ДНК-иммунизация против вируса простого герпеса 1 типа: сравнительный анализ протективного действия генов цитокинов и синтетических пептидов

Козлов, Алексей Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
ДНК-иммунизация против вируса простого герпеса 1 типа: сравнительный анализ протективного действия генов цитокинов и синтетических пептидов
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "ДНК-иммунизация против вируса простого герпеса 1 типа: сравнительный анализ протективного действия генов цитокинов и синтетических пептидов"

на правах рукописи

Козлов Алексей Юрьевич

ДНК-ИММУНИЗАЦИЯ ПРОТИВ ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА 1 ТИПА: СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРОТЕКТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ И СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ

ОЗ.ОО.ОЗ.-молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

Доктор биологических наук, профессор Кущ Алла Александровна Доктор биологических наук, профессор Новиков Виктор Владимирович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук, профессор Гараев Мансур Мухамедович Доктор медицинских наук, профессор Воробьева Майя Сергеевна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Гематологический научный центр РАМН, Москва.

Защита состоится « 17» января 200£"г. в 12.00 часов на заседании диссертационного Совета Д.001.020.01 при ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (адрес: 123098 Москва, ул. Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

2004 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета Доктор медицинских наук

Н.П. Косякова

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы.

Вирус простого герпеса (ВПГ) является причиной многих тяжелых заболеваний человека, проявляющихся в виде воспалительных поражений различных органов и тканей (герпетического кератита, энцефалита, уретритов, вагинитов). Большинство людей вступают в контакт с ВПГ1 в раннем возрасте (в 3 года - 6 лет). В 99% случаев после контакта у иммунокомпетентных детей клинические симптомы не развиваются, но в сыворотке можно обнаружить антитела. К 13-14-летнему возрасту, в среднем, инфицировано 70-83% детей, в возрасте 50 лет и старше антитела к ВПГ1 и/или 2 типа выявляются у 90% населения (Абазова и др., 1997). В США от ВПГ1 и 2 страдают более 150 млн. человек, и ежегодно инфицируется еще около 0.5 млн. человек (McClements et al., 1996, Whitley, Roizman, 2002). В России ввиду отсутствия должной выявляемости и учета показатель заболеваемости генитальным герпесом составил в 1996 -1999 гг. лишь 11-16 случаев на 100 тыс. населения (против 80-200 случаев на 100 тыс. населения за рубежом) (Тихонова, 1997). По данным опубликованных работ, ВПГ1/2 инфицировано около 22 млн. человек в РФ (Козлова, Пухнер, 1997). Можно предположить, что эта цифра занижена в 5-10 раз.

В настоящее время имеется большое количество лекарственных препаратов для лечения герпетической инфекции, однако заболеваемость, вызванная ВПГ1 и ВПГ2, продолжает расти. Существующая в нашей стране противогерпетическая вакцина на основе инактивированного вируса прошла успешные испытания, однако, при ее применении существует вероятность реактивации вируса в случае его неполной инактивации (Баринский и др., 1999). В зарубежных странах разрабатывают вакцины против герпеса с использованием различных подходов. Один из них основан на получении индивидуальных рекомбинантных вирусных белков. Как показали испытания в США, субъединичные вакцины на основе вирусных белков обеспечивают лишь частичную защиту от первичного заражения и приводят к незначительному сокращению рецидивов заболевания у людей, страдающих генитальным герпесом (Straus et al., 1994). Это стимулирует дальнейшее развитие альтернативных подходов, одним из которых является генетическая иммунизация и создание ДНК-вакцин. ДНК-иммунизация основана на использовании ДНК-конструкций, кодирующих специфические иммуногены. В качестве специфического иммуногена в нашей работе использовался поверхностный гликопротеин gD ВПГ, так как он играет важную роль во взаимодействии вируса с клетками-мишенями и содержит эпитопы, индуцирующие образование вируснейтрализующих антител. Одним из важных компонентов вакпинных-лрепаратов являются алъюванты. Преимущество

ДНК-вакцин состоит в возможш

конструкций с другими

генами, например с генами цитокинов. По имеющимся данным такой подход позволяет существенно повысить уровни как Т-клеточного, так и гуморального иммунного ответов. Перспективными компонентами ДНК-вакцин могли бы быть также новые синтетические иммуномодуляторы, которые обладают иммунорегуляторными свойствами. Разработка биотехнологических препаратов на основе новых подходов является важной задачей здравоохранения, так как позволяет создавать вакцинные препараты, сочетающие высокую эффективность и полную безопасность.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение иммунного ответа и протективных свойств ДНК-конструкции, содержащей ген белка gD ВПГ, и сравнительный анализ адъювантных свойств двух генов - гена фактора некроза опухоли (TNF) и гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), а также двух синтетических пептидов - глюкозаминил-мурамилдипептида (ГМДП) и Гепона.

Для достижения цели ставились следующие задачи:

1. Получить гибридомные клеточные линии, стабильно продуцирующие моноклональные антитела (МКА), взаимодействующие с белком gD ВПГ1.

2. Изучить способность ДНК-конструкции на основе плазмиды pcDNA-3.1(+), содержащей ген gD ВПГ1 (pDNAgD), экспрессироваться в эукариотических клетках линии Vero.

3. Провести сравнительный анализ эффективности различных способов введения pDNAgD in vivo и определить наиболее эффективный способ введения плазмидной конструкции pDNAgD.

4. Исследовать показатели Т-клеточного и В-клеточного иммунных ответов на ДНК-иммунизацию pDNAgD, установить сроки формирования их максимальных уровней, и длительность циркуляции противовирусных антител в крови иммунизированных животных.

5. Провести сравнительный анализ адъювантных свойств 2-х ДНК-плазмид, содержащих ген TNF (pDNATNF) и ген GM-CSF (pDNAGM-CSF), и 2-х синтетических пептидов ГМДП и Гепона.

6. Изучить защитный эффект ДНК-иммунизации pDNAgD, проведенной совместно с изученными адъювантами.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Получены гибридомы, продуцирующие МКА, взаимодействующие с белком gD ВПГ1иВПГ2.

-32. Показано, что внутримышечная ДНК-иммунизация pDNAgD приводит к формированию более высоких уровней Т-клеточного ответа, чем подкожное введение ДНК.

3. Показано, что использование в качестве адъювантов при ДНК-иммунизации pDNAGM-CSF и ГМДП приводит к повышению защитного эффекта однократной иммунизации pDNAgD с 63% до 96-100%.

4. Установлено, что усиление Т-клеточного и В-клеточного иммунных ответов in vitro, происходящее под действием pDNATNF при ДНК-иммунизации, не приводит к усилению защитного эффекта in vivo.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. МКА, полученные в ходе работы, направлены к белку gD ВПГ и активно взаимодействуют с ВПГ1 и 2 в иммунохимических, иммунологических и вирусологических реакциях.

2. Показана способность полученных МКА выявлять белок gD in situ в эукариотических клетках, трансфицированных ДНК-конструкцией pDNAgD in vitro, a также в клетках, инфицированных ВПГ1/2.

3. Установлена оптимальная схема введения pDNAgD in vivo. Определены сроки формирования максимальных уровней Т- и В-клеточных иммунных ответов и длительность циркуляции анти-ВПП антител.

4. Проведен сравнительный анализ адыовантных свойств белка TNF (мФНО), pDNATNF, pDNAGM-CSF, ГМДП и Гепона и установлено, что pDNAGM-CSF и ГМДП существенно повышают эффективность защиты животных от заражения летальными дозами ВПГ 1.

Апробация работы.

Основные положения работы были представлены на международном конгрессе «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека» (8-19 июня 2003 г. Украина), Российском Национальном конгрессе «Человек и Лекарство» (19-23 апреля 1004 г. Москва) и на заседании бюро ОПМ РАМН (30 марта 2004 г. Москва). В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и апробационного совета ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 30 сентября 2004 г.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и тезисы 2 докладов в материалах российских и международных конференций.

Структура и объем диссертации.

Материалы изложены на 140 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 224 источника. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 12 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Животные. Опыты проводили на мышах линии BALB/c, самках с массой тела 1822 г, полученных из Центрального питомника лабораторных животных "Крюково" РАМН.

Вирус и клетки. ВПГ1, референс-штамм F, любезно предоставленный профессором L. Pereira (США), поддерживали путем пассирования на культуре клеток Vero, выращиваемых на среде Игла ("ICN", США), содержащей 10% ЭТС ("ПАНЭКО", Россия), 2мМ глутамина, 50 мкг/мл гентамицина в атмосфере 5% СО2. Концентрирование вируса проводили путем центрифугирования цитоплазматической фракции зараженных клеток Vero в течение 2 часов при 12000 об/мин, на центрифуге Beckman J2-21 М/Е, ротор JA-14. Инфекционную активность вируса in vitro определяли в тесте бляшкообразования и выражали в бляшкообразующих единицах на 1 мл (БОЕ/мл). Летальную дозу ВПГ1 определяли путем заражения животных (мышей линии BALB/c) вирусом в последовательных разведениях (цельный вирус, внутрибрюшинно, по

1 мл. Смертность животных учитывали в течение 60 дней после заражения. Расчет летальной дозы ВПП проводили по формуле:

С[ = доля мышей (в %), павших при максимальном разведении вируса,

вызвавшем летальность выше 50% С; доля мышей (в %), павших при минимальном разведении вируса, вызвавшем летальность ниже 50%

Расчет показал что, инокулят содержал

В качестве ростовой среды для культивирования гибридомых клеток и спленоцитов использовали среду RPMI-1640 ("ICN", США), содержащую 15-20% ЭТС, 4.5 г/л глюкозы, 2мМ глутамина, 0.2 ед./мл инсулина, 50 мкг/мл гентамицина.

Получение МКА. Самок мышей линии BALB/c иммунизировали 5-кратно с интервалом 2 недели. В качестве антигенов использовали рекомбинантный белок gD (rgD) ВПП, любезно предоставленный д.б.н. Улановой Т.В. (Н.Новгород) и содержащий

последовательности с 266 по 394 а.о. ВПГ1 и белок слияния - GST (128 а.о.), а также очищенный ВПП. Первую иммунизацию проводили rgD в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ), вторую - четвертую инъекции - с неполным адъювантом. rgD вводили внутрибрюшинно по 20 мкг на животное. 5-ая иммунизация проводилась очищенным ВПП, внутрибрюшинно, 50 мкг на мышь. Бустерная доза (50 мкг ВПП, внутрибрюшинно) вводилась за 3 дня до выделения селезенки. Гибридизацию клеток проводили по методу (КоЫег, Milstain, 1976). Скрининг AT в культуральной жидкости осуществляли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и непрямого иммунофлюоресцентного анализа. Гибридные клетки клонировали методом предельных разведений.

Асцитные жидкости (АЖ), содержащие МКА, получали путем введения 5-10 млн. гибридомных клеток в брюшную полость мышей BALB/c, предварительно сенсибилизированных пристаном ("Serva", Германия).

Иммуноглобулины (Ig) из асцитных жидкостей выделяли с помощью 2-кратного осаждения сульфатом аммония до 50% насыщения с последующей аффинной очисткой на колонке с протеин-А сефарозой CL-4B ("Pharmacia", Швеция) по методике, рекомендованной фирмой. Оптическую плотность растворов Ig измеряли на спектрофотометре ("Beckman", Германия) при длине волны 280 нм. Концентрацию белка определяли по формуле:

C=D/1,34, где D - оптическая плотность, С - концентрация белка (мг/мл), 1,34 -оптическая плотность раствора бежа с концентрацией 1 мг/мл. Определение субкласса МКА, синтезируемых гибридомными клеточными линиями, проводили методом ИФА с помощью набора "Mouse-Hybridoma-Subtyping Kit" ("Boehringer Mannheim", Германия).

Твердофазный ИФА. 96-луночные планшеты сенсибилизировали очищенным вирусом или rgD в объеме 0.1 мл при концентрации 10 мкг/мл по белку в 0.05 М карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9.5) или в фосфатно-солевом буфере (рН 7.5), в течение 2 часов при 37°С. После инкубации с МКА или сыворотками мышей в серийных разведениях добавляли анти-мышиные AT, конъюгированные с пероксидазой хрена. В качестве субстрата использовали ортофенилендиамин ("Sigma", США).

Непрямой иммунофлюоресцентный анализ (нИФ). ВПГ-инфицированные клетки Vero (0,01 БОЕ/кл) и неифицированные клетки той же линии, выращенные на покровных стеклах, промывали 0,1 М фосфатно-солевым буфером рН 7.5, высушивали на воздухе, фиксировали охлажденным ацетоном 10 мин. На фиксированные препараты наносили культуральную жидкость от гибридом или очищенные МКА и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Затем промывали проточной водой и наслаивали антивидовую сыворотку, меченную флюорохромом ФИТЦ (производство НИИ эпидемиологии и

микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи) в течение 30 минут при 37°С. Окрашенные препараты исследовали с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ И-1.

Иммуноген (плазмида pDNAgD). В качестве специфического вирусного иммуногена использовали плазмиду pcDNAgDHSV, любезно предоставленную проф. D. Emanuel, США. Плазмида была получена на основе коммерческой плазмиды pcDNA-3.1(+) ("Invitrogen", США), в которую был встроен ген gD ВПГ и маркерный ген пео (неомицин-фосфотрансферазы).

Плазмидную ДНК, содержащую ген gD (pDNAgD), получали, трансформируя клетки Е. соИ, и очищали, используя набор "Qiagen maxiprep kit" ("Qiagen Inc.", США).

Выделение рекомбинантного белка - фактора некроза опухолей мышей (мФНОй). Клетки E.coli штамма SG 20050 трансформировали плазмидой pmTNF, содержащей ген мышиного TNFö под контролем триптофанового промотора (Шингарова и др., 1996). Рекомбинантный белок выделяли двукратной хроматографией. Концентрацию очищенного препарата определяли, используя Protein assay kit ("Bio-Rad", США), биологическую активность устанавливали в стандартном тесте (Kramer, Carwer, 1986).

Конструирование плазмиды для эукариотической экспрессии гена мышиного TNFa. Данный раздел работы был выполнен совместно с сотрудниками ИБХ им. М.М. Шемякина и ЮА. Овчинникова РАН, Л.Н. Шингаровой, О.В. Некрасовой и Е. Ф. Болдыревой.

Клетки селезенки мышей активировали конканавалином А и выращивали 24 часа при 37°С. Суммарную мРНК выделяли при помощи Trizol Reagent по методике производителя ("Gibco BRL", США). Далее работа проводилась в ИБХ РАН, как описано (Климова и др., 2004).

В результате была получена плазмида pcmTNF, в дальнейшем обозначаемая как pDNATNF; ее строение подтверждено рестриктным анализом и определением нуклеотидной последовательности участка ДНК, клонированного при помощи ПЦР. Секвенирование проводили с использованием набора Cycle ReaderTM DNA Sequencing Kit ("Fermentas", Литва).

Конструирование плазмиды для эукариотической экспрессии гена мышиного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (pDNAGM-CSF). Клетки селезенки мышей активировали конканавалином А (конА) и выращивали 24 ч при 37 в атмосфере 5% СО2. Суммарную мРНК выделяли при помощи Trizol Reagent ("Gibco BRL", США) по методу (Cromczynski, 1987). Далее работа проводилась в ИБХ РАН, как описано (Козлов и др., 2005).

Трансфекция in vitro. Для получения генетически трансформированных клеток, экспрессирующих белок gD ВПГ1 использовали перевиваемую клеточную линию Vero, чувствительную к данному вирусу. Для трансфекции клеток использовали плазмиду pDNAgD, содержащую маркерный ген пео. Трансфекцию клеток Vero осуществляли стандартным кальций - фосфатным методом. Селекцию трасформантов проводили в культуральной среде, содержащей - генетицин (G-418) в концентрации 400 мкг/мл. После трансфекции клетки фиксировали в разные сроки и изучали экспрессию гена gD методом непрямой иммунофлюоресценции (нИФ) при помощи оригинальных МКА к белку gD (МКА 4g8), получение которых описано выше.

ДНК-иммунизация. Мышей иммунизировали pDNAgD внутримышечно в четырехглавую мышцу бедра обеих задних лап, и/или подкожно и область лимфатических узлов, вводя иглой от 10-20 мкг до 100-110 мкг очищенной ДНК на животное с различными интервалами, как описано в разделе Результаты. Другие плазмидные ДНК, цитокины, белки и пептиды вводили внутримышечно в следующих количествах на одно животное: мФНОо - по 0,1 мкг; pDNATNFö - по 100 мкг; ГМДП (был любезно предоставлен Андроновой Т.М.) - по 300 мкг; pDNAGM-CSF - по 100 мкг; Гепон (был любезно предоставлен Атауллхановым Р.И.) - по 0,1 мкг; белок gD - по 2 мкг; вектор без вставки pDNAMOCK - по 100 мкг.

Реакцию нейтрализации вирусной активности проводили на культуре клеток Vero. Сыворотки мышей в различных разведениях инкубировали с ВПП, инфекционная множественность (ИМ) которого составляла 0.01 БОЕ/кл., в течение 2 часов при 37°С. После инкубации смесь сыворотки и ВПП вносили на монослой клеток Vero. За развитием цитопатического действия (ЦПД) наблюдали в течение 7 дней.

Определение ВПГ-специфических иммуноглобулинов класса IgGl и IgG2a проводили методом ИФА как описано выше. Изотип сывороточных Ig, связавшихся с ВПП, определяли в тест-системе "Mouse-Hybridoma-Subtyping Kit" ("Boerhringer Mannheim", Германия).

Для определения количества CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов в селезенке спленоциты центрифугировали в градиенте Фикол-Пака. Клеточную суспензию (106кл/мл) разводили в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) с 5% альбумина и инкубировали в течение 30 мин в темноте при +4°С. Клетки отмывали, фиксировали 1% парафармальдегидом и окрашивали ФИТЦ-меченными моноклональными антителами к рецепторам CD4 и CD8 ("BD Bioscience", Германия). Количество CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов анализировали методом проточной цитофлюрометрии с помощью установки "FACS Calibur" ("BD", США).

О стимуляции пролиферации Т-лимфоцитов судили по изменению морфологии клеток в реакции бластгрансформации in vitro. Спленоциты, выделенные в градиенте Фикол-Пака, помещали в 96 луночные планшеты по 105 клеток в лунку. В лунки вносили инактивированный ВПГ1 с ИМ 1.0 БОЕ/кл и инкубировали 5 дней при 37°С в атмосфере 5% СО2. В качестве положительного контроля пролиферации использовали конканавалин А (КонА) в концентрации 5 мкг/мл, в качестве отрицательного контроля -необработанные клетки. Подсчитывали количество бластов на ю5 клеток селезенки. Результаты представляли в виде индекса стимуляции пролиферации (ИСП), который рассчитывали как отношение количества бластов в популяции спленоцитов иммунных животных к количеству бластов у неиммунизированных животных.

Активность интерферона (ИФа) в сыворотках крови мышей оценивали в культуре клеток Vero с помощью тест-вируса энцефаломиокардита мышей (ЕМС, штамм Колумбия). Через 24 часа после внесения ЕМС оценивали ЦПД. За единицу активности ИФ принимали величину, обратную максимальному разведению сыворотки животных, при котором наблюдалась 50%-ая задержка деструкции клеток при 100% ЦПД в контроле. В качестве положительного контроля использовали референс-образец ИФа мыши с активностью 64 усл. ед. в 1 мл, любезно предоставленный В.В. Малиновской (НИИ Микробиологии и Эпидемиологии им. Н.Ф. Гамалеи, РАМН).

Протективный эффект изучали, используя по 10-30 мышей линии BALB/c в каждой группе. Мышей иммунизировали однократно или двукратно с интервалом в две недели между инъекциями одной плазмидной ДНК pDNAgD или pDNAgD в сочетании с различными соединениями (мФНО, pDNATNF, pDNAGM-CSF, ГМДП, Гепон). В качестве отрицательного контроля мышам вводили либо физиологический раствор, либо "пустой" вектор pDNA без вставки, либо все перечисленные соединения без pDNAgD. Через 21 день после последней иммунизации мышам вводили внутрибрюшинно концентрированный ВПГ1 в дозе 160 LD50, которая была определена в предварительных опытах и соответствовала Контрольная группа мышей получала дважды по

0,1 мл ФСБ с последующим заражением ВПГ1 в той же дозе.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.

На первом этапе работы были получены и охарактеризованы МКА к ВПГ1. Для получения гибридомных клеточных линий, продуцирующих МКА, была проведена серия экспериментов по слиянию клеток. В опытах использовали спленоциты мышей, гипериммунных к рекомбинантному белку ВПГ (rgD) и/или очищенному ВПП, с титром специфических антител в сыворотке крови не менее, чем 1:100 в нИФ и 1:1o"4 в ИФА. В

результате проведенных экспериментов было получено 324 гибридных клона, устойчивых к селективной среде HAT. Начиная с 14 дня, проводили скрининг гибридомных культур на присутствие антител к белкам ВПП методом ИФА. В качестве антигенов, сорбированных на дно 96 луночных панелей, использовали натуральный вирусный антиген, приготовленный как описано в разделе "Материалы и методы", и rgD ВПГ. Использование натурального вирусного антигена было необходимо в связи с тем, что рекомбинантный белок представляет собой химерную молекулу, состоящую из последовательностей белка gD ВПГ (266-394 а.о.) и бежа слияния GST. Скрининг проводили также методом нИФ, который является высокочувствительным для выявления МКА к сверхранним белкам ВПГ. При первичном скрининге было отобрано 68 клонов, реагировавших с ВПГ или rgD ВПГ. В результате клонирования и реклонирования методом предельных разведений отобрано 6 стабильно продуцирующих гибридом. Асцитные жидкости были получены от всех 6 гибридомных клонов. Продукция МКА гибридомными клетками повышалась при их культивировании in vivo в брюшной полости мышей BALB/c. Ig, содержащиеся в асцитных жидкостях, выделяли и подвергали иммунохимическому анализу.

Изучение активности МКА в реакции нИФ показало (таблица 1), что все изученные МКА способны взаимодействовать с белком gD в клетках, инфицированных ВПГ.

ТАБЛИЦА 1.

Иммунохимические характеристики МКА к антигену gD ВПГ.

№ Клон Класс, субкласс Ig Активность МКА в нИФ, обратное разведение Активность МКА в ИФА, титр

1. 4g8 IgGl 80 4х10у

2. 3d8 IgGl 10 10'

3. 5Ь7 IgGl 10 2x10"

4. 2с9 IgGl 120 104

5. 3f4 IgGl 120 104

6. 2g9 IgG2b 20 <10J

Окраска локализовалась в цитоплазме. В качестве отрицательного контроля использовали незараженные клетки Vero. Активность изученных МКА в реакции нИФ была неодинаковой и отличалась в 2-12 раз. Наибольшей активностью обладали МКА,

продуцируемые клонами 3f4 и 2с9. МКА 4g8 были использованы в последующих опытах по трансфекции клеток in vitro плазмидой, содержащей ген белка gD ВПГ.

Изучение активности МКА в реакции ИФА показало, что МКА клона 4g8 обладали наибольшей активностью (таблица 1).

Данные определения класса и субкласса тяжелых цепей в составе Ig, синтезируемых гибридомными клеточными линиями, приведены в таблице 1. Было показано, что все МКА принадлежали к классу IgG. 5 из 6 МКА принадлежали к субклассу IgGl и только 2g9 - к субклассу IgG2b.

Так как важным свойством противовирусных антител является их способность нейтрализовать инфекционную активность вируса, МКА были изучены в реакции биологической нейтрализации in vitro. Проведенные опыты показали, что МКА 4g8 и 3f4 обладают вируснейтрализующей активностью. Оба МКА полностью подавляли репликацию вируса в клетках Vero, индекс нейтрализации (обратное разведение сывороток, при котором ЦПД подавляется на 50%) составлял 40 усл. ед.

Трансфекция in vitro.

Опыты по трансфекции клеток Vero показали, что появление клонов трансфицированных клеток происходит на третьи сутки после введения чужеродной ДНК и селекции в присутствии генетицина G-418. На пятые сутки после трансфекции 37% клонов содержали в цитоплазме белок gD ВПГ, который определяли методом нИФ. На восьмые сутки после трансфекции количество трансформированных клонов составило 75%. На 15 сутки после внесения чужеродной ДНК и ведения клеток в селективной среде все оставшиеся клоны продуцировали белок gD (100%). Полученные данные указывали на способность конструкции pDNAgD экспрессировать ген gD, встроенный в бактериальную плазмиду, в генетически трансформированных клетках млекопитающих.

ДНК-иммунизация in vivo.

Изучение динамики клеточного и гуморального иммунного ответов на введение плазмиды pDNAgD, содержащей ген gD ВПГ1.

На следующем этапе работы была отработана схема введения pDNAgD ВПГ и изучена динамика иммунного ответа на инъекцию данной конструкции. Плазмидную ДНК вводили внутримышечно в четырехглавую мышцу бедра задних лап, подкожно - в подушечки задних лап и основание хвоста, а также в область подключичных и ягодичных лимфатических узлов. Сравнительный анализ пролиферативного ответа лимфоцитов показал, что наилучшие показатели наблюдались при внутримышечном введении pDNAgD (рисунок 1).

Таким образом, полученные данные согласовывались с результатами Ulmer et al., 1993, показавших, что мышечная ткань в наибольшей степени подходит для экспрессии

вирусиых генов. Развитие клеточного иммунного ответа можно представить как цепь следующих событий. Белок gD ВПГ, продуцируясь в мышечных клетках, может в дальнейшем выходить из них во внеклеточное пространство. В это время он, по-видимому, захватывается АПК (макрофагами и дендритными клетками), которые привлекаются к месту введения в ответ на повреждение мышечной ткани при инъекции ДНК. Затем АПК мигрируют в близлежащие лимфатические узлы и вызывают развитие иммунного ответа, презентируя антиген gD Т-клеткам. Кроме того, АПК могут сами захватывать pDNAgD, экспрессировать данный ген и представлять процессированный белок gD Т-лимфоцитам. На основании полученных данных в дальнейших экспериментах, использовалось преимущественно внутримышечное введение pDNAgD.

х 10

1 - Подкожное введение рВЫА^З в подушечки задних лап;

2 - Подкожное введение рБЫА^ в основание хвоста;

3 - Внутримышечное введение рОКАцО;

4 - Введение р0КА(>0 в зону лимфатических узлов.

Рисунок 1. Пролиферативный ответ лимфоцитов на введение плазмиды в различные участки тела.

Для изучения динамики иммунного ответа, животных иммунизировали внутримышечно, вводя в четырехглавую мышцу бедра каждой задней лапы по 50 мкг плазмиды pDNAgD (рисунок 2).

Было показано, что через одну неделю после однократной иммунизации специфическая активность антител к ВПГ1 практически отсутствовала (рисунок 2), затем постепенно нарастала и через три недели превосходила контрольный уровень в 9 раз (титр AT 1: 450). Повторное введение ДНК приводило к дальнейшему увеличению уровня

антител к ВПГ1, который достигал максимальных значений через две недели после второй инъекции. После третьей иммунизации увеличения активности антител через две недели не наблюдалось. Таким образом, максимальная активность гуморального ответа достигалась через две недели после повторного введения

Рисунок 2. Динамика гуморального иммунного ответа на ДНК-иммунизацию мышей плазмидой pDNAgD ВПГ.

Изучение длительности циркуляции противовирусных антител к ВПГ1 в крови иммунизированных животных показало, что после двукратной инъекции

циркуляция антител в крови животных продолжается три месяца, после чего они практически не выявляются.

Исследование динамики активации Т-клеток показало (рисунок 3), что наибольший пролиферативный ответ Т-клеток на стимуляцию ВПП наблюдался через две недели после однократной инъекции ДНК, когда количество бластов в селезенке у иммунизированных мышей в 8 раз превышало таковое у контрольных, не иммунизированных животных.

После второй иммунизации количество бластов в популяции спленоцитов было достоверно ниже, хотя и превышало контрольный уровень в 6 раз. После 3-ей иммунизации ответ снижался до уровня, не превышающего контрольный. Таким образом, максимальная активация ВПП- специфических Т-лимфоцитов была отмечена через 2 недели после однократной иммунизации

На основании полученных данных в последующих опытах изучали параметры иммунного ответа через 2 недели после однократной и двукратной ДНК-иммунизаций.

Было показано, что при однократной иммунизации животных инактивированным вирусом формируется высокая активность анти-ВПП антител (таблица 2). Напротив, уровни Т-клеточного ответа были невелики. При двукратном введении инактивированного вируса наблюдалась тенденция к увеличению активности антител к ВПГ1. Пролиферативный ответ также увеличивался, однако был ниже данного показателя в группе животных, иммунизированных в 2 раза. Таким образом, было

установлено, что инъекция инактивированного вируса преимущественно стимулирует В-клеточный ответ.

700 -600 500 400 ^ 300 200 100 -0 --

шИ

По оси абцисс - группы животных, изученных в различные сроки:

1 -1 неделя после однократного введения ДНК

2 - 2 недели после однократного введения ДНК

3-3 недели после однократного введения ДНК

4-2 недели после второй инъекции ДНК

5-2 недели после третьей инъекции ДНК

По оси ординат - количество бластов на лунку 96 лун. панели.

группы животных Стимулляция in vitro:

■ PBS

(отрицатели ый контроль)

■ КонА (положитель ный

контроль) □ ВПП (опыт)

Рисунок 3. Динамика пролиферативного ответа Т-клеток на ДНК-иммунизацию животных pDNAgD.

Для изучения протективного эффекта через 3 недели после ДНК-иммунизации животным вводили 160 ЛД50 ВПГ1. Животных наблюдали в течение 60 дней, учитывая возникновение симптомов ВПГ-инфекции и смертность. Было установлено, что мыши контрольной группы погибали в течение 5 дней от ВПГ-инфекции (рисунок 4). У них наблюдались все характерные симптомы инфекции, такие как изъязвление кожи, поражения глаз, неровная походка. Однократное введение плазмиды приводило к

выживанию 63% мышей. Двукратная иммунизация pDNAgD приводила к увеличению защитного эффекта до 100%. Таким образом, нами было продемонстрировано, что двух инъекции pDNAgD достаточно для 100%-ной защиты животных от летальных доз ВПП, что является несомненным преимуществом по сравнению с другими вакцинами. Так, согласно инструкции по применению отечественной вакцины на основе инактивированного вируса, необходимо проводить 2 курса по 5 инъекций в год.

ТАБЛИЦА 2.

Характеристика иммунного ответа мышей на иммунизацию различными антигенами.

№ Антиген Кол-во имму-низадий ИСП' СБ4/СЭ8 в%; ИРИ" Титры АТ Титры нейтрал АТ 1№а (усл.ед.) \gQ2al

1 отсутствует (контроль) 0 1.0±0.1 75/25 3.0 66±17 0 1 0.6

2 рОЫА^ 1 7.9±0.8 68/32 2.1 133±33 10 1 1.2

2 6.0±1.4 72/28 2.6 2000±516 40 4 0.9

рЭЫА^ + 1 12.4±2.4" - 200±60 - - 0.9

3 рОЫАОМ-СвР 2 11.1±2.1 77/23 3.3 1600±270 10 - 1.1

рЭЫА^ рЭКАШР 1 12.0±2.0 67/33 2.0 133±33 5 4 0.98

4 2 9.<М.1 67/33 2.0 17066±4267 10 8 131

5 ВПП 1 1.4±0.1 - 5933±467 40 32 0.4

(инактив.) 2 3.3±1.2 66/34 1.9 8333±1667 80 32 0.54

6 рОЫАвЭ + рМОСК 1 6.8±0.6 - 133±33 10 1 1.15

7 рМОСК. 1 0.8±0.2 - 66±17 0 1 0.62

' ИСП - индекс стимуляции пролиферации; ± - стандартная ошибка; ИРИ - иммунорегуляторный индекс; - обратное разведение сывороток; О - не обнаружено; -Прочерк - не изучено;

Жирным шрифтом обозначены достоверные различия (р<0 05), * - различие достоверно при р=0.1

Одним из основных требований к современным вакцинам является их безопасность. В связи с этим представляло интерес выяснить возможность усиления иммунного ответа при однократном введении плазмидной ДНК. Для увеличения эффективности

однократной ДНК-иммунизации во второй часта работы были использованы различные соединения, которые потенциально могли оказывать адъювантное действие: 1-рекомбинантный белок - фактор некроза опухоли; 2 - ДНК-конструкция, содержащая в своем составе ген цитокина - pDNATNF; 3 - ДНК-конструкция, содержащая ген цитокина - pDNAGM-CSF; 4 - синтетический пептид ГМДП; 5 - синтетический пептид Гепон. В первой серии экспериментов сравнивали В- и Т-клеточный ответы мышей, иммунизированных pDNAgD и pDNAgD совместно с белком мФНОа.

Белок мФНОа вводили за 1 сутки до ДНК-иммунизации, совместно с pDNAgD, через 2 суток и через 5 суток после однократного введения плазмиды. Изучение гуморального ответа показало, что активность анти-ВПП AT была невелика во всех изученных группах (титры 1:100 - 1:200). В то же время, Т-клеточный ответ различался: белок мФНОа, введенный через 5 суток после ДНК-иммунизации, существенно не влиял на параметры Т-клеточного ответа на ДНК-иммунизацию по сравнению с введением одной pDNAgD, тогда как введенный в другие изученные сроки - подавлял стимуляцию Т-клеток к пролиферации.

Следующие опыты были направлены на изучение адъювантного действия двух плазмид, содержащих гены цитокинов - фактора некроза опухолей (pDNATNF) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (pDNAGM-CSF) (таблица 2).

Было показано, что активность антител к ВПГ1 при однократной иммунизации как одной плазмидой pDNAgD, так и в сочетании с ДНК-цитокинов, была низкой. Двукратное введение увеличивало активность AT к ВПГ во всех группах животных. Однако, инъекция pDNAgD совместно с pDNAGM-CSF, не стимулировала увеличения уровня AT по сравнению с двукратным введением одной pDNAgD. При совместном двукратном введении pDNAgD и pDNATNF титры AT возрастали в 8.5 раз по сравнению с двукратным введением pDNAgD (таблица 2)

Анализ пролиферативного ответа Т-клеток показал, что совместное введение pDNAgD с ДНК цитокинов стимулирует образование более высоких уровней пролиферативного ответа. ИСП в группах животных, которым совместно вводили pDNAgD с генами цитокинов, достоверно превышал ИСП в группе мышей, которым вводили одну pDNAgD, как при однократной, так и при двукратной инъекции (таблица 2).

Для характеристики иммунного ответа было изучено соотношение IgG2a и IgGl. Изменение соотношения IgG2a/IgGl субклассов иммуноглобулинов, согласно общепринятым представлениям, указывает на преимущественную активацию Т- или В-клеточного иммунитета. Так, увеличение IgG2a AT коррелирует с направленностью

иммунного ответа по Т-клеточному пути. Сравнительный анализ субклассов ВПГ1-специфических антител в сьторотках иммунизированных животных показал, что максимальное увеличение активности ВПГ1-специфических IgG2a антител при однократной иммунизации наблюдалось в группе животных, иммунизированных pDNAgD. При двукратной - в группе мышей, которым вводили совместно pDNAgD и pDNATNF (таблица 2)

Для выяснения вопроса о том, может ли введение дополнительного количества неспецифической ДНК влиять на показатели иммунного ответа, животных иммунизировали pDNAgD совместно с векторной плазмидой, не содержащей вставки. Было установлено, что достоверных увеличений уровней гуморального и Т-клеточного ответов по сравнению с введением одной pDNAgD не происходит (таблица 2).

Таким образом, было установлено, что использование pDNATNF позволило увеличить уровни как Т-клеточного, так и в особенности - гуморального иммунных ответов. Введение pDNAGM-CSF стимулировало увеличение Т-клеточного ответа. Это позволяло предположить, что ДНК обоих цитокинов обладают адъювантными свойствами.

Следующая серия опытов была посвящена изучению протективного действия ДНК-иммунизации. Наибольший интерес представляло сравнение защитного действия ДНК-иммунизации при однократном введении гена gD ВПГ1 в сочетании с генами цитокинов (рисунок 4).

Через три недели после иммунизации мышам вводили 160 ЛД50 ВПГ1. Животных наблюдали в течение 60 дней. Среди мышей, иммунизированных pDNAgD, наблюдалось выживание 63% животных (рисунок 4). В группе мышей, иммунизированных совместно pDNAgD и pDNATNF, от герпетической инфекции погибло 20% животных (различия оказались статистически недостоверны). В группе животных, которым вводили pDNAgD совместно с pDNAGM-CSF, все мыши выжили. У всех выживших животных симптомы ВПГ-инфекции отсутствовали на протяжении всего периода наблюдения.

Таким образом было установлено, что однократная инъекция pDNAgD совместно с pDNAGM-CSF позволила увеличить выживаемость животных с 63% до 100% (различия статистически достоверны). Интересно отметить, что при введении одной pDNATNF все животные погибли, однако их смертность наблюдалась несколько позднее, на 8-12 дни. В группе животных, которым вводили одну pDNAGM-CSF, выжило 20% мышей (различия оказались статистически недостоверны).

Опыты по двукратной иммунизации животных pDNAgD и pDNATNF показали, что введение pDNATNF снижало 100%-ный протективный эффект pDNAgD до 70% (различия достоверны при р=0.1).

1. 3. 5. 10. 15. 20. 30. 40. 50. 60.

время после заражения, сут. —контроль рЦ.\Ае1)

-Л-рО^вО + рВ^СМ-СБК -*-рБКАеО + рОМТ№ -Ж-рО^СМ-СвР рБ!ЧАТ№

Рисунок 4. Протективные свойства ДНК-иммунизации pDNAgD с использованием в качестве адъювантов pDNAGM-CSF и pDNATNF

Было показано, что использование плазмиды, кодирующей ген ГМ-КСФ, при однократной совместной иммунизации с pDNAgD, приводит к активированию в основном Т-клеточного ответа. Об этом свидетельствовали достоверно увеличивающиеся уровни ^С2а антител, которые, как показано многими авторами, указывают на стимуляцию ТЫ типа, а также значительно повышающаяся пролиферация Т-клеток. В пользу pDNAGM-в качестве адъюванта при ДНК-иммунизации против герпетической инфекции указывает и тот факт, что при двукратном совместном введении двух плазмид уровень пролиферативного ответа Т-клеток оставался на достаточно высоком уровне. Следует отметить, что использование pDNAGM-CSF при. ДНК-иммунизации стимулировало формирование наиболее высоких уровней Т-клеточного ответа по сравнению со всеми другими изученными соединениями.

В следующей части работы мы исследовали адъювантные свойства при ДНК-иммунизации отечественных синтетических пептидов ГМДП и Гепон (таблица 3). Преимуществом данных препаратов является то, что они уже прошли клинические

испытания и применяются на практике для лечения некоторых вирусных заболеваний. ГМДП и Гепон вводили за сутки до ДНК-иммунизации, совместно и через 5 суток после введения pDNAgD.

ТАБЛИЦА3.

Сравнительная характеристика иммунного ответа на введение pDNAgD и pDNAgD в сочетании с ГМДП или Гепоном.

• ИСП - отношение количества бластов в селезенке иммунизированных животных к количеству бластов в селезенке неиммунизированных животных, средние значения ± стандартная ошибка. ** Обратное разведение сывороток, средние значения ± стандартная ошибка. *** Обратное разведение сывороток, при котором ЦПД подавляется на 50%. -Прочерк-не изучено.

Жирным шрифтом обозначены достоверные различия (р<0.05),х - различие достоверно при р=0.1

Результаты опытов показали, что из всех изученных сроков введения препарата ГМДП наиболее эффективным является инъекция за сутки до ДНК-иммунизации (таблица 3). Так, при однократном введении ГМДП за сутки до pDNAgD наблюдалось достоверное увеличение Т-клеточного ответа (р=0.1), а при двукратном - увеличение уровня противовирусных антител в 4 раза по сравнению с введением одной pDNAgD.

При изучении адъювантных свойств препарата Гепон также было показано, что наиболее эффективной является инъекция препарата за сутки до однократной ДНК-

иммунизации. В данном случае показатели Т-клеточного ответа (соотношение IgG2a/IgGl субклассов противовирусных антител и индекс пролиферации лимфоцитов) -не увеличивались, в то же время уровни противовирусных антител в 32 раза превышали активность ЛТ при однократной инъекции одной pDNAgD (таблица 3).

Исследование протективных свойств ДНК-иммунизации показало, что введение ГМДП за сутки до инъекции pDNAgD позволило увеличить защиту животных от доз ВПГ1 160 ЛД50, до 96% (рисунок 5).

Рисунок 5. Протективный эффект ДНК-иммунизации при использовании препаратов ГМДП и Гепон.

При изучении защитного действия ГМДП без ДНК-иммунизации установлено, что ГМДП при однократном введении защищает 20% мышей от летальной дозы ВПП. Исследование протективных свойств pDNAgD и Гепона показало, что при введении препарата за сутки выживают 75% животных. Таким образом, полученные результаты указывают на то, что индукции гуморального ответа недостаточно для полной защиты от

герпетической инфекции. Главную роль в защите от вирусных патогенов in vivo играет Т-клеточный ответ.

Одним из возможных объяснений снижения выживаемости животных при двукратной иммунизации pDNAgD и pDNATNF является повышенная активация цитотоксических Т-лимфоцитов, фенотипа CD8+. Так, к табели животных в наших опытах могла приводить повышенная экспрессия гена белка мФНОа в клетках после введения pDNATNF. Установлено, что активированные цитотоксические Т-лимфоциты могут использовать мембранную форму ФНО для медленного лизиса клеток (Ratner et al., 1993). Кроме того, секретируемый ФНО может связываться с рецепторами (CD 120а и CD120b) на мембране культивируемых клеток и через МАР-киназы и транскрипционный фактор NFkB активировать промотор синтазы 2, индуцируя накопление оксида азота (Poludan et al., 2001). Секретируемый ФНО способен также напрямую активировать каспазный каскад, приводящий к апоптозу. Увеличение продукции ФНО опасно еще и тем, что данный цитокин может изменять проницаемость сосудов и нарушать гематоэнцефалический барьер (Шестопалов и др., 2002). Это могло служить причиной проникновения вируса в периферические ткани, и как следствие, приводить к повышению уровня летальности. На основании полученных данных можно высказать предположение об молекулярных и клеточных механизмах иммунного действия изученных соединений. По-видимому, при введении бежа мФНОа отсутствие стимулирующего эффекта и подавление пролиферации Т-клеток может объясняться избыточным накоплением цитокина в организме и включением иммунных механизмов, действующих по принципу отрицательной обратной связи. Таким образом были показаны различия в ответе in vitro и in vivo: несмотря на высокий Т-клеточный и В-клеточный ответ in vitro, при заражении животных летальными дозами ВПГ1 in vivo наблюдалось снижение выживаемости мышей.

При иммунизации животных pDNAgD совместно с pDNAGM-CSF формировались высокие уровни Т-клеточного ответа и протекции животных от заражения летальными дозами ВПГ1. Можно предположить, что выявленный эффект свидетельствует о том, что ГМ-КСФ формирует более высокие уровни иммунологической памяти. Данное предположение согласуется с результатами (Haddad D et al., 2000), которые показали пролонгирование инфильтрации антигенпрезентирующих клеток (АПК) в месте инъекции pDNAGM-CSF, а значит - и более эффективную презентацию антигена Т-лимфоцитам. Длительность миграции АПК в мышцу увеличивалась более чем в 2 раза. Более того, введение pDNAGM-CSF в мышечную ткань ведет к привлечению в нее дендритных клеток, наиболее эффективных АПК при вирусной инфекции, чего не наблюдалось при введении одной pDNAgD. Показано, что в место инъекции двух плазмид мигрируют

незрелые, наивные дендритные клетки. Эта миграция наблюдается с 3-его по 5-ый день после введения ДНК, а затем эти клетки исчезают из мышцы. Исследование близлежащих лимфоузлов показало, что в них концентрация дендритных клеток увеличивается, начиная с 5 дня после инъекции pDNAGM-CSF (Haddad D et al, 2000). Последовательность событий можно представить следующим образом: дендритные АПК направляются в мышцу, захватывают белок gD, активируются и мигрируют в лимфатические узлы, где и презентируют антиген Т-лимфоцитам.

Введение ГМДП за сутки до иммунизации pDNAgD также стимулировало формирование высоких уровней Т-клеточного ответа и защиту мышей от летальных доз ВПГ1. Можно предположить, что введение ГМДП за сутки до ДНК-иммунизации создает условия для повышения трансфекции мышечной ткани pDNAgD, а так же увеличивает инфильтрацию макрофагов к месту инъекции. При введении Гепона за сутки до однократной инъекции pDNAgD формировалась наибольшая активность гуморального иммунного ответа по сравнению со всеми изученными адъювантами. Известно, что Гепон изменяет продуцируемый клетками спектр цитокинов (Атауллханов и др.2ООЗ). Возможно, при ДНК-иммунизации происходит смещение синтеза цитокинов в сторону Т хелперов 2 типа и как следствие - активация гуморального иммунного ответа.

В заключение следует констатировать, что ДНК-иммунизация против ВПП стимулирует высокую активность Т-клеточного ответа. Использование в качестве адъювантов pDNAGM-SCF и ГМДП позволило увеличить защиту животных от заражения летальными дозами ВПП с 63% до 96-100%. Таким образом полученные данные указывают на перспективность создания вакцинных препаратов против ВПГ на основе ДНК-конструкций, содержащих в качестве специфического иммуногена ген gD ВПГ и в качестве адъювантов - ген цитокина ГМ-КСФ или синтетический пептид ГМДП.

ВЫВОДЫ.

1. Получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела (МКА), направленные к общей антигенной детерминанте белка gD вируса простого герпеса 1 и 2 типов (ВПП и ВПГ2), которые взаимодействуют с рекомбинантным белком gD ВПГ и с белком gD в клетках, зараженных ВПП и ВПГ2 в различных иммунохимических реакциях.

2. С помощью МКА установлена способность ДНК-конструкции, содержащей ген gD ВПП (pDNAgD), экспрессироваться в эукариотических клетках, трансфицированных in vitro.

3. Сравнительный анализ эффективности различных способов введения плазмидной ДНК при иммунизации мышей линии BALB/c ДНК-конструкцией pDNAgD

показал, что внутримышечное введение обеспечивает более высокую эффективность иммунного ответа по сравнению с подкожным введением ДНК.

4. Установлено, что однократная иммунизация pDNAgD увеличивает пролиферативный ответ Т-лимфоцитов на ВПГ in vitro в 8 раз, соотношение анти-ВПГ1 IgG2a/IgGl в 2 раза. Двукратная иммунизация pDNAgD с интервалом 2 недели приводит дополнительно к увеличению активности антител к ВПГ1 в 16 раз и к формированию вируснейтрализующих антител.

5. Сравнительный анализ адъювантного действия соединений на основе генов цитокинов и синтетических пептидов на эффективность ДНК-иммунизации показал, что использование ДНК-конструкции, содержащей ген фактора некроза опухоли (pDNATNF), увеличивает активность Т-клеточного и В-клеточного звеньев иммунитета in vitro, однако снижает защиту животных in vivo. Использование синтетического пептида Гепон стимулирует увеличение активности В-клеточного ответа и не влияет на Т-клеточный ответ. Применение в качестве адъювантов ДНК-конструкции, содержащей ген гралулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (pDNAGM-CSF) и глюкозаминил-мурамилдипептида (ГМДП) приводит к формированию высоких уровней Т-клеточного ответа.

6. Показано, что pDNAGM-CSF и ГМДП оказывают адъювантный эффект, повышая эффективность протекции от летальной дозы ВПП (160 LD50) после однократной ДНК-иммунизации pDNAgD с 63% до 96-100%.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Климова P.P., Козлов АЮ., Андронова Т.М., Гурьянова СВ., Кущ А.А. Иммуностимулирующее действие ГМДП при ДНК-иммунизации против вируса простого герпеса // Ветеринарная патология. - 2003. - №1(5). - С.92-96.

2. Климова Р. Р., Козлов АЮ., Шингарова Л.Н. и др. Влияние ДНК фактора некроза опухоли на иммунный ответ при ДНК-иммунизации против вируса простого герпеса // Молекулярная биология. - 2004. - Т.38. - №2. - С.333-342.

3. Климова P.P., Козлов А.Ю., Кущ А.А. ДНК-иммунизация против вируса простого герпеса защищает животных от летальной дозы вируса // Мат. Международного конгресса «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека», Кара-Дат, Феодосия (Крым), Украина, 8-19 июня, 2003, С.81.

4. Козлов А.Ю., Климова Р.Р., Андронова Т.М., Гурьянова СВ. Адъювантные свойства препарата ГМДП при ДНК-иммунизации против вируса простого герпеса

1 типа // Мат. XI Российского Национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 19-23 апреля, 2004, С.798.

5. Козлов А.Ю., Климова P.P., Шингарова Л.Н. и др. Сравнительный анализ адъювантных свойств глюкозаминил-мурамилдипептида и гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора при ДНК-иммунизации против вируса простого герпеса // Молекулярная биология. - 2005. - №2. - С.

Заказ №342. Объем 1 пл. Тираж 100 экз.

Отпечатано в 0 0 0 «Петроруш». Г. Москва, ул. Палша-2а, тел. 250-92-06 www.po8tator.ru

Р-270 46

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Козлов, Алексей Юрьевич

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.И

Глава 1. Генетическая иммунизация.

Глава 2. ДНК-иммунизация при герпетических инфекциях.

2.1 Классификация герпесвирусов.

2.2 Пути передачи ВПГ.

2.3 Строение ВПГ.

2.4 Взаимодействие вируса с клеткой.

2.5 Иммунный ответ при герпетической инфекции.

2.6 Современные вакцины против ВПГ.

2.6.1 Инактивированные вакцины.

2.6.2 Субъединичные вакцины.

2.6.3 Живые аттенуированные, генноинженерные вакцины.

2.7 ДНК-вакцины против ВПГ-инфекции.

2.8 Адъюванты для ДНК-вакцин.

Глава 3. ГМ-КСФ и ФНО как потенциальные адъюванты для ДНК-вакцин.

3.1 ГМ-КСФ (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор).

3.2 Фактор некроза опухоли (ФНО).

Глава 4. Отечественные иммуномодуляторы нового поколения.

4.1 Глюкозаминил-мурамилдигхептид (ГМДП).

4.2 Гепон.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

5.1 Получение гибридом, продуцирующих МКА к белкам ВПГ1.

5.1.1 Иммунизация.

5.1.2 Миеломная клеточная линия.

5.1.3 Культивирование клеток.

5.1.4 Слияние клеток и выращивание гибридом.

5.1.5 Криоконсервирование гибридом.

5.1.6 Получение асцитных жидкостей, содержащих МК.

5.1.7 Получение МКА из асцитных жидкостей.

5.1.8 Определение концентрации белка.

5.1.9 Субтипирование МКА.

5.1.10 Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА).

5.1.11 Непрямой иммунофлюоресцентный анализ (нИФ).

5.2. Животные.

5.3. Вирус и клетки.

5.4. Определение летальной дозы ВПГ1.

5.5. Иммуноген (плазмида pDNAgD).

5.6. Выделение рекомбинантного фактора некроза опухоли мышей (мФНОа).

5.7. Конструирование плазмиды для эукариотической экспрессии гена мышиного TNFa.

5.8. Конструирование плазмиды для эукариротической экспрессии гена мышиного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (pDNAGM-CSF).

5.9. Трансфекция in vitro.

5.10. ДНК-иммунизация.

5.11. Изучение активности антител к ВПГ1.

5.12. Реакция нейтрализации.

5.13. Определение ВПГ-специфических иммуноглобулинов класса IgGl и IgG2a.

5.14. Определение количества CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов.

5.15. Определение пролиферативного ответа Т-лимфоцитов.

5.16. Активность интерферона (ИФа).

5.17. Протективный ответ

• РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Глава 6. Получение и характеристика МКА к ВПГ.

6.1 Слияние и скрининг гибридом.

6.2 Характеристика MICA.

6.2.1. Активность МКА в реакции нИФ.

6.2.2. Активность МКА в реакции ИФА.

6.2.3. Субтипирование Ig, представляющих МКА.

6.2.4. Способность МКА подавлять инфекционную активность ВПГ в реакции нейтрализации.

Глава 7. Определение летальной дозы ВПГ.

Глава 8. Трансфекция in vitro.

Глава 9. Генетическая иммунизация in vivo.

9.1. Изучение динамики клеточного и гуморального иммунного ответов на введение плазмиды pDNAgD, содержащей ген gD ВПГ1.

9.2. Исследование действия ФНО на иммунный ответ при иммунизации животных pDNAgD.

9.3. Исследование адъювантного действия ГМ-КСФ на ДНК-иммунизацию мышей против герпетической инфекции.

9.4. Влияние ГМДП на иммунный ответ при ДНК-иммунизации против вируса простого герпеса.

9.5. Исследование адъювантного действия препарата Гепон на ДНКиммунизацию животных против ВПГ-инфекции.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "ДНК-иммунизация против вируса простого герпеса 1 типа: сравнительный анализ протективного действия генов цитокинов и синтетических пептидов"

Актуальность проблемы.

Вирус простого герпеса (ВПГ) является причиной многих тяжелых заболеваний человека, проявляющихся в виде воспалительных поражений различных органов и тканей (герпетического кератита, энцефалита, уретритов, вагинитов). Большинство людей вступают в контакт с ВПГ1 в раннем возрасте (в 3 года - 6 лет). В 99% случаев после контакта у иммунокомпетентных детей клинические симптомы не развиваются, но в сыворотке можно обнаружить антитела. К 13-14-летнему возрасту, в среднем, инфицировано уже 70-83% детей, в возрасте 50 лет и старше антитела к ВПГ1 и/или 2 типа выявляются уже у 90% населения (1). В США от ВПГ1 и 2 страдает более 150 млн. человек, и ежегодно инфицируется еще около 0.5 млн. человек (218, 142). В России ввиду отсутствия должной выявляемости и учета показатель заболеваемости генитальным герпесом (ВПГ2) составил в 1996 -1999 гг. лишь 11-16 случаев на 100 тыс. населения (против 80-200 случаев на 100 тыс. населения за рубежом) (43). По данным опубликованных работ инфицировано ВПГ 1/2 около 22 млн. человек (24). Можно предположить, что эта цифра занижена в 5-10 раз.

В настоящее время имеется большое количество лекарственных препаратов для лечения герпетической инфекции, однако заболеваемость, вызванная ВПГ1 и ВПГ2, продолжает расти. Существующая в нашей стране противогерпетическая вакцина на основе инактивированного вируса прошла успешные испытания, однако, при ее применении, существует вероятность реактивации вируса в случае его неполной инактивации (7). В зарубежных странах разрабатывают вакцины против герпеса с использованием различных подходов. Один из них основан на получении индивидуальных рекомбинантных вирусных белков. Как показали испытания в США, субъединичные вакцины на основе вирусных белков обеспечивают лишь частичную защиту от первичного заражения и приводят к незначительному сокращению рецидивов заболевания у людей, страдающих генитальным герпесом (200). Это стимулирует дальнейшее развитие альтернативных подходов, одним из которых является генетическая иммунизация и создание ДНК-вакцин. ДНК-иммунизация основана на использовании ДНК-конструкций, кодирующих специфические иммуногены. В качестве специфического иммуногена в нашей работе использовался поверхностный гликопротеин gD ВПГ, так как он играет важную роль во взаимодействии вируса с клетками-мишенями и содержит эпитопы, индуцирующие образование вируснейтрализующих антител. Одним из важных компонентов вакцинных препаратов являются адъюванты. Преимущество ДНК-вакцин состоит в возможности комбинирования ДНК-конструкций с другими генами, например с генами цитокинов, что по имеющимся данным позволяет существенно повысить уровни как Т-клеточного, так и гуморального иммунного ответов. Перспективными компонентами ДНК-вакцин могли бы быть также новые синтетические иммуномодуляторы, в том числе отечественные, которые обладают иммунорегуляторными свойствами. Разработка вакцин на основе новых биотехнологических подходов позволит предотвратить заболевания, вызванные ВПГ 1/2.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение иммунного ответа и протективных свойств ДНК-конструкции, содержащей ген белка gD ВПГ, и сравнительный анализ адъювантных свойств двух генов - гена фактора Некроза опухоли (TNF) и гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), а также двух синтетических пептидов - глюкозаминил-мурамилдипептида (ГМДП) и Гепона.

Для достижения цели ставились следующие задачи:

1. Получить гибридомные клеточные линии, стабильно продуцирующие моноклональные антитела (MICA), взаимодействующие с белком gD ВПГ1.

2. Изучить способность ДНК-конструкции на основе плазмиды pcDNA-3.1(+)> содержащей ген gD ВПГ1 (pDNAgD), экспрессироваться в эукариотических клетках линии Vero.

6. Изучить защитный эффект ДНК-иммунизации pDNAgD, проведенной совместно с изученными адъювантами.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Получены гибридомы, продуцирующие МКА, взаимодействующие с белком gD ВПГ1 и ВПГ2.

2. Показано, что внутримышечная ДНК-иммунизация pDNAgD приводит к формированию более высоких уровней Т-клеточного ответа, чем подкожное введение ДНК.

Основные положения, выносимые на защиту.

-101. МКА, полученные в ходе работы, направлены к белку gD ВПГ и активно взаимодействуют с ВПГ1 и 2 в иммунохимических, иммунологических и вирусологических реакциях.

2. Показана способность полученных МКА выявлять белок gD in situ в эукариотических клетках, трансфицированных ДНК-конструкцией pDNAgD in vitro, а также в клетках, инфицированных ВПГ1/2.

4. Проведен сравнительный анализ адъювантных свойств белка TNF (мФНО), pDNATNF, pDNAGM-CSF, ГМДП и Гепона и установлено, что pDNAGM-CSF и ГМДП существенно повышают эффективность защиты животных от заражения летальными дозами ВПГ1.

-11

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1 Генетическая иммунизация.

Вакцины - одно из самых значительных достижений медицины. В последние годы разработке вакцин стали уделять особое внимание. Это обусловлено тем, что до настоящего времени не удалось получить высокоэффективные препараты для предупреждения многих распространенных инфекционных заболеваний. Кроме того, увеличились заболевания, обусловленные теми инфекциями, с которыми человечество ранее успешно боролось. В связи с этим актуальным является поиск новых вакцинных препаратов, обладающих высокой иммуногенностью и способных активировать оба типа иммунного ответа (клеточный и гуморальный).

В настоящее время используется 4 основных вида противовирусных вакцин, которые разделяют в зависимости от методов их получения. Одним из них являются вакцины на основе живых аттенуированных вирусов. Опасность применения этих препаратов связана с возможностью появления спонтанных мутаций, приводящих к восстановлению вирулентности. Второй тип -инактивированные вакцины. К недостаткам вакцин на основе инактивированнош вируса относится опасность заражения в случае его неполной инактивации. В последнее время получили распространение вакцины третьего типа - субъединичные вакцины. Однако, наработка вирусного антигена в промышленном масштабе, очистка и выделение вирусных белков предполагает большие материальные затраты и необходимость работы с инфицированным материалом. 4 тип вакцин - генно-инженерные. Вакцины этого типа в большинстве случаев характеризует меньшая иммуногенность по сравнению с вакцинами на основе природных антигенов. Кроме того, белки, полученные методами генной инженерии, бывает трудно выделить и очистить, что сильно удорожает их использование на практике.

-12В последние годы все большее внимание исследователей привлекает новое направление в разработке вакцин, связанное с генетической иммунизацией (ДНК-иммунизацией). Идеи о возможности введения в организм генов с лечебной целью были высказаны еще в начале 60-х годов прошлого века, однако реальные попытки такого рода относятся к концу 80-х годов (13).

В 1990 году была осуществлена попытка лечения тяжелого, обычно несовместимого с жизнью наследственного иммунологического заболевания (иммунодефицита), вызванного дефектом в гене, который кодирует синтез фермента аденозиндезаминазы (ADA). У двух девочек в возрасте до четырех лет, страдавших врожденным дефектом в гене ADA, были взяты клетки костного мозга и перенесены в питательную среду для роста вне организма. В эти клетки был введен ген ADA. Затем трансфицированные клетки были размножены в культуре, после чего введены больным, от которых они были получены. Авторы сообщили о четко выраженном лечебном эффекте (83). Хотя впоследствии возник ряд сомнений в устойчивости полученного эффекта и его конкретных механизмах, именно эта работа послужила мощнейшим толчком для развития генной терапии.

Уже в 1992-1993 годах несколько независимых групп исследователей экспериментально доказали, что введение чужеродной ДНК в организм животного способствует формированию иммунитета (220).

Принцип применения ДНК-вакцин заключается в том, что в организм пациента вводят молекулу ДНК, содержащую гены, кодирующие иммуногенные белки вирусов или патогенных микроорганизмов. В организме хозяина выбранный ген экспрессируется и индуцирует клеточный и гуморальный иммунный ответ.

Для получения ДНК-вакцин ген, кодирующий продукцию иммуногенного белка вируса, встраивают в бактериальную плазмиду. Плазмида представляет собой небольшую стабильную молекулу кольцевой ДНК, которая способна к репликации в бактериальной клетке. Кроме гена, кодирующего белок вируса, в пламиду встраивают генетические элементы, которые необходимы для экспрессии этого гена в клетках эукариот. Плазмиду нарабатывают в культуре бактериальных клеток. Затем плазмидную ДНК выделяют из бактерий и очищают.

В настоящее время разработаны различные методы введения чужеродной ДНК в организм хозяина. Среди способов направленного введения генных конструкций можно выделить следующие:

1. Прямая инъекция генетического материала. Это самый простой метод доставки плазмидной ДНК в клетки in vivo, при котором ДНК вводится непосредственно в ткань путем инъекции. Область использования данного метода ограничена такими тканями, как кожа, тимус и поперечно-полосатые мышцы. Причем достаточно продолжительная (до года) экспрессия трансгена наблюдается преимущественно в мышечной ткани. Эффективность такой трансфекции обычно низкая, но вполне достаточная для генетической иммунизации. Обычно ДНК вводится в солевом растворе внутримышечно или внутрикожно. При этом большая часть ДНК поступает в межклеточное пространство и только после этого включается в клетки (13, 141, 175).

2. Баллистическкая трансфекция. Этот метод основан на обстреле органов и тканей микрочастицами тяжелых мелаллов (золото, вольфрам), покрытых плазмидной ДНК. Микрочастицы проходят через клеточные слои и переносят генетическую конструкцию непосредственно в клетки. Ускорение частицам придается с помощью так называемой генетической пушки (gene gun), которая основана на принципе работы охотничьего ружья. Скорость микрочастиц, используемых в различных системах, значительно варьирует. По данным Клейна с соавторами (124), она может превышать 1000 м/с. Глубина проникновения микрочастиц, как правило невелика - до 1 мм, поэтому метод используется преимущественно для трансфекции клеток кожи или подлежащего хряща. Однако при особых условиях обстрела микрочастицы могут проникать в ткань на глубину до 4-5 мм и переносить ген в волокна поперечно-полосатых мышц. Метод баллистической трансфекции был предложен в 1987 г. Клейном и Стенфордом (123) для генетической трансформации растительных клеток. В нашей стране этот метод был использован в 1988г. Колесниковым и Зелениным (25) для трансформации мышиных клеток культивированных in vitro. В дальнейшем этот метод получил широкое распространение, и был использован для трансфекции клеток животных in vivo (59,203, 214).

3. Введение генетического материала внутрь кровеносных сосудов, питающих трансфицируемый орган. Этот подход находит применение в первую очередь для лечения болезней печени. Используется также введение генетического материала в почку путем инъекций в питающие кровеносные сосуды, в почечную паренхиму и мочевыводящие пути (13,25,18).

4. Аэрозольное введение. Этот способ эффективен при введении генетического материала в дыхательные пути и используется для лечения заболеваний легких (18).

ДНК-вакцины обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными вакцинами.

При ДНК-иммунизации антиген презентируется иммунной системе хозяина в нативной форме, тогда как в процессе производственного получения и очистки рекомбинантных белков (генно-инженерные вакцины) могут произойти изменения трехмерной конфигурации этих молекул. Поэтому иммунизация может быть низкоэффективной в связи с образованием антител, специфичных к иммуногенным молекулам, но не к нативным вирусным белкам.

ДНК-вакцины эффективно индуцируют Т-клеточный иммунный ответ, который играет решающую роль при элиминации вирусных патогенов. Другие вакцины индуцируют главным образом В-клеточный иммунитет.

С помощью ДНК-иммунизации можно избирательно активировать различные субпопуляции Т-хелперных клеток (79,136) .

Кроме того, ДНК-вакцины можно комбинировать с другими лекарственными препаратами и адьювантами, путем встраивания генов этих биологически активных веществ в молекулу ДНК, содержащую вирусный ген.

Важным преимуществом технологии ДНК-вакцин является то, что она позволяет получить вакцины для агентов, которые невозможно культивировать.

Однако, несмотря на ряд преимуществ ДНК-иммунизации, при использовании данного типа вакцин существует несколько неясных моментов. Например, до конца не изучены сроки, в течение которых клетки организма будут вырабатывать антигенный белок. Не все ясно с безопасностью ДНК-вакцин. Неизвестно, может ли в дальнейшем введенная ДНК вызывать рак, или будет ли антиген, продуцируясь в избыточных количествах, вызывать развитие различных форм иммуносупрессии или других патологических явлений (18).

В настоящее время накапливается все больше работ по ДНК-вакцинации. Для успешного использования ДНК-вакцины необходимо индуцирование эффективного и длительного антивирусного иммунитета способного предотвратить последующие вирусные атаки. Особое внимание авторы уделяют изучению реакции различных звеньев иммунитета. Вирус-специфический Т-клеточный иммунный ответ определяется МНС П-го класса - CD4+ Т-клетками, обладающими Т-хелперным фенотипом (Thl) и МНС 1-го класса - CD8+ цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL), которые убивают инфицированные клетки (223). Опыты ведутся на различных животных моделях: высшие обезьяны, кошки, кролики, крысы, мыши и т.д. (223, 142, 185).

Существуют различные схемы иммунизации животных. Для разных патогенов авторами подбирается разнообразный цикл иммунизаций и концентрации вводимой ДНК. Так, в работе Harrison R.A. с соавторами приводится схема иммунизации мышей эукариотической плазмидой, содержащей ген L3 нематоды. В первой группе мышей иммунизировали три раза, с интервалом 4 месяца, методом баллистической трансфекции. Во второй группе мышей иммунизацию проводили 5 раз с интервалом 1 месяц. Авторы показали, что уровни гуморального и клеточного иммунного ответа были выше во второй группе животных (105).

В исследованиях Ruitenberg R.M. et al, 1999 было показано, что после однократного внутримышечного введения плазмиды, содержащей ген gD EHS-1 через две недели после инъекции были обнаружены специфические антитела, уровень которых удерживался в течение 23 недель (титр 1/1250). Иммунный ответ был пропорционален дозе ДНК и вторичное введение ДНК, увеличивало гуморальный ответ. Также было показано, что после двукратного введения ДНК наблюдали образование нейтрализующих антител IgG2a, что может свидетельствовать об активации Thl клеточного ответа, который играет главную роль в элиминации вирусных агентов. Пролиферативный ответ лимфоцитов на белок gD незначительно увеличивался после первой инъекции, однако после второго введения ДНК возрастал в 11 раз по сравнению с контролем. Кроме этого было показано, что при интраназальном заражении вакцинированных животных, очищение от вируса ткани легкого происходит быстрее, а также отмечено уменьшение патологии легких у мышей иммунизированных ДНК, в сравнении с контрольными животными (179).

В работе Abendroth A. et al. приводится схема иммунизации мышей плазмидой содержащей гены IE62 и gE вируса Varicella zoster. Мышей иммунизировали трехкратно с интервалом между первой и второй иммунизациями - 1 неделя, второй и третьей - 3 недели. Плазмиду вводили по 50 мкг, внутримышечно. Через три недели после 3 инъекции у мышей анализировали наличие специфических противовирусных антител и уровень Т-клеточного ответа. Было установлено, что у 20% мышей иммунизированных плазмидой содержащей гены белков IE62 и gE присутствовали антитела против этих белков. Анализ Т-клеточного иммунитета, показал, что у 90% животных, иммунизированных плазмидой содержащей ген IE62 наблюдеется увеличение специфического Т-клеточного ответа. Таким образом, авторами было установлено, что ДНК иммунизация против вируса Varicella Zoster индуцирует возникновение, в основном, Т-клеточного иммунитета (52).

Увеличение Т-клеточного ответа также наблюдали при анализе ДНК-вакцинации плазмидами, содержащими гены белков NS3, NS4, NS5, и Core вируса гепатита С, при 2- и 3-х кратном введении с интервалом в 2 недели между инъекциями. Цитокиновый профиль определяемый после ДНК-иммунизациии демонстрировал классический Т-хелперный ответ 1 типа, с высокими уровнями ИФ-у и ИЛ-2 (90, 98).

Клеточная цитотоксичность - важный механизм защиты против внутриклеточно локализованных возбудителей, таких как вирусы, некоторые бактерии и простейшие. При активации цитотоксических Т-клеток они мигрируют в ткань, находят клетку-мишень и взаимодействуют с ней с помощью Т-клеточного рецептора, узнающего комплекс молекула гистосовместимости - пептид. Одновременно происходит взаимодействие с помощью молекул адгезии. Вследствие такого взаимодействия происходит перестройка ультраструктуры клетки. Аппарат Гольджи ориентируется в сторону контакта. Сюда же подходят микротрубочки и микрофиламенты. К месту контакта приближаются секреторные везикулы и образуется иммунный синапс (место контакта Т-клетки и клетки-мишени). После формирования иммунного синапса наступает эффекторная фаза взаимодействия и в его просвет выбрасывается содержимое секреторных везикул, в состав которых входят перфорин и гранзимы. Молекулы перфорина встраиваются в мембрану клетки-мишени и образуют поры, состоящие из двух десятков мономеров перфорина, через которые внутрь клетки входят гранзимы. Если на клетке-мишени экспрессируется CD95, то происходит его влаимодействие с молекулой-лигандом CD95L на цитотоксическом Т-лимфоците и запускаются механизмы, приводящие к апоптозу пораженной клетки. Аналогичную функцию играют и гранзимы. Помимо этого CTL продуцируют фактор некроза опухоли (ФНО) и интерферон-у (ИФ-у). Взаимодействие ФНО с соответствующим рецептором на клетке-мишени также приводит к возникновению сигнала апоптоза. ИФ-у привлекает к месту взаимодействия клеток макрофаги, которые поглощают апоптотические тельца, образовавшиеся в результате апоптоза (42).

В исследованиях Martins L.P. et al., было показано, что ДНК-вакцинация может индуцировать протективный иммунный ответ при дессиминированной персистентной LCMV-инфекции у мышей. Исследовались две группы мышей, у одной создавалась острая инфекция, у другой персистентная LCMV-инфекция. В первой группе наблюдали высокий уровень CTL-ответа, тогда как у второй группы этот ответ был очень низким. Вторую группу мышей иммунизировали ДНК-плазмидами, содержащими различные гены LCMV. Было показано, что при 3-х кратной иммунизации с интервалом в 3 недели между инъекциями ДНК, резко увеличивался вирусспецифический CTL-ответ у 50% мышей. Данными исследованиями было подтверждено, что генная иммунизация является оптимальным методом для стимулирования CD8+ Т-лимфоцитов (141).

Данные о том, что вакцинация на основе ДНК может индуцировать вирус специфический CTL ответ, были получены и в ряде других работ. Было установлено, что ДНК-векторы, экспрессирующие белки вирусов гриппа, бешенства, гепатита С, ВИЧ, LCMV, а также возбудителя малярии, увеличивают CTL-ответ у экспериментальных животных (175, 90, 223, 207, 221, 54, 103). Показано, что ДНК- вакцины, которые активируют цитотоксические Т-лимфоциты, могут иметь протективные свойства в защите организма, как при острой, так и при персистентной вирусной инфекции, даже при отсутствии противовирусных антител (79).

Детальные механизмы клеточного ответа на ДНК-иммунизацию до конца не изучены. Мышечная ткань часто используется для экспрессии in vivo генов, встроенных в плазмиду (207). Однако, на мышечных клетках нет молекул гистосовместимости II класса, необходимых для презентации антигена Т-лимфоцитам и молекул В7 (CD80/CD86), соединение которых с соответствующим лигандом на Т-клетке (CD28) ведет к формированию коактивационного сигнала, необходимого для превращения наивной Т-клетки в армированную. Экспрессирующийся в мышечных клетках антиген скорее всего поступает в межклеточное пространство, где он будет захватываться транзиторыми антиген-представляющими клетками (АПК), например, клеткам Лангерганса. АПК в свою очередь будут презентировать данный антиген CD4+ Т-лимфоцитам (221). Другие исследователи изучали зависимость CTL-ответа на ДНК-вакцинацию от МНС класса II CD4+ Т-клеток. Для подтверждения данной гипотезы, мышей иммунизировали внутримышечно и внутрикожно ДНК, кодирующей цельный ген OVA, (К-Ь)-ограниченный пептид эпитопа OVA класс I и смесью класса I пептида OVA и смежного (1-аЬ)-ограниченного эпитопа класса II. Было показано, что при иммунизации конструкцией, состоящей из эпитопа класса I, был очень низкий CTL-ответ. У мышей иммунизированных цельным OVA и смесью двух эпитопов (класса I и II) был одинаково высокий уровень цитотоксического Т-клеточного ответа. Для подтверждения того, что природа данного ответа определяется CD4+ Т-хелперами, мыши были истощены как по CD4+, так и по CD8+ до ДНК-иммунизиции. У мышей, истощенных как по CD4+, так и по С08+-клеткам, не было CTL-ответа на иммунизацию ДНК, содержащей цельную молекулу OVA. На основании данных результатов можно сделать заключение, что CTL-ответ при обеих иммунизациях прямо зависит от генерации CD4+ Т-хелперов (136).

2. ДНК-иммунизация при герпетических инфекциях.

Почти треть населения Земли поражена герпетической инфекцией, причем у 50% из них наблюдаются рецидивы заболевания. В России и странах СНГ почти 22 млн. человек страдают от герпетической инфекции (24), а число госпитализированных только с офтальмогерпесом превышает 2.5 млн. в год (26). По данным ВОЗ, заболевания, вызываемые вирусом простого герпеса (ВПГ), занимают второе место (15.8%) после гриппа (35.8%) среди причин смерти от вирусных инфекций (27). Имеются данные, что к пятилетнему возрасту около 60% детей уже инфицировано, а к 15 годам

-20- почти 90% детей и подростков имеют антитела к ВПГ. Большинство людей являются пожизненными вирусоносителями. Причем в 85-99% случаев первичная инфекция у них протекает бессимптомно и только в 1 - 15% - в виде системной инфекции (32). В США более 100 млн. человек инфицировано ВПГ 1 и по разным данным от 40 до 60 млн. - ВПГ 2 (218), причем ежегодно инфицируются до 500 тыс. американцев (142).

В настоящее время имеется большое количество вирусспецифических и неспецифических препаратов для лечения герпетической инфекции, однако, заболеваемость, вызванная ВПГ, продолжает расти. Исследования субъединичных вакцин на основе вирусных белков в США показали, что данные вакцины обеспечивают лишь частичную защиту от первичного заражения ВПГ и практически не снижают рецидивы заболевания у людей, страдающих генитальным герпесом (200). Другие типы современных вакцин, например, основанные на получении мутантных штаммов ВПГ, находятся в стадии разработки.

Тремин герпес (от греческого herpes - ползучий) был использован Геродотом в 100-м году до нашей эры для описания волдырей, сопровождающихся лихорадкой. В настоящее время известно более 100 герпесвирусов, которые инфицируют позвоночных. Большинство из них инфицируют млекопитающих или птиц, но есть представители поражающие рептилий, амфибий и рыб. ДНК-геном герпесвирусов имеет большие размеры и составлен 120-230 kb. Он кодирует несколько десятков белков, не все из которых идентифицированы и описаны в настоящее время (217).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Козлов, Алексей Юрьевич

выводы.

1. Получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела (МКА), взаимодействующие с рекомбинантным белком gD вируса простого герпеса (ВПГ) и с натуральным белком gD в составе ВПГ1 и ВПГ2, в различных иммунохимических реакциях.

2. С помощью МКА установлена способность ДНК-конструкции, содержащей ген gD ВПГ1 (pDNAgD), экспрессироваться в эукариотических клетках, трансфицированных in vitro.

3. Сравнительный анализ эффективности различных способов введения плазмидной ДНК при иммунизации мышей линии BALB/c ДНК-конструкцией pDNAgD показал, что внутримышечное введение обеспечивает более высокую эффективность иммунного ответа по сравнению с подкожным введением ДНК.

4. Установлено, что однократная иммунизация pDNAgD позволяет увеличить пролиферативный ответ Т-лимфоцитов в 8 раз, соотношение анти-ВПП IgG2a/IgGl в 2 раза. Двукратная иммунизация pDNAgD с интервалом 2 недели, приводит дополнительно к увеличению активности антител к ВПГ1 в 16 раз и формированию вируснейтрализующих антител.

5. Сравнительный анализ адъювантного действия соединений на основе генов цитокинов и синтетических пептидов на эффективность ДНК-иммунизации показал, что использование ДНК-конструкции содержащей ген фактора некроза опухоли (pDNATNF) стимулирует увеличение активности Т-клеточного и В-клеточного звеньев иммунитета in vitro, однако снижает защиту животных in vivo. Использование синтетического пептида Гепон стимулирует увеличение активности В-клеточного ответа. Применение в качестве адъюзантов ДНК-конструкции содержащей ген гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (pDNAGM-CSF) и глюкозаминил-мурамилдипептида (ГМДП) приводит к формированию высоких уровней Т-клеточного ответа.

6. Показано, что pDNAGM-CSF и ГМДП оказывают адъювантный эффект, повышая эффективность протекции от летальной дозы ВПГ1 (160 LD50) после однократной ДНК-иммунизации pDNAgD с 63% до 96-100%.

-116

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Козлов, Алексей Юрьевич, Москва

1. Абазова Ф.И., Безух С.М., Борисенко К.К. и др. Неизвестная эпидемия: герпес (патогенез, диагностика, клиника, лечение). Смоленск: Фармаграфикс. -1997.

2. Атауллханов Р.И., Холмс Р.Д., Катлинский А.В. и др. Иммуномодулятор «Гепон» подавляет репликацию вируса гепатита С в культуре клеток человека in vitro // Антибиотики и химиотерапия. 2002. - Том. 47. - №.8. -С.9-11.

3. Атауллханов Р.И., Холмс Р.Д., Наровлянский А.Н. и др. Механизмы противовирусного действия препарата «Гепон»: изменение транскрипции генов цитокинов в перевиваемых клетках человека // Иммунология. — 2003. №.1. - С.9-12.

4. Баринский И .Ф., Шубладзе А.К. Этиология хронических вирусных инфекций. М., 1984. - С.51.

5. Баринский И.Ф., Каспаров А.А., Лазаренко А.А. и др. Убитая коммерческая вакцина против вирусов простого герпеса 1 и 2 типов как средство иммунокоррекции при хронической герпетической инфекции // Журн. Микробиол. 1999. - №.6. - С.98-102.

6. Бибичева Т.В., Силина JI.B. Иммуномодулятор Гепон для местной терапии герпес-вирусной инфекции // В кн.: Тезисы докладов IX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». — Москва. -2002.-С.55.

7. Бибичева Т.В., Силина JI.B. Лечение рецидивирующего генитального герпеса иммуномодулятором Гепон // В кн.: Тезисы докладов IX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва.2002.-С.56.

8. Вирусология. Методы: Пер. с англ. / Под. Ред. Б. Мейхи. М.:Мир, 1988. -344с.

9. Генная терапия медицина будущего / Редактор составитель А.В.Зеленин. М.: ВИНИТИ РАН-ППФНТП «Геном человека». - 2000.

10. Горбарец И.П., Воронкова Н.В., Лопатина Т.В. и др. Опыт применения препарата Гепон в сочетании с рекомбинантным интерфероном-альфа у больных хроническим гепатитом С // Русский медицинский журнал.2003. -№.12. -С.714-717.

11. Грибенча С. В., Холмс Р. Д., Атауллаханов Р. И., Баринский И. Ф. Противовирусная активность пептидного иммуномодулятора "Гепон" в экспериментах на модели уличного вируса бешенства // Вопросы вирусологии. 2003. - №.4. - С.40-45

12. Зеленин А. В. Генная терапия на границе третьего тысячелетия И Вестник российской академии наук. 2001. - Том 71. - №.5. - С.387-395.

13. Игнатьев Г.М., Бычкова Е.Н., Грибенча С.В. и др. А.С. №381904/28-14 (130215).-1986.

14. Карсонова М.И., Андронова Т.М., Пинегин Б.В., Хаитов P.M. Иммуностимулирующая активность мурамилдипептида и его производных // Журн. микробиол. 1999. - №.3, - С. 104-110.

15. Каспаров А.А. Офтальмогерпес. М., 1994.

16. Кладова О.В., Харламова Ф.С., Щербакова А.А. и др. Эффективное лечение синдрома крупа с помощью иммуномодулятора Гепон // Русский медицинский журнал. 2002. - Том. 10. - №.3. - С .138-141.

17. Кладова О.В., Харламова Ф.С., Щербакова А.А. и др. Первый опыт интраназального применения гепона у детей с респираторными заболеваниями // Педиатрия. 2002. - №.2. - С.86-88.

18. Козлова В. И., Пухнер А.Ф. Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания гениталий. Москва. 1997. - С.536.

19. Колесников В.А., Титомиров А.В., Зеленин А. В. Генетическая трансформация клеток животных в культуре с помощью высокоскоростного механического пробоя // Докл. АН СССР. 1988. -Том 305. — С. 1265-1267.

20. Кунгуров Н.В., Герасимова Н.М., Зудин А.Б., Кузовкина Т.В. Генитальный герпес. Екатеринбург: Издательство Уральского университета. 2001. - С.7.

21. Майчук Ю.Ф. Селективная противовирусная терапия при герпетических кератитах //Клиническая медицина. -2001. -№.9. С.70-71.

22. Манько В.М., Скворцов В., Мастернак Т.Б., Иванова А.С. Экспериментальное изучение иммуномодулирующего действия глюкозаминилмурамилдипептида (ГМДП). Влияние ГМДП на гуморальный ответ // Иммунология. — 1988. №.6. - С.34-37.

23. Манько В.М., Скворцов В., Мастернак Т.Б., Ларин А.С. и др. Экспериментальное изучение иммуномодулирующего действия глюкозаминил-мурамил-дипептида (ГМДП). Влияние ГМДП на клеточный иммунитет // Иммунология. 1989. - №. 1. - С.38-41.

24. Мурзич А.В., Голубев М.А. Герпетическая инфекция // Южно-Российский медицинский журнал. 1998. - №.3. - С.44-47.

25. Насонов E.JI. Фактор некроза опухоли-а новая мишень для противовоспалительной терапии ревматоидного артрита // Клин. Фармакол. Терапия - 2001. - №. 1. - С.64-70.

26. Носков Ф.С., Никитина JI.E., Масленникова Л.К., Фридман Е.А. // Иммунология. 1984. - №.4. - С.53-55.

27. Пинегин Б.В., Минкина Г.Н., Агикова Л.А. и др. Использование нового иммуномодулятора ГМДП при лечении больных папилломавирусной инфекцией шейки матки // Иммунология. 1997. - №. 1. - С.49-51.

28. Пинегин Б.В., Ханухова Л.М., Рабинович О.Ф., Андронова Т.М. Новые аспекты клинического применения ликопида при заболеваниях, связанныхс нарушением иммунитета // Медицинская иммунология. 1999. - №.3-4. -С.127-128.

29. Позднякова В.В. Иммунотерапия герпесвирусных заболеваний глаз // Materia Medica. 1999. - №.4. - С.36-45.

30. Полякова Т.С., Магомедов М.М., Артемьев М. Е. и др. Новый подход к лечению хронических заболеваний глотки // Лечащий врач. 2002. - №.4. — С.64-65.

31. Птушкин В.В. Роль гранулоцитарного и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующих факторов в лечении инфекции при нейтропении // Современная Онкология. 2001. - Том.З. - №.3. -С.23-28.

32. Рахмилевич А.Л., Рахимова В.К., Андронова Т.М., Бовин Н.В. Иммуностимулирующее действие мурамилдипептида, глюкозаминилмурамилдипептида и их синтетических производных в системе in vitro // Антибиотик, химиотер. 1989. - №.34. - С.586-588.

33. Рожнова У. А., Гуляева Н. В., Степаничев М. Ю., Алесенко А. В. Роль сфинголипидов в передаче сигнала ФНО В разных отделах мозга // Материалы Второй Российской конференции 18-20 октября 1999.

34. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир, 2000. - 592с.

35. Тихонова Л.И. О состоянии заболеваемости болезнями, передаваемыми половым путем (по итогам 1996 г.), и мерах по их предупреждению в России // заболевания, передаваемые половым путем. 1997. - №.4. -С.22-26.

36. Тищенко АЛ. Новый подход к лечению рецидивирующего урогенитального кандидоза // Гинекология. 2001. - Том.З. - №.6. -С.210-212.

37. Уманский В., Тараховский А., Андронова Т. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины XCIX. 1985. - С.685-687.

38. Чернецова Л.Ф., Зотов П.Б. Иммунотерапия сопровождения ликопидом больных распространенными формами злокачественных новообразований // Российский онкологический журнал. 2001. - №.5. - С.49-53.

39. Шаков И.М. Наружное лечение рецидивирующего генитального герпеса препаратом Гепон // Вестник последипломного медицинского образования. 2003. - №.1. - С.51-52.

40. Шестопалов A.M., Рассадкин Ю.Н., Устинова Е.Н. и др. Влияние фактора некроза опухоли а на эффективность вакцинации против бешенства // Вопросы Вирусологии. 2002. - №.3. - С.37-40.

41. Шингарова Л.Н., Сагайдак Л.Н., Беркова Н.П., Коробко В.Г. Взаимодействие анти-ФНОа моноклональных антител Е7/Н2 с мутантными и гибридными белками // Биоорган.химия. 1997. - Т.23. -С.428-433.

42. Шингарова Л.Н., Сагайдак Л.Н., Турецкая Р.Л., Недоспасов С.А., Есипов Д.С., Коробко В.Г. Мутантный человеческий ФНО: получение и некоторые свойства // Биоорган, химия. 1996. - №.22. - С.234-251.

43. Шмелев В.А., Григорьев Б.В., Можарова Т.И., Попов С. Г. Тимозин-ai и гибридные белки, состоящие из фактора некроза опухолей-a и тимозина-di увеличивают эффективность вакцинации против возбудителя чумы // Журн. Микробиол. 1994. - №.4. - С.85-89.

44. Abendroth A., Slobedman В., Springer M.L. et al. Analysis of immune responses to varicella zoster viral proteins induced by DNA vaccination // Antiviral research. 1999. - V.44. - P.179-192.

45. Agadjanyan M.G., Chattergoon M.A., Holterman M.J. Costimulatory molecule immune enhancement in a plasmid vaccine model is regulated in part through the Ig constant-like domain of CD80/86 // J. Immunol. 2003. - V.171. -P.4311-4319.

46. Andronova Т., Ivanov V. The structure and immunological function of glucosaminylmuramyl peptides // Sov. Medical Reviews. D. Immunology (Harwood Academic Publishers). 1991. - V.4. - P. 1-63.

47. Ankel H., Westra D.F., Wellingwester S. Induction of interferon-alpha by glycoprotein D of herpes simplex virus a possible role of chemokine receptors // Virology. - 1998. - V.251. - Iss.2. - P.317-326.

48. Baca-Estrada M.E., Folvari M., Snider M. et al. Effect of IL-4 and IL-12 liposomal formulation on the induction of immune response to bovine herpesvirus type-1 glycoprotein D // Vaccine. 1997. - V.15. - P.1753-1760.

49. Balitsky K.P., Umansky; V.Y., Tarakhovsky A.M., Andronova T.M. et al. Glucosaminylmuramyl dipeptide induced changes in murine macrophage metabolism // Int. J.Immunopharmac. 1989. - V.l 1. - P.429-434.

50. Bartholdy C., Olszewska W., Stryhn A. et al. Gene-gun DNA vaccination aggravates respiratory syncytial virus-induced pneumonitis // J. Gen. Virol. 2004. - V.85. - P.3017-3026.

51. Behbehani K., Beller D.I., Unanue E.R. The effect of beryllium and other adjuvants on la expression by macrophages // J. Immunol. 1985. - V.l34. -P.2047-2049.

52. Beutler B. et al. Cachectin (tumor necrosis factor): a macrophage hormone governing cellular metabolism and inflammatory response // Endocr. Rev. — 1988. V.9. -P.57-66.

53. Bilsborough J., Uyttenhove C., Colau D. et al. TNF-mediated toxicity after massive induction of specific CD8+ T cells following immunization of mice a tumor-specific peptide // The Journal of Immunology. 2002. - V.l69. -P.3053-3060.

54. Bomford R., Stapleton M., Winsor S., McKnight A. et al. The control of the antibody isotype response to recombinant human immunodeficiency virusgpl20 antigen by adjuvants // AIDS Res. Human Retrov. 1992. - P. 17651771.

55. Bopegamage S.A., Petrovicova A. Tumor necrosis factor alfa and glucose levels in sera of mice infected with Coxsackie B4 and A7 viruses // Acta. Virol. 1998. - V.42. - P.409-412.

56. Bourne N., Milligan G.N. Evaluation in mice of intramuscular, intravaginal and intrarectal immunization with a DNA vaccine against experimental genital herpes / 13th Meeting of ISSTDR. July 11-14. 1999. - Denver. Colorado. USA.

57. Bozkurt В., Kribbs S.B., Clubb F.J. et al. Pathophysiological^ relevant concentrations of tumor necrosis factor-a promote progressive left ventricular dysfunction and remodeling in rats // Circulation. -1998. V.97. - P. 13821391.

58. Browne H., Bruun В., Minson T. Plasma membrane requirements for cell fusion induced by herpes simplex virus type 1 glycoproteins gB, gD, gH and gL // Journal of General Virology. 2001. - V.82. - P.1419-1422.

59. Campadelli-Fiume G., Cocchi F., Menotti L., Lopez M. The novel receptors that mediate the entry of herpes simplex viruses and animal herpesviruses into cells // Rev. Med. Virol. 2000. - V.10. - P.305-339.

60. Cantin, E.M. et al. Expression of herpes simplex virus 1 glycoprotein В by a recombinant vaccinia virus and protection of mice against lethal herpes simplex virus infection // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V.84. - P.5908-5912.

61. Cappel, R., DeCuyper, F., and Rikaert, F. Efficacy of a nucleic acid free herpetic subunit vaccine // Arch. Virol. 1980. - V.65. - P. 15-23.

62. Carswell E.A., Old L.J., Kassel R.L. et al. An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors // Proc. Natl. Acad. Sci. 1975. - V.72. -P.3666-3670.

63. Caselli E., Grandi P., Argnani R., et al. Mice genetic immunization with plasmid DNA encoding a secreted form of HSV-1 gB induces a protective immune response against Herpes simplex virus type 1 infection // Intervirology. -2001.-V.44.-P.1-7.

64. Cedillo-Barron L., Foster-Cuevas M., Cook A. et al. Immunogenicity of plasmids encoding T and В cell epitopes of foot-and-mouth disease virus (FMDV) in swine // Vaccine. 2003. - V.21. - P.4261-4269.

65. Chapin H.B., Wong S.C., Reapsome J. The value of tissue culture vaccine in the prophylaxis of recurrent attacks of herpetic keratitis // Am. J. Ophthalmol. 1962. - V.54. - P.255-265.

66. Chow Y.H., Chiang B.L., Lee Y.L. et al. Development of Thl and Th2 populations and the nature of immune responses to hepatitis В virus DNA vaccines can be modulated by codelivery of various cytokine genes // J. Immunol. 1998. - V.160. - P.1320-1329.

67. Christenson В., Bottiger M., Svensson A. et al. A 15 year surveillance study to antibodies to herpes simplex virus types 1 and 2 in a cohort of young girls // J.Infect. 1992. -V.25. - №.2. - P.147-154.

68. Cockrell A.S., Muggeridge M.I. Herpes simplex virus 2 U145 is a type II membrane protein // J. Virol. 1998. - V.72. - Iss.5. - P.4430-4433.

69. Corr. M., Lee D.J., Carson D.A., Tighe H. Gene vaccination with naked plasmid DNA: mechanism of CTL priming // J. Exp. Med. 1996. - V.184. -P.1555-1560.

70. Cruz P.E., Khalil P.L., Dryden T.D. et al. A novel immunization method to induce cytotoxic T-lymphocyte responses (CTL) against plasmid-encoded Herpes simplex vims type-1 glycoprotein D // Vaccine. 1999. - V.17. -P.l 091-1099.

71. Culver K.W. Gene Therapy. A Handbook for Physicians. 2nd Eddition NY: Mary Ann Inc. Publishers. 1996.

72. Disis M.L., Bernhard H., Shiota F.M. et al. Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor: an effective adjuvant for protein and peptide-based vaccines // Blood. 1996. - V.88. - P.202-210.

73. Dix, R.D., and Mills, J. Acute and latent herpes simplex virus neurological disease in mice immunized with purified virus-specific glycoproteins gB or gD //J.Med. Virol.- 1985.-V.17.-P.9-18.

74. Dundarov, S., Andonov, P., Bakalov, В., Nechev, K., and Tomov, C. Immunotherapy with inactivated polyvalent herpes vaccines // Dev. Biol. Stand.- 1982. -V.52.-P.351-358.

75. Eling D.J., Johnson P.A., Sharma S. et al. Chronic lymphocytic leukemia В cells are highly sensitive to infection by herpes simplex virus-1 via herpesvirus-entry-mediator A // Gene Ther. 2000. - V.7. - P. 1210-1216.

76. Encke J., zu Putlitz J., Geissler M., Wands J.R. Genetic immunization generates cellular and humoral immune responses against the nonstructural proteins of the hepatitis С virus in a murine model // J. Immunol. 1998, - V.161. - P.4917-4923.

77. Ertel W., Morrison M.H., Wang P. et al. The complex pattern of cytokines in sepsis//Ann. Surg.- 1991.-V.214.-P.141-148.

78. Esmann J. The many challenges of facial herpes simplex virus infection // Journal of antimicrobial chemotherapy. 2001. - V.47. - P.17-27.

79. Evans J.A., Darlington D.N., Gann D.S. A circulating factors mediates cell depolarization in hemorrhagic shock // Ann. Surg. 1991. - V.213. - P.549-557.

80. Farrar W.L., Johnson H.M., Farrar J.J. Regulation of the production of immune interferon and cytotoxic T lymphocytes by interleukin-2 // J. Immunol. 1981.1. V.126. P.l 120-1125.

81. Flo J., Perez B.A., et al. Superiority of intramuscular route and full length glycoprotein D for DNA vaccination against herpes simplex viruse-2. Enhancement of protection by the co-delivery of the GM-CSF gene // Vaccine.- 2000. V.18. - P.3242-3253.

82. Gallichan W.S., Rosenthal K.L. Long-term immunity and protection against herpes simplex virus type 2 in the murine female genital tract after mucosal but not systemic immunization // Infect Dis. 1998. - V.177. - P.l 155-1161.

83. Gately M.K., Wolitzky A.G., Quinn P.M., Chizzonite R. Regulation of human cytolytic lymphocyte responses by interleukin-12 // Cell. Immunol. 1992. -V.143. - P.127-142.

84. Geissler M., Gesien A., Tokushige K., Wands J.R. Enhancement of cellular and humoral immune responses to hepatitis С virus core protein using DNA-based vaccines augmented with cytokine-expressing plasmids // J. Immunol. -1997. V.l 58 - P.1231-1237.

85. Ghiasi H., Kaiwar R., Nesburn A.B., et al. Expression of seven herpes simplex virus type 1 glycoproteins (gB, gC, gD, gE, gG, gH, and gl): comparativeprotection against lethal challenge in mice // Journal of Virology. 1994. -P.2118-2126.

86. Griffiths P. Neonatal HSV and evidence based medicine // Rew. Med. Virol. - 1997. - V.7. -Iss.4. -P.197-198.

87. Haarr L., Shukla D., Rodahl E. et al. Transcription from the gene encoding the herpesvirus entry receptor nectin-1 (HveC) in nervous tissue of adult mouse // Virology. 2001. - V.287. - P.301-309.

88. Haddad D., Ramprakash J., Sedegah M. et al. Plasmid vaccine expressing granulocyte-macrophage colony-stimulating factor attracts infiltrates including immature dendritic cells into injected muscles // J. Immunol. 2000. — V.165. -P.3772-3781.

89. Hadden J.W. Immunostimulants // Immunol. Today. 1993. - V. 14. - P.275-280.

90. Harrison R.A., Wu Y., Egerton G., Bianco A.E. DNA immunisation with Onchocerca volvulus chitinase induces partial protection against challenge infection with L3 larvae in mice // Vaccine. -1999. V.8. - P.647-655.

91. Hashido M., Kawana T. Herpes simplex virus-specific IgM, IgA and IgG subclass antibody responses in primary and nonprimary genital herpes patients // Microbiol.-Immunol. 1997. - V.41. - P.415-420.

92. Higgins T.J., Herold K.M. et al. Plasmid DNA-Expressed Secreted and Nonsecreted Forms of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D2 induce Different Types of Immune Responses // J. Inf. Dis. 2000. - V. 182. - P. 1311 -1320.

93. Hofman P. Molecular regulation of neutrophil apoptosis and potential targets for therapeutic strategy against the inflammatory process // Curr. Drug. Targets. Inflamm. Allergy. 2004. - V.3. - C.l-9.

94. Honess R.W., Roisman B. Regulation of herpesvirus macro-molecular synthesis. I. Cascade regulation of the synthesis of three groups of viral proteins // J. Virol. 1974. - V.14. - P.8-14.

95. Ito M., O'Malley Y.A. Antiviral effects of recombinant human tumor necrosis factor // Lymphokine Res. 1987. - V.6. - P.309-318.

96. Jawetz, E., Allende, M.E., and Coleman, V.R. Studies on herpes simplex virus. VT. Observations on patients with recurrent herpetic lesions injected with herpes viruses or their antigens // Am. J. Med. Sci. 1955. - V.229. — P.477-485.

97. Kalden JR. Emerging role of anti-tumor necrosis factor therapy in rheumatic disease // Arthritis. Res. 2002. - V.4. - P.34-40.

98. Kern A.B., Schiff B.L. Vaccine therapy in recurrent herpes simplex // Arch. Dermatol. 1964. - V.89. - P.844-845.

99. Khaidukov S.V., Komaleva R.I., Nesmeyanov V.A. N-acetylglucosamine-containing muramyl peptides directly affect macrophages // Int. J. Immuiopharmacol. 1995. - V. 17. - P.903-911.

100. Khaitov R.M., Pinegin B.V., Butakov A.A., Andronova T.M. Immunotherapy of infectious postoperative complications with glucosaminyl dipeptide // Immunotherapy of Infections. 1994. - P.213-223.

101. Kim J.J., Trivedi N.N., Nottingham L.K. et al. Modulation of amplitude and direction of in vivo immune responses by co-administration of cytokine gene expression cassettes with DNA immunogens // Eur. J. Immunol. 1998. -V.28. -P.1089-1103.

102. Kim. J.J., Bagarazzi M.L., Trivedi N. Engineering of in vivo immune responses to DNA immunizations via codelivery of costimulatory molecule genes // Nat. Biotechnol. 1997. - V.l7. - P.614-646.

103. Kitces, E.N., Morahan, P.O., Tew, J.G., and Murray, B.K. Protection from oral herpes simplex virus infection by a nucleic acid-free virus vaccine // Infect. Immun. 1977. - V.16. -P.955-960.

104. Klein T.M. Wolf E.D. Wu R. et al. High velocity microprojectiles for delivering nuclei acids into living cells // Ibid 1987 - V.327. - P.70-73.

105. Klein T.M., Arentzen R., Lewis P.A., Fitzpatric-McElligot S. Transformation of microbes, plants and animals by particle bombardment // Biotechnology. -1992.- V.10. -P.286-291.

106. Klimova R., Zelenina I., Kolesnicov V., Zelenin A., Kushch A. 9-th Meeting of the European Society of Gene Therapy. 2001. - Antalia, Turkey. -Abstract book.-P.201.

107. Koelle D.M., Corey L. Recent progress in herpes simplex virus immunobiology and vaccine research // Clinical microbiology reviews. -2003-V.16.-№.1.-P.96-113.

108. Kohl S. A hypothesis on the pathophysiology of neonatal herpes simplex virus encephalitis: clinical recurrence after asymptomatic primary infection // Pediatr. Infect. Dis. J. 1990. - V.9. - P.307-308.

109. Kramer S.M., Carwer M.E. Serum-free in vitro bioassay for the detection of tumor necrosis factor // J. Immunol. Meth. 1986. - V.93. - P.201-206.

110. Lasky, L.A., Dowbenko, D., Simonsen, C.C., and Berman, P.W. Protection of mice from lethal herpes-simplex virus-infection by vaccination with a secreted form of cloned glycoprotein-D // Bio-Technology. 1984. - V.2. - P.527.

111. Loomis-Huff R., Jennifer E., et al. Immunogenicity of a DNA vaccine against herpes virus in mice and rhesus macaques // Vaccine. 2001. - V.19. - P.4865-4873.

112. Maecker H.T., Umetsu D.T., DeKruyff R.H., Levys S. Cytotoxic T cell responses to DNA vaccination: dependence on antigen presentation via class II MHC // J. Immunol. -1998. V.161. - Iss.12. - P.6532-6536.

113. Maggi E., Parronchi P., Manetti R. et al. Reciprocal regulatory effects of IFN-gamma and IL-4 on the in vitro development of human Thl and Th2 clones // J. Immunol. 1992. - V.148. - P.2142-2147.

114. Manickan E, Rouse B.T. Roles of different T-cell subsets in control of herpes simplex virus infection determined by using T-cell deficient mouse model // J. Virol. 1995. - V.69. - P.8178-8179.

115. Mannel D.N., Moore R.N., Mergenhagen S.E. Macrophages as a source of tumoricidal activity (tumor-necrotizing factor) // Infect. Immunol. -1980. -V.30. P.523-530.

116. Martins L.P., Lau L.L., Asano M.S., Ahmed R. DNA vaccination against persistent viral infection // J. Virol. 1995. - V.69. - №4. - P.2574-2582.

117. McDermott, M.R., Graham, F.L., Hanke, Т., and Johnson, D.C. Protection of mice against lethal challenge with herpes simplex virus by vaccination with an adenovirus vector expressing HSV glycoprotein В // Virology. — 1989. — V. 169.- P.244-247.

118. Meignier, В., Longnecker, R., and Roizman, B. In vivo behavior of genetically engineered herpes simplex virus R7017 and R7020. Construction and evaluation in rodents // J. Infect. Dis. 1988. - V.158. - P.602-614.

119. Mertz, G.J. et al. Double-blind, placebo-controlled trial of a herpes simplex virus type 2 glycoprotein vaccine in persons at high risk for a genital herpes infection // J. Infect. Dis. 1990. - V.161. - P.653-660.

120. Mertz, G.J. et al. Herpes simplex virus type-2 glycoprotein-subunit vaccine: tolerance and humoral and cellular responses in humans // J. Infect. Dis. 1984.- V.150. P.242-249.

121. Meyer J.D., Yurt R.W., Duhaney R. et al. Tumor necrosis factor-enhanced leukotriene B4 generation and chemotaxis in human neutrophils // Arch. Surg. -1988. V.123. - P.1454-1458.

122. Mikloska Z., Bosnjak L., Cunningham A.L. Immature monocyte-derived dendritic cells are productively infected with herpes simplex virus type 1 // J. Virol. 2001. - V.75. - P.5958-5964.

123. Minami M, Kita M, Yan X.Q. et all. Role INF-gamma and tumor necrosis factor-alpha in herpes simplex virus type 1 infection // J Intrferon Cytokine Res.- 2002. -V.22. P.671-676.

124. Mocarski, E.S., Post, L.E., and Roizman, B. Molecular engineering of the herpes simplex virus genome: insertion of a second L-S junction into the genome causes additional genome inversions // Cell. 1980. - V.22. - P.243-255.

125. Montgomery R.L., Warner M.S., Lum B.J., Spear P.G. Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family // Cell. 1996. - V.87. - P.427-436.

126. Moore A.C., Kong W.P., Chakrabarti B.K., Nabel G.J. Effects of antigen and genetic adjuvants on immune responses to human immunodeficiency virus DNA vaccines in mice // J. Virol. 2002. - V.76. - P.243-250.

127. Murray D.R., Freeman G.L. Tumor necrosis factor-a induces a biphasic effect on myocardial contractility in conscious dogs // Circ. Res. 1996. - V.28. -P.964-971.

128. Nascimento M.C., Sumita L.M., deSouza V.A., Pannuti C.S. Detection and direct typing of herpes simplex virus in perianal ulcers of patients with AIDS by PCR // Journal of Clinical Microbiology. 1998. - V.36. - №.3. - P.848-849.

129. Nasemann, Т., and Schaeg, G. Herpes simplex virus, type II: microbiology and clinical experiences with attenuated vaccine // Hautarzt. 1973. - V.24. -P.133-139.

130. Nass P.H., Karen L.E., Jerry P.W. Protective immunity against herpes simplex virus generated by DNA vaccination compared to natural infection // Vaccine. 2001. - V. 19. - P.1538-1546.

131. Nesmeyanov V., Golovina Т., Valyakina Т., Andronova T.M. Cellular and molecular mechanisms of biological activity of muramyl peptides // Immunotherapy of Infections. 1994. - P.203-212.

132. Nesmeyanov V.A., Khaidukov S.V., Komaleva R.L., Andronova T.M. et al. Muramylpeptides augment expression of la-antigens on mouse macrophages // Biomed. Sci. 1990. - V.l. -P.151-154.

133. Pachuk C.J., Arnold К, Herold R.B. et all. Humoral and cellular immune responses to herpes simplex virus-2 glycoprotein D generated by facilitated DNA immunization of mice // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1998. -V.226. - P.234.

134. Paine R 3rd., Wilcoxen S.E., Morris S.B. et al. Transgenic overexpression of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in the lung prevents hyperoxic lung injury // Am. J. Pathol. 2003. - V.163. - P.2397-2406.

135. Pan C.H., Chen H.W., Tao M.H. Modulation of immune responses to DNA vaccines by codelivery of cytokine genes // J. Formos. Med. Assoc. 1999. — V.98. - P.722-729.

136. Pepos J.S., Leib D.A., Stuart P.M., Easty E.L. Herpes simplex virus diseases: anterior segment of the eye // Ocular Infection and Immunity. 1996. — P.905-932.

137. Pereira L., Ali M., Kousoulas K. Domain structure of herpes simplex virus 1 glycoprotein B: Neutralizing epitopes map in regions of continuous and discontinuous residues // Virology. 1989. - V.172. - P. 11-24.

138. Ratner A., Clark W.R. Role of TNF-alpha in CD8+ cytotoxic T lymphocyte-mediated lysis //J. Immunol. 1993. - V.150. -P.4303-4314.

139. Rieckmann P., D'alessandro F., Nordan R. P. et al. IL-6 and tumor necrosis factor-a: autocrine and paracrine cytokines involved in В cell function // J. Immunol. 1991. - V.146. -P.3462-3468.

140. Robinson H.L., Torres C.A. DNA vaccines // Semin. Immunol. 1997. - V.9. -P.271-283.

141. Rossol-Voth R., Rossol S., Schutt K.H. et al. In vivo protective effect of tumour necrosis factor alpha against experimental infection with herpes simplex virus type 1 // J. Gen. Virol. 1991. - V.72. - P.143-147.

142. Rothel J.S., Scow H.F., Lightwiers M.W. et al. The use of recombinant ovine IL-ip and TNF-a as natural adjuvants and their physiological effects in vivo // Immunol. Cell Biol. 1998. - V.76. - P.167-172.

143. Ruitenberg K.M., Walker C., Wellington J.E. et al. Potential of DNA-mediated vaccination for equine herpesvirus 1 // Veterinary Microbiology. -1999.-V.68.-P. 35-48.

144. Sarrias M.R., Whitbeck J.C., Rooney I. et al. The three HveA receptor ligands, gD, LT-alpha and LIGHT bind to distinct sites on HveA // Mol. Immunol. -2000. V.37. - P.665-673.

145. Sheppard B.C., Fraker D.L., Norton J.A. Prevention and treatment of endotoxin and sepsis lethality with recombinant human tumor necrosis factor // Surgery. 1989.- V.106.-P.156-161.

146. Sin J., Kim J.J., Pachuk C. et al. DNA vaccines encoding interleukin-8 and RANTES enhance antigen-specific Thl-type CD4(+) T-cell-mediated protective immunity against herpes simplex virus type 2 in vivo // J. Virol.2000. V.74. - P. 11173-11180.

147. Sin J.I., Ayavo V., Boyer J., et al. Protective immune correlates can segregate by vaccine type in a murine herpes model system // Int. Immunology. — 1999. -V.l 1. -P.1763-1773.

148. Sin J.I., Kim J., Dang K., et al. LFA-3 plasmid DNA enhances Ag-specific humoral- and cellular- mediated protective immunity against herpes simplex virus-2 in vivo: involvement of CD4+ T cells in protection // Cell Immunol.2001. V.203. - P. 19-28.

149. Smith, G.L., Mackett, M., and Moss, B. Infectious vaccinia vims recombinants that express hepatitis В virus surface antigen // Nature. 1983. -V.302. - P.490-495.

150. Socinski M.A., Cannistra S.A., Sullivan R. et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor induces the expression of the CD1 lb surface adhesion molecule on human granulocytes in vivo // Blood. 1988. - V.72. - P.691-697.

151. Soltz-Szots, J. Therapy of recurrent Herpes simplex // Z. Haut. Geschlechtskr. 1971. - V.46. - P.267-272.

152. Spear P.G. A first step towards understanding membrane fusion induced by herpes simplex virus // Mol. Cell. 2001. - V.8. - P.2-4.

153. Spear P.G., Eisenberg R.J., Cohen G.H. Three classes of surface receptors for alphaherpesvirus entry // Virology. 2000. - V.275. - P. 1-8.

154. Stanbeny, L.R., Bernstein, D.I., Burke, R.L., Pachl, C., and Myers, M.G. Vaccination with recombinant herpes simplex virus glycoproteins: protection against initial and recurrent genital herpes // J. Infect. Dis. 1987. - V.155. -P.914-920.

155. Stanberry, L.R., Myers, M.G., Stephanopoulos, D.E., and Burke, R.L. Preinfection prophylaxis with herpes simplex vims glycoprotein immunogens: factors influencing efficacy // J. Gen. Virol. 1989. - V.70. - P.3177-3185.

156. Straus S.E., Corey R.L., Tigges A.G. et all. Placebo-controlled trial of vaccination with recombinant glycoprotein D of herpes simplex vims type 2 for immunotherapy of genital herpes // Lancet. 1994. - V.343. - P. 1460-1463.

157. Sun X., Hodge L.M., Jones H.P. et al. Co-expression of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor with antigen enhances humoral and tumor immunity after DNA vaccination // Vaccine. 2002. - V.20. - P. 14661474.

158. Sykes K.F., Lewis M.G., Squires В., Johnston S.A. Evaluation of SIV libraiy vaccines with genetic cytokines in a macaque challenge // Vaccine. 2002. -V.20. - P.2382-2395.

159. Tanaka Y., Fujii Т., Yamana H. et al. Experimental gene therapy using p21Wafl gene for esophageal squamous cell carcinoma by gene gun technology // Int. J. Mol. Med. 2004. - V.14. - P.545-551.

160. Tizard M., Chan W.L. Differential T cell response induced by certain recombinant oligopeptides of Herpes simplex vims glycoprotein В in mice // J.Gen. Virol. 1997. - V.78. - P.1625-1632.

161. Tracey K.J., Beutler В., Lowry S.F. et al. Shock and tissue injury induced by recombinant human cachectin // Science. 1986. - V.24. - P.470-474.

162. Trillet-Lenoir V., Green J., Manegold C. et al. Recombinant granulocyte colony stimulating factor reduces the infectious complications of cytotoxic chemotherapy // Eur. J. Cancer. 1993. - V.29. - P.319.

163. Ulmer J.B., Donnelly J.J., Parker S.E. et al. Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein // Science. 1993. -V.259 - P.l 745-1749.

164. Wachsman, M. et al. Protection of guinea pigs from primary and recurrent herpes simplex vims (HSV) type 2 cutaneous disease with vaccinia vimsrecombinants expressing HSV glycoprotein D // J. Infect. Dis. 1987. - V.l55. -P.l 188-1197.

165. Wada H., Noguchi Y., Marino M.W., Dunn A.R., Old L.J. T cell functions in granulocyte/macrophage colony-stimulating factor deficient mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V.94. - P.12557-12561.

166. Wang J.M. Griffin J.D., Rambaldi A. et al. Induction of monocyte migration by recombinant macrophage colony-stimulating factor // J. Immunol. 1988. -V. 141(2). -P.575-579.

167. Webster R.G., Robinson H.L. DNA Vaccines A Review of Development // Biodrugs. - 1997. - V.8. - Iss.4. - P.273-292.

168. Wedlock D.N., Gon L.P., McCarthy A.R. et al. Physiological effects and adjuvanticity of recombinant brushtail possum TNF-a // Immunology and Cell Biology. 1999. - V.77. - P.28-33.

169. Weisbart R.H., Kwan L., Golde D.W., Gasson J.C. Human GM-CSF primes neutrophils for enhanced oxidative metabolism in response to the major physiological chemoattractants // Blood. 1987. - V.69. - P. 18-21.

170. Whithly R.S. Herpes Simplex Virus (in Fields Virology ed. by DM Knipe and RM Howley) // Lippincott Williams & Wilkins. 2001. - P.2461-2509.

171. Whitley R.J., Cobbs C.G., Alford C.A.Jr. et al. Diseases that mimic herpes simplex encephalitis: diagnosis, presentation and outcome // NIAD Collaborative Antiviral Study Group. JAMA. 1989. - V.262. - P.234-239.

172. Whitley R.J., Roizman B. Herpes simplex virus infection // Lancet. 2001. -V.357. -P.1513-1518.

173. Wolff J.A., Lederberg L. A history of gene transfer and therapy // Gene therapeutics. Methods and applications of direct gene transfer. 1994. - P.3-25.

174. Xiang Z.Q., Spitalnik S., Tran M. et al. Vaccination with a plasmid vector carrying the rabies virus glycoprotein gene induces protective immunity against rabies virus // Virology. 1994. - V.199. - P. 132-140.

175. Yokota S., Gepret T.D., Lipsky P.E. Enhancement of antigen- and mitogen-induced human T-lymphocyte proliferation by tumor necrosis factor-a // J. Immunol.- 1988.-V.140.-P.531-536.

176. Yokoyama M., Zhang J., Whitton J.L. DNA immunization confers protection against lethal lymphocytic choriomeningitis virus infection // J. Virol. 1995. -V.69. — P.2684-2688.

177. Young K.L. Linch D.C. Differential effects of granulocyte- and granulocyte-macrophage colony-stimulating factors (G- and GM-CSF) on neutrophil adhesion in vitro and in vivo // Eur. J. Haematol. 1992. - V.49 - P.251-259.

Информация о работе

Козлов, Алексей Юрьевич
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.03

Диссертация

ДНК-иммунизация против вируса простого герпеса 1 типа: сравнительный анализ протективного действия генов цитокинов и синтетических пептидов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы