Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности иммунного ответа при кожных заболеваниях, ассоциированных с герпетической инфекцией, и разработка подходов к их терапии

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Особенности иммунного ответа при кожных заболеваниях, ассоциированных с герпетической инфекцией, и разработка подходов к их терапии"

На правах рукописи

ПОТАПОВА ЛЮДМИЛА АНАТОЛЬЕВНА

ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ КОЖНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИЕЙ, И РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ К ИХ ТЕРАПИИ

03.02.02 - Вирусология

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Москва-2012 г.

Работа выполнена в ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России и ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития Россини .

Научные руководители:

Доктор медицинских наук |Косякова Наталья Павловна

Доктор биологических наук Мезенцева Марина Владимировна

Официальные оппоненты:

Заведующий лаборатории сравнительной Вирусологии ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России,

Доктор медицинских наук, профессор Баринский Игорь Феликсович

Заведующий лабораторией естественного Иммунитета ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России,

Доктор биологических наук, профессор Пронин Александр Васильевич Ведущая организация:

ФГБУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Защита состоится « » мая 2012 г. в 12.00 часов

на заседании Диссертационного совета Д 208.131.01 при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития по адресу: 123098 Москва, ул. Гамалеи, д. 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития.

Автореферат разослан «_» апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор медицинских наук

Е.И. Бурцева

С ИИ С К ЛЯ ' I O^V.'.APCTBFHHAW

j ЬИЬЛЮОПКА

2012__

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Вирус герпеса 8 типа (ВГ-8), или вирус, ассоциированный с саркомой Калоши, был открыт в 1994 году Яном Чангом (Chang et al., 1994). В большинстве развитых стран ВГ-8 не является убиквитарной инфекцией и вероятность его обнаружения в крови здоровых людей для Европы и США составляет 1-3%, а для Японии 0,2% . Исключением среди европейских стран является Италия, где ВГ-8 выявляется в 28% случаев. Более, чем у 50% людей ВГ-8 выявляется в странах центральной Африки, включая Кению и Уганду (Verma et al., 2003). Статистические данные о распространении вируса герпеса 8 типа в Российской Федерации разрозненны и малочисленны (Кадырова, 1999, 2003).

Наиболее распространенной патологией, ассоциированной с ВГ-8, является саркома Калоши (СК), идиопатическая форма которой была впервые описана в 1872 году М. Калоши (Kaposi., 1872). В диагностике СК часто возникают затруднения, так как многие сосудистые новообразования способны симулировать кожные элементы СК. Начальные периоды СК отличаются неясной гистологической картиной и создают трудности в постановке диагноза (Молочков, 2002). Поэтому необходимо оптимизировать диагностику данной инфекции, используя различные подходы и их комбинации. Совершенствование диагностики также целесообразно при оценке рисков трансплантации органов и тканей. Представляется важным тщательно исследовать состояние иммунной системы и, в частности, системы цитокинов у пациентов с СК, так как дефекты иммунной системы у данных пациентов способствуют развитию вирусной инфекции.

Целесообразно также определение особенностей иммунитета, сочетающихся с обнаружением в крови маркеров герпесвируса 8 типа. Это поможет в понимании условий, при которых осуществляется жизнедеятельность ВГ-8, и механизмов его активации.

Исследование новых лекарственных препаратов, в частности их антивирусной активности в отношении гёрпесвирусной инфекции, позволит расширить арсенал применяемых терапевтических средств. Применение пептидов, в качестве лекарственных препаратов, позволит минимизировать побочные эффекты лечения.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящего исследования заключалась в определении характерных особенностей иммунитета у пациентов с кожными заболеваниями, ассоциированными с герпесвирусной инфекцией и совершенствование критериев подбора лекарственных средств для терапии больных с этой инфекцией.

Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:

1. Провести клинико-иммунологическое обследование здоровых добровольцев и пациентов с кожной патологией, включая идиопатическую саркому Капоши (CK).

2. Провести диагностику семи представителей семейства Herpesviridae - вируса простого герпеса 1, 2 типов (ВПГ1.2), ВГ-6 и ВГ-8, цитомегаповируса (ЦМВ), вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), вируса Varicella Zoster (ВЗ) у пациентов с CK, кожной патологией и у здоровых лиц и оценить частоту их распространения, используя различные методы, а также определить наличие ДНК ВГ-8 в биоптатах пациентов с CK и здоровых лиц.

3. Провести сравнительный анализ показателей иммунитета и особенностей их изменений при герпетической патологии, вызываемой ВПГ1.2, ЦМВ, ВЭБ, ВГ-6, ВГ-8, ВЗ.

4. Определить изменения в синтезе цитокинов, продуцируемых основными иммунокомпетентными клетками, на уровне транскрипции и продукции у пациентов с саркомой Капоши, другой кожной патологией и у здоровых лиц.

5. Исследовать маркеры апоптоза Fas, Fas Ligand, NF-kB, каспазы 3 и 8 на уровне транскрипции у больных CK, кожной патологией и у здоровых лиц.

6. Провести скрининг in vitro препаратов пептидной природы в отношении ВПГ-инфекции и определить потенциальную возможность их применения.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Установлено, что для оптимальной диагностики инфекции, вызванной ВГ-8, необходима комбинация методов ИФА и ПЦР. Наиболее эффективной является диагностика ДНК ВГ-8 в биоптате из очага саркомы Капоши.

2. Впервые проведено комплексное обследование больных с классической саркомой Капоши, включающее определение семи представителей семейства Herpesviridae и широкого спектра цитокинов методами ИФА и ПЦР с обратной транскрипцией.

3. Впервые определены наиболее характерные особенности синтеза цитокинов у больных с классической саркомой Капоши, ассоциированной с ВГ-8, указывающие на активацию моноцитов/макрофагов, Th-2, Treg, и B-лимфоцитов и угнетении Th-1.

4. Впервые показано, что у больных с классической саркомой Капоши наличие IgG к малому калсидному протеину ВГ-8 коррелирует с пониженными значениями ИФН-о (р=0,01), а наличие ДНК ВГ-8 коррелирует с повышением продукции рецепторного антогониста к ИЛ-1 (р=0,0015).

5. Впервые проведен скрининг 15 новых веществ полипептидной природы, обладющих противовирусной активностью в отношении ВПГ-2, и выработаны новые критерии оценки их эффективности.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Подтверждена выраженная ассоциация между маркерами ВГ-8 и диагнозом саркома Капоши и показано, что использование двух методов определения маркеров ВГ-8 (ПЦР и ИФА) повышает вероятность диагностики данной инфекции в 1,7 раза по сравнению с использованием одного из методов. Применение метода ПЦР для определения ДНК ВГ-8 в биоптатах СК повышает вероятность обнаружения ВГ-8 до 100%.

2. Определена частота обнаружения вирусов семейства Негрезутёае у пациентов с саркомой Капоши: выявлена повышенная частота обнаружения ДНК ВЗ и ВГ-6 в МПК в 1,5 раза по сравнению со здоровыми и в 2-3 раза по сравнению с пациентами с кожной патологией. Показано снижение в 2,5 раза частоты выявления ДНК ВПГ-1,2 в МПК пациентов с саркомой Капоши и кожной патологией по сравнению со здоровыми лицами.

3. У пациентов с КП снижена вероятность обнаружения к ВГ-6 в 1,5 раза по сравнению с другими осбледуемыми, наиболее выраженная у больных с псориазом.

4. Не обнаружено достоверных различий в частоте выявления ДНК ВЭБ и ЦМВ в группах СК, КП и здоровых лиц.

5. Определено основное направление иммунного ответа по гуморальному типу у пациентов с саркомой Капоши, ассоциированной с ВГ-8: по сравнению со здоровыми лицами отмечено повышенние уровней ИЛ-1Р, ИЛ-4, ИЛ-б, ИЛ-8, ИЛ-12, снижение уровня ИЛ-2, продукции ИФН-а, ИФН-у и чувствительности к препаратам интерферонов I и II типа.

6. Обнаружена корреляция между наличием 1§в к малому капсидному протеину ВГ-8 и снижением количества ИФН-а, а также между выявлением ДНК ВГ-8 в мононуклеарах периферической крови (МПК) и повышенным уровнем рецепторного антогониста к ИЛ-1.

7. В группе пациентов с кожной патологией было обнаружено статистически значимое снижение значений ИЛ-4 и ИЛ-10 по сравнению с больными саркомой Капоши и здоровыми лицами.

8. Усовершенствованы критерии оценки иммуномодулирующего эффекта пептидных препаратов, обладающих антивирусной активностью.

Апробация работы.

Основные положения работы были представлены на I Международной конференции «Проблемы диагностики, лечения и профилактики герпесвирусных инфекций» (Москва, 2008 г.), на IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (С-Петербург, 2008 г.) и IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009 г.). Материалы были доложены на конференции «Молодых ученых» ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.

Гамалеи» Минздравсоцразвития России в апреле 2009 г., на конференции отдела медицинской микробиологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России в ноябре 2009 г. и на совместном заседании Отдела молекулярной вирусологии и совета по предварительной экспертизе диссертационных работ ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России 16 ноября 2010 г.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 181 литературный источник отечественных и зарубежных авторов, 2 ссылки на интернет-сайты. Диссертация выполнена на 145 листах машинописного текста и содержит 7 таблиц и 18 рисунков.

По результатам исследования опубликовано 7 научных работ, из них 3 - в перечень журналов ВАК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Пациенты. В 2006-2009 гг. в клинике МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского было обследовано 22 пациента 49-82 лет с классической саркомой Капоши, 22 пациента 42-60 лет с кожной патологией, в состав которых входили 10 больных с псориазом, 8 - с вульгарной пузырчаткой, 1 - с узловой почесухой, 3-е буллезным пемфигоидом. Все пациенты обследовались в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии и получали стандартную терапию. Также в клинике МОНИКИ произвели взятие биопсии у 10 пациентов с классической саркомой Капоши из очага саркомы и у 10 здоровых добровольцев из эпидермодермальных слоев кожи. В МЛПУ поселка Софрино Пушкинского района Московской области было обследовано 50 здоровых лиц 18-60 лет. Также была исследована кровь 60 пациентов с генитальным герпесом на базе клиники ГНЦ Института иммунологии МЗ РФ: диагноз был подтвержден на основании серологического исследования методом иммунофлюоресцентного анализа на наличие антител IgM и IgG к ВПГ 2 типа.

Культуры клеток:

В работе были использованы культуры клеток почек зеленой мартышки Vero и фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ), выращенные в ростовой среде ИГЛА до образования монослоя. Все клеточные культуры были получены из музея клеточных культур ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России.

Вирусы:

Вирусы были получены из музея вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России.

1. Вирус болезни Ньюкасла (ВБН);

2. Вирус энцефаломиокардита мышей (ВЭМК), штамм «Колумбия БК-СоЬЗК»;

3. Вирус простого герпеса 2 серотипа, штамм ЕС. Пептиды:

ТЬЫув-рго-а^-рго^у-рго (селанк) - №1 Ме^и-Ыв-рЬе-рго^у-рго (семакс) - №2

Thr-lys-pro---------gly-рго - №3

-----lys-pro-arg-pro-gly-pro - №4

---------pro-arg-pro-gly-pro - №5

--------------arg-pro-gly-pro - №6

-..................pro-gly-pro - №7

Thr-lys--------------------------------------------- №8

Thr-lys-pro------------------------------------- №9

Thr-lys-pro-arg-----------------------------№10

-----lys-pro-arg--------------------------- №11

--------------arg-pro--------------- №12

----------------------gly-рго -№13

Gly-pro-gly - №14

Gly-pro-gly-pro - № 15

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Определение ДНК герпесвирусов в МПК осуществлялось с использованием наборов фирмы ЗАО «НПФ ДНК-Технология». Исследования проводились согласно инструкции фирмы производителя. Чувствительность определения ДНК составляла 10 копий/мл. В реакцию брали S мкл образца. Электрофорез кДНК проводили в 1% агарозном геле с бромистым этидием (0,5 мкг/мл) в Трис-ацетатном буфере, содержащем 0,2 М ЭДТА в горизонтальных камерах фирмы «BioRad» 35 минут.

Фотографировали результаты на цифровую камеру Gel Imager-2 (Хеликон) под мягким ультрафиолетовым освещением 360 нм.

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). РНК цитокинов выделяли методом кислой гуанидин тиоционат-фенол-хлороформной экстракции по методике Р. Chromczynski и N. Cacchi (Chromczynski et al., 1987). Обратная транскрипция и ПЦР выполнялись по методу Gelder (Gelder et al., 1995). Для проведения ПЦР

использовались следующие праймеры: ИФН-а, ИФН-р, ИФН-у, ГАДФ (праймеры были любезно предоставлены к.б.н. Альховским С.Ю., лаборатория биотехнологии ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцраэвнтия России), ИЛ-6, ИЛ-8 (Lyn et al., 1998), ИЛ-ip, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10 (Yamamura et al., 1991), ИЛ-18 (Gaede et al., 1999), ИЛ-12 (Harrison et al., 1996), NF-kB (Bazzoni et al., 2009), ФНО-а, Fas, FasLigand, Casp8 и Casp3 (htpp://medgen.ugent.be/rtprimerdb/).

Определение антител. Определение антител класса IgM к вирусам ВПГ1,2, ЦМВ, ВЭБ, ВЗ и IgG к вирусам ВПГ1,2, ВГ-6, ВГ-8, ЦМВ, ВЭБ, ВЗ в сыворотке крови осуществлялось с использованием тест-системам фирмы ЗАО «Вектор-Бесг» согласно протоколу производителя.

Определение цитокинов метотодом ИФА. Определение цитокинов в своропсе крови осуществлялось с помощью тест-системам фирмы ЗАО «Вектор-Бест» согласно протоколу производителя.

Интерфероновый статус. Для исследования использовали гепаринизированную кровь, собранную из локтевой вены обследуемых.

Исследование интерферонового статуса проводили по стандартной методике (Мезенцева М.В. и соавт. 1997 ). Исследование включало в себя определение следующих показателей:

1. Уровня циркулирующего интерферона в плазме крови.

2. Уровня спонтанно продуцируемого клетками крови интерферона.

3. Продукции ИФН-а, индуцируемой вирусом болезни Ньюкасла.

4. Продукции ИФН-у, индуцируемой стандартным митогеном (фитогемагглютинин -ФГА).

5. Уровня чувствительности к препаратам ИФН-а ( с использованием прайминг-эффекта).

6. Уровня чувствительности к препарату ИФН-у (с использованием прайминг-эффекта).

7. Уровня чувствительности к индукторам ИФН - ридостину, циклоферону, амиксину, неовиру, полиоксидонию, иммуналу и ликопиду.

Определение проводили в трехкратных повторах в 96-луночных плоскодонных планшетах фирмы Costar, в которые вносили кровь, разведенную в 10 раз в среде RPMI-1640 (с глютамином и антибиотиками). Планшеты инкубировали 24 часа в СОг-инкубаторе при 37°. Оставшуюся кровь центрифугировали и полученную плазму использовали для определения циркулирующего интерферона. Через 24 часа биологическим методом определяли активность в каждой пробе с помощью титрования.

Для титрования использовали культуру клеток ФЭЧ, выращенную в ростовой среде ИГЛА до образования монослоя. В качестве индикаторного вируса использовался ВЭМК.

За единицу активности итерферона (Ед/мл) принималась величина, обратная его максимальному разведению, которая защищает 50% клеток от цитопатического действия 100ТЦД5о вируса.

Определение лейкоцитов в крови. 20 мкл крови разбавляли в 400 мкл 4% уксусной кислоты. После лизиса эритроцитов подсчет лейкоцитов проводился в камере Горяева.

Подсчет лейкоформулы. Высушенный мазок крови окрашивали азур-эозином. Подсчет лейкоформулы осуществляли под световым микроскопом Биомед-4 (Россия).

Исследование потивовирусной активности пептидов и м-РНК цитокинов в клетках VERO.

Титрование ВПГ-2 и тестирование препаратов проводили в 48-луночных планшетах Costar при температуре 37°С во влажной камере в С02-инкубаторе. Результаты учитывали по цитопатическому эффекту (ЦПД) через 3-4 суток на пике ЦПД.

Лечебные препараты испытывали на клетках почек зеленой мартышки Vero при введении их совместно с вирусом и через 24 часа после заражения. Пептиды были условно обозначены по номерам: №1 -№15. Для сравнения использовали ридостин (НПО «Вектор», Новосибирск, Россия).

Пептиды были взяты в дозах 10"4 М. Тестирование проводили трехкратно. Клетки Vero заражали средне-высокой инфицирующей дозой вируса - 0,001 ТЦД/клетку.

Через 72 часа после заражения при максимальном развитии ЦПД вируссодержащую культуральную жидкость собирали для дальнейшего определения инфекционных титров вируса. Об уровне противовирусной активности веществ судили по их способности ингибировать ЦПД вируса и результатам титрования проб на клетках VERO на основании снижения титра вируса в опыте по-сравнению с контролем - вирус без препаратов.

Для определения м-РНК цитокинов использовали те же клетки VERO через 48 часов после заражения, в качестве контроля применяли клетки VERO, выращенные в ростовой среде и клетки VERO, зараженные вирусом без добавления препарата.

Определение противовирусной активности пептидов в крови пациентов с генитальным герпесом.

Потенциальный профилактический и терапевтический эффект пептидов в клетках крови пациентов с генитальным герпесом проводили с помощью метода расширенного интерферонового статуса согласно методике Ершова Ф.И. и соавт., 2Ó05. Определение проводили трехкратно в плоскодонных планшетах, в которые вносили 0,1 мл крови, разведенной в 10 раз в среде RPMI-1640 (с глютамином и антибиотиками) и пептиды в концентрации 10"5/мл. Планшеты инкубировали 24 часа в СОг-инкубаторе. Через 24 часа биологическим методом определяли активность препарата в каждой пробе с помощью

титрования. Для титрования использовали культуру клеток ФЭЧ, выращенных в ростовой среде ИГЛА до образования монослоя. В качестве индикаторного вируса использовался ВЭМК.

Эффект препаратов оценивали по его способности предотвращать развитие ЦПД в монослое клеток при заражении 100 ТЦД50 вируса. В качестве референс препаратов использовали ридостин и цикпоферон, в качестве контроля - супернатант инкубированных в среде ИГЛА клеток крови без добавления препарата.

Определение мРНК цитокинов в МПК обработанных пептидами.

МПК пациентов с генитальным герпесом и здоровых лиц в количестве 106 клеток разводили в 1 мл среды ИРМ1-1640 (с глютамином и антибиотиками) с добавлением 10"6 М препарата. Пробы инкубировали при 37°С 24 часа в СОг-инкубаторе. После этого МПК дважды отмывали 0,9% К'аС1 и лизировали буфером с гуанидинизотиоционатом. Полученные пробы исследовали на наличие мРНК цитокинов.

Обработка данных. Обработка результатов исследования проводилась в программах (^а^^ка 6» и «БьЦзШса 9». Для оценки данных использовали критерии Хи-квадрат Пирсона, Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса (ККУ) и Медианный тест (МТ).

При обработке результатов исследования уровня синтеза цитокинов методом ИФА анализируемые совокупности характеризовались, как непараметрические данные с мультимодальным распределением. Кроме того, группы здоровых, СК и КП - являются малыми (п<30). Поэтому для оценки трех групп сравнения применялся дисперсионный анализ с использованием критерия Краскелла-Уоллиса (ККУ) и медианный тест (МТ), а в случае ИЛ-6 и ФНО-а, где оценивались только две группы - СК и здоровых лиц, использовался критерий Манна-Уитни. Для сравнения применялись медианные значения. Для оценки экспрессии цитокинов методом ОТ-ПЦР, и оценки распределения вирусных маркеров использовался китерий Хи-квадрат Пирсона.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.

В ходе проведенных исследований было показано (Табл. 1), что у больных с классической (идиопатической) саркомой Капоши (СК) антитела класса к малому капсидному протеину ВГ-8 в сыворотке крови выявлялись в 45% случаев (10 из 22), а в группе пациентов с кожной патологией (КП) и у здоровых лиц антитела к ВГ-8 не были выявлены (р<0,000001). ДНК ВГ-8 в МПК обследованых также определялась у 45% пациентов с саркомой Капоши, что достоверно выше (р=0,000004), чем в группе кожной патологии (9%) и у здоровых лиц (2%). Применение одновременно двух методов ИФА и ПЦР повысило эффективность выявления маркеров ВГ-8 у пациентов с СК до 77%, что

достоверно выше (р<0,000001), чем у пациентов с КП (9%) и здоровых лиц (2%). При исследовании 10 образцов биоптатов из очага саркомы и 10 кожных биоптатов здоровых добровольцев методом ПЦР было отмечено, что ДНК ВГ-8 выявлялась в 100% биоптатов пациентов с СК и не выявлялась у здоровых .

Полученные данные позволяют сделать вывод, что для наиболее оптимальной диагностики маркеров ВГ-8 необходимо комбинировать, как минимум 2 метода.

Недостаточная эффективность (45%) серологического метода может объясняться тем, что в основу используемой тест-системы (НПО «Вектор», Новосибирск, Россия) взята С-концевая часть малого капсидного протеина, полученного рекомбинатным путем. Это означает, что эпитопы рекомбинантного протеина не идентичны эпитопам природного белка, который к тому же имеет больший размер. Нельзя исключать того факта, что данный белок может быть недостаточно йммуногенным для некоторых людей.

Кажущаяся малая эффективность метода ПЦР при определении ДНК ВГ-8 может объясняться малыми титрами вируса в сыворотке крови и недостаточной чувствительностью тест-системы.

Наиболее эффективной оказалась детекция ДНК вируса в биоптатах из очага саркомы, но взятие биопсии не всегда рекомендовано.

Выявление маркеров вирусов герпеса у больных с СК, КП и здоровых лиц.

Таблица 1. Маркеры герпесвирусов (Р- уровень значимости).

Группы/ вирусы ВГ-8 ВГ-6 впг 1,2 вз

Маркеры вирусов 1бС ДНК до ДНК до 1ВМ ДНК ДО 1БМ ДНК

Саркома Капоши (п=22) 45,5 % 45,5 % 95,45 % 68,2 % 100% 0% 18,2 % 81,8 % 0% 81,8 %

Кожная Патология (п=22) 0% 9% 63,6 % 50% 100% 0% 18,2 % 63,6 % 0% 27,3 %

Здоровые (п=50) 0% 2% 96% 36% 92% 4% 46% 64% 2% 50%

Р= <0,01 <0,01 <0,01 0,039 0,16 0,41 0,02 0,29 0,64 0,001

Необходимость выявления маркеров ВГ-8 обоснована в тех случаях, когда имеются трудности в дифференциальной диагностике с другими сосудистыми опухолями и ранними этапами развития СК, так как доказано, что ВГ-8 обнаруживают в ткани саркомы Капоши почти в 100% случаев (АЫазЫ Р., 2002).

Исследование маркеров других вирусов герпеса обнаружило ряд достоверных отличий между обследуемыми группами. Выявление ДНК ВЗ с повышенной частотой (р=0,001) обнаруживается в МПК пациентов с CK и составляет 81,8% что гораздо выше, чем у пациентов с КП (27,3%) и у здоровых лиц (50%). Возможно, это объясняется тем, что в группе CK пациенты более пожилые ( 51-82 года). Ранее было отмечено, что с возрастом снижается клеточный иммунитет по отношению к сверхраннему белку 1Е 63 вируса Varicella Zoster, что приводит к усилению репликации данного вируса (Beutner et al., 2007). Помимо этого, была обнаружена повышенная частота выявления ДНК ВГ-6 (р=0,039) у пациентов с CK в 63,6% случаев по-сравнению с пациентами с КП (50%) и здоровыми лицами (36%). Не исключено, что имеет место взаимное усиление репликации вирусов ВГ-6 и ВГ-8, т.к. в экспериментальных работах in vitro показано, что совместное культивирование вирусов ВГ-6 и ВГ-8 приводит к усилению репликации ВГ-8 (Chun et al., 2005).

Также была выявлена достоверно низкая (р=0,02) частота детекции ДНК ВПГ1,2 в МПК пациентов с CK и КП в 18,2 % случаев по-сравнению со здоровыми людьми (46%).

Исследование IgG к ВГ-6 обнаружило достоверное (р=0,0002) снижение частоты детекции в группе КП (63,6%), no-сравнению с пациентами с CK (95,45%) и здоровыми лицами (96%). Наиболее выражено это оказалось у пациентов с псориазом: у 7 человек из 10 антитела к ВГ-6 не были обнаружены. Это явление, возможно, объясняется тем, что большинство пациентов с КП получают иммуносупрессивную и гипосенсебилизируюшую терапию и в первую очередь в сыворотке крови исчезают антитела с менее высоким титром, что характерно для IgG к ВГ-6.

В отношении маркеров ЦМВ и ВЭБ достоверных отличий между обследуемыми гуппами выявлено не было (р>0, 05).

Исследование цитокинового статуса у пациентов и здровых лиц.

Далее мы исследовали особенности иммунитета и, в частности, изменение цитокинового статуса у обследуемых. Мы изучали экспрессию генов цитокинов по уровню их мРНК и продукцию цитокинов в сыворотке крови (см. Табл. 2, 3).

Исследование синтеза ИЛ-lß показало достоверное (р=0,0016) повышение его продукции у пациентов с CK. Несмотря на то, что медианные значения (МЗ) в группах CK, КП и здоровых составили 0,096 пг/мл, 0,085 пг/мл и 0,107 пг/мл, соответственно, наибольший диапазон Q3-Ql=0,856 пг/мл оказался в группе CK, в группах КП и здоровых лиц Q3-QI составил, соответственно, 0,018 пг/мл и 0,013 пг/мл. Отмечалось также повышение, хотя и статистически недостоверное (р=0,07), частоты экспрессии гена ИЛ-lß у пациентов с CK (81,8%) по-сравнению с пациентами с КП (50%) и здоровыми лицами (58%), т.е. у больных

СК показана активация ИЛ-1р на уровне транскрипции, приводящая к усилению его продукции.

Таблица 2. Частота экспрессии генов цитокинов у пациентов с кожной патологией, СК

ИФН-а ИФН- Р ИФН- У ил-1Р ИЛ-2 ИЛ-4 ИЛ-6 ИЛ-8 ИЛ- 10 ИЛ- 12 ИЛ-18 ФНО-а

СК (%) 54,5 86,4 40,9 81,8 81.8 40,9 27,3 86,4 95,5 86,4 100 27,3

КП (%) 72,7 77,3 36,4 50 77,3 50 22,7 72,7 95,5 40,9 100 27,3

Здоровые (%) 42 76 34 58 66 54 22 50 88 58 96 22

Таблица 3. Изменение продукции итокинов на разных этапах их синтеза.

ЦИТОКИНЫ

Диагноз Метод Ифн -0 Ифн -р Ифн -т ил-1 ил-2 ил- ил- 6 ил-8 ил-10 ил-12 ил-18 Фно-а

Саркома Капоши ОТ-ПЦР (мРНК) - - - - - - - Т - Т - -

ИФА (белок) - н/и - т 1 ? т Г - н/и н/и -

Кожная патология ОТ-ПЦР (мРНК)

ИФА (белок) - н/и - - - 1 н/и - 1 н/и н/и -

Примечание: «-» - отличие от группы здоровых людей недостоверно; Т - повышение частоты экспрессии гена по сравнению со здоровыми людьми; 1 - снижение частты экспрессии гена по сравнению со здоровыми людьми; и/и - показатель не исследовался.

Определение продукции ИЛ-2 в сыворотке крови показало достоверно более низкие (р=0,0001) значения у больных СК (М3=2,095 пг/мл ), по-сравнению с пациентами с КП (М3=9,667 пг/мл ) и здоровыми лицами (М3= 17,24 пг/мл). Различия в экспрессии гена ИЛ-2, определяемой методом ОТ-ПЦР в МПК, оказались недостоверными (р=0,32). Отмечено, что ИЛ-2 экспрессировапся у 18 из 22 больных СК (81,8%), у пациентов с КП - у 17 из 22 (77,3%), у здоровых лиц - в 33 случаях из 50 (66%).

Анализ экспрессии гена ИЛ-4 показал достоверное отличие (р=0,0005) между группами: наименьшие значения определялись в группе КП (М3=0,0 пг/мл), наибольшие - у пациентов с СК (М3=5,24 пг/мл), в группе здоровых лиц МЗ составило 0,98 пг/мл. По частоте выявления мРНК различий меду группами не наблюдалось (р=0,59). У больных СК, КП и здоровых лиц отмечена экспрессия гена ИЛ-4 в 40,9%, 50%, 54% случаев, соответственно.

Исследование уровня синтеза ИЛ-6 проводилось в группах СК и здоровых лиц и показало достоверное (р=,000014) повышение продукции данного цитокина у пациентов с СК (М3=10,0 пг/мл) по-сравнению со здоровыми лицами (М3=0,0 пг/мл). Различий в частоте экспрессии гена ИЛ-6 не наблюдалось (р=0,88). Показана экспрессия гена ИЛ-6 у 27,3%, 22,7% и 22% больных СК, КП и здоровых лиц, соответственно.

Определение количества ИЛ-8 в сыворотке обследуемых показало достоверное (р=0,021) отличие между группами: отмечались повышенные уровни этого цитокина у больных СК

(М3=9,52 пг/мл) и КП (М3=7,51 пг/мл) по-сравнению со здоровыми людьми (М3=5,28). Статистический анализ экспрессии гена ИЛ-8 выявил достоверное (р=0,0077) отличие по частоте выявления мРНК, а именно, усиление частоты определения экспрессии гена ИЛ-8 в группе СК (86,4%) и КП (72,7%) по-сравнению со здоровыми людьми (50%).

Анализ продукции ИЛ-10 в сыворотке крови обследуемых показал достоверные отличия по трем группам (р=0,01). Наименьшие значения наблюдались у больных с СК (М3=0,0 пг/мл). Хотя различия между пациентами с СК (М3=15,0 пг/мл) и здоровыми лицами (М3=14,56 пг/мл) оказались статистически недостоверными (р=1,0), но обращает внимание самый большой диапазон Q3-Q1=26,38 пг/мл в группе СК, по-сравнению с группой КП и здоровыми лицами, где он составил 11,2 пг/мл и 7,045 пг/мл, соответственно. Различий по частоте экспрессии гена ИЛ-10 не было выявлено (р=0,43). В группе больных с СК и КП ИЛ-10 экспрессировался в 95,5% случаев, у здоровых лиц в 88%.

Исследование методом ОТ-ПЦР уровня транскрипции ИЛ-12 показало достоверное (р=0,007) повышение экспрессии гена ИЛ-12 в группе СК (86,3%), по-сравнению с больными с КП (40,9%) и здоровыми лицами (58%).

Анализ продукции ИЛ-18, ФНО-а, ИФН-а, ИФН-у и экспрессии генов ИЛ-18, ФНО-а, ИФН-а, ИФН-р, ИФН-у, и маркеров апоптоза Fas, Fas Ligand, Caspasa 8, Caspasa 3, NF-kB не показал статистически значимых различий между группами (р>0,05).

Суммируя данные исследований цитокинового статуса пациентов с СК, можно отметить дисбаланс, заключающийся в преобладании Th-2-типа иммунного ответа (повышение ИЛ-4) в ущерб Th-1 (угнетение продукции ИЛ-2), обеспечивающему антивирусную защиту. Отмечена активация синтеза ИЛ-ip, ИЛ-12, продуцируемых В-лимфоцитами, а также ИЛ-6, участвующего в дифференцировке Th 17-лимфоцитов, что может свидетельствоать об усилении воспалительных процессов в организме. Возможно, ВГ-8 способен переключать дифференцировку Т-лимфоцитов в сторону Th-2. Это предположение нуждается в дальнейшем изучении.

Результаты исследования синтеза цитокинов в группе КП демонстрируют снижение активности Th-2-лимфоцитов (угнетение синтеза ИЛ-4), возможно Treg-лимфоцитов (подавление синтеза ИЛ-10), что может быть следствием проводимой этим пациентам десенсибилизирующей и иммуносупрессивной терапии с применением цитостатиков и глюкокортикоидов.

Особенности синтеза ряда цитокинов были проанализированы в связи с выявлением маркеров ВГ-8, определяемых методами ПЦР и ИФА.

Было обнаружено, что существует достоверная взаимосвязь (р=0,01) между выявлением антител IgG к малому капсидному протеину ВГ-8 и низкими уровнями ИФН-а (Рис. 1). МЗ в

Рисунок 1. Распределение значений ИФН-а среди пациентов с СК при наличии/отсутствии антител к ВГ-8.

га 30 X

е

X 20

Зависимость значений ИФН-а от выявления 1дв к ВГ-8

поло>с отриц

1дв ВГ-8

□ МеЛап ЕЭ 25%-75% "Т" Ыоп-ОиИег Р)апде о 0и!йег5

Рисунок 2. Распределение значений РА-ИЛ-1 по признаку выявления ДНК ВГ-8 у пациентов с СК.

Зависимость значений РА-ИЛ-1 от выявления от ДНК ВГ-8 в МПК

полож отриц

ДНК ВГ-8

□ Мей>ап 25%-75% Мол-ОитИег Репде

случае выявления составило 0,0 пг/мл, а при отсутствии - 12,38 пг/мл. Вероятно, это происходит потому, что активация вируса происходит на фоне падения иммунитета и снижения уровня ИФН-а.

Также была выявлена взаимосвязь (р=0,0015) между обнаружением ДНК ВГ-8 и повышенными значениями РА-ИЛ-1 (Рис. 2). МЗ РА-ИЛ-1 в случае ДНК-положительных пациентов составило 838 пг/мл, а в случае ДНК-отрицательных - 187,5 пг/мл, что, возможно, отражает реакцию макрофагов на воспалительные процессы в организме, так как РА-ИЛ-1 блокирует действие провоспапительного цитокина ИЛ-1, синтезируемого моноцитами/макрофагами.

Исследование интерферонового статуса у больных СК, КП.

Данные определения интерферонового статуса у пациентов с СК, КП и у 50 здоровых лиц представлены в таблице 4.

Представленные результаты свидетельствуют о снижении функциональной активности системы ИФН-а и ИФН-у при СК и КП. У больных СК и КП анализ экспрессии генов интерферонов, определяемой методом ОТ-ПЦР, и их продукции, определяемой методом ИФА, не выявил отличия от здоровых людей, но нами отмечено снижение способности клеток крови больных продуцировать интерфероны и чувствительности к препаратам ИФН-а и ИФН-у, определяемое биологическим методом. Причем, у больных СК отмечено в большей степени снижение чувствительности к препаратам ИФН-а, а у пациентов с КП - к ИФН-у. Обращает внимание повышение уровня циркулирующего и спонтанно продуцируемого интерферона у больных СК и КП, что на фоне остальных данных, говорит о преобладании неактивной формы ИФН в крови пациентов. Соответственно, можно говорить о снижении активности системы интерферонов у больных СК и КП.

Определение лейкоцитов, особенности лейкоформулы.

Дисперсионный анализ выявил достоверное (р=0,006) повышение лейкоцитов у пациентов с КП. Медианные значения этого показателя у больных СК, КП и здоровых лиц составили, соответственно, 6,1x10%, 13,1х109/л, 7,0x10'/л. Различия по лейкоформуле оказались недостоверны (р=0,41).

Таблица 4. Определение интерферонового статуса у обследованных (р - уровень значимости).

Исследуемая группа Количество обследованных (в %) с нарушениями интерферонового статуса

Саркома Капоши п=22 Кожная патология п=22 Здоровые п=50 Р=

показатель

Повышение уровня циркулирующего ИФН в плазме крови 2/22 (9% больных) 8/22 (36,4% больных) 0/50 (0% обследуемых) 0,000023

Повышение спонтанной продукции ИФН 2/22 (9% больных) 6/22 (27,3% больных) 0/50 (0% обследуемых) 0,000674

Снижение продукции ИФН-а 20/22 (91% больных) 22/22 (100% больных) 0/50 (0% обследуемых) <0,0000001

Снижение продукции ИФН-у 22/22 (100% больных) 11/22 (50% больных) 0/50 (0% обследуемых) <0,0000001

Снижение чувствительности к препаратам ИФН-а 13/22 (59% больных) 5/22 (22,7% больных) 0/50 (0% обследуемых) <0,0000001

Снижение чувствительности к препаратам ИФН-у 7/22 (32% больных) 13/22 (59% больных) 0/50 (0% обследуемых) <0,0000001

Снижение чувствительности к индукторам ИФН 0/22 (0% больных) 0/22 (0% больных) 0/50 (0% обследуемых) —

Обнаружено, что у больных КП 1§Е был выше по сравнению с другими обследуемыми (р=0,03). МЗ ^Е у пациентов с СК, КП и здоровых людей составило, соответственно, 38,5 МЕ/мл, 334,5 МЕ/мл, 57 МЕ/мл.

Статистический анализ не выявил достоверных различий у всех обследованных по уровню (р=0,12), ДО (р=0,2), ^А (р=0,64).

Полученные данные исследования гуморального иммунитета обследованных соответствуют картине воспаления и аллергизации, наблюдаемые у пациентов с кожными заболеваниями, входящими в группу КП.

Противовирусная а1стивн0сть пептидов в отношении ВПГ-2.

Нами было проведено исследование антивирусных свойств 15 пептидов. Из данных, приведенных в таблице 5 видно, что все исследуемые пептиды почти в равной степени обладают выраженной противовирусной активностью в отношении ВПГ2. Противовирусное действие наблюдалось при обеих схемах введения, но более выраженный эффект наблюдался при использовании препаратов по лечебной схеме.

Таблица 5. Снижение инфекционности ВПГ-2 под действием пептидных препаратов in vitro. _

№ Препараты в концентрации 10"5 М Титра ВПГ-2 (lg ТЦД50/мл) при схемах введения препаратов

Введение препарата совместно с вирусом Введение препарата через 24 часа после заражения вирусом

1. Met-glu-his-phe-pro-gly-pro (семакс) 3,5 3,0

2. Thr-lys-pro-arg-pro-gly-pro (селанк) 3,5 3,0

3. 4. 5. 6. 7. —"lyS'pro-arg-pro-gly-pro ............arg-pro-gly-pro ------------arg-pro——- Gly-pro-gly-pro 4,0 3,0

8. 9. 10. П. 12. 13. 14. 15. Thr-lys-pro---------gly-pro --------pro-arg-pro-gly-pro Thr-lys--------------------- Thr-lys-pro——------~— Thr-Iys-pro-arg--........— ----lys-pro-arg----------- .........-.............gly-pro Gly-pro-gly 3,5 3,5

Референс-препарат Ридостин 3,5

Контроль ВПГ-2 6,0 lg

Было установлено, что при экстренной лечебной и лечебной схемах пептиды снижали инфекционный титр вируса на 3,5-4,0 lg ТЦД50 и 3,0-3,5 lg ТЦД50, соответственно.

Данные настоящих исследований показали, что практически все пептиды перспективны для дальнейших исследований в отношении герпесвирусной инфекции. Изменение экспрессии генов цитокинов в клетках Vero под действием пептидов при экспериментальной герпетической инфекции in vitro.

В результате проведенных исследований экспрессии генов цитокинов в клетках VERO, зараженных ВПГ-2, было показано, что спектр синтезируемых клетками мРНК цитокинов значительно меняется под действием пептидных препаратов. Наиболее заметными оказались изменения в синтезе мРНК ИЛ-1р. Так, в результате применения пептидов совместно с вирусом экспрессия гена ИЛ-ip наблюдалась при введении в клетки 13 из 15

пептидов. Также повышение уровня транскрипции ИЛ-lp наблюдалось при использовании in vitro 10 из 15 пептидов через 24 часа после заражения. В контрольном образце клетки заражали вирусом без обработки пептидами и экспрессии гена ИЛ-ip в них не наблюдалось. Подобный характер изменения экспрессии гена ИЛ-ip соответствует ответу иммунной системы на воспалительный процесс, который мог бы наблюдаться в условиях целостного организма при воздействии на него данными пептидами и ВПГ. Кроме того, усиление синтеза ИЛ-ip на уровне транскрипции позволяет предполагать возможную активацию В-лнмфоцитов и продукцию антител в макроорганизме.

Показано угнетение экспрессии гена ИЛ-4 при введении в клетки Vero совместно с вирусом 11 из 15 пептидов, при применении in vitro препаратов через 24 часа после заражения экспрессия подавлялась под действием 6 пептидов. В контрольных клетках, зараженных вирусом, не обработанных пептидами, наблюдалась экспрессия гена ИЛ-4 (см. Талицу 6). Подавление транскрипции ИЛ-4 может отражать способность пептидов влиять на дифференцировку Т-хелперов в Th-1-лимфоциты и угнетать функцию Th-2-лимфоцитов, что является оптимальной коррекцией иммунитета при вирусной инфекции в условиях организма.

Как видно из данных, представленных в таблице б, под действием пептидов в ряде случаев наблюдалось угнетение экспрессии гена ИЛ-8 и активации транскрипции ФНО-а и ИЛ-18, которые в условиях макроорганизма синтезируются моноцитами/макрофагами, что может свидетельствовать о способности пептидных препаратов регулировать функции данных клеток.

Таким образом, обнаруженные закономерности в изменении экспрессии генов цитокинов позволяют прогнозировать антивирусное действие препаратов в отношении герпесвирусной инфекции на основании характерных изменений синтеза цитокинов в клеточной модели. Определение потенциального эффекта пептидов на клетки крови больных генитальным герпесом ex vivo.

Проверка потенциального терапевтического эффекта препаратов проведена ex vivo согласно методике Ершова Ф.И. и соавт., 2005. Показано, что клетки крови больных герпетической инфекцией отвечали адекватной продукцией ИФН в ответ на индукцию определенными пептидами, т.е. при добавлении практически всех пептидов клеточная чувствительность пациентов с герпесвирусной инфекцией определялась в 30-70% случаев (Табл. 7).

Анализ изменения цитокинового профиля в лейкоцитах пациентов с генитальным герпесом показал специфическую картину изменения транскрипции цитокинов, отличающуюся от таковой в клетках VERO.

Отмечено подавление частоты экспрессии гена ИЛ-10, наблюдающееся в 80% случаев (12 из 15 пептидов), что, возможно, является признаком подавления функций Treg-лимфоцитов, супрессирующих иммунный ответ и подавляющих синтез ИФН-у. Таким образом, снижение синтеза ИЛ-10 является признаком стимуляции клеточного иммунитета.

Обнаружена также активация транскрипции ИЛ-2 под действием 9 из 15 пептидов. Известно, что ИЛ-2 участвует в дифференцировки Т-хелперов в Th-1, что также явлется доказательством стимуляции клеточного иммунитета. Показано снижение экспрессии ИЛ-4 при действии 7 из 15 пептидов, что указывает на снижение функций Th-2-лимфоцитов.

Доказательством активации клеточного иммунитета также может служить активация кспрессии гена ИЛ-12 почти в 50% случаев (7 из 15 препаратов). ИЛ-12 также индуцирует дифферениировку Т-хелперов в направлении Th-1, и, следовательно, участвует в антивирусном ответе.

Обобщая эти данные, можно заключить, что исследование изменений цитокинового фона в клетках крови пациентов является критерием, позволяющим прогнозировать потенциальное иммуномодулирующее действие исследуемых препаратов при герпесвирусной инфекции.

Различия в спектре экспрессируемых генов цитокинов на модели VERO и в клетках крови пациентов объясняется разным происхождением клеток. Общим признаком оказалось угнетение экспрессии гена ИЛ-4, что, вероятно, является признаком изменения дифференцировки Т-хелперов и усиления клеточного иммунитета. Дальнейшие исследования на других клеточных и вирусных моделях, а также расширенное популяционное исследование позволит подтвердить эти закономерности и обнаружить новые взаимосвязи и прогностические факторы.

В настоящее время проблема подбора терапии для лечения герпесвирусной инфекции крайне актуальна. Существует необходимость расширения имеющегося арсенала лекарственных средств, так как герпесвирусы широко распространены и ассоциированы с многочисленными заболеваниями человека.

Исследование пептидных препаратов подтвердило их выраженный антивирусный эффект не только на основании снижения цитопатического действия на клетки, но и на основании признаков активации клеточного иммунитета, выявленное путем анализа экспрессии генов цитокинов. Подтверждена эффективность исследованных пептидов в отношении ВПГ2 in vitro и ex vivo. Анализ изменений в синтезе цитокинов предполагает возможность использования этих препаратов и в отношении других представителей семейства Herpesviridae. Таким образом, нами усовершенствованы критерии подбора терапевтических

Таблица 6. Влияние пептидов.

№ Структура пептидов ИФН-а ИФН-р ИЛ-1|) ИЛ-2 ИЛ-4 ил-с. ил-» ил-ю ИЛ-12 ИЛ-18 ФНО-а

Введение пептидов совместно с ви псом

1. Семакс + + + - + + - + + -

2. Селанк + + +/- - + +/- - + -

3. ТЬг-ЬуБ-Рго-ау-Рго + + +/- - + - - - - -

4. Ьу$-Рг0-Лп:-Рг0-0!у-Р[0 + + + +/- - + + - - + -

5. Р го-Аге-Рго-С 1у-Рго + + + + - + + - - +

6. Агг-Рго-С1у-Рго - + + + - + +/- - +/- + -

7. Рго-С1у-Рго + + + +/- + - + - - -

8. ТЬг-Ьу5 + + + + - + - - -

9. ТЬг-Ьуз-Рго + + + + + + + + - + -

10. ТНг-Ьуз-Рго-Аге + + + + +/- + + - + - -

11. Ьув-Рго-Лгн + + + + + - + - - + -

12. Аге-Рго + - - + +/- + - - + -

13. О1у-Рго + + + + + + - + + -

14. 01у-Рго-С1у-Рго - + + +/- - - + -

15. ау-Рго-С1у + + + + + + + -

ВПГ2 (контроль) - + - + + - + - + -

Введение пептидов через 24 часа после заражении

1. Семакс + + + +/- + - + - -

2. Селанк + + - + + + + + - + -

3. ТЬг-Ьуб-Рго-Оу-Рго + + - + +/- +/- + +/- + -

4. 1^У5-Рго-Лг|',-Рго-С|у-Рги + + - + - - + + + -

5. Рго-Аге-Рго-С1у-Рго - + + + + + +/- + - - -

6. Лге-Рго-С1у-Рго - + + + + + + + + + +

7. Рго-С1у-Рго + + + + + + + + +

8. ТЬг-Ьук + + + + + + - + + -

9. ТЬг-Рун-Рго + + + + + + + + + +/-

10. ТЬг-Ьуз-Рго-Аге - + + + + - + + + + +

11. Ьуз-Рго-Агд + + + + + + + +

12. Аге-Рго - + + + - + + - + + _

13. 01у-Рго + + + + + - + +

14. 01у-Рго-01у-Рго + + - + - + + +

15. С1у-Рго-С1у + + + + + + + -

ВПГ2 (контроль) + + - + + + + + + -

Клетки + - - - + - +/- - + -

Таблица 7. Чувствительность к пептидам и изменение экспрессии генов цитокинов у

больных герпесом ex vivo.

№ Пептиды % чувствительных к пептидам больных генктальнымй герпесом (N=60) Изменение в синтезе м-РНК цитокинов в клетках крови больных генитальным герпесом после воздействия пептидов ex vivo

1. Семакс 60 Т ИФН-у, ИЛ-12 i И Л-1В. ИЛ-4. ИЛ-10

2. Селанк 60 т ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-18, ФНО-а i ИЛ-4. ИЛ-10

3. Thr-Lys-Pro-Gly-Pro 50 т ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-8 i ИФН-а. ИЛ-10. ИЛ-18

4. Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro 60 t ИФН-а, ИЛ-2, ИЛ-12 1 ИЛ-4, ИЛ-10

5. Pro-Arg-Pro-Gly-Pro 40 t ИФН-у, ИЛ-12 i ИЛА ИЛ-10

6. Arg-Pro-Gly-Pro 40 Í ИФН-а, ИЛ-2, ИЛ-12 i ИЛ-6. ИЛ-4, ИЛ-10

7. Pro-Gly-Pro 60 | ИЛ-2, ИЛ-12 1 ИЛ-10

8. Thr-Lys 40 Т ИЛ-6, ИЛ-18 1 ФНО-а

9. Thr-Lys-Рго 30 Т ИФН-а, ИЛ-2. ИЛ-6 i ИЛ-8, ИЛ-10

10. Thr-Lys-Pro-Arg 40 т ИЛ-2, ИЛ-6 1 ИЛ-4, ИЛ-10

II. Lys-Pro-Arg 40 т ИЛ-6, ИЛ-12, ИЛ-18 1 ИЛ-10, ИЛ-10

12. Arg-Pro 30 t ИФН-а, KIM, ИЛ-12 1 ИЛ-10, ФНО-а

13. Gly-Pro 50 f ИФН-а, ИЛ-2, ИЛ-4 i ИЛ-10. ФНО-а

14. Gly-Pro-Gly-Pro 50 t ИФН-у. ИЛ-18, ФНО-а 1 ИЛ-6, ИЛ-12

15. Gly-Pro-Gly 70 f ИЛ-2. ИЛ-18 i ИЛ-4, ИЛ-6. ФНО-а

препаратов с предполагаемым антивирусным действием и доказана необходимость исследования потенциального воздействия препаратов in vitro и ex vivo на иммунную систему больных герпесвирусной инфекцией.

ВЫВОДЫ:

1. Подтверждена этиологическая взаимосвязь ВГ-8 с диагнозом саркома Капоши: сочетанное применение методов ИФА и ПЦР повышает эффективность обнаружения маркеров ВГ-8 в сыворотке крови и в МПК пациентов с саркомой Капоши до 77%, а определение ДНК в биоптате из очага саркомы Капоши доводит вероятность определения маркеров ВГ-8 до 100%

2. У пациентов с идиопатической саркомой Капоши отмечается активации инфекции, вызванной вирусом герпеса Зосгер и ВГ-6, и угнетение инфекции, вызванной ВПГ1,2, заключающиеся в повышении и снижении частоты обнаружения ДНК соответствующих вирусов в МПК по сравнению со здоровыми лицами.

3. При идиопатической саркоме Капоши активируется синтез ИЛ-ip, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, угнетается транскрипция ИЛ-2 , а также снижается способность к продукции ИФНа , ИФН-у и уровень клеточной чувствительности к препаратам интерферона I и II типов.

4. Активация лититического цикла вируса ВГ-8 имеет характерную картину: обнаружение ДНК ВГ-8 в мононуклеарах периферической крови сопровождается сильным повышением концентрации антогониста рецептора к ИЛ-1; детекция IgG к малому капсидному протеину ВГ-8 ассоциируется с низкими значениями ИФН-а у больных саркомой Капоши.

5. Экспрессия апоптотических маркеров Fas, Fas Ligand, NF-kB, каспаза 8 и каспаза 3 в мононуклеарах периферической крови у пациентов с саркомой Капоши не отличается от здоровых людей и больных кожной патологией.

6. В группе пациентов с кожной патологией статистически значимо снижаются титры антител IgG к ВГ-6 (р=0,0002) и наблюдаются достоверно более низкие значения ИЛ-4 и ИЛ-10 по сравнению с больными саркомой Капоши и здоровыми лицами.

7. У больных с кожной патологией обнаруживаются достоверно более высокие уровни IgE (р=0,03) и лейкоцитоза (р=0,006).

8. Усовершенствованы критерии подбора препаратов пептидной природы при герпесвирусной инфекции, обладающих противовирусной активностью, что дает возможность направленного конструирования новых пептидов и разработки новых безопасных лекарственных препаратов на основе пептидов, пригодных для терапии герпес-вирусной инфекции.

Слисок опубликованных работ по теме диссертации.

1. Потапова Л.А., Махнева Н.В., Демкин В.В., |Косякова Н.П.| / Выявление ДНК герпесвируса человека 8 типа (ГВЧ-8) у пациентов с классической саркомой Капоши. // I международная конференция. Проблемы диагностики, лечечения, профилактики герпесвирусных инфекций. Москва 2008, с.56-58.

2. Потапова Л.А., |Косякова Н.Щ Сургучева И.М., Щербенко В.Э., Панкова Е.П., Смышляева Н.Б., Мезенцева М.В. / Нарушение цитокинового и интерферонового статуса у больных герпесвирусной инфекцией. // IV Международная конференция «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» // С-Петербург. - 2008. - с. 158.

3. Потапова Л.А., [Косякова Н.Щ Сургучева И.М., Щербенко В.Э., Мезенцева М.В. / Цитокиновый профиль и интерфероновый статус у больных герпесвирусной инфекцией, вызванной вирусом герпеса разных типов. // РАН Российский иммунологический журнал. Наука. 2008. Т. 2 (11). С. 258.

4. Потапова Л.А., |Косякова H.nJ, Махнева Н.В., Мезенцева М.В..../ Вирус герпеса 8 типа и его роль в патологии человека. // Вопросы вирусологии. - 2009. №6. с. 18-23.

5. Шаповап И.М., Потапова Л.А., Мезенцева М.В., Андреева Л.А., Щербенко В.Э., Ершов Ф.И., Мясоедов Н.Ф. / Исследование новый отечественных противовирусных пептидных препаратов на основе глипролинов с иммуномоделирующими свойствами. // IV Российский симпозиум БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ. Казань. - 2009. - с. 279.

6. Андреева Л.А., Нагаев И.Ю., Мезенцева М.В., Шаповал И.М., Подчерняева Р.Я., Щербенко В.Э., Потапова Л.А..../ Исследование противовирусных свойств структурных фрагментов пептида Селанк. // Доклады академии наук. Физиология. Наука. 2010. Т. 431 (№3). С. 414-418.

7. Андреева Л.А., Мезенцева М.В., Нагаев И.Ю., Шаповал И.М., Щербенко В.Э., Потапова Л.А....7 Скрининг ex vivo перспективных лекарственных препаратов пептидной природы: новые подходы. // Доклады академии наук. Физиология. 2010. Т. 434 (№4). С. 262-266.

Список сокращений:

ВБН - вирус болезни Нюкасла

ВГ - вирус герпеса

ВЗ - вирус Varicella Zoster

ВПГ - вирус простого герпеса

ВЭМК - вирус энцефало-миокардита мышей

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИЛ - интерлейкин

ИФН - интерферон

ИФА - иммуноферментный анализ

КП - кожная патология

МПК - мононуклеары периферической крови

МЗ - медианное значение

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА-ИЛ-1 - рецепторный антогонист ИЛ-1

СК - саркома Калоши

ТЦД - тканевое цитопатическое действие

ФНО - фактор некроза опухоли

ФЭЧ - фибробласты эмбриона человека

ЦПД - цитопатическое действие

IE - immediate-early protein

IgG - антитела класса G

IgM - антитела класса М

Th - Т-хелперы

Для заметок

Подписано в печать: 16.04.2012 Тираж: 150 экз. Заказ №845 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.74, корп.1 (495) 790-47-77; www.reglet.ru

f 2 - 1 4 p J J

2011308055

2011308055