Роль цитомегаловирусной инфекции в патологии плода и новорожденного. Поиск новых противовирусных средств

Алиева, Айна Ахмедовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль цитомегаловирусной инфекции в патологии плода и новорожденного. Поиск новых противовирусных средств
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Роль цитомегаловирусной инфекции в патологии плода и новорожденного. Поиск новых противовирусных средств"

003485743

На правах рукописи

№

АДИЕВА АИНА АХМЕДОВНА

РОЛЬ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ В ПАТОЛОГИИ ПЛОДА И НОВОРОЖДЕННОГО. ПОИСК НОВЫХ ПРОТИВОВИРУСНЫХ СРЕДСТВ.

03.00.06. - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

- 3 ЛЕН 2009

Москва - 2009 г.

003485743

Работа выполнена в Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

доктор медицинских наук, профессор

КУЩ

Алла Александровна

НИСЕВИЧ Лия Львовна

МИЛЛЕР Галина Генриховна

БРАГИНА Елизавета Ефимовна

ЧЕШИК Святослав Георгиевич

Ведущая научная организация: НИИ переливания крови Гематологического научного центра РАМН

Зашита состоится « 21 » декабря 2009 г. в 12 часов на заседании Диссертационного Совета Д.001.020.01 при Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: 123098 Москва, ул. Гамалеи, д. 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Автореферат диссертации разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

БУРЦЕВА Елена Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Внутриутробная инфекция (ВУИ) занимает одно из ведущих мест в структуре перинатальной смертности, являясь основной причиной смерти или осложняя течение основного заболевания у 37,5% умерших новорожденных [Цинзерлинг и др., 2002]. Достоверных данных об истинной распространенности ВУИ нет, однако согласно данным ряда исследователей, инфекционные заболевания выявляют у 50-60% госпитализированных доношенных и 70% недоношенных новорожденных [Володин и др., 2004; Сидорова и др., 2006].

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) является одной из наиболее распространенных внутриутробных инфекций, вызывающих тяжелые патологии, вплоть до гибели ребенка [Gibson et.al., 2008; Kenneson et.al., 2007; Kriebs et.al., 2008].

Прогресс в изучении ЦМВИ связан с разработкой и широким внедрением в практику здравоохранения принципиально новых диагностических технологий -высокочувствительных и специфичных методов иммунохимии, молекулярной и клеточной биологии. В связи с этим оценка эффективности современной специфической диагностики ЦМВИ приобретает особую актуальность.

Трудности анте - и постнатальной диагностики ЦМВИ связаны с неоднозначностью возможной реализации инфекционного процесса из-за особенностей иммунной системы новорожденных и неспецифичностью клинических проявлений. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные этой проблеме, устоявшихся канонов пренатальной диагностики ЦМВИ в мире не существует. Разработка четких и общепринятых рекомендаций по лабораторному обследованию недоношенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией с подозрением на ЦМВИ и в России остается нерешенной задачей. Высокая инфицированность недоношенных новорожденных детей ЦМВ ставит вопрос о своевременной диагностике ЦМВИ у беременных женщин и о вертикальной передаче вируса. В связи с этим тактика ведения беременных женщин с высоким риском инфицирования плода должна включать эффективную диагностику и своевременное начало лечения ЦМВИ.

На клеточном уровне цитопатический эффект ЦМВ проявляется в изменении морфологии клетки и ядра, в образовании многоядерных клеток и в появлении внутриядерных включений [Mocarski et.al., 2001]. В связи с этим, исследования, направленные на анализ действия ЦМВ на клеточную пролиферацию, вызывают особый интерес. Так, группой авторов было показано, что ЦМВ стимулирует репликацию клеточной ДНК в зараженных клетках [Hume et.al., 2008; Kalejta et.al., 2003; McElroy et.al,

2000; Prichard et.al., 2008]; описывалось существенное возрастание митотического индекса в инфицированной культуре [Sanchez et.al., 2003; Tran et.al., 2008; Wiebusch et.al., 2005]. Позже появились работы, опровергающие эти данные. Было показано, что вирус может блокировать прохождение клеточного цикла клетками в нескольких точках, включая переход из G| - периода в фазу синтеза ДНК [Lu and Shenk, 1999; Murphy et.al., 2000; Sinclar et.al., 2000] и переход из стадии Gi в M, в точке, обозначаемой как G2/M [Castillo et.al., 2005; Lu and Shenk, 1999; Sanchez et.al., 2006]. Таким образом, данные о влиянии ЦМВ на клеточную пролиферацию оказались противоречивыми и требовали дальнейшего исследования.

Фундаментальные данные о влиянии ЦМВ на клеточные структуры и жизненный цикл клетки необходимы для понимания процессов, приводящих к патологии при внутриутробном развитии детей и их смерти, а также для выбора адекватной терапевтической тактики для новорожденных с ЦМВИ. Существующие на сегодняшний день единичные патентованные препараты, обладающие противовирусной активностью в отношении ЦМВ, не применяются у новорожденных и детей раннего возраста вследствие их высокой токсичности. Кроме того, эффективность лечения существующими препаратами снижена из-за развития лекарственной устойчивости, часто возникающей при длительном их применении [Biron et.al., 2006; Chou et.al., 1999]. Поэтому поиск эффективных и нетоксичных анти-ЦМВ агентов, перспективных в качестве химиотерапевтических средств при ЦМВИ, остается важной проблемой. Все вышеизложенное в совокупности явилось обоснованием для проведения данного исследования.

Цель исследования.

Цель настоящей работы состояла в изучении маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей с сочетанной перинатальной патологией при рождении и в материалах аутопсии; мониторинга метаболической и иммунной терапии; в изучении антивирусной активности аминокислотных производных фуллерена Сб»; в исследовании действия ЦМВ жизненный цикл инфицированных клеток.

Задачи:

выявить прямые (ДНК и инфекционно активный вирус) и непрямые маркеры (специфические IgM, IgG и индекс авидности IgG антител) ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей и изучить динамику их выявления в течение первого года жизни.

установить возможность выявления инфекционно - активного ЦМВ с помощью быстрого культурального метода (БКМ) в материалах аутопсии плодов, умерших новорожденных и детей, умерших на первом году жизни.

разработать метод ПЦР in situ для выявления ДНК ЦМВ на отпечатках различных органов. Оценить эффективность использования различных методов лабораторной диагностики при детекции ЦМВ в материалах аутопсии.

установить частоту выявления ЦМВ у беременных из группы высокого риска по перинатальному инфицированию плода и новорожденного. Оценить эффективность использования метаболических препаратов в предгравидарной подготовке и во время беременности.

оценить эффективность использования Виферона у беременных с ОАГА со второго триместра беременности и у недоношенных детей с клиническими проявлениями ВУИ.

изучить цитотоксичность и антивирусную активность аминокислотных производных фуллерена С6о (АПФ) на модели экспериментальной ЦМВИ in vitro. Сравнить эффективность указанных соединений при использовании лечебной, профилактической и вирулицидной схем воздействия. Оценить сочетанный эффект АПФ и Виферона и продукцию вируса под действием АПФ.

изучить изменение пролиферативной активности в асинхронно - делящейся и синхронизированной культуре фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ) под влиянием ЦМВ. Определить способность клеток ФЛЭЧ, инфицированных в разные периоды клеточного цикла, вступать в митоз.

оценить развитие патологии митоза при инфицировании ЦМВ в присутствии ингибитора репликации вирусной ДНК и при инфицировании ЦМВ инактивированным УФ.

Научная новизна.

Впервые разработан и использован алгоритм комплексного обследования недоношенных новорожденных с клиническими признаками ВУИ вирусологическими методами (БКМ) и с помощью генодиагностики (ПЦР, ПЦР - real time) для выявления возбудителей герпесвирусных инфекций.

Впервые разработан метод ПЦР in situ для выявления ДНК ЦМВ на отпечатках и парафиновых срезах органов мертворожденных и детей, умерших на первом году жизни, который сочетает морфологический и молекулярный подходы и позволяет не только выявлять внутриклеточную вирусную ДНК в инфицированных клетках, но и оценить её относительное количество.

Впервые установлено, что в материалах аутопсии плодов (мертворожденных) и умерших новорожденных чаще определяется инфекционно активный ВПГ, а у детей, умерших на первом году жизни - инфекционно активный ЦМВ.

Впервые показана низкая цитотоксичность и высокая антивирусная активность аминокислотных производных фуллерена С6о- натриевой соли аминокапроновой кислоты

(Сбо-Na-AKK) и натриевой соли аминомасляной кислоты (См-Na-AMK); химиотерапевтический индекс в различных схемах воздействия для Cso-Na-AKK равен 260-2600; для Cf,o-Na-AMK - 2500-5450.

Впервые установлено, что в клетках, инфицированных в S-фазе клеточного цикла, удлиняется период синтеза ДНК; при этом клетки сохраняют способность вступать в митотическое деление. Остановка деления происходит в метафазе митоза.

Впервые показано, что патология митоза развивается в одинаковой степени в клетках, инфицированных интактным вирусом, при подавлении репликации ДНК ЦМВ, а также при заражении ЦМВ, инактивированным УФ облучением.

Практическая значимость.

На основании полученных данных о распространенности ЦМВ инфицирования среди недоношенных детей с сочетанной перинатальной патологией представлено обоснование для организации лабораторного скрининга в отделениях патологии новорожденных.

Установлено, что для достоверной диагностики ЦМВИ у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста необходимо использование БКМ и ПЦР для исследования различных биологических жидкостей (кровь и моча). Серологические методы диагностики у недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, рекомендованы для уточнения фазы течения инфекции. Показана эффективность определения авидности анти-ЦМВ.

Впервые при изучении динамики маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей в течение первого года жизни доказана необходимость проведения неоднократного вирусологического обследования до года.

У недоношенных новорожденных, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, с клиническими признаками врожденной инфекции обосновано использование Виферона с первых дней жизни.

Применение Виферона у беременных со второго триместра беременности показало возможность более ранней антенатальной коррекции иммунопатологических состояний плода и отсутствие и/или снижение количества рецидивов ГВИ у беременных с ОАГА.

Предложен новый современный метод диагностики аутопсийного материала и плацент - ПЦР in situ, позволяющий оценить количество внутриклеточной ДНК и тканевую тропность, что особенно важно в изучении патогенеза ЦМВИ.

Впервые на представительном материале в системе мать-плацента-плод выявлены основные факторы риска внутриутробного инфицирования плода, патологии и смерти в перинатальном и младенческом возрасте.

Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения.

Результаты работы стали основой ряда документов, применяющихся в практическом здравоохранении: Методические рекомендации «Быстрый культуральный метод диагностики герпесвирусных инфекций», Роспотребнадзор. - №02.030-08. - Москва, 2008. Методические рекомендации по использованию Виферона у недоношенных новорожденных с клиническими признаками ВУИ с первых дней жизни (2009, в печати).

Практические рекомендации используются в работе отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных ГБ №8 КЗ г. Москвы и ДКБ №13 им. Филатова г. Москвы.

Материалы диссертационной работы включены в курс лекций и практических занятий для студентов, клинических ординаторов и интернов кафедры клинической лабораторной диагностики РГМУ, кафедры неонатологии РГМУ, аспирантов и ординаторов НИИ педиатрии НЦЗД РАМН.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Маркеры ЦМВИ у недоношенных маловесных новорожденных с сочетанной врожденной патологией выявляются существенно чаще, чем у доношенных новорожденных. Недоношенные маловесные новорожденные являются группой риска по развитию ЦМВИ на первом году жизни, что диктует необходимость проведения неоднократного вирусологического обследования этих детей.

2. ПЦР in situ - информативный, точный и быстрый метод, открывающий новые возможности в диагностике герпесвирусных инфекций, позволяющий оценить относительное количество внутриклеточной ДНК и тропность вируса к определенным тканям при изучении отпечатков органов. Метод эффективен для диагностики и изучения патогенеза инфекций, вызываемых ЦМВ и ВПГ при фетоинфантильных потерях и летальных врожденных дефектах развития. Верификация инфекционных агентов при мертворождении, при выявлении врожденных пороков развития, несовместимых с жизнью, способствует адекватной терапии женщин с мертворождениями в анамнезе и прогнозированию исходов будущих беременностей.

3. Аминокислотные производные фуллерена Сг,о эффективно подавляют экспрессию поздних структурных белков ЦМВ в зараженных клетках. Синергизм Виферона с АПФ дает основание для разработки принципиально новых схем комбинированной терапии ЦМВИ, позволяющих снизить терапевтические концентрации лекарственных соединений.

4. ЦМВ увеличивает длительность S - периода в инфицированных диплоидных фибробластах легкого эмбриона человека. Клетки, находящиеся в момент заражения в

S - периоде клеточного цикла способны вступить в митоз, но необратимо блокируются в метафазе. 5. Для развития патологии митоза достаточно взаимодействия вирусной частицы с клеточной мембраной и/или проникновения вирусных белков в клетку. Синтез вирусной ДНК не является обязательным условием формирования патологических митозов.

Апробация работы.

Основные положения работы были представлены на 5 международной конференции «Русский журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы» (С.-Петербург, 2000), на Ежегодном конгрессе клинической вирусологии (Glasgow, Шотландия, 2000; Saariselka, Финляндия, 2008); на 11, 12, 13 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2001; 2002; 2003); на 3 Российском научном форуме "Актуальные проблемы акушерства, гинекологии и перинатологии" (Москва, 2001), на 3 Международной конференции "Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем" (Махачкала, 2001), на 5 Международной конференции "Фуллерены и атомные кластеры" (С.-Петербург, 2002), на 8 Съезде всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002), на Международной конференции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины" (Москва, 2002), на Российском конгрессе "Генитальные инфекции и патология шейки матки" (Москва,

2004), на 3, 4 Конгрессе педиатров-инфекционистов "Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей" (Москва, 2004; 2005), на 8 Российском Форуме "Мать и дитя" (Москва,

2005), на 10, 11, 13 Конгрессе педиатров России "Актуальные проблемы педиатрии" (Москва, 2006; 2007; 2009), на Международном конгрессе «Новые технологии в медицине и экспериментальной биологии» (Pattaya-Bangkok, Таиланд, 2007), на VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007), на VI Конгрессе детских инфекционистов России "Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики" (Москва, 2007), на III Ежегодном конгрессе и VI Съезде Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины «Современная перинаталогия: организация, технология и качество» (Москва, 2008).

В завершенном виде доклад по диссертационной работе прошел предварительную экспертизу на совместном заседании Отдела прикладной вирусологии и иммунологии, Отдела молекулярной вирусологии и лаборатории биохимии института экспериментальной ветеринарии и Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ Учреждения РАМН НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН от 14 сентября 2009 года.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 66 научных работ, в том числе 23 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, статей за рубежом - 1, в сборниках международных конгрессов за рубежом - 3, в сборниках материалов международных конгрессов и форумов - 38.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, 6-ти глав с изложением результатов собственных исследований, их обсуждения и выводов. Работа изложена на 285 страницах текста, иллюстрирована 26 таблицами и 46 рисунками. Список цитированной литературы включает 124 отечественных и 325 иностранных источников.

Степень личного участия автора: разработка дизайна обследования беременных женщин, недоношенных новорожденных и материалов аутопсии; изучение влияния ЦМВ на пролиферативную активность клеток и антивирусной активности АПФ; организация работы на всех этапах: от определения возбудителей ВУИ различными методами до систематизации и анализа, а также статистическая обработка результатов проведены лично автором.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Культура клеток. В работе использовали диплоидные фибробласты легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ), полученные из лаборатории клеточных культур, НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН и из Медико-генетического научного ..центра РАМН (Москва). Культуру клеток выращивали в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2мМ L-глутамина, 50мкг/мл гентамицина.

Вирус. Использовали референс штамм ЦМВ человека AD 169, любезно предоставленный доктором D. Emanuel (США). Вирус поддерживали путем пассирования на культуре клеток ФЛЭЧ. Определение инфекционной активности вируса проводили модифицированным методом «черных» бляшек. Очаги инфицированных клеток (бляшек) выявляли иммуноцитохимическим методом с использованием смеси моноклональных антител (МКА) к белкам 1Ер72 и рр65. Окрашенные бляшки идентифицировали и подсчитывали с помощью светового микроскопа. Титр вируса выражали в количестве бляшкообразующих единиц, содержащихся в 1 мл (БОЕ/мл).

Пациенты. Объектами исследования были женщины репродуктивного возраста, беременные и новорожденные дети, а также материалы аутопсии различных органов плодов, умерших новорожденных и детей, умерших на первом году жизни. Объем исследований представлен в таблице 1. Для обследования пациентов использовали комплекс лабораторных методов: ПЦР (HCMV, HSV, Chlam.trach., Мус. gen.,Ureapl., HPV

16/18, Neis.gon., Trich.vag.); ПЦР real time (HCMV); ПЦР in situ (HCMV; HSV); БКМ (HCMV); РИФ (HCMV, HSV, энтеровирусы: Коксаки A 23 серотипов, объединенных в 5 пулов, Коксаки В 6 серотипов (1 пул), энтеровирусы 68-71 серотипов (1 пул), краснуха, вирусы гриппа, парагриппозные вирусы 1-3 серотипов, аденовирусы, Мус. pneum., RSV, Chlam. Pneum.); ИФА; микробиологический посев флоры, патологоанатомические исследования органов и плацент и анализ анамнестических данных матерей умерших детей.

Таблица 1.

Группы Количество обследованных Количество анализов

Ретроспективный анализ анамнестических данных матерей плодов и умерших новорожденных п=705

Скрининговое обследование беременных и небеременных женщин в РИФ с поиском широкого спектра вирусных антигенов п=3796 п=18675

Исследование материалов аутопсии плодов и умерших новорожденных в РИФ с поиском широкого спектра вирусных антигенов п=650 п=9750

Исследование плацент п=181 п=665

Мониторинг включения метаболической терапии (п=260) и Виферона (п=74) в комплексное лечение беременных и небеременных женщин с ОАГА п=260 п=74 п=5980 п=1314

Комплексное обследование доношенных и недоношенных новорожденных детей (п=204), в динамике до года (п=174) п=204 п=2850

Исследование материала аутопсии плодов и детей, умерших на первом году жизни на ГВИ п=135 п=1764

Клинический материал. Объектами исследования у новорожденных служили моча, кровь, слюна и ликвор (по показаниям); в случаях смерти ребенка - отпечатки и лизаты от 3-5 органов. У беременных женщин исследовали кровь, мочу и урогенитальный соскоб.

Выявление возбудителен ВУИ в материалах аутопсии. Выявление возбудителей ВУИ в материалах аутопсии плодов и умерших новорожденных, у которых при жизни или при патологоанатомическом исследовании возникло подозрение на врожденную инфекцию, проводили четырьмя методами: иммуноцитохимическим, быстрым культуральным методом (БКМ), ПЦР и ПЦР in situ. Исследовали материалы аутопсии мозга, сердца, легких, печени, почек, селезенки, тимуса, плаценты. Детекцию антигенов энтеровирусов, краснухи, герпес вирусов, респираторных вирусов, в мазках - отпечатках органов осуществляли прямым и непрямым методом иммунофлюоресценции (РИФ) с помощью антител, разработанных в НИИ гриппа РАМН (ООО «Предприятие по производству диагностических препаратов», Санкт-Петербург). Антигены HSV 1,2 и HCMV определяли с помощью МКА к белкам р72, рр65 и gB HCMV, 4А1 и gB HSV,

полученных ранее в лаборатории клеточной инженерии (НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва). Антигены энтеровирусов выявляли в РНИФ с помощью ПКА (ФГУП «ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН», Москва).

Быстрый культуральный метод (БКМ). Для определения инфекционной активности ЦМВ в клиническом материале использовали количественный вариант БКМ, который проводили согласно Методическим рекомендациям Роспотребнадзора №02.03008 [Москва, 2008]. Для обнаружения ЦМВ использовали МКА к белкам ЦМВ [Макарова и др., 1994]. Выявляющими антителами служили антимышиные антитела, коньюгированные с FITC или коньюгированные с пероксидазой хрена. Подсчет окрашенных клеток проводили на 2,5x105 клеток ФЛЭЧ. Положительные результаты представляли в количестве вирусных частиц (в.ч.) на 0,2 мл клинического материала. Чувствительность БКМ соответствовала активности 5 вирусных частиц в 1 мл [Адиева и др., 2008].

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Выделение ДНК производили с помощью сертифицированных коммерческих наборов «ДНК-сорб-А-М», «ДНК-сорб-В», «ДНК-сорб-С» и «Реамикс» согласно инструкции фирмы-производителя. ПЦР в качественном варианте проводили с помощью коммерческих наборов ООО НПФ Тентех» и ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора согласно инструкции фирмы-производителя. Исследование материалов аутопсии проводили с помощью модифицированного совместно с НПФ "Литех" nested варианта ПЦР. Чувствительность определения ДНК составила 103 молекул вирусной ДНК в 1 мл.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР real time). ДНК ЦМВ из лизированных клеток выделяли с помощью «ДНК-сорб-АМ» ФГУН .ЦНИИЭ Роспотребнадзора. ПЦР - амплификацию проводили с применением набора реагентов для выявления ДНК цитомегаловируса человека (HCMV) в клиническом материале методом ПЦР с гибридизационно - флуоресцентной детекцией «АмгашСенс® CMV-FL» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Детекцию продуктов ПЦР - амплификации в количественном варианте осуществляли при помощи прибора «iQ iCycler» (Bio-Rad, США), согласно рекомендации производителя тест-систем.

Полимеразная цепная реакция in situ (ПЦР in situ). Метод ПЦР in situ был модифицирован и использован для анализа фиксированных препаратов-отпечатков материалов аутопсии и препаратов монослойных культур клеток. В качестве положительных контролей использовали зараженные клетки ФЛЭЧ и Vero. В работе были использованы праймеры, направленные к гену ДНК-полимеразы ВПГ и к консервативному сверхраннему региону ЦМВ. Визуализацию проводили с помощью светового микроскопа. В препаратах от пациентов, инфицированных ВПГ и ЦМВ, наблюдались темно-коричневые точки - метки на поверхности или внутри клеток. Далее

подсчитывали количество клеток, содержащих метку, и общее количество клеток на препарате.

Твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА). Определение антител к ЦМВ классов М и G в сыворотке крови проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА), используя коммерческие тест-системы НПО «Диагностические системы» (Нижний Новгород). Для выявления антител класса IgM использовали тест-систему «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-М», для выявления антител класса IgG «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G. Анализ и интерпретацию результатов осуществляли в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

Авидность антител. Индекс авидности (ИА) специфических IgG к ЦМВ в сыворотке крови определяли с помощью тест-систем «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G Авидность» (НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород). Оценку результатов осуществляли в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ). Клетки ФЛЭЧ, неинфицированные и инфицированные ЦМВ, промывали 0,1 М фосфатно-солевым буфером pH 7,4 и фиксировали. Использовали различные способы фиксации в зависимости от поставленных задач: для анализа препаратов при пероксидазном окрашивании фиксировали абсолютным метанолом в течениеЮ мин при -20°С; для РНИФ - охлажденным ацетоном в течениеЮ мин при +4°С; для анализа морфологии клеток - 3% параформальдегидом на фосфатном буфере в течение15 мин при комнатной температуре с последующей обработкой 0,1% раствором Тритона Х-100 на буфере PBS в течение 8 мин.

На фиксированные препараты наносили моноклональные антитела (МКА) и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Затем клетки промывали буфером PBS и инкубировали с антителами, конъюгированными с флуорохромом ФИТЦ в течение 30 минут при 37°С, с пероксидазой хрена - в течение 1 часа при 37°С (DakoCytomation, Дания). Для окраски хроматина ядер использовали флуорохром DAPI в концентрации 1мкг/мл. После окраски стекла заключали в глицерин или в мовиол. Препараты анализировали с помощью флюоресцентного/светового микроскопа Olympus ВХ - 51 (Япония), оснащенного объективами 4х, 10х, 40х и цифровой камерой Olympus U-CMAD3.

Иптерфероновый статус. Изучение интерферонового статуса проводили в лаборатории онтогенеза и коррекции системы интерферона НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (зав. лаб. - д.б.н., проф. В.В. Малиновская). Концентрации альфа-ИФН и гамма-ИФН определяли методом твердофазного ИФА. Для альфа-ИФН использовали тест-систему производства ООО «Протеиновый контур» (С.Петербург, Россия), для тестирования гамма-ИФН применяли набор реагентов Biosource

№>!□ (Бельгия). В качестве индукторов использовали: для альфа-ИФН - вирус болезни Ньюкасла (ВБН), для гамма-ИФН - ФГА. Чувствительность тест-систем для иммуноферментного определения альфа-ИФН составляла 5 пкг/мл, для определения гамма-ИФН - 3 пкг/мл.

Определение цитотоксичности производных фуллерена. Цитотоксичность определяли по влиянию на жизнеспособность клеток ФЛЭЧ, которую оценивали методом исключения витального красителя трепанового синего. Цитотоксичность (ЦД) характеризовали как концентрацию каждого из тестируемых соединений, вызывающую гибель подавляющего большинства клеток или 50% клеток в популяции (ЦДУ5 и ЦД50, соответственно) на 4-е сутки после внесения АПФ - так называемая хроническая цитотоксичность или (ЦДзо). Определяли также концентрацию, вызывающую гибель 50% клеток в течение 24 часов, соответствующую острой цитотоксичности (ОЦДщ).

Пролнферативная активность клеток ФЛЭЧ в присутствии АПФ. Влияние АПФ на репликацию ДНК ФЛЭЧ анализировали методом радиоавтографии. Клетки ФЛЭЧ вносили в 24-луночные панели в низкой концентрации (6х104кл./мл). На следующий день после посадки вносили АПФ в различных концентрациях. Через 24, 48 и 72 часа инкубации вносили в культуральную жидкость радиоактивно меченый тимидин (3Н-ТД). За 50% -ую ингибирующую дозу (ИД50) принимали концентрацию препарата, вызывающую 50% подавление включения радиоактивного тимидина в ДНК клеток_

Определение антивирусной активности АПФ. Для определения анти-ЦМВ активности использовали три схемы воздействия АПФ: лечебную, профилактическую и вирулицидную.

Лечебная схема. Монослой клеток заражали вирусом с различной множественностью инфицирования (1,0 БОЕ/кл. - 0,001 БОЕ/кл). После адсорбции в течение 1 часа при°07дважды промывали и вносили поддерживающую среду, содержащую 2% сыворотки и аминопроизводные фуллерена в различных концентрациях.

Профилактическая схема. На клеточный монослой вносили среду поддержки, содержащую АПФ в различных концентрациях, и инкубировали в течение 24 часов. После обработки клетки дважды промывали и заражали вирусом с различной множественностью инфицирования (1,0 БОЕ/кл. - 0,001 БОЕ/кл) в течение 1 часа при 37°С. Монослой клеток дважды промывали и вносили среду поддержки.

Вирулицидная схема. Вирус с МИ 0,01 БОЕ/кл инкубировали совместно с АПФ в различных концентрациях в течение 1 часа при 37°С. Затем вирус, инкубированный с АПФ, наносили на монослой клеток и выдерживали в течение 1 часа. Монослой клеток дважды промывали и вносили среду поддержки.

Антивирусную активность во всех схемах оценивали по способности ЦМВ к бляшкообразованию и по цитопатогенному действию вируса (ЦПД). Концентрацию вещества, вызывающую подавление ЦПД вируса на 50% по отношению к контролю, принимали за 50%-ую эффективную дозу (ЭД50). ХТИ или индекс селективности (ИС), рассчитывали как отношение концентрации препарата, вызывающей клеточную деструкцию (ЦД50) или снижающую синтез клеточной ДНК на 50% (ИД5о), к концентрации, вызывающей 50% антивирусный эффект (ЭД50).

Определение продукции ипфекционно активного вируса. Для определения влияния АПФ на репродукцию ЦМВ клетки заражали вирусом с МИ 0,1 БОЕ/кл. и 0,01 БОЕ/кл. После адсорбции вносили АПФ в различных концентрациях. При развитии в контроле (без АПФ) 100%-ого ЦПД отбирали культуральную среду из опытных и контрольных культур и заражали неинфицированные клетки ФЛЭЧ, которые культивировали в среде Игла с 2% сыворотки без АПФ. Об активности вируса судили по цитопатогенному действию в динамике инфекционного процесса.

Изучение динамики накопления ДНК ЦМВ методом ПЦР в реальном времени. Монослой ФЛЭЧ заражали ЦМВ с МИ 0,01 БОЕ/кл. После адсорбции вируса вносили изучаемые вещества в соответствующей концентрации. На 4, 7 и 10-е сутки осадок клеток обрабатывали лизирующим буферным раствором и исследовали методом ПЦР real-time.

Радиоавтография. В клетки ФЛЭЧ, выращенные на покровных стеклах в 24-луночных панелях, вносили радиоактивно меченый 3Н-ТД на 1 час в концентрации 1 мкКю/мл для включения в реплицирующуюся ДНК. Фиксацию проводили через различные интервалы времени смесью этилового спирта и концентрированной уксусной кислоты в соотношении 3:1 в течение 40 минут. Затем стекла с клетками обрабатывали холодной 5% трихлоруксусной кислотой 3 раза в течение 5-10 минут для удаления невключившегося предшественника и промывали водой. После высушивания на воздухе покровные стекла монтировали на предметные стекла клетками вверх. Все препараты с радиоактивной меткой покрывали фотоэмульсией типа М (НИИ химфотопроект, Москва) и экспонировали в течение 6-7 дней в темноте. Проявляли амидоловым проявителем и окрашивали гематоксилином Карацци.

Статистическая обработка. Для статистической обработки полученных результатов использовали пакет программ Statistika V6.0. Статистическую значимость межгрупповых различий оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни, Вилкоксона и по t-критерию для независимых выборок с неравными дисперсиями. Анализ различия частот встречаемости маркеров ГВИ в группах пациентов проводили с помощью точного критерия Фишера и Хи-квадрат. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Для изучения перинатальных факторов риска инфицирования плода, патологии и смерти в перинатальном и младенческом возрасте был проведен ретроспективный анализ анамнестических данных матерей 705 плодов и умерших новорожденных. Было установлено, что всего 35% матерей считали себя практически здоровыми. Даже среди матерей до 20 лет, где были и подростки, здоровых было только 51,2%. С увеличением возраста матерей количество здоровых снижалось, и уже в возрасте от 25 до 30 лет их оказалось достоверно меньше (40%; р<0,001), чем среди молодых матерей (до 20 лет), а среди женщин старше 30 лет здоровыми себя считали только 20,9%. Подавляющее большинство имели те или иные хронические болезни, среди которых наиболее частыми были болезни мочеполовой системы.

У большинства матерей умерших был ОАГА. В анамнезе у женщин было отмечено большое количество искусственного прерывания беременности. Даже у женщин до 20 лет их количество составило 12,8%. С увеличением возраста женщин количество искусственного прерывания беременности значительно увеличивалось, и у женщин старше 30 лет их количество достигло 69,6% (по 2 и более раз). Кроме искусственного прерывания беременности в анамнезе отмечались выкидыши, мертворождения, замершая беременность, смерть ребенка в раннем неонатальном периоде, в том числе и у женщин моложе 20 лет. Настоящая беременность и роды независимо от возраста практически у всех (94%) протекали с обострением хронических болезней, с острыми респираторными заболеваниями, с различными осложнениями (анемия, угроза прерывания часто на протяжении всей беременности, маловодие, многоводие, длительный безводный промежуток, слабость родовой деятельности, стремительные роды), которые могли стать причиной острой или хронической гипоксии плода. В подавляющем большинстве случаев женщины не проходили предгравидарную подготовку.

Скрининговое вирусологическое исследование 3796 небеременных и беременных женщин показало значительную инфицированность различными возбудителями, в том числе герпесвирусными инфекциями. Клетки осадка мочи исследовали на наличие антигенов вирусов Коксаки А, В, энтеровирусов 68-71 типов, ВПГ 1 и 2 типов, ЦМВ и краснухи в РИФ. Установлено, что в клетках осадка мочи у женщин выявляется смешанная вирусная инфекция. Одним из компонентов смешанной инфекции является один, а чаще всего два и более энтеровирусов. Энтеровирусы были выявлены до 90% случаев (в том числе, антигены Коксаки В - в 38% случаев, антигены энтеровирусов 6871 серотипов - у 40%), антигены вируса краснухи были обнаружены у 19-23% обследованных. Частота определения антигенов ВПГ составила 11-13%. В 7,8% случаев в обеих группах была выявлена папиломавирусная инфекция, ВПЧ преимущественно 16

типа. Важно отметить, что ЦМВ был обнаружен в 19,1% случаев у небеременных женщин и значительно чаще у беременных женщин (26,2%; р=0,001).

При гистологическом исследовании 150 плацент как мертворожденных, так и 31 последа при рождении живых новорожденных то или иное поражение плаценты и/или пуповины выявлено в 100% случаев. Чаще всего выявлялась гипоплазия плаценты (79%), в 51,3% - морфологическая незрелость; в том числе в 76% случаев - патологическая незрелость. Кроме того, выявлены преждевременное старение плаценты, кровоизлияния, тромбоз сосудов, флебит пупочной вены, краевое прикрепление, абсолютно короткая или длинная пуповина, тощая пуповина, хроническая фетоплацентарная недостаточность.

В плаценте и пуповине выявлялись различные воспалительные изменения (базальньш и париетальный децидуит, интервиллузит, хориоамнионит, фуникулит, мембранит), которые достоверно чаще отмечались в случаях преждевременных родов, чем при родах в срок (68,6% и 39,4%, р<0,001).

Изменения в плаценте имели как альтеративно-продуктивный, так и гнойный характер, в ряде случаев с некрозом. Некротические изменения возникали при инфицировании плаценты вирусными и бактериальными агентами. При выборочном исследовании методом ПЦР 34 плацент от мертворожденных и 30 плацент от живорожденных ДНК ЦМВ была выявлена в 14 случаях у мертворожденных и в 1 случае от живорожденных. ДНК ВПГ была выявлена в 10 случаях у мертворожденных и ни в одном случае у живорожденных.

Одним из косвенных показателей внутриутробного инфицирования являются различные изменения в тимусе. Изучение частоты выявленных изменений в тимусе у доношенных и недоношенных плодов и детей, умерших на первом году жизни показало, что частота изменений в тимусе зависит от срока гестации. У доношенных плодов частота выявленных изменений в тимусе была в два раза больше (66,7% и 32,4%; р<0,001), чем у недоношенных вследствие более длительной антигенной стимуляции в антенатальном периоде. С увеличением возраста количество умерших с наличием изменений в тимусе увеличивается. У умерших на первом году жизни частота выявленных изменений в тимусе у доношенных и недоношенных была практически одинаковой (89,5% и 80,3%). При выборочном вирусологическом исследовании отпечатков тимуса 60 умерших в 48 (80%) были выявлены антигены различных вирусов, в том числе ЦМВ - в 9 (15%) случаях, ВПГ - в 4 случаях, что составило 6,7%.

После проведения патологоанатомических исследований ВУИ была диагностирована у 69,2% умерших в пери - и неонатальном периодах и у 53,5% умерших на первом году жизни. ВУИ носила характер как острого инфекционного заболевания, клинически протекающего как менингоэнцефалит, пневмония, миокардит, гепатит, панкреатит, так и

имела хроническое персистирующее течение с формированием множественных эмбриофетодисплазий, стигм дизэмбриогенеза и пороков развития. Острое течение ВУИ в период новорожденности отмечалось в 13,1% случаев. При этом у недоношенных остро текущий инфекционный процесс был отмечен в 20% случаев, а у доношенных в 3% (р<0,001). У умерших на первом году жизни в подавляющем большинстве случаев инфекция имела хронический персистирующий характер без выраженных воспалительных изменений.

Таким образом, значительное ухудшение состояния женщин с возрастом, многочисленные аборты, отсутствие предгравидарной подготовки и инфекционные заболевания, в числе которых ЦМВИ занимает существенное место, являются факторами риска перинатального инфицирования плода, патологии и смерти в перинатальном и младенческом возрасте. Вышеперечисленные факторы приводят к хроническому кислородному голоданию, обострению эндогенной инфекции, поражению плаценты, развитию хронической фетоплацентарной недостаточности и инфицированию плода и к преждевременным родам.

Разработка алгоритма диагностики ЦМВИ у новорожденных детей с осложненным течением раннего неонаталыюго периода. Недоношенные новорожденные представляют особую группу риска по развитию внутриутробной ЦМВИ, однако до настоящего времени нет общепринятого алгоритма диагностики ЦМВИ у новорожденных детей с признаками ВУИ. В связи с этим были обследованы 204 новорожденных ребенка, родившихся в ГБ №8 Департамента здравоохранения города Москвы. Обследованные дети были разделены на 4 группы: первую группу (группа 1) составили недоношенные новорожденные (п=107) с гестационным возрастом (ГВ) 29,8±2,8 недель с клиническими признаками ВУИ. Во вторую группу были включены недоношенные новорожденные дети без клинических признаков ВУИ (18 детей, ГВ - 34,6±1,2 недель). Контрольную группу (группа 3) составили доношенные новорожденные дети без признаков ВУИ (32 ребенка, ГВ -38,9±0,8 недель). Анализ частоты выявления маркеров ЦМВ у детей у детей первых трех групп был проведен в первую неделю жизни. Четвертую группу составили 47 детей с признаками ВУИ, впервые обследованные в возрасте 1-3 месяцев. Ребенка рассматривали как инфицированного, если маркеры ЦМВИ были обнаружены, по крайней мере, в одном из полученных от него образцов клинического материала. Данные по частоте выявления маркеров ЦМВИ приведены в таблице 2.

Анализ показал, что ДНК ЦМВ была выявлена во всех группах, в том числе доношенных и недоношенных новорожденных без признаков ВУИ. Наиболее часто ДНК ЦМВ выявлялась в 4-й группе, даже значительно чаше (р<0,001), чем у новорожденных с ВУИ, обследованных на первой неделе жизни.

Таблица 2. Выявление прямых маркеров ЦМВИу ноеорозкденных детей.

Группы детей ДНК (ПЦР) Инфекционно активный вирус (БКМ)

группа 1 недоношенные с ВУИ (п=107) 17(15,9%) 18 (16,8%)

группа 2 недоношенные без ВУИ (п=18) 1 (5,6%) 0 (0%)

группа 3 доношенные (п=32) 2 (6,3%) 0 (0%)

группа 4 дополнительная (п=47) 22 (46,8%) 14 (29,7%)

Инфекционно активный вирус был выявлен только у детей с ВУИ и ни в одном случае во 2 и 3 группах. Более частое выявление ДНК и инфекционно активного вируса в 4 группе может свидетельствовать об обострении врожденной инфекции или о постнатальном инфицировании.

Если учитывать результаты обследования двумя методами, то ДНК и/или инфекционно активный вирус у новорожденных с ВУИ, обследованных на первой неделе жизни, был выявлен у 28 из 107 обследованных (26,2%), то есть на 9-10% чаще, чем каждым методом отдельно. Таким образом, обследование двумя метода повышает эффективность лабораторной диагностики.

При анализе выявления маркеров ЦМВИ в различных биологических средах было установлено, что наиболее часто инфекционно активный ЦМВ выявлялся в моче (14,5%), а в крови только в 1% случаев. ДИК ЦМВ в моче выявлялась в 18,7%, и несколько реже -в крови 13,3%. Суммарно тем или другим методом в моче ЦМВ обнаружен в 41% случаев, в слюне - в 27%, в крови и в ликворе у 14-18% детей с признаками ВУИ. Наши данные согласуются с результатами других исследователей, которые показали, что в моче ЦМВ обнаруживается в количествах в 180 раз больших, чем в крови [Halwachs-Baumann G., 2002]. В целом ДНК ЦМВ выявлялась в 12,4% (88 / 710), а инфекционно активный вирус -в 7,3% (52 /710). Выявленные различий достоверны (р=0,003).

Данные количественного изучения ЦМВ во всех положительных образцах показали,

что большая часть образцов, в которых был обнаружен инфекционно активный ЦМВ,

содержали по 10-50 вирусных частиц; максимальные значения достигали 5000 вирусных

частиц. Это свидетельствует о большой вирусной нагрузке при инфицировании

недоношенных новорожденных. Сходная тенденция была выявлена в результате анализа

ДНК. У детей с признаками ВУИ вирусная нагрузка и инфекционная активность ЦМВ

были достоверно выше по сравнению с контрольной группой. Прямая корреляция между

величиной вирусной нагрузки и интенсивностью клинических симптомов при врожденной

ЦМВИ была недавно установлена в работе исследователей США [Arav-Boger R., Pass R., 2007].

Для выяснения связи между данными БКМ и ПЦР был проведен анализ относительного количества ДНК в клинических образцах методом ПЦР - RT. Вычисляли значение порогового цикла Ct для каждого образца путем определения точки, при которой флюоресценция превышала фоновое значение; затем сравнивали результаты для проб, в которых с помощью БКМ была обнаружен инфекционно активный ЦМВ, с результатами для проб, отрицательных по БКМ. Анализ показал, что в образцах, положительных по данным БКМ, вирусная нагрузка была достоверно больше, чем в пробах, отрицательных по результатам БКМ. Данные настоящей работы совпадают с результатами исследователей, изучавших прямые маркеры герпесвирусных инфекций методами ПЦР -RT и БКМ [J.van Doornum G., 2003].

Изучение показателей специфического гуморального иммунитета у новорожденных детей (выявление антител классов IgG и IgM и определение индекса авидности специфических антител) представлено в таблице 3.

Таблица 3. Результаты обследования новорожденных детей с помощью серологических методов.

Выявление Выявление Авндность анти-ЦМВ-IgG-AT

Группы детей анти-ЦМВ анти-ЦМВ (ИА)

IgM-AT IgG-AT <0,6 >0,6

1-я 0,93% 91,6% 38,6% 61,4%

(основная) (1/107) (98/107) (32/83*) (51783*)

2-я 0% 83,3% 33,3% 66,7%

(сравнения) (0/18) (15/18) (5/15*) (10/15*)

3-я 0% 90,6% 13,8% 86,2%

(контрольная) (0/32) (29/32) (4/29*) (25/29*)

4-я 23,4% 80,9% 33,3% 66,7%

(дополнительная) (11/47) (38/47) (12/36*) (24/36*)

* авидность ДО определяли только у детей, у которых было достаточно материала и в сыворотках крови которых были выявлены АТ к ЦМВ класса ^й;

Анализ показал, что у подавляющего большинства детей всех групп присутствовали антитела класса IgG. У 1 ребенка из основной группы на первой неделе жизни были идентифицированы маркеры острого инфекционного процесса - анти-ЦМВ-IgM. Невысокая частота выявления анти-ЦМВ класса IgM у новорожденных детей отмечалась и другими авторами [Nelson et.al., 1997]. В 4-й группе (впервые обследованные в 1-3 мес.) показатель частоты выявления анти-ЦМВ IgM составил 23,4% (р<0,001). Важно отметить, что у 9 из 11 детей с анти-ЦМВ-IgM антитела класса G отсутствовали, но были выявлены ДНК и инфекционно активный вирус.

Оценка авидноети IgG-AT показала, что у большинства обследованных во всех группах были выявлены высокоавидные AT. Антитела с низким или промежуточным значением ИА выявлялись практически с одинаковой частотой у детей с ВУИ и в группах сравнения. В контрольной группе была отмечена наиболее низкая частота выявления низкоавидных антител (13,8%; р=0,026). Необходимо отметить, что у 65,4% детей с ВУИ, в крови которых AT класса IgG отсутствовали, либо обладали ИА<0,6, были выявлены прямые маркеры ЦМВ.

При количественном анализе IgG анти-ЦМВ в группе детей с признаками инфицирования (группа 1 и 4) выявлялись антитела с низкой концентрацией достоверно чаще, чем в группах без ВУИ (р<0,05).

Анализ прямых и непрямых маркеров ЦМВИ (рис. 1) при оценке риска развития инфекционного процесса у новорожденных детей показал, что в группе инфицированных детей ДНК и инфекционно активный вирус выявляются в больших количествах, антитела IgG - в низкой концентрации и с низким индексом авидноети. У детей без признаков инфицирования инфекционный вирус не выявляется, ДНК вируса обнаруживается в низких количествах и в небольшом проценте случаев (5-6%). IgG антитела характеризуются высокой концентрацией и ИА>60.

Наличие низких концентраций материнских типоспецифических нейтрализующих антител у новорожденных детей увеличивает риск постнатального инфицирования ребенка [Hill J. and Roberts S., 2005]. Необходимо учитывать, что у недоношенных новорожденных детей доля антител, обладающих нейтрализующими свойствами, зависит от гестационного возраста. Так, только к 34-й неделе гестации 99% нейтрализующих материнских антител обнаруживаются в периферической крови плода [Karen et.al., 2006]. Это указывает на то, что специфическая диагностика ЦМВИ при оценке риска развития активного инфекционного процесса у новорожденных детей, особенно у недоношенных, требует использования комплекса лабораторных методов.

Изучение маркеров в динамике показало, что через 1-3 месяца после рождения у 19,2%, отрицательных при первичном обследовании, вирус был обнаружен впервые, а через 4-7 мес. еще у 11,5% детей, отрицательных по ЦМВ при рождении впервые появились прямые маркеры ЦМВИ. Эти данные свидетельствуют о том, что для достоверной диагностики ЦМВИ необходимо неоднократное обследование.

Таким образом, на первом году жизни у недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ в 65,4% случаев в разные сроки были выявлены прямые маркеры ЦМВИ, что согласуется с результатами других исследований [Maschmann et.al., 2001; Меджидова и др., 2005], подтверждающими высокий риск развития ЦМВИ у этой группы новорожденных детей. Следует отметить, что в целом при повторных исследованиях количество вирусной нагрузки увеличивалось. Это может быть связано с инфицированием в неонатальном периоде при вскармливании грудным молоком

[Lawrence et.al, 2006], а также с отсроченным проявлением внутриутробной бессимптомной ЦМВИ, которое отмечалось рядом авторов [Barbi et.al., 2003; Maligner et.al., 2003].

Частота выявления серологических показателей и вирусных маркеров в динамике у 75 недоношенных детей с ВУИ из 1-й группы представлена на рисунке 2.

Изучение маркеров в динамике показало прямую корреляцию между обнаружением или отсутствием ЦМВ и серологическими показателями. При активации ЦМВИ в 68,4% случаев при повторном исследовании происходило либо выведение высокоавидных (по всей видимости, материнских IgG-AT), появление собственных низкоавидных IgG-AT с ИА<0,6 (52,6%), либо резкое снижение активности IgG-AT и выявление анти-ЦМВ IgM (15,8%). Это и могло служить основной причиной обнаружения ЦМВ в клинических материалах и развития ЦМВИ при последующих исследованиях. В 75% случаев элиминация вируса сопровождалась появлением собственных анти-ЦМВ IgG или сменой низкоавидных IgG-AT (50%) на высокоавидные или повышением активности IgG антител в несколько раз (25%).

Известно, что низкоавидные антитела циркулируют в периферической крови приблизительно в течение 20 недель после первичной инфекции, затем авидность IgG-AT увеличивается и остается высокой в течение всей жизни [Lazzarotto Т., 2008].

За время проведения исследования в 1-й группе отмечено 12 летальных.исходов (11,2%); при этом у 7 из 12 детей (58,3%) были выявлены прямые маркеры ЦМВИ. В контрольной группе летальных исходов не было.

Для анализа частоты выявления ЦМВИ в различных органах было исследовано 147 органов от 47 мертворожденных и 252 органа от 88 умерших, умерших на первом году жизни. Патологоанатомические исследования проводились сотрудниками кафедры патологической анатомии (зав. кафедрой - д.м.н., проф. Талалаев А.Г.) и патологоанатомами прозектуры Морозовской больницы (зав. отделением - Каск Л.Н.). Данные представлены в таблице 4.

При патологоанатомическом исследовании у умерших были выявлены признаки врожденной генерализованной вирусной инфекции, которая проявлялась как различными воспалительными изменениями (менингит, энцефалит, гепатит, миокардит, пневмония и др.), так и фетодиспластическими изменениями и/или с пороками развития органов. Анализ показал, что ЦМВ выявляется практически во всех исследованных органах: легкие, сердце, печень, почки, мозг. При этом в материалах аутопсии обнаружены как ДНК вируса (ПЦР), так антигены (РНИФ) и инфекционно активный ЦМВ (БКМ).

Таблица 4. Выявление ЦМВ в различных органах у мертворожденных и детей, умерших в течение первого года жизни.

Изученные органы Мертворожденные Дети, умершие на первом году жизни

Общее число проб (п) Число положительных проб Р Общее число проб (п) Число положительных проб

мозг 41 9(21,9%) р=0,33 61 20 (32,8%)

печень 37 7(18,9%) р<0,02 55 25 (45,5%)

легкое 33 5 (15,2%) р<0,0001 48 44(91,6%)

почка 27 7 (25,9%) р<0,03 43 24 (55,8%)

сердце 9 1 (11,1%) р=0,87 45 9 (20,0%)

Всего 147 29 (19,7%) р<0,0001 252 122 (48,4%)

В целом у умерших на первом году жизни маркеры ЦМВ обнаруживались значительно чаще, чем у мертворожденных (48,4% против 19,7%, р<0,0001), в том числе и инфекционно активный вирус (р<0,05). Если говорить о суммарном выявлении прямых маркеров ЦМВИ хотя бы одним из методов в любом из исследованных органов, то у детей, умерших на первом году жизни ЦМВ был обнаружен в 61,5% случаев, в случаях мертворождения - в 35,4% случаев.

Более частое выявление ЦМВ в материалах аутопсии детей, умерших на первом году жизни, может свидетельствовать о реактивации врожденной инфекции (учитывая положительные результаты быстрого культурапьного метода, который позволяет выявить инфекционно активный вирус). Но при этом нельзя исключить и факт постнатального инфицирования.

Проведенное вирусологическое исследование отпечатков органов мертворожденных и плацент с использованием сывороток к широкому спектру антигенов показало совпадение частоты выявления одних и тех же возбудителей в 82% случаев. При параллельном исследовании отпечатков органов умерших и клеток осадка мочи их матерей вскоре после мертворождения или смерти ребенка в раннем неонатальном периоде ВПГ и ЦМВ существенно чаще (р=0,002) выявлялись у плодов и умерших в течение первых суток новорожденных, чем в клетках осадка мочи их матерей, что может свидетельствовать об активном инфекционном процессе в организме плода.

Выявленные изменения в тканях и органах плодов и умерших детей в подавляющем большинстве случаев являются следствием ассоциированного (одновременного или последовательного) инфицирования различными возбудителями в разные сроки гестации.

В подавляющем большинстве случаев у плодов и умерших новорожденных выявлялась смешанная вирусная инфекция.

Если учитывать только результаты выявления герпесвирусных инфекций, то смешанная ВПГ и ЦМВ инфекция одновременно у мертворожденных была выявлена в 45,4%, тогда как, у умерших на первом году жизни в 86%. То есть частота смешанной ВПГ и ЦМВ инфекции с увеличением возраста умерших детей существенно возрастает (р=0,001).

Нами был впервые использован метод ПЦР in situ для выявления ЦМВ в отпечатках органов. Метод ПЦР in situ был разработан на основе двух методов - метода полимеразной цепной реакции и метода гибридизации in situ и сочетал в себе их достоинства: высокую чувствительность с возможностью морфологического исследования. Сравнительный анализ эффективности различных лабораторных методов показал, что метод ПЦР in situ обладает не меньшей чувствительностью по сравнению с классическим методом ПЦР. Анализ количества инфицированных клеток в препаратах методом ПЦР in situ показал, что наиболее интенсивно накопление ДНК ЦМВ происходит в тканях мозга и почек.

Таким образом, для повышения эффективности диагностики врожденной ЦМВИ и прогноза ее развития у недоношенных новорожденных детей необходимо использовать комплекс методов, в том числе определение авидности анти-ЦМВ; при вирусологическом обследовании недоношенных детей с признаками ВУИ недостаточно однократного изучения клинических материалов на первой неделе жизни. У большинства новорожденных ЦМВ элиминировал к 1-3 мес. жизни; в ряде случаев вирус впервые обнаруживался лишь через 1-3 мес. после рождения или в возрасте 4-7 мес. Предпочтительным объектом скринингового исследования для диагностики внутриутробной ЦМВИ является моча, в которой вирус накапливается чаще всего и в больших количествах, чем в других клинических материалах; выявление высокоавидных антител к ЦМВ имеет положительное прогностическое значение, так как у большинства обследованных детей в динамике оно сопровождалось отсутствием выявления прямых маркеров ЦМВ. Отсутствие анти-ЦМВ или присутствие низкоавидных антител к ЦМВ имеют отрицательное прогностическое значение, так как ассоциируются с появлением маркеров ЦМВ через 1-6 месяцев после рождения; метод ПЦР in situ обладает не меньшей чувствительностью по сравнению с классическим методом ПЦР и позволяет оценить не только интенсивность синтеза вирусной ДНК, но также выявить индивидуальную внутритканевую и внутриклеточную локализацию вирусов.

С учетом вышеизложенного, предлагается следующий алгоритм лабораторного обследования недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ и материала аутопсии плодов и умерших детей:

- анализ мочи на 1-й неделе жизни (до 3 недель жизни) методом БКМ для выявления внутриутробной ЦМВИ;

- исследование клинических материалов в динамике через 1, 3 и 6-7 месяцев после рождения для установления возможной реактивации ЦМВИ и развития инфекции у недоношенных новорожденных детей с ВУИ;

- определение активности и авидности специфических антител класса IgG в совокупности с определением прямых маркеров ЦМВ для оценки риска развития активного инфекционного процесса у новорожденных детей;

- при обнаружении ЦМВ в клинических материалах БКМ в количествах, превышающих по инфекционной активности 10-50 и более вирусных частиц в 1 мл, оценивать необходимость использования терапевтических средств;

- использование молекулярно-биологических методов, основанных на выявлении ДНК (ПЦР и ПЦР in situ) для установления этиологического агента и изучения патогенеза ЦМВИ в материалах аутопсии.

В 76,5% случаев у недоношенных детей с подозрением на ВУИ диагноз был подтвержден на первой неделе жизни. При этом ВУИ вирусной этиологии встречалась значительно чаще, чем бактериальной (34,6% против 18,5%). У недоношенных новорожденных с клиническими признаками ВУИ показатели индуцированной продукции альфа-ИФН и гамма-ИФН значительно варьировали и потому особый интерес представлял вопрос о влиянии лечения Вифероном на интерфероновый статус недоношенных новорожденных с признаками ВУИ при рождении (Рис.3).

Анализ уровней ИФН-альфа и ИФН-гамма до лечения и через 1 - 2 месяца после лечения был проведен при обследовании 30 детей. Было установлено, что уровни сывороточного и спонтанного альфа-ИФН были низкими и не различались до и после лечения (медианы 5 пкг/мл).

В связи с высокой вариабельностью значений индуцированного альфа-ИФН дети данной группы были разделены на 2 подгруппы: в подгруппу 1А (п=13) вошли дети с исходно высоким уровнем (>100 пкг/мл) индуцированного альфа-ИНФ, в подгруппу 1Б (п=17) - с низким уровнем цитокина (<100 пкг/мл) до лечения.

Количественный анализ альфа-ИНФ показал, что в подгруппе 1А в результате базового лечения с применением Виферона уровень альфа-ИНФ снижался в 4 раза. В подгруппе 1Б выявлено увеличение уровня индуцированного альфа-ИНФ, который приближался к уровню в контрольной группе. У детей без Виферона уровни альфа-ИНФ

РИС. 1. Частота выявления прямых и непрямых маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных.

100 90

гй 80

0 70 о.

И 60 О-

1 50

| 40

ш 30

с:

со

к 20 л

т 10

0,7 - 4,5 Ед/мл

ИА 0,6

I ■

инфек. вирус ДНК конц. авидность ДО

■ новорожденные без ВУИ новорожденные с ВУИ

РИС. 2. Динамика выявления серологических маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей.

РИС. 3. Изменение уровня индуцированного альфа-ИФНу новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ в результате базового лечения с применением Виферона.

180

140 120

100 80

Г I

Подгруппа 1А

Подгруппа 1Б Подгруппа 1В Контроль

до лечения через 1-2 мес. после лечения

По вертикали - значения медианы альфа-ИФН, пкг/мл; По горизонтали - недоношенные новорожденные дети с ВУИ: подгруппа А - дети с исходно высоким уровнем альфа-ИФН, получавшие базовое лечение с Вифероном; подгруппа Б - дети с исходно низким уровнем альфа-ИФН, получавшие базовое лечение с Вифероном; подгруппа В - дети, получавшие базовое лечение без Виферона; контроль - здоровые доношенные дети.

РИС. 4. Частота обнаружения маркеров ГВИу беременных женщина на различных сроках беременности.

12-16 не д.

26-32 нед.

37-39 нед. гестации

■ суммарное выявление маркеров ГВИ первичное выявление маркеров ГВИ

РИС. 5. Динамика выявления белка gB в ЦМВ-инфицированных фибробластах человека в присутствии различных химиопрепаратов.

число клеток, окрашенных МКА, % 40

— ф- контроль

• фоскарнетЗЗОмкМ ■ -А ■ ■ ганцикловир 2,5 мкМ

— С60-Ыа-АКК

—-СбО-Ыа-АМК

5 время после заражения, дни

-V / У *

' . Г/ V

У />' -Л

Клетки окрашены МКА к белку gB ЦМВ: а - контроль инфицированных клеток без АПФ; б - инфицированные клетки, культивированные в присутствии АПФ.

РИС.6. Включение ЗН - тимидина в ядра клеток ФЛЭЧ, инфицированных в Со - периоде.

контрольная культура

время после выхода из 00, часы ЦМВ-инфицированная культура

РИС. 7. Включение ЗН - тимидина в ядра клеток ФЛЭЧ, инфицированных в 5 - периоде.

£ ^.25

I £'20 £ 5

& ? 15

3 = «"10

О 6 12 18 24 30 36 42 54 60..........96 ------ 102

время после стимуляции из СО, часы ►—контрольная кулыура —инфицированная культура

РИС. 8. Митотический индекс в культуре клеток ФЛЭЧ, инфицированных в 5 - периоде клеточного цикла.

-неинфицированная культура норм.митозы в инфиц. культуре

время после выхола ич О

инфицированная культура ь — патолог, митозы в инфиц. культуре

фактически не изменялись. Полученные данные свидетельствуют об иммунокорригирующем действии Виферона. Оно проявлялось в разнонаправленном изменении уровней индуцированной продукции альфа-ИФН лейкоцитами недоношенных детей.

Результаты повторного обследования детей представлены в таблице 5.

Таблица 5. Результаты повторного исследования биологических среду детей методом БКМ на ЦМВ и ВПГ.

Базисная терапия + Виферон Базисная терапия

Элиминация вирусов 38,5% 23,1%

Снижение кол-ва ЦМВ и ВПГ 30,8% -

Прежнее кол-во ЦМВ и ВПГ 30,7% 76,9%

Положительная динамика 69,3% 23,1%

Исследование показало, что при применении базисной терапии элиминация вирусов отмечена в 23,1%, а при включении Виферона - в 38,5%. В целом, при использовании Виферона в 69,3% случаев у недоношенных детей обнаружена положительная динамика (снижение количества инфекционного вируса или его элиминация), тогда как при базисной терапии - только в 23,1% случаев.

Совместно с д.м.н., проф. Дегтяревой М.В. для оценки эффективности действия Виферона дополнительно были обследованы две группы детей с ВУИ при различных жизнеугрожающих состояниях неонатального периода. Первую группу составили недоношенные новорожденные (п=241) с клиническими признаками ВУИ, получавшие Виферон в дополнение к базовой терапии. Во вторую группу (п=108) были включены дети, получавшие только базовую терапию. Анализ показателей смертности при всех изученных патологических состояниях показал, что уровни летальности между группами леченых и не леченых Вифероном детей в большинстве случаев различались в 2-3 раза.

В таблице 6 представлено количество летальных исходов у детей с энтероколитом, пневмонией и с ВУИ смешанной этиологии.

Таблица 6. Сравнение показателей летальности у детей с ВУИ, получавших и не получавших терапию Вифероном.

Патологические состояния Количество летальных исходов (базисная терапия + Виферон) Количество летальных исходов (базисная терапия) 2-сторонний точный критерий Фишера

Энтероколит 2/45 (4,4%) 6/20 (30%) 0,008

Пневмония 2/63 (3,2%) 7/29 (24,1%) 0,004

ВУИ смешанной этиологии 4/81 (4,9%) 7/38 (18,4%) 0,036

При использовании базисной терапии умерло 20 из 87 детей (22,3%), тогда как при терапии с применением Виферона показатель летальности был существенно ниже и составил 4,2% (8/189). Таким образом, применение Виферона позволило снизить показатели летальности при этих состояниях в 5,3 раза.

Анализ включения метаболической и иммунной терапии в комплексное лечение беременных женщин и недоношенных детей.

Исследование биологических сред новорожденных детей с признаками ВУИ и материалов аутопсии плодов и умерших новорожденных методом БКМ показало присутствие инфекционно-активного ЦМВ в 16,8% - 49% случаев. Высокий процент выявления ЦМВ требует мероприятий по укреплению неспецифического иммунитета и противовирусной терапии. При этом существенное значение имеет состояние здоровья беременных, которым при выявлении активной вирусной инфекции назначают специфические противовирусные препараты, которые в большинстве случаев являются высокотоксичными для плода и не всегда разрешены во время беременности. Возможной альтернативой этому является использование иммунокорригирующей и метаболической терапии. В данном разделе работы проведена сравнительная оценка влияния метаболической терапии и Виферона на течение и исход беременности женщин с ОАГА.

При изучении влияния метаболических препаратов в предгравидарной подготовке было обследовано 260 женщин, инфицированных ЦМВ в возрасте от 22 до 28 лет, у которых проведен анализ анамнестических данных, мониторинг течения беременности, и прослежены исходы родов. Работа проведена на базе научно-консультативного центра при НПО «Питательные среды» (директор - проф., академик РАМНТ Меджидов М.М.). Женщины состояли на учете в ЖК №2 г. Махачкалы и были обследованы совместно с к.м.н. Сулеймановой И.Г. Женщины были разделены на три группы: основную группу (1) составили 106 женщин с ОАГА в возрасте 22-28 лет, взятых под наблюдение за 2-4 месяца до наступления настоящей беременности. На основании выявления наиболее значимых факторов риска внутриутробного инфицирования проводилась комплексная традиционная терапия, после чего была запланирована беременность. Женщины основной группы кроме традиционной терапии получали метаболическую терапию до беременности и во время беременности. Продолжительность терапии составляла 10-12 дней в месяц. Вторую группу (п=82) составили женщины с ОАГА, находившиеся под наблюдением с конца II триместра беременности и прошедшие неполный курс метаболической терапии. В третью группу вошли 72 женщины с ОАГА, взятые на учет с первых недель беременности без подготовки к ней. Женщины этой группы были обследованы, получали специфическое лечение, коррекцию биоценоза, но не получали метаболическую терапию.

Обследование проводили дважды - при постановке на учет в женскую консультацию и за 3-6 недель до родов. По выявлению возбудителей ИППП при первом обращении все группы были идентичны. При повторном обследовании частота обнаружения микоплазмы, уреаплазмы и вторичной бактериальной флоры у женщин в первой группе была значительно ниже. Обследование женщин второй группы перед родами показало достоверно более высокую частоту выявления микоплазмоза и ВПГ. У женщин третьей группы чаще обнаруживали микоплазмы, уреаплазмы, ВПГ и другую патогенную и условно-патогенную флору.

Анализ течения беременности показал, что угроза прерывания беременности в сравниваемых группах отмечалась в 1,8-1,9 раз достоверно чаще, чем у женщин 1-й группы. Женщины из 2 и 3-й группы в три раза чаще, чем женщины 1-й группы болели острыми респираторными вирусными инфекциями, протекающими в более тяжелой форме. Острые респираторные заболевания могли быть одной из причин обострения хронических болезней, которые в группах сравнения наблюдались у каждой второй женщины (56,1% и 55,6%) по сравнению с 21,7% случаев в 1-й группе. Хроническая гипоксия и задержка внутриутробного развития плода отмечались во 2 и 3-й группах значительно чаще (р<0,005). Преждевременные роды в группах сравнения отмечались в 2,5 раза достоверно чаще, чем в основной группе. В 1-й группе 65% родов прошли без каких-либо акушерских осложнений, в то время как в группах сравнения различные осложнения в родах и послеродовом периоде были отмечены у большинства женщин (76,4%-78%). Из 260 живыми родились 258 младенцев. Исходы родов у женщин сравниваемых групп представлены в таблице 7.

Таблица 7. Состояние новорожденных в сравниваемых группах.

Состояние 1 группа 2 группа 3 группа

новорожденных (п=106) (п=82) (п=72)

Родились живыми 106 80 72

Умерли в пери- и

неонат. периодах 0%±1,9 8,5% ±3,1 (р< 0,02) 13,9%±4,1(р< 0,01)

Недоношенные 9,4%± 2,8 23,2%± 4,7(р<0,02) 23,6±%5,0 (р< 0,02)

Масса тела донош. 3486,2 ±548,3 3322,2 ±340,1 3322,2± 341,1

Оценка по шкале 0%± 1,9 31,3% ±5,2(р< 0,001) 38,9%± 5,8(р< 0,001)

Апгар: 6-7 баллов

7-8 баллов 58,5%±4,8 31,3%± 5,2 (р<0,001) 27,8%± 5,3(р<0,001)

8-9 баллов 40,6%± 4,7 37,5%± 5,4 33,3% ±5,5

Гипотрофия 2,8% ± 1,6 8,8% ±3,2 (н/з) 11,1%± 3,7 (р< 0,05)

Клинические

признаки ВУИ 23,6% ±4,1 63,8% ±5,4 (р<0,001) 66,7± 5,6 (р< 0,001)

Примечание: Оценка по шкале Апгар, относительное количество новорожденных с признаками гипотрофии и внутриутробного инфицирования во второй группе вычислялся от числа живорожденных (п=80).

У 23,6% новорожденных 1-й группы были отмечены признаки ВУИ. В группах сравнения 63,8% - 66,7% детей, родились с признаками ВУИ. У 26 новорожденных из второй группы (32,5%) и 34 новорожденных из третьей группы (47,2%) через 2,5-36 часов состояние здоровья резко ухудшилось, нарастали симптомы сердечной и легочной недостаточности и инфекционного токсикоза, что требовало перевода их в отделение реанимации новорожденных. Всего в отделение реанимации было переведено 46 детей, из которых в 61,3% случаев было подтверждено ВУИ.

Таким образом, проведение предгравидарной подготовки за 2-4 месяца до беременности с использованием метаболической терапии приводит к существенному снижению осложнений в родах и послеродовом периоде, снижает вероятность внутриутробного инфицирования плода и новорожденного. Позволяет улучшить течение периода адаптации новорожденных и ведет к снижению перинатальной и младенческой смерти.

В ранее проведенных исследованиях была показана высокая эффективность применения генно-инженерного рекомбинантного препарата Виферон с третьего триместра беременности, начиная с 28 недель [Тареева Т.Г., 2000]. Для обоснования возможности более ранней иммунокоррекции при помощи Виферона мы провели сравнительный анализ включения препарата в комплексное лечение беременных, начиная со второго триместра беременности. Работа проводилась совместно с лабораторией онтогенеза и коррекции системы интерферона НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (зав. лаб. - д.б.н., проф. В.В. Малиновская) и 2-м акушерским отделением МОНИИАГ МЗ РФ (зав. отд. - д.м.н. C.B. Новикова).

Под наблюдением находилось 74 беременные с ОАГА. Исследования проводились в динамике: с 12-16 недель беременности до родов. Были применены общеклинические, ультразвуковые, вирусологические (ПЦР, ПЦР-RT, БКМ, ИФА) и иммунологические (определение альфа-ИФН, гамма-ИФН) методы исследования. Исследования проводились до начала терапии Вифероном, после окончания лечебного курса и накануне родоразрешения. У 40,9% женщин во время предыдущих беременностей отмечено обострение герпесвирусной инфекции (ГВИ), вызванной ВПГ и/или ЦМВ. Смешанная урогенитальная инфекция была выявлена у 42 из 74 беременных (56,8%).

Частота суммарного обнаружения маркеров ГВИ у беременных женщин в динамике представлена на рисунке 4. Женщину считали инфицированной при обнаружении маркеров ГВИ в любом из исследованных биологических сред хотя бы одним из методов.

При обследовании на 12-16 неделе у 15 из 74 женщин (20,3%) были выявлены прямые маркеры ГВИ, при повторном обследовании (26-32 неделя беременности) у 18 из

46 женщин (39,1%; р=0,008). Надо отметить, что у 8 из 18 женщин маркеры ГВИ были впервые обнаружены при повторном обследовании на 26-32 неделях беременности.

При третьем обследовании (37-39 недели беременности) маркеры ГВИ были выявлены у 8 из 23 беременных, что составило 34,8%. У 4 из 8 женщин маркеры ГВИ впервые были обнаружены при третьем обследовании (непосредственно перед родами).

Из 27 случаев первичного обнаружения маркеров ГВИ на разных сроках беременности 15 случаев было выявлено к концу 1 триместра, 8 случаев - в конце 2 триместра и 4 случая - в конце третьего триместра. Как видно из рисунка 4, почти у четверти беременных женщин (26,1%) вирус впервые обнаруживается к концу 2 и 3 триместра беременности. Это указывает на необходимость неоднократного обследования беременных на наличие маркеров ГВИ. Исследование, проведенное в динамике, показало, что с увеличением срока гестации частота выявления маркеров ЦМВ и ВПГ сохраняется на относительно высоком уровне, при этом вирусная нагрузка остается низкой.

Для выявления различных форм ЦМВИ мы пользовались классификацией, предложенной ранее [С.Г. Чешик и др., 2001]. Латентная форма ГВИ, при которой определяются только антитела была выявлена у 40,3% женщин. Реактивированная форма ГВИ, при которой определяются специфические антитела класса- ^М одновременно с была диагностирована у 2,9% женщин. Персистирующая форма ГВИ, характеризующаяся вирусовыделением при отсутствии антител класса 1§М в -крови, на разных сроках беременности впервые была установлена в 51,4% случаев.

В дополнение к базисной терапии с 14 недели беременности 28 женщин получали Виферон-500000 МЕ по следующей схеме: ежедневно в течение 10 дней по 1 свече 2 раза в день (20 свечей); затем дважды в неделю по 1 свече 2 раза в день - 10 свечей. Базисную терапию получали 46 беременных. Результаты повторного вирусологического обследования женщин представлены в таблице 8.

Таблица 8. Результаты повторного обследования беременных на наличие маркеров ЦМВ и ВПГ.

Базисная терапия + Виферон Р Базисная терапия

Элиминация вирусов 8 (28,5%) р=0,025 3 (6,5%)

Реактивация ЦМВ и ВПГ 0 (0%) р=0,014 11 (23,9%)

Прежнее кол-во ЦМВ и ВПГ 3 (10,7%) р >0,05 5 (10,9%)

Анализ показал, что у 28,5% беременных, получавших в дополнение к базисной терапии препарат Виферон, вирус элиминировал из организма. В группе беременных, не получавших Виферон, вирус элиминировал только в трех наблюдениях из 46 (6,5%). Ни в одном случае у женщин, получавших Виферон, не отмечено реактивации ЦМВ и ВПГ

инфекции во время беременности, в то время как у женщин, получавших только базисную терапию, реактивация инфекции была зарегистрирована почти у четверти (23,9%). В прежнем количестве ЦМВ и ВПГ сохранялись почти у 11% обследованных из обеих групп.

Суммируя результаты применения метаболической и иммунной терапии у беременных можно констатировать:

- статистически значимую элиминацию вируса при повторных лабораторных исследованиях биологических сред после применения метаболической и иммунной терапии по сравнению с базисной терапией;

- отсутствие и/или снижение количества рецидивов ВПГ и ЦМВ - инфекций у беременных с ОАГА;

- снижение общего числа случаев внутриутробной инфекции более чем в 3 раза, в том числе тяжелых ее форм (внутриутробная пневмония, сепсис) с 26,7% до 5,2%;

- уменьшение с 25% до 11,3% случаев перинатальной патологии неинфекционного генеза (ЗВУР, хроническая гипоксия, асфиксия при рождении, нарушение мозгового кровообращения);

- снижение в 2-2,5 раза общей частоты осложнений беременности (ФПН, гестоз, угроза прерывания беременности).

Поиск новых субстанций природного происхождения, обладающих противовирусной активностью в отношении ЦМВ человека in vitro.

Новые препараты для лечения ЦМВИ у беременных и новорожденных, несомненно, должны обладать высокой антивирусной активностью в сочетании с незначительной токсичностью для клеток и организма в целом. Поэтому поиск природных, натуральных веществ, представляется весьма перспективным для создания лекарственных средств нового поколения.

В последнее время выявлены уникальные свойства фуллеренов и соединений на их основе, которые повышают устойчивость клеток к токсическим соединениям, образуют аддукты, являются антиоксидантами, обладают адъювантными свойствами, не вызывают аллергенных реакций, проникают через липидные мембраны, модулируя трансмембранный перенос ионов, обладают нейропротективными свойствами. Расширение спектра веществ, обладающих анти-ЦМВ активностью, позволило бы решить проблему резистентности, неизбежно возникающую при применении химиопрепаратов однонаправленного действия.

Часть работы была посвящена изучению противовирусной активности аминокислотных производных фуллерена и оценке возможности использования АПФ в комбинированной терапии вместе с патентованными препаратами для лечения ЦМВИ в

системе in vitro. Три водорастворимые аминокислотные производные фуллерена -аминокапроновая кислота (СмгАКК), Na - соли аминокапроновой кислоты (Си- Na -АКК) и Na - соли аминомасляной кислоты (Cto- Na - АМК) были синтезированы в ИНЭОС им. С.И. Несмеянова РАН и любезно предоставлены к.х.н. Романовой B.C.

Исследование цитотоксического действия АПФ на фибробласты человека показало, что степень цитотоксического действия АПФ выраженная в 50% цитотоксической дозе (СС50) составила для C(,o-Na-AKK- 1500мкг/мл и C6o-Na-AMK- 1200 мкг/мл, а для Ссо-АКК - 100мкг/мл.

Изучение противовирусной активности всех трех АПФ в лечебной схеме показало, что соли АПФ оказывают более выраженное антивирусное действие по сравнению с Сг,о-АКК. Анализ кривых позволил определить эффективную концентрацию препаратов, необходимую для подавления вирусной активности на 50% (эффективная доза - ЭД5о). ЭД50 для Cco-Na-AKK составила 0,6 мкг/мл, ЭД50 для Сс.о-АКК - 2,7 мкг/мл, а для Cf,o-Na-АМК- 22 мкг/мл. Низкая токсичность и выраженный антивирусный эффект C(,o-Na-AMK и C(,u-Na-AKK определили наш выбор этих препаратов для дальнейшего анализа, где был определен индекс пролиферации (IP50), который подтвердил, что изученные вещества обладают относительно низким антипролиферативным действием. IP50 для Cto-Na-AKK составил 160 мкг/мл, а для Cf,o-Na-AMK - 550 мкг/мл. По совокупности полученных данных соли АПФ представлялись весьма перспективными, и в дальнейшем было изучено их влияние на репродукцию инфекционно активного вируса в культуре клеток. Заражение клеток ЦМВ с ИМ 0,01БОЕ/кл. позволило установить, что Сбо-Na-AKK вызывает 50% подавление инфекционной активности вируса при концентрации 1,3 мкг/мл, a G<m-Na-АМК - при 2,2 мкг/мл, ХТИ = 1153 и 545, соответственно.

Анализ показал, что АПФ достоверно подавляют инфекционную активность ЦМВ, выявленную в культуральной жидкости от клеток, зараженных с высокой и низкой множественностью. При этом степень подавления репродукции вируса находилась в зависимости от концентрации вещества и инфекционной множественности ЦМВ.

Для определения профилактического противовирусного эффекта АПФ культуру клеток обрабатывали за 24 часа до инфекции. При заражении с МИ 0,001 БОЕ/кл и концентрации Ceo-Na-AMK от 22мкг/мл до 0,022 мкг/мл, 100% вирусспецифическое поражение клеток в обработанном АПФ варианте задерживалось на 1-2 дня. При 220 мкг/мл - на 7 дней. 50% подавление бляшкообразования отмечалось при концентрации 0,22 мкг/мл при МИ 0,001 БОЕ/кл. ХТИ составил 5454. При постановке опытов по профилактической схеме с Сбо-Na-AKK заметного изменения по времени появления и по проценту пораженных клеток в опыте и контроле не наблюдалось.

При вирулицидиой схеме воздействия вирус (МИ 0,01 БОЕ/кл) инкубировали в течение 1 часа при 37°С с различными концентрациями веществ - Q,o-Na-AKK в концентрациях от 0,1 до 10 мкг/мл; a Ceo-Na-AMK в концентрациях от 0,022 до 220 мкг/мл. При использовании Cto-Na-AMK в концентрации 220 мкг/мл инактивация вируса происходила полностью. В течение времени наблюдения (14 дней) не отмечалось появление характерного ЦПД вируса, в то время как в контроле в 100% клеток наблюдалось ЦПД. При концентрации Cto-Na-AMK 22 мкг/мл активность вируса была снижена на 2,0 lg. Подсчет БОЕ показал, что 50% ингибирующая доза соответствует 0,22 мкг/мл. ХТИ составил 5454. При использовании этой концентрации наблюдали задержку в развитии ЦПД на 4 суток. Аналогичная постановка опыта для C<-,o-Na-AKK при различных концентрациях (10,0, 1,0 и 0,1 мкг/мл) показала, что 50% подавление образования бляшек наблюдается при 1,0 мкг/мл. ХТИ = 1500. Сбо-Na-AKK в концентрации 0,1 мкг/мл не влияла на вирусную активность, а в концентрации 10 мкг/мл снижала титр вируса на 0,97 lg.

Таким образом, 2 из 3-х производных фуллерена являются высокоэффективными ингибиторами репродукции ЦМВ человека в системе in vitro. ХТИ в различных вариантах схем и концентраций для C(,o-Na-AKK составил 1150-2600; для Си-Na-AMK - 545-5450.

Одной из задач исследования была оценка сочетанного антивирусного эффекта фуллерена и Виферона in vitro. Для этого АПФ и Ганцикловир вносили в культуральную среду однократно через час после заражения в концентрации 1 мкг/мл, C«>-Na-AMK вносили в концентрации 0,22 мкг/мл. Для Виферона использовали профилактическую схему, когда клетки обрабатывали за 24 часа до заражения раствором, содержащим 50МЕ Виферона. При комбинированной схеме Ганцикловир вносили в концентрации 0,24 мкг/мл, т.е. в концентрации в 4 раза меньшей, чем рекомендовано в инструкции. АПФ использовали в концентрации 0,1 мкг/мл. Концентрация Виферона в комбинированной схеме также была уменьшена до 10 МЕ/мл.

При иммуноцитохимическом исследовании на 7 сутки после заражения в контрольной инфицированной культуре было 42,8% (900/2100) пораженных клеток. Анализ показал, что все вещества значительно подавляют развитие ЦПД по сравнению с зараженной культурой (Р<0,0005). В культуре, обработанной Ганцикловиром, количество зараженных клеток не превышало 8,0% (186/2300), фуллереном 9,2% (211/2300). При обработке Вифероном количество инфицированных клеток было больше 498/2900 (17,1%). При изучении сочетанного эффекта фуллерена с Вифероном и Ганцикловира с Вифероном оказалось, что антивирусный эффект более выражен у пары ганцикловир+Виферон. Количество инфицированных клеток при обработке культуры ганцикловиром и Вифероном не превышало 2,1% (50/2300), в культуре обработанной

Вифероном и АПФ обнаружено 3,6% (85/2300) инфицированных клеток. Данные однозначно указывают на то, что при комбинированном использовании препаратов достижение противовирусного эффекта происходит при снижении концентраций соединений, что имеет явное преимущество перед использованием анти-ЦМВ препаратов в отдельности.

Для суждения о механизме действия АПФ на ЦМВИ in vitro были проведены дальнейшие опыты. Эффективность Сбо-Na-AMK в профилактической и в вирулицидной схемах позволила предположить, что вещество действует на ранних этапах взаимодействия вирус - клетка. Для проверки данного предположения фибробласты инфицировали ЦМВ в присутствии исследуемого соединения и фиксировали через 2 часа после внесения вируса, а затем окрашивали МКА к белку ЦМВ рр65, который в случае инфицирования вирусом клетки уже через час обнаруживается в ее ядре [Landolfo S., 2003]. Было установлено, что при МИ 0,01 БОЕ/кл. Cco-Na-AMK в концентрации 22 мкг/мл достоверно подавляло проникновение ЦМВ в клетки на 69,8% (р<0,0005) по отношению к инфицированной культуре (48% окрашенных клеток в контроле против 14,5% в присутствии АПФ).

Для того, чтобы выяснить, на какие стадии жизненного цикла вируса оказывают влияние АПФ, было проведено иммуноцитохимическое окрашивание клеток с использованием МКА к сверхраннему, раннему и позднему белкам ЦМВ. В качестве положительного контроля были использованы Фоскарнет и Ганцикловир. Известно, что подавляя активность вирусной ДНК полимеразы, данные препараты ингибируют репликацию ДНК ЦМВ и блокируют экспрессию поздних генов, кодирующих структурные белки в ЦМВ - инфицированных клетках [De Clercd, 2001].

При концентрации 2,2 мкг/мл C(,o-Na-AMK снижала количество клеток окрашенных МКА к 1Ер72 и рр65, на 37% и 62%, соответственно. Эти значения находятся на уровне снижения экспрессии этих белков в инфицированных клетках в присутствии Фоскарнета, Сбо-Na-AKK не влияла на синтез сверхранних и ранних белков. Наиболее эффективно вещества подавляли экспрессию поздних генов. Динамика экспрессии позднего структурного белка gB ЦМВ в культуре ФЛЭЧ в присутствии различных химиопрепаратов представлена на рисунке 5. В инфицированной культуре около 40% клеток на 5 сутки экспрессировали gB. В культуре обработанной АПФ количество клеток эксирессирующих gB достигало только 8-9% (р<0,0001). В культуре, обработанной Ганцикловиром или Фоскарнетом, экспрессия gB отмечалась в 6-7,5%. Полученные результаты позволяют заключить, что АПФ подавляют синтез поздних вирусных белков подобно Ганцикловиру и Фоскарнету, что является косвенным свидетельством ингибирования репликации вирусной ДНК.

Для подтверждения данного вывода прямым методом была проведена серия

экспериментов по количественному изучению динамики накопления ДНК ЦМВ в

культуре инфицированных фибробластов методом ПЦР в реальном времени (таблица 9).

Таблица 9. Накопление ДНК ЦМВ в инфицированных клетках методом ПЦР в реальном времени при действии различных веществ.

Дни после заражения Виферон Фуллерен Фуллерен+ Виферон Ганцикловир Ганцикловир+ Виферон Контроль вируса

4 сутки отр отр отр отр отр 26,80'

7 сутки 27,23 25,96 отр 27,55 26,62 18,73

10 сутки 19,22 21,70 22,97 22,60 26,09 13,72

Значение О. Положительный контроль тест-системы (О =19.11) соответствует 20000 копий ДНК/мл.

В качестве препаратов сравнения были использованы Виферон и Ганцикловир. Результаты ПЦР и ПЦР real - time показывают, что АПФ, Виферон и Ганцикловир препятствуют накоплению вируса в клетке до 7 суток после заражения. Надо отметить, что значения Ct на 7 сутки для всех использованных веществ были на уровне нижнего предела использованной тест-системы (25,96 - 27,55). На 7 сутки количество ДНК в исследованных образцах было снижено на 2,0 lg. Ингибирующая активность проявлялась также и через 10 дней после заражения. При совместном использовании Виферона с АПФ и Ганцикловиром ингибирующий эффект был более длительным и выраженным.

Суммируя полученные данные, можно заключить, что в ЦМВ - инфицированных клетках существует несколько вирусных мишеней воздействия для C(,u-Na-AKK и Сбо-Na-АМК, направленных на подавление инфекционного процесса в пермиссивных клетках in vitro. Для раскрытия молекулярных механизмов антивирусного действия каждого из изученных соединений необходимы дальнейшие исследования.

Возможность комбинирования Виферона с другими лекарственными средствами специфической противовирусной терапии дает основание для разработки принципиально новых схем комбинированной терапии цитомегаловирусной инфекции, позволяющих снизить терапевтические концентрации лекарственных соединений и, следовательно, избежать проявления побочных токсических эффектов при сохранении высокой противовирусной эффективности. Использование препаратов с различными механизмами действия позволит также избежать появления устойчивых к терапии мутантных штаммов вируса. Для того, чтобы выявить клеточные мишени, на которых направлено действие C(,o-Na-AKK и Cso-Na-AMK, необходимо понимать процессы, происходящие в инфицированной клетке после проникновения внутрь клетки и влияние вируса на

жизненный цикл клетки. Для этого были проведены опыты, описанные в следующем разделе работы.

Действие ЦМВ на пролиферативную активность клеток ФЛЭЧ.

В инфицированной культуре к концу первого дня инфекции наблюдались митотические фигуры, в которых расположение хромосом и их морфология не соответствовали ни одной из нормальных стадий митоза и характеризовались неправильным расположением хромосом, повышенной степенью их конденсации и фрагментацией части хромосом. Доля патологических митозов среди общего числа митотических клеток к 40 часам после заражения достигала 80%.

Было высказано предположение, что митотические клетки с аномальной морфологией не способны завершить деление. Подсчет митотических фигур, соответствующих стадиям анафазы и телофазы, показал, что если в контрольной культуре ФЛЭЧ их доля от общего числа митозов составляла в среднем 17%, то на 3-й и 4-й день суммарная доля анафазных и телофазных пластинок снижалось до 1%.

На тех же препаратах проводился подсчет клеток на единицу площади. Оказалось, что в то время как в контрольной культуре эта величина возрастала с 1-го по 4-й день культивирования, в инфицированной культуре число клеток на единицу площади существенно не увеличивалось. Следовательно, в ЦМВ-инфицированной культуре наблюдалась остановка деления клеток. Возможно, что блок клеточного цикла наблюдается на стадии митоза и связан с появлением патологии митотических клеток. Аномальные митотические фигуры при инфицировании активно делящихся клеток ФЛЭЧ появлялись в течение первых суток после заражения. Это наводило на мысль, что патология митоза развивается вне зависимости от синтеза вирусной ДНК, репликация которого начинается, в среднем, через 24 часа после проникновения вируса в клетку.

Для ответа на вопрос, связана ли патология митозов с репликацией вирусной ДНК и экспрессией вирусных белков была проведена серия опытов. Культуру заражали ЦМВ в присутствии Ганцикловира, являющегося ингибитором репликации вирусной ДНК и вирусом, предварительно инактивированным УФ. Степень подавления синтеза ДНК ЦМВ оценивали по числу клеток, содержащих поздний вирусный белок gB с помощью МКА. На 3-й сутки после заражения интактным вирусом 35% клеток содержали белок gB. В культуре обработанной Ганцикловиром число клеток, содержащих поздний антиген, не превышало 3%. Проникновение вирусных частиц внутрь клеток контролировали путем окраски МКА к белку рр65, который является мажорным белком тегумента. Было обнаружено, что 82% клеток содержали белок рр65 после обработки культуры инактивированным вирусом. Обработка вируса ультрафиолетом (УФ) приводила к

снижению экспрессии сверхранних и ранних генов в 15 раз. При этом, появление патологических митозов в одинаковой степени наблюдалось во всех трех культурах.

Результаты подсчета митотического индекса и доли патологических митозов во всех культурах на 3 сутки показали, что в контрольной культуре было 9,3700, в инфицированной культуре 19,8°/00, из которых 9,7°/00 (48,9%) были патологическими. В культуре, зараженной вирусом, обработанным УФ, митотический индекс составил 15,7 700, из них 7,2 7„„ (45,9%) митозов были с различной степенью патологии. В культуре, обработанной Ганцикловиром, митотический индекс был несколько меньшим и составил 10,6 %0. Патология митоза наблюдалась в 6,0°/оо, т. е. в 56,6% из всех митотнческих фигур в культуре. К 5-м суткам в культуре клеток после заражения вирусом обработанным УФ и в присутствии Ганцикловира, также как и в культуре, инфицированной интактным вирусом, количество митозов с аномальной морфологией было близким и превышало 50%. Таким образом, было установлено, что подавление репликации ДНК ЦМВ, а также инактивация УФ транскрипции вирусных генов не препятствуют появлению патологических митозов.

Для изучения влияния ЦМВ на митотический цикл была использована система с индуцированной пролиферацией: клетки вводили в состояние покоя во, затем стимулировали к делению сывороточными ростовыми факторами. Заражали в различных стадиях клеточного цикла (Со, в) и 8).

Данные, полученные при заражении фибробластов, находившихся в момент инфицирования в состоянии покоя Со, представлены на рисунке 6, где точка 0 соответствует 48 часам после удаления сыворотки (во - период) и является моментом заражения клеток. Подсчет меченых клеток в контрольной культуре показал стандартный характер увеличения числа клеток, содержащих 3Н - тимидин. В зараженной культуре доля меченых клеток оставалась на низком уровне. Очевидно, что клетки инфицированной культуры не смогли выйти из состояния покоя и вступить в фазу синтеза ДНК после стимуляции. Подсчет митотических клеток в инфицированной культуре, также показал снижение количества митозов с 3% в момент заражения до 0% и оставался на этом уровне.

Сходные данные были получены при заражении ФЛЭЧ в стадии в) клеточного цикла. Только 8% клеток инфицированных в - периоде клеточного цикла включают ЗН-тимидиновую метку при стимуляции к делению.

Данные литературы о пролиферативной активности клеток, инфицированных в б], противоречивы. Так, в ряде работ приведены данные, свидетельствующие об остановке ЦМВ - инфицированных клеток на границе 0|/5 [Ойтег апс1 Мосатэк!, 1997; Ка1е^а еЫ., 2003; вакат е(. а1., 1999]. \Veibusch апс1 Надете1ег полагают, что к блоку клеточного цикла

на стадии Gi может приводить экспрессия сверхраннего вирусного белка IE2 - 86 [Weibusch and Hagemeier, 1999]. Murphy и соавторы (2000г.) показали, что 1Е2р86 не препятствует вхождению в S период пермиссивных к ЦМВ клеток. В пользу этого говорят данные, полученные ранее Bresnahan с соавт., что 1Е2р86 активизирует промотор гена циклина Е и увеличивает уровень этого циклина, необходимого для вступления клетки в S - период [Bresnahan et. al., 1998]. Показано также, что ЦМВ приводит к деградации ингибитора циклин-зависимых киназ р21 С1р| и, таким образом, индуцирует вхождение клеток в S - фазу [Bresnahan et. al., 1996; Sinclair et.al., 2000; Chen et. al., 2001]. Таким образом, наши данные подтверждают способность клеток, инфицированных в Gi -периоде преодолевать границу Gi/S и дополняют их. Нами установлено, что лишь часть Gi - клеток способны вступить в стадию синтеза ДНК после заражения ЦМВ, но они не способны вступить в митоз.

Динамика вступления клеток в фазу синтеза ДНК в культуре, инфицированной ЦМВ в S - периоде клеточного цикла, приведена на рисунке 7. Точка 24 соответствует моменту заражения клеток и 24 часам после добавления сыворотки (S - период). Подсчет меченых клеток показал, что в инфицированной культуре максимальное число клеток в стадии синтеза ДНК было достигнуто на 6 часов позднее, чем в контрольной популяции. Это позволяет предположить, что длительность S фазы в инфицированных клетках увеличивается.

Результаты по подсчету митотического индекса представлены на рисунке 8, где точка 0 соответствует моменту заражения клеток и 24 часам после добавления сыворотки.

Количество митозов в контрольной и инфицированной культурах на протяжении 48 часов наблюдения практически не отличалось. Через 12 часов после заражения в культуре были зарегистрированы митотические фигуры с аномальным расположением хромосом, число которых постоянно возрастало. К 42 часам их число составило половину от общего количества митозов.

Таким образом, в культуре ФЛЭЧ, инфицированной в S-фазе, клетки способны завершить период синтеза ДНК, хотя и с замедлением. Установлено, что, по крайней мере, в первые часы после заражения инфицированные клетки, находившиеся в S-периоде, способны войти в стадию G2, преодолеть границу G2/M и вступить в митоз подобно неинфицированной культуре. Данные литературы свидетельствуют о том, что под действием ЦМВ пролиферирующие клетки проходят S - период и останавливаются до вступления в митотическую фазу клеточного цикла на границе G2/M [McElroy et.al, 2000; Prichard et.al., 2008].

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что по крайней мере, в первые часы после проникновения ЦМВ, вирус не препятствует вхождению в митоз клеток,

находящихся в периоде синтеза ДНК. Полученные результаты находят подтверждение в работе Jault с соавт., которые установили, что в инфицированных фибробластах, находящихся в момент заражения в S - фазе клеточного цикла, регистрируется высокий уровень содержания циклина В и соответствующей циклин - зависимой киназы cdk-2 [Jault et. al., 1995]. Заключение авторов о блоке G2/M в ЦМВ - инфицированных клетках был сделан на основе данных проточной цитометрии ДНК, который не позволяет дифференцировать клетки, находящиеся в фазе Gj и в митозе, так как обе популяции содержат одинаковое (удвоенное) количество ДНК. Использованные нами методы (радиоавтографическое выявление S - фазных клеток и морфологический анализ митотических фигур) позволил доказать, что клетки зараженные в S - фазе, способны вступить в митоз.

Предположение о том, что в ЦМВ инфицированных ФЛЭЧ прохождение S-фазы клеточного цикла происходит медленнее, чем в неинфицированной популяции, было проверено в дальнейших экспериментах с использованием метода меченых митозов (рис. 9).

РИС. 9. Изменение доли меченых митозов после импульсного внесения 3Н-тимидиш в культуре диплоидных фибробластов человека, инфицированной ЦМВ.

время после заражения и отмывки метки,ч • контроль -- ЦМВ 1БОЕ/кл

В обеих культурах митотические клетки, содержащие метку над хромосомами, впервые наблюдались через 4 ч после отмывки ЗН-тимидина, что соответствует продолжительности фазы вг в диплоидных фибробластах человека. Это свидетельствует о том, что ЦМВ не влияет на прохождение стадии йг клеточного цикла по крайней мере в первые часы после заражения - до 14 часов. Позже динамика меченых митозов существенно различалась в двух культурах. Снижение их доли до 50% было отмечено

через 2В ч после начала опыта, в то время как в контроле этот показатель был достигнут уже к 18 часам.

Более медленное снижение числа меченых митозов в инфицированной культуре по сравнению с контрольной подтверждает высказанное предположение об увеличении длительности Э-фазы в клетках, инфицированных ЦМВ. Расчеты по графику показали, что Э период для контрольной культуры ФЛЭЧ составил 8 часов, а для культур, инфицированных ЦМВ - 18 часов.

Приблизительно половина всех меченых митозов имели отклонения от стандартной морфологии. Другая половина патологических митозов оставалась немеченой. Как было установлено, около половины патологических митозов возникают при инфицировании клеток, находящихся в Б - периоде клеточного цикла. Учитывая отсутствие митозов при инфицировании клеток в - фазе, можно заключить, что остальные, немеченые патологические митозы возникают при инфицировании клеток в стадии, предшествующей митозу - вг или после вступления клеток в митоз.

Подводя итог данному разделу можно заключить, что полученные новые данные свидетельствуют о том, что действие ЦМВ на клеточный цикл зависит от стадии в жизненном цикле клетки в момент ее заражения. Патологические процессы на клеточном уровне развиваются в непосредственной связи с клеточной пролиферацией.

ВЫВОДЫ.

1. Сравнительная оценка эффективности лабораторных методов выявления маркеров ЦМВИ у 204 недоношенных новорожденных детей показала, что частота определения ДНК ЦМВ методом ПЦР составила 15,9%, методом БКМ - 16,8%, двумя методами -26,2%. Анализ авидности противовирусных антител выявил прогностическую значимость выявления низкоавидных антител. Показана необходимость комплексного использования перечисленных методов.

2. Впервые разработан и использован для диагностики внутриутробной ЦМВИ метод ПЦР in situ при исследовании отпечатков органов и тканей умерших новорожденных. Метод позволяет визуализировать инфицированные клетки, оценить локализацию и сравнительное количество внутриклеточной вирусной ДНК.

3. У новорожденных с признаками внутриутробного инфицирования (ВУИ) прямые маркеры ЦМВ обнаруживаются в 26% случаев, а у новорожденных без признаков ВУИ - в 5 раз реже (в 5% случаев). Через 1-3 месяца у 68% внутриутробно инфицированных происходит элиминация ЦМВ. У 19,2% неинфицированных детей маркеры ЦМВ появляются впервые к трем месяцам, а еще у 11,5% - к 6 месяцам. Эти данные свидетельствуют о том, что для достоверной диагностики ЦМВИ необходимо неоднократное обследование.

4. Установлено, что применение Виферона со второго триместра беременности приводит к снижению частоты осложнений беременности в 2-2,5 раза и к снижению патологии у новорожденных с 26,7% до 5,2%. Включение Виферона в комплексное лечение недоношенных новорожденных с клиническими признаками ВУИ оказывает

иммунокорригирующий эффект и снижает смертность при жизнеугрожающих состояниях неонатального периода.

5. Использование в предгравидарной подготовке женщин метаболической терапии за 2-4 месяца до наступления беременности позволяет существенно улучшить течение беременности, состояние плода и исходы родов. Использование метаболической терапии только в период беременности по этим показателям является недостаточной.

6. Впервые установлено, что развитие ЦМВИ in vitro зависит от фазы клеточного цикла в момент заражения. ЦМВ блокирует вступление клеток ФЛЭЧ в S-период при заражении в Go- и G|-периодах клеточного цикла; в клетках, зараженных в S-периоде, удлиняется период синтеза ДНК, сохраняется способность вступить в митоз, который блокируется в метафазе.

7. Индукция патологических митозов ЦМВ может происходить при действии на клетки вируса, инактивированного УФ, а также при подавлении синтеза вирусной ДНК ганцикловиром, что демонстрирует определяющую роль сигнальной трансдукции в регуляции вирусом митотических генов.

8. Впервые установлено, что водорастворимые аминокислотные производные фуллерена Ct,o (Na соль аминомасляной - Cm-Na-AMK и Na соль аминокапроновой кислот - Саг Na-AKK) являются высокоэффективными ингибиторами репродукции ЦМВ в системе in vitro. Химиотерапевтический индекс (ХТИ) при различных схемах воздействия для Cto-Na-AKK составил 1150-2600; для Сбо-Na-AMK - 545-5450, что выше значений ХТИ для известных анти-ЦМВ препаратов.

9. Установлена синергидность антивирусного действия аминокислотных производных фуллерена и Виферона на модели ЦМВИ в культуре клеток. Это указывает на перспективность разработки комбинированного лекарственного средства, сочетающего антивирусные, иммуномодулирующие и антиоксидантные свойства.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Влияние цитомегаловируса на прохождение клеточного никла и формирование патологических митозов в культуре диплоидных фибробластов человека. // Онтогенез - 2001. - Т.32, №1. - С.29-34. / соавт.: Барсукова A.C., Федорова Н.Е., Зацепнна О.В., Кущ A.A.

2. Сравнение эффективности лабораторных методов выявления цитомегаловируса в аутопсийном материале. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии — 2002. - Т.2. - С.63-69. / соавт.: Нисевич Л.Л., Федорова Н.Е., Ильина E.H., Талалаев А.Г., Адуева С.М., Хнжнякова Т.М.., Малахова М.В., Говорун В.М., Куш A.A.

3. Острые респираторные вирусные заболевания и синдром внезапной смерти у детей раннего возраста. // Пульмонология - 2002. - №5. - С.6-9. / соавт.: Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Яцык Г.В., Парсегова Т.С., Туманова Е.Л.

4. Подавление цитомегаловирусной инфекции в клеточной системе аминокислотными производными фуллерена. // Вопросы вирусологии - 2002. - Т.47, №1, - С.30-34. / соавт.: Федорова Н.Е., Адуева С.М., Романова B.C., Парнес З.Н., Галегов Г.А., Куш A.A.

5. Врожденные вирусные инфекции и маловесные дети. // Вопросы современной педиатрии - 2002. - Т.1, №4. - С.9-13. / соавт.: Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Миронюк О.В., Парсегова Т.С., Туманова Е.Л., Кущ A.A., Климова P.P., Федорова Н.Е.

6. Иммуноиитохимическая реорганизация ядрышка в условиях цитомегаловирусной инфекции. II ДАН - 2002. - Т.387, №3. - С.589-592. / соавт.: Жарская О.О., Федорова Н.Е., Кущ A.A., Зацепина О.В.

7. Активация транскрипции рибосомных генов при цитомегаловирусной инфекции фибробластов эмбриона человека in vitro. // Цитология - 2003. - Т.45, №7. - С. 690-701. / соавт.: Жарская О.О., Барсукова A.C., Федорова Н.Е., Кущ A.A., Зацепина О-В.

8. Nanobionics of pharmacologically active derivatives of fullerene C60. // Jornal of Nanoparticle Research, Netherlands - 2003. - Vol. 5. - P.561-566.1 соавт.: Kotelnikova R.A., Bogdanov G.N., Frog E.C., Kushch A.A., Fedorova N.E., Miller G.G

9. Блок клеточной пролиферации и патология митоза в клетках, инфицированных цитомегаловирусом: роль периода клеточного цикла в момент заражения. // ДАН -2003. - Т.392, №4. - С.552-555. / соавт.: Федорова Н.Е., Меджидова М.Г., Кущ А.А

10. Значение врожденных вирусных инфекций как причины перинатальной и младенческой смертности. // Вопросы современной педиатрии - 2005. - Т.4, №2. - С.19-25. / соавт.: Нисевич J1JI., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Парсегова Т.О., Туманова Е.Л., Миронюк О.В., Кущ A.A.

11. Выявление прямых маркеров цитомегаловируса и противовирусных антител у детей раннего возраста. // Вопросы вирусологии - 2005. - Т.50, №1. - С.14-19. / соавт.: Алямовская Г.А., Ксшишян Е.С., Адуева С.М., Федорова Н.Е., Pustowoit В., Малахова М.В., Ильина E.H., Говорун В.М., Кущ A.A.

12. Антивирусная активность липосомных препаратов антибиотика гелиоминина. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2005. - Т.139, №3. - С.330-333. / соавт.: Подольская C.B., Нарышкина H.A., Сорокоумова Г.М., Каплун А.П., Федорова Н.Е., Кущ A.A., Швец В.И

13. Лабораторная диагностика врожденных вирусных инфекций. II Детские инфекции -2006. - Т.5, №2. - С.12-18. / соавт.: Нисевич Л.Л., Бахмут Е.В., Ашнрова A.A., Кущ A.A., Коноплева Т.Н., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Парсегова Т.С., Туманова ЕЛ.

14. Влияние аминокислотных производных фуллерена С60 на развитие цитомегаловирусной инфекции. II Технологии живых систем - 2006. - Т.З, №2. - С.42-46. / соавт.: Фрог Е.С., Котелышкова P.A., Богданов Г.Н., Штолько В.Н., Файнгольд И.И., Кущ A.A., Федорова Н.Е., Романова B.C.

15. Перинатальные факторы риска внутриутробного инфицирования плода, патологии и смерти в перинатальном и младенческом возрасте. II Вопросы акушерства, гинекологии и перннатологии - 2007. - Т.6, №4. - С.13-17. I соавт.: Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Парсегова Т.С., Туманова Е.Л., Кущ A.A.

16. Преконцепционная подготовка женщин к беременности и ее влияние на плод н новорожденного. // Педиатрическая фармакология - 2008. - Т.5, JV» 6. - С.45-51. / соавт.: Нисевич Л.Л., Меджидова Д.Б., Сулейманова И.Г., Гаджнева З.С., Шнщенко В.М., Кущ

A.A.

17. Быстрый культуральный метод диагностики гернесвирусных инфекций. Методические рекомендации - Москва - 2008. - С.21 / соавт.: Кущ A.A., Федорова U.E., Климова P.P.

18. Интерфероновый статус недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками внутриутробной инфекции и его коррекция вифероном. // Российский аллергологическин журнал - 2008. - №6. - С.74-81. / соавт.: Малиновская В.В., Гусева Т.С., Паршина О.В., Гаджиева З.С., Павлова М.В., Климова P.P., Володин H.H., Гетня Е.Г., Солдатова И.Г., Дегтярева М.В., Кущ A.A.

19. Динамика маркеров герпесвирусных инфекции у недоношенных новорожденных детей в отделениях реанимации и интенсивной терапии. // Педиатрия - 2008. - Т..87, №3. -С.143-144. / соавт.: Гаджиева З.С., Павлова М.В., Гетия Е.Г., Н.Н.Володнн, Ж.В. Евсегнеева, С.Н. Щербо, E.H. Выжлова, P.P. Климова, Н.Е. Федорова, М.В. Дегтярева,

B.В. Малиновская, A.A. Кущ.

20. Внутриутробная инфекция: мать-плацента-плод. // Детские инфекции - 2008. - Т.7, №2. - С.9-13. / Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Туманова Е.Л., Парсегова Т.С., Кущ A.A.

21. Алгоритм вирусологического лабораторного обследования недоношенных новорожденных детей с врожденной цитомегаловирусной инфекцией в течение первого года жизни и влияние терапии Вифероном на исход внутриутробной инфекции. // Педиатрия - 2009. - Т.87, №2. - С.55-62. / соавт.: Павлова М.В., Федорова Н.Е., Гаджнева З.С., Евсегнеева Ж.В., Щербо С.Н., Гетия Е.Г., Солдатова И.Г., Дегтярева М.В., Володин H.H., Малиновская В.В., Кущ A.A.

22.

23.

24.

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36.

37.

Выявление прямых маркеров ВПГ и ЦМВ в аутопсинном материале плодов и умерших новорожденных. // Детские инфекции - 2009. - Т.8, №3. - С.16-21. / соавт.: Нисевич Л.Л., Гаджиева З.С., Цнбизов А.С., Климова Р.Р., Кущ А.А. Эффективность лечения рекомбинантным интерфероном -2 (Вифероном®) недоношенных детей с тяжелыми внутриутробными инфекциями // Детские инфекции - 2009. - №3. - С.40-44. / соавт.: Кущ А.А., Дегтярева М.В., Малиновская В.В., Солдатова И.Г., Климова Р.Р., Серова Е.В., Гетия Е.Г., Цибизов А.С., Гаджиева З.С. Герпесвирусные инфекции и перинатальная патология. // Русский педиатрический журнал - 2010. - №6. - С. / Алиева А.А.

Nontoxic fùllerene analogs, effectively suppressing of HIV and CMV infectivity. // Russian Jornal of HIV/AIDS and related problems; Vol.4, №1 Sankt-Petersbourg - 2000, p. 179-180. / соавт.: Kuschch A., Parnes Z, Romanova V., Pokidysheva L„ Titova I., Makarova N„ Adueva S. Involvement of congénital cytomegalovirus-infection in fétus and infant mortality. // Jomal of Clinical Virology. Vol. 18, Nos.1-3, Glasgow, Scotland - 2000, p.195-196. / соавт.: Kushch A., Adueva S., Talalaev A., Fedorova N.. Nisevich L.

Изменение параметров митотического цикла в диплоидных фибробластах человека под действием цитомегаловируса. // Межд. конференция "Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем"- Махачкала - 2001, стр. 102103. / соавт.: Барсукова А., Федорова Н.

Использование диплоидных фибробластов человека для изучения противовирусной активности аминокислотных производных фуллерена. // Межд. конференция "Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем"- Махачкала -2001, стр. 101-102. / соавт.: Федорова Н., Адуева С., Романова В., ПарнесЗ., Галегов Г. Нетоксичные производные фуллерена, эффективно подавляющие инфекционную активность ЦМВ in vitro. // 5 Междунар. конференция "Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы", Т.4, №1 Санкт-Петербург - 2000, стр. 76-77. / соавт.: Кущ А.А., Парнес З.Н., Романова B.C., Макарова Н.Е., Адуева С.М.

Выявление маркеров цитомегаловирусной инфекции у детей раннего возраста. // 3 Межд. конференция "Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем"- Махачкала - 2001, стр.105-106. / соавт.: Адуева С., Федорова Н., Алямовская Г., Сахарова Е., Кешишян Е.

Острые респираторные вирусные заболевания и синдром внезапной смерти. // 11 Нац. конгресс по болезням органов дыхания - Москва - 2001, стр.180. / соавт.: Нисевич JI., Талалаев А., Каск Л., Парсегова Т., Туманова Е., Миронюк О., Кущ А., Климова Р. Острые и хронические внутриутробные вирусные инфекции в перинатальной и младенческой смерти. // Мат. 3 Рос. Научного форума "Актуальные проблемы акушерства, гинекологии и перинатологии" - Москва - 2001, стр.358-361. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Кущ А., Климова Р., Федорова Н., Корнюшин М.

Различная чувствительность эмбриональных клеток человека к цитомегаловирусу. // Межд. конференция "Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем"- Махачкала - 2001, стр.103-104. / соавт.: Адуева С., Хижнякова Т., Смирнова Т., Федорова Н.

Сравнение эффективности методов лабораторной диагностики для выявления ЦМВ в аутопсийных материалах. // Межд. конференция "Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем"- Махачкала - 2001, стр.106107. / Нисевич Л., Федорова Н., Адуева С., Говорун В., Ильина Е., Малахова М. Использование методов лабораторной диагностики при оценке роли цитомегаловируса человека в смертности новорожденных и детей раннего возраста. // 8 Съезд всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов,- Москва - 2002, стр.301. / соавт.: Нисевич Л., Федорова Н., Адуева С., Говорун В., Ильина Е., Малахова М., Кущ А. Nanobionics of farmacologicaly active derivates of fullerene C60. // 5 Международная конференция "Фуллерены и атомные кластеры", С.-Петербург - 2002, 15-18 мая. / соавт.: Котельникова Р., Богданов Г., Фрог Е., Котельников А., Романова В., Андреев С., Кущ А., Федорова Н., Миллер Г.

Врожденные аномалии легкого и бронхов у детей с внутриутробной инфекцией. // 12 Нац. Конгресс по болезням органов дыхания, Москва - 2002, стр.166. / соавт.: Нисевич Л., Кущ А., Миронюк О., Парсегова Т., Туманова Е.

38.

39.

40.

41,

42.

43.

44.

45.

46.

47.

48.

49.

50.

51.

52.

53.

Значение острых респираторных вирусных заболеваний в танатогенезе новорожденных и детей первого года жизни. //12 Нац. Конгресс по болезням органов дыхания, Москва - 2002, стр.201. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск J1., Кущ А., Миронюк О., Корнюшин М. Применение метода полимеразной цепной реакции для диагностики цитомегаловирусной инфекции. // Межд. конференция 'Теномика, протеомика и биоинформатика для медицины", Москва - 2002, стр.251-252. / соавт.: Малахова М., Ильина Е., Федорова Н., Адуева С., Кущ А., Нисевич Л., Талалаев А.

Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции у детей раннего возраста. // Научн. - практ. симпозиум "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении", Москва - 2002, стр.249-251. / соавт.: Адуева С., Меджидова М., Федорова Н., Кущ А., Ильина Е., Малахова М., Говорун В., Алямасольская Г., Кешишян Е., Воронцова Ю., Солдатова И., Дегтярева М.

Врожденные пороки развития желудочно-кишечного тракта у детей с внутриутробной инфекцией. // 8 Конгресс Педиатров России "Детская гастроэнтерология: настоящее и будущее", Москва - 2002, стр. 199-200. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л., Миронюк О., Кущ А.

К вопросу лабораторной диагностики урогенитальных инфекций. // 4 Межд. конференция "Разработки и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем ", Махачкала - 2003, стр.81-83. / соавт.: Акаева Ф., Омарова С., Меджидов М., Алиева С. Нарушения клеточного цикла фибробластов человека, инфицированных цитомегаловирусом. // Цитология, С-Петербург - 2003, стр.939-940. / соавт.: Федорова Н., Меджидова М., Кущ А.

Поражение бронхолегочной системы в перинатальной и младенческой смерти. // 13 Нац. конгресс по болезням органов дыхания, С-Петербург - 2003, стр.225. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л., Парсегова Т., Туманова Е., Кущ А.

Поражение ЦНС при врожденных инфекциях по данным п/а и вирусологических исследований. // Научно - практ. конф. педиатров России и фармакотерапия в педиатрии, Москва - 2004, стр.28-29. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л., Миронюк О., Парсегова Т., Туманова Е., Кущ А.

Применение биологически активных добавок в лечении урогенитальных инфекций. // Всероссийская научно - практ. конф. "Медицинская микробиология-xxl век", Саратов -2004, стр.7-9. / соавт.: Акаева Ф., Омарова С., Меджидов Ш., Алиева С. Использование метода биорезонансного тестирования в лабораторной диагностике урогенитальных инфекций. // Всероссийская научно - практ. конф. "Медицинская микробиология-xxl век", Саратов - 2004, стр.12-13. / соавт.: Акаева Ф., Омарова С. Выявление количественного состава ассоциаций хламидий при смешанной урогенитальнои инфекции. // Росс, конгресс "Генитапьные инфекции и патология шейки матки", Москва -2004, стр.77. / соавт.: Сулейманова И., Омарова С., Меджидов М., Акаева Ф., Алиева С. Клинико-диагностическая значимость ЦМВИ в развитии патологий плода и новорожденных. // Росс, конгресс "Генитальные инфекции и патология шейки матки", Москва - 2004, стр.15-16. / соавт.: Сулейманова И.

Поражения тимуса при внутриутробном инфицировании по результатам п/а и вирусологических исследований. // 3 Конгресс педиатров-инфекционистов "Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей", Москва - 2004, стр.163. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Парсегова Т., Туманова Е., Кущ А.

Клинико-диагностические аспекты хламидийных уретритов у мужчин в городе Махачкале. // Всеросс. научн. конф "Медицинские иммунобиологические препараты в 21 веке: разработка, производство и применение", Уфа - 2005, стр.185-187. / соавт.: Акаева Ф., Омарова С., Садуллаева А., Гаджиева 3., Алиева С., Меджидов М.

Поражение ж/к тракта у детей с внутриутробной инфекцией по результатам аутопсий. // 10 Съезд педиатров России "Пути повышения эффективности медицинской помощи детям", Москва - 2005, стр.379-380. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л., Парсегова Т., Туманова Е., Миронюк О., Кущ A.A.

Удельный вес внутриутробных вирусных инфекций. // 8 Росс. Форум "Мать и дитя", Москва - 2005, стр.581-582. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л.

54. К вопросу о роли пневмоний в танатогенезе детей с внутриутробной инфекцией. // 4 Конгресс педиатров-инфекционистов России, Москва - 2005, стр.133. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л., Парсегова Т., Туманова Е., Кущ А.А.

55. Врожденный сифилис у детей с внутриутробной инфекцией (по результатам п/а и вирусологических исследований). Нисевич Л., Меджидова А., Талалаев А., Каск Л., Парсегова Т., Туманова Е., Миронюк О., Кущ А.А,- 10 Конгресс педиатров России "Актуальные проблемы педиатрии", Москва - 2006, стр.423.

56. Факторы риска развития патологии и смерти в перинатальном и младенческом возрасте. //11 Конгресс педиатров России "Актуальные проблемы педиатрии", 5-8февраль, Москва - 2007, стр.488-489. / соавт.: Нисевич Л, Талалаев А., Каск Л., Туманова Е., Парсегова Т., Сулейманова И., Меджидова Д.

57. Значение врожденной вирусной инфекции в формировании аномалий развития по результатам аутопсий. // Астраханский медицинский журнал, Том 2, № 2. Астрахань - 2007, стр.133. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л. Н., Туманова Е., Парсегова Т., Кущ А.

58. Гепатиты при врожденной вирусной инфекции. // Научно - практ. конф. и школа по инфекционной патологии, 20-24 ноябрь, Москва - 2007. / соавт.: Нисевич Л, Талалаев А., Каск Л., Туманова Е„ Парсегова Т., Кущ А.

59. Risk factors of intrauterine infection, preventive measures. // Proc.of international scientific-practical interdisciplinary workshop "New technology in medicine and experimental biology", Thailand (Pattaya-Bangkok) - 2007, p.49-50. / соавт.: Nisevich L., Medjidova D., Suleimanova I., Kushch A.

60. Цитомегаловирусная инфекция у недоношенных новорожденных детей: количественные методы лабораторного анализа. // VIII Международный конгресс "Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации", 14-17 ноябрь, РУДН, Москва - 2007, стр.473474. / соавт.: Павлова М.В., Федорова Н.Е., Гаджиева З.С., Гетия Е.Г., Дегтярева М.В., Щербо С.Н., Евсегнеева Ж.В., Гущин B.C., Выжлова Е.Н., Малиновская ВВ., Кущ А.А.

61. Выявление маркеров герпесвирусных инфекций у недоношенных новорожденных детей. // VI Конгресс детских инфекционистов России "Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики", 13-14 декабрь, Москва - 2007, стр. 18-19. / соавт.: Гаджиева З.С., Павлова М.В., Климова P.P., Федорова Н.Е., Щербо С.Н., Евсегнеева Ж.В., Гущин B.C., Выжлова Е.Н., Малиновская В.В., Кущ А.А, Гетия Е.Г., Дегтярева М.В.

62. Персистенция герпесвирусов у детей с осложненным течением раннего неонатального периода изменяет цитокиновый статус новорожденных детей. // Мат. III Ежегодного конгресса и VI Съезда Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины «Современная перинаталогия: организация, технология и качество» (29-30 сентября) в журнале «Вопросы практической педиатрии», Москва - 2008, Том 3, №5, стр.17-18. / соавт.: Гетия Е.Г., Паршина О.В., Гусева Т.С., Кущ А.А., Климова P.P., Гаджиева З.С., Павлова М.В., Володин Н.Н., Малиновская В.В., Дегтярева М.В.

63. Quantitative methods of analysis of cytomegalovirus infection in preterm infants during the 6 months. // Clinical Virology Annual Meeting, Saariselkfl, 12-15 March, Lapland, Finland - 2008, p.28. / соавт.: Pavlova M.V., Fedorova N.E., Gadzhieva Z.S., Kushch A.A. Getiya E.G., Degtyareva M.V., Malinovskaya V.V., Shcherbo S.V., Evsegneeva Zh.V.

64. Врожденные пневмонии как одно из проявлений внутриутробной инфекции. // Сборник материалов XVI съезда педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии», 16-19 февраль, Москва - 2009, стр.285. / соавт.: Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Парсегова Т.С., Кущ А.А.

65. Проявления внутриутробного инфицирования у доношенных и недоношенных детей (по материалам аутопсии). // Сборник материалов XVI съезда педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии», 16-19 февраль, Москва - 2009, стр.286. / соавт.: Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Парсегова Т.С., Кущ А.А.

66. Perinatal risk factors for fetal contamination (infection) pathologies and death in the perinatal and infantile period. // Abstracts 4lh Europaediatrics, Moscow - 2009, p. / соавт. Nisevich L., Talalaev A., Kask L., Kushch A.

Список использованных сокращений

АГ- антиген

АПФ - аминокислотные производные фуллерена С(,о AT - антитело

БКМ - быстрый культуральный метод

БОЕ - бляшкообразующая единица

ВКЖ - вируссодержащая культуральная жидкость

ВУИ - внутриутробное инфицирование

ГВИ - герпесвирусные инфекции

ГЦВ - ганцикловир

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИА - индекс авидности

ИППП - инфекции, передаваемые половым путем ИФА - иммуноферментный анализ ИФН - интерферон

МИ - множественность инфицирования МКА - моноклональные антитела

ОАГА - осложненный акушерско-гинекологический анамнез

ПСА - поликлональные антитела

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР - IS - полимеразная цепная реакция in situ

ПЦР - RT - полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени РИФ (РНИФ) - реакция прямой (непрямой) иммунофлюоресценции УФ - ультрафиолет

ФЛЭЧ - фибробласты легкого эмбриона человека

ХТИ - химиотерапевтический индекс

ЦД - цитотоксическая доза

ЦМВ - цитомегаловирус человека

ЦМВИ - цитомегаловирусная инфекция

ЦПД - цитопатическое действие

Заказ № 85-a/l 1/09 Подписано в печать 13.11.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2

; ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

^J) www.cfr.ru ; e-mail:info@cfr.ru

Информация о работе

Алиева, Айна Ахмедовна
доктора биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.06

Автореферат

Похожие работы