Иммуномодуляторы на основе мурамилпептидов и бактериальной ДНК: от эксперимента к клинике

Пащенков, Михаил Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммуномодуляторы на основе мурамилпептидов и бактериальной ДНК: от эксперимента к клинике
ВАК РФ 03.03.03, Иммунология

Автореферат диссертации по теме "Иммуномодуляторы на основе мурамилпептидов и бактериальной ДНК: от эксперимента к клинике"

На правах рукописи

ПАЩЕНКОВ МИХАИЛ ВЛАДИМИРОВИЧ

ИММУНОМОДУЛЯТОРЫ НА ОСНОВЕ МУР АМИЛ ПЕПТИДОВ И БАКТЕРИАЛЬНОЙ ДНК: ОТ ЭКСПЕРИМЕНТА К КЛИНИКЕ

03.03.03 — Иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

21 П0Я 20)3

005539037

Москва, 2013 г.

005539037

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства

Научный консультант:

Доктор медицинских наук, профессор Пинегин Борис Владимирович Официальные оппоненты:

Атауллаханов Равшан Иноятович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Казанский Дмитрий Борисович, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией механизмов регуляции иммунитета НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН

Козлов Иван Генрихович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии педиатрического факультета, проректор по научной работе и инновационному развитию ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России

Ведущая организация: ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского» Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится «25» декабря 2013 г. в 14°° ч на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу: 115478 Москва, Каширское шоссе, д. 24, к. 2. Факс: (499) 6171027

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу: 115478 Москва, Каширское шоссе, д. 24, к. 2.

Автореферат разослан « .» /¿¿7с1?0у2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук Гудима Георгий Олегович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность

Разработка препаратов, направленных на повышение резистентности организма против инфекций и на отторжение злокачественных опухолей является важной, актуальной задачей. Это обусловлено ростом частоты инфекций, вызванных антибиотикоустойчивыми штаммами бактерий (Gould, 2008), ростом частоты хронических инфекционно-воспалительных заболеваний, сопровождающихся вторичными иммунодефицитами, ростом частоты злокачественных новообразований.

Повышение резистентности против инфекций может быть достигнуто путем стимуляции как адаптивного, так и врожденного компонентов иммунной системы. Вакцины активируют адаптивный иммунитет и обеспечивают длительную специфическую защиту, которая, однако, развивается медленно (в течение недель) и эффективна только против одного вида микроорганизмов. Активаторы врожденного иммунитета обладают двумя преимуществами по сравнению с вакцинами: более быстрым развитием защитного эффекта (в течение часов и дней) и относительной неспецифичностью действия (один препарат может быть эффективен против одного или даже нескольких классов микроорганизмов). Поэтому активаторы врожденного иммунитета являются средствами не только профилактики, но и лечения инфекций. В отличие от антибиотиков, активаторы врожденного иммунитета не действуют непосредственно на микробы и не вызывают у последних развития лекарственной устойчивости. Кроме того, правильно подобранные препараты этой группы позволяют частично или полностью восстановить нарушенную функцию иммунитета у пациентов с вторичными иммунодефицитами, по крайней мере на время лечения антибиотиками.

Наилучшими из известных на сегодня активаторов врожденного иммунитета являются иммуномодуляторы бактериального происхождения. Они относятся в основном к двум группам: 1) мурамилпептиды и их синтетические аналоги; 2) нуклеиновые кислоты и их синтетические аналоги. Учитывая разнообразие микроорганизмов, какого-либо универсального иммуномодулятора «против всех инфекций», вероятно, не существует. Однако поиск препаратов, дающих оптимальную защиту против определенных видов и классов патогенов, оправдан и пока далек от завершения.

Мурамилпептиды представляют собой мономерные фрагменты пептидогликана (ПГ) бактерий. Все известные на сегодня мурамилпептидные иммуномодуляторы, в том числе отечественный препарат Ликопид, являются аналогами мурамилдипептида, который активирует врожденный иммунитет через рецептор NOD2 (Girardin et al, 2003; Meshcheryakova et al, 2007). В то

же время мурамилпептиды грамотрицательных бактерий обладают структурной особенностью, а именно содержат в 3-м положении пептидной части остаток мезо-диаминопимелиновой кислоты (мезо-ДАП). Такие мурамилпептиды распознаются рецептором NOD1 (Chamaillard et al, 2003). По данным литературы, агонисты NOD1 являются более эффективными активаторами системы фагоцитов, чем агонисты NOD2, и поэтому лучше защищают от бактериальных инфекций (Clarke et al, 2010). Однако возможности терапевтического применения мурамилпептадой грамотрицательных бактерий, активирующих рецептор NOD1, практически не исследованы. Недостаточно изучены механизмы действия этих мурамилпептидов на клетки врожденной и адаптивной иммунной системы и на организм человека в целом, не охарактеризована возможная терапевтическая эффективность при инфекционно-воспалительных заболеваниях.

Вторая область применения активаторов врожденного иммунитета — лечение онкологических заболеваний. Целью иммуномодулирующей терапией в этом случае является разрыв выгодных для опухоли взаимоотношений с иммунной системой, активация клеток-эффекторов противоопухолевого иммунитета. В этом отношении привлекательны синтетические олигодезоксинуклеотиды (ОДН), содержащие тандемы «неметилированный цитозин — гуанин» (CpG). Эти соединения представляют собой синтетические аналоги бактериальной ДНК (Krieg et al, 1995). CpG-ОДН обладают несколькими видами противоопухолевой активности: вызывают выработку интерферонов (ИФН) I типа, которые обладают антипролиферативным и иммунодулирующим действием; посредством ИФН вызывают активацию противоопухолевых эффекторов — NK-клеток, CD8 Т-клеток; вызывают созревание плазмацитоидных предендритных клеток (ппДК), что способствует индукции адаптивного иммунного ответа против опухоли (Krieg et al, 2002). В доклинических испытаниях на животных показана противоопухолевая активность CpG-ОДН in vivo, тогда как в I фазе клинических испытаний показана безопасность CpG-ОДН у человека (Krieg et al, 2004). Однако терапевтическая эффективность CpG-ОДН у пациентов со злокачественными опухолями не изучена. Не решен принципиальный вопрос: возможно ли путем активации врожденной иммунной системы с помощью CpG-ОДН добиться регресса злокачественной опухоли у человека. Не охарактеризованы механизмы действия CpG-ОДН при злокачественных новообразованиях, биомаркеры ответа иммунной системы на CpG-ОДН, предикторы возможной клинической эффективности CpG-ОДН.

Бактериальная ДНК, помимо активации врожденного иммунитета, может выступать и в другом качестве — как носитель (вектор) генотерапевтического воздействия. Традиционные бактериальные иммуномодуляторы, воздействуя на клетки иммунной системы, вызывают изменение экспрессии сотен генов. Генотерапия представляет собой принципиально иной подход к иммуномодуляции, поскольку позволяет более тонко влиять на отдельные процессы в иммунной системе путем изменения экспрессии отдельных генов. Одним из таких процессов является миграция клеток, которая контролируется хемокинами (цитокинами-хемоатграктантами). Регулирование миграции путем трансгенной экспрессии хемокинов, достигаемой с помощью бактериальных векторов, можно рассматривать как способ иммуномодулирующего воздействия. Однако возможности этого подхода практически не изучены. В частности, одним из ключевых хемокинов, регулирующих миграцию клеток врожденной и адаптивной иммунной системы, является CCL21 (von Andrian, Mempel, 2003). Неизвестно, можно ли с помощью плазмидных векторов добиться значимой экспрессии CCL21 in vivo. Неизвестны кинетика и распределение трансгенного белка в организме. Неизвестно, какое влияние может оказывать трансгенный CCL21 на миграцию клеток в месте экспрессии и во вторичных лимфоидных органах.

Цели и задачи

Цель работы — изучение механизмов действия и терапевтической эффективности иммуномодуляторов бактериального происхождения на основе мурамилпептидов, бактериальной ДНК и ее синтетических аналогов.

Задачи:

1. Изучить иммунобиологические свойства мурамилпептидов грамотрицательных бактерий.

2. Изучить терапевтическую эффективность мурамилпептидов грамотрицательных бактерий в клинических испытаниях.

3. Изучить терапевтическую эффективность и механизмы действия синтетического олигодезоксинуклеотида, содержащего неметилированные тандемы цитозин-гуанин (CpG-олигодезоксинуклеотида), в клинических испытаниях при метастатической меланоме.

4. Изучить возможность применения бактериальной плазмидной ДНК как носителя геноспецифического иммуномодулирующего воздействия (на модели регулирования миграции клеток иммунной системы путем трансгенной экспрессии хемокина CCL21, достигаемой с помощью плазмидных векторов).

Научная новизна

В работе получены новые данные о возможностях клинического применения и механизмах действия мурамилпептидов и CpG-ОДН; предложен принципиально новый подход к иммуномодуляции, основанный на временной трансгенной экспрессии хемокинов.

В частности, впервые систематически изучены иммунобиологические свойства естественных мурамилпептидов грамотрицательных бактерий, содержащих остаток мезо-ДАП. Впервые показано, . что иммуностимулирующей активностью обладают мурамилпептиды, содержащие остаток мезо-ДАП как в концевом положении (глюкозаминилмурамилтрипептид [ГМтри]), так и внутри олигопептидной цепи (глюкозаминилмурамилтетрапептид . [ГМтетра] и его димер [диГМтетра]). .

Впервые охарактеризован рецепторный аппарат и сигнальные пути, участвующие в активации клеток под действием диГМтетра. В отличие от мономерного мурамилпептида ГМтри, который распознается преимущественно через NOD1, в распознавании диГМтетра участвуют рецепторы NODI, NOD2 и TLR2. С помощью ингибиторного анализа показано, что оба мурамилпептида активируют сигнальную цепочку RIP2 — IKK — NF-кВ, а также киназу р38.

На основе этих предпосылок впервые создан иммуномодулирующий препарат, представляющий собой комплекс мурамилпептидов (КМП) грамотрицательных бактерий (ГМтри + ГМтетра + диГМтетра). Впервые показано, что КМП активирует систему фагоцитов у экспериментальных мышей и обладает выраженным протективным действием против бактериальных инфекций. В рамках клинических испытаний указанного комплекса мурамилпептидов впервые изучено влияние агонистов NOD1 на иммунную систему человека in vivo. Показано, что при введении здоровым добровольцам препарат усиливает бактерицидность лейкоцитов, индуцирует выработку провоспалительных цито- и хемокинов, С-реактивного белка, IgM. Впервые показано, что лабораторными маркерами ответа на а, мурамилпептиды грамотрицательных бактерий у человека могут служить уровни хемокинов CCL4 (MIP-ip) и CCL2 (МСР-1), цитокина ИЛ-6, а также С-реактивного белка в сыворотке. Во ПЛП фазе клинических испытаний впервые показано, что КМП грамотрицательных бактерий обладает терапевтическим действием у пациентов с гнойной инфекцией, ускоряет их выздоровление при добавлении к стандартному лечению (хирургическая операция + антибиотикотерапия).

Впервые обнаружено, что миелоидные ДК при стимуляции мурамилпептидами секретируют существенно более низкие количества провоспалительных цито- и хемокинов, чем макрофаги (МФ) при тех же

условиях стимуляции, что обусловлено минимум двумя факторами: ранним -прекращением экспрессии генов провоспалительных цитокинов и относительной неэффективностью трансляции мРНК провоспалительных цитокинов в ДК, стимулированных мурамилпептидами. Впервые показано усиливающее действие интерлейкина-ip на секрецию цитокинов ДК при стимуляции мурамилпептидами.

Показано, что in vitro мурамилпептиды грамотрицательных бактерий вызывают толерантность макрофагов к различным мурамилпептидам, но не индуцируют перекрестную толерантность к липополисахариду (ЛПС). В то же время мурамилпептиды не влияют на ЛПС-индуцированную толерантность к ЛПС, что обосновывает возможность сочетанного применения мурамилпептидов и ЛПС для профилактики септического шока.

Впервые обнаружены антигенные и иммуногенные свойства диГМтетра, изучены кинетика, изотопический состав и эпитопная специфичность антител (AT) к диГМтетра, показаны их защитные свойства на модели летальной инфекции грамотрицательными бактериями.

Впервые показана принципиальная возможность добиться регресса метастатической меланомы, вплоть до индукции длительной ремиссии, с помощью агонистов рецептора TLR9 — CpG-ОДН. Впервые всесторонне изучены иммунологические эффекты, индуцируемые CpG-ОДН у пациентов с метастатической меланомой. Впервые показано, что CpG-ОДН при введении пациентам с меланомой вызывает продукцию ИФН I типа, активацию ппДК, повышение уровней циркулирующих ранних плазматических клеток, снижение уровней циркулирующих NK-клеток, а также — у части пациентов — повышение NK-активности. Впервые показано, что терапевтическая активность CpG-ОДН при меланоме ассоциирована с повышением NK-активности, что позволяет рассматривать цепочку «CpG-ОДН — ппДК — цитокины (ИФН I типа) — NK-клетки» в качестве одного из основных механизмов противоопухолевого действия CpG-ОДН. Впервые охарактеризованы изменения в лимфатических узлах (ЛУ), дренирующих места подкожного введения CpG-ОДН, показана роль ЛУ в механизмах действия CpG-ОДН. Впервые выдвинуто предположение о том, что Treg-клетки блокируют некоторые иммуномодулирующие эффекты CpG-ОДН, что позволяет рассматривать деплецию Treg-клеток как способ повышения терапевтической активности CpG-ОДН.

Впервые показана принципиальная возможность дистанционно управлять клеточным составом регионарных лимфатических узлов (ЛУ) путем трансгенной экспрессии хемокинов в эпидермисе. Впервые получены плазмидные конструкции, позволяющие экспрессировать в эукариотических клетках хемокин CCL21 и маркерный белок EGFP (как раздельно, так и в виде гибридного белка), что позволяет отслеживать трансфицированные

клетки и оценивать внутриклеточное распределение трансгенного ССЬ21. Показано, что внутрикожное введение этих конструкций с помощью технологии генного ружья позволяет добиться высокой экспрессии хемокина ССЬ21 в эпидермисе, которая длится несколько суток. Впервые показано, что трансгенный ССЬ21, экспрессируемый в эпидермисе, доставляется с током лимфы в регионарные ЛУ и накапливается в них в высокой, физиологически значимой концентрации. Впервые показано, что трансгенный ССЬ21, транспортирующийся в ЛУ, влияет на клеточный состав ЛУ, в частности, усиливает накопление в этих ЛУ зрелых ДК и наивных Т-клеток. Кроме того, впервые обнаружена способность ССЬ21 усиливать макропиноцитоз и экспрессию СБ40 на ДК.

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая значимость работы состоит в обнаружении новых свойств и механизмов действия иммуномодуляторов бактериального происхождения. Во-первых, обнаружены новые аспекты влияния мурамилпептидов на врожденный и адаптивный иммунитет: уточнены механизмы распознавания мурамилпептидов грамотрицательных бактерий клетками врожденной иммунной системы человека; описаны особенности экспрессии и секреции провоспалительных цитокинов клетками врожденной иммунной системы человека при воздействии мурамилпептидов; описана способность мурамилпептидов грамотрицательных бактерий усиливать резистентность к грамположительным бактериям; обнаружена иммуногенность более сложных по структуре мурамилпептидов грамотрицательных бактерий, таких как диГМтетра, которая проявляется при иммунизации высокими дозами этих соединений; продемонстрированы защитные свойства АТ против таких мурамилпептидов. В целом, эти результаты расширяют понимание механизмов действия мурамилпептидных иммуномодуляторов. Во-вторых, показана принципиальная возможность добиться регресса меланомы с помощью активатора врожденного иммунитета — Срв-ОДН, высказано предположение о механизмах противоопухолевого действия этого класса соединений. В-третьих, показана эффективность генотерапевтического подхода к иммуномодуляции с использованием бактериальных векторов.

Основной практический результат — создание нового иммуномодулятора «Полимурамил», представляющего собой комплекс мурамилпептидов грамотрицательных бактерий. По результатам клинических испытаний, «Полимурамил» рекомендуется к применению в сочетании со стандартной терапией гнойных хирургических инфекций и гнойных инфекций кожи. Препарат улучшает общие результаты лечения, ускоряет разрешение воспаления, заживление раневых дефектов.

Субстанция «Полимурамил» включена в Государственный реестр лекарственных средств РФ под № ФС-000557, лекарственный препарат «Полимурамил» — под № ЛП-002069.

Результаты работы позволяют рассматривать вопрос о повышении разовой и курсовой дозы «Полимурамила», а также о расширении показаний к применению препарата. Кроме того, полученные в работе новые теоретические данные о свойствах мурамилпептидов могут быть использованы для создания семейства препаратов, являющихся как «чистыми» иммуномодуляторами (ГМтри, ГМтетра и их возможные аналоги), так и антибактериальными вакцинами широкого спектра действия (диГМтетра).

Уровни ССЬ4 (МГР-1|3), ССЬ2 (МСР-1), ИЛ-6 и С-реактивного белка в сыворотке являются биологическими маркерами ответа врожденной иммунной системы на мурамилпептиды грамотрицательных бактерий. Эти показатели могут использоваться для лабораторного мониторинга иммунного ответа при клинических испытаниях мурамилпептидных препаратов.

Подтверждено, что мурамилпептиды не индуцируют секрецию ТЫ- и ТЪ17-инструктивных цитокинов антигенпредставляющими клетками, что следует учитывать при использовании мурамилпептидов в качестве иммунологических адъювантов в вакцинах.

Показано, что СрО-ОДН в качестве монопрепаратов обладают объективной противоопухолевой активностью у части пациентов с метастатической меланомой, что дает основание для клинического применения этого класса препаратов. Полученные данные могут быть использованы в качестве отправной точки при оптимизации режима введения СрО-ОДН, а также при разработке способов применения СрО-ОДН при других злокачественных опухолях. Результаты работы показывают, что применение СрО-ОДН, вероятно, необходимо сочетать с деплецией Тгед-клеток, с тем чтобы повысить активирующее влияние СрО-ОДН на адаптивный иммунный ответ. В работе идентифицированы показатели иммунной системы, которые могут быть использованы для предварительного отбора пациентов, у которых терапия СрО-ОДН будет наиболее эффективна.

Идентифицированы биологические маркеры активации иммунной системы под действием СрО-ОДН: 1) активность 2'5'-олигоаденилатсинтазы в сыворотке; 2) уровень ранних плазматических клеток (СВ19+СВ38ь'гК) в крови. Эти показатели могут использоваться для иммуномониторинга при последующих клинических испытаниях СрО-ОДН. Динамика МС-активности мононуклеарных клеток крови, нормализованная на процентное содержание ИК-клеток, может быть использована как лабораторный показатель при оценке клинической эффективности СрО-ОДН в ходе терапии.

Технология дистанционного управления клеточным составом ЛУ с помощью трансгенной экспрессии хемокинов в эпидермисе может применяться в эксперименте для регулирования миграции различных клеток иммунной системы. Полученные данные позволяют разрабатывать эту технологию в практических целях в качестве средства, повышающего эффективность профилактической и лечебной вакцинации. Обработка дендритных клеток хемокином ССЬ21 может использоваться для усиления поглощения антигенов при приготовлении дендритно-клеточных вакцин.

Положения, выносимые на защиту

1. Мурамилпептиды грамотрицательных бактерий индуцируют комплекс защитных реакций врожденного иммунитета, приводящий к повышению резистентности против бактериальных инфекций.

2. Лекарственный препарат, представляющий собой комплекс мурамилпептидов грамотрицательных бактерий, обладает объективной иммунологической и клинической эффективностью у человека.

3. СрО-ОДН обладают объективной иммунологической и клинической эффективностью у пациентов с метастатической меланомой. Механизм противоопухолевого действия Срв-ОДН при меланоме связан с повышением Ж-активности в процессе лечения.

4. Временная трансгенная экспрессия хемокина ССЬ21 в эпидермисе является инструментом, позволяющим регулировать численность дендритных клеток и Т-клеток в регионарных ЛУ.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на ежегодной конференции Американского Общества клинической онкологии (2004); 65-й, 66-й ежегодных конференциях по исследованиям в дерматологии (2004, 2005); 31-й, 32-й, 34-й, 38-й ежегодных конференциях Комитета по дерматологическим исследованиям (2004, 2005, 2007, 2011); 35-й и 36-й ежегодных конференциях Европейского общества дерматологических исследований (2005, 2006); Международной конференции по исследованиям в дерматологии (2008, Эдинбург); XI Международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (2011, Казань); XIX и XX Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (2012, 2013, Москва); объединенном иммунологическом форуме (2013, Нижний Новгород).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 34 печатных работы, из них 20 статей в 11 научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки для

публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций («Иммунология», «Российский аллергологический журнал», «Российский иммунологический журнал», «Медицинская иммунология», «Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии», «Цитокины и воспаление», «Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова», Journal of Clinical Oncology, Journal of Investigative Dermatology, Brain Pathology, International Immunopharmacology), 1 патент, 2 статьи в научных журналах, 1 методическое пособие, 10 публикаций в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 246 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы, 52 рисунка. Диссертация включает следующие разделы: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты собственных исследований, Обсуждение, Выводы, Список литературы. Библиография включает 406 источников, в том числе 25 отечественных и 381 зарубежный.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

КМП грамотрицательных бактерий, очищенный от других компонентов бактерий, был получен в лаборатории препаративной биохимии ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА» путем многократной фенольной экстракции пептидогликана S. typhi, его гидролиза в присутствии лизоцима, с последующим диализом продуктов реакции через мембрану с размером отсечки 5 кДа. Диализат содержал три мурамилпептида: 1) N-anemn-D-глюкозаминил-Р( 1 —И)-№ацетил-0-мурамоил-Ъ-аланил-0-изоглютамил-мезо-диаминопимелиновую кислоту (ГМтри), 2) №ацетил-0-глюкозаминил-ß( 1 —>4)-Н-ацетил-Б-мурамоил-Ь-аланил-В-изоглютамил-мезо-диаминопимелоил-О-аланин (ГМтетра) и 3) димер ГМтетра (диГМтетра), в котором мономерные остатки ГМтетра соеднинены путем амидной связи между карбоксильной группой терминального D-аланина одного остатка ГМтетра и ш-аминогруппой мезо-диаминопимелиновой кислоты другого остатка ГМтетра (Pashenkov et al, 2010). Выделение химически чистых мурамилпептидов из КМП проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Химическую структуру компонентов верифицировали с помощью масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии.

Исследование свойств мурамилпептидов in vitro проводили на культурах МФ и миелоидных ДК человека, полученных согласно общепринятым методикам из моноцитов крови здоровых доноров (Sallusto et al, 1994). Длительность стимуляции клеток мурамилпептидами составляла от 3 до 24 ч., концентрация мурамилпептидов — от 0,1 до 100 мкг/мл. В качестве внутреннего контроля использовали липополисахарид (ЛПС) Е. coli 0111:В4. Для определения экспрессии мРНК цитокинов и других генов

использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени. В ПЦР использовали либо валидированные тест-системы (Applied Biosystems, США), либо, если праймеры конструировали самостоятельно, то специфичность амплификации проверяли в предварительных экспериментах путем гель-электрофореза и анализа кривых плавления. Секрецию цитокинов и хемокинов исследовали с помощью иммуноферментного . и мультиплексного анализа. Экспрессию молекул антигенпредставления и костимуляции исследовали с помощью иммунофлюоресцентного окрашивания и проточной цитометрии. Аллостимулирующую способность ДК оценивали путем сокультивирования с аллогенными наивными Т-хелперами, с оценкой пролиферативного ответа последних через 120 ч. после начала сокультивирования. Для подавления экспрессии (нокдауна) рецепторов врожденной иммунной системы NODI, NOD2 и TLR2 использовали РНК-интерференцию (Opitz et al, 2005); эффективность нокдауна оценивали с помощью ПЦР в реальном времени (определение мРНК целевых и нецелевых генов) и проточной цитометрии (определение экспрессии TLR2 на поверхности клеток). Для изучения сигнальных путей, активируемых мурамилпептидами, использовали апробированные, специфические низкомолекулярные ингибиторы компонентов сигнальных путей. Толерантность МФ к мурамилпептидам и ЛПС индуцировали путем 24-часового культивирования с различными дозами соответствующих агонистов; наступление толерантности оценивали по продукции ФНО при повторной 24-часовой стимуляции МФ теми же или другими агонистами. Все эксперименты были выполнены не менее, чем на 4 независимых биологических образцах, в большинстве случаев — на 5 и более образцах.

Доклинические испытания иммунотропной активности КМП проводили на мышах Fl (C57/BL6 х СВА1ас) массой 18-20 г. Влияние препарата на бакгерицидность лейкоцитов перитонеального экссудата исследовали с помощью проточной цитометрии (Dambaeva et al, 2003), влияние на уровни цитокинов в сыворотке — с помощью ИФА, влияние на антибактериальную резистентность — путем оценки выживаемости мышей при заражении летальными дозами бактерий. Уровень AT к КМП и их отдельных изотипов в сыворотках оценивали с помощью ИФА. Все эксперименты были поставлены на группах из 5 мышей на группу/точку и более, при оценке выживаемости использовали 10 мышей на группу.

Все протоколы клинических испытаний были одобрены соответствующими регулирующими органами. I фаза клинических испытаний КМП (препарата «Полимурамил») была проведена на базе Отделения аллергии и иммунопатологии кожи ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА». 4 различных режима введения препарата были исследованы на 28 здоровых добровольцах. Использовали стандартные критерии включения и исключения, а также стандартный комплекс методов для выявления нежелательных явлений. В ходе работы оценивали влияние препарата на ключевые показатели иммунного статуса, в частности на бактерицидность лейкоцитов крови (проточная цитометрия), уровни цитокинов и хемокинов в

сыворотке (мультиплексный анализ), уровни иммуноглобулинов и С-реактивного белка в сыворотке (нефелометрия), уровни ауто-АТ и AT к препарату (ИФА).

ПЛП фаза клинических испытаний препарата «Полимурамил» была проведена на базе ГКБ №15 им. О.М.Филатова г.Москвы и кафедры факультетской хирургии с курсом анестезиологии и реаниматологии Рязанского государственного медицинского университета им. академика И.П.Павлова. Исследовано 2 группы пациентов с гнойными хирургическими инфекциями, каждая по 30 человек: первая группа получала стандартное лечение (хирургическая операция + антибиотикотерапия), вторая группа — стандартное лечение + Полимурамил. Эффективность препарата регистрировали квалифицированные хирурги по апробированным шкалам объективной и субъективной оценки. В ходе работы проводили мониторинг ключевых показателей иммунного статуса (см. выше).

CpG-ОДН 7909 представляет собой полностью фосфоротиоатный ОДН с последовательностью 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3\ где неметилированные CpG-тандемы выделены подчеркиванием (Krieg et al, 2004). Клинические испытания CpG-ОДН 7909 проводились на базе б клинических центров Австрии и Германии. Исследование представляло собой открытые, неконтролируемые, мультицентровые испытания II фазы. В испытаниях участвовали 20 пациентов с метастатической меланомой (IIIB-IV стадии). Препарат вводили по 6 мг подкожно 1 раз в неделю, по возможности в область ЛУ, дренирующих кожно-подкожные метастазы (Pashenkov et al, 2006). Клиническую эффективность препарата оценивали квалифицированные специалисты по лучевой диагностике и дерматоонкологи. Показатели иммунного статуса, имеющие отношение к предполагаемым механизмам действия препарата, исследовали до начала лечения и на 8-й неделе. Для исследования субпопуляционного состава лимфоцитов крови и синтеза цитокинов лимфоцитами крови использовали иммунофлюоресцентное окрашивание и проточную цитометрию, для исследования клеточного состава лимфатических узлов — лазерную конфокальную микроскопию. Для исследования активности NK-клеток использовали стандартную клеточную линию-мишень — К562. Для исследования экспрессии генов в ЛУ и в опухолевой ткани применяли ПЦР в реальном времени, с использованием валидированных тест-систем (Applied Biosystems). Т-клетки, специфичные к антигенам меланомы, выявляли по секреции ими ИФН-гамма в тесте ELISPOT. Растворимые факторы в сыворотках исследовали с помощью ИФА и радиоиммунного анализа. Для изучения влияния Treg-клеток на пролиферативный ответ Т-клеток производили деплецию CD25hlgh Treg-клеток с помощью иммуномагнитных частиц (Miltenyi Biotech, Германия).

Для изучения влияния временной трансгенной экспрессии хемокина CCL21 в коже на клеточный состав регионарных ЛУ использовали плазмидные векторы, содержащие кДНК гена CCL21a мыши и к ДНК маркерного белка EGFP. Векторы позволяли экспрессировать как два белка

независимо, так и гибридный белок (Jalili et al, 2010). Экспрессию и секрецию трансгенов in vitro подтверждали с помощью иммуноцитохимии, конфокальной микроскопии, Вестерн-блотгинга и иммуноферментного анализа. Для подтверждения хемотактической активности секретируемого CCL21 использовали систему Transwell, в качестве клеток-мишеней использовали спленоциты мыши. Для введения плазмидных векторов in vivo (внутрикожно) применяли технологию генного ружья. Экспрессию трансгена in vivo подтверждали методами иммуногистохимии и конфокальной микроскопии. Уровни CCL21 в регионарных ЛУ оценивали с помощью ИФА тканевых лизатов, клеточный состав ЛУ анализировали с помощью проточной цитометрии. Для подтверждения результатов использовали также модель адоптивного переноса спленоцитов, меченных флюоресцентной меткой (карбоксифлюоресцеином). Все опыты повторяли не менее 3 раз, в каждом опыте использовали не менее 3 мышей на группу/точку.

Статистика. При сравнении двух независимых групп использовали U-тест Манна—Уитни. При сравнении парных измерений использовали тест Уилкоксона; если количество измерений было менее 5, то использовали парный t-тест. При множественных сравнениях достоверность различий вначале тестировали в ANOVA; при получении р < 0,05 различия в парах групп выявляли с помощью тестов Манна—Уитни или Уилкоксона. Доли сравнивали с помощью критерия у2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Развитие иммуномодуляторов бактериального происхождения шло по пути упрощения химического состава, избавления от ненужной белковой (антигенной) нагрузки. Бактериальными иммуномодуляторами первого поколения были живые и убитые бактерии (Coley, 1910), затем появились нефракционированные лизаты бактерий (Foissin et al, 1967). В последующем были выделены в чистом виде компоненты бактерий, обладающие собственно иммуномодулирующим (иммуностимулирующим) действием. В клеточной стенке бактерий таковыми оказались пептидогликан и его фрагменты — мурамилпептиды (Ellouz et al, 1974), в цитозоле — ДНК (Krieg et al, 1995). Именно эти две группы соединений — мурамилпептиды и ДНК, а также их (полу)синтетические аналоги — составляют на сегодня два основных класса иммуномодуляторов бактериального происхождения.

В работе исследованы свойства и возможности клинического применения представителей обоих классов соединений. Мурамилпептиды грамотрицательных бактерий и синтетические аналоги бактериальной ДНК (CpG-ОДН) использовались как активаторы врожденного иммунитета; кроме того, бактериальная ДНК в форме плазмидных векторов применялась как носитель генотерапевтического воздействия, с целью получения иммуно-модулирующего эффекта путем изменения экспрессии только одного гена.

Иммунобиологические свойства мурамилпептидов грамотрицательных бактерий

Существующие мурамилпептидные иммуномодуляторы являются агонистами рецептора NOD2, тогда как терапевтические возможности мурамилпептидов, содержащих остаток мезо-ДАП и активирующих рецептор NOD1, не изучены. Путем лизоцимного гидролиза ПГ грамотрицательной бактерии — S. typhi — был получен комплекс мурамилпептидов (КМП), состоящий из трех компонентов — ГМтри, ГМтетра и диГМтетра (рисунок 1). Все три мурамилпептида содержат остаток мезо-ДАП.

Рисунок 1. Схема строения пептидогликана S. typhi и его фрагментов, получаемых путем обработки лизоцимом. GlcNAc - N-ацетилглюкозамин, MurNAc - N -ацетилмурамовая кислота, L-Ala - L-аланин, D-isoGlu - D-изоглютаминовая кислота, meso-DAP - мезо-диаминопимелиновая кислота.

Первоочередным вопросом была характеризация и сравнение активности полученных мурамилпептидов по отношению к клеткам врожденной иммунной системы. Для опытов использовали 2 ключевых типа клеток врожденного иммунитета: МФ и миелоидные ДК.

При стимуляции МФ все три мурамилпептида дозозависимо индуцировали продукцию цитокинов ФИО (рисунок 2), ИЛ-6, ИЛ-1бета и ИЛ-10 (рисунок 3), причем активности мурамилпептидов соотносились как ГМтри > ГМтетра > диГМтетра. Влияние мурамилпептидов и ЛПС на поверхностный фенотип МФ было менее выраженным: ни одно из протестированных соединений не влияло на экспрессию CD86 и HLA-DR, экспрессия CD80 возрастала незначительно (Pashenkov et al, 2010).

9000

8000 7000 -6000 -5000 -4000 -3000 2000 1000 0

д -

О 0,1 0,1 1 10 1,1 1 10 0,1 1 10 0,1 1 10 мкг/мл

ЛПС ГМтри 'Мгетра ди- ГМДП ГМтетра

Рисунок 2. Уровни ФНО в супернг гантах МФ после 24-часовой стимуляции указанными веществами (ИФА). М ± у, п = 7. *р< 0,05 в сравнении с уровнем ФНО в супернатантах клеток, культив! рованных без стимуляторов.

ИЛ-6

Л ¡1 il 1.1

И Л-10

11 1

1 10 1 ю

о 0,1 ЛПС

1 ю 1 ю 1 ю

гм гм ди™ три тетра тетра

ГМ ГМ диГМ три тетра тетра

Рисунок 3. Уровни ИЛ-1бета, ИЛ-6, ] Л-10 в супернатантах МФ после 24-часовой стимуляции указанными веществами М ± сз, п=5.*р< 0,05 в сравнении с уровнями в супернатантах МФ, кульи вированных без стимуляторов.

9000

8000 -7000 -

^ 6000 - т

1 5000 -•S 4000 -° 3000 -В 2000 -1000 -

0 J------а-- .=.-----

0 0,1 1 10 1 10 1 10 мкг/мл

ЛПС ГМ ГМ диГМ три тетра тетра

Рисунок 4. Уровни ФНО в супернатантах ДК после 24-часовой стимуляции указанными веществами (ИФА). М±а, п = 7. *р< 0,05 в сравнении с клетками, культивированными без стимуляторов.

Миелоидные ДК при стимуляции мурамилпептидами секретировали существенно более низкие количества ФНО, чем МФ, при практически одинаковом ответе обоих типов клеток на ЛПС (рисунок 4, ср. с рисунком 2). Аналогичные закономерности были получены для секреции ИЛ-1бета, ИЛ-6, ИЛ-10 дендритными клетками (Пащенков и соавт., 2012).

Тем не менее, мурамилпептиды при воздействии на ДК усиливали экспрессию маркера CD83 (рисунок 5), а также HLA-DR и молекул костимуляции CD80 и CD86 (Пащенков и соавт., 2012). Совокупность этих признаков указывает на созревание ДК. Активности трех мурамилпептидов соотносились между собой как ГМтри > ГМтетра > диГМтетра.

Наиболее активное соединение — ГМтри — было исследовано также на предмет влияния на функциональные свойства ДК. ГМтри усиливал способность ДК активировать наивные CD4+ Т-клетки в аллогенной смешанной лейкоцитарной реакции (Pashenkov et al, 2010), что также указывает на созревание ДК. Кроме того, ГМтри индуцировал экспрессию ряда хемокинов, в частности CXCL8 (ИЛ-8) и CCL4 (MIP-ip), участвующих в привлечении различных субпопуляций лейкоцитов (рисунок 5).

ДК, стимулированные мурамилпептидами, не вырабатывали Thl- и ТЬ17-инструктивные цитокины (ИЛ-12, ИЛ-23). Последнее позволяет предполагать, что такие ДК неспособны индуцировать дифференцировку Т-клеток по Thl- и ТЬ17-пути, что согласуется с данными литературы (Fritz et al, 2007; Magalhaes et al, 2008). Мурамилпептиды не индуцировали экспрессию ИФН I типа и ИФН-индуцибельных генов ни в ДК, ни в МФ.

100

=г га

1 10 мкг/мл

ГМ ГМ диГМ три тетра тетра

ИЛ-д Эо- 1Р-10 М1Р-1а RANTES

таксин МСР-1 М1Р-1|3

Рисунок 5. Влияние мурамилпептидов и ЛПС на фенотип и продукцию хемокинов дендритными клетками. Слева — экспрессия маркера созревания С083 на ДК после 24-часовой стимуляции мурамилпептидами и ЛПС (проточная цитометрия). М ± ст, п = 5. Справа — уровни хемокинов в супернатантах ДК после 24-часовой стимуляции ГМтри (10 мкг/мл, черные столбики), ЛПС (0,1 мкг/мл, заштрихованные столбики), или без стимуляции (белые столбики), по данным

мультиплексного анализа. М нестимулированными ДК.

± а, п = 4. *р < 0,05, **р < 0,01 в сравнении с

Таким образом, в результате первого этапа работы было установлено, что все три исследованных мурамилпептида обладают активностью по отношению к клеткам врожденного иммунитета — МФ и ДК (ГМтри > ГМтетра > диГМтетра). При этом было сделано две относительно неожиданных находки: 1) мурамилпептиды слабо активируют продукцию цитокинов в ДК (слабее, чем в МФ и слабее, чем ЛПС в ДК); 2) иммуностимулирующим действием обладают все три исследованных мурамилпептида, тогда как, по данным литературы, ГМтетра и диГМтетра считаются у человека иммунологически неактивными (СнагсНп е1 а1, 2003). Эти два явления были исследованы более подробно.

При исследовании кинетики экспрессии мРНК ФНО в ДК и МФ, стимулированных ГМтри или ЛПС, оказалось, что пиковый уровень мРНК ФНО наступает через 1 ч. после начала стимуляции и имеет примерно одинаковую величину, независимо от вида клеток и вида стимула (рисунок 6А). Пиковый уровень ФНО в супернатанте наступает примерно к 3 ч. после начала стимуляции; при этом уровень ФНО в супернатантах ГМтри-стимулированных ДК более чем в 10 раз ниже, чем уровень того же цитокина в супернатантах МФ и ЛПС-стимулированных ДК (рисунок 6В и 6Г). На основании этого был сделан вывод, что в ДК, стимулированных ГМтри, имеет место относительная неэффективность трансляции мРНК ФНО в белок. Неэффективность трансляции, в свою очередь, может быть обусловлена недостаточной активацией киназы р38 в ДК, стимулированных ГМтри. В присутствии ИЛ-1 бета, который является активатором р38, ГМтри-стимулированная продукция ФНО дендритными клетками возрастает до уровня ЛПС-стимулированной (Пащенков и соавт., 2013).

^1000

О- 100 о

X CL

5 1

№ h li

0 1 9 Время (ч.)

□ ДК ГМтри и ДКЛПС ■ МФ ГМтри sa МФ ЛПС

0 1 3 Время после доб. ActD (ч.)

10000

1000

10000

1000 -

100

100 -

Без сти-"муляции

- ГМтри -ЛПС

О 3 6 9 12 15 18 21 24

Время (ч.)

0 3 6 9 12 15 18 21 24

Время (ч.)

Рисунок 6. Кинетика экспрессии мРНК ФНО и секреции ФНО макрофагами и ДК при стимуляции ГМтри (10 мкг/мл) и ЛПС (ОД мкг/мл). А — кинетика экспрессии мРНК ФНО (показана относительная экспрессия; уровень мРНК ФНО в МФ в точке «О ч.» принят за 1). М±а, п=4. Б — кинетика убыли мРНК ФНО в МФ и ДК, стимулированных ГМтри или ЛПС, после остановки транскрипции с помощью актиномицина D (ActD), который добавляли через 1 ч. после начала стимуляции ГМтри или ЛПС. Уровень мРНК ФНО, достигнутый в этой точке в данном типе клеток при данной стимуляции, принят за 100%, уровень мРНК в нестимулированных клетках того же типа — за 0%. М±а, п=3. В и Г — кинетика уровней ФНО в супернатантах ДК (В) и МФ (Г). М±о, п=4.

Кроме того, в ДК, стимулированных ГМтри, возврат уровня мРНК ФНО к исходному происходил уже к 9 ч., т.е. раньше, чем в ДК, стимулированных ЛПС, и МФ, стимулированных ЛПС и ГМтри (рисунок 6А). Падение уровня мРНК в ГМтри-стимулированных ДК не было обусловлено недостаточной стабильностью мРНК: если транскрипцию мРНК останавливали путем добавления актиномицина D через 1 ч. после начала стимуляции, то уровни мРНК ФНО в ДК и МФ падали с примерно одинаковой скоростью независимо от типа стимула (рисунок 6Б). Таким образом, раннее падение уровня мРНК ФНО в ГМтри-стимулированных ДК, наиболее вероятно, обусловлено ранним прекращением транскрипции, а не сниженной стабильностью мРНК ФНО.

Аналогичные закономерности экспрессии мРНК были обнаружены для цитокина ИЛ-6, хемокинов CCL4, CXCL1, CXCL8 (Пащенков и соавт., 2013). Таким образом, низкая секреция цитокинов ГМтри-стимулированными ДК

обусловлена ранним прекращением транскрипции генов цитокинов и относительной неэффективностью трансляции.

Чтобы понять механизмы, участвующие в активации МФ под действием диГМтетра, ранее считавшегося «неактивным», применили трансфекцию МФ малыми интерферирующими РНК (siRNA) с целью нокдауна рецепторов, участвующих в распознавании пептидогликана и мурамилпептидов. Ответ МФ на диГМтетра наиболее существенно подавлялся при нокдауне NOD1 и NOD2, в меньшей степени — при нокдауне TLR2 (рисунок 7). Наибольшее подавление ответа МФ на ГМтри наблюдалось при нокдауне NOD 1,что согласуется с литературными данными (Girardin et al, 2003; Chamaillard et al, 2003), хотя небольшое ингибирующее влияние оказывал также нокдаун TLR2 и NOD2. Ответ на контрольный мурамилпептид — ГМДП — подавлялся исключительно при нокдауне NOD2, что также согласуется с данными литературы (Meshcheryakova et al, 2007).

Стимул: ГМтри

Стимул: диГМтетра

Стимул: ГМДП

Кон. NOD1

TLR2 NOD2

SiRNA

7. Остаточная

Кон. NOD1

TLR2 NOD2

SiRNA

Кон. NOD1

TLR2 NOD2

SiRNA

(ОПфно) макрофагами,

Рисунок 7. Остаточная продукция ФНО ч ——т _ х----------,

трансфицированными контрольной или геноспецифическими siRNA и стимулированными ГМтри, ГМДП или диГМтетра. ОПФНо в клетках, трансфицированных контрольной siRNA, равна 100%. М±о, п=7. *р<0,05.

Для уточнения механизмов действия диГМтетра и ГМтри использовали ингибиторный анализ. Оказалось, что коктейль ингибиторов протеаз широкого спектра действия подавляет ответ МФ на диГМтетра примерно на 70%, но не ингибирует ответ на ГМтри (Пащенков и соавт., 2013). Это позволяет утверждать, что диГМтетра подвергается протеолизу в эндосомах МФ с образованием мономерных продуктов, таких как ГМтри или ГМДП, которые затем распознаются рецепторами NOD1 и NOD2.

С помощью ингибиторов SB203580, VX-745, BAY11-7082 и генистеина было показано, что мурамилпептиды ГМтри и диГМтетра активируют одну и ту же сигнальную цепочку «RIP2 - IKK - NF-кВ», а также киназу р38 (Пащенков и соавт., 2013). Таким образом, установлены механизмы активации клеток врожденного иммунитета под действием диГМтетра.

Известно, что однократная стимуляция клеток врожденной иммунной системы микробными соединениями, в том числе их субоптимальными дозами, приводит к развитию временной толерантности к повторной стимуляции теми же или родственными агонистами (Freudenberg, Galanos, 1988). Этот феномен может быть использован для профилактики эндотоксинового и септического шока. В литературе имеются сообщения о том, что МДП и ГМДП вызывают перекрестную толерантность к ЛПС (Meshcheryakova et al, 2001; Hedl et al, 2007), что делает мурамилпептиды еще более интересными с точки зрения профилактики указанных видов шока.

Нам не удалось воспроизвести индукцию толерантности к ЛПС с помощью мурамилпептидов, описанную в литературе. МФ, стимулированные ГМтри или ГМДП, в т.ч. в субоптимальных дозах, переставали отвечать на оба мурамилпептида, но не на ЛПС (рисунок 8). И наоборот, МФ, стимулированные ЛПС, переставали отвечать на ЛПС, но не на мурамилпептиды. Наши данные объясняются исходя из того, что перекрестную толерантность вызывают вещества, активирующие близкие сигнальные пути (Bagchi et al, 2007), в то время как сигнальные пути ЛПС и мурамилпептидов существенно различаются.

Интересно, что сочетанная стимуляция ЛПС и мурамилпептидами приводила к развитию сочетаной толерантности к обоим агонистам (Пащенков и соавт., 2013). Таким образом, хотя исследованные мурамилпептиды не могут быть использованы для индукции перекрестной толерантности к ЛПС, возможно сочетанное применение мурамилпептидов и ЛПС в низких дозах для профилактики септического шока.

250 у

200 -

О 150

О 50

1 10 100

ГМтри

10 100

Разрешающий

стимул:

■ ГМтри И ГМДП □ ЛПС

ГМДП

ЛПС

Индукторы толерантности (мкг/мл)

Рисунок 8. Индукция толерантности и перекрестной толерантности МФ к повторному воздействию ГМтри, ГМДП и ЛПС. МФ культивировали 24 ч. с индукторами толерантности в указанных концентрациях, отмывали и культивировали еще 24 ч. с разрешающими стимулами — ГМтри (10 мкг/мл), ГМДП (1 мкг/мл) или ЛПС (0,1 мкг/мл), после чего анализировали уровни ФИО в супернатантах. Последние выражали в процентах от выработки ФИО нетолеризованными МФ при действии того же разрешающего стимула. М±а; п=10.

Физ. •] Р~Р КМП (к-во инъекций)

Физ.

КМП (к-во инъекций)

Рисунок 9. Влияние КМП на функциональную активность перитонеальных лейкоцитов и выработку цитокинов у мышей. А — мышам вводили внутрибрюшинно указанные дозы КМП, либо физиологический раствор (К2), либо ничего (К1). Через 24 ч оценивали способность перитонеальных лейкоцитов убивать St. aureus. Показан процент микробных клеток, убитых за 3 часа инкубации. М±а, п = 8 в каждой группе. ** р < 0,01 при сравнении с К1 и К2. Б — мыши получили указанное количество ежесуточных инъекций КМП (разовая доза 100 мкг/мышь) или физиологического раствора подкожно. Через 24 ч после последней инъекции оценивали бактерицидность перитонеальных лейкоцитов как в А. М±о, п = 8. *** р < 0,001 при сравнении групп, получивших данное количество инъекций КМП или физиологического раствора. В и Г — мышам вводили КМП подкожно. Контрольная группа получала 1 инъекцию физиологического раствора. Через 2 ч после последней инъекции получали сыворотку и анализировали в ней уровни ФИО (В) и ИЛ-6 (Г). М±а, п = 5. * р < 0,05, ** р < 0,01 при сравнении с контрольной группой. Все значения р получены в U-тесте Манна—Уитни.

Показав наличие биологической активности у исследованных мурамилпептидов, перешли к проведению доклинических испытаний in vivo. Поскольку активностью обладают все три мурамилпептида (ГМтри, ГМтетра, диГМтетра), то в дальнейшей работе использовали комплекс мурамилпептидов (КМП), состоящий из ГМтри, ГМтетра и диГМтетра в соотношении примерно 1:1:1,5. Было выявлено несколько видов активности

КМП, которые являются определяющими для противоинфекционных иммуиомодуляторов (рисунок 9, таблица 1). При однократном внутрибрюшинном введении препарат дозозависимо усиливал бактерицидность перитонеальных лейкоцитов по отношению к St. aureus (рисунок 9А). При курсовом подкожном введении препарата наблюдалось постепенное нарастание бактерицидности лейкоцитов, с достижением максимума к 5-му—7-му дню (рисунок 9Б). КМП вызывал также повышение сывороточных уровней ФИО и ИЛ-6 — ключевых цитокинов, «оркеструющих» врожденный иммунный ответ (рисунок 9В и 9Г). Однако уровни цитокинов достигали пика уже на 1-е сутки, а затем снижались практически до фоновых величин и при повторных введениях препарата существенно не менялись. Таким образом, к провоспалительному действию препарата наступает толерантность, что согласуется с данными in vitro. Напротив, антимикробный эффект при повторных введениях нарастает. Подобная дихотомия между провоспалительным и антимикробным действием была ранее описана для ЛПС (Foster et al, 2007).

Наиболее важные эксперименты касались непосредственной оценки антимикробной резистентности (таблица 1). Курсовое ежедневное введение КМП сопровождалось значительным ростом резистентности мышей к летальной дозе St. aureus, причем максимум защиты (70—80%), как и максимум бактерицидности лейкоцитов, приходился на 5-е—7-е сутки.

Таблица 1. Выживаемость мышей, получивших указанное количество ежесуточных инъекций КМП или физиологического раствора п/к и зараженных 1 летальной дозой St. aureus,а_

Разовая доза Количество инъекций

КМП (мкг) 1 3 5 7 10

0 0 0 10 0 Н.д.

10 0 30 20 70** 40

100 0 30 60# 80** 50

а Заражали через 24 ч. после последней инъекции. Показаны проценты мышей, выживших к 10-м суткам после заражения. Каждое значение получено на группе из 10 мышей. # р = 0,06, ** р < 0,01 при сравнений методом хи-квадрат с группой, не получившей КМП. Н.д. — не делали.

В ходе работы было обнаружено, что однократное введение высокой дозы КМП (100 мкг/мышь) вызывает образование специфических АТ против КМП (рисунок 10А, В). Первым повышается уровень специфического затем ^в2а и 1 (рисунок 10Б). Такая последовательность появления изотипов характерна для первичного иммунного ответа. После повторного введения КМП (через 10 суток после первой инъекции) уровни ^01 и 1§С2а дополнительно нарастают, тогда как уровни IgM не меняются (рисунок ЮГ). В конкурентном ИФА было показано, что эти АТ направлены преимущественно против диГМтетра, т.е. против наиболее сложного по строению мурамилпептида (рисунок 10Д).

10 (сут.)

Режим иммунизации

■ 1дМ

И ГдС31 □ 1дС2а

Ю (сут.)

■ 1дМ и 1дС1 □ 1дС2а

Режим иммунизации

Ингибиторы: ♦ КМП

■ ГМтри+ГМтетра АдиГМтетра

0 0,1 1 10 100 1000 5000 Ингибитор (мкг/мл)

Рисунок 10. Характеристики АТ к КМП. А и Б — титры АТ к КМП (А) и их отдельных изотипов (Б) через указанное количество суток после введения физиологического раствора (ФР) или первичной иммунизации КМП (100 мкг/мышь). В и Г — титры АТ к КМП (В) и их отдельных изотипов (Г) через 10 суток после: 1 — введения ФР; 2 — первичной иммунизации КМП (100 мкг/мышь); 3 — бустерной иммунизации (100 мкг/мышь через 10 сут. после первичной); 4 — форсированной иммунизации (10 ежедневных инъекций по 100 мкг/мышь, перерыв 10 суток, бустерная иммунизация). Д — ингибирование связывания АТ к КМП в ИФА с помощью КМП, ГМтри+ГМтетра и диГМтетра. А, Б, Г, Д — показан 1 опыт из двух с аналогичными результатами, В — показаны М±а по 4 независимым опытам. В каждом опыте анализировали пуловые сыворотки, полученные не менее чем от 10 мышей. Значения достоверности на графике «В»: * р < 0,05 в сравнении с режимом 1 (1:-тест).

Иммунные сыворотки, содержащие эти АТ, защищали мышей от летальной инфекции грамотрицательной бактерией — Б. 1урЫтигшт, однако против грамположительной бактерии — золотистого стафилококка — были малоэффективны (рисунок 11).

10 & 8 '

О 6 14 . <3 2 0

♦ Контрольная

сыворотка ■ Иммунная сыворотка ▲ Физ. р-р

О 2 4 6 8 10 12 Сутки после заражения

0 12 3

Сутки после заражения

Рисунок 11. Выживаемость мышей после внутрибрюшинного введения 500 мкл ФР, либо 500 мкл контрольной сыворотки (от мышей, получивших ФР), либо 500 мкл иммунной сыворотки (от мышей, получивших 100 мкг КМП двукратно с интервалом 10 суток) и последующего внутрибрюшинного заражения: А — 1 DCL S. typhimurium, штамм 415 (10 микробных клеток), Б — 1 DCL St. aureus, штамм Wood46 (5x109 микробных клеток мышь).

Таким образом, проведенные эксперименты показали способность КМП и его компонентов активировать врожденный иммунитет, кульминацией чего является повышение резистентности против летальной бактериальной инфекции. Защитное действие КМП обусловлено, в частности: 1) активацией фагоцитов; 2) ранней индукцией выработки провоспалительных цитокинов и хемокинов; 3) последующим формированием толерантности к провоспалительному действию мурамилпептидов, что препятствует гиперстимуляции врожденного иммунитета в ходе инфекции. При определенных условиях защита может реализовываться также путем индукции AT к мурамилпептидам.

Клиническая и иммунологическая эффективность КМП грамотрицательных бактерий (препарата «Полнмурамил») в клинических испытаниях

С учетом вышеизложенных данных, а также данных токсикологических исследований (в работу не включены), были проведены клинические испытания КМП, получившего название «Полимурамил».

В I фазе клинических испытаний препарат испытывали в 4 режимах: в дозах 100, 200 и 400 мкг внутримышечно однократно, а также в дозе 200 мкг внутримышечно ежедневно в течение 5 дней (Пащенков и соавт., 2011). Пациентов наблюдали в течение 3 месяцев с момента первой инъекции.

-1 4 24 120

Время после инъекции (ч)

■ Полимурамил (400 мкг) - Плацебо

-1 4 24 120

Время после инъекции (ч)

-1 4 24

Время после инъекции (ч)

-1 4 24

Время после инъекции (ч)

Рисунок 12. Иммунологические эффекты Полимурамила при однократном внутримышечном введении в дозе 400 мкг в сравнении с эффектом плацебо. А — процент клеток St. aureus, убитых лейкоцитами крови внутриютеточно за 1 ч (см. Материалы и методы); Б — зимозан-индуцированная,. люминол-зависимая хемилгоминесценция лейкоцитов крови; В—Ж — уровни IgM, С-реактивного белка (CRP), МСР-1 (CCL2), MIP-ip (CCL4) и ИЛ-6 в сыворотке крови. * — р < 0,05, ** — р < 0,01 при сравнении групп, получивших Полимурамил и плацебо, в данной точке (тест Манна—Уитни). # — р < 0,05, ## — р < 0,01, ### — р < 0,001 при сравнении значений в группе, получившей Полимурамил, с исходными в той же группе (тест Уилкоксона).

У добровольцев, получивших препарат в дозе 1x400 мкг, было обнаружено повышение бактерицидности лейкоцитов по отношению к стафилококку через 4 ч. после введения, с возвратом к исходной величине к 5-м суткам (рисунок 12А). Также наблюдалось раннее повышение уровней цито- и хемокинов CCL4 (MIP-lß), CCL2 (МСР-1) и ИЛ-6 в сыворотке, с нормализацией к 24 ч. (рисунок 12Д—12Ж). В более поздние сроки (через 24—120 ч. после инъекции) происходил подъем уровней С-реактивного белка и IgM в сыворотке (рисунок 12В, Г). Аналогичные, хотя и менее четкие изменения наблюдались при режиме 5x200 мкг. Препарат не вызывал повышения сывороточных уровней ревматоидного фактора, а также AT к одно- и двухцепочечной ДНК. В отличие от доклинических испытаний (см. рисунок 10), не происходило повышения уровня AT к самому препарату — вероятно, потому, что в клинических испытаниях использовали существенно более низкие дозы препарата на единицу массы тела.

Полимурамил обладал приемлемым спектром нежелательных явлений, среди которых преобладали местные реакции, не требовавшие медицинского вмешательства (преходящая болезненность и инфильтраты в месте инъекции, преходящий субфебрилитет). Нежелательные явления были более выражены при курсовом введении препарата (таблица 2).

Таблица 2. Нежелательные явления за весь период наблюдения при одно- и пятикратном внутримышечном введении ПМ в указанных дозах.__

Нежелательные явления Плацебо (п=6) 1x100 мкг (п=6) 1x200 мкг (п=6) 1x400 мкг (п=6) 5x200 мкг (п=10)

Головная боль (степень 1)* 0 0 0 0 1 (10%)

Местные реакции (степень 1-2)* 0 0 2 (33%) 1 (17%) 4 (40%)

Повышение температуры тела до 37,0—37,5°С 0 1 (17%) 1 (17%) 1 (17%) 2 (20%)

Повышение температуры тела до 37,6—38,0°С 0 1 (17%) 1 (17%) 0 1 (10%)

Обострение очагов хронической инфекции 0 0 1 (17%) 0 0

Другие нежелательные явления 0 0 0 0 0

♦Согласно Общим терминологическим критериям нежелательных явлений Национального Института здравоохранения США, версия 3.0 (2006).

ПЛП фаза клинических испытаний Полимурамила была проведена у пациентов с гнойными хирургическими инфекциями (Пащенков и соавт., 2012). Было сформировано две группы по 30 человек: группа сравнения, получавшая стандартное лечение (хирургическая операция + антибиотикотерапия), и основная группа, получавшая стандартное лечение + Полимурамил по 200 мкг в/м в течение 5 суток. Длительность введения Полимурамила была выбрана на основании доклинических испытаний, показавших, что при ежесуточном введении КМП пик бактрицидности

лейкоцитов и антимикробной защиты наступает на 5-е—7-е сутки (рисунок 9Б, таблица 1). Безопасность данного режима введения препарата была подтверждена I фазой клинических испытаний (таблица 2).

По тяжести состояния и спектру нозологических форм две группы исходно не различались. При объективной оценке на следующие сутки после окончания приема Полимурамила в основной группе достоверно чаще отмечался регресс воспаления и полная эпителизация раны, чем в группе сравнения (таблица 3). У пациентов основной группы раньше, чем в группе сравнения, происходила нормализация температуры тела (5,4±1,9 суток против 7,3±2,5 суток, р<0,05); различий по срокам антибактериальной терапии и длительности пребывания в стационаре выявлено не было.

Таблица 3. Показатели исчезновения морфологических элементов в зависимости от

Показатель 24 ч. после окончания лечения 4 нед. после окончания Лечения

Основная группа Группа сравнения Основная группа Группа сравнения

Регресс воспаления 30** 21 30 28

Появление эпителизации 27 22 30 30

Полная эпителизация 6* 0 28 25

Общая эффективность лечения на следующий день после окончания терапии в основной группе была оценена достоверно выше, чем в группе сравнения (таблица 4).

Таблица 4. Общая эффективность лечения в основной и контрольной группах при объективной оценке через сутки после окончания терапии*.

Основная Группа

Эффект группа сравнения

N % N %

Хороший 25 83,3 17 56,7

Удовлетворительный 5 16,7 10 33,3

Отсутствует 0 0 3 10

ИТОГО 30 100 30 100

1 р = 0,045 в тесте х-квадрат для таблицы 3x2.

Сами пациенты основной группы в эти сроки тоже лучше оценивали свое состояние; у них были достоверно менее выражены болевые ощущения, гиперемия, отек и нарушения сна (таблица 5).

Через месяц после окончания лечения различий между основной группой и группой сравнения ни по одному параметру выявлено не было (таблицы 3, 5).

Таблица 5. Показатели субъективной оценки (баллы по 4-балльной шкале; М±о).

Показатель До лечения 24 ч. после окончания лечения 4 нед. после окончания лечения

Основная группа Группа сравнения Основная группа Группа сравнения Основная группа Группа сравнения

Местные ощущения 2,7±0,4 2,7±0,51 0,87±0,19 *** 1,16±0,26 0,32±0,08 0,32±0,05

Гиперемия и отек 2,8±0,29 2,6±0,4 0,76±0,16 *** 1,42±0,28 0 0

Нарушение сна 1,9±0,29 2,0±0,44 0,65±0,44 *** 1,15±0,49 0,05±0,14 0,05±0,14

Физический дискомфорт 2,9±0,44 2,7±0,48 1,05±0,38 *** 1,4±0,55 0 0

***р<0,001

Таким образом, Полимурамил при введении человеку обладает объективной иммунологической активностью; ускоряет выздоровление пациентов с гнойными хирургическими инфекциями при добавлении к стандартному лечению. По результатам испытаний, субстанция «Полимурамил» зарегистрирована в Государственном реестре лекарственных средств РФ под № ФС-000557, лекарственный препарат «Полимурамил» — под № ЛП-002069.

Противоопухолевая активность CpG-ОДН 7909 у пациентов с

метастатической меланомой (II фаза клинических испытаний)

Другой класс бактериальных иммуномодуляторов — CpG-ОДН — привлекает внимание в первую очередь в связи с их противоопухолевой активностью, показанной в многочисленных экспериментах (подробный обзор — см. Krieg et al, 2007). CpG-ОДН являются агонистами рецептора TLR9 (Hemmi et al, 2000). Противоопухолевую активность CpG-ОДН связывают с их способностью активировать ппДК, индуцировать продукцию ИФН I типа, Thl-ответ, активировать ЦГЛ и NK-клетки (Krieg et al, 2002). В то же время возможности использования CpG-ОДН для лечения злокачественных опухолей у человека до проведения данной работы практически не были изучены. Считается, что иммунотерапия более эффективна при так называемых «иммуногенных» опухолях, к которьм относится, в частности, меланома. В рамках настоящей работы были проведены первые клинические испытания системной терапии CpG-ОДН 7909 при метастатической меланоме. CpG-ОДН 7909, ранее известный как ОДН 2006, на момент исследования был единственным ОДН, полностью прошедшим доклинические, токсикологические и I фазу клинических испытаний (Krieg et al, 2004).

Испытания показали, что препарат обладает объективной противоопухолевой активностью. Полная ремиссия длительностью более 3 лет была достигнута у 1 пациента (полный регресс метастаза в легком),

частичная ремиссия длительностью 16 недель — у 1, стабилизация заболевания длительностью 8 недель — у 3; у остальных 15 пациентов имело место прогрессировать заболевания (эффект отсутствовал). Таким образом, частота объективных ответов составила 5/20 (25%).

У 80

ч:

с 60

+ 40

со

О О 20

О 1- 16

<и

.с 8

а>

со 4

О 0

¡12

"3 10 с;

о с

О" <

СМ

О 8 Недели

к 440 О., 380

<Ег зго

х § 260 © Я 200 § 140 80

0 8 Недели

I-Ф ^ т 60

о о. 50

1 т р 40

л та 30

.С СО 20

С) О га X 10

О 0

0 8 Недели

♦ Частичная ремиссия ■ Стабилизация □ Прогрессирование ^"Медианы

0 4 8 Недели

Рисунок 13. Эффекты Срв-ОДН 7909 на клетки, экспрессирующие Т1Л19, у пациентов с меланомой. А — процентное содержание СБ86+ клеток среди ппДК, Б — средняя интенсивность флюоресценции (СИФ) маркера НЬЛ-БЯ на ппДК крови. В и Г — процентное (среди В-клеток) и абсолютное (на 1 мкл) содержание ранних плазматических клеток с фенотипом СВ19+СБ38Ы8Ь. Д — уровни 2'-5'-олигоаденилатсинтетазы в сыворотке (маркер интерферонового ответа).

Иммунологическое исследование пациентов проводили до начала терапии и на 8-й неделе. Было обнаружено, что препарат активирует оба типа клеток, конституционально экспрессирующих ТЫ19: ппДК и В-клетки. Активация ппДК выражалась в повышении экспрессии НЬЛ-БЯ и СБ86 (рисунок 13А, Б), а также в продукции ИФНI типа, о чем косвенно судили по повышению активности 2'-5'-олигоаденилатсинтетазы (ИФН-индуцибельного фермента) в сыворотке (рисунок 13Д). Активация В-клеточного звена проявлялась в виде повышения относительного и абсолютного содержания в крови ранних плазматических клеток с фенотипом СВ19+СБ38ЫеЬ (рисунок 13В, Г). Все описанные лабораторные изменения не коррелировали с клинической эффективностью СрО-ОДН.

300

3 со 240

а. ЬЙ 180

Е 120

1—

ГО X 60

О 8

Недели

Ё К

га §

0 X

1 оо

3 §

□ о

Е ч о 2

2,5 2

1,5 1

0,5 0

И 30.1

О 12.1

Есть Нет Клинический эффект

• Полная ремиссия

♦ Частичная ремиссия

■ Стабилизация заболевания

* Прогрессирование заболевания -*- Медианы

Рисунок 14. Влияние терапии СрО-ОДН 7909 на численность (А) и цитотоксическую активность (Б) циркулирующих ЫК-клеток у пациентов с меланомой. * р < 0,05.

Вторичные эффекты препарата, наиболее вероятно обусловленные цитокинами, касались МК-клеток. В ходе лечения отмечалось снижение уровней циркулирующих МК-клеток (рисунок 14А), что происходило вне зависимости от клинического эффекта и, вероятно, отражало привлечение МК-клеток в ткани. Однако изменения КК-активности коррелировали с клиническим эффектом (рисунок 14Б). №С-активность в настоящем исследовании выражали в количестве литических единиц на 105 циркулирующих МК-клеток. При этом оказалось, что у пациентов с ремиссией и стабилизацией МК-активность в ходе лечения повышалась, а у

пациентов с прогрессированием — снижалась. Таким образом, отношение NK-активности на 8-й неделе к NK-активности до лечения у пациентов с наличием клинического эффекта было достоверно выше, чем у пациентов с отсутствием эффекта (рисунок 14Б). Это позволяет рассматривать NK-клетки в качестве вероятных эффекторов противоопухолевого действия CpG-ОДН. Косвенно этот вывод подтверждается и тем фактом, что в метастатически очагах, прогрессирование которых начиналось после периода стабилизации или частичной ремиссии, отмечалось снижение экспрессии NK-клеточных маркеров CD56 и CD160 (по данным ПЦР в реальном времени), что косвенно указывает на снижение содержания NK-клеток (Pashenkov et al, 2006).

Подтверждено, что CpG-ОДН при подкожном введении вызывают гиперплазию ЛУ, дренирующих место введения препарата, с равномерным увеличением Т-зон и В-зон (с формированием вторичных фолликулов) и с обогащением плазмацитоидными ДК. Аналогичные изменения были ранее описаны у мышей (Hartmann et al, 2000). В гиперплазированных ЛУ, дренирующих место инъекции, обнаружена индукция генов Thl-профиля IL 12В и IL12RB2, увеличение содержания зрелых миелоидных и плазмацитоидных ДК (Pashenkov et al, 2006). Мы предполагаем, что именно в ЛУ разворачиваются основные клеточно-молекулярные события, приводящие к активации ппДК, В-клеток и цитотоксических эффекторов.

Исследовали также различные фенотипические и функциональные показатели Т-клеток, однако каких-либо изменений этих показателей на фоне лечения CpG-ОДН выявлено не было. В то же время известно, что активация «обычных» CD4+ и CD8+ Т-клеток может блокироваться Treg-клетками. Чтобы изучить, оказывают ли Treg-клетки какое-либо влияние на механизмы действия CpG-ОДН, были поставлены следующие опыты. Из мононуклеаров крови с помощью иммуномагнитной сепарации выделяли фракцию CD4+ Т-клеток, затем удаляли из нее CD25h,gh Treg-клетки, после чего сравнивали пролиферативный ответ нефракционированных CD4+ Т-клеток и Treg-обедненных CD4+ Т-клеток на стимуляцию моноклональными AT к CD3 (рисунок 15А, Б). До лечения CD3-индуцированная пролиферация как нефракционированных, так и Treg-обедненных CD4+ Т-клеток у большинства пациентов была крайне низка. На 8-й неделе пролиферативный ответ нефракционированных CD4+ Т-клеток оставался низким, тогда как пролиферация Treg-обедненных Т-клеток у нескольких пациентов значительно возрастала (рисунок 15В, отмечены стрелками). Полученные данные могут быть интерпретированы следующим образом. Известно, что AT к CD3 (в отсутствие AT к CD28) активируют Т-клетки памяти и Treg-клетки, но не наивные Т-клетки. При этом активированные Treg-клетки подавляют пролиферацию Т-клеток памяти. Повышение пролиферативного ответа Treg-обедненных CD4+ Т-клеток указывает, что в ходе лечения происходит нарастание количества CD4+ Т-клеток памяти. Вероятно, это происходит в результате активации и дифференцировки Т-клеток в дренирующих ЛУ, где цитокиновое микроокружение делает «обычные»

CD4+ Т-клетки временно нечувствительными к ингибирующему действию Treg (Pasare, Medzhitov, 2004). Однако, выйдя в кровоток, CD4+ Т-клетки памяти вновь «подпадают» под ингибирующее действие Treg-клеток и могут быть активированы in vitro только после удаления Treg-клеток. Эти данные указывают на целосообразность сочетания CpG-ОДН с деплецией Treg-клеток для усиления противоопухолевого эффекта.

МНК

CD4+ Т-клетки

Деплеция CD25h'9h клеток

Стимуляция МАТ к CD3

Оценка пролиферации

Изотип- Перед После

контроль деплецией __ деплеции

8% 3%

6% 0,3%

•ТШ-

Мышиный lgG1

CD25 FITC

■ Н.0, все CD4* S Н.0, Тгед-обедн. □ Н.8, все CD4+ И Н.8, Тгед-обедн.

Профессирование Стабилизация ЧР

Рисунок 15. Изменение пролиферативного ответа нефракционированных СБ4+ Т-клеток и Treg-oбeднeнныx СБ4+ Т-клеток в ходе лечения Срв-ОДН 7909. А — схема опытов. Б — пример деплеции СВ25Ь|611 Treg-клeтoк из популяции СБ4+ Т-клеток (проточная цитометрия). Указано процентное содержание СБ251ои (цифра слева) и СБ25ь,в11 (цифра справа) клеток среди СБ4+ Т-клеток до и после деплеции. В — анти-СБЗ-индуцированная пролиферация всех (нефракционированных) СБ4+ Т-клеток и Treg-oбeднeнныx СБ4+ Т-клеток до лечения (н. 0) и на 8-й неделе (н. 8) у 8 различных пациентов. ЧР — частичная ремиссия.

При ретроспективном анализе было обнаружено, что у пациентов, ответивших на терапию, до лечения отмечалось достоверно более высокое процентное содержание CD80+ В-клеток, CD8+ центральных Т-клеток памяти, активированных CD8+ Т-клеток, экспрессирующих CD40L, а также более высокое процентное (но не абсолютное) содержание CD56+CD16+ NK-клеток. Значимость этих маркеров как предикторов клинической эффективности CpG-ОДН должна быть подтверждена в более крупных исследованиях.

Таким образом, во II фазе клинических испытаний было показано, что препарат класса Срв-ОДН обладает объективной противоопухолевой активностью у пациентов с метастатической меланомой и вызывает ряд иммунологических эффектов, сопоставимых с их ожидаемым механизмом действия. Мы полагаем, что первым событием в механиме противоопухолевого действия СрО-ОДН является активация ппДК. Активированные ппДК вырабатывают ИФН I типа и, возможно, другие цитокины, которые усиливают цитотоксичность клеток (рисунок 16). Противоопухолевый эффект СрО-ОДН ассоциирован с нарастанием №С-активности в процессе лечения. Поскольку нарастание №С-активности происходит не у всех пациентов, можно предположить, что у пациентов, не ответивших на терапию, блокирован ответ клеток иммунной системы на ИФН I типа (СгЬсЫеу-ТЬогпе е1 а1, 2009).

Рисунок 16. Иммунологические эффекты и предполагаемый механизм противоопухолевого действия СрО-ОДН при метастатической меланоме (по данным настоящего исследования и литературы).

Дистанционное управление миграцией клеток иммунной системы с помощью трансгенной экспрессии хемокина ССЬ21 в коже

Помимо активации врожденного иммунитета, бактериальная ДНК может быть использована и в другом качестве — как вектор для генотерапевтического воздействия. Генотерапию можно рассматривать как

«моногенный» подход к иммуномодуляции, при котором желаемый эффект достигается путем изменения экспрессии только одного гена. В качестве модели в работе было выбрано регулирование миграции клеток врожденного и адаптивного иммунитета с помощью трансгенной экспрессии хемокина CCL21, достигаемой in vivo с помощью плазмидных векторов.

Хемокин CCL21 конституционально экспрессируется клетками венул с высоким эндотелием (ВВЭ) в Т-зонах вторичных лимфоидных органов (von Andrian, Метр el, 2003), а при воспалении — также эндотелием афферентных лимфатических сосудов (Martin-Fontecha et al, 2003). Рецептором для CCL21 служит CCR7, который экспрессируется зрелыми ДК, наивными Т-клетками и центральными Т-клетками памяти (Sallusto et al, 1998, 1999). CCL21 регулирует миграцию зрелых ДК из периферических тканей в Т-зоны, а также привлекает из кровотока указанные субпопуляции Т-клеток. Встреча зрелых ДК и Т-клеток абсолютно необходима для индукции адаптивного иммунного ответа, что придает хемокину CCL21 ключевую роль в этом процессе. Повышение уровня CCL21 в регионарных ЛУ увеличивает вероятность контакта антигенпредставляющих ДК с редкими антигенспецифическими Т-клетками и может рассматриваться как способ повышения эффективности вакцинации. Возможность решить эту задачу с помощью плазмидных векторов, кодирующих кДНК CCL21, не исследована.

В основу опытов был положен феномен поступления хемокинов из кожи в регионарные ЛУ (Baekkevold et al, 2001; Palframan et al, 2001). Хемокины, вырабатываемые в коже при воспалении, либо введенные в кожу искусственно, с током лимфы доставляются в ЛУ, где рекрутируют соответствующие популяции клеток. Таким образом, для искомого повышения уровня CCL21 в ЛУ теоретически достаточно получить экспрессию этого хемокина в коже.

Были получены плазмидные конструкции, позволяющие экспрессировать в эукариотических клетках мышиный CCL21 (mCCL21) и маркерный белок EGFP (рисунок 17А, Б). Плазмида pVR1012-mCCL21-IRES-EGFP предназначена для раздельной трансляции mCCL21 и маркерного белка EGFP с одной бицистронной мРНК, что позволяет идентифицировать трансфицированные клетки in vitro и in vivo (рисунок 17А). Вторая плазмида — pVR1012-mCCL21/EGFP — предназначена для экспрессии гибридного белка mCCL21/EGFP (рисунок 17Б), что дает возможность исследовать внутриклеточное распределение трансгенного mCCL21, а также связывание его с рецепторами. Были получены также соответствующие контрольные плазмиды, не содержащие кДНК mCCL21.

Введение конструкций, кодирующих mCCL21, в клетки COS-7 in vitro приводило к высокой экспрессии трансгена, что было подтверждено несколькими независимыми методиками: иммуноцитохимии, конфокальной микроскопии, Вестерн-блоттинга (рисунок 17В—17Е). Внутриклеточное распределение гибридного белка mCCL21/EGFP было характерным для секретируемого протеина (перинуклеарно в комплексе Гольджи и в секреторных везикулах; рисунок 17Е).

Д Stop condon

mCCL21 IRES EGFP

^ Sto^ondon

mCCL21 , EGFP

pVR1012-mCCL21-IRES-EGFP

г pVR1012-mCCL21-' IRES-EGFP

viJl^'-iS«,

pVR1012-mCCL21«3FP

PVR1012 (контроль)

CD Ш

о и E

се >

и ш се

о о Е

се >

£ а.

г-сл О О

-42 кДа I

-15 кДа

Рисунок 17. Экспрессия трансгенного mCCL21 in vitro. А — бицистронная плазмида pVR1012-mCCL21-IRES-EGFP, где кДНК mCCL21 и EGFP находятся под контролем одного промотера (pCMV) и разделены IRES-последовательностъю, что

позволяет экспрессировать два независимых белка с одной матричной РНК. Б_

плазмида pVR1012-mCCL21/EGFP, позволяющая экспрессировать гибридный белок mCCL21/EGFP. В — Вестерн-блотгинг лизатов клеток COS-7, трансфицированных указанными плазмидами, либо контрольной плазмидой pVR1012, либо не трансфицированных. Г — иммуноцитохимическое выявление mCCL21 в клетках COS-7, трансфицированных плазмидой pVR1012-mCCL21-IRES-EGFP и контрольной плазмидой. Д — конфокальная микроскопия тех же клеток на предмет экспрессии EGFP. Е — конфокальная микроскопия клеток COS-7, трансфицированных плазмидой pVR1012-mCCL21/EGFP.

В супернатантах клеток COS-7 (0,5x106 клеток, 1 мл среды), трансфицированных 5 мкг плазмиды, через 48 ч после трансфекции концентрация mCCL21 составила 60 ± 1,2 нг/мл. В супернатантах клеток, трансфицированных контрольной плазмидой pVR1012, уровень mCCL21 был ниже порога детекции (<10 пг/мл).

EGFP

pVR1012-IRES-EGFP (контроль) pVR1012-mCCL21-IRES-EGFP

pVR1012-mCCL21-IRES-EGFP + + AT к CCL21 (5 мкг/мл) Рек. mCCL21 0,1 мкг/мл Рек. mCCL21 1 мкг/мл

Спленоциты

0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 Количество мигрировавших % С04+С062!_+ клеток клеток (на лунку, хЮОО) в мигрировавшей фракции

Рисунок 18. Функциональная активность трансгенного тССЬ21. А — ДК костномозгового происхождения экспрессируют маркер ДК СБПс (график 2) и ССЯ7 — рецептор ССЬ21 (график 3). График 1 — изотип-контроль. Б — ДК костномозгового происхождения, инкубированные с супернатантом клеток С08-7, трансфицированных плазмидой рУШ012-тССЬ21/ЕОРР, связывают флюоресцентный гибридный белок тССЬ21-ЕОРР (график 2). Это связывание полностью блокируется преинкубацией супернатанта с нейтрализующими АТ к гаССЬ21 (график 3). График 1 — интактные ДК. В — миграция спленоцитов мышей ВАЬВ/с, индуцированная супернатантами клеток С08-7, трансфицированных указанными плазмидами, а также рекомбинантным тССЬ21 в указанных концентрациях (ТгапвлуеП). Г — процентное содержание С04+С062Ь+ клеток среди исходных спленоцитов и среди мигрировавших клеток.

Далее было показано, что трансгенный mCCL21, секретируемый клетками COS-7 in vitro, обладает ожидаемой биологической активностью. Так, гибридный белок mCCL21/EGFP связывался с ДК, несущими рецептор CCR7 (рисунок 18А), причем связывание полностью блокировалось нейтрализующими AT к mCCL21 (рисунок 18Б). Кроме того, супернатанты,

содержащие трансгенный тССЬ21, индуцировали хемотаксис спленоцитов (рисунок 18В), преимущественно СБ4+СБ62Ь+ наивных Т-клеток селезенки (рисунок 18Г), причем этот эффект тоже блокировался АТ к тССЬ21 (рисунок 18В, Г).

pVR 1012-тСС L21 -IRES-EGFP

PVR1012-контроль

Эпидермис Дерма

р^ Эпидермис

Дерма -i

Интактная pVR1012- pVR1012-

кожа IRES- mCCL21-

EGFP IRES-

(контр.) EGFP

Интактные pVR1012- pVR1012-

ЛУ IRES- mCCL21-

EGFP IRES-(контр.) EGFP

Рисунок 19. Экспрессия трансгенного mCCL21 в эпидермисе и его поступление в дренирующие ЛУ. А — экспрессия маркерного белка EGFP в эпидермисе через 24 ч. после введения pVR1012-mCCL21-IRES-EGFP (слева) и отсутствие таковой после введения контрольной плазмиды (справа). Плазмиды вводили внутрикожно с помощью генного ружья. Б — иммуноцитохимическая окраска тех же образцов кожи поликлональными AT к mCCL21 (АРААР-методика, ядра подкрашены гематоксилином). Показан 1 эксперимент из 3 с идентичными результатами. Маркер длины — 100 мкм. В — уровни mCCL21 (ИФА) в 72-часовых супернатантах суспензий клеток кожи, полученных через 24 ч. после внутрикожного введения указанных плазмид. Г — содержание mCCL21 в паховых ЛУ мышей линии pit через 72 ч. после введения указанных плазмид в кожу живота (с помощью генного ружья). На графиках В и Г показаны М±а по трем опытам (в каждом опыте — 3 мыши на группу); * * р < 0,01.

Внутрикожное введение плазмиды pVR1012-mCCL21-IRES-EGFP с помощью генного ружья позволяло достичь высокой экспрессии mCCL21 в эпидермисе, которая достигала максимума через 24 ч. и исчезала к 14-м суткам после трансфекции. Трансген экспрессировался исключительно в клетках эпидермиса, о чем судили по экспрессии маркерного белка EGFP (рисунок 19А). Однако иммуногистохимическое окрашивание на mCCL21 показало, что трансгенный белок секретируется кератиноцитами и диффундирует в дерму (рисунок 19Б). Трансгенный mCCL21 секретировался также суспензиями клеток кожи ex vivo (рисунок 19В).

В опытах на мышах линии pit, не экспрессирующих собственного CCL21 (Nakano, Gurm, 2001), было показано, что трансгенный mCCL21, вырабатываемый в эпидермисе, доставлялся с током лимфы в регионарные ЛУ и накапливался в них в высокой, физиологически значимой концентрации (рисунок 19Г). Таким образом, была подтверждена состоятельность идеи, положенной в основу исследования (возможность поступления трансгенного хемокина из кожи в дренирующие ЛУ).

> с;

га-

45 -i

30 -

• 15

Интактные ЛУ

se ш

pVR1012-1RES-EGFP (контр.)

□ 1 -е сутки

□ 3-й сутки ■ 7-е сутки

pVR1012-mCCL21-IRES-EGFP

CD4+CD62L+ Т-клетки

pVR1012-IRES-EGFP (контр.)

pVR1012-mCCL21-I RES-EGFP

Рисунок 20. Влияние трансгенной экспрессии mCCL21 в коже на клеточный состав дренирующих ЛУ у мышей линии pit. А — общая клеточность паховых ЛУ, дренирующих места введения указанных плазмид, в указанные сроки после введения. Б и В — процентное содержание, соответственно, CDllc+ ДК и CD4+CD62L+ клеток (наивных CD4+ Т-клеток и центральных CD4+ Т-клеток памяти) в дренирующих ЛУ через 72 ч после введения плазмид. На всех графиках показаны М±о по трем опытам (в каждом опыте — 4 мыши на группу); * р < 0,05.

Трансгенный тССЬ21, накапливающийся в ЛУ, влиял на клеточный состав ЛУ, в частности, вызывал накопление в этих ЛУ зрелых ДК и наивных Т-клеток (рисунок 20). Таким образом, была экспериментально подтверждена возможность дистанционного регулирования клеточного состава ЛУ с помощью временной трансгенной экспрессии хемокина тССЬ21 в коже, достигаемой с помощью плазмидного вектора. Это позволило положительно ответить на основной вопрос этой части работы. Кроме того, были сделаны неожиданные находки, в частности обнаружена способность ССЬ21 усиливать макропиноцитоз и экспрессию СБ40 на ДК, а также усиливать эмиграцию ДК из кожи (МШ е! а1, 2010).

Заключение

При разработке новых иммуномодулирующих препаратов должны быть последовательно решены несколько задач: 1) получение препарата, обладающего стандартизованным молекулярным составом, что является залогом воспроизводимости биологических и клинических эффектов препарата; 2) характеризация видов активности и механизмов действия препарата; 3) исходя из охарактеризованных механизмов действия — определение сферы применения препарата; 4) определение доз, путей введения, продолжительности терапии, позволяющих добиться максимального терапевтического действия при минимуме побочных эффектов; 5) сбор доказательной базы, подтверждающей безопасность и клиническую эффективность препарата.

Насколько полно были решены эти задачи в настоящей работе? Во всех случаях использовали препараты, стандартизованные по составу (смесь трех естественных мурамилпептидов в известном соотношении, синтетический ОДН, рекомбинантные плазмиды известной последовательности). В тех случаях, когда препараты были доведены до стадии клинических испытаний, предварительная информация об их механизмах действия была собрана либо в ходе данной работы (Полимурамил), либо в работах других групп (СрС-ОДН 7909). В клинических испытаниях были получены доказательства иммунологической и клинической эффективности Полимурамила и СрС-ОДН 7909 у человека. Безусловно, необходимо дальнейшее накопление доказательной базы об эффективности этих препаратов.

При разработке мурамилпептидного иммуномодулятора мы отдавали предпочтение препарату естественного происхождения в форме для парентерального применения, исходя из следующего: 1) иммунная система человека эволюционно приспособлена к распознаванию именно естественных мурамилпептидов; 2) неограниченность источника сырья и отсутствие процедур химического синтеза делает получение естественного иммуномодулятора относительно недорогим; 3) парентеральный путь введения позволяет повысить биодоступность и дает возможность воздействовать на те клетки иммунной системы, которые не контактируют с

мурамилпептидами естественной микрофлоры и не обладают толерантностью к ним.

Некоторым недостатком Полимурамила можно считать его трехкомпонентность. Хотя иммуностимулирующей активностью обладают все три компонента, она выражена в разной степени (ГМтри > ГМтетра > диГМтетра). Более того, диГМтетра может обладать и дополнительным механизмом действия, связанным с его иммуногенными свойствами (хотя этот механизм, очевидно, не работает при тех дозах препарата, которые были использованы в клинических испытаниях). В ходе дальнейшей работы на базе Полимурамила может быть создано семейство мурамилпептидных препаратов, обладающих более направленным действием на врожденный и адаптивный иммунитет.

Результаты работы еще раз подчеркивают, что в основе клинического применения бактериальных иммуномодуляторов должно лежать четкое понимание принципов их действия на иммунную систему. Основная сфера применения бактериальных иммуномодуляторов — повышение резистентности против инфекций. Здесь бактериальные иммуномодуляторы решают ту же задачу, что и вакцины, но путем активации другой подсистемы иммунитета. Имеет смысл сравнить иммунобиологические свойства бактериальных иммуномодуляторов как активаторов врожденного иммунитета с действием вакцин, которые повышают резистентность путем активации адаптивного иммунитета.

Во-первых, поскольку индукция врожденного иммунного ответа происходит в течение нескольких минут и часов после начала стимуляции, то защитный эффект иммуномодуляторов наступает быстро. Напротив, защитный эффект вакцин связан с пролиферацией и дифференцировкой редких антиген-специфических Т- и В-клеток и развивается в течение недель и месяцев.

Во-вторых, поскольку врожденная иммунная система не обладает памятью (за редкими исключениями), то эффект иммуномодуляторов после окончания их приема длится не дольше нескольких суток. Напротив, действие вакцин благодаря Т- и В-клеткам памяти длится месяцы и годы.

В-третьих, врожденный иммунный ответ относительно неспецифичен. Поэтому ответ, индуцируемый данным иммуномодулятором, может вести к повышению резистентности против различных групп микроорганизмов. Напротив, вакцина эффективна только против тех микробов, чьи антигены содержатся в данной вакцине либо перекрестно реагируют с ними.

В-четвертых, к провоспалительным эффектам иммуномодуляторов развивается преходящая толерантность, тогда как прямое антибактериальное действие при повторных введениях иммуномодуляторов усиливается.

Перечисленными иммунобиологическими свойствами определяются основные показания к назначению бактериальных иммуномодуляторов. Это,

в частности: 1) лечение инфекционно-воспалительных заболеваний, особенно вызванных лекарственно-устойчивыми штаммами бактерий и/или протекающих на фоне иммунодефицита (при этих состояниях иммуномодуляторы применяются вместе с антибиотиками, согласно стратегии «двойного удара» [Пинегин, Андронова, 1998]); 2) быстрое повышение резистентности при угрозе индивидуального заражения (например, ВИЧ при незащищенном половом контакте) или массового заражения (например, в случае применения биологического оружия); 3) предоперационная подготовка при высоком риске инфекционных осложнений хирургических операций; 4) профилактика септического шока путем создания толерантности к провоспалительному действию микроорганизмов. Для достижения этих целей иммуномодуляторы, очевидно, должны назначаться однократно или коротким курсом. Особенно полезны иммуномодуляторы в тех случаях, когда вид возбудителя инфекции заранее не известен.

Полимурамил, создававшийся именно как противоинфекционный иммуномодулятор, обладает всеми иммунобиологическими свойствами, перечисленными выше. Иммуностимулирующее действие препарата наступает уже в первые часы после введения и длится не дольше нескольких суток после окончания введения (рисунок 12). Действие Полимурамила относительно неспецифично: хотя препарат получен из грамотрицательной бактерии (Salmonella typhi), он вызывает повышение резистентности к грамположительному микробу — золотистому стафилококку (таблица 1). К провоспалительным эффектам Полимурамила и его компонентов развивается толерантность (рисунки 8 и 9), тогда как антимикробные эффекты и собственно антимикробная защита при повторных введениях препарата возрастают (рисунок 9, таблица 1). Клиническая эффективность Полимурамила в данной работе была показана только в рамках совместного применения с антимикробными средствами. Однако учитывая свойства препарата, Полимурамил в перспективе может применяться для решения более широкого спектра задач, перечисленных выше, для чего требуется проведение соответствующих доклинических и клинических испытаний.

Назначение иммуномодуляторов при злокачественных опухолях преследует иные цели, а именно: активацию цитотоксического звена иммунитета, направленного на уничтожение клеток опухоли и ее стромы; перевод существующего в ткани опухоли «плохого» воспаления, поддерживающего опухолевый рост, в «хорошее», способствующее регрессу опухоли (Balkwill, Mantovani, 2012). Возможно, что для достижения этих целей требуется более длительный курс лечения, чем для профилактики и лечения инфекций. В работе показана принципиальная возможность добиться регресса злокачественной солидной опухоли — метастатической меланомы — путем длительной системной терапии CpG-ОДН, причем

механизм действия CpG-ОДН, по данным работы, связан с усилением цитотоксичности NK-клеток. Несмотря на некоторое разочарование этим классом препаратов, наступившее в последние 3—4 года, полный отказ от них был бы ошибкой, так как CpG-ОДН обладают терапевтическим действием у существенной части больных, а их побочные эффекты менее выражены, чем у химиопрепаратов (Krieg et al, 2012). Дальнейшая разработка CpG-ОДН как противоопухолевых иммуномодуляторов может идти по следующим направлениям: 1) оптимизация схем введения препарата; 2) выявление прогностических признаков эффективности/неэффективности CpG-ОДН, с целью предварительного отбора пациентов для этого вида терапии; 3) сочетание с другими иммуномодулирующими воздействиями, например с деплецией Treg-клеток; 4) минимизация провоспалительных эффектов CpG-ОДН при сохранении противоопухолевых, что может быть достигнуто, например, путем применения CpG-ОДН А-типа.

Генные технологии, предназначенные для направленной коррекции или модуляции экспрессии отдельно взятых генов, вероятно, будут занимать все более значимое место в арсенале иммуномодулирующих средств. В данной работе проиллюстрировано одно из направлений иммуномодуляции на генном уровне — регулирование миграции клеток иммунной системы путем помощью временной трансгенной экспрессии хемокинов, которая достигается с помощью бактериальных плазмидных векторов. Представленную работу можно рассматривать как «проверку принципа»: проведенные эксперименты показали, что трансгенный подход работоспособен и, вероятно, может использоваться для регулирования миграции различных популяций клеток иммунной системы при использовании соответствующих хемокинов.

В нашем случае, когда в качестве трансгена используется хемокин CCL21, мишенью воздействия являются ключевые «игроки», участвующие в индукции адаптивного иммунного ответа: зрелые ДК, субпопуляции Т-клеток, возможно активированные B-клетки. Наиболее очевидное практическое применение этого подхода состоит в повышении эффективности вакцинации. Это реализуется путем введения вакцины и трансгена в один и тот же лимфатический дренажный бассейн. Возможно использование этой технологии и для усиления естественного адаптивного иммунного ответа, например против злокачественной опухоли. В этом случае генные конструкции, предназначенные для экспрессии хемокина, должны вводиться в тот лимфатический бассейн, который дренирует ложе предварительно облученной или хирургически удаленной опухоли. Результаты, полученные в работе, дают основание для проведения прямых экспериментов, где будет оценено влияние трансгенной экспрессии хемокинов на антиген-специфический иммунный ответ.

выводы

1. Мурамилпептиды грамотрицательных бактерий ГМтри, ГМтетра и диГМтетра активируют клетки врожденной иммунной системы человека in vitro (ГМтри > ГМтетра > диГМтетра), что выражается, в частности, в индукции выработки провоспалительных цитокинов и хемокинов макрофагами и ДК, а также в созревании ДК. Основную роль в распознавании мурамилпептидов грамотрицательных бактерий играет рецептор NOD1, при участии NOD2 и TLR2. Активирующее действие мурамилпептидов на клетки врожденного иммунитета обеспечивается клатрин-зависимым эндоцитозом; пептидазным процессингом диГМтетра; активацией сигнальной цепочки «RIP2 — 1кВ-киназа — фактор транскрипции NF-кВ»; активацией киназы р38. .

2. ДК, по сравнению с МФ, слабее отвечают продукцией провоспалительных цитокинов и хемокинов на стимуляцию мурамилпептидами, что обусловлено более низкой эффективностью трансляции и более ранним прекращением транскрипции мРНК цито- и хемокинов в ДК, стимулированных мурамилпептидами.

3. Однократная стимуляция МФ мурамилпептидами вызывает состояние толерантности к мурамилпептидам, но не к ЛПС. Однократная стимуляция макрофагов ЛПС вызывает состояние толерантности к ЛПС, но не к мурамилпептидам. Состояния толерантности к мурамилпептидам и ЛПС могут быть индуцированы в МФ с помощью соответствующих агонистов одновременно и не влияют друг на друга.

I. Комплекс мурамилпептидов (КМП), состоящий из ГМтри, ГМтетра и диГМтетра, при курсовом введении мышам повышает резистентность к летальной инфекции золотистым стафилококком, с достижением максимальной защиты (70-80%) на 5-е-7-е сутки. Защита коррелирует с нарастанием бактерицидной активности активности лейкоцитов по отношению к стафилококку, а также с развитием толерантности к провоспалительному действию мурамилпептидов, что препятствует гиперстимуляции врожденной иммунной системы в ходе инфекции.

5. У мышей, получивших высокие дозы КМП, повышается титр AT, направленных против диГМтетра. Сыворотки, содержащие эти AT в высоком титре, защищают мышей от инфекции грамотрицательными бактериями.

КМП (препарат «Полимурамил») обладает объективной иммунологической активностью у здоровых добровольцев: усиливает бактерицидность лейкоцитов по отношению к золотистому стафилококку, вызывает повышение уровней С-реактивного белка, 1дМ и хемокинов в сыворотке крови. Препарат «Полимурамил» ускоряет выздоровление пациентов с гнойными хирургическими инфекциями при его добавлении к стандартному лечению.

Препараты класса СрО-ОДН, применяемые системно в режиме монотерапии, обладают объективной противоопухолевой активностью у части пациентов с метастатической меланомой, при отсутствии неприемлемой токсичности. Клиническая эффективность СрО-ОДН при метастатической меланоме связана с повышением цитотоксической активности ЫК-клеток в ходе лечения. В опухолевых очагах, прогрессировать которых возобновлялось после периода стабилизации или частичной ремиссии, выявлены признаки «ухода» опухоли от распознавания и/или киллинга КГК-клетками. К другим иммунологическим эффектам СрО-ОДН, отражающим механизм действия препарата, относятся: 1) гиперплазия регионарных лимфатических узлов с привлечением Т-клеток, В-клеток, МС-клеток, плазмацитоидных пре-ДК и индукцией выработки цитокинов ТЫ-профиля; 2) индукция выработки интерферонов I типа плазмацитоидными пре-ДК; 3) созревание плазмацитоидных пре-ДК; 4) повышение процентного и абсолютного содержания ранних плазматических клеток в крови; 5) снижение абсолютного содержания циркулирующих Ж-клеток; 6) активация СБ4+ Т-клеток, которая маскируется присутствующими в крови Тгец-клетками. Внутрикожное введение плазмидной конструкции, кодирующей хемокин ССЬ21, позволяет временно достичь высокой экспрессии биологически активного ССЬ21 в клетках эпидермиса у мышей. Трансгенная экспрессия ССЬ21 в эпидермисе позволяет дистанционно управлять клеточным составом регионарных лимфатических узлов: трансгенный ССЬ21 транспортируется из эпидермиса в регионарные лимфатические узлы, где вызывает накопление зрелых ДК и субпопуляций Т-клеток. Кроме того, ССЬ21 усиливает макропиноцитоз и экспрессию СБ40 дендритными клетками, усиливает их эмиграцию из кожи.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1- Пащенков М.В.. Пинегин Б.В. Основные свойства дендритных клеток. Иммунология, 2001, Т.22, №1, С.7-16.

2. Пащенков М.В.. Пинегин Б.В. Роль дендритных клеток в регуляции иммунного ответа. Иммунология, 2002, Т.23, №6, С.313-320.

3. Pashenkov М.. Teleshova N., Link Н. Inflammation in the central nervous system: the role for dendritic cells. Brain Pathology, 2003, V.13, N1, P.23-33.

4. Пащенков M.B.. Пинегин Б.В. Физиология клеток врожденной иммунной системы: дендритные клетки. Иммунология, 2006, Т.27, №6, С.368-377.

5. Pashenkov М.. Goess G., Wagner С., Hormann М., Jandl Т., Moser A., Britten СМ., Smolle J., Roller S., Mauch C., Tantcheva-Poor I., Grabbe S., Loquai C., Esser S., Franckson Т., Schneeberger A., Haarmann C., Krieg AM., Stingl G., Wagner SN. Phase II trial of a toll-like receptor 9-activating oligonucleotide in patients with metastatic melanoma. Journal of Clinical Oncology, 2006, V.24, N36, P.5716-5724.

6. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Пащенков M.B. Значение функциональной активности толл-подобных рецепторов и других рецепторов врожденной иммунной системы в физиологии почек. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2007, Т.93, №5, С.505-520.

7. Хаитов P.M., Пащенков М.В.. Пинегин Б.В. Роль патгерн-распознающих рецепторов во врожденном и адаптивном иммунитете. Иммунология,

2009, Т.30, №1, С.66-76.

8. Пащенков М.В.. Попилюк С.Ф., Алхазова Б.И., Львов В.Л., Феденко Е.С., Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. Иммунобиологические свойства мурамилпептидных фрагментов пептидогликана грамотрицательных бактерий. Иммунология, 2010, Т.31, №3, С.119-125.

9. Jalili A., Pashenkov М.. Kriehuber Е., Wagner С., Nakano Н., Stingl G., Wagner SN. Induction of targeted cell migration by cutaneous administration of a DNA vector encoding a biologically active chemokine CCL21. Journal of Investigative Dermatology, 2010, V.130, N6, P.1611-1623.

10. Pashenkov M.V.. Popilyuk S.F., Alkhazova B.I., L'vov V.L., Murugin V.V.', Fedenko E.S., Khaitov R.M., Pinegin B.V. Muropeptides trigger distinct activation profiles in macrophages and dendritic cells. International Immunopharmacology, 2010, V.10, N8, P.875-882.

11. Пащенков M.B.. Муругина H.E., Муругин В.В., Пинегин Б.В. Выявление и характеризация цитолитических CD8+ и CD4+ Т-клеток. Иммунология,

2010, Т.31, №1, С.4-12.

12. Пащенков М.В.. Пинегин Б.В. Изучение условий дифференцировки CD4+ цитотоксических Т-лимфоцитов. Труды XI Международного конгресса «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии». Российский Аллергологический Журнал, 2011, Т.4, С.284-286.

13. Пащенков М.В.. Будихина А.С., Голубева Н.М., Алхазова Б.И., Елисютина О.Г., Львов В.Л., Феденко Е.С., Пинегин Б.В., Хаитов P.M.

Результаты I фазы клинических испытаний иммуномодулятора «Полимурамил». Иммунология, 2011, Т.32, №6, С.239-243.

14. Пащенков М.В., Будихина A.C., Голубева Н.М., Алхазова Б.И., Львов В.Л., Ступин В .А., Привиденцев А.И., Трушин С.Н., Селиверстов Д.В., Огорельцев А.Ю., Пинегин Б.В., Хаитов P.M. Результаты II/III фазы клинических испытаний иммуномодулятора «Полимурамил» при гнойной хирургической инфекции. Иммунология, 2012, Т.ЗЗ, №4, С.199-203.

15. Пащенков М.В., Попилюк С.Ф., Алхазова Б.И., Львов В.Л., Муругин В.В., Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Влияние муропептидов, содержащих остаток мезо-диаминопимелиновой кислоты, на макрофаги и дендритные клетки человека. Цитокины и воспаление, 2012, Т.11, №1, С.33-41.

16. Пащенков М.В., Алхазова Б.И., Львов В.Л., Пинегин Б.В. Индукция толерантности макрофагов человека к липополисахариду и мурамилпептидам грамотрицательных бактерий. Российский иммунологический журнал, 2012, Т.6, №15, С.246-252.

17. Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Применение РНК-интерференции для изучения механизмов распознавания мурамилпептидов. Иммунология, 2012, Т.ЗЗ, №6, С.292-297.

18. Пащенков М.В., Пак В.Г., Алхазова Б.И., Львов В.Л., Пинегин Б.В. Индукция и защитные свойства антител к мурамилпептидам грамотрицательных бактерий. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 2013, №2, С.64-73.

19. Пащенков М.В.. Алхазова Б.И., Львов В.Л., Пинегин Б.В. Особенности индукции провоспалительных генов в дендритных клетках и макрофагах под действием глюкозаминилмурамилтрипептида грамотрицательных бактерий. Иммунология, 2013, Т.34, №1, С.10-15.

20. Пащенков М.В.. Алхазова Б.И., Львов В.Л., Пинегин Б.В. Применение ингибиторного анализа для изучения механизма действия мурамилпептидного иммуномодулятора «Полимурамил». Медицинская Иммунология, 2013, Т.15, №1, С.56-62.

21. Львов В.Л., Пинегин Б.В., Хаитов P.M., Пащенков М.В. Патент Российской Федерации RU 2441906 С2 «Применение композиции, состоящей из низкомолекулярных фрагментов пептидогликана грамотрицательных бактерий, для лечения и профилактики заболеваний человека». Бюллетень Роспатента №4 от 10.02.2012.

22. Хаитов P.M., Пащенков М.В.. Пинегин Б.В. Биология рецепторов врожденной иммунной системы. Физиология и патология иммунной системы, 2008, Т. 12, №6, С.3-28.

23. Пащенков М.В., Будихина A.C., Голубева Н.М., Алхазова Б.И., Львов В.Л., Ступин В.А., Привиденцев А.И., Трушин С.Н., Селиверстов Д.В., Огорельцев А.Ю., Феденко Е.С., Пинегин Б.В., Хаитов P.M. Клиническая и иммунологическая эффективность иммуномодулятора Полимурамил при гнойной хирургической инфекции. Физиология и патология иммунной системы, 2011, Т.15, №9, С.12-18.

24. Пащенков М.В.. Симонова А.В., Аршинова С.С., Мартынов А.И., Ярилин А.А., Пинегин Б.В., Кулаков В.В., Климова С.В., Никонова М.Ф., Шарова Н.И., Донецкова А.Д., Литвина М.М., Муругин В.В. Оценка клеточного иммунитета. Пособие для врачей клинической лабораторной диагностики. 50 с. М., 2009.

25. Pashenkov М., Goess G., Wagner С., Schneeberger A., Krieg A.M., Stingl G., Wagner S.N. Cancer regression induced by TLR9-targeted inummostimulatory CpG treatment in patients with metastatic melanoma: results of a clinical phase II trial. Journal of Investigative Dermatology, 2004, V.122, P.A58.

26. Wagner S.N., Pashenkov M.. Goess G., Wagner C., Schneeberger A., Krieg A.M., Stingl G. TLR9-targeted CpG immunostimulatory treatment of metastatic melanoma: A phase II trial with CpG 7909 (ProMune). Journal of Clinical Oncology, 2004, V.22, P.713S.

27. Jalili A., Pashenkov M., Wagner C., Stingl G., Wagner S.N. Construction of a DNA construct allowing the secretion of functionally active chemokines in vitro and in vivo. Archives of Dermatological Research, 2005, V.296, P.422.

28. Jalili A., Pashenkov M.. Wagner C., Nakano H., Stingl G., Wagner S.N. Induction of targeted cell migration by dermal administration of a DNA vector encoding a biologically active chemokine. Journal of Investigative Dermatology, 2005, V.125, P.A42.

29. Jalili A., Pashenkov M.. Wagner C., Nakano H., Stingl G., Wagner S.N. Transient reconstitution of a genetic defect by a DNA vector allowing the secretion of a biologically active chemokine. Journal of Investigative Dermatology, 2005, V.124, P.A83.

30. Jalili A., Pashenkov M.. Wagner C., Nakano H., Stingl G., Wagner S N CCL19/21 as survival rather than maturation factors for DCs. Journal of Investigative Dermatology, 2006, V.126, P.50.

31. Jalili A., Pashenkov M.. Wagner C., Nakano H., Stingl G., Wagner SN CCL21 as an inflammatory chemokine in the skin; impact on dendritic cell maturation and migration. Experimental Dermatology, 2007, V.16, P.210.

32. Jalili A., Pashenkov M.. Wagner C., Nakano H., Stingl G., Wagner S.N. CCL21 acts as an important regulator of skin inflammation by induction of antigen uptake, survival and migration of skin-residing dendritic cells. Journal oflnvestigative Dermatology, 2008, V.128, P.S168.

33. Jalili A., Pashenkov M.. Kriehuber E., Wagner C., Nakano H., Stingl G., Wagner SN. Induction of targeted cell migration by cutaneous administration of a DNA vector encoding a biologically active chemokine CCL21. Experimental Dermatology, 2011, V.20, P. 176.

34. Пащенков M.B., Арбатский Н.П., Алхазова Б.И., Львов В.Л., Пинегин Б.В. Особенности индукции провоспалительных генов в дендритных клетках и макрофагах под действием глюкозаминилмурамилтрипептида грамотрицательных бактерий. Труды XI Международного конгресса «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармаколопш». Российский Аллергологический Журнал 2011 Т.4, С.281-282. '

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

2-5-ОАС — 2'5'-олигоаденилатсинтетаза AT — антитела

ГМДП — глюкозаминилмурамилдипептид

ГМтри — глюкозаминилмурамилтрипептид

ГМтетра — глюкозаминилмурамилтетрапептид

ДК — дендритная клетка

диГМтетра — димер глюкозаминилмурамилтетрапептида

ИЛ — интерлейкин

ИФА — иммуноферментный анализ

ИФН — интерферон

КМП — комплекс мурамилпептидов

ЛПС — липополисахарид

ЛУ — лимфатический узел

мезо-ДАП — мезо-диаминопимелиновая кислота

МФ — макрофаг

ОДН — олигодезоксинуклеотид

ОПфно — остаточная продукция фактора некроза опухолей ппДК — плазмацитоидная пре-дендритная клетка ПЦР — полимеразная цепная реакция ФИО — фактор некроза опухолей ActD — актиномицин D CCL — СС chemokine ligand - хемокин СС-типа CCR — СС chemokine receptor - рецептор к СС-хемокину CpG-ОДН — ОДН, содержащий тандем(ы) «неметилированный цитозин— гуанин»

EGFP — enhanced green fluorescent protein - усиленный зеленый

флюоресцентный белок ELISPOT — enzyme-linked immunospot assay IKK — IxB-kinase - киназа фактора 1кВ

МСР-1 — monocyte chemotactic protein-1 - моноцитарный

хемотактический белок 1 MIP-ip — macrophage inflammatory protein-ip - макрофагальный

воспалительный белок-1 бета nod — nucleotide oligomerization domain - домен олигомеризации нуклеотидов

Pit — paucity of lymphoid tissue - разреженность лимфоидной ткани

RIP2 — receptor-interacting protein 2 - рецептор-взаимодействующий белок 2

Th — T helper - Т-хелпер

TLR — Toll-like receptor - То11-подобный рецептор

Treg — Т-регуляторная клетка

Подписано в печать оз.юлз . Формат 60x84/16. Бумага офисная «5уе<:оСору». Тираж 100 экз. Заказ № 652 Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора медицинских наук, Пащенков, Михаил Владимирович, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР «ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ» ФЕДЕРАЛЬНОГО МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО АГЕНТСТВА»

05201^5011 На правах рукописи

Пащенков Михаил Владимирович

ИММУНОМОДУЛЯТОРЫ НА ОСНОВЕ МУРАМИЛПЕПТИДОВ И БАКТЕРИАЛЬНОЙ ДНК: ОТ ЭКСПЕРИМЕНТА К КЛИНИКЕ

03.03.03 - иммунология

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Б.В.Пинегин

МОСКВА 2013

Оглавление

ОСНОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.....................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................6

ГЛАВА 1. Обзор литературы.....................................................................................................15

1.1 Общая характеристика иммуномодуляторов..................................................................15

1.2 Принципы функционирования врожденной иммунной системы.................................17

1.3 Бактериальные иммуномодуляторы как аналоги ПАМП..............................................25

1.4 Иммунобиологические и терапевтические свойства мурамилпептидов.....................28

1.5 Иммунобиологические и терапевтические свойства микробной ДНК и ее аналогов 45

1.6 Дендритные клетки — связующее звено между врожденным и адаптивным иммунитетом............................................................................................................................53

1.7 Роль хемокинов CCL19 и CCL21 в миграции дендритных клеток и клеток адаптивной иммунной системы.............................................................................................56

1.8 Дистанционное управление клеточным составом ЛУ как способ иммуномодулирующего воздействия....................................................................................59

1.9 Резюме................................................................................................................................60

ГЛАВА 2. Материалы и методы................................................................................................62

2.1 К главе 3.............................................................................................................................62

2.2 К главе 4.............................................................................................................................74

2.3 К главе 5.............................................................................................................................79

2.4 К главе 6.............................................................................................................................85

2.5 Статистическая обработка данных..................................................................................90

ГЛАВА 3. Иммунобиологические свойства мурамилпептидов грамотрицательных бактерий........................................................................................................................................91

3.1 Получение комплекса мурамилпептидов из S. typhi и подтверждение его биологической активности.....................................................................................................91

3.2 Влияние мурамилпептидов грамотрицательных бактерий на МФ и ДК человека in vitro............................................................................................................................................93

3.3 Факторы, определяющие различия в ответе ДК и МФ на мурамилпептиды in vitro 102

3.4 Характеризация рецепторов, участвующих в активации МФ под действием ГМтри и диГМтетра..............................................................................................................................109

3.5 Характеризация поглощения, процессинга и сигнальных путей ГМтри и диГМтетра в МФ........................................................................................................................................114

3.6 Иммуностимулирующая активность производных мурамилпептидов......................119

3.7 Индукция толерантности и перекрестной толерантности МФ к мурамилпептидам и ЛПС.........................................................................................................................................120

3.8 Влияние КМП грамотрицательных бактерий на врожденный иммунитет мышей ..124

3.9 Обнаружение и характеризация антител к КМП..........................................................128

ГЛАВА 4. Клиническая и иммунологическая эффективность комплекса мурамилпептидов грамотрицательных бактерий (препарата «Полимурамил»).................................................133

4.1 I фаза клинических испытаний......................................................................................134

4.2 II/III фаза клинических испытаний................................................................................141

ГЛАВА 5. Противоопухолевая активность и механизмы действия CpG-ОДН 7909 у пациентов с метастатической меланомой (II фаза клинических испытаний).....................145

5.1 Характеристики пациентов.............................................................................................145

5.2 Терапевтическая эффективность....................................................................................148

5.3 Нежелательные явления..................................................................................................149

5.4 Изменения фенотипических и функциональных свойств клеток крови в ходе лечения CpG-ОДН 7909.......................................................................................................................151

5.5 Лабораторные предикторы эффективности CpG-ОДН 7909 ......................................161

5.6 Анализ ЛУ, дренирующих места введения CpG-ОДН 7909.......................................161

5.7 Анализ метастазов, прогрессирующих после частичной ремиссии или стабилизации

.................................................................................................................................................167

ГЛАВА 6. Дистанционное управление миграцией клеток иммунной системы с помощью

трансгенной экспрессии хемокина CCL21 в коже.................................................................169

6.1 Трансфекция плазмидами, кодирующими mCCL21, приводит к экспрессии и секреции mCCL21 клетками COS-7 in vitro........................................................................169

6.2 Трансгенный mCCL21 обладает функциональной активностью................................171

6.3 Трансгенный и рекомбинантный CCL21 повышают поглощение декстрана и экспрессию CD40 на ДК.......................................................................................................174

6.4 Введение mCCL21 -кодирующих плазмид в кожу с помощью генного ружья вызывает экспрессию mCCL21 в эпидермисе с последующей диффузией в дерму и накоплением в дренирующих ЛУ........................................................................................175

6.5 Внутрикожное введение плазмид, кодирующих mCCL21, вызывает миграцию ДК и различных субпопуляций Т-клеток в дренирующие ЛУ...................................................177

6.6 Внутрикожное введение плазмиды, кодирующей mCCL21, усиливает эмиграцию ДК из трансфицированных участков кожи...............................................................................180

ГЛАВА 7. Обсуждение.............................................................................................................182

7.1 «Полимурамил» — иммуномодулятор на основе естественных мурамилпептидов грамотрицательных бактерий...............................................................................................182

7.2 CpG-ОДН 7909 — синтетический аналог бактериальной ДНК с противоопухолевой активностью...........................................................................................................................203

7.3 Дистанционное управление клеточным составом ЛУ путем трансгенной экспрессии хемокинов в коже..................................................................................................................214

7.4 Заключение.......................................................................................................................217

ВЫВОДЫ...................................................................................................................................222

БЛАГОДАРНОСТЬ...................................................................................................................224

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................................225

ОСНОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

2-5-ОАС — 2'5'-олигоаденилатсинтетаза

АГ — антиген

АПК — антигенпредставляющая клетка

AT — антитела

АЧТВ — активированное частичное тромбопластиновое время

БСА — бычий сывороточный альбумин

ВВЭ — венулы с высоким эндотелием (high endothelial venules)

ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография

ГМДП — глюкозаминилмурамилдипептид

ГМтри — глюкозаминилмурамилтрипептид

ГМтетра — глюкозаминилмурамилтетрапептид

ДК — дендритная клетка

диГМтетра — димер глюкозаминилмурамилтетрапептида

ИФА — иммуноферментный анализ

КИП — коктейль ингибиторов протеаз

КМП — комплекс мурамилпептидов

JI2000 — липофектамин 2000

ЛПС — липополисахарид

ЛУ — лимфатический узел

МАПК — митоген-активируемая протеинкиназа

МАТ — моноклональное антитело

МДП — мурамилдипептид

МЛУ — множественная лекарственная устойчивость

МНК — мононуклеарная клетка

МФ — макрофаг

НЯ — нежелательное явление

ОДН — олигодезоксинуклеотид

OnjNF — остаточная продукция фактора некроза опухолей

ПАМП — патоген-ассоциированный молекулярный паттерн

ПГ — пептидогликан

пДК — плазмацитоидная дендритная клетка

пДНК — плазмидная ДНК

ппДК — плазмацитоидная пре-дендритная клетка

ПЗ — прогрессирование заболевания

ПМ — «Полимурамил»

ПР — полная ремиссия

ПРР — паттерн-распознающий рецептор

ПЦР-РВ — полимеразная цепная реакция в реальном времени

СЗ — стабилизация заболевания

СИФ — средняя интенсивность флюоресценции

УДФ — уридиндифосфат

ФР — физиологический раствор

ХЛ — хемилюминесценция

ЦТЛ — цитотоксический Т-лимфоцит

4P — частичная ремиссия

ЭБ — эритроциты барана

ЭЕ — эндотоксиновая единица

ActD — актиномицин D

CCL — CC chemokine ligand - хемокин СС-типа

CCR — CC chemokine receptor - рецептор к СС-хемокину

CFSE — карбоксифлюоресцеина сукцинимидиловый эфир

CpG-ОДН — ОДН, содержащий тандем(ы) «неметилированный цитозин — гуанин)

CRP — C-reactive protein - С-реактивный белок

СТСАЕ — Common Terminology Criteria for Adverse Events - общие

терминологические критерии нежелательных явлений

CXCL — СХС chemokine ligand - хемокин СХС-типа

EGFP — enhanced green fluorescent protein - усиленный зеленый флюоресцентный белок

ELISPOT — enzyme-linked immunospot assay

FAM — 6-карбоксифлюоресцеин

FITC — флюоресцеина изотиоцианат

GAPDH — глицеральдегидфосфатдегидрогеназа

GM-CSF — гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

IFN — интерферон

IKK — iKB-kinase - киназа фактора 1кВ

IL — интерлейкин

IRAK — interleukin-1 receptor-associated kinase - киназа, ассоциированная с

рецептором к интерлейкину-1

IRES — internal ribosome entry site - внутренний сайт входа в рибосомы

LAL — limulus amoebocyte lysate - лизат амебы лимулюс

Lin — общее обозначение линейных маркеров CD3, CD14, CD16, CD19, CD56

МСР-1 — monocyte chemotactic protein-1 - моноцитарный хемотактический белок 1

meso-DAP — л/езо-диаминопимелиновая кислота

МНС — major histocompatibility complex - главный комплекс гистосовместимости

MIP — macrophage inflammatory protein - макрофагальный воспалительный белок

MyD88 — myeloid differentiation antigen 88 - миелоидный дифференцировочный антиген 88

NF-kB — nuclear factor kappa В - ядерный фактор каппа-В

NLR — NOD-like receptor - NOD-подобный рецептор

NOD — nucleotide oligomerization domain - домен олигомеризации

олигонуклеотидов

РЕ — phycoerythrine - фикоэритрин

Pit — paucity of lymphoid tissue - разреженность лимфоидной ткани

RIP2 — receptor-interacting protein 2 - рецептор-взаимодействующий белок 2

siRNA — small interfering ribonucleic acid - малая интерферирующая РНК

Th — T helper - Т-хелпер

TLR — Toll-like receptor - То11-подобный рецептор

TNF — фактор некроза опухолей

Treg — Т-регуляторная клетка

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Разработка препаратов, направленных на повышение резистентности организма против инфекций и на отторжение злокачественных опухолей является важной, актуальной задачей. Это обусловлено ростом частоты инфекций, вызванных антибиотикоустойчивыми штаммами бактерий [127], ростом частоты хронических инфекционно-воспалительных заболеваний, сопровождающихся вторичными иммунодефицитами, ростом частоты злокачественных новообразований.

Повышение резистентности против инфекций может быть достигнуто путем стимуляции как адаптивного, так и врожденного компонентов иммунной системы. Вакцины активируют адаптивный иммунитет и обеспечивают длительную специфическую защиту, которая, как правило, развивается медленно и эффективна только против одного вида микроорганизмов. Иммуномодуляторы бактериального происхождения активируют врожденный иммунитет. Поэтому защитное действие этой группы препаратов, в отличие от действия вакцин, наступает быстро, а также является относительно неспецифичным, т.е. эффективным против больших групп патогенов. Все это делает иммуномодуляторы бактериального происхождения мощными средствами не только профилактики, но и лечения инфекций. Иммуномодуляторы, в отличие от антибиотиков, не действуют непосредственно на микробы, в связи с чем к ним не формируется лекарственной устойчивости у микробов. Кроме того, правильно подобранная иммуномодулирующая терапия позволяет частично или полностью восстановить нарушенную функцию иммунитета у пациентов с вторичными иммунодефицитами, по крайней мере на время лечения антибиотиками.

Учитывая сказанное, иммуномодуляторы бактериального происхождения целесообразно применять совместно с антибиотиками для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний, особенно при инфекциях лекарственно-устойчивыми штаммами и/или при наличии иммунодефицитных состояний (стратегия «двойного удара» [18]). Кроме того, эта группа иммуномодуляторов может применяться и в ситуациях, требующих быстрого повышения резистентности организма при угрозе индивидуального или массового заражения. Учитывая разнообразие

микроорганизмов, иммуиомодулятора «против всех инфекций», вероятно, не существует. Однако поиск препаратов, дающих оптимальную защиту против определенных видов инфекций, оправдан и пока далек от завершения.

Известные на сегодня бактериальные иммуномодуляторы относятся в основном к двум группам: 1) мурамилпептиды и их синтетические аналоги; 2) нуклеиновые кислоты и их синтетические аналоги. Мурамилпептиды представляют собой мономерные фрагменты пептидогликана (ПГ) бактерий. Все известные на сегодня мурамилпептидные иммуномодуляторы, в том числе отечественный препарат Ликопид, являются аналогами мурамилдипептида, который активирует врожденный иммунитет через рецептор NOD2 [123, 254]. В то же время мурамилпептиды грамотрицательных бактерий обладают структурной особенностью, а именно содержат в 3-м положении пептидной части остаток мезо-диаминопимелиновой кислоты (мезо-ДАП). Такие мурамилпептиды распознаются рецептором NOD1 [79]. По данным литературы, агонисты NOD1 являются более эффективными активаторами системы фагоцитов, чем агонисты NOD2, и поэтому лучше защищают от бактериальных инфекций [85]. Однако возможности терапевтического применения мурамилпептидов грамотрицательных бактерий, активирующих рецептор NOD1, практически не исследованы. Недостаточно изучены механизмы действия этих мурамилпептидов на клетки врожденной и адаптивной иммунной системы и на организм человека в целом, не охарактеризована возможная терапевтическая эффективность при инфекционно-воспалительных заболеваниях.

Целью иммуномодулирующей терапией при онкологических заболеваниях является разрыв выгодных для опухоли взаимоотношений с иммунной системой, активация клеток-эффекторов противоопухолевого иммунитета. В этом отношении привлекательны синтетические олигодезоксинуклеотиды (ОДН), содержащие тандемы «неметилированный цитозин — гуанин» (CpG). Эти соединения представляют собой синтетические аналоги бактериальной ДНК [208]. CpG-ОДН обладают несколькими видами противоопухолевой активности: вызывают выработку интерферонов I типа, которые обладают антипролиферативным и иммунодулирующим действием; посредством интерферонов вызывают активацию противоопухолевых эффекторов — NK-клеток, CD8+ Т-клеток; вызывают

созревание плазмацитоидных дендритных клеток, что способствует индукции адаптивного иммунного ответа против опухоли [203]. В доклинических испытаниях на животных показана противоопухолевая активность CpG-ОДН in vivo, тогда как в I фазе клинических испытаний показана безопасность CpG-ОДН у человека [207]. Однако терапевтическая эффективность CpG-ОДН у пациентов со злокачественными опухолями не изучена. Не решен принципиальный вопрос: возможно ли путем активации врожденной иммунной системы с помощью CpG-ОДН добиться регресса злокачественной опухоли у человека. Не охарактеризованы механизмы действия CpG-ОДН при злокачественных новообразованиях, биомаркеры ответа иммунной системы на CpG-ОДН, предикторы возможной клинической эффективности CpG-ОДН.

Бактериальная ДНК, помимо активации врожденного иммунитета, может выступать и в ином качестве — как носитель (вектор) генотерапевтического воздействия. Традиционные бактериальные иммуномодуляторы, воздействуя на клетки иммунной системы, вызывают изменение экспрессии сотен генов. Генотерапия представляет собой принципиально иной подход к иммуномодуляции, поскольку позволяет более тонко влиять на отдельные процессы в иммунной системе путем изменения экспрессии отдельных генов. Одним из таких процессов является миграция клеток, которая контролируется хемокинами (цитокинами-хемоаттрактантами). Регулирование миграции путем трансгенной экспрессии хемокинов, которая обеспечивается бактериальными векторами, можно рассматривать как способ иммуномодулирующего воздействия. Однако возможности этого подхода практически не изучены. В частности, одним из ключевых хемокинов, регулирующих миграцию клеток врожденной и адаптивной иммунной системы, является CCL21 [381]. Неизвестно, можно ли с помощью плазмидных векторов добиться значимой экспрессии CCL21 in vivo. Неизвестны кинетика и распределение трансгенного белка в организме. Неизвестно, какое влияние может оказывать трансгенный CCL21 на миграцию клеток в месте экспрессии и во вторичных лимфоидных органах.

Цели и задачи

Информация о работе

Пащенков, Михаил Владимирович
доктора медицинских наук
Москва, 2013
ВАК 03.03.03

Диссертация

Иммуномодуляторы на основе мурамилпептидов и бактериальной ДНК: от эксперимента к клинике - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы