Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Методы молекулярной гибридизации, иммунофлюоресценции и иммуноферментного анализа в диагностике Herpes simplex virus

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Методы молекулярной гибридизации, иммунофлюоресценции и иммуноферментного анализа в диагностике Herpes simplex virus"

pro од

1 \ КОЯ 1S9S

на правах рукописи

КАРАХАН Наталья Марковна

МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ, ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ И ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА В ДИАГНОСТИКЕ HERPES SIMPLEX VIRUS

(03.00.07 - микробиология) ( 03.00.06 - вирусология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических: наук

МОСКВА 1996 г.

Работа выполнена в Московском ордена Трудового Красного Знамени Научно-Исследовзтельском Институте Педиатрии и Детской Хирургии Министерства здравоохранения и медицинской промышленности России.

Научные руководители:

1. канд.биол.наук О.Д. Видута

2. доктор мед.каук В.П. Ветров

Официальные оппоненты:

1. доктор мед. наук И.К.Мазурова

2. канд. биол. наук Л.А. Чекановская'

Ведущее учреждение Институт молекулярной генетики

Защита диссертаций состоится11_"_1996 г.

в "_" на заседании Диссертационного Совета Д 176.01.01 Московского

научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского ГК санэпиднадзораРФ

по адресу 125212 г. Москва, ул. адмирала Макарова д. 10.

с диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Автореферат разослан"_"_1996 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета д.м.н. Горская Е.М.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Актуальность проблемы диагностики и лечения заболеваний, вызванных Неф es simplex virus (вирусом простого герпеса- ВПГ) определяется ее высоким удельным весом в общей заболеваемости, Широкому распространению герпесвирусной инфекции во многом способствует тот факт, что инфекция наиболее часто протекает в средне-тяжелой и легкой формах, субклинически, вплоть до бессимптомного вирусоноси-тельсгва (Коломиец А.Г. и др.1988, Stagno S.et.al.1985). Первичное заражение вирусом ведет к практически пожизненному вирусоносительству, а заболевание, как правило, носит латентный или хроническй характер и передается в последующих поколениях.

Герпетическая инфекция у иммунокомпетентных лиц обычно представлена локальными везикулярными заболеваниями ограниченных зоь -Щ13ИСТЫХ оболочек.Пациенты со сниженным иммунным статусом могут ра^ивать.тяжелые хронические или прогрессирующие инфекции (GaffieyM.G. еы 1991).

Активация ла^-тно существующей герпетической инфекции может происходить в резульч воздействия широкого спектра факторов, способствующих снижению ;«1Му.-.ЛТета в результате экологически неблагоприятных условий проживания, гоР,ональных изменений во время беременности, различного вида травм и стреи.од (Семенова Т.Б. и др.

1990, BlondeauJJH.et.al. 1990).

В то же время, вирус простого герпеса обладает лчмуноде-ирессивной активностью, вызывая ингибирование Т-клеточнол пр^.-.ч-ферации, иногда в сочетании с дефектом гуморального ответа, подаь-л-ет фагоцитарную активность макрофагов, снижает процесс интерферо-нообразования (Иванов C.B. и др. 1990, Львов Н.Д. и др. 1990, Кульчар Г .И. и др. 1990, Johnson J.R. et.al. 1992). Субклиническое течение герпетической инфекции и бессимптомное вирусоносительсгво среди женщин детородного возраста значительно затрудняют диагностику и создают опасность инфицирования плода, что может приводить к развитию врожденных уродств, локализованных и генерализованных форм герпеса новорожденных. Инфицированные новорожденные, не развившие в неонатальном периоде каких-либо патологических состояний, представляют собой группу риска по развитию вирусной инфекции в последую-

щие годы жизни, что может повлечь за собой развитие целого рада патологий органов и тканей.

Хронические и латентные формы герпетической инфекции наиболее сложны в диагностике в результате многообразия клинических проявлений и отсутствия четких клинических критериев оценки природы заболевания и его стадии, что диктует необходимость диагностирования инфицирования по результатам лабораторного исследования. Б настоящее время дяя идентификации вируса простого герпеса активно используются серологические и молекулчрно-биологические методы, разработанные в научно-исследовательских учреждениях. Однако, не все они еще нашли широкое применение в клинической практике, например, метод молекулярной гибридизации, с помощью которого возможна индикация генома в биологических пробах. Для широкого внедрения метода необходима его адаптация к запросам клиники. В настоящей работе на примере групп пациентов с риском реактивации герпе-свирусной инферши (недоношенные новорожденные дети, их матери и дети, проживающие на загрязненных радионуклидами территориях) были разработаны критерии оценки степени инфицированное™ вирусом простого герпеса методами молекулярной гибридизации, иммунофлюо-ресценции и иммуноферментного анализа.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Использование современных методов диагностики (молекулярная гибридизация, иммунофлюоресценция и иммуноферментный анализ) для индикации вируса простого герпеса непосредственно в клинических пробах с целью разработки диагностических критериев степени инфицирования в сопоставлении с тяжестью заболевания у обследованных.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Адаптировать лабораторный вариант метода молекулярной гибридизации на клиническом материале, полученном от недоношенных новорожденных детей и их матерей, разработав количественную оценку выявляемых нуклеотидных последовательностей вируса простого герпеса в сопоставлении с тяжестью клинического состояния обследованных.

2. Разработать количественную шкалу оценки выявляемых методами иммунофлюоресценции (ИФ) и иммуноферментного анализа

- л -

игенов вируса простого герпеса в крови, слюне и моче недоношен-хжденных детей в coitоставлении с их клиническими характери-

•пределить с помощью метода иммуноферментного анализа диаг-и. значимые величины титров противогерпетических антител классе, выявляемых в сыворотках крови недоношенных новорожденных ; матерей.

)ценить, используя методы молекулярной тбридизации, иммуно-енции и иммуноферментного анализа, эффективность реафероно-ia основании динамики изменения количественного содержания игенов вируса щкхпого i ериеса.

азработать комплексную систему оценки, основанную на одновре-швлении генома возбудителя и его антигенов, для дифференциации :ительства и хронического инфекционного промесса, ассоцииро-вирусом простого герпеса у детей, проживающих в загрязненных шдами территориях.

ыявить широту распространения и формы (моно- и смешанный ха-:рпесвирусного инфицирования среди недоношенных новорожден, их матерей и детей из зоны радиациошюго коигроля. сертационная работа выполнена в Московском научно-теяьском институте педиатрии и детской хирургии M3MII РФ i и научный консультант работы - академик РАМН, проф. 10. Е. в). Реализация поставленных задач и цели осуществлялась на базе диационной эконатологии (рук. д.м.н. JI.C. Банена), отдела физио-1Т0Л0П1И новорожденных (рук. Г. М. Дементьева) МНИШ1ДХ, отде-нолопм (рук. д.м.н. М. М. Гараев) и отдела сравнительной вирусо-к. д.м.н. Баринский И. Ф.) института вирусологии им. Д. И. Иванов-;русологической лаборатории ВНИИГБ совместно с к.б.н. Пугакар-L и лаборатории интерферонотерапии отдела гаггерферонов (рук. ювекая) МНИИЭМ им. И. Ф. Гамалея

^ НАУЧНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

помощью методов молекулярной гибридизации, иммуио-(енции и иммунофермагпюго анализа разработана оригинальная (енная шкала оценки степени инфицированное™ вирусом простого позволившая установить взаимосвязь между сте-

пенью инфицирования и тяжестью клинического состояния обследованных.

Методами молекулярной гибридизации, иммунофлюоресценции и иммуноферментного анализа проведен диагностический контроль, позволивший в ранние сроки оценить эффективность реаферона и предложить длительность индивидуального курса терапии.

Предложены диагностические критерии вирусоносительства и хронических форм инфекционного процесса, ассоциированного с гер-песвирусами, позволяющие прогнозировать тяжесть состояния обследованных и назначать этиотропную терапию.

Выявлена зависимость между высокой степенью инфицированное™ герпесвирусами детей из зоны радиационного контроля и степенью загрязнения территории.

Методами молекулярной гибридизации и иммунофлюоресценции была установлена высокая частота встречаемости герпесвирусного инфицирования среди недоношенных новорожденных детей, их матерей и детей, проживающих на экологически неблагоприятных территориях.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Предложены параметры количественной индикации вируса простого герпеса методами молекулярной гибридизации, иммунофлюоресценции и иммуноферментного анализа, а также комплекса этих методов для использования в клинической практике.

Определение стадии инфекционного процесса по данным количественной многофакторной системы оценки результатов вирусологических исследований (активная фаза или хроническая вялотекущая инфекция) позволяет формировать группы риска по развитию инфекционной патологии, ассоциированной с. вирусом простого герпеса (ВПГ), в доклиническом периоде инфекционного процесса, назначать применение этиогропной терапии в период активной фазы инфекционного процесса, когда терапия наиболее эффективна.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Результата работы использованы в клинической практике Московского Научно-Исследоватеяьского Института Педиатрии и Детской Хирургии МЗМП России.

По материалам работы получены удостоверения на рационхчи-заторские предложения^ 989 от 21.09.93 "Модификация метода ИФ и оценка результатов его анализа"^ 990 от 21.09-93 "Расширенная диагностика герпетической инфекции по данным методов МГ,ИФ и ИФА"; N 991 от 21.09.93 "Способ оценки тяжести состояния инфицированных ВПГ детей°;Н 992 от 21.09.93 "Дополнительные показатели тяжести состояния детей при герпесвирусной инфекции"^ 993 от 21.09.93 "Эффективность диагностического контроля, проводимого методами МГ, ИФ и ИФА по выявлению герпесвирусных агентов в клинических образцах новорожденных детей при реаферонотерапии"^ 994 от 21.09.93 "Способ оценки результатов анализов методом прямой иммунофлюоресценции при диагностике герпетической инфекции в биологических жидкостях"; N 995 от 21,09.93 "Способ оценки адекватности применяемой терапии с помощью диагностического контроля, проводимого методом МГ"; N1019 от 18.09.94" Маркеры риска развития полиорганной соматической патологии, ассоциированной с персистентными герпесвирусной и хламидий-ной инфекциями у детей, пострадавших в результате ЧАЭС-аварии"; N1020 от 18.09.94 "Способ количественной многофакторной системы оценки результатов вирусологических исследований для выявления герпетической инфекции".

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения настоящей работы обсуждены на совместном заседании отдела радиационной экопатологии и отдела физиологии и патологии новорожденных МНИИ Педиатрии и Детской Хирургии МЗМП России.

Материалы диссертации опубликованы в медицинской печати (6 работ).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, 4 главы, в которых изложены результаты собственных исследований и наблюдений, заключение, выводы, практические рекомендации и указатель литературы. Работа иллюстрирована 12 рисунками, 17 таблицами, 1 фотографией.

ОБЪЕМ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выявление маркеров герпесвирусного инфицирования' (вирусная ДНК, вирусные АГ и АТ) проводилось у недоношенных новорожденных детей (328 чел), находившихся в отделении неонаталогии МНИИПиДХ на базе 13 горбольницы города Москвы, их матерей (111 чел) и детей из зоны радиационного контроля (302 чел), находившихся на лечении в отделении радиационной экопатологии МНИИПиДХ.

В результате сопоставления данных вирусологического обследования (высокая, умеренная степень инфицирования) с клиническими характеристиками была выявлена взаимосвязь этих показателей у недоношенных новорожденных детей, что послужило основанием для разработки количественной многофакторной системы оценки результатов вирусологического исследования.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Выявление вирусных нуклеотидных последовательностей вируса простого герпеса типов 1 и 2 (ВПГ 1 и 2) и цитомегаловируса (ЦМВ) проводили методом молекулярной гибридизации с помощью 32ЛР-меченных ДНК-зондов.

В качестве гибридизационных зондов на ВПГ1 и ВПГ2 использовали рекомбшантные плазмиды, полученные клонированием по ЕсоК1 сайту в векторе рНС следующих фрагментов геномов ВПГ: Б, Н-фрагментов ВПГ1, К, О- фрагментов ВПГ2 (Жидкова Н.И.1984, Видута О.Д.и др. 1990). В качестве гибридизационного зонда на ЦМВ использовали пдазмиду, состоящую из вектора р!)С8 и вирусспецифического фрагмента дойной 8.9 тыс,пар нуклеотидов,клонированного по Есо!11 сайту, любезно предоставленную сотрудником института Вирусологам им. Д.И. Ивановского. Селивановым Н.И. Зонды для гибридизации метили 3-ЛР в реакции НИК-трансляции по стандартной методике (Манниатис Т. и др. 1984).

2. Выявление герпетического антигена и определение титров ^ М и ^ О противогерпетических антител проводили с помощью иммуно-ферментного анализа (ИФА).

Определение герпетического антигена (АГ) и противогерпе- ти-ческих антител (АТ) проводили с помощью тест-систем, созданных в институте вирусологии им.Д.И. Ивановского совместно с научно-

исследовательским центром молекулярной диагностики (Никитина А.А. и др. 1990).

Учет результатов при определении герпетических АГ и титров ^ М и 1ц С АТ проводили с помощью мультискана фирмы "ТйеЛек" при длине волны 492 нм.

3- Выявление внутриклеточных вирусных антигенов проводили методом иммунофлюоресцепции (ИФ).

Для определения герпетического антигена использовалась флюоресцирующая противогерпетическая сыворотка Свердловского НИИ вирусных инфекций МЗ РСФСР. Рабочее разведение сыворотки составляло 1:32.'Для определения хламидийного антигена использовалась коммерческая тест-система 'Хлаии-Скан". Обработка препаратов проюдилась по стандартной методике, Просмотр препаратов проводили в водной иммерсии с помощью микроскопа "Люмам"-И-1 с ультрафиолетовой приставкой. Объектив х 90, оккуляры х 7.

4. Клинический анализ недоношенных новорожденных детей, их матерей и детей, длительное время проживающих в условиях влияния малых доз ионизирующего облучения проводился совместно с сотрудниками МНИИПДХ Соха Л.Г.,Рюминой И.И., Кешищян Е.С. и Нисан Л.Г.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью всех новых усовершенствований в области вирусной диагностики является ранний,быстрый и специфичный диагноз с высоким порогом чувствительности для обнаружения вирусов непосредственно в биологических пробах, полученных от пациентов. В целях адаптации лабораторного метода молекулярной гибридизации к запросом клиники была разработана количественная оценка результатов выявления вирусной ДНК. Количественное содержание нулеодидных последовательностей вируса простого герпеса (ВПГ) определяли по степени засветки рентгеновской пченки "после реакции МГ с 32лР2меченными ДНК-зондами, использованными в качестве положительного контроля с различным количественным содержанием нуклеотидных последовательностей вируса, титруемых с шагом 10 при начальной концентрации, равной 0.1 мкг в пробе. Количественное содержание ДНК оценивалось по 4-балльной системе: 1балл10л-5мкг, 2 балла-10М мкг, 3 балла-1(У>-3 мкг, 4 балла-10Л-2 мкг в пятне.

Выработка критериев степени инфицированное™ вирусом простого герпеса но данным метола МГ проводилась на примере группы недоношенных: новорожденных лег«') и их матерей.

Таблица 1.

Взаимосвязь между количественным содержанием ДНК вируса простого герпеса (в баллах), выявляемого методом молекулярной гибридизации,п клинических пробах недоношенных новорожденных детей и степенью тяжести их клинического состояния.

Клинические характеристики недоношенных новорожденных количество ДНК вируса простого герпеса в баллах

3-4 балла „ 10 л-2 - 10л3 мкг/100 мкл ,„ 1-2 балла „„„ 10А-4 - 1(Г-5 мкг/100 М1

детей 1-я группа (п - 36) 2-я группа (п - 56)

тяжелые формы патологии 69.4» (25 чел.) 30.35? Р 1-2 (11 чел.) <0>0£

легкие формы патологии 30.6% (11 чел.) 55.4% ? 2 (31 чел.) <0.05

условно-здоровые дети 14.3% ( 8 чел.)

Было обнаружено,что высокому количественному содержанию вирусной ДНК (3-4 балла) соответствовала высокая частота встречаемости тяжелых форм патологииО'ФП) у недоношенных новорожденных детей, составляя 69.4% от общего количества детей с высоким количественным содержанием ДНК ВПГ в клинических образразцах. Условно-здоровых детей в этой группе не было выявлено.

Аналогичная картина наблюдалась среди матерей обследованных новорожденных детей. Так, среди женщин с высоким количественным содержанием ДНК ВПГ частота встречаемости высокой степени отяго-щенности акушерско-шнекологического анамнеза составила 80%. что в 4 раза превышала таковую матерей с умеренной степенью отягощенное™ анамнеза (20%).

Таким образом, результаты обследования новорожденных недоношенных детей и их матерей методом МГ выявили четкую взаимосвязь между количественным содержанием ДНК ВПГ и степенью тяжести клинического состояния младенцев и степенью отягощенное™ акушерско-

гинекологического анамнеза рожениц. Герпесвирусы характеризуются политропизмом к широкому спектру органов и тканей. В связи с этим, степень инфицированности ВПГ оценивалась также по числу биологических локусов (кровь, слюна, аспираты верхних дыхательных путей, моча), в которых выявлялась вирусная ДНК. Среди детей с полилокусным выявлением ДНК ВПГ 63.5% обследованных страдали тяжелыми формами патологии ,тогда как легкие формы патологии составили 33-3%, а условно-здоровые дети (У.К.) составили 3.2% обследованных. У матерей обследованных новорожденных при высокой степени отягощеннности акушерско-гинекологического анамнеза, ДНК ВПГ обнаруживалась одновременно в трех биологических локусах в 76.5% случаев, тогда как при умеренной степени отягощенности акушерско-гинекологического анамнеза полилокусное инфицирование имело место в 2.3 раза реже (у 33 3 % обследованных).

Более того, полилокусное обнаружение ДНК ВПГ в клинических образцах материй четко коррелировало с тяжестью состояния их младенцев. Так, количество детей с тяжелыми формами патологии, родившимися от матерей с полилокусным выявлением ДНК ВПГ, четырехкратно превышало таковое детей с легкими формами патологии, составляя 82.4% и 17.6% соответственно. В то же врем, при монолокусном инфицировании матерей тяжелыми формами патологии страдало менее половины новорожденных (41.7%), а легкими формами патологии 58.3% новорожденных.

Таким образом, разработанная для метода МГ количественная оценка, позволила диагностировать вирусоносительство ( 1-2 балла) и заболевания, ассоциированные с герпесвируаад инфекцией (3-4 балла), а также дала возможность выявить группу риска ко развитию патологических сосгояний-(2-3 балла в отсугсгвие клинически/, проявлений). Выявление вирусной ДНК одновременно в нескольких биологических ло-кусах повышает чувствительность метода,позволяет судить с локализации или распространении воспалительного процесса по органам ч тканям, дает возможность выявления групп, риска, а также прогнозироь^ развитие тяжелых форм патологии новорожденных,ассоциированных с полилокусным инфицированием их матерей.

Методами ИФ и ИФА было проведено тестирование клинических образцов, полученных от недоношенных новорожденных детей, учитывая количественное содержание герпетических антигенов. Результаты

количественного определения АГ ВПГ методом ИФА выражались в оптических единицах ( от 0.1 до 2.0 o.e.). Высокая степень инфицированное™ соответствовала количественному выявлению ЛУ ВПГ о пределах от 0.5 o.e. и выше, а умеренная в пределах от 0.1 до 0.5 o.e.

Таблица 2.

Взаимосвязь между количественным содержанием антигена вируса простого герпеса (в баллах), выявляемо!« методом им муноферм ентного анализа,в клинических пробах недоношенных новорожденных детей и степенью тяжести их клинического состояния.

Клинические характеристики недоношенных новорожденных детей Количественное содеожание АГ ВПГ в оптических единицах при длине волны 492 нм

>0.5 o.e. от 0.1 до 0.5 o.e.

1-я группа (п = 30) 2-я группа (п - 55)

тяжелые формы патологии 76.755 (23 чел.) 40.0% Р 1-2 (22 чел.) <0.05

легкие формы патологии 23.3% ( 7 чел.) 47.3% р i_2 (26 чел.) < о.05

условно-здоровые дети 12.7% ( 7 чел.)

Сопоставление количественного содержания АГ ВПГ в исследуемых образцхч новорожденных недоношенных детей с их клиническими характеристиками выявило, что среди детей с высоким количественным содержанием АГ ВПГ 76,7% обследованных страдало тяжелыми формами патологии,а 23.3% детей - легкими формами патологии, тогда как условно-здоровых детей в этой группе не было. Таким образом, выявлена взаимосвязь между высоким количественным содержанием АГ НЛГ (> 0.5 o.e.), обнаруживаемым с помощью метода ИФА и тяжелым клиническим состоянием обследованных.

Метод ИФ субъективен по оценке результатов и. кроме того, метод не имеет межлабораторной стандартизации по оценке результатов исследования, В целях усовершенствования использования метода в клинике предложена количественная оценка результатов определения внутриклеточного АГ ВПГ методом ИФ (4-балльная шкала) в клетках эпителия и мазках крови недоношенных новорожденных детей. Для эпителиальных клеток мазков-отпечатков слизистых оболочек, слюны и мочи

- и -

количественная оценка степени инфициртвания проводилась по интенсивности свечения ядер. Степень реакции в периферической крови на антиген ВПГ определили по количеству нейгрофилов (сенсибилизированных и содержащих гранулы неинакгивированного антигена), специфически окрашивающихся лротивогерпегической сывороткой,также используя четырехбальную систему.

Сопоставление результатов анализов но количественному содержанию внутриклеточных герпетических АГ в мазках-отпечатках слизис той верхних дыхатегельных путей (ВДП) новорожденных детей с их клиническими характеристиками выявило, что при высоком количественном содержании внутриклеточного герпетического антигена (3-4 балла) частота встречаемости тяжелых форм патологии, еостанляег 90.0%, легкие формы патологии диагностируются в 9 раз реже и составляют 10.0%, тогда как условно-здоровых детей в т>й группе не было выявлено.

Взаимосвязь между шжестш клинического состоянии обследованных и выявлением у нич высокого количественного содержания АГ ВПГ была выявлена при исследовании мазков-отпечатков слизистой рга или аспиратов ВДП, но не мазков периферической кропи.

Реакция в периферической крови на этот антиген может быть и отрицательной у инфицированных герпесом новорожденных при иммунодефицитом состоянии. Однако, степень реакции в периферической крови на внутриклеточный АГ ВПГ хорошо коррелировала с состоянием иммунитета новорожденных недоношенных детей, в частности с их/-ингерфероновым статусом.

Рис. I.

баллы

1 2' 3

Степень реакции в периферической крови (в баллах) на АГ ВПГ

Шаимосшш. между частотой встречаемости инфицированных вирусам ггросто-ш и-риссп недоношенных новорожденных детей со сниженным иммунитетом н степенью реакции л периферической кропи на герпетическлп антиген (м баллах).

'Гак, при нормальной реакции в крови на АГ ВПГ, оцениваемой нами на 2 балла по четырехбалльной шкале, лишь у 7.1% деггей значения?-интерферона были снижены по сравнению с нормой. В то же время, среди детей с отрицательной и слабой ( 1 балл ) реакцией в периферической крови на АГ ВПГ, количество детей со сниженными по сравнению с нормативами значениями^-интерферона составляет 46.4% и 28.6% соответственно, а при высокой степени реакции в периферической крови на АГ ВПГ (3-4 балла) частота встречаемости таких детей составляет 17.9%.

Таким образом, количественное выявление методом ИФ АГ ВПГ к клетках мазков-отпечатков слизистых оболочек коррелиловало с тяжестью состояния обследованных, тогда как результат анализов мазков крови отражают состояние вирусспецифического иммунитета.

В то же время,методом ИФА была проведена работа по выяснению диагностического значения титров вирусспецифических антител классов М и ^ 0 9 сыворотках крови новорожденных недоношенных детей и их матерей в сопоставлении с клиническими характеристиками обследованных. В результате проведеного анализа было показано,что среди матерей недоношенных новорожденных детей наблюдалась четкая взаимосвязь между величинами титров противогерпетических АТ классов 1&М и ^С и степенью отягошенности акушерско-гинекологического анамнеза. Использование этого метода для диагностики герпетической инфекции у недоношенных новорожденных детей, учитывая их возможную иммунологическую незрелость, должно сочетаться с другими диагностическими показателями.

Выявленное снижение интерферонового статуса у инфицированных ВПГ недоношенных новорожденных детей позволяет применение реаферонотерапш. Курс реаферонотерапии проводился под диагностическим контролен методами МГ. ИФ и ИФА с учетом разработанных ранее критериев активности инфекционного процесса.

Методом МГ было выявлено, это после проведенного курса реаферонотерапии, количество детей с вирусной ДНК, выявленной в нескольких исследованньк тканях (кровь, слюна и/или моча) уменьшается в 2.1 раза (с 80,9% до 38.1%). В результате пятидневного курса реаферонотерапии только у 23,8% детей наблюдалась полная элиминация вирусной ДНК. В то же время у большинства обследованных детей распространение герпетической инфекции по нескольким биологиче-

ским локусаи сменилась на инфициропанносп» вирусом герпеса в одной биологическом локусе, увеличив частоту встречаемости монолокусного инфицирования ВПГ с 19.1% до 38,1%. Это уменьшение количества биологических локусов обнаружения вирусной ДНК ко|зрелиронало с улучшением клинического состояния детей.

Количественное содержание ДНК ВПГ (по четмрехбапльной системе) также снижалось под воздействием курса {хяфе|н1Натерапии. Так частота встречаемости ДНК ВПГ в количестве 3-4 балла до и после курса реафережотерапии уменьшалась и к|юви в 1.49 [кш (с. 28,6% т> 19.1%). 8 слюне с 4.8% до 0. Частота встречаемости ДНК ВПГ п количестве 1-2 балла уменьшалась в крови & 1.25 раза (с 71.4% до 57.1%),» слюне в 3.49 раза Сс 66.7% до 19.1% ), а в иоче п 10.9 раза ( с 52.4% до 4.8%). Одновременно возрастала частота встречаемости отрицательных результатов.

Так, в крови до курса реаферонотерапии отрицательных результатов в крови не было выявлено, тогда как после лечения отрицательные результата исследования имели меси» в 23.8% случаев. В слюне после курса реаферонотерапии частота встречаемости отрицательных тестон на наличие ДНК ВПГ возросло в 2.8 раз ( с 28.5% до 80.9%), а в моче в 2

раза (с 47.6% до 95.2%).

На рис. 2. представлена динамика изменений частота выявления

ДНК и антигенов ВПГ методами молекулярной гибридизации, иммуно-флюоресценции и инмуноферменгного анализа в клинических пробах, полученных от недоношенных новорожденных детей в курсе реаферонотерапии.

цыявтгсние ДНК и етгигенов вируса простого герпеса методами молекулярной шбрцдизгпди (МГ), иш/укофлюорссдапдаи (ИФ) и иммуиофериентного анализа (ИФА) в клинических образцах , полученных от недоношенных но-всраддегашх детей до я гатас курса реа^срснатерапии.

До курса торанки После курсе геряпни

Исследуемые тмте I - кропь, 2 - слюне, 3 - моча

Таким образом, методом МГ удается обнаружить значительное снижение частоты обнаружения нуклеотидных последовательностей ДНК герпесвирусов в клинических образцах новорожденных детей за пятидневный курс реаферонотерапии. Причем, вирусный геном в первую очередь полностью элиминируется из клеток осадка мочи (с 46.2% до 0%), значительно, на 53(с 69.2% до 15.4%),уменьшается частота встречаемости такового в клетках слюны и только на 15,4% - (со 100% до ¡>4.6%) в крови.

В то же время методами ИФ и ИФА обнаружить достоверные количественные изменения в содержании вирусных АГ за пятидневный курс реаферонотерапии не представляется возможным. Количественное содержание герпетических антигенов изменяется в значительно поздние сроки ввиду длительности персистенции АГ ВПГ после окончания фазы репродукции вируса.

Среди анализируемых биологических локусов кровь облздает наибольшей консервативностью в ответ на проводимое лечение. Поэтому, при разработке длительности курса терапии необходимо учитывать ее индивидуальный характер и ориентироваться на динамику содержания вируса в крови. В то же время, оценить эффективность подбора лекарственных средств при терапии в максимально короткие сроки возможно в тканях с высокими темпами элиминации генома возбудителя -эпителиальные клетки мочи, слизистой зева и верхних дыхательных путей.

Выявление антигенов и нуклеиновых кислот ВПГ может различаться не только в результате различной чувствительности используемых методов, но и в результате нахождения инфекционного агента в той или иной фазе репродуктивного цикла (Hardy D.A. et.al 1990, Мс Clintock J .Т. et.al 1989.). Следовательно, объективизация полученной информации достигается в результате использования набора методов, которые выявляют различные вирусные компоненты.

На основании полученных ранее данных была разработана количественная многофакторная система оценки результатов вирусологических анализов, проводимых одновременно двумя методами, выявляющими вирусную ДНК (метод МГ) и вирусный АГ (метод ИФ).

Массивная степень инфицирования оценивалась по высокому содержанию (3-4 балла) вирусных ДНК и АГ, полилокусному выявлению этих маркеров в образцах крови, слюны и мочи и очень низкой (0-1 балл)

или очень высокой (3-4 балла) реакцией в периферической крови на АГ ВПГ.

Низкая степень инфицированное™ характеризовалась умеренным (1-2 балла) количественным содержанием ДНК и АГ ВПГ. выявляемых лишь в одном из трех исследуемых биологических локусов и нормальной (2 балла) реакцией в периферической крови на АГ ВПГ. Низкую степень инфицированное™ расценивали как вирусоносительство.

&га система оценки была применена при анализе результатов вирусологических исследований у детей (121 чел.) с хронической соматической патологией, длительно проживающих в условиях влияния малых доз радиации. На основании проведенных исследований выделены группы детей, различающихся степенью инфицированности герпесвирусами. Первую группу составили дети с высокой степенью инфицирован-ностиы, а вторую - дета, инфицированные на уровне вирусоноситель-ства.

Обследованные дети по состоянию здоровья относи-

лись ко II и П1 группам здоровья.И группа здоровья- здоровые дети с риском развития у них хронической патологии, III группа -больные дети с хроническими заболеваниями или врожденной патологией в состоянии компенсации (Черток М.М. и др.1990),

При сопоставлении степени инфидарованности ВПГ обследованных детей и состояния их здоровья были получены следующие данные, представленные в табл. 3.

Таблица 3.

Сопоставление степени инфицированности вирусом простого герпеса детей из зоны радиационного контроля с состоянием их здоровья.

группа здоровья массивная ст епень низкая степень Р 1-2

инфицирования инфицирования

1-я группа п=75 2-я группа п=90

II группа - 65.6% Р<0.05

здоровья (59 чел.)

III группа. 100% 34,4% Р<0.05

здоровья (75 чел) (31 чал.)

Дети с массивной степенью инфицированное™ все относились к III группе здоровья, характеризующейся наличием хронических заболеваний. В то же время, среди детей с низкой степенью инфицированное™ к III группе здоровья относилось лишь $4А% обследованных, а 65.5% детей этой группы относилось к группе с риском возможности развития у них хронической патологии.

Таким образом, использование комплекса диагностических методов позволило дифференциировать детей в соответствии с характером инфекционного процесса и выявить группы риска по его хронизаиии и осложненному течению патологии,выявленной у детей, длительное время проживающих в зонах с повышенный радиационным фоном.

Разработанная комплексна» система оценки была применена при обследовании на наличие герпесвирусного инфицировании 5? детей из 2-х деревень Брянской области, различающихся по степени загрязнении радионуклидами и среднегодовой эффективной дозе облучении.

Частота встречаемости массивного инфицировзник ВПГ составляла 70% среди детей из зоны отселения, тогда как ( ¡жди детей мл зоны с Правом отселения (меньшая степень загрязненности радионуклидами) массивное инфицирование ВПГ было выявлено у 30% обследованных.

Вирусоносительство ВПГ среди детей, проживающих в зоне отселения, составило 44.4%, тогда как среди детей, проживающих ни территории с меньшей степенью загрязненности, частота встречаемости ви-русоносительства составила 55-5%.

В то же время, частота сниженной реакции в периферической крови на АГ ВПГ имела место в 70.3% случаев среди детей из зоны отселения, тогда как среди детей, проживающих на менее загрязненной территории этот показатель составлял 29.7%. Нормальна« реакция в периферической крови на АГ БПГ встречалась в 35% случаев у детей из зоны отселения, тогда как у детей из менее загрязненного района нормальная реакция в периферической крови вшшпась в 65 ^случаев.

Таким образом, с Помощью количественной комплексной оценки результатов вирусологических анализов выявлена взаимозависимость между степенью инфициройанности ВПГ, снижением вирусспецифического иммунитета в периферической крови и степенью загрязненности территории проживания радионуклидами, что подтверждает факт активизации герпссвирусной инфекции в зависимости от величины дозы радиоактивного загрязнении.

Определение распространенности герпесвирусного инфицирования проведено в группах пациентов с повышенным риском рецидивиро-вания ВПГ или возникновения первичной герпесвирусиой инфекшш ¡недоношенные новорожденные дети, их матери и дет с хроническими формами соматической патологии воспалительного характера, длительное время проживающие на территориях с повышенным радиационным фоном. Процесс реактивации эндогенных и экзогенных инфекций протекает на фоне снижения иммунологических реакций, в частности, в результате гормональных сдвигов при беременности, в условиях длительного воздействия малых доз ионизирующей {шиации.

Все три обследованные группы обнаружили высокую частоту встречаемости герпесиирусов. Так, по данным метода МГ этот показатель составлял 92.2% обследованных среди рожениц, 92.У недоношенных новорожденных детей и 95-9% у детей из зоны радиационного шяроля. Причем, во всех группах моноинфекция составляла не более -10.9%, тогда как смешанные формы герпесвирусного инфицирования,включающего в себя ВПГ1,ВПГ2 и ЦМВ,варьировали от 79-9% обследованных (недоношенные новорожденные дети) до 81.3% (матери недоношенных новорожденных детей).

Сходные данные были получены при обследовании этих групп пациентов методом ИФ с целью выявления герпетического и хламидийного антигенов.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны диагностические критерии вирусоносительа ва и активного инфекционного процесса на основании предложенной количественной оценки выявляемых иуклеотидных последовательностей и антигенов вируса простого герпеса в клиническом материале обследованных с помощью методов молекулярной гибридизации, иммунофлюо-ресценции и иммуноферментного анализа.

2. Установлена взаимосвязь между величиной титров противогер-петических антител класса и 1д.О, определяемых методом иммуноферментного анализа^ сыворотках крови женщин детородного возраста и тяжестью патологии. Для недоношенных новорожденных детей этот тест недостаточно информативен.

3- Предложена оценка эффективности подбора лекарствишых средств в максимально короткие сроки на основании динамики измене-

ния количественного содержания вирусной ДНК в курсе реафероноте-рашш, выявляемой методом молекулярной гибридизации, по темпам элиминации вирусной ДНК из эпителиальных клеток осадка мочи, зева, верхних дыхательных пугей. Продолжительность курса терапии должна носить индивидуальный характер и основываться на уменьшении количественного содержания ДНК вируса простого герпеса в крови.."

4. Разработан диагностический комплекс методов, одновременно выявляющий ДНК и антигены возбудителя, и определены количественные параметры степени инфицирования, что дало возможность оценить стадию инфекционного процесса и вычленить группы риска по развитию патологии, ассоциированной с вирусом простого герпеса в доклинический период.

5. С помощью разработанной комплексной системы оценки обнаружена взаимосвязь между степенью инфицированности вирусом простого герпеса детей, проживающих на загрязненных радионуклидами территориях и степенью радиационного загрязнения.

6. Методами молекулярной гибридизации и иммунофлюоресцен-пии установлена высокая частота герпесвирусного инфицирования среди нацистов с риском реактивации герпесвирусной инфекции. Во всех обследованных группах преобладал смешанный характер инфицирования.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Установленная высокая степень распространенности герпесвирусного инфицирования свидетельствует о необходимости внедрения в клиническую практику комплекса современных методов диагностики, позволяющих одновременную индикацию генома возбудителя и его белков, что повышает чувствительность диагностического комплекса в 2-3 раза.

2. Применение команекса диагностических методов с разработанной доя них количественной оценкой результатов позволяет судить о стадии инфекционного лроцеса: активный инфекционный процесс характеризуется высокой степенью инфицированности, выражающейся в высоком количественном содержании (3-4 балла) ДНК ВПГ по данным метода МГ и выявлением ДНК возбудителя одновременно в нескольких биологических жидкостях. При этом АГ ВПГ в мазках отпечатках эпите-лимьных клеток выявляются по данным метода ИФ на высоком количе-

ственном уровне (3-4 балла) при реакции в периферической крови на этот АГ или очень низкой (меньше 1 балла), что свидетельствует о снижении вирусспецифического иммунитета, или очень высокой (3-4 балла), что свидетельствует о напряженности иммунитета.

Низкая степень инфицированности, расцениваемая как здоровое вирусоносительство, характеризуется отрицательным или слабо положительным (1-2 балла) ответом МГ, нормальной реакцией в периферической крови на АГ ВПГ и умеренным (1-2 балла) содержанием АГ возбудителя в эпителиальны клетках проб (метод ИФ).

3. Показателем к проведению специфической терапии является высокая степень инфицированности по данным метода МГ в сочетании с данными метода ИФ. характеризующая активный инфекционный процесс, так как именно на этой стадии терапевтическое воздействие имеет свой положительный эффект.

4. Среди анализируемых биологических локусов кровь обладает наибольшей консервативностью на проводимое лечение. Поэтому, для разработки индивидуальной длительности курса терапии необходимо ориентироваться на результаты анализа крови, тогда как оценить эффективность подбора лекарственных средств в максимально короткие сроки лучше всего по результатам анализов мочи и слюны, проводимых методом МГ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Маркеры риска развития полиорганнай соматической патологии, ассоциированной с персистентной герпесвирусной и хламидийной инфекциями у детей, проживающих на территориях, загрязненных радионуклидами в результате аварии на ЧАЭС.-Российский Вестник Пе-ринатологии и Педиатрии, 1994. 39- N 5 С. 18-20. (соавт. Балева Л.С.,Вицуга О.Д.ДЦербо С.Н.,Макаров В.Б.,Федюшкина H.A., Соха Л.Г., Шайхаев Г.О., Земляная Н.Ю., Зайцева С.П., Гараев М.М., Сафронова О.Н.).

2. Первичный иммунный ответ, вирусспецифические и неспецифические иммунные комплексы при цитомегаловирусном и герпетическом инфицировании новорожденных - Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1993.6.104-105 (соавт. Вельтшцева Е.Ю., Видута О. Д., Пономарева А. М., Нисан Л.Г.; Дементьева Г. М., Алешкин В. А.).

3.Способ зкпресс-индикации герпесвирусных нуклсотидных последовательностей методом молекулярной гибридизации в спинномозговой жидкости и моче у детей с нейроинфекцией и патологией почек.-Методы исследования в молекулярной, общей и медицинской вирусологии (Сб.науч.тр.Ин-та вирусологии им. Д.И.Ивановского) М.1992. С.49-% (соавт.Видута О.Д., Гараев М. М.).

4. Диагностика герпесвирусной инфекции у больных с аллотраис-плантированньши органами- Вопр. вирусологии ,1993. 38.N С. 214-21б.(соавт. Войлокова Р. Я., Посевая Т. А., Видуга О. Д.. Гараев М, М.. Ба-ринский И. Ф., Шабалина Н. В.,),

5. Адаптация методов диагностики герпесвирусной инфекции при аллотранснлангации органов.-Научные достижения в практическую работу (Сб.ст. Клин, больница 119 институт повышения квалификации руководящих работников и специалистов М. 1992 вьш.6 С, 111-119.( соавт. Войлокова Р.Я., Хоробрых В.В., Посевая Т.А., Космачева В.П., Князе-ваЕ.С., Алеев И.А., Лавров A.A., Яшина Т.В., Павлова И.П.)

6. Использование различных методов диагностики для выявлении вируса простого герпеса в образцах слюны,- Методы исследования в молекулярной, общей и медицинской вирусологии (Сб. науч. тр. Ин-та вирусологии им. Д.И.Ивановского) М. 1992. С. 242-246. (соавт. Никитина A.A., Львов Н.Д., Соколова М.В., Рукавишникова И.А., Бикбулаюв P.M., Харитоненков И.Г., Видута О .Д., Гараев М. М.).