-но меченные щелочные легкие цепи, с актином мышечных волокон. Биохимия 56:639-47.

19. Пинаев Г.П. (1987) Структура и функции белков сократительной системы. Ленинград, Наука.

20. Пронина (Карпичева) O.E., Вржосек А., Дабровска Р., Боровиков Ю.С. (2005) Влияние нуклеотидов на ориентацию и подвижность субфрагмента-1 миозина в теневом мышечном волокне. Биохимия (Москва) 70:1382-8.

21. Пронина (Карпичева) О.Е., Копеланд О., Марстон С, Боровиков Ю.С. (2006) С-концевые сайты кальдесмона управляют циклом гидролиза АТФ, сдвигая промежуточные состояния актомиозина к слабым формам взаимодействия миозина с актином. Цитология 48:9-18.

22. Розанов Ю.М., Черногрядская Н.А., Барский И.Я., Боровиков Ю.С., Шудель М.С. (1971) Поляризованная ультрафиолетовая флуоресценция мышечных волокон и некоторых других цитологических анизотропных объектов. Цитология 13:190-200.

23. Adams S., Reisler Е. (1993) Role of sequence 18-29 on actin in actomyosin interactions. Biochemistry 32:5051-6.

24. Andreev O.A., Takashi R., Borejdo J. (1995) Fluorescence polarization study of the rigor complexes formed at different degrees of saturation of actin filaments with myosin subfragment-1. J. Mus. Res. CellMotil. 16:353-67.

25. Aronson J.F., Morales M.F. (1969) Polarization of tryptophan fluorescence in muscle. Biochemistry 8:4517-22.

26. Bacchiocchi C., Lehrer S.S. (2002) Ca2+-induced movement of tropomyosin in skeletal muscle thin filaments observed by multi-site FRET. Biophys.J. 82:1524-36.

27. Bacchiocchi C„ Graceffa P., Lehrer S.S. (2004) Myosin-induced movement of alpha-alpha, alpha-beta, and beta-beta smooth muscle tropomyosin on actin observed by multisite FRET. Biophys.J. 86:2295-307.

28. Bailey K. (1948) Tropomyosin: a new asymmetric protein component of the muscle fibril. Biochem. J. 43:282-7.

29. Bartegi A., Fattoum A., Derancourt J., Kassab R. (1990) Characterization of the carboxyl-terminal 10-kDa cyanogen bromide fragment of caldesmon as an actin-calmodulin-binding region. J. Biol. Chem. 265:15231-8.

30. Berger C.L., Thomas D.D. (1994) Rotational dynamics of actin-bound intermediates of the myosin adenosine triphosphatase cycle in myofibrils. Biophys.J. 67:250-61.

31. Borejdo J., Putnam S. (1977) Polarization of flourescence from single skinned gly-cerinated rabbit psoas fibres in rigor and relaxation. Biochim. Biophys. Acta 459:578-95.

32. Borejdo J., Putnam S., Morales M.F. (1979) Fluctuations in polarized fluorescence: evidence that muscle cross-bridges rotate repetitively during contraction. Proc. Natl. Acad. Scl USA 76:6346-50.

33. Borejdo J., Assulin O., Ando T.f Putnam S. (1982) Cross-bridge orientation in skeletal muscle measured by linear dichroism of an extrinsic chromophore. J. Mo-lec.Biol. 158:391-414.

34. Borejdo J., Shepard A., Akopova I., Grudzinski W., Malicka J. (2004a) Rotation of the lever arm of myosin in contracting skeletal muscle fiber measured by two-photon anisotropy. Biophys. J. 87:3912-21.

35. Borejdo J., Shepard A., Dumka D., Akopova I., Talent J., Malka A., Burghardt T.P. (20046) Changes in orientation of actin during contraction of muscle. Biophys. J. 86:2308-17.

36. Borejdo J., Talent J., Akopova I., Burghardt T.P. (2006) Rotations of a few cross-bridges in muscle by confocal total internal reflection microscopy. Biochim. Biophys. Acta 1763:137-40.

37. Borejdo J., Muthu P., Talent J., Akopova I., Burghardt T.P. (2007) Rotation of actin monomers during isometric contraction of skeletal muscle. J. Biomed. Opt. 12:014013.

38. Borovikov Y.S., Chernogriadskaia N.A. (1979) Studies on conformational changes in F-actin of glycerinated muscle fibers during relaxation by means of polarized ultraviolet fluorescence microscopy. Microsc. Acta 81:383-92.

39. Borovikov Y.S., Levitskii D.I., Kirillina V.P., Poglazov B.F. (1982) Effect of Ca2+ binding to 5,5'-dfthiobis(2-nitrobenzoic acid) light chains on conformational changes of F-actin caused by myosin subfragment-1. Eur. J. Biochem. 125:343-7.

40. Borovikov Y.S., Gusev N.B. (1983) Effect of troponin-tropomyosin complex and Ca2+ on conformational changes in F-actin induced by myosin subfragment-1. Eur. J. Biochem. 136:363-9.

41. Borovikov Y.S., Levitsky D.I. (1985) Fluorescence polarization study on Ca2+-sensitivity of confrontational changes in F-actin induced by the formation of F-actin-subfragment-l complex. Gen. Physiol. Biophys. 4:457-63.

42. Borovikov Y.S., Levitsky D.I. (1989) The effect of myosin light chain phosphorylation and Mg2+ on the conformation of myosin in thick filaments of glycerinated fibers of rabbit skeletal muscle. Eur. J. Biochem. 183(1):83-8.

43. Borovikov Y.S., Vdovina I.B., Khoroshev M.I., Kirillina V. (1991) The orientation of fluorescent probes attached to actin and myosin subfragment-1 at the strong and the weak binding of these proteins in ghost fiber. J. Muscle Res. CellMotil. 12:104.

44. Borovikov Y.S., Kakol I. (1991) Conformational changes of contractile proteins accompanying modulation of skeletal muscle contraction. Polarized microflurime-try unvestigations. Gen. Physiol. Biophys., 10:245-64.

45. Borovikov Y.S., Kirillina V. (1992) Effect of Mg-ADP on structure of actin in F-actin-myosin subfragment 1 complex. Basic Appi Myol. 2:169-74.

46. Borovikov Y.S., Nowak E., Khoroshev M.I., Dabrowska R. (1993) The effect of Ca2+ on the conformation of tropomyosin and actin in regulated actin filaments with or without bound myosin subfragment 1. Biochim. Biophys. Acta 1163:280-6.

47. Borovikov Y.S., Horiuchi K.Y., Avrova S.V., Chacko S. (1996a) Modulation of actin conformation and inhibition of actin filament velocity by calponin. Biochemistry 35:13849-57.

48. Borovikov Y.S. (1999) Conformational changes of contractile proteins and their role in muscle contraction. Int. Rev. Cytol. 189:267-301.

49. Borovikov Y.S., Moraczewska J., Khoroshev M.I., Strzelecka-Gotaszewska H. (2000) Proteolytic cleavage of actin within the DNase-l-binding loop changes the conformation of F-actin and its sensitivity to myosin binding. Biochim. Biophys. Acta 1478:138-51.

50. Borovikov Y.S., Wrzosek A., Kulikova N., Vikhorev P., Vikhoreva N., Dabrowska R. (2004a) Behavior of caldesmon upon interaction of thin filaments with myosin subfragment 1 in ghost fibers. Biochim. BiophysrActa 1699:183-9.

51. Borovikov Y.S., Kulikova N., Pronina O.E., Khaimina S.S., Wrzosek A., Dabrows-ka R. (2006) Caldesmon freezes the structure of actin filaments during the acto-myosin ATPase cycle. Biochim. Biophys. Acta 1764:1054-62.

52. Borovikov Y.S., Karpicheva O.E., Avrova S.V., Redwood C.S. (2009a) Modulation of the effects of tropomyosin on actin and myosin conformational changes by troponin and Ca2+. Biochim. Biophys. Acta 1794:985-94.

53. Borovikov Y.S., Karpicheva O.E., Chudakova G.A., Robinson P., Redwood C.S. (20096) Dilated cardiomyopathy mutations in alpha-tropomyosin inhibit its movement during the ATPase cycle. Biochem. Biophys. Res. Commun. 381:403-6.

54. Bremel R.D., Weber A. (1972) Cooperation within actin filament in vertebrate skeletal muscle. Nature 238:97-101.

55. Bretscher (1984) Smooth muscle caldesmon. Rapid purification of F-actin cross-linking properties. J. Biol. Chem. 259:12873-80.

56. Brown J.H., Zhou Z., Reshetnikova L., Robinson H., Yammani R.D., Tobacman L.S., Cohen C. (2005) Structure of the mid-region of tropomyosin: bending and binding sites for actin. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102:18878-83.

57. Burghardt T.P., Garamszegi S.P., Ajtai K. (1997) Probes bound to myosin Cys-707 rotate during length transients in contraction. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:9631-6.

58. Burton DJ., Marston S.B. (1999) Control of shortening speed in single guinea-pig taenia coli smooth muscle cells by Ca2+, phosphorylation and caldesmon. Pflugers Arch. 437:267-75.

59. Chalovich J.M., Chock P.B., Eisenberg E. (1981) Mechanism of action of troponin and tropomyosin.! Biol. Chem. 256:575-8.

60. Chalovich J.M., Greene L.E., Eisenberg E. (1983) Crosslinked myosin subfrag-ment-1: a stable analogue of the subfragment ATP complex. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4909-13.

61. Chalovich J.M., Cornelius P., Benson C.E. (1987) Caldesmon inhibits skeletal acto-myosin subfragment-1 ATPase activity and the binding of myosin subfragment-1 to acting. Biol. Chem. 262:5711-6.

62. Chalovich J.M., Hemric M.E., Velaz L. (1990) Regulation of ATP hydrolysis by caldesmon. A novel change in the interaction of myosin with actin. Ann. NY Acad. Sci. 599:85-99.

63. Chandy I.K., Lo J.C., Ludescher R.D. (1999) Differential mobility of skeletal and cardiac tropomyosin on the surface of F-actin. Biochemistry 38:9286-94.

64. Chaussepied P., Morales M.F., Kassab R. (1988) The myosin SH-2 50-kilodalton fragment crosslink: location and consequences. Biochemistry 27:1778-85.

65. Corbett M.A., Akkari P.A., Domazetovska A., Cooper S.T., North K.N., Laing N.G., Gunning P.W., Hardeman E.C. (2005) An alpha-tropomyosin mutation alters dimer preference in nemaline myopathy. Ann Neurol. 57:42-9.

66. Cooke R. (1995) The actomyosin engine. FASEBJ. 9:636-42.

67. Cooke R. (1997) Actomyosin interaction in striated muscle. Physiol. Rev. 77:671-97.

68. Craig R., Lehman W. (2001) Crossbridge and tropomyosin positions observed in native, interacting thick and thin filaments. J. Mol. Biol. 311:1027-36.

69. Crick F.H.C. (1953) The packing of a-helices. Simple coiled-coils. Acta Crystal-logr. 6:689-97.

70. Dabrowska R., Goch A., Galazkiewicz B., Osinska H. (1985) The influence of caldesmon on ATPase activity of the skeletal muscle actomyosin and bundling of actin filaments. Biochim. Biophys. Acta 842:70-5.

71. Donner K., Ollikainen M., Ridanpaa M., Christen H-J., Goebel H. H., de Visser M., Pelin K., Wallgren-Pettersson C. (2002) Mutations in the (3-tropomyosin CTPM2) gene a rare cause of nemaline myopathy. Neuromuscul. Disord. 12:151-8.

72. Dufour C., Weinberger R.P., Gunning P. (1998) Tropomyosin isoform diversity and neuronal morphogenesis. Immunol. Cell Biol. 76:424-9.

73. Dyson H.J., Wright P.E. (2005) Intrinsically unstructured proteins and their functions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6:197-208.

74. Ebashi S. (1963) Third component participating in the superprecipitation of «natural actomyosin». Nature 200:1010.

75. Ebashi S., Kodama A., Ebashi F. (1968) Troponin. I. Preparation and physiological function.,/. Biochem. 64:465-77.

76. Egelman E. H.; Francis N., DeRosier D.J. (1982) F-actin is a helix with a random variable twist. Nature 298:131-5.

77. Egelman E.H.,Orlova A. (2001) Two conformations of G-actin related to two conformations of F-actin. Results Probl Cell Differ. 32:95-101.

78. Engelhardt V.A., Ljubimova M.N. (1939) Myosin and adenosine triphosphatase. Nature 144:668-9.

79. Fiske C.H., Subbarow Y. (1925) Determination of inorganic phosphate. J. Biol. Chem. 66:375-400.

80. Foster D.B., Huang R., Hatch V., Craig R., Graceffa P., Lehman W., Wang C.L. (2004) Modes of caldesmon binding to actin: sites of caldesmon contact and modulation of interactions by phosphorylation. J. Biol. Chem. 279:53387-94.

81. Fraser I.D.C., Marston S.B. (1995) In vitro motility analysis of smooth muscle caldesmon control of actin-tropomyosin filament movementJ. Biol. Chem. 270:19688-93.

82. Frisbie S.M., Xu S., Chalovich J.M., Yu L.C. (1998) Characterizations of cross-bridges in the presence of saturating concentrations of MgAMP-PNP in rabbit permeabilized psoas muscle. Biophys. J. 74:3072-82.

83. Fujita H., Lu X., Suzuki M., Ishiwata S., Kawai M. (2004) The effect of tropomyosin on force and elementary steps of the cross-bridge cycle in reconstituted bovine myocardium J. Physiol. 556:637-49.

84. Gatazkiewicz B., Borovikov Y.S., Dabrowska R. (1987) The effect of caldesmon on actin-myosin interaction in skeletal muscle fibers. Biochim Biophys Acta. 916:368-75.

85. Galihska-Rakoczy A., Engel P., Xu C., Jung H„ Craig R., Tobacman L. S., Lehman W. (2008) Structural basis for the regulation of muscle contraction by troponin and tropomyosin J. Mol. Biol. 79:929-35.

86. Geeves M.A. (1991) The dynamics of actin and myosin association and the crossbridge model of muscle contraction. Biochem.J. 274:1-14.

87. Geeves M.A., Holmes K.C. (2005) The molecular mechanism of muscle contraction. Adv. Protein Chem. 71:161 -93.

88. Goody R.S., Hofmann W. (1980) Stereochemical aspects of the interaction of myosin and actomyosin with nucleotides. J. Muscle Res. Cell Motil. 1:101-15.

89. Gordon A.M., Homsher E., Regnier M. (2000) Regulation of contraction in striated muscle. Physiol. Rev. 80:853-924.

90. Graceffa P. (1997) Arrangement of the COOH-terminal and NH2-terminal domains of caldesmon bound to actin. Biochemistry 36:3792-801.

91. Graceffa P. (1999) Movement of smooth muscle tropomyosin by myosin heads. Biochemistry 38:11984-92.

92. Greenfield N.J., Hitchcock-DeGregori S.E. (1995). The stability of tropomyosin, a two stranded coiled-coil protein, is primarily a function of the hydrophobicity of residues at the helix-helix interface. Biochemistry 34:16797-805.

93. Gunning P.W., Schevzov G., Kee A.J., Hardeman E.C. (2005) Tropomyosin iso-forms: divining rods for actin cytoskeleton function. Trends Cell. Biol. 15:333-41.

94. Hammell R.L., Hitchcock-DeGregori S.E. (1997) The sequence of the alternatively spliced sixth exon of alpha-tropomyosin is critical for cooperative actin binding but not for interaction with troponin. J. Biol. Chem. 272:22409-16.

95. Harricane M.C., Fabbrizio E., Arpin C., Mornet D. (1992) Involvement of caldesmon at the actin-myosin interface. Biochem.J. 287:633-7.

96. Haselgrove J. (1972) X-ray evidence for a conformational change in the actin containing filaments of vertebrate striated muscle. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 37:341-52.

97. Hayashi K., Yamada S., Kanda K., Kimizuka F., Kato I., Sobue K. (1989) 35 kDa fragment of caldesmon conserves two consensus sequences of the tropomyosin-binding domain in troponin T. Biochem. Biophys. Res. Commun. 161:38-45.

98. Hemric M.E., Chalovich J.M. (1990) Characterization of caldesmon binding to myosin. J. Biol. Chem. 265:19672-78.

99. Hitchcock-DeGregori S.E., Song Y„ Greenfield NJ. (2002) Functions of tropomyosin's periodic repeats. Biochemistry 41:15036-44.

100. Holmes K.C., Popp D., Gebhard W., Kabsch W. (1990) Atomic model of the ac-tin filament. Nature 347:44-9.

101. Holmes K.C. (1995) The actomyosin interaction and its control by tropomyosin. Biophys. J. Suppl. 68:2-7.

102. Holmes K.C. (1996) Muscle proteins: their actions and interactions. Curr. Opin. Struct. Biol. 6:781-9.

103. Holmes K.C. (1997) The swinging lever-arm hypothesis of muscle contraction. Curr. Biol. 7:R112-8.

104. Holmes K.C., Geeves M.A. (2000) The structural basis of muscle contraction. Philos. Trans. R. Soc. Lorid. B. Biol. 5c/. 355:419-31.

105. Holmes K.C., Schroder R.R., Sweeney H.L., Houdusse A. (2004) The structure of the rigor complex and its implications for the power stroke. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 359:1819-28.

106. Holthauzen L.M.F., Correa F., Farah C.S. (2004) Ca2+-induced rolling of tropomyosin in muscle thin filaments. J. Biol. Chem. 279:15204-13.

107. Houdusse A., Sweeney H.L. (2001) Myosin motors: missing structures and hidden springs. Curr. Opin. Str. Biol. 11:182-94.

108. Huber P.A., Fraser I.D., Marston S.B. (1995) Location of smooth-muscle myosin and tropomyosin binding sites in the C-terminal 288 residues of human caldesmon. Biochem. J. 312:617-25.

109. Huber P.A., El-Mezgueldi M., Grabarek Z., Slatter D.A., Levine B.A., Marston S.B. (1996) Multiple-sited interaction of caldesmon with Ca2+-calmodulin. Biochem. J. 316:413-20.

110. Huxley A.F., Niedergerke R. (1954) Structural«changes in muscle concentration; interference microscopy of living muscle fibers. Nature 173:971-3.

111. Huxley H., Hanson J. (1954) Changes in the cross-strlations of muscle during contraction and stretch and their structural interpretation. Nature 173:973-6.

112. Jenkins F.A., White H.E. (1957) In fundamentals of optics. McGraw-Hill New York 524-31.

113. Johnson W.C.J. (1988) Secondary structure of proteins through circular dich-roism spectroscopy. Annu. Rev. Biophys. Chem. 17:145-66.

114. Kabsch W., Mannherz H.G., Suck D., Pai E.F., Holmes K.C. (1990) Atomic structure of the actin: DNAse 1 complex. Nature 347:37-44.

115. Kakol I., Borovikov Y.S., Szczesna D„ Kirillina V.P., Levitsky D.I. (1987) Conformational changes of F-actin in myosin-free ghost single fibre induced by either phospho-rylated or dephosphorylated heavy meromyosin. Biochim. Biophys. Acta 913:1-9.

116. Katayama E., Ikebe M. (1995) Mode of caldesmon binding to smooth muscle thin filament: possible projection of the amino-terminal of caldesmon from native thin filament. Biophys. J. 68:2419-28.

117. Kishino A., Yanagida T. (1988) Force measurements by micromanipulation of a single actin filament by glass needles. Nature 334:74-6.

118. Kohn W.D., Kay C.M., Hodges R.S. (1997) Salt effects on protein stability: two-stranded alpha-helical coiled-coils containing inter- or intrahelical ion pairs. J. Mol. Biol. 267:1039-52.

119. Kulikova N., Dabrowska R. (1996) The influence of caldesmon on papain proteolysis of monomeric smooth muscle myosin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 225:195-202.

120. Kulikova N., Pronina O.E., Dabrowska R., Borovikov Y.S. (2006) Caldesmon restricts the movement of both C- and N-termini of tropomyosin of F-actin in ghost fibers during the actomyosin ATPase cycle. Biochem. Biophys. Res. Commun. 345:280-6.

121. Marston S.B. (1982) The rates of formation and dissociation of actin-myosin complexes. Biochem.J. 230:453-60.

122. Marston S.B., Smith C.W.J. (1985) The thin filaments of smooth muscles. J. Muscle Res. Cell Motil. 6:669-708.

123. Marston S.B., Redwood C.S. (1991) The molecular anatomy of caldesmon. Biochem.J. 279:1-16.

124. Marston S.B., Redwood C.S. (1992) Inhibition of actin-tropomyosin activation of myosin MgATPase activity by the smooth muscle regulatory protein caldesmon. J. Biol. Chem. 267:16796-800.

125. Marston S.B., Redwood C.S. (1993) The essential role of tropomyosin in cooperative regulation of smooth muscle thin filament activity by caldesmon. J. Biol. Chem. 268:12317-20.

126. Marston S.B., Fraser I.D.C., Huber P.AJ. (1994) Smooth muscle caldesmon controls the strong binding interactions between actin, tropomyosin and myosin. J. Biol. Chem. 269:32104-9.

127. Maytum R., Lehrer S.S., Geeves M.A. (1999) Cooperativity and switching within the three-state model of muscle regulation. Biochemistry 38:1102-10.

128. Maytum R., Geeves M., Konrad M. (2000) Actomyosin regulatory properties of yeast tropomyosin are dependent upon N-terminal modification. Biochemistry 39:11913-20.

129. McKillop D.F., Geeves M.A. (1993) Regulation of the interaction between actin and myosin SI: evidence for three states of the thin filament. Biophys.J. 65:693-701.

130. McLachlan A.D., Stewart M. (1975). Tropomyosin coiled-coil interactions: evidence for an unstaggered structure. J. Mol. Biol. 98:293-304.

131. Miki M., dos Remedios C.G., Barden J.A. (1987) Spatial relationship between the nucleotide-binding site, Lys-61, Cys-374 in actin, a conformational change induced by myosin subfragment-1 binding. Eur. J. Biochem. 168:339-45.

132. Miki M., Hai H., Saeki K., Shitaka Y., Sano K., Maeda Y., Wakabayashi T. (2004) Fluorescence resonance energy transfer between points on actin and the C-terminal region of tropomyosin in skeletal muscle thin filaments.,/. Biochem. 136:39-47.

133. Michele D.E., Albayya F.P., Metzger J.M. (1999) A nemaline myopathy mutation in alpha-tropomyosin causes defective regulation of striated muscle force production. J. Clin. Invest. 104:1575-81.

134. Mirza M., Marston S., Willott R., Ashley C, Mogensen J., McKenna W., Robinson P., Redwood C, Watkins H. (2005) Dilated cardiomyopathy mutations in thin filament regulatory proteins result in a common functional phenotype. J. Biol. Chem. 280:28498-506.

135. Monteiro P.B., Lataro C., Ferro, J.A, Reinach F.C. (1994) Functional a-tropomyosin produced in Escherichia coli. J. Biol.Chem. 269:10461-10466.

136. Moody C.J., Lehman W., Craig R. (1990) Caldesmon and the structure of smooth muscle thin filaments: electron microscopy of isolated thin filaments. J. Muscle Res. Cell Motil. 11:176-185.

137. Moraczewska J., Greenfield N.J., Liu Y., Hitchcock-DeGregori S.E. (2000) Alteration of tropomyosin function and folding by a nemaline myopathy-causing mutation. Biophys. J. 79:3217-25.

138. Moraczewska J., Gruszczynska-Biegala J., Redowicz M., Khaitlina S.Y., Strzelecka-Golaszewska H. (2004) The DNase-l binding loop of actin may play a role in the regulation ofactin-myosin interaction by tropomyosin/troponin. Biol. Chem. 279:31197-204.

139. Morales M.F., Botts J. (1979) On the molecular basis for chemomechanicaJ energy transduction in muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3857-9.

140. Morales M.F. (1984) Calculation of the polarized fluorescence from a labeled fiber. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:8145-56.

141. Mueller H., Perry S.V. (1962) The degradation of heavy meromyosin by trypsin. Biochem. J. 85:431-9.

142. Narita A., Yasunaga T., Ishikawa T., Mayanagi K., Wakabayashi T. (2001) Ca2+-induced switching of troponin and tropomyosin on actin filaments as revealed by electron cryomicroscopy.7. Mol. Biol. 308:241-61.

143. Nesmelov Y.E., Agafonov R.V., Burr A.R., Weber R.T., Thomas D.D. (2008) Structure and dynamics of the force-generating domain of myosin probed by mul-tifrequency electron paramagnetic resonance. Biophys. J. 95:247-56.

144. Nevzorov I., Redwood C., Levitsky D. (2008) Stability of two beta-tropomyosin isoforms: effects of mutation Arg91 Gly. J. Muscle Res. Cell Motil. 29:173-6.

145. Nichei T., Mendelson R., Botts J. (1974) Use of fluorescence polarization to observe changes in attitude of S-1 motietes in muscle fibres. Biophys. J. 14:236-42.

146. Nitao L.K., Todd O. Yeates, Reisler E. (2002) Conformational dynamics of the SH1-SH2 helix in the transition states of myosin subfragment-1. Biophys. J. 83:2733-41.

147. Nowak E., Borovikov Y.S., Dabrowska R. (1989) Caldesmon weakens the bonding, between myosin heads and actin in ghost fibers. Biochim. Biophys. Acta 999:289-92.

148. Nowak E., Borovikov Y.S., Khoroshev M.I., Dabrowska R. (1991) Troponin I and caldesmon restrict alterations in actin structure occurring on binding of myosin subfragment 1. FEBS Lett. 281:51 -4.

149. Oda T„ Namba K., Maeda Y. (2005) Position and orientation of phalloidin in F-actin determined by X-ray fiber diffraction analysis. Biophys. J. 88:2727-36.

150. Okamoto Y., Sekine T. (1985) A streamlined method of subfragment one preparation from myosin. J. Biol. Chem. 98:1143-5.

151. Olson T.M., Kishimoto N.Y., Whitby F.G., Michels V.V. (2001) Mutations that alter the surface charge of alpha-tropomyosin are associated with dilated cardiomyopathy. J. Mol. Cell Cardiol. 33:723-32.

152. Onishi H., Morales M.F. (2007) A closer look at energy transduction in muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:12714-9.

153. Oosawa F. (1983) Macromolecular assembly of actin. Muscle and non-muscle motility. New York: Academic Press 151-216.

154. Orlova A., Egelman E.H. (1997) Cooperative rigor binding of myosin to actin is a function of F-actin structure. J. Mol. Biol. 265:469-74.

155. Page R., Lindberg U.7 Schutt C.E. (1998) Domain Motions in Actin. J. Mol. Biol. 280:463-74.

156. Payne M.R., Rudnick S.E. (1984) Tropomyosin as a modulator of microfilaments. Trends Biochem. Sci. 361 -3.

157. Perry S.V. (2001) Vertebrate tropomyosin: distribution, properties and function. J. Muscle Res. Cell Motil. 22:5-49.

158. Pirani A., Vinogradova M.V., Curmi P.M., King W.A., Fletterick R.J., Craig R., To-bacman L.S., Xu C., Hatch V., Lehman W. (2006) An atomic model of the thin filament in the relaxed and Ca2+-activated states. J. Mol. Biol. 357:707-17.

159. Pittenger M.F., Kistler A., Helfman D.M. (1995) Alternatively spliced exons of the beta tropomyosin gene exhibit different affinities for F-actin, effects with nonmuscle caldesmon.7. Cell Sci. 108:3253-65.

160. Popp D., Maeda Y„ Stewart A.A., Holmes K.C. (1991) X-ray diffraction studies on muscle regulation. Adv. Biophys. 27:89-103.

161. Potter J.D., Gergely J. (1974) Troponin; tropomyosin, and actin interactions in the Ca2+ regulation of muscle contraction. Biochemistry 13:2697-703.

162. Prochniewicz-Nakayama E., Yanagida T., Oosawa F. (1983) Studies on conformation of F-actin in muscle fibers in the relaxed state, rigor, and during contraction using fluorescent phalloidin. J. Cell Biol. 97:1663-7.

163. Prochniewicz E., Walseth T.F., Thomas D.D. (2004) Structural dynamics of ac-tin during active interaction with myosin: different effects of weakly and strongly bound myosin heads. Biochemistry 43:10642-52.

164. Pronina O.E., Robinson P., Borovikov Y.S., Redwood C.S. (20076) Alteration of (B-tropomyosin function by nemaline myopathy-causing mutations El 17K and Q147P. In Abstracts of 51th Annual Meeting of Biophysical Society, Baltimore, USA, Biophys.J. B342.

165. Rayment I., Rypiewski W., Schmidt-Base K., Smith R., Tomchick D., Benning M.f Winkelmann D., Wessenberg G., Holden H. (1993a) Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. Science 261:50-8.

166. Rayment I., Holden H.M., Whittaker M., Yohn C.B., Holmes K.C., Milligan R.A. (19936) Structure of the actin-myosin complex and its implications for muscle contraction. Science 261:58-65.

167. Redwood C.S., Marston S.B. (1993) Binding and regulatory properties of expressed functional domains of chicken gizzard smooth muscle caldesmon. 268:10969-76.

168. Robinson P., Griffiths P.J., Watkins H., Redwood C.S. (2007) Dilated and hypertrophic cardiomyopathy mutations in troponin and alpha-tropomyosin have opposing effects on the calcium affinity of cardiac thin filaments. C/'rc. Res. 101:1266-73.

169. Roopnarine O., Thomas D.D. (1996) Orientation of intermediate nucleotide states of indane dione spin-labeled myosin heads in muscle fibers. Biophys.J. 70:2795-806.

170. Roopnarine O., Szent-Gyôrgyi A.G., Thomas D.D. (1998) Microsecond rotational dynamics of spin-labeled myosin regulatory light chain induced by relaxation and contraction of scallop muscle. Biochemistry 37:14428-36.

171. Root D.D., Reisler E. (1992) Cooperativity of thiol-modified myosin filaments: ATPase and motility assays of myosin function. Biophys. J. 63:730-40.

172. Sakamoto T., Amitani I., Yokota E., Ando T. (2000) Direct observation of processive movement by individual myosin V. Biochem. Biophys. Res. Commun.272:586-90.

173. Sen A., Chalovich J.M. (1998) Caldesmon-actin-tropomyosin contains two types of binding sites for myosin SI. Biochemistry 37:7526-31.

174. Singh A., Hitchcock-DeGregori S.E. (2006) Dual requirement for flexibility, specificity for binding of the coiled-coil tropomyosin to its target, actin. Structure 14:43-50.

175. Shy G.M., Engel W.K., Somers J.E., Wanko T. (1963) Nemaline myopathy. A new congenital myopathy. Brain 86:793-810.

176. Smith C.W., Pritchard K., Marston S.B. (1987) The mechanism of Ca2+ regulation of vascular smooth muscle thin filaments by caldesmon and calmodulin. J. Biol. Chem. 262:116-22.

177. Sobue K., Muramoto Y., Fujita M., Kakiuchi S. (1981) Purification of a calmo-dulin-binding protein from chicken gizzard that interacts with F-actin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5652-5.

178. Sobue K., Morimoto K., Kanda K., Maruyama K., Kakiuchi S. (1982) Reconstitution of Ca2+-sensitive gelation of actin filaments with filamin, caldesmon and calmodulin. FEBSLett. 138:289-92.

179. Spudich J.A., Watt S. (1971) Regulation of rabbit skeletal muscle contraction. 1, Biochemical studies of interaction of tropomyosin-troponin complex with actin and proteolytic fragments of myosin J. Biol. Chem. 246:4866-71.

180. Stewart M., McLachlan A.D. (1975) Fourteen actin-binding sites on tropomyosin? Nature 257:331-3.

181. Sutoh K. (1983) Mapping of actin-binding sites on the heavy chain of myosin subfragment 1. Biochemistry 22:1579-1585.

182. Sutoh K., Ando M., Sutoh K., Toyoshima Y.Y. (1991) Site-directed mutations of Dictyostelium actin: disruption of a negative charge cluster at the N terminus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7711 -4.

183. Szent-Gyorgyi A.G. (1949) Free-energy relations, contraction of actomyosin. Biol. Bull. 96:140-61.

184. Szczesna D., Borovikov Y.S., Kakol I., Sobieszek A. (1989) Interaction of tropomyosin with F-actin-heavy meromyosin complex. Biol. Chem. HoppeSeyler. 370:399-407.

185. Szczesna D., Graceffa P., Wang C. L., Lehrer S.S. (1994) Myosin S1 changes the orientation of caldesmon on actin. Biochemistry 33:6716-20.

186. Szpacenko A., Dabrowska R. (1986) Functional domains of caldesmon. FEBS Left. 202:182-6.

187. Squire J.M., Morris E.P. (1998) FA5EBJ. 12:761-771.

188. Tanaka H., Iwane A.H., Yanagida T. (2000) Biophys.J. 78:234a.

189. TaoT., Lamkin M., Lehrer S.S. (1983) Excitation energy transfer studies of the proximity between tropomyosin and actin in reconstituted skeletal muscle thin filaments. Biochemistry 22:3059-66.

190. Thierfelder L., Watkins H., MacRae C. (1994) Alpha-tropomyosin and cardiac troponin T mutations cause familial hypertrophic cardiomyopathy: a disease of the sarcomere. Cell 77:701-12.

191. Thomas D.D., Seidel J.C., Gergely J. (1979) Rotational dynamics of spinlabeled F-actin in the sub-millisecondtime range. J. Mol. Biol. 132:257-73.

192. Thomas D.D., Cooke R. (1980) Orientation of spin-labeled myosin heads in glycerinated muscle fibers. Biophys. J. 32:891-905.

193. Thomas D.D. (1994) Angular disorder of weak-binding actomyosin cross-bridges. BiophysJ. 66:1272-3.

194. Thomas D.D., Ramachandran S., Roopnarine O., Hayden D.W., Ostap 1VUE=. (1995) The mechanism of force generation in myosin: A disorder-to-order transition, coupled to internal structural changes. Biophys. J. 68:135s-41 s.

195. Tobacman L.S., Butters C.A. (2000) A new model of cooperative myosin-tbiin filament binding. J. Biol. Chem. 275:27587-93.

196. Tokunaga M., Sutoh K., Wakabayashi T. (1991) Structure and structural change of the myosin head.^c/vwices in Biophysics 27:157-67.

197. Tong S.W., Elzinga M. (1990) Amino acid sequence of rabbit skeletal muscle myosin. 50-kDa fragment of the heavy chain. J. Biol. Chem. 265:4893-901.

198. Toyoshima Y.Y., Kron S.J., McNally E.M., Niebling K.R., Toyoshima G, Spudich J.A. (1987) Myosin SI is sufficient to move actin filaments in vitro. Nature 328:536-9.

199. Tregear R.T., Mendelson R.A. (1975) Polarization from a helix of fluorophores and its relation to that obtained from muscle. Biophys. J. 15:455-67.

200. Trybus K.M., Krementsova E., Freyzon Y. (1999) Kinetic characterization of a monomeric unconventional myosin V construct. J. Biol. Chem. 274:27448-56.

201. Uyeda T.Q., Ruppel K.M., Spudich J.A. (1994) Enzymatic activities correlate with chimaeric substitutions at the actin-binding face of myosin. Nature 368:567-9.

202. Velaz L., Ingraham R.H., Chalovich J.M. (1990) Dissociation of the effect of caldesmon on the ATPase activity and on the binding of smooth heavy meromyo-sin to actin by partial digestion of caldesmon. J. Biol. Chem. 265:2929-34.

203. Vibert P., Craig R., Lehman WJ. (1993) Three dimensional reconstruction of caldesmon-containing smooth muscle thin filaments. Cell Biol. 123:313-21.

204. Vibert P., Craig R., Lehman W. (1997) Steric-model for activation of muscle thin filaments. J. Mol. Biol. 266:8-14.

205. Vikhorev P.G., Vikhoreva N.N., Vorotnikov A.V., Krymsky M.A., Borovikov Y.S. (1999) N-terminal myosin-binding site of caldesmon inhibits the conformation changes in F-actin induced by heavy meromyosin. J. Muscle fíes. Cell Motil. 20:852.

206. Vorotnikov A.V., Marston S.B., Huber P.AJ. (1997) Location and functional characterization of myosin contact sites in smooth muscle caldesmon. Biochem.J. 328:211 -8.

207. Xie L., Schoenberg M. (1998) Binding of SH-1/SH-2-modified myosin sub-fragment-1 to actin. Biochemistry 37:8048-53.

208. Wang C.-L.A., Wang L.-W.C., Xu S., Lu R.C., Saavedra-Alanis V., Bryan J. (1991) Localization of the calmodulin- and the actin-binding sites of caldesmon. J. Biol. Chem. 266:9166-72.

209. Weeds A.G., Pope B. (1977) Studies on the chymotryptic digestion of myosin. Effects of divalent cations on proteolytic susceptibility. J. Mol. Biol. 111:129-57.

210. Wells J.A., Yount R.G. (1979) Active site trapping of nucleotides by crosslink-ing two sulfhydryls in myosin subfragment 1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76:4966-70.

211. Wilson M.G.A., Mendelson R.A. (1983) A comparison of order and orientation of cross-bridges in rigor and relaxed muscle fibres using fluorescence polarization. J. Muscle Res. Cell Motil. 4:671 -93.

212. White S.P., Cohen C., Phillips G.N. (1987) Structure of co-crystals of tropomyosin and troponin. Nature 325:826-8.

213. Yanagida T., Oosawa F. (1978) Polarized fluorescence from e-ADP incorporated into F-actin in a myosin-free single fibre: Conformation of F-action and changes induced in it by heavy meromyosin. J. Mol. Biol. 126:507-24.

214. Yanagida T. (1984) Angles of fluorescently labelled myosin heads and actin monomers in contracting and rigor stained muscle fiber. Contractile Mechanisms in Muscle. NY and London Plenum Press.

215. Yanagida T., Kitamura K., Tanaka H„ Hikikoshi Iwane A., Esaki S. (2000) Single molecule analysis of the actomyosin motor. Curr. Opin. Cell Biol. 12:20-5.

Информация о работе

Карпичева, Ольга Евгеньевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.25

Диссертация

Молекулярные механизмы регуляции тропомиозином актин-миозинового взаимодействия - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы