Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунохимическое исследование регуляторной субъединицы с АМР-зависимой протеинкиназы и типа

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимическое исследование регуляторной субъединицы с АМР-зависимой протеинкиназы и типа"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

На правах рукописи

УДК 577.152.3

СВЕШНИКОВА Елена Васильевна

ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГУЛЯТОРНОЙ СУБЪЕДИНИЦЫ сАМР — ЗАВИСИМОЙ ПРОТЕИНКИНАЗЫ П ТИПА

03.00.04— биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена во Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения.

Научные руководители: член-корреспондент РАН, профессор Е. С. Северин, кандидат биологических наук И. Д. Гроздова

Официальные оппоненты: доктор химических наук С. Н. Кочетков, доктор биологических наук Н. Б. Гусев

Ведущая организация: кафедра химической энзимологин химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится 1995 г.

в час. на заседании Специализированного Ученого совета Д.171.02.01. при Центре медико-биологических и экологических проблем АЕН РФ (113149, Москва, Симферопольский бульвар, 8).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНЦМДЛ.

Автореферат разослан ЛН&бЪ/ьу 1995 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат биологических наук

В. В. Отраднова

\

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. сАМР-зависимые протеинкипазн (ПК) ййдяются регуляторами ферментами клетки, участвующими в развитии биологического ответа на Бездействие внешних сигналов: гормонов, нейромедиаторов, Факторов роста и др. ПК осуществляют рэ-гуляторнув функцию путем фосфорилирования различных белков, ко-"iopoo ПрИВОя.ит R. "" «плар.тп.

Молекула iíK чти,™^, -лл","!"ии и.,

каталитических (с) и двух регудяторшх (R) суоъеяишщ. о комплексе r ингибирует активность с-субъединицн. При повышении уровня camp в клетке происходит диссоциация фермента с образованием комплекса r с camp и свободной ферментативно активной с-субъединицы. Она осуществляет перенос r-фосфата АТФ на серико-вые и треониновые остатки аминокислот белков-субстратов, in vitro многие белки могут служить субстратами самр-ззвисимых проте-тшкиназ. in vivo объект фосфорилирования определяется внутриклеточной локализацией R-суОъединицы, которая заякоривает фермент вблизи белка-субстрата. Таким образом, r определяет активность фермента и субстрат фосфорилирования.

Интерес к этим ферментам существенно возрос после того, как обнаружилась их связь с процессами пролиферации и дифференциров-кл клеток. В работах cho-chung et al. было показано участие регу-ляторных субъединиц II типа (Ш) в торможении пролиферации злокачественных клеток • человека. Вот почему остается актуальным изучение структуры rII, локализации функциональных участков и их взаимодействия в ее молекуле, а также возможности специфического воздействия на ее функции.

В решении этих задач целесообразно использовать современные метода иммунохимии, обладающие высокой специфичностью и чувствительностью. Ранее иммунологические метода применяли для определения содержания ПК в тканях, изучения их тканевой и видовой спе-' v цифичности. Использование ив антител для изучения структуры RII и воздействия на ее основные функции носило отрывочный характер, и имеющиеся сведения по этому вопросу довольно противоречивы.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении ишунохимических свойств нейрональной rii, влияния антител на ее основные функции и сравнении rII из мозга человека и животных.

В соответствии с поставленной целью работа состояла из следующих этапов:

1) выделение RII из мозга свиньи, быка и человека;

2) получение антител на нейрональную Ш;

3) характеристика антител к RII;

4) локализация антигенных детерминант на молекула RII;

5) изучение влияния внтител на основные функции RII, а именно, на связывание camp и образование холофермента in vitro;

6) сравнение RII из мозга человека, быка и свиньи;

7) исследование влияния антител к RII на пролиферацию клеток в культуре.

Научная новизна и практическая ценность исследования. Впервые была выделена в гомогенном состоянии регуляторная субъ-единицв сАМР-эависиыой протеинкиназы II типа из мозге человека и описаны ее отличия от RII из мозга других млекопитающих. В частности, обнаружено, что в мозге человека присутствуют две изофор-мы RII, различающиеся по молекулярному весу, тогда как в мозге быка и свиньи она представлена только одной изоформой. Большой набор внтител, использованный в настоящей работе, позволил выявить иммунохимические различия между RII мозга разных млекопи-тавдих.

Впервые были получены антитела, стабилизирующие самр-зэви-симую протеинкиназу II типа в активной форме.

Разработаны подхода для использования антител в качестве специфического агента для изучения роли едмр-зависимого фосфори-лирования в регуляции пролиферации лейкемических клеток в культуре.

Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены на vi Всесоюзном симпозиуме "Роль циклических нуклеотндов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций" 3-? октября 1988 г. (Петрозаводск), на международном симпозиуме, организованном институтом им. Р.Коха, "International symposium on iiranunotherapeutic prospects of infectious diseases" 8-ii мэя 1990 г. (Берлин), на Всесоюзном симпозиуме "Биохимия опухолевой клетки" 1990 г. (Минск) и на семинаре отдела биотехнологии Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения (1994Г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, оСзор литературы, описание методов, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена по 12? страницах машинописного текста, включая 7 таблиц и 25 рисунков.

. . _ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Характер"™."'.? ~ :: с-сгг^гидач

протеинкиназы II типа.

Регуляторную субъединицу ш выделяли по одной и той же методике из разных объектов: из мозга быка, свиньи и человека. Она включала 3 основные стадии: кислотное и сульфатаммонийное фракционирование экстракта ткани, его ионообмвннув хроматографа) на ДЕАЕ-сефадексе А-50 и афХинную хроматографию на сдмр-сефарозв. Сравнение гомогенных препаратов нейронэльной RII животных и человека методом SDs-элэктрофорезз в 9-15% градиенте акриламидного геля показало, что RII из мозга быка и свиньи представлены одним белком М.м. 54 кДа, в то время как RII человека - двумя белками 54 и 51-52 кДа (рис. I). Судя по интенсивности окрашивания белковых полос на электрофореграмме, в очищенных препаратах rII человека обе изоформы присутствовали приблизительно в равном количестве. Молекулярная масса этих белков и их соотношение соответствуют двум изоформам Rila и RII0, ранее обнаруженным в мозге крыс. Наличие даух изоформ в очищенных препаратах rII из мозга человека подтверждает ранее опубликованные результата анализа экстрактов клеток человека.

kJ>* III«

er

-ÜL SL

-а.

Рис.1. Электрофоретический анализ субъединиц ПКИ в 9-151 градиента акриламидного геля.

1 - с-субъедшпща из мозга свиньи",

2 - ки из мозга свиньи;

3 - RII из мозга Оыкв;

4 - яи из мозга человека.

В некоторых препаратах иИ из мозга животных присутствовала примесь белка 37 кДа, который является С-концевым фрагментом молекулы иН и образуется при ее протеолитической деградации (й').

Один из препаратов RII человека был выделен, по методике, которая отличалась от стандартной только тем, что в ней отсутствовала стадия подкисления тканевого экстракта и последующего удаления выпавших белков. Электрофоретический анализ этого препарата выявил, помимо нативных Rila и Rllß, примесь двух белков, М.м. 37 и 35 кДа, По-видимому, 35 кДа белок является С-концевым фрагментом Rile. В этом случае меньшая молекулярная масса Rile обусловлена укороченностью ее молекулы в С-концевой области.

Гомогенные препараты RII связывали сamp б количестве 13-18 нмоль/мг белка, что соответствует I моль самр/моль r. Это свойство RII мозга отличает ее от RII сердечной мышцы, которая, согласно данным литературы, связывает 2 моль самр/моль r.

Для ряда экспериментов RII получали элхщией с аффинного сорбента, сАМР-сефарозы, раствором I мМ camp, затем свободный camp удаляли гельфильтрацией. RII, выделенная таким способом, не взаимодействовала с с-субъединицей, и представляла собой комплекс RII-camp.

В работе использовали препараты с-субъединицы из мозга свиньи или быка, которые были гомогенны по данным электрофоретичес-кого анализа в денатурирующих условиях, с-субъединица была представлена одним белком молекулярной массы 40 кДа (рис.1). Удельная фосфотрансферазная активность различных препаратов фермента колебалась в диапазоне от 200 до 500 нмоль/мин/мг белка. RII ин-гибировала его активность на 80-85% при молярном соотношении R/c «I.I-I.3. Присутствие camp, 10~7-10"6 М, полностью предотвращало ингибирование. Константа диссоциации R- и с-субъединиц из мозга свиньи составляла 6 нЫ, что соответствует данным литературы. Таким образом, полученные нами R- и с-субъединицы были способны образовывать холофермент, диссоциирупдий при добавлении camp. Эти результаты свидетельствуют о сохранении ими нативной конфэрмации после очистки до гомогенного состояния.

Детерминанты r-субъединицы.

rii в комплексе .с camp (rii-camp) и свободная rii из мозга свиньи были использованы ■как антигены для иммунизации кроликов. Антисыворотки к обоим препаратам образовывали одну полосу преципитации с rh и rii-camp при диффузии в агаре, что подтверждает данные электрофоретического анализа о гомогенности препаратов rii. При инкубации rii с антисыворотками в растворе она практи-

чески вся осаждалась в виде иммунного комплекса. В супернатантах проб ее оставалось лишь 8-13Ж, судя по связыванию ими camp. Эти результаты указывают на то, что антитела выработались именно на RII.

В работе были также использованы моноклонзльные антитела и клонов, полученные Шемчуковой О.Б. (ВНВДДЛ) к rII из мозга быка.

В основном у мышей выработались антитела подкласса igo2a,

ян HCKSblÜiu^a" ÜCf.? 5 Г Vi— mmifjae-«^«-.!;-. " TaGl.

Константа сродства MoAT к rII варьи1«>«ала в п" • ли

50 нМ. По данным иымуноферментного анализа (ИФА) im один из клонов не реагировал с с-субъединицей протзинкиназн.

Эпитопная специфичность всех МоАт была изучена методом конкурентного ИФА, используя МоАт I, 2, 4 и 6, меченные биотином. Результаты анализа позволили выявить 4 детерминанты на молекуле RII, к которым присоединялись МоАт следующих клонов:

1) МоАт 2 и 13; 3) МоАт 17 и 21;

2) МоАт I, 4 И 6; 4) МоАт 24, 26, 28 и 30.

МоАт 17, 21, 24, 26, 28 и 30 присоединялись только к натив-ной rii и не реагировали с ней после тепловой денатурации (rII, 0.7 мг/мл, выдерживали 5 мин. в кипящей воде). Этот факт позволяет предположить, что две последние детерминанты пространственные, а не линейные.

Политональные внтатела были использованы для определения количества детерминант на молекуле rII из мозга свиньи методом количественной преципитации (рис,2). Кривая зависимости количества преципитата от количества антигенэ в пробе имела Форму характерную для одной пары "антиген-антитело", с одним максимумом преципитата з зоне эквивалентности (рис.2А, кривая I). Наибольшее количество преципитата образовывалось при ассоциации 2.1-2.4 моль антител/моль к (at/r). Свободная rii присоединяла одинаковое количество антител при взаимодействии с обеими антиснворотками. Экстраполяция At/r в преципитатах к нулевой концентрации антигена' показала, что в избытке внтисыворотки rii может присоединять 6 молекул антител (рис.2В, кривая I). Таким образом, впервые установлено, что на молекуле нейрональной rii имеется не менее шести антигенных детерминант.

Мы не обнаружили различий в иммунохимических свойствах свободной rii и rII-camp. Присоединение camp не изменяло характера кривой количественной преципитации и количества детерминант на

Н (в составе НгСг),мкг

Рис.2.Количественная преципитация. А - количество Оелка в преципитатах, образованных антисывороткой к Ш-самр с и11 (I), яас2 (2) ии' (3). На оси абсцисс отложено количество антигена в пробе. Холофермент получали инкубацией эк-вимолярных количеств й-и с-субъединиц в течение 10 мин при 30°С. 4 - активность с-субъединицы в супернатантах проб после инкубации холофермента с антисывороткой'и удаления преципитата. Выражена в процентах к ее активности после инкубации такого же ее количества с контрольными у-глобулинами.

В - молярное соотношение антител и антигена (Ат/л) в преципитатах проб, где все взятое количество антигена осаждалось. Количество антител в преципитате рассчитывали по разности общего количества Оелка и антигена в осадке.

ее молекуле. Это позволило предположить удзлвьность детерминант от центров связывания camp на молекуле rII. ИМмунохямический анализ R', 37 кДа, подтвердил это предположение. Препарат R' образовывал преципитат с антисывороткой к rII-camp. Однако методом количественной преципитации на молекуле R' была выявлена лшь «дна детерминанта (рис. 2А и В, кривая 3). Таким образом, поли-клоналыше стттиг«.«*! п основном на детерминанты, локализованные в н-концепоЗ сб""пТИ •. - ______

Для локализации детерминант, к которым образоьэлйоь !'?*■«"-пш, rii из мозга быка расщепляли бромцианом по остаткам метиони-на. Продукты гидролиза разделяли методом sDs-электрофореза, переносили на нитроцеллюлозные фгльтры и анализировали их взаимодействие с МоАт методом иммуноблоттинга. Основным продуктом расщепления rII был белок 24-26 кДа. Если ориентироваться на положение метионина в первичной структуре rii из сердца быка, то этот пептид соответствует ее н-концевому фрагменту, содержащему I-I50 аминокислотные остатки. Низкомолекулярные пептиды представляют собой С-концевые фрагменты и продукты их неполного растепления. В иммуноблотинге все МоАт присоединялись к фрагменту 2426 кДа и, в меньшей степени, к примеси высокомолекулярных пептидов 30-33 кДа. С низкомолекулярными пептидами никакие антитела

Rabbit As

Г №

от сАМР сАМР

¡¡Вы ill I 1.1....... 1ф i iiiiiiiiiii.ij.il ii i .1 .ыфi I,I I, С

I и

-J

-1

MoAb

R'(37kDa)

Рис.3. Локализация антигенной области на молекуле R—субъбдиницы сАмр-эависимой ПКП мозга.

не реагировали. Все МоАт давали сходную картину в иммуноблотин-ге. С другой стороны, при анализе взаимодействия МоАт с нативным препаратом нП, содержавшим примесь белка 37 кДа, обнаружилось, что ни одни антитела не реагировали с к'. Реакция наблюдалась только с нативной к11.

Таким образом, МоАт присоединялись к и-концевому фрагменту нП, содержащему 1-150 аминокислотные остатки, и не взаимодействовали с ее С-концевым фрагментом, включающим 91-400 аминокислоты. Сопоставление этих данных позволяет заключить, что все МоАт выработались на детерминанты, расположенные в области 1-90 аминокислотных остатков 1*11 из мозга быка. Предполагаемая локализация иммуногенной области не молекуле нейрональной ни схематически изображена на рис.3.

Влияние антител на основные функции н-субъединицы.

а) взаимодействие с С-субъедшшцей

При количественной преципитации холофермента йгсг антисывороткой, полученной при иммунизации комплексом яП-саир, было обнаружено, что антитела по-разному реагируют со свободной пП и с ЯП в составе холоферментв. При инкубации с холоферментом к М1 присоединялось в зоне эквивалентности меньше антител (Ат/н=1.8--2.0) (рис.2В, кривая 2), чем при осаждении свободной ЛИ (Ат/и= =2.1-2.4) (рис.2В, кривая I). В избытке антител отношение Ат/к в преципитатах холофермента становилось таким же, как при осаждении свободной Ш1 (рис.2В, кривая 2), а в супернатантах проб возрастала фосфотрансферазная активность (рис.2А, кривая 3). Эти данные свидетельствуют о том, что некоторые антитела этой антисыворотки не присоединялись к йП в составе холофермента, но, взятые в избытке, вытесняли с-субъединицу и осавдали иИ.

Конкурентные отношения между с-субъединицей и частью антител, выработанных на ¡Ш-самр, были подтверждены при другой постановке опыта: сначала получали комплекс Ш с антителами, а потом определяли его способность присоединять с-субъединицу. Оказалось, что преинкубация я11 с гаь-фрагментами антител, очищенных на им-муносорбенте, предотвращала последующее образование холофермента (ряс. 4, кривая I). В присутствии каЬ-фрагментов неиммунных т-глобулинов йI ингибировэла активность с-субъединицы на 80%. После ее инкубации с гаь-фрагментами антител в соотношении I Раь/я она ингибировалз фэсфотрансферазную активность только на 47-50%.

С увеличением количества гаь-фрагментов возрастала доля активной с-субъедишщы. При соотношении 5 РаЬ/й, близком к насыщению всех детерминант, они полностью предотвращали ее ингибирование.

Таким образом, анализ взаимодействия л11 с полшслоналышми антителами позволил выявить участок на ее молекуле, присоедине-

Активцость С. %

Biii/iJ« «Л

холофермента.

1 - рдь-фрагменты антител,

выработанных на комплекс RII-CAMP.

2 - Fab-фрагменты антител, выработанных на свободную R. Зэ 100% принята активность

с-субъедяницы в отсутствие R.

Рав/К, моль/моль

ние антител к которому ингибирует образование холофермента. В свою очередь, ассоциация R- и с-субъединиц ослабляет взаимодействие с этими антителами.

Интересно, что антитела с такими свойствами мы получили только при иммунизации r-субъединицей, содержавшей прочно связанный скмр. Антитела, выработанные на свободную RII, не обладали такими свойствами. Анализ кривых количественной преципитации этих антител с холофзрментом и свободной rII выявил одинаковую зависимость Ат/r в преципитатах от количества антигена в пробе. Этот факт указывает на одинаковое сродство антител данной антисыворотки к свободной rII и rII в составе холофермента. Образование преципитата во всем диапазоне отношений At/r не сопровоя- . далось диссоциацией холофермента и возрастанием фосфотрансфераэ-ной активности в супернатанте. Feb-фрагменты антител этой антисыворотки не препятствовали образованию холофермента и ингибиро-ванию активности с-субъединици (рис.4, кривая 2). Различие между антисыворотками к rii и rII-camp по составу антител могло быть обусловлено большей стабильностью RII в комплексе с camp, а также различиями в иммунореактивности иммунизированных животных.

Б дальнейшей работе для изучения влияния антител на свойства RII использовали стандартные препараты МоАт определенной специфичности. Влияние МоАт на взаимодействие R- и с-суоъединиц оценивали по способности RII ингибировать активность с-субъединицы в присутствии антител.

Большинство МоАт (МоАт 13. 17. 21, 24, 26, 28 и 30) не влияло на образование холофермента (табл.1). В шс присутствии RII ингибировала фосфотрансферазную активность до 20-30%, как в контроле. Исключение составляют МоАт I, 2, 4 и 6, которые препятствовали образованию холофермента и снижению активности с-субъеди-ющы. Выраженность эффекта зависела от типа МоАт и соотношения At/r (табл.1). Так, МоАт 2 и 6 полностью предотвращали ингибиро-вание с-субъединицы, а МоАт I и 4 - лишь частично: в их присутствии активность с-суОьединицы снижалась до 62* и i1%, соответственно. С увеличением At/r возрастало количество свободной, активной с-субъединицы.

Ингибирование образования холофермента в присутствии МоАт I, 2, 4 и 6 подтвердило результаты, полученные при анализе поли-клональной антисыворотки к rII-camp, о наличии регуляторного участка на молекуле RIJ, присоединение антител к которому препятствует ассоциации r- и с-субъединиц. .

б) связывание camp

Влияние МоАт на способность rii связывать camp изучали при различных концентрациях camp от 0.08 до 8 дМ и при молярном соотношении MoAt/r равном 10 (табл. I).

МоАт I, 2, 4 и 6 ингибировали связывание camp. Степень ин-гибирования зависела от сродства антител к RII. Так, МоАт 6, обладавшие наибольшим сродством к RII в рассматриваемой группе антител (Кд= 50 нМ), практически полностью ингибировали связывание RII и camp во всем диапазоне его концентраций. Антитела I, 2 и 4 ингибировали связывание camp в меньшей степени. В их присутствии RII присоединяла 45-55% camp.

Антитела 17 и 21 не влияли ни на связывание camp, ни на взаимодействие R~ и с-субъединиц.

МоАт 24, 26, 28 и 30 усиливали способность RII связывать camp. Эффект был более выраженным при высокой концентрации camp. МоАт 26 увеличивали связывание R с camp в 2 раза при концентрации camp 8 мМ и соотношении At/r = 5.1. Остальные антитела этой группы увеличивали связывание camp не более, чем в 1.5 раза.

Тзллща I.

Влияние моноклональных антител на основше ¡функции rII

at/r I 3 14 10

МеАт Активность с, %

I 56 ---6Z" ------46 i IT

?. - ТУкО тпо 56i7

4 30 «~>г\ ¿1 ~ влад

6 70 100 0

13 25 28

17 15 33 I03i6

21 26 17 I24tB

24 43 26 40 I64tII

26 21 24 33 21I±53

28 22 29 I32±S

30 20 35 I65iI2

За 100» принимали активность с~субъедшшцы в пробах, не содержавших RII. В отсутствие антител RII снижала активность с-субъедшпщы до 23-25$.

Ну rao отметить, что активирующий эффект антител наблюдался только при использовании препаратов Ш1 с пониженной способностью связывать camp (0.2-0.4 моль самр/моль r) и под влиянием антител связывание возрастало только до уровня, характерного для свежеш-делегшой rII. Антитела не оказывали никакого влияния на связывание camp я-суОъедизшней, обладавшей максимально возможной активностью. По-видимому, присоединение антител к детерминанте 4 типа придает молекуле rii конформацию, оптимальную для связывания camp. На способность антител фвссировать rII в определенной кок-формации указывают также ранее опубликованные данные о<5 увеличении сродства rii к camp под действием антител.

Таким образом, нами установлено, что несмотря на удаленность иммуногенной области RII от ее функциональных центров, присоединение антител к некоторым детерминантам влияет на ее взаимодействие с с-суОъеданицей и camp. Эти данные указывают на существование регуляторннх участков в н-концевой облвсти молекулы нейро-нальной rII, присоединение к которым определенных лигандов может оказывать существенное влияние на сАМР-зависимув протеинкинаэу.

Сравнение свойств" r-субъединиц из мозга человека, быка и свиньи.

1) электрофоретический анализ RII человека и животных

Для изучения видовой специфичности нейрональной rii она была выделена в гомогенном состоянии из мозга человека, быка и свиньи. Электрофоретический анализ препаратов показал, что в мозге быка и свиньи присутствует только rii молекулярной массы 54 кДа. в то же время, в мозге человека rii представлена двумя белками, 51-52 кДа и 54 кДа (рис.1). Интерес к данному факту обусловлен тем, что согласно данным литературы, изоформа rII 51- 52 кДа участвует в регуляции пролиферации клеток. Дифференцировка клеток сопровождается увеличением количества этой изоформы и ее транслокацией в клеточное ядро (cho-chung et al.).

Анализ взаимодействия изоформ нейрональной RII человека с МоАт методом иммуноблотинга показал, что МоАт 17, 26, 28, 30 взаимодействовали как с Rilo, так и с Rile. В то же время МоАт 2 и 6 реагировали только с Rila.

2) константы диссоциации комплекса R- и с-субъединиц

Константы диссоциации комплексов rII из разных источников с

с-субъединицей из мозга свиньи определяли путем измерения активности с-субъединицы в присутствии различных количеств RII. Для rII из мозга человека и быка Кд оказалась равной 10.6 нМ и 12.9 нМ, соответственно, тогда как для rII свиньи она несколько ниже и равна 6.6 нМ. Таким образом, различие в сродстве RII разных видов к с-субъединице свиньи не превосходит 2 раз. Полученный результат позволяет предположить, что с-связывавдему участку RII не присуща сильная видовая специфичность. Константа диссоциации, полученная для субъединиц протеинкиназы из мозга свиньи, соответствует дац-ным литературы.

3)сравненив иммунохимических свойств RII человека и животных.

При изучении взаимодействия МоАт и RII были обнаружены различия в иммунологических свойствах RII из мозга человека и животных. Прежде всего, при определении титра МоАт методом ИФА' на планшетах с сорбированными RII из мозга человека, быка и свиньи, было обнаружено, что антитела большинства клонов взаимодействовали с RII снка г свиньи при большем разведении, чем с RII человека. Так, титры МоАт, определенные на RII из мозга человека, оказались в 10 раз ниже для клонов I и 26, в 100 раз ниже для клонов 2; 4; 13 и 28 и в 1000 раз - для клонов 6 и 30. Эти результаты

свидетельствуют о том, что большинство МоАт обладали меньшим сродством к rii человека, чем к nil Оыка или свиньи. Это обстоятельство позволяет предполагать существенные различия в первичной структуре RII из мозга человека и исследованных животных.

Исключение составляли МоАт 17, 21 и 24, которые практически одинаково реагировали со всеми тремя RII. По-видимому, данные игпттела вработались на видонеспецифические детермнанты, сходные у RII ттз мозга человека. Л **.' "о»'* > ' и ™ х Г" основные функции RII. Этот факт позволяет цредио.Ч'->**ть, i- г™ неспецифические детерминанты располоаены вне регуляторных участков, влияидих на функционирование протеинкиназы.

Видовая специфичность была выявлена и между нейрональными rII животных (бык и свинья). Антитела первой группы, МоАт 2 и 13, обладали более высоким сродством к гомологичному' антигену (rII быка), чем к rII из мозга свиньи. Особо следует отметить МоАт 13, титр которых, определенный с rII быка, был в 300 раз выше, чем при определении с rII других видов. Детерминанту МоАт 13 можно считать видоспецифической для rii Оыка. Ее существование указывает на отличие первичной структуры rii быка от rii из мозга человека и свиньи.

Различие в сродстве rII из мозга человека и животных к МоАт подтвердилось при изучении их влияния на образование холофермен-та. Качественно МоАт оказывали сходное воздействие на все три белка. Однако для достижения одинакового количественного эффекта в случае rII человека требовалась значительно большая концентрация антител.

Так, МоАт 2 и 6 полностью ингибировали образование холофер-мента как с RII животных, так и rII. человека. Однако, с rii быка и свиньи 100%-ное ингибирование достигалось при молярном отношении Ат/r = 3, а с rII человека - только при At/r = 13.6 (МоАт 2) и II.7 (МоАт 6). '

Частичное подавление ассоциации rii человека с с-субъединицей моноклональными антителами I проявлялось только при соотношении At/r = 14. При этом фосфэтрансферазная активность снижалась до 73.5Я. Меньшие количества этих антител (Ат/п = 2.23.3) не влияли на образование холофермента, тогда как в случав rii быка и свиньи такие количества МоАт i вызывали максимальный эффект. МоАт 13 - 30 не влияли на взаимодействие с-субъединицы с rii человека, как и в случае rii быка и свиньи.

Меньшее сродство rii человека к МоАт по сравнению с rii быка и свиньи отразилось и на эффекте активации связывания camp. Так, если связывание camp с rii быка или свиньи возрастало на 80% под действием МоАт 28 и 30, то связывание camp с rII человека в тех же условиях увеличивалось лишь на Ю-ЗОЖ. Антитела'третьей группы (МоАт 17 и 21) не влияли на связывание camp с rII человека. МоАт 6 полностью кнгибировали эту реакцию во всем диапазоне концентраций camp (0.1 - 8 мкМ), но только при молярном соотношении MoAt/r равном 14.

Таким образом, мы показали, что нейрональнзя ri1 обладает видовой специфичностью. Различия мевду RII из мозга человека и животных выражены в значительно большей степени, чем между rII из мозга быка и свиньи. Они отражают вариабельность ы-концевого фрагмента RII в области 1-90 остатков аминокислот. Существенных изменений в участках связывания camp и С-субъеданицы обнаружено не было. Интересно, что МоАт, взятые в концентрации, необходимой для присоединения к rII человека, оказывают на нее по сути такое же влияние, как и на RII быка и свиньи. Этот факт свидетельствует о том, что несмотря на вариабельность первичной структуры N-концевого фрагмента rii характер взаимодействия мевду функциональными доменами ее молекулы сохраняется в принципе неизменным.

Получение набора МоАт, обладающих разными свойствами, дает возможность их использовать для направленной и специфической регуляции активности ПК и таким образом влиять на клеточный метаболизм.

Использование антител к R-субъвдиницв в экспериментах на клетках.

Охарактеризованные поли- и моноклональные антитела были использованы нами для изучения их влияния на пролиферацию клеток лимфоидного происхождения и локализации RII в клетках.

В качестве модельной системы мы использовали клетки Т-лимфэмы человека линии Jurkat. При добавлении к этим клеткам аф-финноочищенных кроличьих антител, выработанных на rII из мозга

TPS

свиньи и меченных радиоактивным 1 г, было обнаружено, что антитела присоединяются к клеткам. Причем, эффект специфичен: нормальные г-глобулины, добавленные к клеткам в такой же концентрации, присоединялись в 5-10 раз меньшем количестве, чем антитела к RII. Анализ фракций клеточного гомогената, полученных методом

ультрацентрифугирования (ХОООООд, I час, 4°С), показал, что практически все антитела, присоедашшатеся к клеткам, обнаруживается но фракции клеточных мембран. Поскольку эти эксперименты проводились в условиях, исключающих эндоцктоз, полученные результаты позволяют заключить, что антитела присоединялись к р.П или како-ии-либо другому перекрестно реагируинему белку на поверхности

Наличие RII на nosepiruci.; и«,,«, —»,„-

гим, независимым методом с помощью проточной щ1тофлюсрс:.:зтр:;п. Клетки инкубировали с аффшшоочице иными антителами к rII и присоединившиеся антитела выявляли коныогатом ФИТЦ с антителами к igG кроликов. Контрольные пробы содержали вместо антител к RII такое же количество у-глобулинов сыворотки неиммунных кроликов.

Рис.5. Анализ взаимодействия клеток Т-лкмфомы JurXat. с антителами к rII методом проточной цитофлюорометрии. Ось aC'.iдюс представляет собой линейную шкалу интенсивности флюо-

ресцекции ¡номера каналов). Ось ординат - относительное число клеток. Обычно на приборе- анализировали не менее 20 ООО клеток, ч - гистограмма интенсивности флюоресценции клеток Jurkat, образе такных контрольными y-глобулинами;

б - гистограмма интенсивности флюоресценции клеток curkat, обработанных антителами;

в - наложение пиков флюоресценции в опытных"и контрольных пробах. Клетки, не менее 70% от общего количества обработанных.антителами к r, образовали пик, расположенный справа от контрольного.

К янтиК

а

■й

Интенсивность флюоресценции клеток Т-лимфомы, обработанных антителами к Ш, была в 2 - 6 раз выше, чем в контроле. Эти результаты подтвердили, что клетки линии Jurkat способны специфически присоединять антитела, выработанные на йИ.

Для сравнения аналогичный анализ был проведен на клетках Т-лимфомы человека линии мо1Ъ-4, не содержащих иИ, на свежевыделе иных нормальных лимфоцитах периферической крови человека и лимфоцитах, стимулированных к бласттрансформации конканавалином А, 10 мкг/мл, в течение 48 часов. Все три типа клеток, обработанных антителами в тех же условиях, что и клетки лыка!;, образовали пик фшюоресценции, который совпадал с пиком аутофлюоресценции и с пиком флюоресценции клеток после их инкубации с нормальными г-глобулинами. Таким образом, на клетках мо1Ъ-4 и на лимфоцитах человека до и после. бласттрансформации мы не обнаружили белка, способного присоединять антитела, выработанные на яН. Эти результаты подтвердили специфичность присоединения антител к клеткам линии Уигкаъ и наличие на их поверхности специфического антигена, отсутствующего на других клетках.

Мы попытались исследовать локализацию лИ методом Кунса. Однако, применение этого метода для суспензионной культуры Jurkat было затруднено не специфической флюоресценцией полилизина, который использовали в качестве подложки для прикрепления клеток. Поэтому для изучения локализации яИ были использованы культуры клеток, прикрепляющихся к подложке: фибробласты мыши линии ЗТЗ и клетки феохромацитомы крысы рс-12 нейронального цроисховдения. Чувствительность, этого метода оказалась недостаточной для достоверного выявления рецептора антител на поверхности этих клеток или доказательства его отсутствия, однако в процессе этого исследования был обнаружен интересный факт. В одиночных клетках рс-12, растущих в богатой питательной среде, Ш была обнаружена в ядрах. В то же время в клетках, культивируемых в бессывороточной среде или в присутствии сыворотки, но при высокой плотности клеток, Ш находилась в цитоплазме.

В клетках зтз аналогичных изменений локализации Ш не было обнаружено. Во всех клетках Ш была в цитоплазме на микротрубочках независимо от плотности клеточной культуры и наличия сыворотки в культуральной среде. •

Различия в локализации ЯП могли быть вызваны природой самих клеток. С другой стороны, этот факт можно объяснить

различиями в интенсивности пролиферации клеток pcxi к зтз. Ее оценивали по включению 3Н-тимидина в кислотонерастворимую фракцию

о

клеток. Расчет включения Н-тимидина на одну клетку показал, что уровень биосинтеза ДНК в клетках рс-12, содержавших RII в ядрах, был почти в 2 раза вше, чем в активно пролиферирукщих клетках зтз.

. r.„.v.,:;— - »-»пиит Tiar.TViaiîQ клетки РС-12 в присутствии ¿J 2 прэвн'ччлсч """¡Т.

культивируемые в монослое или Ое с сывороточной среде. Эти даншс указывают на связь мевду локализацией RII и пролиферативным статусом клеток и позволяют предположить участие RII в регуляции пролиферации. В последующих экспериментах мы попытались проверить это предположение, используя антитела к rII, которые обладали способностью специфически присоединяться к клеткам линии jurkat.

Влияние антител к rii на пролиферацию оценивали по включению ^Н-тимидина в кислотонерастворимую фракцию клеток Jurkat после их инкубации с антителами. Поликлональные аффинноочивдпше антитела добавляли к клеткам в конечной концентрации от 5 до 60 мкг/мл. После инкубации клеток Jurkat с антителами в течение суток включение 3Н-тимидина в них снижалось. Степень ингибирования биосинтеза ДНК зависела от концентрации антител (рис.6). При концентрации антител 50 мкг/мл биосинтез ДНК снижался до 30%, а в некоторых опытах до 10%, по сравнению с его уровнем в клетках, росших в присутствии такого же количества нормальных jr-глобулинов кролика. Инкубация клеток с антителами в течение 2-4 часов практически не влияла на их пролиферацию.

МоАт 21. 28 и 30 к RII также ингибировали биосинтез ДНК в клетках Jurkat. Однако их влияние было менее выраженным, чем ио -ликлональных антител, возможног вследствие низкого сродства МоАт. к rîî человека. МоАт I, 2, 4, 6 и 17 не оказывали никакого влияния на процесс биосинтеза ДНК в данной клеточной культуре,

, Ранее сотрудниками нашего Центра (Шемчуковой 0. и др.) Оыл установлен факт ингибирования биосинтеза ДНК клеток Т-Л1ЗДомы Jurkat моноклоналъными антителами к стафилококковому знтеротокси-ну В (seb). Согласно их данным, МоАт к ses клона ss ингибировали включение 3Н-тишшша в эти клетки на 11%. Авторы предположили, что подавление пролиферации связано с наличием белка на поверхности клеток, который перекрестно реагирует с антителами к ses а участвует в регуляции-пролиферации ' клеток. Не является ла RII

таким белком?

Мы проверили методом ИФА ее способность реагировать с МоАт к эев двух клонов, один из которых (35) ингибировал пролиферацию клеток дигка!;. Титр антител в асцитах клонов Б5 и Б1з, определен-

Рис.6. Влияние антител к RII на пролиферацию клеток Jurkat.

Концентрация антител в пробах указана на оси абсцисс. За 100$ было принято включение Зн-тимидина в клетки, инкубированные в присутствии таких же концентраций т-глобулинов неимммунной сыворотки.

ней по взаимодействию с сорбированной RII из мозга быка, оказался равным 10 и 7хЮ5, соответственно. Эти данные близки к значениям их титров в реакции с seb: ЗхЮ6 и 4х104. Полученный результат указывает на способность МоАт, выработанных на стафилококковый токсин, присоединяться к RH.

Совокупность приведенных фактов позволяет предположить, что в определенных условиях RII может быть экспонирована на поверхности клеток Т-лимфомы Jurkat и присоединение к ней лигандов, например, специфических или перекрестно реагирующих антител, отражается на пролиферативном статусе клеток.

Не последнюю роль в этих процессах играет стафилококковый энтеротоксин. Известно, что в высоких концентрациях, 10~7- Ю_9М,

ses окаэыьает токсический эффэкт на Т-лимфоцити, а в концентрации Ю-9- Ю-1*М индуцирует лимфокитшй каскад и пролиферацию этих клеток. Токсическое и митогекное влияние seb реализуются разними регуляторными системами клетки. Чтобы еыяснить, связана ли rII с какой-либо из этих систем, мы исследовали влияние антител к rII на развитие токсического и митогенного эффекта seb.

Инкубация клеток Jurkat, I млн/мл, в течение суток с seb, О,£,5xIGZ^ZZ-Z""* " ""»»»тпш, „ яйж по

сравнению с клетками, pocsiaui о^о ¿ы. па

регуляторную субъединицу в концентрации от 12,5 до 50 мкг/мл к клеткам, обработанным токсином, не влияло на этот процесс. По-видимому, RII (ига белок, перекрестно реагирующий с антителами к r) не принимает участия в реализации токсического эф£екта seb.

Митогенный эффект seb воспроизвели при инкубации клеток Jur-kat в течение двух суток с 0,25 xI0_IIM токсина. Инкубация в течение одних суток не отражалась на пролиферации клеток. Добавление антител, 12.5 мкг/мл, к клеткам одновременно с токсином ускоряло развитие митогенного эф£екта. В их присутствии пролиферация клеток возрастала в 2 раза уже через сутки. Кроме того, антитела к rii усиливали митогенный эффект энтеротоксинз. Через двое суток культивирования клеток в присутствии обоих агентов уровень биосинтеза ДНК в них был в 2.6 раз выше, чем в клетках, к которым был добавлен только seb.

Влияние антител, направленных к rII, на пролиферацию клеток, обработанных токсином, зависело от концентрации токсина и длительности его контакта с клетками.

Интересный результат действия антител был получен при длительном культивировании меток после их однократной обработки токсином в очень низкой концентрации - 2.5 fM. Добавление антител через 2 недели после внесения токсина в среду культивирования приводило к ингибировани» пролиферации клеток на 30%. Способность антител к RII ингибировать пролиферацию клеток Jurkat поело их контакта с токсином в очень низкой концентрации сохранялась в течение месяца. В этом случае включение Зн-тамидина в клетки под действием антител снижалось до 50%.

Иммуноферментный анализ взаимодействия seb с антителами, выработанными на rII, показал, что они не присоединяются к токсину, сорбированному на планшете. Поэтому представляется маловероятным, что совместное влияние антител и токсина на клетки обус-

ловлею воздействием антител на токсин. Можно предположить, что стафилококковый токсин в низкой концентрации способен индуцировать появление R.II на поверхности клеток Т-лимфомы. Экспонированный белок доступен действию антител в течение длительного времени, не менее месяца, после контакта клеток с токсином. Присоединение антител, выработанных на RII или seb, к этому белку подавляет пролиферацию клеток Т-лимфомы.

ВЫВОДЫ

• 1. Выделены в гомогенном состоянии каталитическая и регуля-торная субъединицы сАМР-зависимой протеинкиназы II типа из мозга человека, быка и свиньи.

2. Регуляторная субъединица II типа мозга человека представлена двумя изоформами молекулярной массы 51-52 кДа (Rile) и 54 кДа (Rlloi) :и отличается по иммунохимическим свойствам от RII из мозга быка и свиньи.

3. Получены и охарактеризованы моноспецифические поликлона льные кроличьи антитела двух типов к RII свиньи и и клонов моноклональных антител к RII быка.

4. На молекуле RII имеется не менее 6 антигенных детерминант. Они локализованы в n-концевом фрагменте молекулы белка.

5. На молекуле rii выявлена детерминанта, присоединение антител к которой ингибировало образование холофермента из субъади-ниц протеинкиназы.

6. Моноклональные антитела, выработанные к другой детерминанте, придавала RII конформацию, способствующую связыванию с amp.

7. Антитела к регуляторной субъединице в определенных условиях вызывали торможение пролиферации клеток линии Turkat Т-лимфомы человека, факт, ранее описанный, для антител к стафилококковому токсину, перекрестно реагирующих с регуляторной субъединицей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Гроздова И.Д., Мамаева Е.Г., Свешникова Е.В. Активность про-теинкиназ в опухолях человека - vi Всесоюзный симпозиум "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции фер- , ментативных реакций" - Петрозаводск, 1988, стр.28.

2. Гроздова и.Д., Ншенко Е.В., Свешникова Е.В., Северин Е.С.

Иммунохимическив свойства регуляторной суОъодишщы самр-зовнси-мой протеинкиназн II типа - Биохимия, 1990, т.55, стр.1244-1250. 3. Гроздова И.Д., Свешникова К.В. Иммунохимическое картирование регуляторной субъединицы санр-зэвисимой протеинкиназн на плазматической мембране лимфомц Jurkat - Всесоюзный симпозиум "Еиохи-ш опухолевой клетки", Минск, 1990.

1.' Ягом«»* i.u.. ____—- о Proliferation of т-lyrophoma

Jurkat colls ie inhibited "it" i-«bbit — и»

dependent protein kinase regulatory subunit type n the surfase of these cells - International symposium on iramuno-therapeutic prospects oi infectious diseases - Berlin (West), 1990, p.142.

5. Grozdova I.D., Kolesnikova O.O., Koroljova L.H., Shemchukova O.B., Sveshnikova E.V., Sveshnikov P.G. Antibodies' to the regulatory subunit of cAMP-dependent protein kinase type II from bovine brain inhibit the holoenzyroe formation - Biochemistry International, 1992, v.27, p.811-622.