Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транслокация холофермента и субъединиц сАМР-зависимой протеинкиназы в ядро

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Транслокация холофермента и субъединиц сАМР-зависимой протеинкиназы в ядро"

АКАДЕМИЯ НАУК АРМЯНСКОЙ ССР ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи АПР15КЯН АЩРАНИК ГУРГЕНОБИЧ

УДК 577.152.3.

ТРАНСЛОКАШЯ ХОЛОШМШГА И СУБЪЩШИЦ сЛ1ДР-ЗАШСШОЙ ПРОТЕИНКИНАЗЫ В ЯДРО

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван - 1988

FfedoTa выполнена в Институте молекулярной биологии АН СССР (директор - академик АН СССР А.Д.Мираабеков).

Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор Е.С.Северин

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Н.А.Федоров.

доктор биологических наук Г.К.Парсаданян

Ведущая организация: Университет Дружбы Народов им. Пат-риса Лумумбы.

Защита диссертации, состоится 1988 г.

...

в ° '• часов на заседании специалиаированного совета Д 005.15.01 при Институте биохимии.АН Арм.ССР;по адресу: 375044, г.Ерекш, ул.П.Севака, 5/1.

С диссертацией.мояно ознакомится в библиотеке Института биохимии АН Арм.ССР. •

Автореферат разослан " I98g г>

Ученый секретарь" специализированного-совета-, ■ •

докт. биол. наук, профессор sj А.А.Семоняк

S-л i/ii/ji j

* j ' ОНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

r.'cJr':"J1 Актуальность проблемы. В последнее время все большее внима-ний~привлекают к себе молекулярные механизмы регуляции процессов жизнедеятельности организмов, функционирутацих в условиях изменяющейся окружающей среды. сАМР - циклический аденозин 3:5-монофос-фат, являясь внутриклеточным проводником регуляторных сигналов ряда гормонов и пойротрансмитт еров, оказывает большое влияние на функционирование живого организма (Greengard,*1978).

Была выдвинута гипотеза, подтвержденная накопленными к настоящему времени данными, согласно которой все эффекты сАМР в эукариотических организмах реализуются через систему сАМР-зависи-шх протеинккназ, фосфорилиругацих различные белковые субстраты и играющих таким образом важную роль в регуляции различных биологических процессов, в том числе пролиферации и экспрессии генов.

Рядом авторов были получены данные, указывающие на возможность транслокации субъединиц сАМР-зависимой протеинкиназы из цитоплазмы в ядро, экспериментами in vitro показана акцепция этих белков на хроматине (uesterova et ai., 1981) и обнаружено, что регуляторная субъединица обладает топоизомеразной активностью (Jungnan et al., 19В5).

Однако, на сегодняшний день вопрос о роли сАМР и сАМР-зависи-мых протеинкиназ в регуляции физиологических и метаболических процессов в клетках остается невыясненным, переход протеинкиназы из цитоплазмы в ядро показан исключительно косвенными методами, остается неизученной динамика транслокации и связанные с нею события, нет ответа на такие вопросы, как в каком состоянии ПК трансПринятые сокращения: ПК - сАМР-зависимая протеинкиназы; Я '- регуляторная субъединица ПК; С - каталитическая субъединица ПК; ДСН - додецилсульфат натрия, ПЭГ - полиэтшгенгликоль, ДМСО - диметилсульфоксид.

локируется в ядро - диссоциированной или недиосоциированной форме, деградировав ом или недеградированном состоянии, как влияет ' на" этот процесс автофосфорилированиа протеинкиназы, не изучено

связывание холоферментаи субъединиц сАМР-зависимой протеинкиназы ' с соответствующими. акцепторными участками хроматина. -• ". Цель работа. Основной задачей настоящей работы являлось прямое доказательствофакта транслокации протеинкиназы в ядро, иссле-•дование динамики этого процесса, выяснение влияния автофосфорили-рования на процесс транслокацйи и изучение связывания холофермен-та и субъединиц .сАМР-зависимой протеинкиназы с соответствувдими акцепторными участками в ядре. .

Научная новизна. В ходе, работыбылапредложена модификация -инкапсулирования различных веществ в тени эритроцитов! Это позво- • ■ лило использовать данный метод для высокоэффективного введения белков и ферментов в мембранные везикулы теней эритроцитов.без потери нативности структуры и ферментативной активности для последующего инъецирования их в культивируемые метки.

Была изучена динамика распределения экзогенной регуляторной субъединицы протеинкиназы в. клетках МШ ЗТЗ и установлен факт .транслокации ее из цитоплазмы в ядро. Установлено, что после транслокации в. ядро регуляторная су'бъедакица сАМР-зависимой протеинкиназы локализуется в'непосредственной близости от ядрышка.

■ При изучении взаимодействия холофермонта и. субъединиц сАМР-' зависимой протеийкиназы с акцепторными участками в ядре- было показано , что связывание регуляторной и каталитической субъединиц протеинкиназы с соответствующими акцепторными участками имеет положи- . тельный кооперативный характер. Вычислены соответствующие коэффи-'_ циенты Хилла и константы диссоциации. Установлено, что концентрация участков связывания.в ядре для регуляторной и каталитической ■субъединиц примерно одинакова и значительно превышает концентрацию

- 3 -

' * - "

участков связывания в ядре для холофермента сАЦР-зависимой проте- • инкиназы. •' :

Практическое значение. Предложенные в работе модификации ме- . тода инкапсулирования различных веществ в тени эритроцитов дают возможность вводить ферменты в культивируемые; клетки, изучать их внутриклеточное перераспределение^ функции и механизмы действия.

Протекнкиназн играют важяуа роль, в рёгудявди процессов жизне--.деятельности организмов: Изучение динамики процесса транслокации • Ж. в ядро и взаимодейстЬия холофермента и субъедшгац ПК с ядерны- ' ш. акцепторными участками является вагным. этапом, в понимании проблемы регуляции клеточной активности-.и.углубляет, ^выставления о ■ механизмах .функционирования. оМР-зайиошой.'протешкиназы .нее участия-в-проведении.регуляторах сигналов.- •

■ .. Апробация I -работы. Основный результаты , работы доложены на X Всесоюзной конференции т биохзшии нервной, системы "Фундаментальные достшиния найрохишш - М9ДИЦше" (Горышй,. 1937). . . Публикации. По - теме-диссертации- опубликовано 4 научные, работы.

Структура-и объем работы.. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, посвященного. еАМР-зависшыи протеик-киназам и'их свойствам, .роли'сАМР.в регуляции экспрессии генома и транслокации ПК в ядро, описания методов исследования, язложе- . ■ния результатов и.их обсуждения, выводов л. списка литературы (147-ссылок). Работа изложена на- 105 страницах машинописного текста' и включает- 26 рисунков.'

аШШИШШШЯ .ЧАСТЬ Материалы и метода

- Выделение сАМР-зависимой-дротеинкиназы из мозга свиньи проводили по методу Нестеровой и соавт. (Nesterova еЛ а1., 1975).-с последущим разделением холофермента на субъединицы на колонке

с сАМР-сефарозой (Кочетков и сотр., 1976).

Анализ гомогенности белковых препаратов проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсуль-фата натрия в пластинках, предложенный Леммли ( ъ&етпи, 1970).

Выделение ядер из мозга свиньи проводили по методу Шаво и соавт. С оьаиуеаи et а1.,19Ьб) с некоторыми модификациями Рад-дона И СОавТ. (Паййоп et а1.р1972).

Мечение белков радиоактивным йодом проводили согласно методу (Гард, 1980).

Ядерно-акцепторный анализ. Для изучения связывания белков с ядрами возрастающие концентрации меченных радиоактивным йодом белков инкубировали определенное время с суспензией изолированных ядер,, осаждали ядра центрифугированием и промывали их для освобождения от несвязавшейся метки и связанную о ядрами радиоактивность измерял;! в ¿'-счетчике С0-30 ('Чг^егЬесЬг^ие").

Приготовление теней эритроцитов'. Выделенные из крови человека эритроциты диализовали в течение ночи против 50 объемов 1:6 разведенного рзз (137 ыМ КаС1, 3 мМ КС1, 8 мМ фосфата натрия и I мМ фосфата калия, рН 7,4), содержащего 0,5$ детергента ЫР-40. После диализа теки эритроцитов осаждали центрифугированием и промывали аналогичным образом до прозрачности супернатанта.

Подсчет теней эритроцитов к ядер проводили ь камере ГоряеБа.

Концентрации белка определяли по модифицированному методу (Нагггее, 197?) и экспресс-методом Бирдена (ВеаЫеп, 1978).

Культивирование клеток. Для опытов использовали линию клеток нормальных шшшншх фибробяастов - Ы1Н ЗГЗ, которые выращивали во флаконах емкостью 100 мл в среде Игла с гидролизатом лакталь-бумина (1:1) с добавлением глютамина, антибиотиков пенициллина и .стрептомицина и 10$ фетадьной телячьей сыворотки.

Введение белков в тени эритроцитов осуществляли модифицированным наш методом Лойтера ( ьоугег ^ аХ., 1984 ). Суть процедуры сводилась к следующему: к теням эритроцитов добавляли дотер-

гент ЫР-40, тщательно перемешивали, добавляли меченный радиоактивным йодом белок и инкубировали 25 мин при интенсивной перемешивании при комнатной температуре. Затем суспензию переносили к специфическому адсорбенту неионных детергентов ХАД-2 в определенном объеме рвз и инкубировали на холоду при непрерывном перемешивании в течение одного часа, после чего смесь оставляли осаждаться и надосадочную жидкость собирали- Осадок промывали 10-12 раз ?вз до содержания в сулернатанте радиоактивности, на три порядка меньшей изначальной. Собранный супернатаят центрифугировали на центрифуге Т-5 идявтэкх) , осадки собирали, а супорнатант центрифугировала на центрифуге Ь5-65 "Вескааа" при 20000 об/мин в течение часа, используя ротор от -40. Осадки после этого объединяли с осадками после Т-5 центрифуги и использовали для слияния с клетками.

Введение белков в клетки пш помощи теней эритроцитов. После перемешивания теней эритроцитов, нагруженных белком, с осажденными клетками к смеси добавляли по каплям в течение двух минут при мягком непрерывном перемешивании 0,5 мл среда без сыворотки, содержащей 5С$ ПЭГ-4000 и 105? ДЯСО. Подученную смесь оставляли инкубироваться в покое на 1,5-2 мин при 37°С. После инкубации к смеси добавляла по каплям в течение 1,5 мин при мягком непрерывном перемешивании I мл среди без сыворотки. Затем тот же объем среды без сыворотки за время, на 15 сек меньше предыдущего и так далее да разведения раствора полиэтиленгликоля в 60 раз. Эту смесь инкубировали при 37°С 20 мин. От вводившихся теней эритроцитов освобождались низкоскоростным центрифугированием. Осажденные клетки ресуспендировали в среде с 10$ фетальной сыворотки, расфасовывали во флаконы о покровными стеклами и инкубировали при 37°С различное время от 2 до 16 часов.

Приготовление препаратов для световой микроскопии. Все мани-

пуляции осуществляли при комнатной температуре. Из флаконов осторожно отбирали среду и дважды промывали клетки PBS , Фиксации клеток осуществляли инкубацией клеток с 70% этанолом в течение 7 мин. Покровные стекла сушили на воздухе, приклеивали антеланом на предметные стекла и покрывали радиочувствительной эмульсией

• типа "М" (ГОСНИИХт^ОТОПРОЕКГ). Экспонировали препараты от четырнадцати до двадцати пяти дней'. .

Приготовление препаратов для электронной микроскопии. Все манипуляции осуществляли на холоду при 4°С. -Везикулы промывали

• PBS , фиксировали в смеси 0,5$ глутарового 'альдегида и 2% парафор-мальдегида-в течение 40 мин. После фиксации везикулы осаждали,

• небольшие порции осадка обезвоживали в спирте повышающейся концентрации и заливали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы окраши-

' ьали' уракилацетатом или цитратом, свинца и изучали .в электронном

, микроскопе • jemIÜOCX (Jeol). . •

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОШУЩЖЕ ''

Связывание холофетаента и субъединиц о А№-зависимой протеин- -•киназы с акцепторными участками ядра. Для. изучения связывания хо-

• лоферлента и субъединиц протеинкиназы с-соответствующими акцепторными участками в ядре мы, использовали метод, применяемый при исследовании гормон-рецепторных комплексов. Для этой цели изолированные

мозга свиньи ядра мы инкубировали с-различными белками, мечен-

-трс; '

"хщ радиоактивным йодом • и обнаружили определенные количест-

ва радиоактивности в ядрах.•Инкубацию проводили в присутствии 140 Mfcl KCl, так как при такой'ионной силе предотвращается неспецифи-чес.кое связывание белков с 'поверхностью ядра (Нестерова и др., ■1987), Поскольку в настоящее время нет данных относительно взаимо. действия сМ!Р-зависимоЙ протеинкиназы с -ее субъеданиц с ядерной мембраной и в аналогичных условиях регуляторная субъодишща, взаи- -модействует с белками хроматина (Априкян и др., 1987), то мокно

предположить, .что мы имеем дело с'транслокзнней белков через ядерную мембрану. '

Связывание холофермента оАМР-зависимой протеинкиназы с акцепторными участками ядра. Инкубация ядер, изолированных из мозга 'свиньи с холоферментом сАМР-зависимой протеинкиназы, меченной радиоактивным йодом, могла привести к ошибочным результатам в силу возможной диссоциации последнего на субъединицы. Ео избежание этой диссоциации холофермент был обработан обратимым бифункциональным • сшивающим-реагентом метил-4-меркаптобутиртодатом согласно методу (Николаев, Г981). После мечения это:го препарата радиоактивным йодом была проведена гель-фильтрация на сефадексе G-200. Электрофорез. в полиакряламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия ' показал'отсутствие полосы с молекулярной массой меньше 180 кДа (молекулярная масса холофермента-протеинкиназы)., Такий образом, в полученном препарате содержался в основном сшитый холофермент' сАМР-зависимой протеинкиназы.

Инкубация изолированных ядер с возрастающим концентрациями 'меченного радиоактивным йодом сшитого холофермента протеинкзмазы

Рис.1. Связывание с-ядрами холофермента сЛМР-зависикой протеинкиназы.

0Д>6 •

позволяла построить кривую насыщения, представленную на рис.1. Видно, что кривая достигает насыщения при концентрации холофер-мента, близкой к значению 5,0 х

С цельв выявления цитоплазматических факторов, влияющих на связывание холофермента с акцепторными участками ядра, в инкубационную смесь добавлялся цитозоль, однако в этих экспериментах добавление цитоплазматических белков не оказывало существенного влияния на характер кривой связывания холофермента протеинкипаоы с акцепторными участками в ядре.

Кроме того, в качестве конкурентных белков за связывание с неспецифическими местами акцепции к изолированным ядрам перед инкубацией добавляли избыточные концентрации как бычьего сывороточного альбумина, так и гистона Н1. Однако это таюге не приводило к изменению характера кривой насыщения.

Рис.2. Анализ связывания холофермента сАМР-зависимой протеинкиназы с ядрами в координатах Скэтчар-да (а) и методом двойных обратных величин (б).

инкиназы с' акцепторными участками в ядре в координатах Скэтчар-. да (а) й методом двойных обратных величин (б)'. Константы диссо-г циации для. холоферлента сАМР-зависимой протеинкиназы, определенные из этих кривых связывания, примерно равны и составили 1,2- х

и 2,2 х 10~Щ>! соответственно. Такие высокие величины константы диссоциации свидетельствуют о достаточно высоком срод- . стве холофермента к акцепторным участкам в ядре.

Количество участков связывания в ядре для холофермента; сАМР-

■ я ■

зависимой протеинкиназы оказалось равным 8,5 х 10~° фйоль. Следует отметить, что эта величина оказалась значительно ниже количества участков' связывания в ядре для регуляторной и каталитической-.субъ&диниц протеинкиназы. '

Связывание регуляторной- и каталитической субъединиц с'МР-. зависимой'протеинкиназы с акцепторными участками ядра. Инкуба-.ция изолированных .ядер с возрастающими концентрациями меченной радиоактивным йодом регуляторной субъединицы привела к'построе--нию сигмоидальной кривой насыщения, представленной на рис.3 ■ (кривая I). Видно, -что кривая насыщения при концентрации- регу- -ляторной субъединицы более 1,8 х 10~% возрастает неспецифич'ес-ким образом. -■-.'" .

. Как и в случае.с холоферментом, ни- добавление в' инкубационную. смесь цитозоля, ни предварительная -инкубация изолирован- • ,нЫх- ядер с.избыточными концентрациями бычьего сывороточного аль. бумина и гистона'Н1 не изменяла сколь-нибудь, существенно сиг-моидайьный характер кривой -связывания регуляторной субъедшпщы.

. На рис.3 представлена также кривая связывания фосфоформы ' регуляторной субъединицы с ядром (кривая 2). Из характера-кривой следует,' что связывание- фо'сфорилирс ванной-регуляторной субъединицы с 'акцепторными -участками в ядра значительно снижено по сравнению с дефосфофорлой и носит скорее'неспецифический

и>

Л • *

.й

¡^ёо&фм¿а. Я], нН ^ 30

Рис. 3. Связывание дефосфоформй (-1). и фосфоформы Е-субъеди-ницы протеинкиназы с акцепторными, участками в ядре.

характер. Эти результаты хорошо согласуются с данными, полученными раннее в нашей лаборатории по транслокации фосфоформы регу-ляторной субьединицы в ядро ^.о.уо.г'т _ в* .а 1.,тг).

На рис. 4 и 5 представлены кривые связывания регуляторной

Рис. 4. Анализ кривой связывания регуляторной субъединицы .с ядрами в координатах Скэтчардэ.

' 0,Ь & _ 2,4 [Сёаъаднаа Я],нМ

- и -

Бис. 5.- Анализ кривой' связывания регулятор-иой субъединицы с ядрами методом двойных ' обратных величин.

■ .лф г-0£5 ■ . - Ц05 . то 6,15 ■ ^ • 1 . ■ ■ • , КХщ*»»*!'*.!,^

субъеданици о акцепторными участками ядре в координатах Скэт-' чарда. и'двойных обратных величин. Константы-диссоциации, • .вычисленные из втих графиков, хорошо согласуются друг с другом и равны 6,0 и 6,2 нМ соответственно.-

Кривая связывания каталитической субъединицы с ядерными акцепторными участками и соответствующие грвфики в координатах ■ Скэтчарда и двойных обратных величин представлены на рис.6 и 7.,

т • 2,0

а * "

йЧ

и '

2 <у

2 3 Е

2.1? 1.0 »»

¡31 •

■ * •

3 • я

Рис.6.' Связывание с ядрами каталитической субъединицы сАМР-зависимой протеинкиназы. •

ДО .6,0 - '9,0 • 12,0

иатаригпчъес*о.5? субъ&зиНЩо], Н^

Рис.7. Анализ кривой связывания каталитической субъ-

• единицы' (С-) с ядрами в координатах Скэтчарда (а) . и методом двойных обратных величин (б).

Необходимо отметить,- что и в этом случае кривая насыщения имеет сигмоидальный характер, как и в случае связывания регулятор-', ной■субъединицы с ядром; Эти данные,так же, как и нелинейность графика Скэтчарда, указывают на наличие определенной коопера-. . тивности в связывании каталитической и регуляторной субъединиц. сАЫР-зависимой 'протеинкиназы с акцепторным участками ядра.

Связывание каталитической субъединицы с акцепторными участками ядра характеризуется константой диссоциации, равной . ' (4,14-6,7) х 1СГ10М. ' .

."В качестве контроля на специфичность .связывания белков с .акцепторными участками в ядре нами-были использованы меченные . радиоактивным йодом бычий сывороточный альбумин-и. ¿'-глобулин 'человека. Результаты экспериментов-представлены'на рис.8. -Видно, что связываше этих белков с ядрами носит неспецифический'характер и представляет собой обычную сорбцию белков-ядра-. ми. Стоит еще раз обратить внимание на то,-что связывание фос-фоформы регуляторной субъединицы с .ядрами имеет аналогичный "характер. , ' •

к

о

1*

го -2 42

л

аг *

а

0,6

г м &

[СаО^СЮНЫи И М

/20

Рис.8.

Связывание с ядрами бычьего сывороточного альбумина (I) и ¿'-глобулина человека (2).

Связывание регуляторной и каталитической -субъединиц сАМР-зависимой протеинкиназы с акцепторными участками ядра носит достаточно специфический характер, на что указывают -как сигмоидальный характер соответствующих кривых связывания, так и сравнительно высокие значения их констант диссоциации.

На рис. 9,ю представлены кривые связывания с акцептор-

яг 42

"5 С5 а: а: 0,4

зг С5 ю

<=2 0 1 -0,4

1,6

¡0Ыъя К]

Рис.9. Связывание регуляторной субъеданицы (Я) с ядрами в координатах Хилла. 0Л - количество участков' Связывания в ядре.

ними участками в одре для регуляторной и каталитической субъединиц в координатах Хилла, по которым вычислены соответствующие им коэффициенты. Связывание как регуляторной, так и каталитической субъединиц протеинкиназы с ядрами' характеризуется -положительной коопёративностм» с коэффициентом Хилла для регу--ляторной субъединицы 2,2; а для каталитической суо'ъеданицы -5,8. ^

■ W'

Рис.10. Связывание каталитической субъединицы (С) . с ядрами в координатах Хилла..

Такие высокие значения -коэффициента Хилла свидетельстцут: . о существупаей гетерогенности мест связывания дня субъединиц сАМР-аависимой протеинкиназы и указывают на наличие определенной кооперативности в этом связывании. Ядро представляет собой исключительно сложную систему, в которой содержатся различные по своей природе белки - субстраты протеинкиназы. Однако даае в случае, если данный белок имеет .в .одре только одно место связывания, оно может в ядре быть представлено одновременно-в различных конформационных состояниях, например, в случае с хроматином - это-конденсированный и активированный хроматин. Именно' эти состояния и могут обусловливать различное сродство . изучаемаго белка к этим акцепторным участкам.' В свою очередь, . это -существенно повлияет на кажущуюся величину коэффициента Хилла и создаст видимость существования большего количества

мест акцепции, чем это.есть на самом деле.

[количество участков связывания в ядре (0,а) дая регуляторной и каталитической субъединиц примерно одинаково и составляет 0,37 и 0,33 фмоль соответственно. Для холофермента сАМР-зависи-мой протеинкиназы эта величина существенно ниже и составляет 8,5 х Ю-3 фмоль. До сих пор остается неясным, существуют ли отдельные места связывания для холофермента и субъединиц проте-инкиназы, или же во всех трех случаях природа участков связыва-. ния одинакова. В настоящее время признается, что каталитические субъединицы сАМР-зависимых протеинкийаз из различных тканей идентичны друг другу, а регуляторные различаются по своим физико-химическим свойствам. В связи с этим представляется весьма .вероятным, что специфичность сАМР-занисимых протеинкиназ заключена в их регуляторных субъединицах.' В частности, процесс транслокации протеинкиназы и специфическая посадка фермента в соответствующем акцепторном участке хроматина могут быть связаны с транспортом и /»осадкой в ядре именно регуляторной субъединицы, что подразумевает независимую роль регуляторной субъединицы в регуляции экспрессии генома.-В этой связи представляет определенный интерес транслокация этого белка в ядро, динамика транслокацйи и локализация в ядре сАМР-связывавдего компонента сАМР-зависимой протеинкиназы.

В связи с.этим было целесообразным ввести экзогенную регу-ляторную субъединицу сАМР-зависимой протеинкиназы в клетки Я1Н сТЗ и проследить за ее поведением.

Введение регуляторной субъвдишгтш сАМР-зависимой протеинкиназы в тени эритроцитов. Использование липосом для введения белков в клетки, к сожалению, имеет ряд-недостатков. В первую очередь, это возможная деградация белка при различных способах приготовления липосом: ультразвуковая обработка мультиламеляр-

ных смектических мезофазкоторая нередко привода даже к значительной'химической деградации фосфолипидов (Грегореадас, 1983); применение органических растворителей и длительный диализ для освобождения от детергентов.'Во-вторых, это довольно низкий процент включения (10-15$)"макромолекул в липосомы и' еще более низкий процент липосом, слившихся с клетками iii vitro (1-5%).

Исходя из этого, ш остановили свой выбор на тенях эритроцитов, введения в них регуляторной субъединида сАМР-зависимой .протеинкиназы и последующего слияния с' помощью полиэтиленглико-ля с клетками. ■ . . •

Регуяягорная субъединица сАМР-зависимой протеинкиназы неявляется термостабильнкм белком, легко подвергается действию протеолитических ферментов и быстро теряет сАМР-связываидую активность под действием различных факторов' химической и физичес- • кой природа. Поэтому существуйте в настоящее время метода, основанные на применении сильных детергентов 'и длительном диализе (до 18 часов), не могут быть использованы для введения регуля-: торной' еубъедшицы ПК в тени эритроцитов. В этом-случае необхо-г дим метод, позволяющий быстро и с большой эффективностью вводить -фермент з тени эритроцитов без потери ферментативной активности ' и избежать химической и биологической деградации. Исходя, из всего этого, мы остановили, свой выбор на предложенном Лойтером мэ-тоде получения способствующих слиянию капсул вируса сендая ( HVJ'- Human Virus Japaness ) путем солюбилизации интактнах вирионов с тритоном'Х-100 ( Loyter et el., 1984 );Этот метод также имел ряд недостатков, наиболее существенными из которых являлись длительность всего процесса - свыше-10 часов, - и достаточно долгий.диализ при еысокой температуре, которые неприемт . лемы для регуляторной субъединицы сАМР-завискмо.й .протеинкиназы. . Поэтому наш были разработаны некоторые модификации, позволявши«

достаточно быстро (в течение 2-3 часов) я с большой эффективностью (50-55$ от изначального количества бе'лка) вводить регу-ляторную субъединицу сАМР-зависимой проттшшазы в тени эритроцитов без заметной деградации и потери сАМР-связынаищей активности.

Суть метода сводится к следующему. К теням эритроцитов добавляли неионный детергент ыр -40 или тритон Х-100, что приводит к образованию разрывов на мембранах теней эритроцитов. Затем добавляли к этой суспензии меченный радиоактивным йодом белок и инкубировали определенное время при комнатной температуре для достижения равномерного распределения белка во всей суспензии. Д&лее к суспензии добавляли специфический адсорбент неполных детергентов ХАД-2 в определенном объеме рзз п инкубировали 60 шк при 4°. На этом этапе детергент связывается с-ХАД-2 и происходит замыкание нарушенных детергентом мембран теней эритроцитов с включенная в них водной фазы, содержащей меченный белок. После инкубации осаждали ХАД-2, собирали надосадок, повторяли процедуру промывки, используя рвз, обычно 10-12 раз, и объединенный надосадок центрифугировали 15 мин при 1000 х е .' Осадок представляет собой мембранные везикулы теней эритроцитов (МВТЭ) разных размеров, нагруяенные белком. Белок локализуется в МВТЭ как по. всему объеэду, так и в примембранной области везикул. Количество белка, введенного в МВТЭ, определяли по связанной с везикулами радиоактивности. Это количество составило 2225$ от изначального количества радиоактивности. Здесь ватао "отметить, что количество МВТЭ, нагруженных белком, мокко увеличить вдвое высокоскоростным центрифугированием супернатанга (100000 х ¡г, 60 мин). В осадке оказываются мембранные везикулы теней эритроцитов малых размеров и содержат такое же количество белка (оценено по счету радиоактивности), что и МВТЭ, получен-

ныв после низкоскоростного центрифугирования. Таким образом, мембранные везикулы теней эритроцитов, объединенные после центрифугирования при lOOOxg и 100000xg содержат 45-50/ь о? изначального количества радиоактивного белка.

Количество белка, инкапсулированного в мембранные везику-•лы теней эритроцитов, зависит от различных параметров. Основные из этих факторов, которые весьма существенным образом влия--ют на процент включения белка в МВТЭ - эго количество детергента, добавляемого к теням эритроцитов для образования пор на их мембранах, время инкубации этих теней с белком и объем добавляемого вместе с ХАД-2 к теням эритроцитов для удаления детергента, сопряженного, с образованием мембранных везикул теней эритроцитов.

Оптимальное количество как np-40, так и тритона Х-100 составляет 1,4$. При этом количество белка, инкапсулированного . в МВГЭ, при добавлении оптимального количества детергента в ' случае использования np-40 составляет 46$ от изначального количества белка, что на 10-12$ больше в случае использования тритона Х-100..

Оптимальное время инкубации составило 20 мин.

Весьма существенным образом влияет на количество белка, оказавшегося в мембранных везикулах теней эритроцитов, объем pbs, добавляемого вместе с ХАД-2 к смеси тени - детергент-белок. При соотношении объема- pbs к объему теней,-равному 1,0 наблюдается максимальное включение белка в МВТЭ (52$). Этот факт, . очевидно, можно объяснить тем, что при добавления большего количества pbs происходит более резкое уменьшение содержания детергента в пробе и, как следствие этого, более быстрое замыкание разрывов мембран теней эритроцитов с включением в них содержащегося в водной'фазе суспензии белка.

' При применении вышеуказанных оптимальных параметров количество инкапсулированного в МВТЭ белка составляло 50-55%, в тя-де опытов значение этой величины достигало 64$.

. Динамика тшнслокации регуляторной субъединици сАМР-зависимой протеинкиназы после введения ее в клетки. Регуляторную субъединицу сАМР-зависимой протеинкиназы вводили в клетки ЗГЗ путем слияния мембранных везикул теней эритроцитов,. нагру-'женных и , с клетками с помощью полиэтиленТликоля. ■ Через различное время после слияния клетки фиксировали, проводили ц;го-авторадиографию и наблвдали внутриклеточную локализацию меченной радиоактивным йодом регуляторной субъединицы сАМР-зависимой • протеинкиназы в препаратах. .•■'■■•

■ Через 2 часа после слияния регуляторная субъединица находится как на клеточной мембране, 'так и в цитоплазме в примем-бранной области. Через 6. часов регуляторная субъедшшца локализуется ужо в ядре и приядерней области цитоплазмы, при этом большая часть ее локализована в ядре. ■

■ К 8 и 10 часу после слияния с МИГЭ, нагруженными регуляторной субъединицей практически вся регуляторная' субъеддница находится в ядре, и можно сказать, что она сконцентрирована л локализуется в приядрышковей зоне. Внутриклеточная локализация регуляторной субъединвцы .через 12 и 16 часов поело слияния мало чем отличается друг от друга, и регуляторная субъёдиница в зтих случаях располагается в непосредственной близости от ядрышек, и частично в самих ядрыьках.-

Таким образом, экзогенная регуляторная субъедглница, вве_ денная в клетки ига ЗГЗ путем слияния с мембранными везикулами теней эритроцитов, транслоцируется из примембрэнной области цитоплазмы в ядро через 6 часов после слияния, а еще через 6 часов локализуется в области ядрышка. Так как регуляторная

* субъеданвда подвергается значительному протеолизу и это является одним из регуляторных механизмов функционирования этого белка, то было интересно выявить в каком виде й транслоцирует-ся в ядро.

На рис.II представлен электрофорез (авторадиография) меченной радиоактивным йодом рогуляторной субъединицк до введения ее в мембранные везикулы теней эритроцитов (I) и через 12 часов после слияния МВТЗ-12^1-В с суспензией клеток ШН ЗГЗ (2). При сравнении полос I и 2 можно заметить, что и через 12 часов после введения ее в клетки не подвергается выраженному действию протеолитических ферментов клетки и находится в состоянии, близком к состоянию Е до введения в тени эритроцитов.

55 «Да

Рис.II. Электрофорез (автора-даография) регуляторной субъ-единигш сАМР-зависимой проте-инкиназы до введения ее в тени эритроцитов (I) и черев 12 часов после введения ее в клетки (2).

I 2

В качестве контроля на специфичность локализации мы вводил меченный радиоактивным йодом бычий сывороточный альбумин в тени эритроцитов и проводили их слияние с клетками шн ЕГЗ.

После цитоавторадиографии во всех временных точках наблюдалась примерно одинаковая картина - неспецифическое равномерно-хаотическое распределение бычьего сывороточного альбумина по всей клетке.

Таким образом, регуляторная субъединица сАМР-зависимой протеинкиназы при введении в клетки ЮТ ЗТЗ после инкапсулирования е мембранные везикулы теней эритроцитов транслоцщует-ся из примембранной области цитоплазмы в ядро и затем специфическим образом локализуется в непосредственной близости от ядрышка, не подвергаясь при этом выраженному разрушающему действию протеолитических ферментов клетки.

Исходя из вышеприведенных данных можно заключить, что регуляторная субъединица сАМР-зависимой протеинкиназы II типа направленно транслоцируется из цитоплазмы в ядро, что указывает на важную роль регуляторной субъединицы в реализации функций генетического аппарата клетки. -

ВЫВОДЫ

1. Экспериментами по взаимодействию субъединиц и холофер-мента сАМР-зависимой протеинкиназы из мозга свиньи с ядрами, изолированными из того же источника, показано, что связывание регуляторной и каталитической субъединиц с акцепторными участками в ядре характеризуется константами диссоциации (6,0-6,2) х 10"% и (4,1-6,7) х Ю"-1-сМ, соответственно, связывание холофер-мента протеинкиназы с акцепторными участками в ядре характери- ' зуется константой диссоциации (1,2-2,2) х 10"-'-%.

2. Установлено, что концентрация участков связывания в ядре для регуляторной и каталитической субъединиц протеинкиназы примерю одинакова (0,37 фМ и 0,38 фй, соответственно) и значительно превышает концентрацию участков связывания в ядре для

- • - 22 -

' Я

холоферыента сАМР-зависимой протеинкиназы (8,5 х 10 р). Показано, что связывание фосфофорш регуляторной субъединицы с ядром имеет неспецифический характер.

3. Разработана модификация метода введения'различных веществ в тени эритроцитов, позволяющая быстро ж эффективно вводить (около 50$) различные белки и ферменты в мембранные везикулы теней эритроцитов для последующего инъецирования белков в культивируемые клетки;

4. Методом'слияния мембранных везикул теной эритроцитов, нагруженных гомогенной регуляторной субъединицей сАМР-зависи-мой протеинкиназы П типа-, с культивируемыми клетками показана динамика распределения регуляторной субъеданицы'протеинкиназы' в клетках МН 313.

5. С помощью цитоавто'радиографичеокого метода установлен факт траислокацт регуляторной субъединицы сАМР-зависимой протеинкиназы П типа из цитоплазмы в ядро в клетках nih ЗТЗ.

6. Установлено, что после транслокации из цитоплазш в яд-.ро регуляторная субъединвда сАМР-зависимой протеинкиназы' локализуется в непосредственной близости от ядржек, не. подвергаясь при этом выраженному действию протеолитических ферментов

' клетки. ' . . . '

' МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ООУШЖОЗАШ В СЛЕЩЩХ РАБОТАХ:

I. Нестерова М.В.,- Глухов А.И:/Априкян А.Г,, Северин Е.С. Ядерные белки - субстраты.сАМР-зависймой протеинкиназы. -. Биохимия, 1987. Т.5Й.№ 7, C.II50-II53. ■'2. Априкян А.-Г., Нестерова М.В., Глухов А.И., Северин Е.С. Связывание холофермента и субъединкц сМР-зависишй проте-шшшазн.'с ядрами. - Биохимия., 1987. Т.52, И 8. C.I300-I306.

5. Априкян А.Г. •, Северин Е.С» Транслокация холоферюкта и субъединиц- сАМР-з'ависимой протеинкинавы в ядро. - X Всесоюзная конференция по' биохиши нервной' системы "Фундаментальные достижения нейрохишш - медицине". Тезисы докладов, Горький, 1987. С.69. ' ' ' . I. Aprikian A.G., Hesterova M.V., Severin E.S. Dynamic, distri-

V ■

bution of the regulatory subunlt of pAMP-dependent. protein '. kinase type II In KIH 3T3 cells. - Biochemistry international,' 1988. V.16* N4. P.601-604.