Анализ маркеров вируса простого герпеса у недоношенных новорожденных детей с признаками внутриутробной инфекции

Гаджиева, Замира Сайпудиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ маркеров вируса простого герпеса у недоношенных новорожденных детей с признаками внутриутробной инфекции
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ маркеров вируса простого герпеса у недоношенных новорожденных детей с признаками внутриутробной инфекции"

На правах рукописи

0034Э4547

ГАДЖИЕВА ЗАМКРА САЙПУДИНОВНА

АНАЛИЗ МАРКЕРОВ ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА У НЕДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ С ПРИЗНАКАМИ ВНУТРИУТРОБНОЙ ИНФЕКЦИИ

03.01.03. -Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 С мд?

Москва - 2010 г.

003494547

Работа выполнена в Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Кущ Алла Александровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Каражас Наталья Владимировна

кандидат медицинских наук Кистенева Лидия Борисовна

Ведущая научная организация:

Учреждение РАМН НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Защита состоится 2- 2010 г. в У^дасоп

на заседании Диссертационного Совета Д.001.020.01 при Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: 123098 Москва, ул. Гамалеи, д. 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Е.И. БУРЦЕВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы

Герпесвирусные инфекции (ГВИ) чрезвычайно широко распространены в человеческой популяции и являются актуальной проблемой вирусологии и практического здравоохранения. Важное значение для педиатрии и неонатологии имеют вирусы простого герпеса 1 и 2 типов (ВПГ), так как нередко являются причиной мертворождаемости, преждевременных родов, младенческой смертности и заболеваемости новорожденных. Внутриутробная инфекция (ВУИ) развивается у 27-37% детей, рожденных живыми у матерей группы высокого инфекционного риска, обусловливая от 11% до 45% перинатальных потерь, которые могут достигать по данным разных авторов до 66% [Макаров О.В. и соавт., 2008; Whitley R., 2004].

Особую группу риска по частоте заболеваемости и ранней неонатальной смертности составляют недоношенные дети. Доля детей, родившихся недоношенными, составляет 3-16,6% от общего числа новорожденных. По данным литературы новорожденные с очень низкой массой тела при рождении, составляющие примерно 1% от всех рожденных детей, формируют до 75% заболеваемости и смертности. Эта группа детей характеризуется наиболее высоким риском по развитию инфекционных заболеваний, связанных с общей функциональной незрелостью иммунной системы [Лепарский Е. А. и соавт, 2005; Хазалов А. И. и соавт., 2007].

Ранее полагали, что серьезную угрозу для здоровья беременной женщины и ее ребенка представляют только клинически выраженные формы генитального герпеса (ГГ). В настоящее время получены данные о том, что в 60- 80% случаев дети с неонатальным герпесом рождаются от матерей с атипичными или бессимптомными формами течения ВПГ-инфекции [Bursrein D.N., 2003]. Для выявления атипично протекающих инаппарантных форм ГГ необходимо оптимизировать диагностику ГВИ у беременных и усовершенствовать тактику ведения женщин с данной патологией.

Диагностика ГВИ у новорожденных детей часто представляет сложную задачу в связи с отсутствием типичных клинических симптомов ГВИ, а также из-за особенностей иммунной системы новорожденных. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные этой проблеме, разработка четких и общепринятых рекомендаций по лабораторному обследованию недоношенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией и подозрением на ГВИ в России остается нерешенной проблемой.

Не менее сложную проблему представляет лечение недоношенных новорожденных

детей с ГВИ. Специфичные противовирусные препараты обладают высокой токсичностью и

не разрешены для терапии новорожденных детей. В связи с этим одной из важных задач

медицины и здравоохранения является разработка новых препаратов, эффективно подавляющих вирусный патоген и развитие тяжелых форм заболевания.

Цель исследования

Цель настоящей работы состояла в сравнительном анализе маркеров ВПГ-инфекции в группах риска: у новорожденных детей и беременных женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом.

Задачи

1. Оценить частоту выявления маркеров ВПГ у доношенных и недоношенных новорожденных детей и проследить динамику выявления маркеров ВПГ в течение первого года жизни.

2. Изучить эффективность лечения препаратом Виферон инфицированных недоношенных детей.

3. Выявить прямые маркеры ВПГ и серологические показатели ВПГ-инфекции у беременных женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом (ОАГА) в течение беременности, начиная со 2-го триместра.

4. Оценить влияние ВПГ на исход беременности и формирование патологических состояний у детей, родившихся от ВПГ инфицированных матерей.

5. Разработать протокол ПЦР in situ для выявления ВПГ на цитологическом препарате в клетках мертворожденных детей. Оценить эффективность методов лабораторной диагностики при детекции ВПГ в материалах аутопсии.

Научная новизна и практическая значимость

1. Разработан алгоритм комплексного лабораторного обследования недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ культуральным методам (БКМ) и с помощью генодиагностики (ПЦР, ПЦР-рв) для выявления ВПГ.

2. Показано, что включение Виферона в комплексное лечение недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ моделирует показатели интерферонового статуса и приближает к уровню здоровых доношенных новорожденных детей.

3. Установлена распространенность ВПГ-инфекции в группе беременных с ОАГА. На основании комплексного обследования беременных в динамике установлена частота первичного инфицирования и реактивации ВПГ в данный группе риска.

4. Впервые разработан протокол ПЦР in situ для выявления ДНК ВПГ в отпечатках органов мертворожденных детей, позволяющий оценить наличие инфицированных клеток и их тканевую принадлежность.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Показана высокая частота выявления маркеров ВПГ у недоношенных маловесных новорожденных детей с сочетанной врожденной патологией по сравнению с доношенных детьми. Недоношенные маловесные новорожденные дети являются группой риска по развитию ВПГ-инфекции на первом году жизни, что диктует необходимость проведения неоднократного вирусологического обследования этих детей.

2. Включение Виферона в комплексное лечение недоношенных новорожденных детей с признаками ВУИ оказывает иммуномодулирующее действие и снижает показатели летальности у детей с тяжелыми патологическими состояниями.

3. Показана высокая частота выявления маркеров ВПГ у беременных женщин с ОАГА и отмечены неблагоприятные исходы беременности у женщин этой группы риска чаще, чем у женщин, не имевших маркеров ВПГ.

4. ПЦР in situ - информативный молекулярно-биологический метод, открывающий новые возможности в лабораторной диагностике ВПГ-инфекции. Метод эффективен как для диагностики, так и для изучения патогенеза инфекций, вызываемых ВПГ.

Апробация работы

Основные положения работы были представлены на VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007), на VI Конгрессе детских инфекционистов России "Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики" (Москва, 2007), на Ежегодном конгрессе клинической вирусологии (Saariselka, Финляндия, 2008), на III Ежегодном конгрессе и VI Съезде Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины «Современная перинаталогия: организация, технология и качество» (Москва, 2008). В завершенном виде доклад по диссертационной работе прошел предварительную экспертизу на совместном заседании Отдела молекулярной вирусологии и совета по предварительной экспертизе диссертационных работ в Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН от 17 декабря 2009 года.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, 5 глав с изложением результатов собственных исследований, их обсуждения и выводов. Работа изложена на 146 страницах, иллюстрирована 11 таблицами и 22 рисунками. Список цитированной литературы включает 61 отечественных и 171 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культура клеток. В работе использовали клетки перевиваемой линии Vero, полученные из лаборатории культур тканей НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН. Культуру клеток выращивали в среде Игла MEM с добавлением 10% ЭТС, 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина.

Вирус. Для заражения клеток использовали референс штамм F ВПГ1 и штамм G ВПГ 2, любезно предоставленные профессором L. Pereira (США). Вирус поддерживали путем пассирования на культуре клеток Vero.

Определение инфекционной активности вируса. Инфекционный титр вируса определяли в культуре клеток модифицированным методом бляшек. Для титрования готовили возрастающие десятикратные разведения вируса, которые вносили по 0,2 мл в 24-х луночные планшеты с монослоем клеток Vero. Активность вируса выражали в количестве бляшкообразующих единиц, содержащихся в 1 мл (БОЕ/мл). Титр вируса составлял не менее 1x108 БОЕ/мл.

Пациенты. В период с 1 ноября 2006 г. по 1 июля 2009 г. было обследовано 212 детей, родившихся в специализированном акушерском отделении ГБ №8 Департамента Здравоохранения города Москвы. Дети с признаки ВУИ находились в отделении реанимации и интенсивной терапии. Обследование 74 беременных женщин и их новорожденных детей проводилось на базе Московского Областного НИИ акушерства и гинекологии МЗ РФ в период с 20 марта 2008 г. по 25 июня 2009 г. Проведено исследование отпечатков и лизатов 219 органов от 40 мертворожденных детей. Патологоанатомические исследования проводились на базе Морозовской детской городской клинической больницы (г. Москва).

Быстрый культуральный метод. Для определения инфекционной активности ВПГ в клиническом материале использовали быстрый культуральный метод (БКМ). Клетки Vero высаживали в 24-луночные панели с покровными стеклами в концентрации 60 тыс. клеток в 1 мл. Клинический материал вносили в объеме 0,2 мл в культуру клеток. Инкубация с клиническим материалом осуществлялась в течение 24 часов, затем клетки фиксировали в охлажденном ацетоне в течение 30 мин. при +4°С. После фиксации покровные стекла монтировали на предметные стекла и проводили рНИФ. Детекцию ВПГ проводили с помощью моноклональных антител (МКА), полученные в институте вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН [Климова P.P. и соат., 1999]. Результаты иммуноцитохимической окраски регистрировали путем подсчета окрашенных клеток.

Твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА). Определение антител (AT) к ВПГ классов М и G в сыворотке крови проводили методом тИФА с помощью сертифицированных наборов фирм НПО «Диагностические системы» (Россия), а также ЗАО

«Вектор-Бест» (Россия). Для определения антител IgM использовали набор «ВектоВПГ-IgM». Для выявления и определения титра IgG антител использовали наборы «ДС-ИФА-Анти-ВПГ-1,2-0». Индекс авидности (ИА) специфических IgG определяли с помощью набора «ДС-ИФА-Анти-ВПГ-1,2-0- Авидность» фирмы «Диагностические системы» (Россия). Анализ и интерпретацию результатов осуществляли в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

Полнмеразпая цепная реакция (ПЦР). Выделение ДНК проводили с помощью двух сертифицированных коммерческих наборов фирм ООО НФП «Гентех» и ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Использованы набор реагентов для выявления ДНК «ГерпАм» фирмы ООО НПФ «Гентех» (Москва) и «АмлиСенс HSV 1, 2 типов» фирмы ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Амплификация проводилась с использованием термоциклера «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) согласно рекомендации производителя тест-систем.

Полнмеразпая цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-рв). ПЦР-рв проводили с помощью сертифицированных коммерческих наборов ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора «HSV 1, 2 типов-FRT». Для амплификации использовали термоциклер «iQ ¡Cycler» («BioRad», США), согласно рекомендации производителя тест-системы.

Полнмеразпая цепная реакция «in situ» (ПЦР in situ).

Метод ПЦР in situ был модифицирован и использован для анализа фиксированных препаратов-отпечатков материалов аутопсии и препаратов культур клеток. Препараты готовились на стеклах с адгезивным покрытием (Histobond, Германия). В работе были использованы праймеры, направленные к гену ДНК-полимеразы ВПГ. Визуализацию проводили с помощью светового микроскопа. В препаратах от пациентов, инфицированных ВПГ, наблюдали темно-коричневую метку ДНК ВПГ. Далее подсчитывали количество клеток, содержащих метку, и общее количество клеток в препарате.

Анализ интерферонового статуса. Изучение интерферонового статуса проводили совместно с лабораторией онтогенеза и коррекции системы интерферона НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (заведующая лабораторией - д.б.н., проф. В.В. Малиновская). Для определения концентраций ИФН-а использовали тест-систему производства ООО «Протеиновый контур» (С.-Петербург, Россия); для тестирования ИФН-у применяли набор реагентов Biosource IFNy (Бельгия) методом твердофазного ИФА на ридере Anthos. В качестве индукторов использовали: для ИФН-а - вирус болезни Ньюкасла (ВБН), для ИФН-у - ФГА. Чувствительность тест-систем для иммуноферментного определения ИФН-а составляла 5 пкг/мл, для определения ИФН-у - 3 пкг/мл.

Характеристика препарата Виферон. Для лечения недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ использовали иммуномодулирующий препарат

Виферон. В состав препарата входит человеческий рекомбинантный интерферон-а2Ь, аитиоксидаиты (а-токоферола ацетат и аскорбиновая кислота) и основа (масло какао). Детям вводили с 3-7 суток жизни Виферон, ректально по 1 свече, содержащей 150000 МЕ рекомбинантного интерферона-а2Ь человека, каждые 12 ч в течение 7 дней.

Статистическая обработка данных. Для статистической обработки полученных результатов использован ПК и пакет прикладных программ 81аЙ8ика У6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ Выявление внутриутробной ВПГ-инфекции у недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ лабораторными методами на первой неделе жизни.

Обследовано 212 детей, которые были разделены на 2 группы. Основную группу

(группа 1) составили недоношенные новорожденные дети с клиническими признаками ВУИ бактериальной и/или вирусной этиологии (п=145), гестационный возраст от 25 до 36 недель, в среднем 29,8±2,8 недель. Сразу после рождения эти дети были переведены в отделение реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ). Контрольную группу (группа 2) составили доношенные новорожденные дети, родившиеся без признаков ВУИ (п=67), гестационный возраст 38-41 недель, в среднем - 38,9±0,8 недель.

Выявление маркеров ВПГ проводилось методом ПЦР для обнаружения геномной ДНК возбудителя и методом БКМ для определения инфекционной активности вируса. Ребенка считали инфицированным, если прямые маркеры ВПГ у него были обнаружены по крайней мере в одном из изученных клинических материалов. У недоношенных детей из основной группы инфекционно-активный ВПГ методом БКМ на первой неделе жизни был обнаружен у 29 детей из 145 (20,0%), тогда как в контрольной группе вирус не был выявлен ни в одном из изученных случаев (таблица 1). ДНК ВПГ методом ПЦР обнаружена в основной группе у 25 детей из 145 (17,2%) и в контрольной группе у 5 из 67 детей (7,5%). Обнаружение прямых маркеров ВПГ у ребенка на первой недели жизни свидетельствует о внутриутробной передаче вируса от матери к ребенку.

Таблица 1. Выявление прямых маркеров ВПГ у новорожденных детей.

Группы детей ДНК ВПГ Инфекционная активность ВПГ

Группа 1 (основная) 17,2% (25/145) 20% (29/145)

Группа 2 (контрольная) 7,5% (5/67) 0% (0/67)

Статистическая значимость р=0,01 р=0,0001

Различия в частоте обнаружения прямых маркеров ВПГ методами ПЦР и БКМ в группе недоношенных детей с ВУИ и в группе доношенных новорожденных детей, как показала статистическая обработка, являются статистически значимыми (р<0,05). ДНК ВПГ была выявлена как в основной группе детей с признаками ВУИ, так и в контрольной группе детей без ВУИ. Тогда как инфекционно-активный вирус был выявлен только у недоношенных детей с признаками ВУИ из группы 1, что свидетельствует об активном течении инфекции у детей этой группы.

Суммарно два метода позволили обнаружить в группе 1 у 39 из 145 обследованных недоношенных новорожденных детей методом ПЦР и/или БКМ прямые маркеры ВПГ, что составило 26,8%. Это показывает, что применение двух методов лабораторной диагностики повышает эффективность выявления прямых маркеров вируса.

Анализ выявления маркеров ВПГ в различных биологических материалах показал, что наиболее часто маркеры ВПГ методами БКМ и/или ПЦР выявлялись в моче (13,6%) и слюне (8,5%). Реже ВПГ встречался в крови (6,2%) и спинномозговой жидкости (СМЖ) (7,8%). Статистическая обработка данных показала, что различие в частоте выявления ВПГ в моче по сравнению с таковой в крови было статистически значимым (р=0,004).

При количественной оценке содержания ДНК ВПГ методом ПЦР-рв в клинических образцах наибольшее количество ДНК было обнаружено в образцах мочи (р=0,02). Таким образом, не только по частоте обнаружения, но и по вирусной нагрузке наиболее предпочтительным объектом для диагностики внутриутробной ВПГ-инфекции является моча, в которой вирус накапливается чаще всего и в больших количествах, чем в других клинических материалах.

Для изучения параметров гуморального иммунитета у новорожденных детей исследовали сыворотки крови методом тИФА на наличие специфических анти-ВПГ антител классов IgM, IgG и определяли авидность IgG-AT. Серологические тесты показали, что в сыворотке крови у подавляющегося большинства недоношенных детей при первичном обследовании на первой неделе жизни 97,9% образцов сывороток присутствовали Анти-ВПГ-IgG AT (142/145). Отсутствовали Анти-ВПГ-IgG AT у 3 (2,1%) новорожденных детей.

Было установлено (рисунок 1), что в группе недоношенных детей с признаками инфицирования IgG-AT с низкими титрами выявлялись достоверно чаще, чем в контрольной группе (р=0,043). Гуморальные защитные реакции обеспечиваются в основном материнскими антителами, однако наибольшее поступление IgG-AT через плаценту происходит только к 34-ой неделе гестации, когда в крови ребенка обнаруживаются 99% нейтрализующих материнских антител [Karen et.al., 2006].

а60

■недоношенны в дети

□доношенные Дети

0 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 титры антител

Рисунок 1. Сравнение уровней противовирусных антител класса 1^0 в крови новорожденных детей.

Этим можно объяснить, что в группе недоношенных новорожденных у большинства детей наблюдается низкое содержание IgG-AT в крови.

Ни у одного обследованного новорожденного ребенка при первичном обследовании антитела к ВПГ класса IgM обнаружены не были. На низкую частоту обнаружения IgM-AT у инфицированных новорожденных детей указывали и другие авторы. Они объясняли отсутствие или низкий уровень IgM быстрым убыванием антител этого класса при первичной инфекции [Tunback Р. et al., 2007]. Отсутствие IgM-AT можно также объяснить неспособностью иммунной системы новорожденного к продукции IgM-AT, которая возможно связана с незрелостью иммунной системы [Decían P.O. et al, 2007].

Изучение прямых маркеров ВПГ в динамике в группе недоношенных детей показало, что в 75% случаев у инфицированных новорожденных вирус элиминировал к 4-7 месяцам жизни (рисунок 2). В то время как через 1-3 месяца после рождения у 8 (10,6%) детей, отрицательных при первичном обследовании, вирус впервые был обнаружен, что указывает либо на постнатальное инфицирование, либо на позднюю реализацию внутриутробной ВПГ-инфекции. В возрасте 4-7 месяцев маркеры вируса обнаруживались еще у 7 детей (9,3%). Эти данные указывают на то, что при обследовании недоношенных детей с признаками ВУИ недостаточно однократного изучения клинических материалов в первую неделю жизни. Динамическое исследование, проведенное в настоящей работе, показало, что дети, у которых были выявлены маркеры ВПГ методами БКМ и/или ПЦР в первые месяцы жизни,

заслуживают дальнейшего наблюдения, и при увеличении активности вируса -терапевтического вмешательства.

На первой неделе жгонн

30% (32/107)

Выявление маркеров ВИГ на разных сроках обследования

Через 1-3 месяца жизни

10,6% (8/75)

Элиминация вгцзуса 75% (24/32)

Через 4-7 месяцев жизни

9,3% (7/75)

Рисунок 2. Анализ прямых маркеров ВПГ у недоношенных новорожденных детей с признаками ВУИ в динамике.

На основании полученных результатов предлагается следующий алгоритм лабораторного обследования недоношенных новорожденных детей:

1) в целях повышения эффективности диагностики внутриутробной ВПГ-инфекции у недоношенных новорожденных детей необходимо использовать два метода лабораторной диагностики: быстрого культурального метода (БКМ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР);

2) иммуноферментный анализ антител к ВПГ в сыворотках крови недоношенных новорожденных детей в большинстве случаев мало информативен;

3) предпочтительным объектом исследования для диагностики внутриутробной ВПГ-инфекции у новорожденных детей является моча, в которой вирус накапливается чаще всего и в больших количествах;

4) при обследовании недоношенных детей с клиническими признаками ВУИ для исключения диагностических ошибок недостаточно однократного изучения клинических материалов, рекомендуется трехкратное обследование детей на первой неделе жизни, повторное - через 1-3 и 4-7 месяцев после рождения.

Анализ интерферонового статуса недоношенных новорожденных детей с признаками ВУИ. Оценка эффективности включения Виферона в комплексное лечение недоношенных новорожденных детей.

У новорожденных детей отмечается функциональная незрелость клеточного звена иммунитета, которая проявляется в низкой активности NK-клеток, в сниженном пролиферативном ответе Т-клеток, в недостаточной регуляции продукции цитокинов и смещении ответа в сторону ТЬ2-типа [Gasparoni A. et al., 2003]. Естественная иммунная недостаточность увеличивает риск развития инфекционных заболеваний у новорожденных детей. Особого внимания заслуживают недоношенные новорожденные дети с низкой массой тела при рождении, которые представляют группу повышенного риска по инфекционным заболеваниям.

Для оценки реакций врожденного иммунитета в настоящей работе было проведено изучение уровней ИФН-а и ИФН-у у 137 новорожденных детей. Основную группу составили недоношенные новорожденные дети (п=45) с клиническими признаками ВПГ-инфекции. В контрольную группу вошли практически здоровые доношенные новорожденные дети (п=67).

При сравнении медианных значений концентрации сывороточной и спонтанной продукции ИФН-а и ИФН-у в двух группах статистически значимых различий не обнаружили (р>0,05), значения находились на пороге чувствительности метода. Сравнение медианных величин индуцированной продукции цитокинов клетками крови in vitro (таблица 2) показало, что у детей основной группы количество индуцированной продукции ИНФ-а оказалось достоверно выше, чем у детей контрольной группы (pD0,05).

Таблица 2. Сравнительный анализ индуцированной продукции ИФН-а и ИФН-у клетками крови у новорожденных детей in vitro.

Интерферон Основная группа (п=45) Контрольная группа (ч=67)

ИФН-а 58* [5; 528] 27 [5; 1145]

ИФН-у 9 [0; 2394] 4 [3; 85]

"продукция в пкг/мл, медианы [мин.; макс.]

Результаты сравнения индуцированной продукции ИФН-у в основной и контрольной группах (таблица 2) не выявил статистически значимых различий (р=0,09).

Следует отметить, что показатели индуцированной продукции ИНФ-а у недоношенных новорожденных основной группы значительно варьировали по сравнению с показателями контрольной группы (рисунок 3). Значительная доля показателей индуцированного ИНФ-а у детей основной группы была сдвинута в сторону больших

значений. В этой группе значения, превышающие 100 пкг/мл, встречались в 43% случаев, тогда как в контрольной группе 21%. Большой разброс показателей может указывать на дисбаланс в регуляции экспрессии ИФН-а клетками крови у недоношенных новорожденных детей с ВУИ. Продукция ИФН-у в основной группе также характеризовалась значительной вариабельностью показателей.

А Б

□ контрольная группа И основная группа Рисунок 3. Индуцированная продукции ИФН-а и ИФН-у клетками крови новорожденных детей после индукции in vitro.

А - индуцированная продукция ИФН-а;

Б - индуцированная продукция ИФН-у.

Одним из современных подходов к лечению внутриутробных инфекций является иммунотерапия. В работе был проведен анализ эффективности иммуномодулирующей терапии путем включения в комплексное лечение ГВИ иммуномодулирующего препарата Виферон - рекомбинантного интерферона-а2.

Основную группу, которую составили недоношенные дети (п=45) разделили на две подгруппы: 1А и 1Б, В подгруппу IA (п=23) вошли наиболее тяжелые дети с ярко выраженными клиническими признаками ВПГ-инфекции, получавшие Виферон в дополнение к базовой терапии. Количественный анализ индуцированной продукции ИФН-а у детей подгруппы 1А показал, что уровень ИФН-а в два раза выше (таблица 3) по сравнению с уровнем данного цитокина (таблица 2) основной группы детей с ВПГ-инфекцией (107 пкг/мл против 58 пкг/мл).

В подгруппу сравнения (подгруппа 1Б) были включены недоношенные новорожденные дети (п=22) с клиническими признаками ВУИ, получавшие только базовую терапию без включения Виферона.

Анализ уровней ИФН-а и ИФН-у у детей обеих подгрупп проводилось после лечения через 1-2 месяца. Было установлено, что уровни сывороточного и спонтанного ИФН-а и ИФН-у были низкими и не различались до и после лечения (медианы 5 пкг/мл). Уровень индуцированной продукции ИНФ-а снизился и приблизился к уровню, выявленному у доношенных практически здоровых детей (таблица 3).

Таблица 3. Изменение уровня индуцированного ИФН-а и ИФН-у у новорожденных в результате базового лечения с применением Виферона.

Индуцированная продукция ИФН До лечения препаратом Виферон После лечения через 1-2 месяца Статистическая значимость

ИФН-а (п=23) 107* [8; 460] 37 [5; 503] р=0,02

ИФН-у (п=23) 7 [0; 85] 77 [0; 3615] р=0,0003

"продукция в пкг/мл, медианы [мин.; макс.]

Было также установлено, что после лечения Вифероном уровень индуцированной продукции ИФН-у значительно увеличился по сравнению с уровнем, установленный для здоровых доношенных детей (77 пкг/мл против 4 пкг/мл). Продукция ИФН-у у детей с ВУИ исходно была низкой.

Известно, что вирусы, включая ВПГ, способны к подавлению системы ИФН. Данный эффект проявляется в способности нарушать активность протеинкиназы Я и кодировать синтез гомологичных цитокинов у1Ь-10 и у1Ь-6, которые блокируют иммунный ответ, подавляя ТЫ-зависимые реакции и активацию макрофагов [Д. Мейл и соавт., 2007]. Это свидетельствует о повышении потенциальных защитных свойств организма леченых детей, так как известно, что ИФН-у является одним из ключевых цитокинов адаптивного иммунного ответа, непосредственная роль которого заключается в подавлении репликации вирусов, активации фагоцитов и цитотоксической активности естественных киллеров (ЕК).

Наиболее важным показателем действия Виферона явилось статистически значимое снижение смертности у недоношенных детей с признаками ВУИ по сравнению с детьми из этой группы, получавшие только базовое лечение без применения Виферона (4% против 18%, р<0,05).

Комплексное лабораторное обследование беременных женщин с отягощенным акушерско-гннекологнческнм анамнезом с целью выявления ВПГ-инфекции.

Внутриутробное инфицирование плода ВПГ во многом определяется заболеваниями будущих матерей во время беременности. Особенно опасна генитальная локализация герпеса у беременных, которая встречается в 7 - 35% случаев, и в последнее время этот показатель постоянно увеличивается [Bursrein D.N., 2003; Баринский И.Ф., 2004]. Передача ВПГ-инфекции новорожденному может произойти как с клинически выраженной формой ГГ у матери, так и с атипичными или бессимптомными формами течения ВПГ-инфекции [R. Pass, 2000; Bursrein D.N., 2003].

Диагностика атипичной или бессимптомной форм ВПГ-инфекции у беременных женщин представляет определенную сложность и требует усовершенствования тактики ведения женщин с данной патологией. Особую группу риска представляют беременные женщины с ОАГА, у которых в анамнезе отмечены как моноинфекция так и микст-инфекции различной природы (вирусные, бактериальные, грибковые), которые увеличивают риск реализации внутриутробной ВПГ-инфекции.

Было проведено обследование 74 беременных женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом (ОАГА) комплексом лабораторных методов с целью выявления маркеров ВПГ-инфекции. Было проведено также обследование 34 новорожденных детей, родившихся от этих обследованных матерей. Во время беременности отмечалась высокая отягощенность матерей по инфекционным заболеваниям: у 43 из 74 (58,1%) женщин была выявлена та или иная урогенитальная инфекция различной этиологии (вирусная, бактериальная, грибковая). В течение всего периода обследования у 18 из 74 (24,3%) беременных женщин в осадках мочи и урогенитальных соскобах были выявлены прямые маркеры ВПГ. У 2-х женщин с наличием маркеров ВПГ течение беременности приняло патологический характер: у одной из этих пациенток было произведено искусственное прерывание беременности в связи с многочисленными поражениями внутренних органов плода, у другой произошел самопроизвольный выкидыш.

Однако во время обследования не было выявлено клинических проявлений ГГ, что свидетельствует о бессимптомной форме течения инфекции. Об опасности этой формы ВПГ-инфекции свидетельствуют данные, показавшие, что большинство детей с неонатальным герпесом рождаются от матерей с атипичными или бессимптомными формами инфекции [Brown Z.A. et al., 1997; Bursrein D.N., 2003].

Для определения диагностической значимости использованных нами методов лабораторной диагностики ВПГ-инфекции у пациенток данной группы риска был проведен

сравнительный анализ частоты выявления ДНК ВПГ методами ПЦР и ПЦР-рв, а также инфекционной активности вируса методом БКМ. ДНК ВПГ была обнаружена в 24,3% случаев, тогда как инфекционный вирус был обнаружен в 4% случаев. Различия в частоте выявления ДНК ВПГ по сравнению с инфекционно-активным вирусом статистически значимы (р<0,05).

Была проведена сравнительная оценка количества ДНК ВПГ в различных клинических образцах (таблице 4). Полученные значения (СО методом ПЦР-рв сравнивали со значениями стандартных контрольных образцов с известным содержанием ДНК в пробе. Концентрация обнаруженной ДНК в моче и в урогенитальных соскобах выше, чем в образцах крови (р=0,04).

Таблица 4. Сравнительный количественный анализ содержания ДНК ВПГ в исследуемых пробах методом ПЦР-рв.

результаты ПЦР материал Ct (пороговый цикл) Концентрация ДНК (коп.ДНК/мл)

Кровь 28,4'±0,5 10*

Моча 26,3 ± 2,6 1000

Соскоб 26,1 ±3,1 1000

средние значения

При определении концентрации ДНК ВПГ в клинических образцах методом ПЦР-рв было показано, что методом БКМ маркеры вируса были обнаружены в тех материалах, которые содержали более 1000 коп.ДНК/мл и не были выявлены в материалах, содержащих 100 и менее коп.ДНК/мл, что указывает на меньшую чувствительность метода по сравнению с ПЦР (таблица 5). Большая чувствительность ПЦР по сравнению с культуральным методом была также показана в работах других авторов [Bruisten S.M. et al., 2001; van Doornum G.J. J. et al., 2003; Wald A. et al., 2003].

Таблица 5. Сравнительный анализ результатов выявления ВПГ с помощью ПЦР-рв и БКМ.

Результаты БКМ Значения Ct (ПЦР-рв) Концентрация ДНК (коп.ДНК/мл) Статистическая значимость

Положительный 23,4' ± 2,7 1000* 0,01

Отрицательный 27,7 ± 1,0 100

средние значения

Сравнение эффективности лабораторных методов при диагностике неонаталыюго герпеса у недоношенных новорожденных детей и ГГ у беременных женщин с ОАГА показало, что выбор диагностического метода зависит от формы течения ВПГ-инфекции и от исследуемой группы риска. При обследовании беременных женщин, у которых ВПГ-инфекция протекает в бессимптомной форме, предпочтительным методом диагностики является метод ПЦР. При обследовании недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ оптимальным является использование двух методов -быстрого культурального метода и метода ПЦР.

Исследование сывороток крови методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) показало, что у 64 (86,5%) беременных при первом обследовании были выявлены анти-ВПГ-^О антитела, которые характеризовались высокой авидностыо (ИА>60). Анти-ВПГ-1§0 антитела отсутствовали у 10 (13,5%) женщин. У двух (2,7%) беременных при первичном обследовании помимо ^в-АТ были обнаружены антитела класса 1§М, которые являются маркерами острой инфекции.

Данные серологического исследования в совокупности с результатами выявления прямых маркеров ВПГ позволили судить о времени инфицирования и форме инфекции у обследованных беременных женщин. Латентная форма, при которой определяются только антитела, была выявлена у 28 (37,8%) женщин. Реактивация инфекции, которая сопровождалась с обнаружением прямых маркеров ВПГ, была диагностирована у 15 женщин (20,3%). Персистирующая форма инфекции, характеризующаяся бессимптомным выделением вируса, была установлена у 21 женщины (28,4%). Первичное инфицирование произошло у 3 (4,0%) беременных, причем 2 женщины были инфицированы на втором триместре беременности и 1 - на третьем. По литературным данным риск развития неонатального герпеса при инфицировании на третьем триместре беременности варьирует от 30 до 50 % [КипЬегНп Э. V/., 2007].

Серологическое обследование беременных женщин показало, что не всегда выявление прямых маркеров ВПГ-инфекции сопровождается выявлением антител класса ^М и обнаружение антител высокими титрами. Несмотря на то, что у 18 (24,3%) женщин были обнаружены маркеры ВПГ-инфекции, ^М антитела были обнаружены лишь у 2-х из них (11,1%). Также у 6 из 18 (33,3%) женщин были выявлены ДО-АТ с низкими титрами или вовсе отсутствовали. Полученные данные подтверждают вывод о том, что рекомендуемый в литературе принцип динамического наблюдения с целью определения 4-кратного нарастания титра ^б-АТ в парных сыворотках не всегда оправдан при диагностике герпесвирусной инфекции, особенно при обследовании новорожденных, детей раннего возраста и беременных.

Под наблюдением находились 34 новорожденных детей, родившихся у обследованных нами матерей. У 6 (17,6%) из 34 новорожденных состояние расценивалось как тяжелое или средней степени тяжести (оценка по шкале Апгар при рождении составила 6 - 7 баллов). Состояние 28 (82,4%) новорожденных было удовлетворительным (оценка по шкале Апгар 8-9 баллов).

Из 28 новорожденных детей, родившихся в удовлетворительном состоянии, ни у одного ребенка не были обнаружены маркеры ВПГ (группа 1). Из 6 детей, родившихся в тяжелом или среднетяжелом состоянии (группа 2), у 3-х детей были обнаружены маркеры ВПГ. При сравнении частоты выявления ВПГ у детей в этих группах различия оказались статистически значимыми (р=0,002).

В группе 2 у двоих детей с наличием маркеров ВПГ была диагностирована внутриутробная инфекция (ВУИ), что клинически подтверждалось наличием внутриутробной пневмонии, врожденного везикулеза, конъюгационной желтухи. Отмечались также симптомы перинатального поражения ЦНС гипоксически-ишемического и геморрагического генеза. Один из этих детей родился недоношенным. У всех матерей этих детей были выявлены маркеры ВПГ в течение беременности. При более подробном анализе лабораторных данных матерей новорожденных детей с признаками ВУИ оказалось, что у одной из этих женщин маркеры ВПГ выявлялись в течение всего периода беременности, при количественном анализе ДНК ВПГ в пробах была обнаружена высокая вирусная нагрузка, которая составила 10000 коп.ДНК/мл. У другой женщины маркеры ВПГ были выявлены один раз при первичном исследовании во втором триместре беременности и количество ДНК ВПГ в пробах этих пациенток не превышало 1000 коп.ДНК/мл.

Таким образом, у 5 из 18 беременных женщин с маркерами ВПГ (30%) отмечен неблагоприятный исход беременности для плода, включая рождение ребенка с клиническими признаками ВУИ. Из 18 новорожденных детей от неинфицированных ВПГ матерей 3 ребенка (16,7%) родились в тяжелом состоянии.

Выявление ДНК ВПГ методом ПЦР in situ в клетках аутопсийного материала от мертворожденных детей.

Известно, что установление этиологического агента при внутриутробных вирусных

инфекциях у новорожденных детей весьма затруднено. Это связано с трудностями

лабораторной диагностики, сходством и многообразием клинических проявлений различных

заболеваний, иногда с отсутствием четко выраженных клинических признаков

внутриутробного инфицирования. Но даже после проведения патологоанатомического

исследования плодов и умерших новорожденных без вирусологических исследований далеко

не всегда удается поставить диагноз врожденной вирусной инфекции и определить ее

этиологию [Нисевич JI. Л. и соавт., 2006; Squier W., 2008]. Использование современных молекулярно-биологических и вирусологических методов лабораторного исследования пока не нашло широкого распространения в практическом здравоохранении для установления посмертного диагноза.

Проведено патологоанатомическое и вирусологическое исследование отпечатков и лизатов органов от 40 мертворожденных детей, у которых при патологоанатомическом исследовании возникло подозрение на врожденную вирусную инфекцию. Патологоанатомические исследования проводились на базе Морозовской детской городской клинической больницы (г. Москва).

Для оценки вероятности внутриутробного инфицирования маркеры ВПГ выявляли молекулярно-биологическими (ПЦР, ПЦР in situ) и вирусологическим методами (БКМ). Прямые маркеры ВПГ были выявлены у 17 из 40 (42,5%) мертворожденных детей. При исследовании материалов аутопсии методом ПЦР ДНК вируса была обнаружена в 27 (22,7%) органах, методом ПЦР in situ - в 31 (26,1%) органе. Статистически достоверных различий в частоте выявления ДНК ВПГ двумя разновидностями ПЦР обнаружено не было. Инфекционный вирус был обнаружен в 13 (10,9%) органах. Анализ данных показал, что ДНК вируса была выявлена достоверно чаще (р=0,006), чем инфекционно активный вирус культуральным методом. Это может свидетельствовать об отсутствии инфекционной активности возбудителя или об утрате инфекционной активности при хранении материалов до начала анализа.

Сравнение данных ПЦР и БКМ позволяет сделать вывод, что БКМ не является методом выбора при анализе аутопсийного материала, так как сохранение инфекционной активности ВПГ требует либо хранение аутопсийных материалов при низких температурах (-20-70 С0) до исследования, либо внесение в культуру в течение суток после смерти ребенка. Оба этих условия не всегда могут быть соблюдены. Кроме того БКМ требует ведения культуры клеток, что также в условиях лабораторий практического здравоохранения затруднено.

Был проведен сравнительный анализ частоты выявления ДНК и инфекционной активности вируса в различных органах (рисунок 4). Следует отметить, что маркеры ВПГ возможно было выявить почти во всех исследованных органах: легкие, печень, почки, мозг. Чаще всего маркеры вируса были выявлены в клетках мозга (42%) и почек (40%). В клетках легкого (25%) и печени (33%) маркеры выявлялась реже. Статистически достоверных различий найдено не было. Отсутствие маркеров ВПГ наблюдалось при исследовании лизатов и отпечатков сердца.

25%

33%

сердце почча

Рисунок 4. Выявление маркеров ВПГ в различных органах мертворожденных детей.

Подсчет инфицированных клеток в препаратах, полученных методом ПЦР in situ, показал, что наиболее интенсивно накопление ДНК ВПГ происходит в тканях мозга и почек, по сравнению с другими органами (рисунок 5).

в г

Рисунок 5. Выявление ДНК ВПГ в препаратах отпечатков органов методом ПЦР in situ. А, В - отпечатки инфицированных органов мозга и почек; Б, Г - отпечатки неинфицированных органов мозга, почек.

При патологоанатомическом исследовании в 21 случаи из 40 (52,5%) были выявлены признаки текущего инфекционного процесса; при этом у двух недоношенных мертворожденных с экстремально низкой массой тела была выявлена острая вирусная инфекция в виде энцефалита, менингита, миокардита, гепатита.

Результаты, полученные в настоящей работе при изучении маркеров ВПГ в материалах аутопсии, подтверждают данные о значении герпесвирусных инфекций в смерти новорожденного и конкретизируют частоту поражения разных органов и тканей ВПГ.

Данные, представленные в работе, дают основание полагать, что инфицирование ВПГ в эмбриональном и фетальном периодах не столь редкое явление. Использование современного молекулярно-биологического метода (ПЦР) для выявления ВПГ в аутопепйном материале помогает найти вероятное этиологическое объяснение причин фетоинфантильных потерь и врожденных дефектов. Разработка метода ПЦР in situ позволяет обнаруживать инфекционный агент непосредственно в клетках любых органов, тем самым расширяя возможности диагностики ВУИ.

ВЫВОДЫ;

1. При обследовании 212 недоношенных новорожденных детей с признаками внутриутробного инфицирования (ВУИ) на первой неделе жизни установлено, что частота выявления прямых маркеров ВПГ значительно выше (26,8%), чем в группе доношенных детей (7,5%). Обследование в динамике показало, что у 10,6% детей маркеры ВПГ впервые появляются к трем месяцам жизни и еще у 9,3% детей - через 4-7 месяцев после рождения. Это указывает на необходимость неоднократного обследования детей данной группы риска в течение первого года жизни.

2. Сравнительная оценка частоты обнаружения ВПГ у недоношенных детей быстрым культуральным методом (20%) и методом ПЦР (17,2%) показала, что применение двух методов повышает эффективность выявления прямых маркеров ВПГ (26,8%).

3. Отсутствие антител к ВПГ класса IgM у недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ и маркерами ВПГ, а также присутствие антител к ВПГ класса IgG у подавляющего большинства обследованных детей свидетельствуют о малой информативности серологических методов диагностики.

4. Количественное изучение способности клеток крови к индукции ИФН-а показало, что включение препарата Виферон, содержащий рекомбинантный интерферон - а2Ь, в комплексное лечение новорожденных детей оказывает иммунокорригирующее действие и снижает показатели летальности у недоношенных детей с признаками ВУИ.

5. Впервые разработан и использован для диагностики внутриутробной ВПГ-инфекции метод ПЦР in situ при исследовании отпечатков органов и тканей умерших новорожденных, который позволяет визуализировать инфицированные клетки и оценить локализацию вирусной ДНК. Установлена высокая частота выявления ДНК ВПГ (42,5%) методом ПЦР in situ в аутопсийных материалах мертворожденных детей.

6. Показано, что у беременных женшин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом маркеры ВПГ встречались в 24,3% случаев. Неблагоприятные исходы беременности у женщин этой группы риска наблюдались чаще при выявлении ВПГ (30%), чем у женщин, не имевших маркеров ВПГ (16,6%).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Выявление маркеров герпесвирусных инфекций у недоношенных новорожденных детей./ VI Конгресс детских инфекционистов России "Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики", 13-14 декабрь, Москва - 2007, с. 1819.// Адиева A.A., Гаджиева З.С., Павлова М.В., Климова P.P., Федорова Н.Е., Щербо С.Н., Евсегнеева Ж.В., Гущин B.C., Выжлова E.H., Малиновская В.В., Кущ А.А, Гетия Е.Г., Дегтярева М.В.

2. Динамика маркеров герпесвирусных инфекций у недоношенных новорожденных детей в отделениях реанимации и интенсивной терапии./ Педиатрия - 2008, Том 87, № 3, с. 143-144.// Адиева A.A., Гаджиева З.С., Павлова М.В., Гетия Е.Г., Володин Н.Н, Евсегнеева Ж.В., Щербо С.Н., Выжлова E.H., Климова P.P., Федорова Н.Е., Дегтярева М.В., Малиновская В.В., Кущ A.A.

3. Персистенция герпесвирусов у детей с осложненным течением раннего неонатального периода изменяет цитокиновый статус новорожденных детей./ Материалы III Ежегодного конгресса и VI Съезда Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины «Современная перинаталогия: организация, технология и качество» (Москва, 29-30 сентября 2008) в журнале «Вопросы практической педиатрии» - 2008, Том 3, № 5, с. 17-18.// Гетия Е.Г., Паршина О.В., Гусева Т.С., Кущ A.A., Климова P.P., Адиева A.A., Гаджиева З.С., Павлова М.В., Володин H.H., Малиновская В.В., Дегтярева М.В.

4. Влияние виферона на интерфероновый статус недоношенных новорожденных детей с признаками внутриутробного инфицирования./ Аллергология и иммунология - 2008, Том 9, № 3, с. 348-349.// Малиновская В.В., Паршина О.В., Гусева Т.С., Павлова М.В., Гаджиева З.С., Гетия Е.Г., Дегтярева М.В., Кущ A.A.

5. Ннтсрфероновый статус недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками внутриутробной инфекции и его коррекция виферопом./ Российский аллергологическин журнал - 2008, № 6, с. 74-81.// Малиновская В.В., Гусева Т.С., Паршина О.В., Гаджнева З.С., Павлова М.В., Климова P.P., Володин H.H., Гетия Е.Г., Солдатова И.Г., Дегтярева М.В., Кущ A.A.

6. Преконцепцпонная подготовка женщин к беременности и ее влияние на плод и новорожденного./ Педиатрическая фармакология - 2008, Том 5, № б, с. 45-51.// Нисевич Л.Л., Аднева A.A., Меджидова Д.Б., Сулсймапова И.Г., Гаджнева З.С., Шнщенко В.М., Кущ A.A.

7. Эффективность лечения рекомбинантным интерфероном а-2 (Виферон®) недоношенных детей с тяжелыми внутриуиробными инфекциями./ Детские инфекции - 2009, Том 8, № 3, с. 40-44.// Кущ A.A., Дегтярева М.В., Малнновская В.В., Солдатова И.Г., Климова P.P., Аднева A.A., Серова Е.В., Гетия Е.Г., Цибизов A.C., Гаджнева З.С.

8. Выявление прямых маркеров вируса простого герпеса и цитомегаловируса в материалах аутопсии плодов и умерших новорожденных./ Детские инфекции -2009, Том 8, № 3, с. 16-22.// Адиева A.A., Нисевич ЛЛ., Гаджнева З.С., Цибизов A.C., Климова P.P., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Кущ A.A.

9. Сравнительный анализ маркеров герпесвирусных инфекций у недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками внутриутробной инфекции./ Герпес -2009.// Гаджиева З.С., Климова P.P., Адиева A.A., Альховский C.B., Володин H.H., Гетия Е.Г., Солдатова И.Г., Дегтярева М.В., Кущ A.A.

10. Выявление маркеров герпесвирусной инфекции у беременных женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом./ Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологи - 2010.// Гаджиева З.С., Цибизов A.C., Новикова C.B., Агаджанова Е.А., Адиева A.A., Альховский C.B., Малиновская В.В., Климова P.P., Кущ A.A.

Список использованных сокращений

AT - антитела

БКМ - быстрый культуральный метод БОЕ - бляшкообразующая единица ВУИ - внутриутробная инфекция ВПГ - вирус простого герпеса ГВИ - герпесвирусная инфекция ГГ - генитальный герпес ИА - индекс авидности

тИФА - твердофазный иммуноферментный анализ

ИФН - интерферон

ПФП-а-интерферон альфа

ПФН-Y - интерферон гамма

МКА - моноклональные антитела

ОАГА - отягощенный акушерско-гинекологический анамнез

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР in situ - полимеразная цепная реакция in situ

ПЦР-рв - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

СМЖ - спинномозговая жидкость

ЦНС - центральная нервная система

Vero - клетки почек зеленой мартышки

Заказ № 98-а/02/10 Подписано в печать 24.02.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-тай: info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гаджиева, Замира Сайпудиновна

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Вирусы простого герпеса 1 и 2 типов: структура, репродукция репликация вируса в клетке.

1.1. Структура и организация генома вирионов ВПГ

1.2. Репродукция ВПГ в клетке

Глава 2. Инфекция, вызываемые ВПГ 1 и 2 типов.

2.1. Герпесвирусная инфекция у беременных женщин

2.2. Значение ВПГ в развитии ВУИ у недоношенных детей

2.3. Лечение герпесвирусной инфекции у новорожденных детей

Глава 3. Лабораторная диагностика герпесвирусной инфекции.

3.1. Культуральный метод

3.2. Полимеразная цепная реакция

3.2.1. ПЦР «в реальном времени»

3.2.2. ПЦР «in situ»

3.3. Иммуноферментный анализ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ маркеров вируса простого герпеса у недоношенных новорожденных детей с признаками внутриутробной инфекции"

Актуальность проблемы

Ранее полагали, что серьезную угрозу для здоровья беременной женщины и ее ребенка представляют только клинически выраженные формы генитального герпеса (ГГ). В настоящее время получены данные о том, что в 60 - 80% случаев дети с неонатальным герпесом рождаются от матерей с атипичными или бессимптомными формами течения ВПГ-инфекции [85]. Для выявления атипично протекающих инаппарантных форм генитально герпеса необходимо оптимизировать диагностику ГВИ у беременных и усовершенствовать тактику ведения женщин с данной патологией.

Не менее сложную проблему представляет лечение недоношенных новорожденных детей с ГВИ. Специфичные противовирусные препараты обладают высокой токсичностью и не разрешены для терапии новорожденных детей. В связи с этим одной из важных задач медицины и здравоохранения является разработка новых препаратов, эффективно подавляющих вирусный патоген и развитие тяжелых форм заболевания.

Цель исследования

Задачи

2. Изучить эффективность лечения препаратом Виферон инфицированных недоношенных детей.

Научная новизна и практическая значимость

Основные положения, выносимые на защиту

Апробация работы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Гаджиева, Замира Сайпудиновна

ВЫВОДЫ:

4. Количественное изучение способности клеток крови к индукции ИФН-а показало, что включение препарата Виферон, содержащий рекомбинантный интерферон — а2Ь, в комплексное лечение новорожденных детей оказывает иммунокорригирующее действие и снижает показатели летальности у недоношенных детей с признаками ВУИ.

42,5%) методом ПЦР in situ в аутопсийных материалах мертворожденных детей.

6. Показано, что у беременных женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом маркеры ВПГ встречались в 24,3% случаев. Неблагоприятные исходы беременности у женщин этой группы риска наблюдались чаще при выявлении ВПГ (30%), чем у женщин, не имевших маркеров ВПГ (16,6%).

3.4. Заключение.

Клиническая диагностика ГВИ в настоящее время, в группах высокого риска, является актуальной и в тоже время чрезвычайно трудной задачей из-за неспецифичности и полиморфности симптоматики, что нередко приводит к позднему назначению адекватной терапии. Одна из нерешенных проблем состоит в быстрой и дифференциальной диагностике бактериальных инфекций от заболеваний вирусной этиологии. В работах последних лет доказано, что отрицательный результат обследования крови и мочи методом ПЦР, полученный в первые дни жизни, не исключает возможности отсроченной реализации ВУИ [59].

За последние пятнадцать лет в лабораторной диагностике ГВИ достигнуты значительные успехи, разработаны и внедрены в клиническую практику современные методы лабораторной диагностики. Однако эффективность и информативность различных методов неодинаковы при диагностике ГВИ у новорожденных, детей раннего возраста и беременных женщин.

Суммируя данные литературы, можно заключить, что наряду с достоинствами каждый из имеющихся в лабораторной практике методов имеет и ряд недостатков. Это означает, что для надежной и адекватной диагностики ВПГ-инфекции требуются дальнейшие детальные сравнительные исследования, которые помогут выработать алгоритмы вирусологического обследования, оптимальные для разных групп риска. Данный вывод в особенности относится к таким социально значимым группам, какими являются беременные женщины и новорожденные дети.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гаджиева, Замира Сайпудиновна, Москва

1. Альбицкий В. Ю. Состояние здоровья детей дошкольного возраста, родившихся недоношенными.// Рос. педиатр, журнал. — 1998. № 4. -С. 12-15

2. Баранов А. А., Альбицкий В. Ю., Волчина С. Я. Глубоконедоношенные дети как биоэтическая проблема.// Рос. педиат. журнал. 1999. - № 1. — С. 29-32

3. Барановская Е. И., Жаворонюк С. В., Калинин А. Л. Герпетическая инфекция в практике акушера гинеколога.// Мед. Новости. 2001. - № 4. - С. 35-37

4. Баринский И. Ф. Герпевирусная инфекция — иммунодефицитные заболевания XXI века.// Аллергология и иммунология 2004. - Т.5. -№ 1. - С. 202-204

5. Баринский И. Ф., Шубладзе А. К., Каспаров А. А., Гребешок В. Н. Герпес (этиология, диагностика, лечение).// М.: Медицина. 1986. -С. 272

6. Барычева Л. Ю., Орехов К. В.// Иммунология. 2004. - № 6. - С. 8-12

7. Бубнова И. И., Зайдиева 3. С., Тютюнник В. Л. Морфология последа при генитальной герпетической инфекции.// Акушерство игинекология 2001. - № 6. - С. 24-28

8. Букринская А.Г. Вирусология.// М.: Медицина. — 1986

9. Буштырев В.А., Лаура Н. В., Захарова Н. И. Оценка состояния здоровья недоношенных новорожденных с перинатальными инфекциями.// Рос. вестник перинатологии и педиатрии. — 2006. № 3. -С. 11-14

10. Владимирова Н. Ю., Наговицына Е. Б., Сятковская А. Л. Эпидемиологические аспекты репродуктивных потерь.// Проблемы репродукции 2001. - Т. 7. - № 3. - С. 54-57.

11. Володин Н. Н. Неонатология: национальное руководство.// М.: Геотар-медиа, 2007. С. 848

12. Володин Н. Н., Дегтярев Д. Н., Ковтун И. Ю. и др. Перспективы использования метода ПЦР для ранней диагностики герпесвирусной инфекции у новорожденных детей.// генодиагностика в современной медицине (сборник тезисов) М. - 2000. - С. 197-198

13. Гранитов В. М. Герпетическая инфекция.// Новгород: изд. НГМД -2001.-С. 88

14. Грачева Л. И.// Педиатрия. 1999. - № 4. - С. 83-86

15. Гриноу А., Дж. Осборн. Врожденные перинатальные и неонатальные инфекции.// Пер. с анг. М.: Медицина, 2000. - С. 288

16. Дегтярев Д.Н., Дегтярева М.В., Ковтун И.Ю., Шаламова Л.В. Принципы диагностики внутриутробных вирусных инфекций у новорожденных и тактика ведения детей группы риска. // Перинатология сегодня. 1997. - № 3. - С. 18-24

17. Дементьева Г. М. Профилактическая и превентивная неонатология. Низкая масса тела при рождении. Гипоксия плода и новорожденного: лекция для врачей. М., 1999. - С. 70

18. Долгих Т. И. Лабораторная диагностика — основа информационного обеспечения диагностического процесса при оппортунистических инфекциях (обзор литературы).// Клин. Лаб. Диагн. 2008. - № 1. - С. 49-51

19. Долгих Т. И. Оценка эффективности лабораторных методов диагностики врожденной ЦМВИ.// клиническая лабораторная диагностика 2000. - № 11. - С. 35

20. Ефимов Е. И. Диагностика и биокоррекция нарушений антиинфекционного гомеостаза в системе «мать-дитя».// Н. Новгород: Изд-во НГМА. 2004. - С. 376

21. Зайдиева 3. С., Тютюнник В. Л., Цахилова С. Г. Тактика ведения беременности и родов при генитальной герпесвирусной инфекции.// Рос. мед. журн. 1998. - № 5. - С. 33-36

22. Климова P.P. и др. Получение и свойства моноклональных антител к вирусу герпеса 1 и 2 типа.// ЖМЭИ.- 1999. № 5. - С. 99-103.

23. Кудашов Н. И., Помелова В. Г., Зубков В. В. Клинико — иммунологические критерии диагностики герпесвирусной инфекции новорожденных.// Российский вестник перинатологии и педиатрии — 1998.-№5.-С. 12-18

24. Кунгуров Н.В., Герасимова Н.М., Зудин А.Б., Кузовкова Т.В. Генитальный герпес.// Екатеринбург — 2001

25. Кущ А. А., Федорова Н. Е., Климова Р. Р. Быстрый культуральный метод диагностики герпесвирусных инфекций. Методические рекомендации №02.030-08, Роспотребнадзор. М. 2008. - С. 20

26. Макаров О. В., Ковальчук Л. В. Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет.// ГЭОТАР-МЕД, 2007 г.

27. Макацария А. Д., Бицадзе В. О., Акинынина С. В. Синдром системного воспалительного ответа в акушерстве.// М.: Мед. информ. агенство 2006. - С. 448

28. Марченко JI. А., Шурмалина А. В. Стратегия лечения больных с рецидивирующим генитальным герпесом.// Российский международный журнал 2001. - № 3. — С. 50-53

29. Марченко JI. А., Шуршалина А. В. Обоснование принципов современной терапии генитального герпеса.// Гинекология. — 2000. — Т. 2. № 3. - С. 296-302

30. Меджидова A.A. и др. Сравнение различных методов лабораторной диагностики при выявлении цитомегаловируса в аутопсийном материале умерших новорожденных и детей, умерших на первом году жизни.// ЖМЭИ 2002. - Т. 3. - № 2. - С. 63-69

31. Мейл Д., Бростофф Дж., Рот Д.Б., Ройтт А. Иммунология.// М.: издательство «Логосфера». 2007. - С. 70-77

32. Никонов А. П., Асцатурова О. Р. Генитальный герпес и беременность.// Гинекология 2002. - Т. 4. - № 1. - С. 4-6

33. Нисевич Л. Л., Талалаев А. Г. Основные причины смерти новорожденных.// Руководство по педиатрии. Неонатология. Москва 2006.- С. 432-448

34. Орджоникидзе И. В., Тютюнник В. Л. Акушерская тактика у пациенток с герпетической инфекцией.// Акушерство и гинекология — 2001.-№4.-С. 56-59

35. Орджоникидзе И. В., Тютюнник В. Л., Марченко Л. А. Генитальный герпес (этиология, патогенез, клиника, диагностика, планирование беременности).// Акушерство и гинекология 2001. - № 3. — С. 61-63

36. Полетаев А. В., Будыркина Т. С., Морозов С. Г. и др. Инфекция матери как причина патологии плода и новорожденного.// Аллергология и иммунология 2001. - Т. 2. - № 2. — С. 110-116

37. Прилепская Заболевания шейки матки, влагалища и вульвы (клинические лекции): 2 издание — М.: МЕДпресс — 2000. С. 432

38. Прозоровский С. В., Тартаковский И. С.// Клин. лаб. диагн. — 1998. -№2.-С. 33-35

39. Протоколы диагностики, лечение и профилактики внутриутробной инфекции у новорожденных детей М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ. - 2001. -С. 96

40. Прохоров В. Н., Кононова И. Н., Бушуева П. В., Власова И. А. Значение оценки местного иммунитета генитального тракта беременных.// Мед. иммунология — 2001. — Т. 3.- № 2. С. 257-258

41. Ребриков Д. В., Трофимов Д. Ю. ПЦР «в реальном времени»: подходы к анализу данных (обзор).// Прикладная биохимия и микробиология -2006. Т. 42. - № 5. - С. 520-528

42. Ройтт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология.// М.: издательство «Мир». 2000. - С. 168-189

43. Самгин М. А., Халдин А. А. Простой герпес. Дерматологические аспекты.// М.: «МЕДпресс-информ» 2002. — С. 160

44. Серов В. Н. Сочетанная внутриутробная герпетическая и цитомегаловирусная инфекция и ее влияние на плод и новорожденного.// Материалы Ш съезда Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ -2000. С. 76-77

45. Серов В. Н., Тютюнник В. Л., Зубков В. В. Перинатальные исходы у беременных с инфекционными заболеваниями и плацентарной недостаточностью.// Акушерство и гинекология. — 2001. № 1. - С.16.21

46. Скоромец А. П. Инфекционные поражения нервной системы у новорожденных: Автореф. дисс.доктора мед. наук С.Пб. — 2001. — С. 70

47. Скрипкин Ю. К., Шарапова Г. Я., Селисский Г. Д. Инфекции, передаваемые половым путем: практическое руководство.// М.: МЕДпрессинформ 2001. - С. 464

48. Соколов Е.И. Клиническая иммунология: В 3-х т.// М.: Медицина. — 1998.-С. 228

49. Сорокина М. Н., Скрипченко Н. В. Вирусные энцефалиты и менингиты у детей.// Москва 2004. — С. 424

50. Сухих Г. Т. Иммунология беременности.// М.: Изд. РАМН 2003. - С. 400

51. Тареева Т. Г., Малиновская В. В., Будыкина Т. С. и др. Диагностическая и прогностическая значимость иммунного и интеферонового статуса при вирусно — бактериальной инфекции у беременных.// Мед. Иммунология 2002. - Т. 4. - № 2. - С. 284-285

52. Тетрацшвили Н. К., Сухих Г. Т. Роль цитакинов в невынашивании беременности.// Материалы V Российского форума «мать и дитя». М. -2003.-С. 231-232

53. Трунова А. А., Авдеева О. В., Обухова О. О. Содержание цитокинов в сыворотке крови мужчин с генитальным герпесом в стадии клинической ремиссии.// Аллергология и иммунология 2004. - Т. 5. -№ 1.-С. 124

54. Федорова Н.Е., Меджидова М.Г., Воронцова О.Н. и др. Количественные лабораторные методы для диагностики цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей.// Вопросы вирусологии. — 2005. № 1. — С. 9-14

55. Филдс Б., Найп Д. Вирусология.// М., изд. «Мир» 1989. — Т. 3

56. Цинзерлинг А. В., Мельникова В. Ф. Перинатальная инфекция: практическое руководство.// Практич. рук-во. СПб.: Эпби СПб. — 2002. - С. 352

57. Яцука В. М., Губанова Е. В. Динамика заболеваемости генитальным герпесом и деятельность ЛПУ в Москве и Московской области.// Сборник научных работ ЦНИКВИ МЗ РФ. М. - 2000. - С. 93-94

58. Яцык Г. В., Бомбардинова Е. П., Акоев Ю. С. Особенности течения септического процесса у недоношенных детей на современном этапе.// Рос. педиат. журнал. 2000. - № 2. - С. 47-49

59. Яцык Г. В., Скворцова В. А., Боровик Т. Э. Функциональное состояние желудочно-кишечного тракта у новорожденных.// Педиатрия. 2001. - № 3. - С. 89-92

60. Alanen A., Hurranen V. HSV DNA in amniotic fluid without neonatal infection.// Clin. Ifect. Dis. 2000. - V. 30. - № 2. - P. 363-367

61. Alwine J. С., Steinhart W. L. , Hill C. W. Transcription of herpes simplex type 1 DNA in nuclei isolated from infected HEp-2 and KB cells.// Virol. -1974.-V. 60.-P. 302-307

62. Amin H. J., Zamora S. A., D. D. Mc Millan. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant.// J. Pediatr. -2002. V. 140. - № 4. - P. 425-431

63. Andorsky D. J., Lund D. P., Lillehei C. W. Nutritional and other postoperative management of neonates with clinical outcomes.// J. Pediatr. -2001.-V. 139.-P. 27-33

64. Anzivino E., Fioriti D., Mischitelli M. et al. Herpes simplex virus infection in pregnancy and in neonate: status of art of epidemiology, diagnosis, therapy and prevention.// Virology Journal. 2009. — V. 6. - № 40. - P. 111

65. Ashley LR, Corey L. Herpes simplex viruses. In: Schmidt N, Whitely R, Emmons, editors. Diagnostic procedures for viral, Rickettial and Chlamydial infection.// ApHA American Public Health Association -1989.-P. 265-319

66. Baker D. A. Consequences of herpes simplex virus in pregnancy and their prevention.// Curr Opin Infect Dis. 2007. - V. 20. - P. 73-76

67. Batterson W., Roizman B. Characterization of the herpes simplex virion-associated factor responsible for the induction of alpha genes.// J of Virol. 1983. -V. 46.-P. 371-377

68. Baumal C. R., Levin A. V., Read S. E.Cytomegalovirus retinitis in immunosuppressed children.// Am. J. Ophthalmol. 1999. — V. 127. - № 5. -P. 550-558

69. Biswas N, Weller S. K. The UL5 and UL52 subunits of the herpes simplex virus type 1 helicase-primase subcomplex exhibit a complex interdependence for DNA binding.// J Biol Chem. 2001. - V. 276. - № 20

70. Boehmer P. E., Dodson M. S., Lehman I. R. The herpes simplex virus type-1 origin binding protein. DNA helicase activity.// J of Biological Chemistry. 1993. -V. 268. - P. 1220-1225

71. Boutell C., Everett R. D. The Herpes Simplex Virus Type 1 (HSV-1) Regulatory Protein ICP0 Interacts with and Ubiquitinates p53.// J. Biol. Chem. 2003. - V. 38. - P. 36596-36602

72. Braig S., Chanzy B. Management of genital herpes during pregnancy: the French experience.// Herpes. 2004. - V. 11. - № 2. - P. 45-47

73. Branco F. J., Fraser N. W. Herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript expression protects trigeminal ganglion neurons from apoptosis.// J. Virol. 2005. - V. 79. - P. 6969-6975

74. Brocklehurst P. Should acyclovir prophylaxis be used in late pregnancy in women with recurrent genital herpes infection? How to use a clinical decision analysis.// P. Brocklehurst Genitourin Med. 1997. - V. 73. - № 4.-P. 314-319

75. Brown Z. A., Gardella C., Wald A., Morrow R. A., Corey L. Genital herpes complicating pregnancy.// Obstet Gynecol. 2005. - V. 106. - P. 845-856

76. Brown Z. A., Selke S., Zen J. et al. The acquisition of herpes simplex virus during pregnancy.// N. Engl. J. Med. 1997. - № 337. - P. 509-515

77. Brown Z. A., Wald A., Morrow R. A., Selke S., Zeh J., Corey L. Effect of serologic status and cesarean delivery on transmission rates of herpes simplex virus from mother to infant.// JAMA 2003. - V. 289. - P. 203209

78. Bruisten S. M., Cairo I., Fennema H., Pijl A., Buimer M., Peerbooms P. G. H. et al. Diagnosing genital ulcer disease in a clinic for sexually transmitted diseases in Amsterdam.// J. Clin. Microbiol. 2001. - V. 39. -P.601-605

79. Bursrein D. N. Sequally transmitted treatment guidelines.// Current Opinion in Pediatrics-2003.-V. 15.-P. 391-397

80. Carrozza M., DeLuca N. Interactions of the viral activator protein ICP4 with TFIID through TAF250.// Molecular and Cellular Biology. 1996. -V. 16.-P. 3085-3093

81. Centers for Disease Control and Prevention Website. Sexually transmitted disease guidelines.// http://www.cdc.gov/std/treat ment/2006/rr551 l.pdf.

82. Chan S. H., Perussia B., Gupta J. W. Induction of interferon gamma production by natural killer cell stimulatory factors: characterization of the responder cells and synergy with other inducers.// J. Exp. Med. 1991.1251. V. 173.-P. 819-879

83. Chen K. T., Segû M., Lumey L. H., Kuhn L., Carter R. J., Bulterys M., Abrams E. J. Genital herpes simplex virus infection and perinatal transmission of human immunodeficiency virus.// Obstet Gynecol — 2005. -V. 106.-P. 1341-1348

84. Chen Sh., Pearson A., Coen D.M. Failure of Thymidine Kinase-Negative Herpes Simplex Virus To Reactivate from Latency following Efficient Establishment.// J Virol. 2004. - V. 78. - № 1. - P. 520-523

85. Chen Y. M., Knipe D. M. A dominant mutant form of the herpes simplex virus ICP8 protein decreases viral late gene transcription.// Virol. 1996. -V. 221.-P. 281-290

86. Cheng C. H. Measured versus estimated energy expedinture in mechanically ventilated critically ill patients.// Clinical Nutrition. 2002. -V. 21. - № 2. - P. 165-172

87. Chiou H. C., Weller S. K., Coen D. M. Mutations in the herpes simplex virus major DNA-binding protein gene leading to altered sensitivity to DNA polymerase inhibitors.// Virol. 1985. - V. 145. - P. 213-226

88. Constantin N., Dodson M. S. Two-hybrid analysis of the interaction between the UL52 and UL8 subunits of the herpes simplex virus type 1 helicase-primase.// J of General Virol. 1999. - V. 80. - P. 2411-2415

89. Cook W. J., Wobbe K. K., Boni J., Coen D. M. Regulation of Neighboring Gene Expression by the Herpes Simplex Virus Type 1 Thymidine Kinase Gene.//J Virol.-1996.-V. 218.-№ l.-P. 193-203

90. Corey L., Handsfield H. H. Genital herpes and public health; addressing a global problem.// JAMA. 2000. - V. 283. - P. 791-94

91. Costanzo F., Campadelli-Fiume G., Foa-Tomasi L., Cassai E. Evidence that herpes simplex virus DNA is transcribed by cellular RNA polymerase B.// J of Virol. 1977. - V. 21. - P. 996-1001

92. Crate J. J., Mocarski E. S., Lehman I. R. A DNA helicase induced by herpes simplex virus type 1.// Nucleic Acids Research. 1988. - V. 16.1261. P. 6585-6596

93. Cusini M., Ghislanzoni M. The importance of diagnosing genital herpes.// J Antimicrob Chemother 2001. - V. 47. - P. 9-16

94. Desselberger U. Herpes simplex virus infection in pregnancy: diagnosis and significance.// Intervirology. 1998. - V. 41. - P. 185-190

95. Edward K., Wagner's, Herpes Virus Research.// http://www.dbc.uci.edu/.

96. Edwards K., Logan J., Saunders N. Real-time PCR.// Horizon Bioscence -2004.-P. 1-36

97. Elgadi M. M., Smiley J. R. Picornavirus internal ribosome entry site elements target RNA cleavage events induced by the herpes simplex virus virion host shutoff protein.// J of Virol. 1999. - V. 73. - P. 9222-9231

98. Elias P., Lehman I. R. Interaction of origin binding protein with an origin of replication of herpes simplex virus 1.// Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 1988. - V. 85. - P. 2959-2963

99. Enright A. M., Prober C. G. Neonatal herpes infection: Diagnosis, treatment and prevention.// Semin Neonatol 2002. - V. 7. - P. 283-291

100. Espy M. J., Ross T. K., Teo R. et al. Evaluation of LightCycler PCR for implementation of laboratory diagnosis of herpes simplex virus infections.// J. Clin. Microbiol. 2000. - V. 38. - P. 3116-3118

101. Everett R. D. Herpes Simplex Virus type 1 regulatory protein ICP0 does not protect cyclins D1 and D3 from degradation during infection// J. of virol. 2004. - V. 78. - P. 9599-9604

102. Faber S. W., Wilcox K. W. Association of the herpes simplex virus regulatory protein ICP4 with specific nucleotide sequences in DNA.// Nucleic Acids Research. 1986. - V. 14. - P. 6067-6083

103. Freedman E., Mindel A., Jones C.I. Epidemiological, clinical and laboratory aids for the diagnosis of neonatal herpes an Australian perspective. // Herpes. -2004. - V. 11. - № 2. - P. 38-40

104. G. J. J. van Doornum, Guldemeester J., Osterhaus A. D. M. E. et al. Diagnosing Herpesvirus Infections by Real-Time Amplification and Rapid Culture.// Journal of Clinical Microbiology 2003. - P. 576-580

105. Gao M., Knipe D. M. Potential role for herpes simplex virus ICP8 DNA replication protein in stimulationof late gene expression.// J of Virol. -1991. V. 65. - P. 2666-2675

106. Gaytant M. A. et al. Congenital cytomegalovirus infection: review of the epidemiology and outcome.// Obstet. Gynecol. Surv. — 2002. V. 57. - P. 245-256

107. Godowski P. J., Knipe D. M. Mutations in the major DNA-binding protein gene of herpes simplex virus type 1 result in increased levels of viral gene expression.// J of Virol. 1983. - V. 47. - P. 478-486

108. Godowski P. J., Knipe D. M. Transcriptional control of herpesvirus gene expression: gene functions required for positive and negative regulation.// Proceedings of the National Academy of Sciences. 1986. - P. 256-260

109. Godowski P. J., Knipe D. M. Identification of a herpes simplex virus function that represses late gene expression from parental viral genomes.// J of Virol. 1985. - V. 55. - P. 357-365

110. Gottlieb S. L., Douglas JM Jr, Schmid D. S. et al. Seroprevalence and correlates of herpes simplex virus type 2 infection in five sexually transmitted-disease clinics.// J Infect Dis. 2002. - V. 186. - P. 1381-1389

111. Grangeot-Keros L., Cointe D. Diagnosis and prognostic markers of HCMV infection.// J. Clin. Virol. 2001. - V. 21. - P. 213-221

112. Granzow H., Klupp B.G., Fuchs Wet, et al. Egress of alphaherpesviruses: comparative ultrastructural study.// J. of virol. 2001. - P. 3675-3684

113. Gressens P., Langston C., Martin J. R. In Situ PCR Localization of Herpes Simplex Virus DNA Sequences in Disseminated Neonatal Herpes Encephalitis.// J of Neuropathology and Experimental Neurology 1994. -V. 53. -№5.-P. 469-482

114. Haarr L., Shukla D., Rodahl E. et al. Transcription from the gene encoding the herpesvirus entro receptor nectin — 1 (HveC) in nervous tissue of adult mouse.// Virol. 2001. - V. 287. - P. 301-309

115. Haase A.T., Retzel E. F., Staskus K. A. Amplification and detection of lentiviral DNA inside cells.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990. - V. 87. -P. 4971-4975

116. Haliona B. Epidemiology of genital herpes resentadvancer.// Eur. J. Dermatol - 1999. - V. 9. - № 3. - P. 177-184

117. Hallman M. Intrauterine infections and the fetus.// Duodecim. 1999. - V. 115. - № 14.-P. 1437-1438

118. Hardwicke M. A., Sandri-Goldin R. M. The herpes simplex virus regulatory protein ICP27 contributes to the decrease in cellular mRNA levels during infection.// J of Virol. 1994. - V. 68. - P. 4797-4810

119. Hassan J., Connell J. Translational mini-review series on infectious disease: congenital cytomegalovirus infection: 50 years on.// Clin Exp Immunol. 2007. - V. 149. - № 2. - P. 205-210

120. Hill D. J., Petrik J., Arany E. Growth factors and the regulation of fetal growth.// Obstst. Gynecol. 1998. - V. 92. - № 2. - P. 179-183

121. Hodgson J., Zuckerman M., Smith M. Development of a novel internal control for a real-time PCR for HSV DNA types 1 and 2. // J Clin Virol -2007. V. 38. - № 3. - P. 217-220

122. Honess R. W., Roizman B. Regulation of herpesvirus macro-molecular synthesis. I. Cascade regulation of the synthesis of three groups of viral proteins.// J of Virol. 1974. - V. 14. - P. 8-19

123. Hwang Y. S., Spruance. The epidemiology of uncommon HSV 1 infection.// J. of the IHMF - 1999. - V.6. - №1. - P. 16-19

124. Igarashi K., Fawl R., Roller R. J., Roizman B. Construction and properties of a recombinant herpes simplex virus 1 lacking both S-component origins of DNA synthesis.//J of Virol. 1993. -V. 67. - P. 2123-2132

125. Jacobs R. F. Neonatal herpes simplex virus infections.// Semin. Perinatol. -1998.-V. 22.-P. 64-71

126. Jean S., LeVan K. M., Song B., Levine M., Knipe D. M. Herpes simplex virus 1 ICP27 is required for transcription of two viral late (gamma2) genes in infected cells.// Virol. 2001. - V. 283. - P. 273-284

127. Jing X, Cerveny M, Yang K, He B. Replication of herpes simplex virus 1 depends on the gamma 134.5 functions that facilitate virus response to interferon and egress in the different stages of productive infection.//J Virol.-2004.-V.78

128. Jones C.L. Herpes simplex virus infection in the neonate: clinical presentation and management. // Neonatal Network 1996. - V. 15. - P.13011.15

129. Karr В. M., Read G. S. The virion host shutoff function of herpes simplex virus degrades the 5' end of a target mRNA before the 3' end.// Virol. —1999. V. 264. - P. 195-204

130. Kawana T. Vertical transmission of alpha herpes virus.// Nippon. Rinsho2000. -V. 58. № 4. - P. 871-876

131. Kenneson A., Cannon M. Review and meta-analysis of the epidemiology of congenital cytomegalovirus (CMV) infection. // Rev Med Virol. 2007. -V. 17. -№4.-P. 253-76.

132. Kim J.C., Choi S.H., Kim J.K. et al. Белок ICP27 вируса простого герпеса типа 1 индуцирует апоптоз путем повышения внутриклеточного содержания активных форм кислорода.// Молекулярная биология 2008. - Т. 42. - № 3. - С. 470-477

133. Kimberlin D. W. Advances in the treatment of neonatal herpes simplex infections.// Rev Med Virol 2001. - V. 11. - P.157-163

134. Kimberlin D. W. Herpes Simplex Infection.// Clinical Microbiology Reviews. 2004. - P. 1-13

135. Kimberlin D. W. Herpes simplex virus infections in newborn. // Semin. Perinatol. 2007. - V. 31. - P. 19-25

136. Kimberlin D. W. Herpes Simplex Virus, Meningitis and Encephalitis in Neonates.// J. Herpes 2004. - V. 11. - № 2. - P. 65-76

137. Kimberlin D. W. Neonatal herpes simplex infection.// Clin. Microbiol, Rev.-2004.- V. 17.-№ l.-P. 1-13

138. Kimberlin D. W., Lin C. Y., Jacobs R. F. et al. Safety and efficacy of highdose intravenous acyclovir in the management of neonatal herpes simplex virus infections.// Pediatrics. 2001. - V. 108. - P. 230-238

139. Kimberlin D. W., Lin CY, Jacobs RF, et al. Safety and efficacy of highdose intravenous acyclovir in the management of neonatal herpes simplex virus infections. Pediatrics. 2001. - V. 108. - P. 230-238

140. Klapper P. E., Cleator G. M. Herpes simplex virus.// Inter virology 1997. -V. 40.-P. 62-71

141. Kleinschmidt-De Masters B. K., Gilden D. H. The expanding spectrum of herpes simplex virus infection of the nervous system.// Brain Pathol. -2001. -V. 11.-№4.-P. 440-451

143. Knipe D.M. Fundamental Virology.// Lippicott W&W. Philadelphia, 2001.-P. 1123-1185

144. Koff A., Tegtmeyer P. Characterization of major recognition sequences for a herpes simplex virus type 1 origin-binding protein.// J of Virol. 1988. — V. 62.-P. 4096-4103

145. Kriebs J. M. Understanding herpes simplex virus: transmission, diagnosis, and considerations in pregnancy management.// J Midwifery Womens Health 2008. - V. 53. - P. 202-208

146. Kristie T. M., Sharp P. A. Interactions of the Oct-1 POU subdomains with specific DNA sequences and with the HSV alpha-trans-activator protein.// Genes & Development. 1990. - V. 4. - P. 2383-2396

147. Kwong A. D., Kruper J. A., Frenkel N. Herpes simplex virus virion host shutoff function.// J of Virol. 1988. - V. 62. - P. 912-921

148. Lee C. K., Knipe D. M. An immunoassay for the study of DNA-binding activities of herpes simplex virus protein ICP8.// J of Virol. 1985. - V. 54.-P. 731-738

149. Lin B. T. Retinoblastoma cancer suppressor gene product is a substrate of the cell cycle regulator cdc2 kinase.// EMBO J. 1991. - V. 10. - P. 857864

150. Linssen C.F.M., Jacobs J.A., Stelma F. et al. Herpes simplex virus load in bronchoalveolar lavage fluid is related to poor outcome in critically ill patients.// Intensive Care Med. 2008. - V. 34. - № 12. - P. 2202-2209

151. Lockshon D., Galloway D.A. Cloning and characterization of oriL2, a large palindromic DNA replication origin of herpes simplex virus type 2.// J of Virol. 1989. -V. 58.-P. 513-521

152. McGregor F., PhelanA., Dunlop J., Clements J. B. Regulation of herpes simplex virus poly(A) site usage and the action of immediate-early protein IE63 in the early-late switch.// J of Virol. 19996. - V. 70. - P. 1931-1940

153. McNamee E. E., Taylor T. J., Knipe D. M. A dominant-negative herpesvirus protein inhibits intranuclear targeting of viral proteins: Effects on DNA replication and late gene expression.// J of Virol. — 2000. V. 74. -P. 10122-10131

154. Meerbach A., Sauerbrei A., Meerbach W. et al. Fatal outcome of herpes simplex virus type 1-induced necrotic hepatitis in a neonate.// Med Microbiol Immunol. -2006. -V. 195. P. 101-105

155. Mettenleiter T. C. Herpesvirus assembly and egress.// J Virol. — 2002. V. 76.-P. 1537-1547

156. Mladina N., Mehikic G., Pasik A. TORCH infection in mother as a course of neonatal morbidity.// Med. Arh. 2000. - V. 54. - P. 273-276

157. Morrison E. E., Stevenson A. J., Wang Y. E. et al. Defferences in the intracellular localization and fate of Herpes Simplex Virus tegument proteins early in the infection of VERO cells.// J of General virol. 1998. — V. 79.-P. 2517-2528

158. Mossman K. L., Saffran H. A., Smiley J. R. Herpes Simplex Virus ICP0 Mutants Are Hypersensitive to Interferon.// J Virol. 2000. - V.74. - № 4. - P. 2052-2056

159. Muller M. T. Binding of the herpes simplex virus immediate-early gene product ICP4 to its own transcription start site.// J of Virol. — 1987. V. 61.-P. 858-865

160. Mullis K. B., Falloona F. A. Specific synthesis of DNA in vitro a polymerase-catalysed chain reaction.// Meth. Ensymol. 1987. - V. 155. -P. 335-349

161. Najioullah F., Bosshard S., Thouvenot D. et al. Diagnosis and surveillance of herpes simplex virus infection of the central nervous system. // J Med Virol 2000. - V. 61. - № 4. - P. 468-73

162. Nakajima H., Kobayashi M., Pollard R. B., Suzuki F. Pathogenic role of Th2 responses on the severity of encephalomyelitis induced in mice by herpes simplex virus type 2 infection.// J. Neuroimmunol. 2000. - V. 10. -P. 106-113

163. Namangala B., Inoue N., Kohara J., Kuboki N., Sakurai T., Hayashida K., Sugimoto C. Evidence for the immunostimulatory effects of low-dose orally delivered human IFN-alpha in cattle J.// Interferon Cytokine Res. -2006. - V. 26. - № 9. - P. 675-681

164. Nuovo G. PCR in situ hybridization.// NY, Raven Press 1992

165. Nuovo G. Preparation of samples for polymerase chain reaction in situ.// Scan Microsc Suppl. 1996. - V. 10. - P. 49-55

166. Nuovo G., Gallery F., McConnell P. Analysis of non specific DNA synthesis during in situ PCR.// PCR Method Applic. - 1994. - V. 4. - P. 342 - 349

167. Nuovo G., Gallery F., McConnell P., Becker J., Bloch W. An improved technique for the in situ detection of DNA after polymerase chain reaction amplification.// Am J Pathol. 1991. - V. 139. - P. 1239 - 1244

168. Nuovo G., Gallery F., McConnell P., Horn R., Bloch W. Importance of different variables for enchansing in situ detection of PCR — amplified DNA.// PCR Methods Appl. 1993. - V. 2. - № 305. - P. 312

169. Nuovo G., Gorgone G., McConnell P. In situ localization of PCR -amplified human and viral cDNAs.// PCR Methods Appl. 1992. - V. 2. -P. 117-123

170. O'Riordan D. P., Golden C. W., Aucott S. W. Herpes Simplex Virus Infection in Preterm Infant.// J. Pediatrics. 2007. - V. 22. - P. 1613-1620

171. Oroskar A. A., Read G. S. A mutant of herpes simplex virus type 1 exhibits increased stability of immediate early (alpha) mRNAs.// J of Virol. 1987. -V. 61. -P. 604-606

172. Papavassiliou A. G., Silverstein S. J. Characterization of DNA-protein complex formation in nuclear extracts with a sequence from the herpes simplex virus thymidine kinase gene.// J of Biological Chemistry. — 1990. -V. 265.-P. 1648-1657

173. Polvino-Bodnar M., Orberg P. K., Schaffer P.A. Herpes simplex virus type 1 oriL is not required for virus replication or for the establishment and reactivation of latent infection in mice.// J of Virol. 1987. -V. 61. - P.1353528-3535

174. Preston C. M., Newton A. A. The effects of herpes simplex virus type 1 on cellular DNA-dependent RNA polymerase activities.// J of General Virol. -1976.-V. 33.-P. 471-482

175. Proffit M. R., Schindler S. A. Rapid detection of HSV with enzyme-linked virus inducible system employing a genetically modified cell line.// Clin Diagn Virol 1995. - V. 4. - P. 175-82

176. Quinlan M. P., Chen L. B., Knipe D. M. The intranuclear location of a herpes simplex virus DNAbinding protein is determined by the status of viral DNA replication.// Cell. 1984. - V. 36. - P. 857-868

177. Randolph A. G., Washington A. E., Prober C. G. Cesarean delivery for women presenting with genital herpes lesions. Efficacy, risks, and costs.// JAMA. 1993. - V. 270. - P. 77-82

178. Rawlinson W. et al. Viruses and other infections in stillbirth: what is the evidence and what should we be doing?// Pathology. 2008. - V. 40. - № 2.-P. 149-60

179. Revello M. et al. Preconceptional primary human cytomegalovirus infection and risk of congenital infection // J. Infect. Dis. 2006. - V. 193. - № 6. - P.783-7

180. Reynolds A., Liand L., Baines J. Conformational Changes in the Nuclear Lamina Induced by Herpes Simplex Virus Type 1 Reguire Genes UL31 and UL34.// J of virol. 2004. - V. 78. - № 11. - P. 5564-5575

181. Rudnick C. M., Hoekzema G. S. Neonatal herpes simplex virus infections.// Am Fam Physician. 2002. - V. 65. - № 6. - P. 1138-1142

182. Ruyechan W. T. The major herpes simplex virus DNA-binding protein holds single-stranded DNA in an extended configuration.// J of Virol. -1983.-V. 46.-P. 661-666

183. Sandri-Goldin R. M., Hibbard M. K. The herpes simplex virus type 1 regulatory protein ICP27 coimmunoprecipitates with anti-Sm antiserum, and the C terminus appears to be required for this interaction.// J of Virol. — 1996.-V. 70.-P. 108-118

184. Sauberbrei F., Eichborn U., Hottenrott G., Wutzler P. Virological diagnosis of herpes simplex encephalitis.// J. Clin. Virol. 2000. - V. 17. - P. 31 -36

185. Sauerbrei A., Wutzler P. Herpes simplex and varicella-zoster virus infections during pregnancy: current concepts of prevention, diagnosis and therapy. Part 1: herpes simplex virus infections.// Med Microbiol Immunol -2007.- V. 196.-P. 89-94

186. Schang L. M., Phillips J., Schaffer P. A. Requirement for cellular cyclin-dependent kinases in herpes simplex virus replication and transcription. // J. Virol. 1998. - V. 72. - № 7. - P. 5626-5637

187. Slomka M. J., Emery L., Munday P. E. et al. A comparison of PCR with virus isolation and direct antigen detection for diagnosis and typing of genital herpes.// J Med Virol 1998. - V. 55. - P. 177-183

188. Spear P. Herpes Simplex Virus: receptors and ligands for cell entry.// Cellular Microbiology. 2004. - № 6. - P. 401-410

189. Spear P., Longnecker R. Herpesvirus entry: an Update.// J. of virol. 2003. -V. 77.- №19.-P. 10179-10185

190. Squier W. Shaken baby syndrome: the quest for evidence.// Dev. Med. Child Neurol. 2008. - V. 50. - № 1. - P. 10-14

191. Stanberry L. R. Control of STDs — the role of prophylactic vaccines against herpes simplex virus.// Sex. Trans. Infect. 1998. - V. 74. - P. 391-394

192. Stern S., Herr W. The herpes simplex virus transactivator VP16 recognizes the Oct-1 homeo domain: evidence for a homeo domain recognition subdomain.// Genes & Development. 1991. - V. 5. - P. 2555-2566

193. Stow N. D. Localization of an origin of DNA replication within the TRS/IRS repeated region of the herpes simplex virus type 1 genome.// EMBO J. 1982. -V. 1. - P. 863-867

194. Stow N. D., McMonagle E. C. Characterization of the TRS/IRS origin of DNA replication of herpes simplex virus type 1.// Virol. — 1983. V. 130. -P. 427-438

195. Stringer K. F., Ingles C. J., Greenblatt J. Direct and selective binding of an acidic transcriptional activation domain to the TATA-box factor TFIID.// Nature. 1990. - V. 345. - P. 783- 786

196. Suligoi B., Cusan M., Santopadre P., Palu G., Catania S., Girelli G., Pala S., Vullo V. HSV-2 specific seroprevalence among various populations in Rome, Italy. The Italian Herpes Management Forum.// Sex Transm Infect. -2000. V. 76.-P. 213-214

197. Swiss Herpes Management Forum. Swiss recommendations for the management of genital herpes and herpes simplex virus infection in the neonate.// Swiss Med Wkly. 2004. - V. 134. - P. 205-214

198. Taylor T. J., Brockman M. A., McNamee E. E., Knipe D. M. Herpes Simplex Virus.// Front Biosci. 2002. - V. 7. - P. 752-764

199. Thellin O., Coumans B., Zorzi W. Tolerans to the foeto placental graft: ten ways to support a child for nine months.// Curr. Opin. Immunol. — 2000.-V. 12.-P. 731-737

200. Thomas D., Blakqori G., Wagner V., Banholzer M., Kessler N., Elliott R. M., Haller O., Weber F. J. Inhibition of RNA Polymerase II Phosphorylation by a Viral Interferon Antagonist.// J Virol. 2004. - V. 30.-P. 31471-31477

201. Thompson R. L., Shieh M., Sawtell N. M. Analysis of Herpes Simplex Virus ICP0 Promoter function in sensory neurons during acute infection, Establishment of Latency, and Reactivation in vivo.// J of virol. 2003. -V. 77.- №22.-P.12319-12330

202. Trincado D., Eawlinson W. Congenital and perinatal infections with cytomegalovirus.// J. Paediatr. Child Health. 2001. - V. 37. - P. 187-92

203. Tunback P., Bergstrom T., Claesson B. A. et al. Early acquisition of herpes simplex virus type 1 antibodies in children—a longitudinal serological study.// J Clin Virol 2007. - V. 40. - № 1. - P. 26-30

204. Twagira M., Hadzic N., Smith M., et al. Disseminated neonatal herpes simplex virus (HSV) type 2 infection diagnosed by HSV DNA detection in blood and successfully managed by liver transplantation.// Eur J Pediatr -2004.-V. 163 -№3.-P. 166-169

205. Wagner E. K., Roizman B. Ribonucleic acid synthesis in cells infected with herpes simplex virus. I. Patterns of ribonucleic acid synthesis in productively infected cells.// J of Virol. 1969. - V. 4. - P. 36-46

206. Wald A., Huang M., Carrell D. et al. Polymerase Chain Reaction for Detection of Herpes Simplex Virus (HSV) DNA on Mucosal Surfaces: Comparison with HSV Isolation in Cell Culture.// The Journal of Infectious Diseases-2003.-V. 188. -№ l.-P. 1345-1351

207. Weiss H. Epidemiology of herpes simplex virus type 2 infection in the developing world.// Herpes 2004. - V. 11. - P. 24-35

208. Weller S.K. et al. Cloning, sequencing, and functional analysis of oriL, a herpes simplex virus type 1 origin of DNA synthesis.// Molecular & Cellular Biology. 1985. - V. 5. - P. 930-942

209. Whitley R. J. Herpes simplex virus in children.// Curr Treat Options Neurol -2002. V. 4.-P. 231-237

210. Whitley R. J., Kimberlin D. W. Herpes simplex virus.// Clin. Infect. Dis. — 1998. -V. 26. P. 541-555

211. Xiao P., Capone J. P. A cellular factor binds to the herpes simplex virus type 1 transactivator Vmw65 and is required for Vmw65-dependent protein-DNA complex assembly with Oct-1.// Molecular & Cellular Biology. 1990. - V. 10. - P. 4974-4977

212. Xu F, Sternberg M. R., Kottiri B. J., McQuillan G. M., Lee F. K., Nahmias A. J., Berman S. M., Markowitz L. E. Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States.// JAMA 2006. - V. 296.- P. 964-973

213. Young E. J., Chafizaden E., Oliveira V. L. Disseminated herpes simplex infection during pregnancy.// Genta Clinic. Infect. Dis. — 1996. — V. 22. -№1.-P. 51-58

214. Zelus B. D., Stewart R. S., Ross J. The virion host shutoff protein of herpes simplex virus type 1: messenger ribonucleolytic activity in vitro.// J of Virol. 1996. -V. 70. - P. 2411-2419

Информация о работе

Гаджиева, Замира Сайпудиновна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Анализ маркеров вируса простого герпеса у недоношенных новорожденных детей с признаками внутриутробной инфекции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы