Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Диагностика цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей и оценка анти-ЦМВ активности новых мембраноактивных полианионных соединений in vitro

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Диагностика цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей и оценка анти-ЦМВ активности новых мембраноактивных полианионных соединений in vitro"

На правах рукописи

ПАВЛОВА МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ДИАГНОСТИКА ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У НЕДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ И ОЦЕНКА АНТИ-ЦМВ АКТИВНОСТИ НОВЫХ МЕМБРАНОАКТИВНЫХ ПОЛИАНИОННЫХ СОЕДИНЕНИЙ IN VITRO

03.00.06 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Москва - 2008 г.

003454694

Работа выполнена в ГУ НИИ вирусологии им Д И. Ивановского РАМН.

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Кущ Алла Александровна. Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Чешик Святослав Георгиевич Доктор биологических наук Каражас Наталья Владимировна

Ведущая организация:

ГУ НИИ вакцин и сывороток им И.И. Мечникова РАМН

Защита состоится « О _» декабря 2008 г. в 12.00 часов

на заседании Диссертационного Совета Д.001.020.01 при ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: 123098 Москва, ул. Гамалеи, д. 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при ГУ НИИ вирусологии им Д И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан «_• ноября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор медицинских наук

Е.И. Бурцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) является одной из самых распространенных причин врожденных вирусных инфекций и может вызывать тяжелые патологии, вплоть до гибели ребенка (Орехов и др., 2004; Alford et al., 1990; Gaytant et al., 2002) По данным отечественных и зарубежных специалистов от 0,5 до 5% детей появляются на свет с врожденной ЦМВИ, из них около 90% детей являются бессимптомными носителями (Kenneson et al., 2007; Gaytant et al., 2002) Вместе с тем, субклиническая форма ЦМВИ не означает гарантии благополучия в дальнейшем у 5-15% таких детей в ближайшие 1-2 года и в более поздние сроки регистрируются нарушения ЦНС, органов слуха, зрения, отмечается детский церебральный паралич, отставание в умственном развитии, плохая успеваемость в школе (Michaels, 2007; Suresh et al, 1999)

Диагностика ЦМВИ у новорожденных детей часто представляет сложную задачу в связи с отсутствием типичных симптомов и признаков ЦМВИ, а также из-за особенностей иммунной системы новорожденных Недоношенные новорожденные представляют группу высокого риска по развитию ЦМВИ, так как известно, что заболеваемость у таких детей повышена по сравнению с доношенными новорожденными (Yamamoto et al., 2001) Несмотря на многочисленные исследования, посвященные этой проблеме, разработка четких и общепринятых рекомендаций по лабораторному обследованию недоношенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией с подозрением на ЦМВИ в России остается нерешенной задачей. Важность решения проблемы своевременного выявления врожденной и перинатальной ЦМВИ объясняется также тем, что именно ЦМВИ часто служит причиной гибели детей во втором полугодии жизни (Долгих и др, 1999).

Не менее важной проблемой является выбор адекватной терапевтической тактики лечения новорожденных с ЦМВИ. Существующие в настоящее время единичные патентованные препараты, обладающие противовирусной активностью в отношении ЦМВ, не применяются у новорожденных и детей раннего возраста вследствие их высокой токсичности Кроме того, эффективность лечения имеющимися препаратами снижена из-за развития лекарственной устойчивости, часто возникающей при длительном применении (Biron et al, 2006, Chou et al., 1999). Поэтому поиск эффективных и нетоксичных анти-ЦМВ агентов, перспективных в качестве химиотерапевтических средств при ЦМВИ, остается важной и актуальной проблемой

Цель и задачи исследования.

Цель настоящего исследования заключалась в изучении маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей и детей раннего возраста с сочетанной перинатальной

патологией в течение первого года жизни, а также в исследовании антивирусной активности новых поликарбоксилатных соединений, модифицированных мембранотропными и аминосульфокислотными фармакофорами на модели экспериментальной ЦМВИ in vitro.

Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:

1. Выявить прямые маркеры ЦМВ (ДНК и инфекционную активность) у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста с сочетанной перинатальной патологией

2. Установит присутствие противовирусных антител классов IgM и IgG и индекс авидности антител IgG у недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками внутриутробного инфицирования.

3. Изучить динамику маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей в течение первого года жизни.

4 Определить цитотоксичность и антивирусную активность новых поликарбоксилатных соединений, модифицированных мембранотропными и аминосульфокислотными фармакофорами, на модели экспериментальной ЦМВИ in vitro в лечебной, профилактической, вирулицидной и микробицидной схемах воздействия.

5. Выяснить возможный механизм анти-ЦМВ активности новых поликарбоксилатных соединений.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Установлено, что для достоверной диагностики ЦМВИ у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста необходим комплекс методов, включающих выявление противовирусных антител и их авидности, а также обнаружение прямых маркеров ЦМВ.

2 Изучение динамики маркеров ЦМВ у недоношенных новорожденных детей в течение первого года жизни показало необходимость проведения неоднократного вирусологического обследования данной группы риска по развитию ЦМВИ минимум до 1 года.

3 Впервые установлено, что новые поликарбоксилатные соединения, модифицированные мембранотропными и аминосульфокислотными фармакофорами, обладают низкой цитотоксичностью и высокой антивирусной анти-ЦМВ активностью

4. Впервые показано, что мембраноактивные полианионные соединения обладают двунаправленным действием на ЦМВ предотвращают его проникновение в чувствительные клетки и обладают внутриклеточным противовирусным действием.

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Показана высокая частота выявления ЦМВИ у недоношенных маловесных новорожденных детей с сочетанной перинатальной патологией по сравнению с доношенными новорожденными детьми

2. Установлена необходимость проведения неоднократного (по крайней мере, трехкратного) вирусологического обследования детей из этой группы риска по развитию ЦМВИ в течение первого года жизни

3 Среди новых мембраноактивных полианионных соединений выявлены соединения, обладающие низкой цитотоксичностью и высокой антивирусной анти-ЦМВ активностью Максимальный эффект противовирусного действия установлен для AS-688, химиотерапевтический индекс для которого в вирулицидной, микробицидной и лечебной схемах воздействия составляет не менее 3000.

4. Показано, что мембраноактивные полианионные соединения эффективно подавляют проникновение ЦМВ в чувствительные клетки, а также ингибируют накопление вирусной ДНК и экспрессию поздних структурных белков ЦМВ в зараженных клетках.

Апробация работы.

Основные положения работы были представлены на Международном Междисциплинарном Симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Крым, Украина, 2006г.), на VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007г.), на VI Конгрессе детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики» (Москва, 2007г.), на Ежегодном конгрессе клинической вирусологии (Saanselka, Финляндия, 2008г), на V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008г.), на III Ежегодном конгрессе и VI Съезде Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины «Современная перинатология: организация, технология и качество» (Москва, 2008г.), на Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» и IV Международной конференции по иммунотерапии (Москва, 2008г.). В завершенном виде доклад по диссертационной работе прошел предварительную экспертизу на совместном заседании Отдела молекулярной вирусологии и совета по предварительной экспертизе диссертационных работ ГУ НИИ вирусологии им Д И. Ивановского РАМН от 27 сентября 2008 г

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 279 источников отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 155 страницах машинописного текста и содержит 7 таблиц и 16 рисунков.

По результатам исследования опубликовано 11 научных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Культура клеток. В работе использовали диплоидные фибробласты легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ) полученные из Медико-генетического научного центра РАМН (Москва). Культуру клеток выращивали в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина.

Вирус. Использовали референс штамм ЦМВ AD 169, любезно предоставленный доктором D. Emanuel (США) Вирус поддерживали путем пассирования на культуре клеток ФЛЭЧ.

Определение инфекционной активности вируса. Определение инфекционной активности вируса проводили модифицированным методом «черных» бляшек. Для титрования готовили возрастающие десятикратные разведения вируса. Очаги инфицированных клеток (бляшек) выявляли иммуноцитохимическим методом с использованием смеси моноклональных антител (МКА) к белкам 1Ер72 и рр65. Окрашенные бляшки идентифицировали и подсчитывали с помощью светового микроскопа. Титр вируса выражали в количестве бляшкообразующих единиц, содержащихся в 1 мл (БОЕ/мл).

Пациенты. В 2006-2008 гг. было обследовано 157 новорожденных детей, родившихся в специализированном акушерском отделении ГБ №8 Департамента Здравоохранения г. Москвы 107 недоношенных новорожденных детей имели клинические признаки внутриутробного инфицирования (ВУИ) и находились в отделении реанимации и интенсивной терапии 50 практически здоровых новорожденных родились в отделении физиологии и не имели признаков ВУИ, из них 18 детей родились преждевременно (срок гестации <37 недель).

Быстрый культуральный метод (БКМ). Для определения инфекционной активности ЦМВ в клиническом материале использовали БКМ, который проводили согласно Методическим рекомендациям Роспотребнадзора №02.030-08 (Москва, 2008). Клетки ФЛЭЧ высаживали в 24-луночные панели в концентрации 250 тыс клеток в 1 мл. Через 48 часов культивирования, вносили образцы слюны, осадка мочи или лейкоцитарной фракции крови и проводили совместное центрифугирование клеток ФЛЭЧ с клиническими образцами в течение 35 мин. при 2 500 об./мин После отмывки фибробласты инкубировали в течение 24 часов, затем фиксировали охлажденным метанолом (-20° С) в течение 20 мин. Детекцию ЦМВ-инфицированных клеток проводили с помощью моноклональных антител к 1Ер72 и рр65 ЦМВ. Выявляющими антителами служили антимышиные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (DAKO, Швеция) Результаты выявления ЦМВ с помощью БКМ выражали в количестве окрашенных клеток на 2,5x105 клеток ФЛЭЧ.

Твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА). Определение антител к ЦМВ классов М и G в сыворотке крови проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА), используя коммерческие наборы фирмы "Диагностические системы" (Россия) Для выявления антител класса IgM использовали тест-систему "ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-М СМ-153", для выявления антител класса IgG - "ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G СМ-151". Анализ и

интерпретацию результатов осуществляли в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

Авидность антител. Индекс авидности (ИА) специфических IgG определяли с помощью тест-системы фирмы "Диагностические системы" ("ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G Авидность СМ-152", Россия) Оценку результатов осуществляли согласно рекомендациям фирмы-производителя.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Определение ДНК ЦМВ в клинических образцах методом ПЦР проводилось в лаборатории «Диасан» (Москва). В работе были использованы набор реагентов для выявления нуклеотидных последовательностей (cytomegalovirus) методом полимеразной цепной реакции «ЦМВ Ам» научно-производственной фирмы «ГЕНтех» (Москва), согласно инструкции фирмы производителя. Чувствительность определения ДНК ЦМВ составляла 103 молекул вирусной ДНК в 1 мл.

Мембраноактивные полианионные соединения (МПС). МПС были синтезированы в ИЦ биомодуляторов и лекарственных соединений НИФ Здоровья совместно с ИНХС им. А.В. Топчиева РАН (Москва). Макромолекулы этих соединений имеют сходное полимерно-чередующееся строение, имитирующее чередование фуран-производных и кислотных структур в полимерной основе нуклеиновых кислот. Соединения различаются по химическому составу боковых групп (X) различной фармакофорной функциональности (Табл.1). В данной работе было изучено восемь образцов МПС.

Таблица 1. Химический состав исследуемых МПС общей формулы

СОХ

№ Соединение Соотношение боковых групп (X) различной химической структуры в составе макромолекулы (мол. %)

Карбокси- Адамантан- Норборнен- Сульфокислотно-

кислотные содержащие содержащие анионные

1 As-470 100 0 0 0

2 As-473 94 6 0 0

3 As-632 93 7 0 0

4 As-504 92 0 8 0

5 As-677 86 0 8 6

6 As-678 79 0 8 13

7 As-679 67 0 8 25

8 As-688 60 0 0 40

Определение цитотоксичности МПС. Цитотоксичность определяли по влиянию на жизнеспособность клеток ФЛЭЧ, которую оценивали методом исключения витального красителя трипанового синего.

О цитотоксическом действии каждого из тестируемых соединений судили по концентрации, вызывающей гибель 50% клеток на 3-е сутки после внесения МПС - так называемая хроническая цитотоксичность или ЦД50 Определяли также концентрацию, вызывающую гибель 50% клеток в течение 24 часов, соответствующую острой цитотоксичности (ОЦЦ50), и максимально переносимую дозу (МПД), соответствующую концентрации МПС, которая не влияла на жизнеспособность клеток на протяжении 7-ми суток воздействия вещества

Определение антивирусной активности МПС. Для определения анти-ЦМВ активности использовали четыре схемы воздействия МПС: лечебную, профилактическую, вирулицидную и микробицидную.

Лечебная схема Монослой клеток заражали вирусом с различной множественностью инфицирования (МИ) - от 0,1 БОЕ/кл. до 0,0001 БОЕ/кл. После адсорбции вируса в течение 1 часа при 37° С клетки дважды промывали и вносили среду поддержки, содержащую 2% сыворотки, и исследуемые соединения в различных концентрациях.

Профилактическая схема На клеточный монослой вносили среду поддержки, содержащую МПС в различных концентрациях, и инкубировали в течение 24 часов. После обработки клетки дважды промывали и заражали вирусом с различной МИ - от 0,1 БОЕ/кл до 0,0001 БОЕ/кл в течение 1 часа при 37 "С Монослой клеток дважды промывали и вносили среду поддержки.

Вирулицидная схема. Вирус с МИ 0,01 БОЕ/кл инкубировали совместно с МПС в различных концентрациях в течение 1 часа при 37° С. Затем вирус, инкубированный с МПС, наносили на монослой клеток и выдерживали в течение 1 часа. Монослой клеток дважды промывали и вносили среду поддержки.

Микробщидная схема На клеточный монослой вносили среду без сыворотки, содержащую МПС в различных концентрациях, и инкубировали в течение 1 часа Затем сюда же, не отбирая вещество, вносили вирус с различной МИ - от 0,1 БОЕ/кл до 0,0001 БОЕ/кл. и снова инкубировали 1 час при 37° С Монослой клеток дважды промывали и вносили среду поддержки.

Антивирусную активность во всех схемах оценивали по способности ЦМВ к бляшкообразованию и по цитопатогенному действию вируса (ЦПД). Концентрацию соединения, вызывающую ингибирование вирусного ЦПД на 50% по отношению к контролю, принимали за ингибирующую дозу (ИД50). Химиотерапевтический индекс (ХТИ), или индекс селективности (ИС), рассчитывали как отношение концентрации препарата, вызывающей 50%-ый цитотоксический эффект (ЦЦ50), к концентрации, вызывающей 50% антивирусный эффект (ИД50).

Определение продукции инфекционно активного вируса. Для определения влияния МПС на репродукцию ЦМВ клетки заражали вирусом с МИ 0,1 БОЕ/кл. и 0,01 БОЕ/кл. После адсорбции вносили МПС в различных концентрациях. На 5-е сутки после заражения, когда в контроле (без МПС) наблюдалось полное ЦПД, отбирали культуральную жидкость из опытных и контрольных культур. Отобранной вируссодержащей жидкостью заражали неинфицированные клетки ФЛЭЧ. Об инфекционной активности вируса в опытных и контрольных образцах судили по количеству образовавшихся вирусных бляшек.

Иммуноцитохимический метод выявления вирусспецифических белков.

Сверхранний 1Ер72, ранний рр65 и поздний структурный gB белки ЦМВ определяли в инфицированных клетках ФЛЭЧ методом иммуноцитохимического окрашивания. Для этого использовали моноклональные антитела (МКА), специфичные к вирусным белкам и инкубировали в течение 1 часа при 37° С. В качестве выявляющих антител использовали поликлональные кроличьи анти-мышиные иммуноглобулины, конъюгированные с пероксидазой хрена (DakoCytomation, Дания) Реакцию проявляли диаминобензидином (DAB), Biosciences, США Препараты анализировали с помощью флуоресцентного/ светового микроскопа Olympus ВХ-51 (Япония), оснащенного объективами 4х, 10х, 40х и цифровой камерой Olympus U-CMAD3.

Изучение динамики накопления ДНК ЦМВ методом ПЦР в реальном времени.

Монослой ФЛЭЧ заражали ЦМВ с МИ 0,01 БОЕ/кл. После адсорбции вируса вносили изучаемое вещество в соответствующей концентрации. На 1, 3, 5 и 10-е сутки клетки промывали 0,1 М ФСБ и обрабатывали трипсином Полученную суспензию клеток центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин, осадок клеток обрабатывали лизирующим буферным раствором ДНК ЦМВ из лизированных клеток выделяли, используя комплекты реагентов «ДНК-сорб-АМ» (производства ФГУН Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии Роспотребнадзора). ПЦР-амплификацию проводили с применением набора реагентов для выявления ДНК цитомегаловируса человека (CMV) в клиническом материале методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® CMV-FL» (производства ФГУН Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии Роспотребнадзора). Детекцию продуктов ПЦР-амплификации в количественном варианте осуществляли при помощи прибора «iQ lCycler» (Bio-Rad, США).

Внутриклеточная локализация МПС в диплоидных фибробластах человека. Для

изучения проникновения и внутриклеточной локализации МПС использовали ФИТЦ-меченые образцы соединения AS-679 (AS-679FLU).

Клетки ФЛЭЧ высаживали на стекла в 24-луночные планшеты в концентрации 200 тыс. клеток в 1 мл. Через 24 часа культивирования при температуре 37°С в атмосфере 5% СОг на монослой клеток вносили меченый ФИТЦ AS-679FLU в концентрации 100 мкг/мл. Исследуемое соединение инкубировали с клетками в течение 7 дней. Через 24 часа, а также на 3, 5 и 7 сутки

покровные стекла с клетками тщательно отмывали ФСБ (рН=7,4) и фиксировали холодным метанолом при -14°С в течение 20 минут. Отмытые от метанола препараты анализировали. Изображения регистрировали с помощью флуоресцентного микроскопа Axiovert 200М (Carl Zeiss), оснащенного объективом Plan-Neofluar lOOx 1,3 и цифровой камерой Orea II ERG-2 (Hamamatsu) Параллельно регистрировали фазово-контрастное изображение.

Статистическая обработка результатов. Подсчет средних значений и стандартных ошибок проводили с использованием пакета прикладных компьютерных программ STATISTICA 6 Значимость различий оценивали по t-критерию Стьюдента Частоту встречаемости маркеров ЦМВ анализировали с помощью критерия Хи-квадрат. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Выявление внутриутробной ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ лабораторными методами диагностики на первой неделе жизни.

В ходе выполнения работы было проведено комплексное исследование маркеров ЦМВИ у 157 новорожденных детей, родившихся в специализированном акушерском отделении ГБ №8 Департамента Здравоохранения города Москвы. Обследованные дети были разделы на три группы Основную группу (группа 1) составили недоношенные новорожденные дети (п=107) с гестационным возрастом от 25 до 36 недель (в среднем 29,8±2,8 недель) с клиническими признаками внутриутробной инфекции (ВУИ), переведенные в отделение реанимации и интенсивной терапии В группу сравнения (группа 2) были включены недоношенные новорожденные дети без клинических признаков ВУИ (18 детей, гестационный возраст от 32 до 37 недель, в среднем - 34,6±1,2 недель) Контрольную группу (группа 3) составили доношенные новорожденные дети, родившиеся без признаков ВУИ (32 ребенка, гестационный возраст 38-41 недель, в среднем - 38,9±0,8 недель).

Для определения инфекционной активности ЦМВ и вирусной ДНК использовали количественные варианты БКМ и ПЦР, соответственно.

На первой неделе жизни инфекционная активность ЦМВ методом БКМ была выявлена у 16,8% детей группы 1 (18/107), тогда как в группах 2 и 3 вирус не выявлялся ни в одном из изученных случаев (таблица №2). Методом ПЦР ДНК ЦМВ выявлена у 15,9% детей основной группы (17/107), у 5,6% (1/18) детей группы сравнения и в 6,3% случаев (2/32) в контрольной группе доношенных детей без ВУИ. С помощью двух методов в группе 1 на первой неделе жизни у 28 недоношенных новорожденных детей в клинических образцах методом ПЦР и/или БКМ были выявлены прямые маркеры ЦМВ, что составило 26,2% Обнаружение ЦМВ прямыми лабораторными методами у ребенка на первой недели жизни свидетельствует о внутриутробной передаче вируса от матери к ребенку (Revello, 2002). Таким образом, можно

утверждать, что у 26,2% недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ была выявлена внутриутробная ЦМВИ.

Таблица №2. Выявление прямых маркеров ЦМВИ у новорожденных детей

Группы детей ДНК ЦМВ Инфекционная активность ЦМВ

группа 1 (основная) 15,9% (17/107) 16,8% (18/107)

группа 2 (сравнения) 5,6% (1/18) 0% (0/18)

группа 3 (контрольная) 6,3% (2/32) 0% (0/32)

Для оценки частоты обнаружения ЦМВ в отдельных образцах было изучено 569 образцов. Установлено, что чаще всего ЦМВ выявлялся в моче (суммарно методами БКМ + ПЦР в 41% всех изученных образцов), реже в слюне - 27%, в крови и в ликворе у 14-18% больных детей Эти данные согласуются с результатами о том, что в моче ЦМВ обнаруживается в количествах в 180 раз больших, чем в крови (НаЫасЬз-Ваишапп с1 а1., 2002) На основании этих данных диагностика внутриутробной ЦМВИ в медицинских центрах европейских стран проводится путем изучения мочи БКМ.

Согласно имеющимся данным, спектр АТ и их авидность более полно характеризуют иммунный ответ организма на вирусную инфекцию, чем рутинное определение присутствия АТ в крови, и позволяют судить об активности инфекционного процесса и его продолжительности (СИакгауаги е1 а1., 2007, МосагеЬ, 1993). Выявление низкоавидных анти-ЦМВ-АТ 1йО может свидетельствовать о первичной ЦМВИ, о текущем заболевании и о недавнем заражении. Обнаружение высокоавидных антител позволяет констатировать уже перенесенную или рекурентную ЦМВИ (Коровина, 2001). Для изучения состояния специфического гуморального иммунитета новорожденных детей были использованы серологические методы диагностики' тИФА и определение индекса авидности специфических АТ (ИА). Полученные данные представлены в таблице №3.

Таблица №3. Результаты обследования новорожденных детей с помощью серологических

методов исследования.

Группы детей Анти-ЦМВ 1ёМ Отсутствие анти-ЦМВ ДО Авидность анти-ЦМВ АТ, индекс авидности (ИА)

АТ АТ (ИА) < 0,6 (ИА) > 0,6

группа 1 0,93% 8,4% 30% 47,7%

(основная) (1/107) (9/107) (32/107) (51/107)

группа 2 0% 16,7% 27,8% 55,6%

(сравнения) (0/18) (3/18) (5/18) (10/18)

группа 3 0% 9,4% 12,5% 75%

(контрольная) (0/32) (3/32) (4/32) (24/32)

Серологические тесты показали, что в периферической крови у подавляющегося большинства детей присутствовали антитела к ЦМВ класса IgG Анти-ЦМВ-IgG отсутствовали у 9 (8,4%) новорожденных из группы 1. У 1 из этих детей на первой неделе жизни были идентифицированы также маркеры острого инфекционного процесса - анти-ЦМВ-IgM (таблица №3) Невысокая частота выявления анти-ЦМВ класса M у новорожденных также отмечается другими авторами (Donner, 1993, Nelson, 1997).

Оценка авидности IgG-AT показала, что среди недоношенных новорожденных с ВУИ у 32 из 107 (30%) детей индекс авидности (ИА) был представлен низким значением (ИА<0,6), а у 51 (47,7%) IgG-AT обладали ИА>0,6 (таблица №3) Показано, что у 65,4% детей с ВУИ, в крови которых AT класса IgG отсутствовали, либо обладали ИА<0,6, были выявлены прямые маркеры ЦМВИ. В то же время у остальных детей, имеющих прямые маркеры ЦМВ в этот срок, в крови присутствовали только высокоавидные IgG. Возможно, что для проявления активности ЦМВ у новорожденных важную роль играет не только авидность и репертуар IgG AT, содержащихся в сыворотке ребенка, но и нейтрализующие свойства этих AT. Однако надо учитывать, что у недоношенных новорожденных детей доля AT, обладающих нейтрализующими свойствами, зависит от возраста гестации. Так, только к 34 неделям гестации 99% нейтрализующих материнских AT достигают сыворотки плода (Karen, 2006).

В группе недоношенных новорожденных детей без ВУИ соотношение AT IgG высокой и низкой авидности приблизительно соответствовало таковому для группы недоношенных новорожденных детей с ВУИ, однако анти-ЦМВ-IgM обнаружено не было. В группе доношенных новорожденных детей без ВУИ маркеры острого инфекционного процесса также отсутствовали и преобладали IgG-AT с ИА>0,6, наблюдаясь в 75% случаев (таблица №3).

Таким образом, проведенные исследования показывают, что для верификации и постановки диагноза врожденной ЦМВИ у новорожденных детей необходимо комплексное обследование, включающее помимо рутинных серологических методов изучение авидности AT и выявление прямых маркеров ЦМВ. При этом БКМ позволяет в короткие сроки определить в организме больного ребенка не только наличие вирусного ДНК-генома, но и его инфекционную активность.

Динамика выявления маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей в течение первого года жизни.

Из 107 недоношенных новорожденных детей группы 1, первично обследованных на 1 неделе жизни, клинические материалы от 26 детей были изучены в динамике трижды Повторные обследования проводили через 1-3 и 5-7 месяцев после рождения. Результаты обследования недоношенных новорожденных детей с признаками ВУИ в динамике представлены на схеме №1.

Из 26 детей на 1 неделе жизни прямые маркеры ЦМВИ (положительный анализ БКМ и/или ПЦР) были обнаружены у 9 из 26 детей, что составило 34%. При выявлении

инфекционной активности ЦМВ методом БКМ вирусная нагрузка составляла 2-3 инфекционные частицы в 0,2 мл клинического материала.

Схема №1. Анализ прямых маркеров ЦМВ у недоношенных новорожденных детей с признаками ВУИ в динамике

При повторном обследовании детей через 1-3 месяца после рождения у 7 из 9 (77,7%) первично инфицированных вирус обнаружен не был, у 2 детей ЦМВ был выявлен повторно. Можно предположить, что элиминация вируса у недоношенных новорожденных с внутриутробной ЦМВИ явилась результатом проведения комплексной этиотропной, посиндромной и иммуномодулирующей терапии в отделениях реанимации новорожденных. Возможно, элиминация ЦМВ является также результатом сочетанного действия терапии и активизации собственного гуморального и клеточного антивирусного ответа у повторно обследованных детей.

Важно отметить, что через 1-3 месяца после рождения у 5 из 26 (других) детей (19,2%) ЦМВ был обнаружен впервые. При первичном обследовании вирус выявлен не был. Интересным является тот факт, что у 3 из 5 детей, у которых была выявлена инфекционная активность ЦМВ методом БКМ, была обнаружена высокая вирусная нагрузка, которая варьировала от 200 до 40 ООО инфекционных частиц в 0,2 мл пробы. У 2 детей была обнаружена только ДНК ЦМВ Возможно, это связано с отсроченным проявлением внутриутробной бессимптомной ЦМВИ, которое отмечалось рядом авторов (Barbi, 2003; Malinger, 2003). Не исключено также, что инфицирование этих новорожденных ЦМВ произошло уже в неонатальном периоде, в частности, при вскармливании младенцев грудным молоком (Lawrence, 2006). Такие дети нуждаются в дальнейшем обследовании, поскольку ЦМВИ часто

выявляется, а иногда и служит причиной гибели детей во втором полугодии жизни (Нисевич и соавторы, 2005, 2006.).

Через 5-7 месяцев после рождения у 1 из 7 детей (14,3%), у которых в возрасте 1-3 месяцев выявлялись прямые маркеры ЦМВИ, вирус элиминировался. В то время как у остальных 6 детей (85,7%) ЦМВ продолжал определяться. Следует отметить, что на этом сроке еще у 3 детей (11,5%) впервые появились прямые маркеры ЦМВ. В целом на 5-7 месяце жизни у 9 из 26 детей присутствовал ЦМВ, что составило 34,6%

Из групп доношенных и недоношенных новорожденных без ВУИ повторно были обследованы 15 детей через 7-12 месяцев после рождения. У одного ребенка в моче спустя 8 месяцев после первичного обследования был обнаружен инфекционно активный вирус (1000 вирусных частиц в 0,2 мл). ДНК ЦМВ была выявлена у 5 из 15 детей (33,3%), однако интенсивность окраски полос в агарозном геле была минимальная и не превышала интенсивности, оцениваемой на 1-2 креста (из четырех).

За время проведения исследования в группе 1 из 107 недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ отмечены 10 летальных исходов (9,3%), в контрольной группе летальных исходов не было. Среди 10 умерших детей у 6 детей были выявлены прямые маркеры ЦМВИ. У 4 детей на первой неделе жизни вирусные маркеры обнаружены не были, смерть наступила на второй неделе жизни.

Таким образом, на первом году жизни из 26 обследованных в динамике недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ у 17 детей (65,4%) в различные сроки были выявлены прямые маркеры ЦМВИ, что согласуется с результатами других исследований (Maschmann, 2001; Меджидова, 2005), подтверждающими высокий риск развития ЦМВИ у этой группы новорожденных детей.

Сравнительное изучение серологических показателей и вирусных маркеров в динамике было проведено у 75 недоношенных новорожденных детей с ВУИ из группы 1. В течение первого года жизни наблюдалась корреляция обнаружения/элиминации ЦМВ с серологическими показателями (схема №2). Так, у 21 ребенка из 75 детей группы 1 через 1-6 месяцев после рождения в материалах были впервые выявлены прямые маркеры ЦМВИ. В периферической крови 13 из этих 19 детей (2 ребенка не были обследованы) в 68,4% случаев при повторных исследованиях происходило либо выведение высокоавидных, по всей видимости, материнских IgG-AT и появление собственных низкоавидных IgG-AT с ИА<0,6 (52,6%), либо резкое снижение активности IgG-AT и выявление анти-ЦМВ-IgM (15,8%) (схема №2). Эти обстоятельства и могли служить главной причиной появления ЦМВ (активации ЦМВИ) при последующих исследованиях Элиминация прямых маркеров ЦМВ из организма детей с внутриутробной ЦМВИ в течение первых 3 месяцев жизни произошла у 19 детей из 28 (68%). Из этих 19 детей серологическими методами анализа было обследовано 16. У 12 из 16 (75%) детей по серологическим показателям в крови элиминация вируса сопровождалась появлением собственных анти-ЦМВ-IgG или сменой низкоавидных IgG-AT (6/12, 50%) на

высокоавидные или же повышением активности ^в-АТ в несколько раз (4/12, 25%) (схема №2). Известно, что низкоавидные АТ персистируют в сыворотке крови в течение примерно 20 недель после первичной инфекции, затем авидность АТ увеличивается и остается высокой в течение всей жизни (ЬаггагоКо, 2008).

Схема №2. Выявление серологических маркеров ЦМВИ у новорожденных детей в

динамике

Суммируя полученные результаты выявления маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ в течение первого года жизни, можно сделать следующие выводы."

1. Частота встречаемости ЦМВ среди недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ, находящихся в отделении реанимации и интенсивной терапии, статистически значимо превышало таковую среди новорожденных детей без симптомов ВУИ (26,2% против 6,3%, р<0,05) Это указывает на необходимость исследования маркеров ЦМВ у детей с клиническими признаками ВУИ.

2. Для эффективной диагностики врожденной ЦМВИ у новорожденных и детей раннего возраста необходимо комплексное обследование мочи и крови детей на первой неделе жизни (в течение первых 3-х недель жизни), включающее не только рутинный метод тИФА для качественного определения анти-ЦМВ IgG и IgM, но также определение индекса авидности анти-ЦМВ IgG, а также использование БКМ и ПЦР как прямых методов обнаружения ЦМВ.

3. При вирусологическом обследовании новорожденных с признаками ВУИ недостаточно однократного изучения клинических материалов на первой неделе жизни, так как у большей части новорожденных вирус элиминировался к 1-3 мес. жизни, тогда как у 19,2% детей вирус впервые появился через 1-3 мес. и у 11,5% — через 5-7 мес. после рождения. Необходимо исследование клинических материалов в динамике через 1-3 и 6-7 месяцев после рождения для установления возможной реактивации или заражения ЦМВ.

Противовирусная активность мембраноактивных полианионных соединений (МПС) в отношении ЦМВ человека in vitro.

Вторая часть настоящей работы была посвящена изучению противовирусной активности новых мембраноактивных полианионных соединений на модели экспериментальной ЦМВИ in vitro

Исследования цитотоксического действия МПС на фибробласты человека и их анти-ЦМВ активности показали, что соединения обладают различной степенью цитопатогенности и противовирусной активности (таблица №2). По совокупности полученных данных соединения AS-688 и AS-679 представлялись наиболее перспективными и были выбраны для изучения их влияния на репродукцию инфекционно активного ЦМВ в культуре клеток

При заражении вируссодержащей культуральной жидкостью (ВКЖ) от клеток, инфицированных ЦМВ с ИМ 0,1 БОЕ/кл. и обработанных AS-688 в концентрации 100 мкг/мл, развитие ЦПД было снижено на 70% относительно контроля, обработанных AS-679 той же концентрации - на 55% (рис.1). При обработке зараженных клеток AS-688 в концентрации 10 мкг/мл, 1 мкг/мл и ОД мкг/мл количество вирусспецифических бляшек составило 45%, 46% и 71% от контроля, соответственно При обработке зараженных клеток AS-679 в тех же концентрациях соответствующие значения составили 47%, 66% и 80% Рассчитанное по графику, 50% подавление инфекционной активности вируса под действием AS-688 достигалось при концентрации соединения 0,8 мкг/мл, а под влиянием AS-679 - 8 мкг/мл (рис 1)

концентрция, мкг/мл -*-Аз-688, МИ=0,01 БОЕ/кл -»-А5-688, МИ=0,1 БОЕ/кл -Х-А5-679, МИ=0,01 БОЕ/кл -а-А5-679, МИ=0,1 БОЕ/кл

Рис.1. Влияние А8-688 и А8-679 на инфекционную активность ЦМВ

Использование ВКЖ от клеток, зараженных ЦМВ с МИ 0,01 БОЕ/кл , при аналогичной постановке опыта позволило установить, что А5-688 вызывает 50% подавление репродукции инфекционно активного вируса при концентрации 0,5 мкг/мл, а АБ-679 - при 4,2 мкг/мл (рис.1). Анализ результатов позволил заключить, что соединения АЭ-688 и А8-679 достоверно подавляют инфекционную активность ЦМВ. При этом степень подавления вирусной активности находилась в прямой зависимости от концентрации вещества и множественности

инфицирования ЦМВ. Следует также отметить, что соединение А5-688 по сравнению с А3-679 как при высокой, так и низкой МИ подавляло инфекционную активность ЦМВ в 10 раз эффективнее.

Изучение противовирусного действия 8 соединений, результаты которого приведены в таблице №2, показало, что соединение А5-688 оказывало наибольшее анти-ЦМВ действие в трех схемах воздействия, микробицидной, профилактической и вирулицидной (таблица №2) Химиотерапевтический индекс, определяемый как отношение ЦЦ50 к ИД50, находился в пределах 3000-4286, что характеризовало его как малотоксичное и одновременно высокоэффективное соединение. Поэтому именно оно и было выбрано для дальнейшего изучения механизма противовирусного действия в отношении ЦМВ

Эффективность АБ-688 в профилактической, вирулицидной и в микробицидной схемах позволяла предположить, что вещество действует на ранних этапах взаимодействия вирус -клетка Для проверки данного предположения фибробласты инфицировали ЦМВ в присутствии исследуемого соединения и фиксировали через 2 часа после внесения вируса, а затем окрашивали МКА к белку ЦМВ рр65, который в случае инфицирования вирусом клетки уже через час обнаруживается в ее ядре. Было установлено, что при МИ 0,5-1 БОЕ/кл. АЭ-688 в концентрации 10 мкг/мл достоверно подавлял проникновение ЦМВ в клетки на 97,4% (р<0,0001) по отношению к инфицированной культуре (58% окрашенных клеток в контроле против 1,5% в присутствии АЭ-688) (рис 2).

Одним из возможных механизмов, объясняющих этот факт, по всей видимости, является конкуренция за специфическую адсорбцию вириона на клеточных рецепторах, ключевую роль в которой на начальных этапах играет электростатическое притяжение. Поверхность клеток имеет избыточный отрицательный заряд, а вирионы (как правило, содержащие оболочку) обычно несут противоположный - положительный заряд В подтверждение высказанного положения можно привести данные о том, что многие соединения полианионного типа, имитирующие градиент отрицательного заряда клеточной поверхности, электростатически связывают активные центры белков оболочки вируса, участвующих во взаимодействии вириона с рецептором, препятствуя его адсорбции на поверхности пермиссивных клеток фе Оегсё, 2002; БЬиЫа, 1999).

Ранее было установлено, что эффективность полианионных соединений повышается с ростом отрицательного заряда молекулы (Сербии, 2004). Действительно, среди восьми изученных соединений АЗ-688, имеющее наибольшее количество сульфокислотных группировок, которые создают мощный отрицательный заряд, оказалось наиболее эффективным против ЦМВ-инфекции.

Таким образом, предположительно полимерно-электростатическое взаимодействие макромолекул соединения А8-688 с вирионами ЦМВ объясняет его прямое вирулицидное действие на внеклеточные вирионы.

Таблица №2. Подавление ЦМВИ в культуре клеток ФЛЭЧ под действием МПС

МПС ЦД50*, мкг/мл МИ Противовирусное действие

Микробицидное Вирулицидное Лечебное Профилактическое

ид5„**, мкг/мл хти*** ид50**, мкг/мл хти*** ИД50**, мкг/мл хти*** ид50**, мкг/мл ХТИ***

А8-470 3500 0,01 >100 <10 >100 <10 >100 <10 >100 <10

0,001 10 350 >100 <10 >100 <10 >100 <10

Ав-473 2500 0,01 100 25 >100 <10 >100 <10 >100 <10

0,001 100 25 >100 <10 >100 <10 >100 <10

А8-504 1700 0,01 >100 <10 >100 <10 >100 <10 >100 <10

0,001 100 17 >100 <10 >100 <10 >100 <10

А8-632 2400 0,01 >100 <10 >100 <10 >100 <10 >100 <10

0,001 10 240 58 41 >100 <10 >100 <10

А8-688 3000 0,01 1 3000 0,7 4286 1 3000 45 67

0,001 0,55 5450 0,4 7500 0,7 4286 12 250

Ав-677 1440 0,01 53,5 27 27 53 >100 <10 100 14

0,001 1 1440 22 66 >100 <10 65 22

А8-678 1420 0,01 3 473 б 237 >100 <10 8,6 165

0,001 1 1420 4 355 >100 <10 7,5 189

Ав-679 500 0,01 5 100 1 500 >100 <10 7 71

0,001 1 500 0,1 5000 >100 <10 5,5 91

*- Концентрация МПС, при которой наблюдалась 50% гибель клеток через 3 дня после внесения вещества (ЦЦ50), ** - Концентрация МПС, вызывающая ингибирование ЦМВИ на 50% по отношению к контролю,

*** - Химиотерапевтический индекс, равный отношению концентрации МПС, вызывающей клеточную деструкцию (ЦД50), к концентрации, вызывающей 50% антивирусный эффект (ИД50).

11

4

Рис. 2. Влияние А8-688 на проникновение ЦМВ в диплоидные фибробласты человека

1-2 — Увеличение х10:

1 - Контроль инфицированных клеток без МПС

2 - Клетки, инфицированные ЦМВ, в присутствии А8-688

3—4 — Увеличение х40:

3 - Контроль инфицированных клеток без МПС

4 - Клетки, инфицированные ЦМВ, в присутствии А8-688

Клетки, инфицированные ЦМВ, окрашены МКА к белку рр65 ЦМВ.

Полимерно-электростатическая активность должна сохраняться и на стадии адсорбции вирион-клетка, где А8-688 по степени насыщенности сульфокислотными группами способен эффективно конкурировать с одним из родственных по химической природе клеточным рецептором ЦМВ - гепарансульфатом. Это объясняет высокую эффективность соединения АБ-688 также и в профилактической схеме. В то же время оставался неясным механизм противовирусного действия данного соединения в лечебной схеме воздействия.

Для того чтобы выяснить, на какие стадии жизненного цикла вируса оказывает влияние МПС А8-688, было проведено иммуноцитохимическое изучение клеток контрольной и опытной популяций с использованием МКА к сверхраннему (1Е) р72, раннему (Е) рр65 и позднему (Ь) gB белкам ЦМВ. В этих экспериментах в качестве положительного контроля был использован ганцикловир (ГЦВ) как патентованный препарат, молекулярный механизм действия на ЦМВ которого хорошо изучен. Известно, что, подавляя активность вирусной ДНК-

полимеразы, ГЦВ ингибирует репликацию ДНК ЦМВ, и блокирует экспрессию поздних генов, кодирующих структурные белки в ЦМВ-инфицированных клетках (Ое С1егсс1, 2001).

Экспрессию сверхраннего и раннего белков изучали в течение первых 3-х суток после заражения вирусом с МИ 0,1 БОЕ/кл. А8-688 использовали в концентрации 10 мкг/мл. Подсчет клеток, окрашенных МКА к 1Ер72 и рр65, показал, что число клеток, синтезирующих 1Е и Е вирусные белки, под действием АБ-688 по отношению к контрольной популяции достоверно не отличалось (р=0,15). Как и ожидалось, в культуре, обработанной ГЦВ, также не было достоверных отличий относительно контроля в синтезе сверхранних и ранних вирусных белков (р=0,66).

2 3 4 5 6

время после заражения, сутки

-»- Контроль -Аз-688 —ГЦВ

Рис. 3. Влияние А8-688 на синтез позднего белка gB ЦМВ

II

Г

/ ' % ". У " У ¿г.

»V

Рис. 4. Влияние соединения А8-688 на синтез позднего белка «В ЦМВ через 5 суток после

заражения

1 - Контроль инфицированных клеток без МПС

2 - Инфицированные клетки, культивированные в присутствии А8-688 Клетки, инфицированные ЦМВ, окрашены МКА к позднему белку gB ЦМВ.

На 3 сутки после заражения в контрольной культуре зараженных клеток был выявлен поздний белок gB Количество клеток, содержащих этот антиген, составило 10,8% популяции, В опытпой культуре, содержащей AS-688, количество клеток, окрашенных МКА к gB, снизилось вдвое - до 5,8% (р<0,0001, рис 3) В контрольной культуре количество клеток, синтезирующих этот структурный белок, постепенно нарастало и к 5-м суткам после заражения составляло 65%, тогда как в культуре, обработанной AS-688, количество клеток, содержащих gB, не превышало 17% от общего числа клеток в популяции (р<0,0001, рис 3,4) В фибробластах, обработанных ГЦВ, также наблюдалось снижение количества клеток, окрашенных МКА к gB, по сравнению с контролем (12,5% на 5 сутки после заражения, р<0,0001)

Полученные результаты позволяют заключить, что соединение AS-688 подавляет синтез поздних вирусных белков подобно ганцикловиру, что является косвенным свидетельством ингибирования репликации вирусной ДНК.

Для подтверждения данного вывода прямым методом была проведена серия опытов по количественному изучению динамики накопления ДНК ЦМВ в культуре инфицированных фибробластов методом ПЦР в реальном времени Клетки заражали вирусом с МИ 0,01 БОЕ/кл, затем вносили AS-688 в концентрации 100 мкг/мл и изучали количество ДНК ЦМВ в клетках на 1, 3, 5 и 10-е сутки В качестве препарата сравнения, ингибирующего синтез вирусной ДНК, был использован ГЦВ В результате проведенных экспериментов достоверные отличия (р<0,05) в подавлении синтеза ДНК ЦМВ были обнаружены уже на 3 сутки (рис 5) На 5 сутки количество ДНК ЦМВ под действием AS-688 по сравнению с контрольной культурой было снижено в 7,5 раз (рис 5), что по эффективности было сравнимо с влиянием ганцикловира (р=0,017) Ингибирующая активность AS-688 на синтез ДНК ЦМВ проявлялась также и через 10 дней после заражения Таким образом, соединение AS-688 достоверно подавляло накопление вирусной ДНК в течение всего опыта с 3 по 10 сутки, оказывая длительное противовирусное действие (р<0,05, рис.5)

Суммируя полученные данные, можно заключить, что соединение AS-688 в ряду изученных МПС, в клеточной системе ш vitro оказывает двунаправленное действие. Во-первых, AS-688 эффективно препятствует проникновению ЦМВ в чувствительные клетки, негативно влияя на внеклеточный вирус и блокируя его первичные контакты с клетками. Во-вторых, -ингибирует развитие ЦМВИ в уже зараженных клетках, подавляя накопление вирусной ДНК.

Анализ данных позволяет предположить, что действие AS-688 на зараженные клетки в лечебной схеме является следствием внутриклеточного действия МПС.

Для экспериментального изучения этого вопроса использован МПС AS-679, на основе которого был приготовлен конъюгат с ФИТЦ - AS-679flu. После внесения полученного соединения в диплоидные фибробласты человека наблюдалась четкая флюоресценция в цитоплазме уже через 24 часа (рис.6).

=с 3

5 2

с 1

О -1-1-,-1-I---1-,-(-1-1-1

О 1 23456789 10 11 время после заражения, сутки

^-Контроль —•— Ганцикловир —А5-688

Рис.5. Динамика накопления ДНК ЦМВ в культуре инфицированных клеток под

действием А8-688

1 - контроль клеток без АБ-679

2 - 4 - после внесения А8-679 РШ:

2 - через 1 сутки;

3 - через 3 суток;

4 - через 5 суток.

Рис 6. Динамика проникновения и изменение интенсивности флюоресценции Ав-679 п" диплоидных фибробластах человека

Более длительная инкубация А5-679рьи приводила к дальнейшему нарастанию интенсивности свечения (рис 6). На 5 сутки наблюдался максимум интенсивности флюоресценции, и дальнейшая инкубация меченого МПС с клетками не приводила к его усилению Таким образом, наблюдалась прямая корреляционная зависимость накопления А8-679рш в цитоплазме ФЛЭЧ от длительности воздействия на клетки Представлялось интересным выяснить, не связано ли проникновение А3-679РШ в клетки с нарушением целостности клеточных мембран под действием МПС.

Для этого был проведен анализ клеточной культуры ФЛЭЧ с помощью теста исключения витального красителя трипанового синего Подсчет окрашенных клеток показал, что даже при использовании МПС в максимальной концентрации 100 мкг/мл соединение не нарушало проницаемость их мембран в течение 7 суток воздействия на клетки

Учитывая вышеизложенное, можно констатировать, что МПС проникают в клетки человека, не нарушая проницаемости их мембран, и обладают не только мембраноактивным, но и внутриклеточным анти-ЦМВ действием.

Как ранее было установлено, инфекционная активность ЦМВ, находящегося в культуральной жидкости от зараженных клеток, под действием АБ-688 в концентрации 100 мкг/мл при МИ 0,01 БОЕ/кл. снижается на 88,7% (рис.1) В то же время последующие эксперименты показали, что ингибирование накопления внутриклеточной ДНК ЦМВ в той же клеточной системе при аналогичных условиях проведения опыта составило 15% относительно контроля (рис.5). Сравнительный анализ этих данных позволяет предположить, что МПС могут оказывать негативное влияние не только на накопление вирусной ДНК в зараженных клетках, но и на более поздние стадии жизненного цикла ЦМВ, такие как сборка, почкование и выход вирусных частиц из клетки.

Вирулицидное, микробицидное и профилактическое действия новых соединений согласуются с их мембранотропным действием, электростатически (А8-688) или электростатически-липофильно (А5-679) направленным на противоположно заряженную поверхность вириона и его липидную оболочку, а также на блокаду адсорбции вируса на поверхности клеточных мембран в конкуренции с клеточным рецептором ЦМВ -гепарансульфатом Лечебное действие МПС на уже инфицированные клетки основано на выявленном нами угнетающим воздействии их на внутриклеточный вирусспецифический биосинтез и, возможно, более поздние стадии репродукции вируса.

Важно подчеркнуть, что в молекулярной структуре МПС реализован принцип имитации исключительно полимерного остова нуклеиновых кислот без имитации собственно нуклеотидных факторов генетической информации Поэтому в отличие от известных противовирусных антиметаболитов нуклеотидного типа, таких как ганцикловир и аналоги, химическая природа МПС полностью исключает опасность побочной химической интервенции

в ДНК клетки Это обеспечивает повышенную цитогенетическую безопасность МПС по сравнению с применяемыми сегодня препаратами.

Таким образом, низкая цитотоксичность, двунаправленный характер воздействия на клетки-мишени, а также высокая противовирусная активность в вирулицидной, микробицидной и лечебной схемах отличают МПС (А5-688 и АЭ-679) от известных низкомолекулярных препаратов и указывают на перспективность дальнейшего изучения искусственных имитаторов-антагонистов нуклеиновых кислот и их мембранотропных производных в качестве антивирусных препаратов нового поколения.

ВЫВОДЫ:

1. Частота выявления прямых маркеров цитомегаловируса (ДНК ЦМВ и/или инфекционной активности) у недоношенных новорожденных детей с признаками внутриутробного инфицирования (ВУИ) на первой неделе жизни значительно выше (26,2%), чем у доношенных и недоношенных новорожденных детей без признаков ВУИ (5-6%) У новорожденных детей без ВУИ обнаружена ДНК ЦМВ, но не выявлена инфекционная активность вируса

2 Трехкратное обследования 26 недоношенных новорожденных детей в течение первого года жизни показало, что через 1-3 мес. после рождения у 77,7% детей с внутриутробной ЦМВ-инфекцией (ЦМВИ) произошла элиминация прямых маркеров ЦМВ. У 19,2% детей с ВУИ прямые маркеры ЦМВИ впервые появились через 1-3 мес., у 11,5% - через 5-7 месяцев после рождения Это указывает на необходимость проведения неоднократного вирусологического обследования детей данной группы риска в течение первого года жизни

3 Выявление высокоавидных анти-ЦМВ антител у большинства обследованных в динамике недоношенных новорожденных детей с ВУИ сопровождалось элиминацией прямых маркеров ЦМВ Отсутствие анти-ЦМВ или присутствие низкоавидных антител к ЦМВ ассоциировалось в появлением маркеров ЦМВ через 1-6 месяцев после рождения.

4. Полученные данные показали, что для повышения эффективности диагностики и прогноза развития ЦМВИ необходимо использовать комплекс методов, включающих выявление противовирусных антител, определение их авидности, обнаружение ДНК и инфекционной активности ЦМВ.

5. Среди новых поликарбоксилатных соединений, модифицированных мембранотропными и аминосульфокислотными фармакофорами, обнаружены соединения, обладающие низкой цитотоксичностью и высокой антивирусной активностью в отношении ЦМВ. Максимальный противовирусный эффект выявлен для А8-688, химиотерапевтический индекс доя которого в вирулицидной, микробицидной и лечебной схемах воздействия составил не менее 3000.

6. Установлено, что мембраноактивное полианионное соединение АБ-688 обладает двунаправленным действием на ЦМВ человека: эффективно подавляет проникновение ЦМВ в чувствительные клетки, а также ингибирует накопление вирусной ДНК и поздних структурных белков ЦМВ в зараженных клетках.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Адиева А А , Гаджиева 3 С , Павлова М В , Гетия Е Г , Н Н Володин, Ж В. Евсегнеева, С.Н Щербо, Е Н. Выжлова, Р Р Климова, Н.Е Федорова, М В. Дегтярева, В В Малиновская, А.А Кущ /Динамика маркеров герпесвирусных инфекций у недоношенных новорожденных детей в отделениях реанимации и интенсивной терапии // Педиатрия, 2008, Том 87, №3, с.134-140.

2 Сербии А В , Карасева E.H., Федорова Н Е., Павлова М.В., Климова Е.В , Леонтьева М В., Кущ А А. / Производные поликарбоксилатных соединений, подавляющие цитомегаловирусную инфекцию. Микробицидный эффект in vitro // Антибиотики и химиотерапия, 2007, №11-12, с 16-22

3. Павлова М.В., Федорова Н Е., Сербии А.В , Егоров Ю А , Карасева Е Н, Климова Е В., Кущ А.А / Противовирусная активность поликарбоксилатных соединений, модифицированных модифицированных каркасно-углеводородными и сульфокислотными фармакофорами, при цитомегаловирусной инфекции in vitro//Антибиотики и химиотерапия, 2008, №7-8, с 3-9.

4. Павлова М.В., Федорова Н Е, Карасева Е Н., Климова Е.В., Голышев С А., Поляков В.Ю., Сербии A.B., Кущ А А / Влияние мембраноактивных полианионных соединений на различные стадии жизненного цикла цитомегаловируса человека в клетках культуры // Антибиотики и химиотерапия, 2008, №9-10, с. 22-28

5. Павлова М В , Ростовская М В , Федорова Н.Е , Савченкова И П , Тепляшин A.C., Кущ А.А / Развитие цитомегаловирусной инфекции в мезенхимальных стволовых клетках, индуцированных к остоегенной дифференцировке// Международный Междисциплинарный Симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине», Судак, Крым, Украина, 17-27 сентября 2006, с.49-51.

6. Павлова М В., Федорова Н Е., Адиева А.А , Гаджиева 3 С., Гетия Е Г., Дегтярева М В., Щербо С.Н., Евсегнеева Ж В , Выжлова E.H., Малиновская В В , Кущ А А / Цитомегаловирусная инфекция у недоношенных новорожденных детей: количественные методы лабораторного анализа. // Научные труды VIII международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке, концепции болезней цивилизации», Москва, 14-17 ноября, 2007, с.473-474.

7. Адиева A.A., Гаджиева З.С, Павлова М.В, Климова Р Р., Федорова Н Е, Щербо С.Н, Евсегнеева Ж В., Дегтярева М.В , Гетия Е.Г, Гущин B.C., Выжлова E.H., Малиновская В.В., Кущ А А. / Выявление маркеров герпес-вирусных инфекций у недоношенных новорожденных детей // VI Конгресс детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики», 13-14 декабря, 2007, с.18-19

8. Pavlova M.V., Fedorova N Е , Adieva А.А, Gadzhieva Z S , Kushch A A. Getiya E.G., Degtyareva M.V., Malmovskaya V.V , Shcherbo S.V., Evsegneeva Zh V / Quantitative methods of analysis of cytomegalovirus infection in preterm infants during the 6 months// Clinical Virology Annual Meeting, Saanselka, Lapland, Finland, 12-15 March 2008.

9. Павлова M В., Леонтьева M.B , Карасева Е.Н / Противовирусная активность мембранотропных соединений на основе полианионной матрицы, модифицированной адамантановыми и

норборненовыми фармакофорами, в отношении цитомегаловируса человека // V Конференция ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», 19-22 мая, 2008. Приложение к журналу «Вестник РАМН», №6,2008, с 323.

10 Малиновская ВВ, Паршина О.В , Гусева Т.С., Павлова MB, Гаджиева 3 С., Гетия ЕГ., Дегтярева М В., Кущ А А / Влияние Виферона на интерфероновый статус недоношенных новорожденных детей с признаками внутриутробного инфицирования. // Аллергология и иммунология, 2008, Том 9, №3, с 348-349.

11. Гетия Е Г., Паршина О.В., Гусева Т.С, Кущ А.А , Климова Р.Р , Адиева A.A., Гаджиева З.С., Павлова М В , Володин H.H., Малиновская В В., Дегтярева М.В./ Персистенция герпес-вирусов у детей с осложненным течением раннего неонатального периода изменяет цитокиновый статус новорожденных детей. // Материалы III Ежегодного конгресса и VI Съезда Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины «Современная перинаталогия. организация, технология и качество» (Москва, 29-30 сентября 2008) в журнале «Вопросы практической педиатрии», 2008, Том 3, №5, с. 17-18.

Список использованных сокращений АТ - антитела

БКМ - быстрый культуральный метод

БОЕ - бляшкообразующая единица

ВКЖ - вируссодержащая культуральная жидкость

ВУИ - внутриутробное инфицирование

ГЦВ - ганцикловир

ИА - индекс авидности

ИФА - иммуноферментный анализ

МИ - множественность инфицирования

МКА - моноклональные антитела

МПС - мембраноактивные полианионные соединения

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ФЛЭЧ - фибробласты легкого эмбриона человека

ХТИ - химиотерапевтический индекс

ЦД50 - хроническая цитотоксичность

ЦМВ - цитомегаловирус человека

ЦМВИ - цитомегаловирусная инфекция

Заказ №256/10/08 Подписано в печать 28.10 2008 Тираж 100 экз Уел пл 1,75

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 www.cfr ru; e-mail:info@cfr ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Павлова, Мария Владимировна

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Цитомегаловирус человека: структура и репликация

1.1. Структура и организация генома

1.2. Репликация цитомегаловируса

Глава 2. Врожденная цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ)

2.1. Эпидемиология заболевания

2.2. Современные аспекты патогенеза ЦМВИ у детей первого месяца жизни

2.3. Клиника ЦМВИ у детей первого месяца жизни 30 2.6. Исходы внутриутробной ЦМВИ

2.5. Методы лабораторной диагностики ЦМВИ

2.5.1. Выявление инфекционной активности ЦМВ культуральными методами

2.5.2. Обнаружение вирусных антигенов в клинических образцах. Метод антигенемии

2.5.3. Определение нуклеиновых кислот вируса методами молекулярной биологии

2.5.4. Изучение противовирусных антител серологическими методами

2.6. Лечение ЦМВИ у новорожденных детей

Глава 3. Противовирусные химиопрепараты, применяемые при ЦМВИ.

Поиск и изучение новых анти-ЦМВ агентов

3.1. Патентованные лекарственные препараты, применяемые при лечении ЦМВИ

3.1.1. Нуклеозиды и нуклеотидные производные — ингибиторы ЦМВИ

3.1.2. Ненуклеозидные ингибиторы ЦМВИ

3.2. Лекарственные препараты, находящиеся на стадии клинических испытаний

3.1.1. Нуклеозидные ингибиторы ЦМВИ

3.1.2. Ненуклеозидные ингибиторы ЦМВИ

3.3. Поликарбоксилатные соединения как потенциальные ингибиторы ЦМВИ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Диагностика цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей и оценка анти-ЦМВ активности новых мембраноактивных полианионных соединений in vitro"

Актуальность проблемы.

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) является одной из наиболее часто встречающихся инфекций у новорожденных и детей раннего возраста, вызывающих тяжелые патологии, вплоть до гибели ребенка (35,126). По данным отечественных и зарубежных специалистов от 0,5 до 5% детей появляются на свет с врожденной ЦМВИ, из них около 90% детей, являются бессимптомными носителями (55,126).

Диагностика ЦМВИ у новорожденных детей часто представляет сложную задачу в связи с отсутствием типичных симптомов и признаков ЦМВИ, а также из-за особенностей иммунной системы новорожденных. Недоношенные новорожденные представляют группу высокого риска, т.к. известно, что заболеваемость у таких детей повышена по сравнению с доношенными новорожденными. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные этой проблеме, разработка четких и общепринятых рекомендаций по лабораторному обследованию недоношенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией с подозрением на ЦМВИ в России остается нерешенной задачей. Важность решения проблемы своевременного выявления врожденной и перинатальной ЦМВИ объясняется также тем, что именно ЦМВИ часто выявляется (первично или в результате реактивации), а иногда и служит причиной гибели детей во втором полугодии жизни (14).

Не менее важной проблемой является выбор адекватной терапевтической тактики лечения новорожденных с ЦМВИ. Существующие на сегодняшний день единичные патентованные препараты, обладающие противовирусной активностью в отношении ЦМВ, не применяются у новорожденных и детей раннего возраста вследствие их высокой токсичности. Кроме того, эффективность лечения имеющимися препаратами снижена из-за развития лекарственной устойчивости, часто возникающей при длительном применении (62,94). Поэтому поиск эффективных и нетоксичных анти-ЦМВ агентов, перспективных в качестве химиотерапевтических средств при ЦМВИ, остается важной проблемой.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящего исследования заключалась в изучении маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей и детей раннего возраста с сочетанной перинатальной патологией в течение первого года жизни, а также в исследовании антивирусной активности новых поликарбоксилатных

1 соединений, модифицированных мембранотропными и аминосульфоI j кислотными фармакофорами на модели экспериментальной ЦМВИ in vitro. ! Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:

1. Выявить прямые маркеры ЦМВ (ДНК и инфекционную активность) у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста с сочетанной перинатальной патологией. , 2. Установить присутствие противовирусных антител классов IgM и IgG и индекс авидности антител IgG у недоношенных новорожденных детей с I клиническими признаками внутриутробного инфицирования.

3. Изучить динамику маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей в течение первого года жизни.

4. Определить цитотоксичность и антивирусную активность новых \ поликарбоксилатных соединений, модифицированных мембранотропными I и аминосульфокислотными фармакофорами, на модели экспериментальной ЦМВИ in vitro в лечебной, профилактической, вирулицидной и j микробицидной схемах воздействия.

I 5. Выяснить возможный механизм анти-ЦМВ активности новых I поликарбоксилатных соединений.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Установлено, что для достоверной диагностики ЦМВИ у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста необходим комплекс методов, включающих выявление противовирусных антител и их авидности, а также обнаружение прямых маркеров ЦМВ.

2. Изучение динамики маркеров ЦМВ у недоношенных новорожденных детей в течение первого года жизни показало необходимость проведения неоднократного вирусологического обследования данной группы риска по развитию ЦМВИ в течение 1 года жизни.

3. Впервые установлено, что некоторые поликарбоксилатные соединения, модифицированные мембранотропными и аминосульфокислотными фармакофорами, обладают низкой цитотоксичностью и высокой противовирусной анти-ЦМВ активностью.

4. Впервые показано, что мембраноактивные полианионные соединения обладают двунаправленным действием на ЦМВ: предотвращают его проникновение в чувствительные клетки и обладают внутриклеточным противовирусным действием.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Показана высокая частота выявления ЦМВИ у недоношенных маловесных новорожденных детей с сочетанной перинатальной патологией по сравнению с доношенными новорожденными детьми.

2. Установлена необходимость проведения неоднократного (по крайней мере, трехкратного) вирусологического обследования детей данной группы риска по развитию ЦМВИ в течение первого года жизни.

3. Среди новых мембраноактивных полианионных соединений выявлены соединения, обладающие низкой цитотоксичностью и высокой противовирусной анти-ЦМВ активностью. Максимальный эффект противовирусного действия установлен для А8-688, химиотерапевтический индекс для которого в вирулицидной, микробицидной и лечебной схемах воздействия составил не менее 3000.

4. На примере одного из представилей мембраноактивных полианионных соединений показано, что он эффективно подавляет проникновение ЦМВ в чувствительные клетки, а также ингибирует накопление вирусной ДНК и экспрессию поздних структурных белков ЦМВ в зараженных клетках.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Павлова, Мария Владимировна

ВЫВОДЫ:

1. Частота выявления прямых маркеров ЦМВ (ДЕК и/или инфекционной активности) у недоношенных новорожденных детей с признаками внутриутробного инфицирования (ВУИ) значительно выше (26,2%), чем у доношенных и недоношенных новорожденных детей без признаков ВУИ (56%). У новорожденных детей без ВУИ обнаружена ДНК ЦМВ, но не выявлена инфекционная активность вируса.

2. Трехкратное обследование 26 недоношенных новорожденных детей в течение первого года жизни показало, что через 1-3 мес. после рождения у 77,7% детей с внутриутробной ЦМВИ произошла элиминация прямых маркеров ЦМВ. У 19,2% детей с ВУИ прямые маркеры ЦМВИ впервые появились через 1-3 мес., у 11,5% - через 5-7 месяцев после рождения. Это указывает на необходимость проведения неоднократного вирусологического обследования детей этой группы риска минимум до 1 года. -3. Выявление высокоавидных анти-ЦМВ у большинства обследованных в динамике недоношенных новорожденных детей с ВУИ сопровождалось элиминацией прямых маркеров ЦМВ. Отсутствие анти-ЦМВ или присутствие низкоавидных антител к ЦМВ ассоциировалось в появлением маркеров ЦМВ через 1-6 месяцев после рождения.

4. Полученные данные показали, что для достоверной диагностики и прогноза развития ЦМВИ необходимо использовать комплекс методов, включающих выявление противовирусных антител, определение их авидности, обнаружение ДНК и инфекционной активности ЦМВ.

5. Среди новых поликарбоксилатных соединений, модифицированных мембранотропными и аминосульфокислотными фармакофорами, обнаружены соединения, обладающие низкой цитотоксичностью и высокой антивирусной активностью в отношении ЦМВ. Максимальный противовирусный эффект выявлен для А8-688, химиотерапевтический индекс для которого в вирулицидной, микробицидной и лечебной схемах воздействия составляет не менее 3000.

6. Установлено, что мембраноактивное полианионное соединение А8-688 обладает двунаправленным действием на ЦМВ человека: эффективно подавляет проникновение ЦМВ в чувствительные клетки, а также ингибируют накопление вирусной ДНК и поздних структурных белков ЦМВ в зараженных клетках.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Павлова, Мария Владимировна, Москва

1. Александровский A.B., Кудашов Н.И., Ванько JT.B. Герпесвирусная инфекция у новорожденных детей. // Юж.-Рос. мед. журн. 1999. №2-3. С. 51-56.

2. Вашукова С.С., Макарова Н.Г. Особенности лабораторной диагностики внутриутробных инфекций методом иммуноферментного анализа. // Пробл. репродукции. 1997. Т.З. №4. С. 78-81.

3. Виноградская Г.Р., Новикова J1.H., Башмакова М.А. Оптимизация ПЦР для обнаружения цитомегаловируса в моче новорожденных. //Вопросы вирусологии,-1994.-Т.4.- С. 171 -174.

4. Володин H.H. Актуальные проблемы неонатологии. Москва. 2004. 448 с.

5. Гришаев М.П. Цитомегаловирусная инфекция и ее лабораторная диагностика. //Новости Вектор-Бест.- 1996.- №1.-С. 74-80.

6. Дегтярев Д.Н., Дегтярева М.В., Ковтун И.Ю., Шаламова JI.B. Принципы диагностики внутриутробных вирусных инфекций у новорожденных и тактика ведения детей группы риска. // Перинатология сегодня. 1997. №3. С. 18-24.

7. Диагностика и лечение внутриутробных инфекций: Метод, рекоменд. для врачей неонатологов. Под. ред. Володина H.H., Дегтярева Д.Н. Москва. 1998. 234 с.

8. Ильина И.Д. Цитомегаловирусная инфекция у недоношенных детей. // Дисс. к.м.н. Москва. 1994. 134 с.

9. Каражас Н.В. Цитомегаловирусная инфекция — типичный представитель оппортунистических инфекций //Российские медицинские вести. 1997. -№2.-С. 34-38.

10. Клиническая иммунология: В 3-х т. Под ред. Акад. РАМН Е.И.Соколова. М.: Медицина. 1998. 228 с.

11. Ковтун И.Ю. Характер и течение перинатальной патологии у детей, внутриутробно инфицированных вирусами семейства герпеса. // Автореф., к.м.н. Москва. 2000. 24 с.

12. Коровина H.A., Заплатников А.Л., Чебуркин A.B. и др. Цитомегаловирусная инфекция у детей раннего возраста (Клиника, диагностика, современные возможности терапии). // Руководство для врачей.- М. Медпрактика. 2001. 64 с.

13. Кочергина С.А., Теплова С.Н., Русанова H.H., Малиновская В.В., Посевая Т.А. Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции у детей первых месяцев жизни. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2000. №2. С. 116-118.

14. Кулаков В.И., Гуртовой Б.Л., Орджоникидзе Н.В., Тютюнник B.JI. Цитомегаловирусная инфекция в акушерстве. М., Геотар-Мед. 2001. С. 31.

15. Макаренко Э.Н. Особенности течения беременности и исход родов у женщин с цитомегаловирусной инфекцией. // Автореф. дисс. к.м.н. — Ставрополь. 1999. 22 с.

16. Матвеев В.А. Цитомегаловирусная инфекция у детей (клинико-эпидемиологические и иммунологические аспекты). // Автореф. дисс., д.м.н. СПб. 1997. 67 с.

17. Медицинская вирусология: Руководство / Под ред. Д.К.Львова. М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 2008. - 656 с.

18. Нисевич JI.JI., Талалаев А.Г., Каск JI.H. и др. Значение различных вирусных инфекций в невынашивании, мертворождении, перинатальной и младенческой смертности. // Педиатрия. 1999. №1. С. 4-10.

19. Нисевич JI.JL, Талалаев А.Г., Каск JI.H., Миронюк О.В., Парсегова Т.С., Туманова Е.А., Кущ A.A., Меджидова A.A., Климова P.P., Федорова Н.Е. Врожденные вирусные инфекции и маловесные дети. // Вопросы современной педиатрии. 2002. том 1. №4. С. 9-13.

20. Ожегов A.M., Мальцев C.B., Мякишев JI.C. Клинико-иммунологическая характеристика активной цитомегаловирусной и сочетанной с ней инфекции у детей первого года жизни. // Педиатрия. 2001. №2. С.26-31.

21. Орехов К.В., Голубева М.В., Барычева Л.Ю. Внутриутробная цитомегаловирусная инфекция (лекция) // Сибирский медицинский журнал : Научно-практический рецензируемый журнал. 2004. - Том 19, №1. - С. 76-84.

22. Орехов К.В., Яненко И.А., Безроднова С.М. Факторы риска развития внутриутробной герпетической инфекции // Здоровье и болезнь как состояние человека: Сб. ст. Ставрополь. 2000. С. 225-227.

23. Пенкина Н.И., Шкляева Е.Ю., Лопатина Л.Н. и др. Внутриутробные инфекции в структуре младенческой смертности. / В кн.: Проблемы внутриутробной инфекции плода и новорожденного. // Материалы III сыезда РАСПМ. М. 2000. С.33-34.

24. Попов С.Д. Патологическая анатомия и молекулярно-биологическая диагностика цитомегаловирусной инфекции // Автореф. дисс., к.м.н. — СПб. 1993.

25. Протоколы диагностики, лечения и профилактики внутриутробных инфекций у новорожденных детей. РАСПМ. М. 2002.

26. Пустовойт Б., Герман Ф., Макарова Н. и др. / Динамика иммунного ответа при первичной ЦМВИ и при реактивации цитомегаловируса у больных после аллотрансплантации органов. // Вопросы вирусологии.-2001.- №3.-С.23-29.

27. Пустотина O.A., Бубнова Н.И. Диагностика внутриутробной инфекции (компоненты последа и амниотической жидкости). // Акуш. и гин. 1999. №4. С. 3-5.

28. Самохин П.А. Цитомегаловирусная инфекция у детей. М., 1992.

29. Сербии A.B. Пути создания биоселективных полимерных систем комбинированного противовирусного действия. // Автореферат дисс. на соискание ученой степени доктора хим. наук. ИНХС им. А.В.Топчиева РАН-НИФ Здоровья. Москва. 2004, 48 с.

30. Тимофеев Д.И., Перминова Н.Г., Сербии A.B., Тимофеев И.В. Мембранотропные соединения и препараты, воздействующие на ранние стадии ВИЧ-инфекции. Антибиотики и химиотерапия, 2003. Т.48. - № 2.

31. Фисенко А.П. Цитомегаловирусная инфекция у детей: современные методы диагностики и лечения. // Автореф. дисс. д.м.н. Москва. 1996. С.40.

32. Царегородцева Е.Е. ВЗРП и Внутриутробное инфицирование // Материалы II Российского форума «Мать и дитя». Москва. 2000. С. 164165.

33. Цинзерлинг A.B. Современные инфекции: Патологическая анатомия и вопросы патогенеза. СПб.: Сотис. 1993. 287 с.

34. Цинзерлинг A.B., Цинзерлинг В.А. Современные инфекции: Патологическая анатомия и вопросы патогенеза. 2 изд. исправл. и дополн. - СПб.: Сотис. 2002.

35. Цинзерлинг В.А., Мельникова В.Ф. Перинатальные инфекции. (Вопросы патогенеза, морфологической диагностики и клинико-морфологических сопоставлений). //Практич. руков. СПб.: Элби СПб. 2002.

36. Шахгильдян В.И., Шипулина О.Ю., Каражас Н.В. и др. / Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов.// Эпидемиология и инфекционные болезни.- 2001.-№1.- С.36-39.

37. Шипулина О.Ю., Шахгильдян В.И., Шипулин Г.А., и др. Полимеразная цепная реакция в диагностике цитомегаловирусной инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов. // Вопросы вирусологии.- 1998.- №2.- С. 9195.

38. Abraham КА, O'Kelly Р, Spencer S, Hickey DP, Conlon PJ, Walshe JJ. Effect of cytomegalovirus prophylaxis with acyclovir on renal transplant survival. Ren Fail. 2008;30(2):141-6.

39. Aigner C, Jaksch P, Winkler G, Czebe K, Taghavi S, Marta G, Klepetko W. Initial experience with oral valganciclovir for pre-emptive cytomegalovirus therapy after lung transplantation. Wien Klin Wochenschr. 2005 Jul; 117(13-14):480-4.

40. Anders D.G., Kerry J.A., Pari G., et al. DNA synthesis and late viral gene expression. In: Arvin A.M., Mocarski E.S., Voore P. et al., Editors. Human Herpesviruses: Biology, Therapy and Immunoprophylaxis. Cambridge: Cambridge Press; 2006: 292-307.

41. Anders DG, Kacica MA, Pari G, et al. Boundaries and structure of human cytomegalovirus or/Lyt, a complex origin for lytic-phase DNA replication. // J. Virol.- 1992.-V.66.- P.3373-3384.

42. Anders DG, McCue LA. The human cytomegalovirus genes and proteins required for DNA synthesis. // Intervirology.- 1996.- V.39.- P.378-388.

43. Andrei G, De Clercq E, Snoeck R. Novel inhibitors of human CMV. Curr Opin Investig Drugs. 2008 Feb;9(2): 132-45.

44. Arav-Boger R, Pass R. Viral load in congenital cytomegalovirus infection. Herpes. 2007 Jun; 14(1): 17-22.

45. Aukrust P., Meuller F. et al. Modulation of lymphocyte and monocyte activity after intravenous immunoglobulin administration in vivo. // Clin. Exp.Immunol 1997. - Vol. 107, N 1, - p.50-56.

46. Baldick, C. J. and Shenlc, T. Proteins associated with purified human cytomegalovirus particles. // J Virol.- 1996.- V.70.- P.6097- 6105.

47. Barbi M, Binda S, Caroppo S, Primache V. Neonatal screening for congenital cytomegalovirus infection and hearing loss. // J Clin Virol. 2006 Feb;35(2):2069.

48. Benco D.M., Gibson W. Primate cytomegalovirus glycoproteins lectin-binding properties and sensitivities to glycosidases. // J. Virol.-1986.-V.59.-P.703-713.

49. Biron K.K. Antiviral drugs for cytomegalovirus diseases. Antiviral Res. 2006 Sep;71(2-3): 154-63

50. Biron K.K., Harvey R.J., Chamberlain S.C. et al. Potent and selective inhibition of human cytomegalovirus replication by 1263W94, a benzimidazole l-riboside with a unique mode of action. Antimicrob. Agents Chemother. 2002. 46,2365-2372.

51. Biron KK. Antiviral drugs for cytomegalovirus diseases. Antiviral Res. 2006 Sep;71(2-3): 154-63.

52. Bitsch A., Kirchner H., Dupke R., Bein G. Cytomegalovirus transcripts in peripheral blood leukocytes of actively infected transplant patients detected by reverse transcription polymerase chain reaction // J. Infect. Dis.-1993.-V.167.-P.740-743.

53. Bitsch A., Kirchner H., Dupke R., Bein G. Cytomegalovirus transcripts in peripheral blood leukocytes of actively infected transplant patients detected by reverse transcription polymerase chain reaction // J. Infect. Dis.-1993.-V. 167.-P.740-743.

54. Boeckh M, Huang M, Ferrenberg J, Stevens-Ayers T, Stensland L, Nichols WG, Corey L. Optimization of quantitative detection of cytomegalovirus DNA in plasma by real-time PCR. // J Clin Microbiol.- 2004.- V.42.- No.3.- P.1142-1148.

55. Boeckh M., G. Boivin. Quantitation of cytomegalovirus: methodologic aspects and clinical applications // Clinical Microbiol. Rewiews.- 1998.- V.ll.-No.3.- P.533-554

56. Borst EM, Messerle M. Analysis of human cytomegalovirus oriLyt sequence requirements in the context of the viral genome. J Virol. 2005 Mar;79(6):3615-26.

57. Boukrinskaia A.G., Serbin A.V., Bogdan O.P., Stotskaya L.L., Alymova I.V., Klimochkin Yu.N. Polymeric Adamantane Analogues. United States Patent US005880154A. 1999, Mar. 9.

58. Bresnahan W.A., and Shenk T. UL82 virion protein activates expression of immediate early viral genes in human cytomegalovirusinfected cells. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2000.- V.97.- P. 14506- 14511.

59. Bresnahan W.A., Boldogh I., Thompson E.A., et al. Human cytomegalovirus inhibits cellular DNA synthesis and arrests productively infected cells in late Gl. // Virilogy.- 1996.- V.224.- p.150-160.

60. Britt W. Boppana S. Human cytomegalovirus virion proteins. Hum Immunol. 2004 May;65(5):395-402.

61. Britt W. Maturation end egress. In: Arvin A.M., Mocarski E.S., Voore P. et al., Editors. Human Herpesviruses: Biology, Therapy and Immunoprophylaxis. Cambridge: Cambridge Press; 2006, P. 308-320.

62. Britt WJ, Mach M. Human cytomegalovirus glycoproteins. // Intervirology.-1996.-V.39.- p.401-412.

63. Broom A.D., Agrawal V.K., Tutonda M.G., Fain H.D., Buckheit R.W. Unusual single-stranded polyribonucleotides as potent anti-HIV agents. J. Med. Chem. 1995; No.38, P. 3253-3257.

64. Browne E.P., Shenk T. Human cytomegalovirus UL83-coded pp65 virion protein inhibits antiviral gene expression in infected cells. // Proc Natl Acad Sci.- 2003.-V.100.-No.20.- P. 11439-11444.

65. Burdzenidze E, Chundzadze M, Zhvania M, Chikovani M. Neurological symptoms of cytomegalovirus infection in children. // Georgian Med News. 2005 May; Vol.122, P. 44-47.

66. Burshtein M., Serbin A., Bukrinskaya A. Effect of different adamantane and norbornene derivatives on HIV-1 infection in vitro. Antiviral Research. 2006. 70(1):A45.

67. Caliendo A.M., Kirsten G.St., Allega J. et al. Distinguishing Cytomegalovirus (CMV) Infection and Disease with CMV Nucleic Acid Assays. // Journal of Clinical Microbiology, May 2002, Vol. 40, P. 1581-1586.

68. Canestri A., Ghosn J., Wirden M. et. al. Foscarnet salvage therapy for patients with late-stage HIV disease and multiple drug resistance. Antivir Ther. 2006; No 11(5), P. 561-566.

69. Castillio J. P., Kowalika, T. F. / HCMV infection modulating the cell cycle and cell death. // International Reviews of Immunology.-2004.- V.23.- P. 113139.

70. Castillio J. P., Kowalika, T. F. Human cytomegalovirus immediate early proteins and cell growth control. // Gene.- 2002.- V.290.- P. 19-34.

71. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Knowledge and practices of obstetricians and gynecologists regarding cytomegalovirus infection during pregnancy-United States, 2007. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2008 Jan 25;57(3):65-8.

72. Cerbulo-Vazquez A, Valdes-Ramos R, Santos-Argumedo L. Activated umbilical cord blood cells from pre-term and term neonates express CD69 and synthesize IL-2 but are unable to produce IFN-gamma. Arch Med Res. 2003 Mar-Apr;34(2): 100-5.

73. Chakrabarti S, Collingham K.E., Osman H., Fegan C.D., Milligan D.W. Cidofovir as primary pre-emptive therapy for post-transplant cytomegalovirus infections. Bone Marrow Transplant. 2001; Nov; 28(9):879-81.

74. Chakravarti A, Kashyap B, Wadhwa A. Relationship of IgG avidity index and IgM levels for the differential diagnosis of primary from recurrent cytomegalovirus infections. // Iran J Allergy Asthma Immunol. 2007 Dec;6(4): 197-201.

75. Chee, M. S., Bankier A.T., Beck S. et al. Analysis of the protein-coding content of the sequence of human cytomegalovirus strain AD 169. // Curr. Top. Microbiol. Immunol.- 1990-. V.154.- P. 125-170.

76. Cherrington J.M., Khoury E.L., Mocarski E.S. Human cytomegalovirus ie2 negatively regulates alpha gene expression via a short target sequence near the transcription start site. //J.Virol.-1991.-V.65.-P.887-896.

77. Child S. J., Hakki M., De Niro K. L. et al. Evasion of cellular antiviral responses by human cytomegalovirus TRS1 and IRS1. Journal of virology., 2004.- V.78.- № l.-P. 197-205.

78. Chin K.C., Cresswell P. Virepin (cig5), an IFN-inducible antiviral protein protein directly induced by human cytomegalovirus. // Proc. Natl. Acad. Sci.-2001.- V.- 98(26).- P.15125-15130.

79. Chou S. Antiviral drug resistance in human cytomegalovirus. Transplant Infection Disease. 1999; 1: 105-114.

80. Chou Sunwen, Marousek Gail I. Maribavir Antagonizes the Antiviral Action of Ganciclovir on Human Cytomegalovirus. Antimicrobal Agents and Chemotherapy, Oct. 2006, Vol. 50, No. 10, p. 3470-3472.

81. Chrisp P., Clissold S.P. Foscarnet. A review of its antiviral activity, pharmacokinetic properties and therapeutic use in immunocompromised patients with cytomegalovirus retinitis. Drugs 1991; 41:104-129

82. Ciesla S.L., Trahan J., Wan W.B., Beadle J.R., Aldern K.A., Painter G.R., Hostetler K.Y. Esterification of cidofovir with alkoxyalkanols increases oral bioavailability and diminishes drug accumulation in kidney. Antiviral Res. 2003. No 59, P. 163-171.

83. Compton T. An Immortalized human fibroblasts cell line is permissive for human cytomegalovirus infection. // J.Virol.-1993.-V.67.-P.3644-3648.

84. Compton T. Receptors and immune sensors: the complex entry path of human cytomegalovirus. Trends Cell Biol. 2004. Vol.14, No 1, P. 5-8.

85. Compton T., Fiere A. Early events in human cytomegalovirus infection. In: Arvin A.M., Mocarski E.S., Voore P. et al., Editors. Human Herpesviruses: Biology, Therapy and Immunoprophylaxis. Cambridge: Cambridge Press; 2006: P. 229-238.

86. Cvetkovic RS, Wellington K.Valganciclovir: a review of its use in the management of CMV infection and disease in immunocompromised patients. Drugs. 2005; Vol. 65, No 6, P. 859-78.

87. De Clercd E. Strategies in the design of antiviral drugs. Nature Rev Drug Discovery 2002; No 1, P. 13-25.

88. De Clercq E. Therapeutic potential of HPMPC as an antiviral drug. Rev. Med. Virol. 1993; No 3, P. 86-96.

89. De Clercq E., Holy A. Acyclic nucleoside phosphonates: a key class of antiviral drugs. Nat. Rev. Drug Discov. 2005. 4, 928-940.

90. De Wit D, Olislagers V, Goriely S, Vermeulen F, Wagner H, Goldman M, Willems F. Blood plasmacytoid dendritic cell responses to CpG oligodeoxynucleotides are impaired in human newborns. Blood. 2004 Feb 1;103, No 3, P. 1030-1032.

91. DeSmet M.D., Meenken C.J., Van den Horn G.J. Fomivirsen: a phosphorothioate oligonucleotide for the treatment of CMV retinitis. Ocul. Immunol. Inflamm. 1999; 7:189-198.

92. DeVries J. The ABCs of CMV. // Adv Neonatal Care. 2007 Oct;7(5):248-55; quiz 256-7.

93. Distéfano A.L., Alonso A., Fabián Martin et al. Human Cytomegalovirus: detection of congenital and perinatal infection in Argentina. // BMC Pediatrics.-2004.-4:11 doi: 10.1186/1471-2431-4-11.

94. Distéfano AL, Alonso A, Martin F, Pardon F. Human cytomegalovirus: detection of congenital and perinatal infection in Argentina. BMC Pediatr. 2004 Jun 23;4:11.

95. Egorov Y., Serbin A., Alikhanova O., Burshtein M., Lupandin S., Bukrinskaya A. Raft-tropic Antivirals: 1. Synthesis and anti-HIV-1 Evaluation of Cholesten-containing Polyanions Antiviral Research. 2007. 74(3):49.

96. Elizabeth K. Stehel, Angela G. Shoup et al. Newborn Hearing Screening and Detection of Congenital Cytomegalovirus Infection // Pediatrics, May 2008; 121: 970-975.

97. Emery VC, Hassan-Walker AF. Focus on new drugs in development against human cytomegalovirus. Drugs. 2002;62(13):1853-8.

98. Faulds D., Heel R.C. Ganciclovir. A review of its antiviral activity, pharmacokinetic properties and therapeutic efficacy in cytomegalovirus infections. Dugs 1990; 39:597-638.

99. Fitzgerald-Bocarsly P., Dai J., Singh S. Plasmacytoid dendritic cells and type I IFN: 50 years of convergent history Cytokine & Growth Factor Reviews, 2008, 19,3-19.

100. Fortunato, E. A., Spector, D. H. Regulation of human cytomegalovirus gene expression. // Adv Virus Res.- 1999.- V.54.- P.61-128.

101. Francisci D, Tosti A, Baldelli F, et al. The pp65 antigenaemia test as a predictor of cytomegalovirus-induced end-organ disease in patients with AIDS. //AIDS.- 1997.- V.ll.- P.1341-1345.

102. Galli L, Novelli A, Chiappini E, Gervaso P, Cassetta MI, Fallani S, de Martino M. Valganciclovir for congenital CMV infection: a pilot study onplasma concentration in newborns and infants. // Pediatr Infect Dis J. 2007 May;26(5):451 -453.

103. Gawn J.M., Greaves R.F. Absence of IE1 p72 protein function during low-multiplicity infection by human cytomegalovirus results in a broad block to viral delayed-early gene expression. J Virol. 2002 May;76(9):4441-4455.

104. Gaytant M.A., Steegers E.A., Semmekrot B.A., Merkus H.M., Galama J.V. Congenital cytomegalovirus infection: review of the epidemiology and outcome // Obstet. Gynecol. Surv. 2002. - V.57. - P.245-256.

105. Gibson W. Assembly and maturation of the capsid. In: Reddehase M.J., Editor. Cytomegaloviruses: Pathogenesis, Molecular Biology, and Infection Control. Norfolk, United Kingdom: Caister Scientific Press; 2006: 231-244.

106. Gibson W. Structure and assembly of the virion. // Intervirology.- 1996.-V.39.- P.389-400.

107. Gindes L, Teperberg-Oikawa M, Sherman D, Pardo J, Rahav G. Congenital cytomegalovirus infection following primary maternal infection in the third trimester // BJOG. 2008 Jun;l 15(7):830-5.

108. Gleaves C.A., Hursh D.A., Meyers J.D. Detection of human cytomegalovirus in clinical specimens by centrifugation culture with a nonhuman cellline. // J. Clin. Microbiol.-1992.-V.30.-P. 1045-1048.

109. Gold MC, Donnelly E, Cook MS, Leclair CM, Lewinsohn DA. Purified neonatal plasmacytoid dendritic cells overcome intrinsic maturation defect with TLR agonist stimulation. Pediatr Res. 2006 Jul;60(l):34-7. Epub 2006 May 11.

110. Graça A, Silvério C, Ferreira JP, Brito A, Almeida S, Paixâo P, Pinheiro L. Congenital or neonatal cytomegalovirus infection? Acta Med Port. 2004 Jul-Aug;17(4):335-40.

111. Grangeot-Keros L., Cointe D. Diagnosis and prognostic markers of HCMV infection // J. Clin. Virol. 2001. - Vol.21. - P.213-221.

112. Gretch D.R., Gehrz R.C., Stinski M.F. Characterization of a human cytomegalovirus glycoprotein complex (gcll). // J. Virol.-1988.-V.69.- P.1205-1215.

113. Gretch, D.R., Kari, B., Rasmussen, L., et al. Identification and characterization of three distinct families of glycoprotein complexes in the envelopes of human cytomegalovirus. // J Virol.- 1988.- V.62.- P.875- 881.

114. Griffiths PD, Walter S. Cytomegalovirus. Curr Opin Infect Dis. 2005 Jun;18(3):241-5.

115. Griffiths, P. D., Panjwani, D. D., Stirk, P. R., et al. Rapid diagnosis of cytomegalovirus infection in immunocompromised patients by detection of early antigen fluorescent foci. // Lancet.-1984.- P. 1242-1245.

116. Guo AH, Lu M. Two cases of congenital nephrotic syndrome resulting from cytomegalovirus infection. // Zhonghua Er Ke Za Zhi. 2007 Nov;45(l l):872-3.

117. Hagemeier C., Walker S.M., Sissons P.J., et al. The 72K IE1 and 80K IE2 proteins of human cytomegalovirus independently trans-activate the c-fos, c-myc and hsp70 promoters via basal promoter elements // J. Gen. Virol.-1992.-V.73 .-P.2385-2393.

118. Halwachs-Baumann G., Genser B., Pailer S., Engele H., Rosegger H.,Schalk A., Kessler H.H., Truschnig-Wilders M. Human cytomegalovirus load in various body fluids of congenital infected newborns. // J. Clin. Virol.- 2002.-V.25.- P.S81-87.

119. Hamprecht K, Jahn G. Human cytomegalovirus and congenital virus infection.//Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz 2007. Nov;50(ll): 1379-92.

120. Hamzeh FM, Lietman PS, Gibson W, et al. Identification of the lytic origin of DNA replication in human cytomegalovirus by a novel approach utilizing ganciclovir-induced chain termination. // J Virol.- 1990.- V.64.- P.6184-6195.

121. Hansen-Pupp I, Harling S, Berg AC, Cilio C, Hellstrom-Westas L, Ley D Circulating interferon-gamma and white matter brain damage in preterm infants. PediatrRes. 2005 Nov;58(5):946-52.

122. Hassan J, Connell J. Translational mini-review series on infectious disease: congenital cytomegalovirus infection: 50 years on. // Clin Exp Immunol. 2007 Aug;149(2):205-10.

123. Hassan J, Dooley S, Hall W. Immunological response to cytomegalovirus in congenitally infected neonates. Clin Exp Immunol., 2007,147, 3, 465-71.

124. Ho E.S., Lin D.C., Mendel D.B., Cihlar T. Cytotoxicity of antiviral nucleotides adefovir and cidofovir is induced by the expression of human renal organic anion transporter 1. J. Am. Soc. Nephrol. 2000. 11, 383-393.

125. Honess R.W., Roizman B. Regulation of herpesvirus macromolecular synthesis. I. Cascade regulation of the synthesis of three groups of virus proteins. // J. Virol.-1974.-V. 14.- P.8-19.

126. Horacek J., Brucek P., Otova B. Detection of nuclear cytomegalovirus antigen in cell-culture as compared to classical virus isolation. // Acta Virol.-1991.- V.35.- P.187-189.

127. Huang E.S., Pagano J.S. Nucleic acid hybridization technology and detection of proviral genomes. //Methods Virol.- 1977.-V.6.-P.457-497.

128. Iskenderian AC, Huang L, Reilly A, et al. Four of eleven loci required for transient complementation of human cytomegalovirus DNA replication cooperate to activate expression of replication genes. // J Virol.- 1996.- V.70.-P.383-392.

129. Istas A.S., Demmler Y.J. et al. Surveillance for congenital cytomegalovirus diseases: a report from the National Congenital Cytomegalovirus Diseases Registry. // Clin. Infect. Dis.- 1995. Vol.20 - No. 3. - P.665-669.

130. Jault M. F., Jault J.-M., F. Ruchti, et al. Cytomegalovirus infection induceshigh levels of cyclins, phosphorylated Rb, and p53, leading to cell cyclearrest. // J. Virol.- 1995.- V.69.- P.6697-6704.

131. Kaiser 1, Perrin L, Halaya K, et al. Improved monitoring of cytomegalovirus infection after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation by an ultrasensitive plasma DNA PCR assay. // J. CI. Microbiology.- 2002.- V.40(l).-P. 4251-4255.

132. Kalejta R. F., Bechtel J.T., Shenk T., Mutations that abolish the ability of HCMV pp71 protein to induce DNA synthesis in quiescent cell do not affect its ability to accelerate G1 phase cell cycle progression. // J Virol.- 2003.- V.77.-P.3451-3459.

133. Kanich R.E., Craighead J.E. Human cytomegalovirus infection of cultured fibroblasts. II. Viral replicative sequence of a wild and an adapted strain. // Lab. Invest.-1972.-V.27.-P.237-282.

134. Karen B. Fowler and Robert F. Pass. Risk Factors for Congenital Cytomegalovirus Infection in the Offspring of Young Women: Exposure to Young Children and Recent Onset of Sexual Activity. // Pediatrics, Aug 2006; 118:286-292.

135. Kari B., Gehrz R. A human cytomegalovirus glycoprotein complex designated gC-II is a major heparin-binding component of the envelope. // J. Virol.-1992.-V.66.-P. 1761-1764.

136. Kari B., Gertz R. Characterization of cytomegalovirus glycoproteins in a family of complexes designated gC-II with murine monoclonal antibodies. // Arch. Virol.-1990.-V.112.-P.55-65.

137. Kenneson A, Cannon MJ. Review and meta-analysis of the epidemiology of congenital cytomegalovirus (CMV) infection. // Rev Med Virol. 2007 Jul-Aug; 17(4) :253-76.

138. Kiezebrink-Lindenhovius HH, van den Berg YL, Sprikkelman AB, Weel JF, Veenhoven RH. Cytomegalovirus infection: congenital or postnatally acquired? Importance of the Guthrie card. Ned Tijdschr Geneeskd. 2001 Jun 30; 145(26): 1259-61. •

139. Kline J.N., Hunninghake G.M., He B., Monick M.M., Hunninghake G.W. Synergistic activation of the human cytomegalovirus major immediate early promoter by prostaglandin E2 and cytokines // Exp-Lung-Res. 1998. V. 24(1). P. 3-14.

140. Kociecki J, Kociecka W, Dmitriew A. Cytomegalovirus infection—selected aspects of clinical pathology. // Klin Oczna. 2007;109(l-3):74-8.

141. Kovacs A.S., Churchill M.A., Wood D., et al. Molekular and epidemiologic evaluations of a cluster of cases of Menetriers disease associated with cytomegalovirus // Pediatrics Infectious Disease Journal (R).- 1993.- V. 12.-№12.-P. 1011-1014.

142. Krosky P.M., Baek M.C., Coen D.M. The human cytomegalovirus UL97 protein kinase, an antiviral drug target, is required at the stage of nuclear egress. J. Virol. 2003. 77, 905-914.

143. Krosky P.M., Underwood M.R., Turk S.R., et.al./ Resistance of human cytomegalovirus to benzimidazol ribonucleosides maps to two open reading frames: UL89 and UL56. // J. Virol. 1998.- V.- 72. P. 4721- 4728.

144. Landolfo S, Gariglio M., Gribaudo G., et al. The human cytomegalovirus. // Pharmacology & therapeutics.- 2003.- V.98.- P.269-297.

145. Lazzarotto T, Guerra B, Lanari M, Gabrielli L, Landini MP. New advances in the diagnosis of congenital cytomegalovirus infection. J Clin Virol. 2008 Mar;41(3):192-7.

146. Lazzarotto T., Varani S., Guerra B., et al. Prenatal indicators of congenital cytomegalovirus infection // Journal of Pediatrics.- 2000.- V.137. No.l.

147. Lee J.Y., Irmiere A., Gibson W. Primate cytomegalovirus assembly: evidence that DNA packaging occures subsequent to B-capsid assembly. // Virology.-1988 -V. 167.- P.87-96.

148. Liu F., Zhou Z.H. Comparative virion structure of human herpesviruses. In: Arvin A.M., Mocarski E.S., Voore P. et al., Editors. Human Herpesviruses: Biology, Therapy and Immunoprophylaxis. Cambridge: Cambridge Press; 2006: 27-43.

149. Liu ZG, Hsu H, GoeddelDV, et al. Dissection of TNF receptor 1 effector functions: JNK activation is not linked to apoptosis while NF-kappaB activation prevents cell death. Cell 1996; 87: 565-576.

150. Lombardi G., Stronati M. Infezione congenital da cytomegalovirus. // Minerva pediat. 2005. - Vol.57. - P.213-227.

151. Luck S, Sharland M, Griffiths P. Ganciclovir therapy for neonates with congenital cytomegalovirus infection. // Eur J Pediatr. 2007 Jun;166(6):633-4.

152. Mach M, Kropff B, Dal Monte P, Britt W. Complex formation by human cytomegalovirus glycoproteins M (gpULlOO) and N (gpUL73). J Virol. 2000 Dec;74(24):l 1881-11892.

153. Maeda-Takekoshi F., Takekoshi M., Tanaka S. Expression of the immediate early antigens of human cytomegalovirus is responsible for virus proliferation; an intracellular immunization approach. //Tokai. J. Exp. Clin. Med.-1992.-V.17.-P.75-83.

154. Malm G, Engman ML. Congenital cytomegalovirus infections. // Semin Fetal Neonatal Med. 2007 Jun; 12(3): 154-9.

155. Margolis M.J., Pajovic S., Wong E.L., et al. Interaction of the 72-kilodalton human cytomegalovirus IE1 gene product with E2F1 coincides with E2F-dependent activation of dihydrofolate reductase transcription. // J Virol.- 1995.-V.69.- P.7759-7767.

156. Martin DF, Kuppermann BD, Wolitz RA et. al. Oral ganciclovir for patients with cytomegalovirus retinitis treated with a ganciclovir implant. N Engl J Med. 1999 Apr 8;340(14): 1063-70.

157. Maschmann J., Yamprecht K., Dietz K., et al. Cytomegalovirus infection of extremely low-birth weight infants via breast milk // Clinical Infection Deseases, 2001.- V.33.- P. 1998-2003.

158. Masse MJ., Messerle M., Mocarski E.S. The location and sequence composition of the murine cytomegalovirus replicator (orz'Lyt). // Virology.-1997.-V.230.- P.350-360.

159. McGavran M.H., Smith M.G. Ultrastructural, cytochemical and microchemical observations on cytomegalovirus (salivary gland virus) infection of human cells in tissue culture. // Exp Mol Pathol.- 1965.- V.4.- P.l-10.

160. Meine Jansen CF, Toet MC, Rademaker CM, Ververs TF, Gerards LJ, van Loon AM. Treatment of symptomatic congenital cytomegalovirus infection with valganciclovir. // J Perinat Med. 2005;33(4):364-6.

161. Mendez J.C., Sia I.G., Tau K.R., Espy M.J., Smith T.H., Chou S., Paya C.V. Novel mutation in the CMV UL97 gene associated with resistance to ganciclovir therapy. Transplantation 1999; 67:755-757.

162. Mercorelli B, Sinigalia E, Loregian A, Palu G. Human cytomegalovirus DNA replication: antiviral targets and drugs. Rev Med Virol. 2008 May-Jun; 18(3): 177-210.

163. Meyer J.D., Ljungman P., Fisher L.D. Cytomegalovirus excretion as a predictor of cytomegalovirus disease after marrow transplantation: importance of cytomegalovirus viremia. //J. Infect. Dis.- 1990.- V. 162.- P/373-380.

164. Michaels M.G., Greenberg D.P., Sado D.L., Wald E.R. Treatment of children with congenital cytomegalovirus infection with ganciclovir // Pediatr. Infect. Dis. 2003. -Vol.22. - P.504-509.

165. Michaels MG. Treatment of congenital cytomegalovirus: where are we now? Expert Rev Anti Infect Ther. 2007 Jun;5(3):441-8.

166. Mocarski E.S. Comparative analysis of herpesvirus-common proteins. In: Arvin A.M., Mocarski E.S., Voore P. et al., Editors. Human Herpesviruses: Biology, Therapy and Immunoprophylaxis. Cambridge: Cambridge Press; 2006: 44-58.

167. Mocarski E.S. Cytomegalovirus: biology and replication. // In book: The human herpesviruses. Ed. by Roizman B., Whitley R.J., Lopez C., New York.-1993.-P. 173-226.

168. Mocarski E.S. Viral genes and their functions. In: Arvin A.M., Mocarski E.S., Voore P. et al., Editors. Human Herpesviruses: Biology, Therapy and Immunoprophylaxis. Cambridge: Cambridge Press; 2006: 202-228.

169. Mocarski E.S., Courcelle C. T. Cytomegalovirus and their replication. // In book: Fields Virology, 4th Ed. by D. Knipe, P. Howley.- 2001.- P.2629- 2673.

170. Mocarski E.S., Thomas Shenk, Robert F. Pass. Cytomegaloviruses. // In book: Fields Virology, 5th Ed. by D. Knipe, P. Howley. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins.- 2007.- P.2701-2772.

171. Mocarski ES, Liu AC, Spaete RR. Structure and variability of the a sequence in the genome of human cytomegalovirus (Towne strain). // J Gen Virol.-1987.-V.68.-P.2223-2230.

172. Mosca F, Pugni L. Cytomegalovirus infection: the state of the art// J Chemother. 2007 Oct; 19 Suppl 2:46-8.

173. Mulamba G.B., Hu A., Azad R.F., Anderson K.P., Coen D.M. Human cytomegalovirus mutant with sequence-dependent resistance to the phosphorothioate oligonucleotide fomivirsen (ISIS 2922). Antimicrob. Agents Chemother. 1998; 42:971-973.

174. Miiller A, Eis-Hiibinger AM, Brandhorst G, Heep A, Bartmann P, Franz AR. Oral valganciclovir for symptomatic congenital cytomegalovirus infection in an extremely low birth weight infant. // J Perinatol. 2008 Jan;28(l):74-6.

175. Murphy, E.A., Streblow, D.N., Nelson, et al. The human cytomegalovirus IE86 protein can block cell cycle progression after inducing transition into the S phase of permissive cells. //J Virol.- 2000.- V.74.- P.7108- 7118.

176. Namangala B., Inoue N., Kohara J., Kuboki N., Sakurai T., Hayashida K., Sugimoto C. Evidence for the immunostimulatory effects of low-dose orally delivered human IFN-alpha in cattle — J. Interferon Cytokine Res., 2006, 26, 9, 675-81.

177. Ng PC, Li K, Wong RP, Chui K, Wong E, Li G, Fok TF. Proinflammatory and anti-inflammatory cytokine responses in preterm infants with systemic infections. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 2003 May;88(3):F209-13.

178. Novotny, J., Rigoutsos, I., Coleman, D., et al. In silico structural and functional analysis of the human cytomegalovirus(HHV5) genome. // J Mol Biol.- 2001.- V.310.- P. 1151-1166.

179. Nozawa N, Inoue N. Mechanisms of congenital CMV infection. // Nippon Rinsho. 2006 Mar;64 Suppl 3:446-50.

180. Numazaki K. Congenital infection and HCMV. Nippon Rinsho. 2006 Mar;64 Suppl 3:496-9.

181. Ornoy A. Fetal effects of primary and non-primary cytomegalovirus infection in pregnancy: are we close to prevention? Isr Med Assoc J. 2007 May;9(5):398-401.

182. O'Riordan D.P., Golden W.C., Aucott S.W. Herpes simplex virus infections in preterm infants Pediatrics 2006,118, p. 1612-1620.

183. Painter G.R., Hostetler K.Y. Design and development of oral drugs for the prophylaxis and treatment of smallpox infection. Trends Biotechnol. 2004. 22, 423-427.

184. Pass RF, Fowler KB, Boppana SB, Britt WJ, Stagno S. Congenital cytomegalovirus infection following first trimester maternal infection: symptoms at birth and outcome. // J Clin Virol. 2006 Feb;35(2):216-20.

185. Perol Y., Caro V., Mazeron M.C. Cytomegalovirus antigenemia assay: therapeutic usefulness and biological significance. // Nouv Rev Fr Hematol.-1993.- V.35(l).-P .95-98.

186. Perry CM, Balfour JA. Fomivirsen. Drugs. 1999 Mar;57(3):375-80.

187. Pignatelli S., Monte D., Zini N. et. al. Immunoelectron microscopy analysis of HCMV gp UL73 (gN) localization. // Arch. Virol.- 2002.- Vol. -147(6).-P.1247-1256.

188. Poma E., Kowalik T., Zhu L., et. al. The human cytomegalovirus IE 1-72 protein interacts with the cellular pi07 protein and relieves p 107-mediated transcriptional repression of an E2F-responsive promoter. // J.Virol.-1996.-Vol.-70.- P. 7867-7877.

189. Prichard M.N., Duke G.M., Mocarski E.S. Human cytomegalovirus uracil DNA glycosylase is required for the normal temporal regulation of both DNA synthesis and viral replication. // J Virol.- 1996.- V.70.- P.3018-3025.

190. Prichard M.N., Jairath S., Penfold M.E., St Jeor S., Bohlman M.C., Pari G.S. Identification of persistent RNA-DNA hybrid structures within the origin of replication of human cytomegalovirus. J Virol. 1998 Sep;72(9):6997-7004.

191. Rafailidis PI, Mourtzoukou EG, Varbobitis IC, Falagas ME. Severe cytomegalovirus infection in apparently immunocompetent patients: a systematic review. Virol J. 2008 Mar 27;5:47.

192. Rahav G. Congenital cytomegalovirus infection a question of screening. Isr Med Assoc J. 2007 May;9(5):392-4.

193. Razonable R.R., Emery V.C. Management of CMY infection and disease in transplant patients consensus article—IHMF® management recommendations. Herpes. 2004.11, 77-86.

194. Reefschlaeger J., Bender W., Hallenberger S. et al. Novel non-nucleoside inhibitors of cytomegaloviruses (BAY 38-4766): in vitro and in vivo antiviral activity and mechanism of action. J. Antimicrob. Chemother. 2001. 48, 757767.

195. Revello M.G., Gerna G. Diagnosis and management of human cytomegalovirus infection in the mother, fetus and newborn infant // Clin. Microbiol. Rev. -2002. Y.15. - P.680-715.

196. Roby C., Gibson W. Characterization of phosphoptoreins and protein kinase activity of virions, noninfectious enveloped particles and dense bodies of human cytomegalovirus. // J. Virol.-1986.-V.59.-P.714-727.

197. Roizman B., Sear A.E. Herpes simplex viruses and their replication. In book: Virology, Ed. by Fielda B.N., Knipe D.M., Chanock R.M., Hirsch M.S., Melnick J.L., MonathT.P., New York.- 1990.-P. 1795-1841. '

198. Roizman B.R., Knipe D.M. Herpes simplex viruses and their replication. // -In: Fields Virology, 4th Ed. by D. Knipe, P. Howley. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins.- 2001.- P.2399-2459.

199. Rosen P.P. Cytomegalovirus infection in cancer patients. // Pathol. Annu.-1978.-V.13,- P.175-208.

200. Saito S, Kato Y, Maruyama M, Ichijo M. A study of interferon-gamma and interleukin-2 production in premature neonates and neonates with intrauterine growth retardation. Am J Reprod Immunol. 1992 Jan-Mar;27(l-2):63-8.

201. Salvant B.S., Fortunato E.A., Spector D.H. Cell cycle dysregulation by human cytomegalovirus: influence of the cell cycle phase at the time of infection and effects on cyclin transcription. // J. Virol.- 1998.- V.70.- P.7867-7877.

202. Schulzke S, Biihrer C. Valganciclovir for treatment of congenital cytomegalovirus infection. // Eur J Pediatr. 2006 Aug;165(8):575-6.

203. Shukla D. A novel role for 3-O-sulfated heparin sulfate in herpes simplex virus 1 entry. Cell 1999; 99: 13-22

204. Simmen K., Singh J., Mattias B. et. al. Global modulation of cellular transcription by human cytomegalovirus is initiated by viral glycoprotein B. // PNAS.-2001.-V.98.- P.7140-7145.

205. Singh N. Antiviral drugs for cytomegalovirus in transplant recipients: advantages of preemptive therapy. Rev Med Virol. 2006 Sep-Oct;16(5):281-287.

206. Smith J.D., DeHarven E. Herpes simplex virus and human cytomegalovirus replication in WI-38. II. An ultrastructural study of viral penetration. // J. Virol.-1974.-V.14.- P.945-956.

207. Soetens O, Vauloup-Fellous C, Foulon I, Dubreuil P, De Saeger B, Grangeot-Keros L, Naessens A. Evaluation of different cytomegalovirus (CMV) DNA

208. PCR protocols for analysis of dried blood spots from consecutive cases of neonates with congenital CMV infections. J Clin Microbiol. 2008 Mar;46(3):943-6.

209. Song, Y., Stinski, M. F. Effect of the human cytomegalovirus IE86 protein on expression of E2F-responsive genes: a DNA microarray analysis. Proc Natl Acad Sci USA.- 2002.- V.99.- P.2836- 2841.

210. Spaete R.R., Gehrz R.C., Landini M.P. Human cytomegalovirus structural proteins. // J Gen Virol.- 1994.- V.75.- P.3287-3308.

211. Spaete R.R., Mocarski E.S. The a sequence of the cytomegalovirus genome functions as a cleavage/packaging signal for herpes simplex virus defective genomes. // J Virol.- 1985.- V.54.- P.817-824.

212. Stasiak P.C., Mocarski E.S. Transactivation of the cytomegalovirus ICP36 gene promoter requires the alpha gene product TRS1 in addition to IE1 and IE2. // J. Virol.- 1992.- V.66.- P.1050-1058.

213. Steininger C. Novel therapies for cytomegalovirus disease. Recent Patents Anti-Infect Drug Disc. 2007 Jan;2(l):53-72.

214. Stotskaya L.L., Serbin A.V. Antiviral Macromolecular Therapeutic Systems (MTS): Principles and Methods of Design. Antiviral Research 1993, 20(1):183.

215. Suneja M, Nair R. Cytomegalovirus glomerulopathy in a kidney allograft with response to oral valganciclovir. Am J Kidney Dis. 2008 Jul;52(l):el-4.

216. Suresh B. Boppana, Karen B. Fowler, William J. Britt, Sergio Stagno, and Robert F. Pass. Symptomatic Congenital Cytomegalovirus Infection in Infants Born to Mothers With Preexisting Immunity to Cytomegalovirus Pediatrics, Jul 1999; 104: 55 60.

217. Suzuki Y, Toribe Y, Mogami Y, Yanagihara K, Nishikawa M. Epilepsy in patients with congenital cytomegalovirus infection. II Brain Dev. 2008 Jun;30(6):420-4.

218. Tagawa M, Moriuchi H. Epidemiology of congenital cytomegalovirus infection. Nippon Rinsho. 2006 Mar;64 Suppl 3:455-9.

219. Theiler R. N., Compton T. Characterization of the signal peptide processing and membrane association of human cytomegalovirus glycoprotein O. // J Biol Chem.- 2001.- V.276.- P.39226- 39231.

220. Topilko A., Michelson S. Morphological and cytochemical analysis of human cytomegalovitus inoculum. Correlation of free particles in inoculum with counterparts in infected cells. // Res. Virol.-1994.-V.145.-P.65-73.

221. Vol.87, Suppl. N l.-p.206.

222. Townsend L.B., Devivar R.V., Turk S.R., Nassiri M.R., Drach J.C. Design, synthesis, and antiviral activity of certain 2,5,6-trihalo-l-(beta-dribofuranosyl) benzimidazoles. J. Med. Chem. 1995. 38, 4098-4105.

223. Tyrrell D.A., Bynoe M.L., Hoom B. Studies on the antiviral activity of 1-adamantanamine. Br J Exp Pathol. 1965 Aug;46(4): 370-375

224. Valcyte (valgancyclovir hydrachloride tablets) package insert. Roche laboratories Inc., 2003.

225. ViroPharma Inc. ViroPharma announces presentation of Phase 1 clinical data for maribavir. Available: http://www.viropharma.com/ (accessed January, 31, 2006).

226. ViroPharma Inc., ViroPharma Completes Enrollment in Phase 2 clinical study of maribavir in bone marrow transplant patients. Available: http://www.viropharma.com/ (accessed January 31, 2006).

227. Vistide (cidofovir injection) package insert. Gilead Sciences Inc., 1996.

228. Vollmer B., Seibold-Weiger K., Schmitz-Salue C. et al. Postnatally acquired cytomegalovirus infection via breast milk: effects on hearing and development in preterm infants. Pediatr. Infect. Dis. J. 2004, 23 (4): 322-327.

229. Wang L.H., Peck R.W., Yin Y., et al. Phase I safety and pharmacokinetic trials of 1263W94, a novel oral antihuman cytomegalovirus agent, in healthy and human immunodeficiency virus-infected subjects. Antimicrob. Agents Chemother. 2003. 47, 1334-1342.

230. Weber O., Bender W., Eckenberg P. et al. Inhibition of murine cytomegalovirus and human cytomegalovirus by a novel non-nucleosidic compound in vivo. Antiviral Res. 2001. 49, 179-189.

231. Weclawiak H, Kamar N, Mengelle C, Guitard J, Esposito L, Lavayssiere L, Cointault O, Ribes D, Rostaing L. Cytomegalovirus prophylaxis withvalganciclovir in cytomegalovirus-seropositive kidney-transplant patients. J Med Virol. 2008 Jul;80(7): 1228-32.

232. White E.A., Spector D.H. Early viral gene regulation and function. In: Arvin A.M., Mocarski E.S., Voore P. et al., Editors. Human Herpesviruses: Biology, Therapy and Immunoprophylaxis. Cambridge: Cambridge Press; 2006: 262291.

233. Wiebusch L, Hagemeier C. The human cytomegalovirus immediate early 2 protein dissociates cellular DNA synthesis from cyclin-dependent kinase activation. EMBO J. 2001 Mar 1;20(5): 1086-98.

234. Wiebusch L., Asmar J, Uecker R., et al. Human cytomegalovirus immediate-early protein 2 (IE2)-mediated activation of cyclin E is cell-cycle-independent and forces S-phase entry in IE2-arrested cells. J Gen Virol. 2003 Jan;84(Pt 1):51-60.

235. Winkler M., Siepen D., Stamminger T. Functional interaction between pleiotropic transcativator pUL69 of human cytomegalovirus and the human homology of yeast chromatin regulatory protein SPT6. // J. Virol.-2000.-V.74.-P.8053-8064.

236. Wolf D.G., Courcelle C.T., Prichard M.N., Mocarski E.S., Distinct and separate roles for herpesvirus-conserved UL97 kinase in cytomegalovirus NA synthesis and encapsidation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001. 98, 1895— 1900.

237. Wright E, Bain M, Teague L, Murphy J, Sinclair J. Ets-2 repressor factor recruits histone deacetylase to silence human cytomegalovirus immediate-early gene expression in non-permissive cells. J Gen Virol. 2005 Mar;86(Pt 3):535-44.

238. Xu Y, Cei S.A. et al. Human cytomegalovirus DNA replication requires transcriptional activation via an IE2- and UL84-responsive bidirectional promoter element within oriLyt. J Virol. 2004 Nov;78(21):l 1664-77.