Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

сАМР-зависимая индукция 2,5-олиго/А/синтетазы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Турпаев, Кирилл Тигранович

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Интерферон и его действие на клетку

1.1. Открытие интерферона

1.2. Индукция интерферона

1.3. Гетерогенность интерферона

1.4. Основные эффекты действия интерферона на клетку

1.4.1. Взаимодействие интерферона с поверхностью клетки

1.4.2. Интерферон-зависимая индукция белков

1.5. Механизм антивирусного действия интерферона

1.5.1. Инактивация тРНЕ.

1.5.2. Подавление-метилирования мРНК.

1.5.3. Индукция дсРНК-зависимой протеинкиназы.

1.5.4. Активация системы 2,5-олиго/А/.

1.6. Действие интерферона на активность клеточных ферментов

1.7. Действие интерферона на иммунную систему.

1.8. Действие интерферона на рост и дифференцировку клеток

2. Циклические нуклеотиды и интерферон.

2.1. Система сАМР и ее роль в регуляции метаболизма

2.2. Система сШР и Са2+, их роль в регуляции метаболизма

2.3. Участие сАМР в осуществлении клеточного эффекта интерферона.

2.4. Участие сШР в осуществлении клеточного эффекта интерферона

3. Система 2,5-олиго/А/ и ее роль в регуляции метаболизма 34 3.1. 2,5-олиго/А/синтетаза.

3.1.1. Энзимологическая характеристика 2,5-олиго/А/синтетазы.

3.1.2. Индукция 2,5-олиго/А/синтетазы интерфероном

3.1.3. Другие индукторы 2,5-олиго/А/синтетазы

3.2. 2,5-олиго/А/-зависимая нуклеаза.

3.3. 2'-фосфодиэстераза.

3.4. Двуспиральная РНК.

3.5. Участие системы 2,5-олиго/А/ в регуляции клеточного роста.

3.6. Участие системы 2,5-олиго/А/ в регуляции дифференци-ровки клеток.

Введение Диссертация по биологии, на тему "сАМР-зависимая индукция 2,5-олиго/А/синтетазы"

При изучении биохимического механизма действия интерферона в клетках была обнаружена ранее неизвестная система регуляции белкового синтеза. Эта система состоит из фермента, полимеризу-ющего АТР в 2,5-олигоаденилат - 2,5-олиго(А) синтетазы, рибо-нуклеазы, активируемой 2,5-олигоаденилатом, и фосфодиэстеразы, расщепляющей 2,5-олигоаденилат до AMP и АТР,

Действие этих ферментов направлено на обеспечение локального распада мРНК и деградации рРНК в тех областях цитоплазмы, которые содержат двуспиральную РНК, например дсРНК, входящую в реп-ликативный комплекс вирусов или в гетерогенную ядерную РНК.

2,5-олиго(А)синтетаза является индуцибельным ферментом и ее активность значительно возрастает при действии на клетку интерферона. Активность 2,5-олиго(А)синтетазы возрастает при действии на клетку интерферона. Активность 2,5-олиго(А)синтетазы возрастает также в покоящихся клетках, при дифференцировке клеток, а также под действием некоторых стероидных гормонов.

Однако, механизм даже наиболее изученной, интерферон -зависимой индукции 2,5-олиго(А)синтетазы остается непонятным. Неизвестно, какие события происходят в клетке после связывания интерферона со специфическим рецептором, расположенным на плазматической мембране, и какова природа сигнала, вызывающего усиление экспрессии гена 2,5-олиго(А)синтетазы. Неизвестно, какие факторы определяют уровень активности 2,5-олиго(А)синтетазы при изменении скорости клеточного роста и при дифференцировке клеток.

В представленной работе делается попытка подойти к решению этих вопросов. Для этого мы воспроизводили один из эффектов, происходящих в клетке под действием интерферона, а также и при погружении клеток в состояние покоя - подъем внутриклеточной концентрации сАМР.

По нашим данным, независимо от подхода, который применялся для подъема уровня сАМР (либо через активацию аденилатциклазы, либо через подавление фосфодиэстеразы сАМР), рост внутриклеточной концентрации сАМР индуцировал в клетках N1НЗТЗ образование 2,5-олиго(А)синтетазы. Т.о. индукция этого фермента при действии на клетки интерферона может осуществляться через сАМР. Согласно нашим данным, любое воздействие на клетки, которое вызывает рост уровня сАМР и (или) рост сАМР -зависимого фосфорилирова-ния, например лишение клеток сыворотки, - с необходимостью приводит к индукции 2,5-олиго(А)синтетазы.

Приведенные в представленной работе экспериментальные данные позволяют предположить, что по крайней мере один из механизмов, обеспечивающих цитостатическое действие сАМР и поддержание клеток в состоянии покоя, связан с индукцией 2,5-олиго(А)синте-тазы. Эти данные указывают на тесное взаимодействие двух систем низкомолекулярных регуляторов клеточного метаболизма - системы сАМР и системы 2,5-олиго(А).

0 Б-3 0 Р ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Турпаев, Кирилл Тигранович

-.94 -ВЫВОДЫ

В представленной работе были получены следующие результаты:

1. Показано, что подъем внутриклеточного уровня сАМР, полученный в результате обработки клеток ШН ЗТЗ теофиллином или адреналином, вызывает рост активности 2,5-олиго/А/синтетазы в 2-3 раза.

2. Показано, что для осуществления сАМР-зависимого роста клеточной активности 2,5-олиго/А/синтетазы необходим синтез РНК. При действии на клетки одновременно с теофиллином или адреналином ак-тиномицина Д, происходит подавление роста активности 2,5-олиго-/А/синтетазы.

3. Показано, что при последовательной обработке клеток теофиллином и актиномицином Д, происходит усиление сАМР-зависимой индукции 2,5-олиго/А/синтетазы (эффект супериндукции). Согласно этим данным для остановки вызванного сАМР роста активности 2,5-олиго/А/синтетазы необходим синтез РНК.

4. Показано, что подъем внутриклеточного уровня сбМР, полученный при действии на клетки стрептозотоцина, не оказывает заметного воздействия на клеточную активность 2,5-олиго/А/синтетазы, что свидетельствует о специфичности обнаруженного индуцирующего эффекта сАМР.

5. Показано, что при углублении клеток ЗТЗ в состояние покоя, в них происходит непрерывный рост активности сАМР-зависимой проте-инкиназы и 2,5-олиго/А/синтетазы. В течение 9 суток активность сАМР-зависимой протеинкиназы возрастала в 5-7 раз, активность 2,5-олиго/А/синтетазы возрастала в 8 раз. Этот результат согласуется с полученными нами данными о сАМР-зависимой индукции 2,5-олиго/А/синтетазы .

Автор считает приятным долгом выразить благодарность доктору биологич. наук К.А.Кафиани, доктору химич. наук Е.С.Северину и кандидату биологич. наук А.В.Иткесу за постоянную поддержку, внимание и руководство в работе.

Не могу не выразить искреннюю признательность за критические замечания при работе над рукописью и помощь в ходе экспериментальной работы, оказанную мне сотрудниками Группы молекулярных основ эмбриогенеза и Лаборатории энзиматиче ской регуляции клеточной активности, прежде всего: кандидату биологич. наук А.В.Иткесу, О.Н.Карташевой, кандидату химич. наук М.Н.Кочетковой, Ю.И.Русаковой и кандидату химич. наук В.Л.Туницкой.

4. Заключение

Приведенные выше данные показывают, что наиболее характерным для интерферона можно считать его антивирусное и антипролифера-тивное воздействие на клетку. На молекулярном уровне эти эффекты в основном обеспечиваются интерферон-зависимой индукцией 2,5-олиго/А/синтетазы (что приводит к росту внутриклеточной концентрации 2,5-олиго/А/) и подъемом концентрации сАМР. При обработке многих клеточных линий этими нуклеотидами, или их производными, можно воспроизвести, в той или иной степени, антивирусный и антипроли-феративный эффекты интерферона.

Представляет интерес изучение прямого взаимодействия между двумя регуляторными системами клетки: системой 2,5-олиго/А/ и системой сАМР. Как элемент этого взаимодействия, в представленной работе будет показана и охарактеризована сАМР-зависимая индукция 2,5-олиго/А/синтетазы.

Взаимодействие между системами 2,5-олиго/А/ и сАМР можно сравнить с сопряжением сАМР, сбМР и Са^+-зависимых регуляторных систем. Это взаимодействие, как часть разветвленного механизма регуляции метаболизма, по-видимому, имеет существенное значение в контроле скорости клеточного роста и процесса дифференцировки, в регуляции ответа клетки на гормональное воздействие.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

I. Клеточная культура

Клетки UIH ЗТЗ культивировали в средах 199 и Игла (1:1) с добавлением 10% среды PPMI 1640 ( Flow laboratories ) и 10% сыворотки теленка. ( Serva ). В культуральную среду за 24-36 часов до образования клетками монослоя добавляли адреналин ( Sigma) до I мкМ или теофиллин ( Merck ) до I мМ и инкубировали 1-24 часа. Для обработки клеток использовали также актиномицин Д (Reanal) в концентрации I мкг/мл. Актиномицин добавляли в культурную среду, если не будет указано иначе, одновременно с теофиллином или адреналином.

Для перевода клеток в состояние покоя, клетки по образовании ими монослоя, переводили на среду, содержащую 0,5% сыворотки и инкубировали в этих условиях в течение 1-9 дней.

2. Определение активности 2,5-олиго/А/синтетазы

Клетки снимали со стекла раствором Версена, осаждали центрифугированием 2000 G х 5 мин и суспендировали в лизирующем растворе (200 мкл), содержащем 30 мМ KCI, 5 мМ MgCl2 , 20 мМ Трис-НС1 рН 7,6 , 0,1% тритона Х-Ю0и 10% глицерина, - при 4°С. Через 20 мин суспензию центрифугировали 8000 gx 6 мин и супернатант пропускали через колонку ДЭАЭ-целлюлезы (0,4 х 0,6 см) уравновешенную раствором, содержащим 20 мМ Трис-HCI рН 7,6, 5 мМ MgCl2 и I мМ ДТТ. Полученный лизат, свободный от 2'-фосфодиэстеразной активности (1,0 - 1,5 мг/мл белка), вносили в инкубационную смесь, содержащую 120 мМ ацетата калия, 20 мМ ацетата магния, 20 мМ Трис-HCI рН 7,6 , 15 мкг/мл поли/И/'поли/Ц/ ( Reanal ) I мМ ATP, о

60 мкС;/мл Н° ATP, I мМ ДТТ, 5 мМ креатинфосфата, 0,1 мг/мл креа-тинкиназы и~0,6 - 1,0 мг/мл белка клеточного лизата, объем смеси

- 100 мкл. После 16 часов инкубации при 30°С в реакционную смесь вносили щелочную фосфатазу Е. coli до 0,01 ед/мл и Трис до 20 мМ, после чего проводили вторую инкубацию в течение 14 часов при 37°С. После проведения инкубации из смеси брали аликвоту, 20 мкл, наносили ее на пластинку Силуфола УФ-254 и проводили хроматогра-фическое. разделение в системе изопропанол-аммиак-вода (7:1:2 , по объему), - один раз;в системе бутакол-вода/85:15 по объему),

- три раза. В первой системе происходило разделение дефосфорили-рованных олигоаденилатов от аденозина и остатка AMP (при возможном гидролизе 5*-концевых фосфатов щелочной фосфатазой). Во второй системе достигалось полное удаление следов аденозина из зоны, содержащей олигоаденилат. В качестве стандарта мы использовали тример 2,5-олиго/А/. Количество радиоактивного материала, содержащегося на хроматограмме в зоне соответствующей тримеру 2,5-олиго/А/, определялось в жидкостном сцинтилляционном счетчике.

Мы применяли также несколько иной метод определения 2,5-олиго/А/, образовавшегося в реакционной смеси. Для этого после окончания инкубации с щелочной фосфатазой в среду добавляли 10 объемов (около I мл) дистиллированной воды и весь объем наносили на колонку ДЭАЭ-^еллюлозы (0,4 х 0,4 см), уравновешенную 10 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCI pH 7,6. Колонку промывали I мл того же буфера. Дефо сфорилированный олигоаденилат собирали в 150 мкл буфера, содержащего 200 мМ KCl, 20 гМ Трис-HCI pH 7,6. Аликвоту (20 мкл) наносили на Силуфол УФ-254 и проводили тонкослойную хроматографию в системе изопропанол-аммиак-вода (7:1:2). Положение тримера 2,5-олиго/А/ определяли по стандартному образцу. Картина хромато-графического разделения показана на Рисунке 2. Зона, содержащая тример 2,5-олиго/А/ вырезалась из пластинки Силуфола, элюирова-лась водой (0,5 мл) просчитывалась в сцинтилляционном счетчике.

Сцинтилляционная жидкость, которую мы использовали, имела следующий состав: 60 г нафталина, 4 г ППО, 0,2 г П0П0П, 70 мл этанола, диоксан- до I литра.

Оба приведенных метода хроматографического разделения Н -2,5-олиго/А/ от меченого тритием AMP и аденозина, были достаточно эффективны и их применение давало близкие значения активности 2,5-олиго/А/синтетазы в лизатах исследуемых клеток.

Активность 2,5-олиго/А/синтетазы мы определяли по включению AMP в тример 2,5-олиго/А/ за I час инкубации фермента, содержавшегося в I мг частично очищенного лизата.

3. Определение сАМР и сШР

Содержание в исследуемых клетках циклических нуклеотидов (сАМР и cfflP) мы определяли, используя стандартные препараты Радиохимического центра Amersham .

Клетки снимали со стекла раствором Версена и осаждали центрифугированием 1000 gx 3 мин, супернатант декантировали и отбрасывали. Экстракцию циклических нуклеотидов проводили 10 объемами этанола, - в течение 10-12 час. при комнатной температуре, после чего проводили повторное центрифугирование в том же режиме. Осадок промывали этанолом и после центрифугирования объединенный супернатант сушили под вакуумом.

Осадок, образовавшийся после испарения этанола, растворяли в 0,1 мл Трис-ЭДТА буфера рН 7,5, содержащего 50 мМ Трис и 3 ММ ЭДТА. Компоненты, которые не растворились в буфере, удаляли центрифугированием, и полученный раствор непосредственно использовали для определения циклических нуклеотидов.

Определение сАМР. Метод основан на конкуренции за связывание с белковой фракцией, имеющей высокое сродство к сАМР, между немеченым сАМР и фиксированным количеством внесенного в пробу Н3 сАМР. При этом количество радиоактивного материат 3 ла, содержащегося в комплексе (Н , Н ) сАМР обратно пропорционально содержанию Н^сАМР в исследуемом препарате (при построении калибровочной кривой - в стандартной пробе).

Для построения калибровочной кривой мы брали на I пробу 50 мкл Н3сАМР (исходная концентрация 18 нМ или 0,5 мкС /мл), 100 мкл раствора сАМР-связываклцего белка в дистиллированной воде и 50 мкл раствора сАМР в Трис/ЭДТА буфере. Были приготовлены парные стандартные пробы, содержащие соответственно 16, 8, 4, 2 и I пмоль Н^сАМР. Еще две пробы не содержали сАМР. Общий объем проб составлял 200 мкл.

После окончания инкубации, которая проводилась на льду в течение 2 часов, к каждой пробе добавляли 100 мкл свежеприготовленной суспензии активированного угля и после энергичного встряхивания пробы центрифугировали при 1000 д, в течение 3 мин. Из над-осадочной жидкости отбирали аликвоты по 200 мкл и определяли в них радиоактивность в сцинтилляционном счетчике, о

После измерения содержания Н сАМР в пробах мы определяли следующие параметры: С0 - счет проб, не содержавших внешний Н^сАМР, Сх - счет в пробах, содержащих известное количество стандартного Н^сАМР. Мы строили график по значениям С^/С^, содержание сАМР в пробе. Исходя из этого графика, легко определить содержание сАМР в исследуемых образцах согласно эмпирической формуле:

X = ш [Со/Сд. - I] пикомолей сАМР на пробу, где т — 1,3.

Определение содержания сАМР в экспериментальных пробах проводили по приведенной методике, с тем отличием, что вместо стандартного раствора Н^сАМР, в инкубационную смесь вносили 50 мкл раствора экстракта циклических нуклеотидов в Трис/ЭДТА буфере.

Содержание сАМР в изучавшихся клетках мы определяли в отношении к белку клеточного лизата, полученного по той же методике, как и при определении активности 2,5-олиго/А/синтетазы.

Определение сШР. Метод основан на конкуренции за связывание с антисывороткой к сШР между немеченым сбМР и фик3 сированным количеством внесенного в пробу Н сОМР. Количество мео ченого Н°с6МР, который находится в комплексе с антисывороткой, примерно обратно пропорционально содержанию Н^сбМР в исследуемых клетках (или в стандартных пробах, при построении калибровочной кривой).

Для построения калибровочной кривой мы составляли следующую о инкубационную смесь: 50 мкл Н сбМР (исходная концентрация 8 нМ или 0,16 мкСк/мл), 100 мкл стандартного раствора Н^сбМР в Трис/ ЭДТА буфере, 50 мкл раствора антисыворотки в дистиллированной воде. Были приготовлены парные стандартные пробы, содержащие соответственно 8, 4, 2, I и 0,5 пикомолей Н^сШР. Еще две пробы не содержали Н^сШР. Общий объем проб составлял 200 мкл.

Инкубацию проводили на льду в течение 1,5 часов. После окончания инкубации в смесь вносили I мл охлажденного раствора сульфата аммония (исходная концентрация 39 г/100 мл). Через 5 мин. после интенсивного перемешивания, суспензию центрифугировали,су-пернатант декантировали из пробирки и все его остатки тщательно удаляли. Осадок растворяли в 1,1 мл дистиллированной воды и в о

I мл этого раствора определяли содержание Н сШР в диоксановом сцинтилляторе.

Определение сОМР в экспериментальных пробах мы проводили по приведенной методике, с тем отличием, что вместо стандартного раствора Н^сбМР в инкубационную смесь вносили 100 мкл экстракта

- 50 циклических нуклеотидов в Трис/ЭДТА буфере.

Калибровочную кривую мы строили исходя из следующих величин: С0 - счет в пробах, не содержавших внешнего Н^сбМР, Сх -счет в цробах, содержавших известное количество стандартного lícGMP. Строили график О^С^ содержание сбМР в пробе. По этому графику легко было определить содержание cGMP в исследуемых образцах согласно эмпирической формуле: X = m \^Сс/Сх - i] пико-молей cGMP на пробу, где m — о, 8.

Полученные величины содержания сбМР в клетках мы брали в отношении к концентрации белка (мг/мл) в клеточном лизате, полученном по той же методике, как и при определении активности 2,5-олиго/А/синтетазы.

4. Определение активности сАМР-зависимой протеинкиназы

В качестве субстрата для сАМР-зависимой протеинкиназы мы использовали N -концевой фрагмент гистона Hj (остатки 1-72). Этот полипептид имеет высокое сродство к сАМР-зависимой протеин-киназе, что позволяет с достаточной точностью проводить определение активности этого фермента непосредственно в клеточном лизате, в присутствии протеинкиназ других типов. На Я -концевой фрагмент гистона Hj протеинкиназа переносит один остаток фосфори-ла по аминокислотному остатку Ser 37, и уровень фосфорилирова-ния на 75-80$ определяется активностью сАМР-зависимой протеинкиназы. / 6,114 /

Клеточный лизат мы получалипо приведенной выше методике. К 10 мкл лизата добавляли 50 мкл инкубационной смеси, которая содержала 25 мМ Трис-HCI рН 7,2 , 5 мМ MgCl2 f jq мм меркапто-этанола, 50 мкг Н-концевого фрагмента гистона Hj , 50мкМ t --АТР (примерно 100 000 имп./мин), а также, если не будет - 51 указано иначе, 10 мкМ сАМР. Инкубацию проводили в течение I часа при 37°С.

После окончания инкубации раствор полностью переносили на фильтры Whatman ЗММ диаметром 24 мм. Фильтры промывали 10% раствором трихлоруксусной кислоты - один раз в течение 30 мин, и еще три раза в Ь% растворе трихлоруксусной кислоты. Промывку фильтров проводили при 4°С, общий объем растворов соответствовал 15 мл трихлоруксусной кислоты на каждый фильтр. После промывки фильтры переносили сначала в смесь этанол-ацетон (1:1, по объему) и потом в ацетон. Радиоактивность, оставшуюся на фильтрах, определяли в жидкостном сцинтилляционном счетчике. Сцинтилляционная жидкость имела следующий состав: 0,2 г П0П0П, 4 г ППО - на I л толуола. / 90 /

Специфическую активность фермента пересчитывали в наномолях

QO

Р включенного в Н-концевой фрагмент гистона Hj за I мин на I мг/мл белка клеточного лизата, полученного по приведенной выше методике.

5. Определение активности 2'-фосфодиэстеразы

Инкубационная смесь содержала 125 мМ ацетата калия, 10 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, I мМ ДТТ, 20 Ш Трис-HCI pH 7,5, 300 нМ меченого тритием тримера 2,5-олиго/А/ (1500 имп./мин на пробу) и 20-40 мкг белка клеточного лизата на пробу. Общий объем смеси составлял 30 мкл. Инкубацию проводили в течение 2 часов при 37°С.

Реакцию останавливали нагреванием инкубационной смеси до 90°С, - в течение 10 мин. После охлаждения- смеси, к ней добавляли 5 мкл 100 мМ Трис и 5 мкл раствора щелочной фосфатазы E.coli (0,01 ед. активности на пробу) и проводили повторную инкубацию при 37°С в течение 8 часов. Аликвоту (20 мкл) смеси наносили на

Силуфол УФ-254 и проводили хроматографическое разделение по приведенной выше методике в системе изопропанол-аммиак-вода (7:1:2). Активность фермента определяли по уменьшению числа остатков АМР в области тримера 2,5-олиго/А/.

6. Щелочной гидролиз 2,5-олиго/А/

После проведения синтеза 2,5-олиго/А/ и последующей инкубации с щелочной фосфатазой, реакционную смесь наносили на колонку ДЭАЭ-целлюлезы (0,4 . 0,4 см), уравновешенную 10 мМ КС1, 10 мМ Трис-НС1 рН 7,6. Колонку промывали I мл того же буфера. Дефосфо-рилированный продукт собирали в 150 мкл буфера, содержащего 200 мМ КС1, 20 мМ Трис-НС1 рН 7,3. К элюату добавляли ПаОН до концентрации 0,3 М и проводили инкубацию при 37°С в течение 18 часов. Аликвоту (20 мкл) наносили на Силуфол УФ-254 и проводили хроматографическое разделение в системе изопропанол-аммиак-вода (7:1:2), по приведенной выше методике.

7. Определение белка

Содержание белка в лизатах клеток мы определяли по связыванию с красителем кумасси 6-250. Раствор, содержащий краситель, имел следующий состав: 100 мг кумасси 0-250, 50 мл этанола, 100 мл 85$ фосфорной кислоты и дистиллированной воды до 1л. К 2 мл раствора красителя добавляли 20 мкл клеточного лизата и определяли на спектрофотометре поглощение на 595 нм. Калибровочную кривую строили внося 10-100 мкг бычьего сывороточного альбумина ( Кеапа1 ) в 2 мл раствора кумасси 6-250. Коэффициент экстин-кции - 6,25 оптических ед. на I мг белка в пробе (2 мл). / 22 /

8. Дополнение

Стандартный препарат 2,5-олиго/А/, который мы применяли в качестве свидетеля при хроматографическом анализе, был нам предоставлен д.х.н. М.Я.Карпейским. Меченый тритием тример 2,5-оли-го/А/, который мы применяли для определения активности 2'-фосфо-диэстеразы, был нам предоставлен О.Н.Карташевой.

Фрагмент гистона Нр который мы применяли как субстрат для определения, протеинкиназной активности, был нам предоставлен к.х.н. В.Л.Туницкой (Инст. молек. биол. АН СССР).

Титрованный препарат интерферона мыши был нам предоставлен к.м.н. Т.И.Криспиным (Инст.эпидемиологии и микробиологии АМН СССР).

Статистическую обработку материала (определение достоверности результатов и среднего квадратичного отклонения) мы проводили, используя таблицы и формулы, приведенные в книге Г.Н.Зайцева "Методика биометрических расчетов". / 4 /

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ •

I. Характеристика метода определения активности 2,5-олиго/А/синтетазы

Большая часть нашей работы включала определение активности 2,5-олиго/А/синтетазы в частично очищенных лизатах фибробластов мыши. Эту очистку мы проводили, пропуская клеточный лизат через колонку ДЭАЭ-целлюлозы, уравновешенную 20 мМ Трис-КС1 буфером. При этом достигалась очистка активности по белку в 2,5-3 раза и практически полное освобождение препарата от 2'-фосфодиэстераз-ной активности. Если в исходном лизате, до пропускания через колонку, активность 2'-фосфодиэстеразы составляла 200^40 пмолей/мг белка/час (при концентрации субстрата 0,3 мкМ), то после очистки активность этого фермента не была обнаружена, т.е. была ниже чувствительности метода (20 пмолей/мг/час).

Продукт, по образованию которого мы определяли активность 2,5-олиго/А/синтетазы, имел одинаковую хроматографическую подвижность с дефосфорилированным тримером 2,5-олиго/А/ (См.Рисунок 2).

Этот продукт мог быть получен только в присутствии поли/И/-полд/Ц/ в реакционной смеси. После инкубации в 0,3 М ИаОН происходил полный гидролиз продукта. (См.Таблицу 2). На основании литературных данных, а также исходя из того, что в качестве меченого субстрата мы использовали Н^АТР, мы считаем, что примененные методы позволяют с необходимой точностью определять 2,5-олиго/А/-синтетазную активность в лизатах исследуемых клеток. /37,86,119/

Ошибка метода при определении активности 2,5-олиго/А/синте-тазы составляла Ъ%. Источник ошибки - неизбежная погрешность при взятии аликвоты из реакционной смеси и при определении радиоактивного материала, находящегося на хроматограмме в области триме

Рис.2. Разделение аденозина, AMP и продуктов 2г5-олиго/А/син-тетазной реакции методом тонкослойной хроматографии.

На пластинку Силуфол УФ-254 наносили 20 мкл инкубационной смеси (см. Материалы и методы, раздел 2). Проводили хроматогра-фическое разделение в системе изопропанол-аммиак-вода (7:1:2), один раз и в системе бутанол-вода (В£НГ), три раза.

Темные пятна на фотографии - положение стандартных препаратов тримера 2,5-олиго/А/ (I), аденозина (2) и AMP (3). Фотография получена при освещении пластинки Силуфол УФ-254 ультрафиолетом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Турпаев, Кирилл Тигранович, Москва

1. Березин И.В., Варфоломеев С.Д. Биокинетика. М.: Наука,1979, с. 97-101.

2. Григорович Ю.А. Калмодулин Са2+ - зависимый белковый активатор ФДЭ и других ферментативных систем. - Усп.биологич.химии, 1982, т. 22, с. 76-100.

3. Думлер И.Л., Этингоф Р.Н.Белковый ингибитор фосфодиэстеразы.- Доклады АН СССР, 1973, т. 213, с. II97-I200.

4. Зайцев Г.Н. Методика биометрических расчетов. М.: Наука,1973, с. 7-86.

5. Нестерова М.Н., Соломония P.O., Северин Е.С. Циклические нуклеотиды в регуляции процессов клеточного деления. Усп. биологич.химии, 1982, т. 22, с. 63-75.

6. Тунвдкая В.Л., Црковска И., Карташева О.Н., Иткес А.В., Северин Е.С. Система сАМР-зависимого фосфорилирования цри углублении клеток ЗТЗ в состояние покоя. Биохимия, 1984, в печати.

7. V. АЪе11 C.W., Monahan Т.М. The role of adenosine 3,5 cylic monophosphate in the regulation of mammalian cell division. -J.Cell.Biol., 1973, v. 59, p. 549-558.

8. Abreu S.L., Bancroft P.C., Stewart W.E. Interferon priming.

9. Effect of interferon messenger RNA. J.Biol.Chem., 1979, v. 254, p. 4114-4118.

10. Allen L.B., Eagle N.C., Huffman J.H., Shuman D.A., Meyer R.B.,

11. Sidwell R.W. Enhancement of interferon antiviral action in L-cells by cylic nucleotides. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1974, v. 146, p. 580-584.

12. Baglioni C., Maroney P. Mechanism of action of human interferon. Induction of 2,5-oligo(A) polymerase. J.Biol.Chem.,1980, 255, 8390-8393.

13. Baglioni C., Nilsen T.W., Maroney, P.A. Synthesis of (2-5)oligoadenilate and activation of an endoribonuclease in in-terferon-treated HeLa cells infected with reovirus. J.Virol., 1982, v. 42, p. 1039-1045.

14. Baglioni C., Nilsen T.W., Maroney P.A., Robertson H.D. Heterogeneous nuclear RNA promotes synthesis of (2,5) oligo-adenylate and is cleaved by the (2,5) oligoadenylate-activa-ted endoribonuclease. Mol.Cell.Biol., 1982, v. 2, p. 154160.

15. Ball A.L. Induction of 2,5-olygoadenylate synthese activityand new protein by chick interferon. Virology, 1979, v. 94, p. 282-286.

16. Besancon P., Bourgeade M.P., Justensen J., Perbus D., Thang

17. M.N. Two inducers of cell differentation enhance the 2,5-oligoadenilate synthèse activity in MSV-transformed cells. -Biochem.Biophys. Res. Comm., 1981, v. 103, p. 16-24.

18. Biron K.K., Raska K. Effect of dibutyril-cAMP on adenovirusreflication in different cell lines. Virology, 1973, v. 56, p. 383-385.

19. Blalock J.E., Stanton J.D. Common pathways of interferon andhormonal action. Nature, 1980, v. 283, p. 406-408.

20. Bourgeade M.F., Chany C. Inhibition of interferon action bycytochalasin B., colchicine, and vinblastine. Proc.Soc. Exp.Biol.Med., 1976, v. 153, p. 501-504.

21. Bourgeade M.F., Rousset S., Paulin D., Chany C. Reorganization of the cytoskeleton by interferon in MSV-transformed cells. J.Interferon Res., 1981, v. 1, p. 323-332.

22. Bradford M.N. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt.Biochem., 1976, v. 72, p. 248-254.

23. Branca A.A., Baglioni C. Evidence that types I and II interferons have different receptors. Nature, 1981, v. 294, p. 768-770.

24. Branca A.A., Baglioni C. Down-regulation of the interferonreceptor. J.Biol.Chem., 1982, v. 257, p. 13197-13200.

25. Cavalieri R.L., Petska S. Synthesis of interferon in heterologous cell, cell-free extracts and Xenopus laevis oocytes. Tex. Rep. Biol. Med., 1977, v. 35, p. 117-125.

26. Chany C., Fournier F., Rousset S. Potentiation of the antiviral activity of interferon by actinomycin D. Nature New Biol., 1971, v. 230, p. 113-114.

27. Cheung W.J. Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation. Science, 1980, v. 199, p. 19-27.

28. Chrapkiewicz N.B., Beale E.G., Granner D.K. Induction of themessenger RNA coding for phosphoenolpyruvate carboxykinase in H^-li-E cells. Evidence for a nuclear effect of cyclic AMP.- J.Biol.Chem., 1982, v. 257, p. 14428-14432.

29. Cohen P. The role of protein phosphorylation in neural andhormonal control of cellular activity. Nature, 1982, v. 296, p. 613-620.

30. Cohen S., Bigazzi P.E. Symphokines, cytokines and interferon.- Interferon, 1980, v. 2, p. 81-95.

31. Cohen S., Fava R.A., Sawyer S.T. Purification and characterization of epidermal growth factor receptor I protein kinase from normal mouse liver. Proc. Uatn. Acad. Sci. USA, 1982, v. 79, p. 6237-6241.

32. Das H., Das A., Ghosh-Dastidar P., Ralson R., Yaghai В.,

33. Roy R., Gupta H. Protein synthesis in rabbit reticulocytes. Purification and characterisation of a double-stranded RNA -dependent protein synthesis inhibitor from reticulocyte lysates. J.Biol.Chem., 1981, v. 256, p. 6491-6495.

34. Degre M., Rollag H. Effect of murine beta-interferon preparation on phagocytosis and cyclic AMP levels in mouse peritoneal macrophages. J.Interferon Res., 1982, v. 2, p. 151157.

35. DeRubertis P.R., Graven P.A. Activation of the renal corticaland hepatic granylate cyclase guanosine 3,5-monophosphate systems by nitrosoureas. - Biochem.Biophys.Acta, 1977, v. 499, p. 337-351.

36. Doetsch P., Wu J.M., Sawada Y., Suhadolnik R. Synthesis andcharacterisation of (2'-5') ppp3'dA (p3'dA)n, and analogue of (2'-5') ppp A(pA)n. Nature, 1981, v. 291, p. 355-358.

37. Drocourt J.-L., Dieffenbach C.W., Ts'o, P.O.P., Justensen J.,

38. Thang M.N. Structural requirements of (2-5) oligodenylate for protein synthesis inhibition in human fibroblasts. -Nucl.Ac.Res., 1982, v. 10, p. 2163-2174.

39. Dubois M.F., Vignal M., Cunff M.L., Chany C. Interferon inhibits transformation of mouse cells by exogenous cellular or viral genes. Nature, 1983, v. 303, p. 433-435.

40. Epstein L.B. Interferon-gamma: is it really different fromthe other interferons? Interferon, 1981, v. 3, p. 13-44.

41. Ernest M.J., De Lap L., Feigelson P. Induction of hepatictyrosine aminotransferase mRNA by protein synthesis inhibitor. J.Biol.Chem., 1978, v. 253, p. 2895-2897.

42. Etienne-Smekens M., Goldstein J., Ooms H.A., Dumont J.E.

43. Variation of (2-5) oligoadenylate synthetase activity during rat-liver regeneration. Eur.J.Biochem., 1983, v. 130, p. 269-273.

44. Etienne-Smekens M., Vandenbussche P., Content J., Dumont J.E.2.5)oligoadenylate in rat liver: modulation after partial hepatectomy. Proc. Nat.Acad.Sci.USA, 1983, v. 80, p.4609-4613.

45. Parrell P.J., Balkow K., Hunt T., Jackson R.J., Trachse H.

46. Phosphorylation of initiation factor eJF-r and the control of reticulocyte protein synthesis. Cell, 1977, v. 11, p. 187-200.

47. Fellous A., Ginzburg I., Littaver U. Modulation of tubulinmRNA levels by interferon in human lymphoblastoid cells. -EMBO Journal, 1982, v. 1, p. 835-839.

48. Perbus D., Justensen J., Besancon P., Thang M.N. The (2-5)oligoadenylate synthese has a multifunctional 2', 5'-nucleotidyl-transferase activity. Bichem.Biophys.Res.Comm.,1981, v. 100, p. 847-856.

49. Floyd-Smith G., Slattery E., Sengyel P. Interferon action:

50. UNA cleavage pattern of a (2-5)oligoadenylate-dependent en-donuclease. Nature, 1931, v. 212, p. 1030-1032.

51. Friedman D.L., Johnson R.A., Zeilig R.A. The role of cyclicnuclotides in the cell cycle. Adv.Cycl. Nucl. Res., 1976, v. 7, p. 69-114.

52. Friedman R.M. Interferons. A primer. New York, London:

53. Academic press, 1981, p. 25-88.

54. Friedman R.M., Pastan I. Interferon and cyclic-3,5-adenosinemonophosphate: potentiation of antiviral activity. Bichem. Biophys. Res. Comm., 1969, v. 36, p. 735-740.

55. Friedman-Einat M., Revel M., Kimchi A. Initial characterisation of a spontaneous interferon secreted during growth and differentiation of Friend erythroleukemia cells. Mol. Cell. Biol., 1982, v. 2, p. 1472-1480.

56. Fuse A., Mahmud I., Kuwata T. Mechanism of stimulation by human interferon of prostaglandin synthesis in human cell lines. Cancer Res., 1982, v. 42, p. 3209-3214.

57. Gelehrter T.D., Tomkins G.N. Control of tyrosine aminotransferase^ synthesis in tissue culture by a factor in serum. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1969, v. 64, p. 723-730.

58. Gewert D.R., Shah S., Clemens M.I. Inhibition of cell division by interferons. Changes in the transport and intracellular metabolism of thymidine in human lymphoblastoid (Daudi) cells. Eur. J.Biochem., 1981, v. 116, p. 487-492.

59. Goldberg N.D., Haddox M.K. Cyclic GMP metabolism and involvement in biological regulation. Ann.Rev.Biochem., 1977, v. 46, p. 823-896.

60. Goldberg S.L., O'shaugnessy M.V., Stewart R.B. The relatioship between adenosine 3,5-cyclic monophosphate (cAMP) and interferon activity in mouse cells. J.Gen.Virol., 1980, v. 48, p. 377-381.

61. Goldfine J.D. Interaction of insulin, polypeptide hormones,and growth factors with intracellular membranes. Biochem. Biophys. Acta, 1981, v. 650, p. 53-67.

62. Greene J.J., Dieffenbach C.W., Yang L.C., Ts'o, P.O.P.

63. Species specific posttranscriptional regulation of interferon synthesis. - Biochemistry, 1980, v. 19, p. 2485-2491.

64. Greengard P. Phosphorylated proteins as physiological effectors. Science, 1978, v. 199, p. 146-152.

65. Grunberger G., Zick Y., Roth J., Gorden P. Protein kinase activity of the insulin receptor in human circulating and cul tured mononuclear cells. Biochem.Biphys.Res.Comm., 1983, v. 115, p. 560-566.

66. Heywood S.M., Kennedy D.S. Purification of myosin translational control RNA and its interaction with myosin messenger RNA. Biochemistry, 1976, v. 15, p. 3314-3319.

67. Huez G., Silhol M., Leblen B. Microinjected interferon doesnot promote an antiviral responce in HeLa cells. Biochem. Biophys.Res.Comm., 1983, v. 110, p. 155-160.

68. Isaaas A., Lindemann J. Virus interference I. The interferon.- Proc. Royal Soc. B., 1957, v. 147, p. 258-267.

69. Itkes A.V., Kochetkova M.N. Activation of phosphodiesteraseof cyclic adenosine monophosphate by 2,5-oligoadenylate. -Biochem.Intern., 1981, v. 3, p. 341-347.

70. Jacobsen H., Czarniecki C.W., Krause D., Friedman R.M., Silverman R.H. Interferon-induced synthesis of 2-5 A-dependent RNase in mouse JLS-V9R cells. Virology, 1983, v. 125, p. 496-501.

71. Jacobsen H., Krause D., Friedman R.M., Silverman R.H. Induction of ppp(Arp)nA-dependent RNase in murine JLS-V9R cells during growth inhibition. Pur.Nat.Acad.Sci.USA, 1983, v. 80, p. 4954-4958.

72. Justensen J., Perbus D., Thang M.N. Elongation mechanism andsubstrate specificity of 2,5-oligodenylate synthetase,. -Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1980, v. 77, p. 4618-4622.

73. Kafiani C.A., Itkes A.V., Kartasheva O.N., Kochetkova M.N.,

74. Turpaev K.T., Severin E.S. A study on the relationship between the interferon enzyme system and the system of cyclic nucleotide metabolism. Adv.Enz.Reg., 1983, v. 21, p. 353365.

75. Kimchi A., Shure H., Revel M. Regulation of lymphocyte mitogenesis by (2-5) oligoadenilate. Nature, 1979, v. 282, p. 849-851.

76. Kimchi A., Shure H., Revel M. Anti-mitogenic function of interferon-induced (2-5)oligodenylate and growth-related variations in enzymes that synthesise and degrade this oligonucleotide. Bur.J.Biochem., 1981, v. 114, p. 5-10.

77. Krishnan I., Baglioni C. Increased levels of (2-5) oligo(A)polymeraze activity in human luraphoblastoid cells treated ^ith glucocorticoids. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1980, v. 77, p. 6506-6510.

78. Krishnan J., Baglioni 0. Regulation of 2,5-oligo(A)polymerase activity in quiescent human fibroblasts treated with interferon. Virology, 1981, v. 111, p. 666-670.

79. Lab M., Thang M.N., Soteriadou K., Koehren P., Justensen J.

80. Lengyel P. Mechanisms of interferon action: the (2-5)(A) synthetase RNaseL pathway. - Interferon,1981, v. 3,p.78-100.

81. Lundgren E., Larsson J., Miorner H., Stannegard 0. Effects ofleucocyte and fibroblast interferon on events in fibroblast all cycle. J.Gen.Virol., 1979, v. 42, p. 582-590.

82. Lundgren E., Lundblad D. Changes in DNA-polymerase and tymidine kinase activity during interferon treatment. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1982, v. 105, p. 1569-1576.

83. Maurer R.A. Transcriptional regulation of the prolactin geneby ergocryptine and cyclic AMP. Nature, 1981, v. 294, p. 94-97.

84. Meisner H., Laraers W.H., Hanson R.W. Cyclic AMP and the synthesis of phosphoenolpyruvate carboxykinase (GTP) mRNA. Trends Biochera.Sci., 1983, v. 8, p. 165-167.

85. Michell B. Hormone action at membranes. Trends Biochem.,1. Sci., 1984, v. 9, p. 3-4.

86. Minks M.A., Benvin S., Baglioni C. Mechanism of pppA(2'p5'A)n2'P5'A0H synthesis in extracts of interferon-treated HeLa cells. J.Biol.Chem., 1980, v. 255, p. 5031-5035.

87. Minsk M.A., West D.K., Benvin S., Baglioni C. Structural requirements of doublestranded RNA for the activation of 2,5-oligo(A) polymerase and protein kinase of interferon-trea-ted HeLa cells. J.Biol.Chem., 1979, v. 254, p. I0I80-10183.

88. Mittal C.K., Murad F. Activation of guanylate cyclase by superoxide dismutase and hydroxyl radical: a physiological regulation of guanosine 3,5-monophosphate phormation. Proc. Nat.Acad.Sci.USA, 1977, v. 74, p. 4360-4364.

89. Murthy A.S.N., Flavin M. Microtuble assembly using the microtuble-associated, protein states of phosphorylation with protein kinase and phosphatase. Eur.J.Biochem., 1983, v. 137, p. 37-46.

90. Nesterova M»V., Sashchenko L.P., Vasiliev V.Yu., Severin E.S.

91. A cyclic adenosine 3,5-monophqphate-dependent histone kinase from rat brain. Purification and some properties of the enzyme. Biochem.Biophys.Acta, 1975, v. 377, p. 271-281.

92. Nilsen T.W., Maroney P.A., Baglioni C. Double-stranded RNAcaused synthesis of 2,5-oligo(A) and degradation of messenger RNA in interferon-treated cells. J.Biol.Chem., 1981, v. 256, p. 7806-7811.

93. Nilsen T.W., Wood D.L., Baglioni C. 2,5-oligo(A)-activatedendoribonuclease. Tissue distribution and characterisation with a binding assay. J.Biol.Chem., 1981, v. 256, p. 1075110754.

94. Oikarinen J. Cortisol induces (2-5) oligodenylate synthetasein cultured chick embryo tendon fibroblasts. Biochem.Biophys. Res. Comm. , 1982, v. 105, p. 876-881.

95. Paston J.H., Johnson G.S., Andersson W.B. Role of cyclic nucleotides in growth control. Ann.Rev.Biochem., 1975, v. 44, p. 491-522.

96. Reichman M., Devash M., Suhadolnik J., Sela I. Human leukocyte interferon and the antiviral factor (AVE) from virus-infected plants stimulate plant tissues to produce nucleotides with antiviral activity. Virology, 1983, v. 128, p.240-244.

97. Revel M., Kimchi A., Shulman L., Wolf D., Merlin G., Schmidt

98. A., Friedman M. Interferon-induced enzymes: synthesis andfunction in the cell-regulatory action in interferon. -Miami Winter Symp., 1981, v. 18, p. 361-380.

99. Rodbell M. The role of hormone receptors and GTP-regulatory proteins in membrane transduction. Nature, 1980, v. 284, p. 17-22.

100. Rubin B.I., Gupta S.L. Interferon-induced proteins in human fibroblasts and development of the antiviral state. J.Virol., 1980, v. 34, p. 446-454.

101. Rubin B.I., Gupta S.L. Differential efficacies of human type I and type II interferons as antiviral and antiproliferative agents. Proc. Hat. Acad. Sci., USA, 1980, v. 77, p. 5928-5932.

102. Salganik R.I., Pankova T.G., Deribas V.I., Igonina T.M. Multistage functional system amplifying and streading the effect of estradiol in rat uterus. Mol.Cell.Biochem., 1980, v. 29, p. 183-188.

103. Santoro M.G., Juffe B.M., Garaci E., Esteban M. Antiviral effect of prostaglandins of the A series: inhibition of vaccina virus replication in cultured cells. J.Gen.Virol., 1982, v. 63, p. 435-440.

104. Schmidt A., Chernajovsky Y., Shulman L., Federman P., Beris-si H., Revel M. An interferon-induced phophodiesterase degrading (2-5)oligoadenylate and the C-C-A terminus of tRNA. -Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1979, v. 76, p.4788-4792.

105. Schneck J., Rager-Zisman B., Rosen O.M., Bloom B.R. Genetic analysis of the role of cAMP in mediating effects of interferon. Proc. Hat.Acad.Sci. USA, 1982, v. 79, p. 18791883.

106. Sehgal P.B. How many human interferons are there? Interferon, 1982, v. 4, p. 1-18.

107. Seghal P.B., Tamm I. Two mechanisms contribute to the superinduction of poly(I), poly(C)-induced human fibroblast interferon. Virology, 1979, v. 92, p. 240-244.

108. Seghal P.B., Tamm I., Vilcek J. On the mechanism of enhancement of interferon production of actinomycin D and cyclo-xemide. Virology, 1976, v. 70, p. 256-265.

109. Sekar V., Atmar V.J., Josh A.R., Krim M., Kuehn G.D. Inhibition of ornitine decarboxylase by human fibroblast cells by tipe I and type II interferons. Biochem.Biophys.Res. Comm., 1983, v. 114, p. 950-954.

110. Shimizu N., Sokawa Y. 2,5-oligodenylate synthetase activity in lymphocytes from normal mouse. J.Biol.Chem., 1979,v. 254, p. 12034-12037.

111. Shlyapnikov S.V., Arutunyan A.A., Kurochkin S.N., Memelova L.V., Nesterova M.V., Sashchenko L.P., Severin B.S. Investigation of the sites phosphorilated in lysine-rich histo-nes by protein kinase from pig brain. FEBS Letters, 1975, v. 53, p. 316-319.

112. Shure H., Lapidot Y., Rapoport S., Pauet A., Revel M. Antimitogenic effects of interferon and (2-5) oligoadenylate in synchronized 3T3 fibroblasts. FEBS Letters, 1981,v. 134, p. 212-216.

113. Silverman R.H., Caley P.J., Knight M., Gilbert C.S., Kerr I. Control of the ppp(A2,p)nA system in HeLa cellsa effects of interferon and virus infection. Eur. J.Biochem., 1982,v. 124, p. 131-138.

114. Silverman R.H., Watling D., Balkwill P.R., Trowsdale J., Kerr I.M. The ppp(A2'p)nA and protein kinase systems in wild-type and interferon treated Daudi-cells. Eur.J.Biochem., 1982, v. 126, p. 333-340.

115. Slate D.L., Ruddle P.H. Genetic control of the interferon system. Interferon, 1981, v. 3, p. 65-76.

116. Stark G.S., Dower W.J., Schimke R.T., Brown R.E., Kerr I.M. 2-5A synthetase: assay, distribution and variation with growth or hormone status. Nature, 1979, v. 278, p. 471473.

117. Stewart W.E. The interferon system. Wien, Hew York: Springer-Verlag, 1979, p. 27-76, 196-256.

118. Stewart W.E., Gossen L.B., Lockart R.Z. Distinguishing characteristics of the interferon responses of primary and con-tinous mouse cell cultures. J.Gen.Virol., 1971, v. 13,p. 35-50.

119. St.Laurent G., Yoshie 0., Floyd-Smith G., Samanta H., Se-hgal P.B., Langyel P. Interferon action: two (2-5)(A)n synthetases specified by distinct mRNAs in Ehrlich ascites tumor cells treated with interferon. Cell, 1983, v. 33, p. 95-102.

120. Tallman J.P., Smith C.C., Henneberry R.C. Induction of functional B-adrenergic receptors inHeLa cells. Proc.Nat.Acad. Sci. USA, 1977, v. 74, p. 873-877.

121. Tamm I., Pfeffer L.M., Wang E., Landsberger P.R., Murphy J. Inhibitinn of cell proliferation and locomotion by interferon: membrane and cytoskeletal changes in treated cells. -Miami Winter Symp., 1981, v. 18, p. 417-438.

122. Taylor-Papadimitriou J. Effects of interferon on cell growth and function. Interferon, 1980, v. 2, p. 13-46.

123. Tomkins G.M., levinson B.B., Baxter J.D., Dethlefsen L. Further evidence for posttranscriptional control of inducible tyrosine aminotransferase synthesis in cultured hepatoma cells. Nature New Biol., 1972, v. 239, p. 9-14.

124. Tovey M.G. Interferon and cyclic nucleotides. Interferon, 1982, v. 4, p. 23-46.

125. Tovey M.G., Dron M., Morgensen K.E., Leblen В., Mecht J.V., Begon-Lours-Gugmarho J. Isolation of Daudi cells with reduced sensitivity to interferon. On the mechanisms of resistance. J.Gen.Virol., 1983, v. 64, p. 2649-2653.

126. Tovey M.G., Rochette-Egly C., Castagna M. Effect of interferon on concentration of cyclic nucleotides in cultured cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1979, v. 76, p. 38903893.

127. Trofatter K., Daniels C. Effect of prostaglandins and cyclic adenosine 3,5-monophosphate modulators on herpes simplex virus growth and interferon response in human cells. -Infect.Immun., 1980, v. 27, p. 158-167.

128. Vaughan M., Danello M.A., Manganiello C., Strewler G.J. Regulation of cyclic nucleotide phosphodieterase activity. -Adv. Cyclic Nucl. Res., 1981, v. 14, p. 263-271.

129. Wallach D., Fellous M., Revel M. Preferental effect of interferon on the synthesis of HLA antigenes and their mRNAs in human cells. Nature, 1982, v. 299, p. 833-836.

130. Wang J.H., Desai R. Modulator binding protein. Bovine protein2+exhibiting the Ca dependent association with the protein modulator of cyclic nucleotide phosphodiesterase. J.Biol. Chem., 1977, v. 252, p. 4175-4184.

131. Weber J.M., Stewart R.B. Cyclic AMP potentiation of interferon antiviral activity and effect of interferon on cellular cyclic AMP level. J.Gen.Virol., 1975, v. 28, p. 363-372.

132. Weigent D.A., Stanton G.C., Howard M.J. Recombinant gamma interferon enhances natural killer cell activity similar to natural gamma interferon. Biochem.Biophys.Res.Comm., 1983, v. 111, p. 525-529.

133. West D.K., Baglioni C. Induction by interferon in HeLa cells of a protein kinase activated by double-stranded RNA. Eur. J.Biochem., 1979, p. 461-468.

134. Wheelock E.P. Interferon-like virus-inhibitor induced human leukocytes by phyt©hemagglutinin. Science, 1965, v. 149,p. 310-311.

135. Yang K., Samanta H., Dougherty J., Yayaram B., Broeze R., Lengyel P. Interferon,double-stranded RNA,and RNA degradation. Isolation and characterisation of homogenous human (2-5)(A)n synthetase. J.Biol.Chem., 1981, v. 256, p. 9324-9328.

136. Yonehara S., Ishii A., Yonehara-Takanashi M. Cell surface receptor-mediated interalization of interferon: its relation to the antiviral activity of interferon. J.Gen.Virol., 1983, v. 64, p. 2409-2418.