Выявление маркеров цитомегаловируса у новорожденных и детей раннего возраста. Развитие апоптоза при цитомегаловирусной инфекции in vitro

Меджидова, Марина Гудовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выявление маркеров цитомегаловируса у новорожденных и детей раннего возраста. Развитие апоптоза при цитомегаловирусной инфекции in vitro
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Выявление маркеров цитомегаловируса у новорожденных и детей раннего возраста. Развитие апоптоза при цитомегаловирусной инфекции in vitro"

на правах рукописи

МЕДЖИДОВА МАРИНА ГУДОВНА

ВЫЯВЛЕНИЕ МАРКЕРОВ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСА У НОВОРОЖДЕННЫХ И ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА. РАЗВИТИЕ АПОПТОЗА ПРИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ IN VITRO

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Москва - 2005 г.

Работа выполнена в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Федорова Наталья Евгеньевна. Официальные оппояевты:

Доктор медицинских наук, профессор Чешик Святослав Георгиевич Доктор биологических наук, профессор Миллер Галина Генриховна

Ведущая организация:

Институт Молекулярной генетики РАН.

Защита состоится » декабря 2005 г. в 12." часов

На заседании диссертационного Совета Д.001.020.01 при ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: 123098 Москва, ул. Гамалеи, д. 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

> ноября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета Доктор медицинских наук

НЛЫСосякова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы.

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) является одной из наиболее часто встречающих инфекций у новорожденных и детей раннего возраста, вызывающих тяжелые патологии, вплоть до гибели ребенка. (Самохин, 1987; Alford, Stagno, 1990; Gaytant, 2002). По данным отечественных и зарубежных специалистов от 0,5 до 5% детей появляются на свет с врожденной ЦМВИ, из них около 90% детей, являются асимптоматичными носителями (ВагЫ, Binda, 2003; Gaytant, 2002).

Диагностика ЦМВИ у новорожденных детей часто представляет сложную задачу в связи с отсутствием типичных симптомов и признаков ЦМВИ, а также из-за особенностей иммунной системы новорожденных. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные этой проблеме, разработка четких и общепринятых рекомендаций по лабораторному обследованию новорожденных и детей раннего возраста с подозрением на ЦМВИ остается нерешенной задачей.

Ассоциированные с ЦМВИ аномалии в эмбриональном развитии детей и различные заболевания у новорожденных и детей раннего возраста связаны с патологическим действием ЦМВ на клетку. В то же время недостаточно изучены процессы, лежащие в основе морфологических и функциональных изменений ЦМВ-инфицированных клеток. Особое значение среди механизмов, приводящих к деструктивным нарушениям клетки, имеет апоптоз.

В настоящее время активно изучается влияние ЦМВ на программированную клеточную гибель. Однако основное внимание большинства исследователей направлено на поиск я изучение индивидуальных вирусных белков, обладающих антиапоптозными свойствами (Goldmacher, 2005; Skaletskaya, 2001). В результате установлено, что белки ЦМВ (vICA, vMIA) ингибируют развитие апоптоза на нескольких уровнях (Goldmacher, 2005; Castülio, 2004). Вместе с тем в ряде работ показано, что механизмы реализации апоптоза связаны с пролифератнвной активностью клеток. Установлено, что в регуляции этих процессов участвуют одни и те же клеточные факторы (Chen, 2001, Campbell, 2004). В то же время, практически отсутствуют данные о реализации процессов апоптоза под влиянием ЦМВ в клетках, находящихся на различных стадиях клеточного цикла. В связи с этим изучение действия ЦМВ на программированную клеточную гибель в зависимости от пролиферативной активности клеток пред

Цель и задачи исследовании.

Цель настоящего исследования заключалась в сравнительной оценке эффективности методов лабораторной диагностики ЦМВИ у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста с подозрением на ЦМВИ, а также в изучении действия ЦМВ на гибель клеток в зависимости от пролиферативного состояния клеток.

Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:

1. Выявить прямые маркеры ЦМВ у недоношенных новорожденных и детей раннего

возраста с подозрением на ЦМВИ. 5. Изучить спектр и индекс авидности противовирусных антител у недоношенных новорожденных и детей раннего возраст

3. Сравнить эффективность методов лабораторной диагностики при выявлении ЦМВИ у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста.

4. Изучить динамику гибели ЦМВ-зараженных клеток, инфицированных в различных фазах клеточного цикла.

5. Изучить изменения транскрипционных уровней мРНК проапоптозного гена fas и антиапоптозного гена bcl-2 в клетках ФЛЭЧ, инфицированных в состоянии пролиферативного покоя и в состоянии синтеза ДНК.

6. Проследить изменение экспрессии белка Вс1-2, активацию каспазы-3 и освобождение цитохрома С из митохондрий в цитоплазму в клетках, находящихся в момент заражения в различных фазах клеточного цикла.

7. Изучить действие ЦМВ на целостность цитоскелета и хроматина клетки.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Установлено, что при выявлении ЦМВ у новорожденных и детей раннего возраста, наиболее информативным и чувствительным является быстрый культуральныЙ метод (БКМ).

2. Впервые показано, что в ЦМВ-инфицированных фибробластах индукция процессов апоптоза зависит от пролиферативного состояния клеток в момент заражения.

3. Впервые показано, что в фибробластах человека под действием ЦМВ увеличивается экспрессия гена bcl-2 на уровне транскрипции и трансляции.

4. Показано, что при заражении делящихся фибробластов в ранней стадии инфекции (48 часов после проникновения вируса) повышается уровень мРНК гена fas.

5. Впервые установлено, что в фибробластах, инфицированных ЦМВ в состоянии пролиферативного покоя, экспрессия маркеров апоптоза (Вс1-2, каспаза-3, цитохром С) происходит быстрее, чем в фибробластах зараженных в состоянии активной пролиферации.

6. Показано, что повреждение хроматина под действием цитомегаловируса не сопровождается межнуклеосомными разрывами ДНК.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Показана высокая частота выявления ЦМВИ у недоношенных новорожденных и дегей раннего возраста с подозрением на ЦМВИ.

2. БКМ является более чувствительным и информативным методом лабораторной диагностики ЦМВИ у новорожденных и детей раннего возраста по сравнению с серологическими методами и методом ПЦР.

3. Показано, что в фибробластах, инфицированных в состоянии пролиферативного покоя, программированная гибель клеток развивается значительно быстрее, чем в делящихся клетках.

Апробация работы.

Основные положения работы были представлены на трех международных и четырех российских научно-практических конференциях и симпозиумах в 2002-2004 г.г. В завершенном виде доклад по диссертационной работе прошел предварительную экспертизу на совместном заседании Отдела молекулярной вирусологии и совета по предварительной экспертизе диссертационных работ ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН от 29 сентября 2005г.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 234 источников отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 160 страницах машинописного текста и содержит 5 таблиц и 23 рисунка.

По результатам исследования опубликовано 11 научных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Культура клеток. В работе использовали диплоидные фибробласты легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ) полученные из Медико-генетического научного центра РАМН (Москва). Культуру клеток выращивали на среде БМЕМ, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТО), 2 мМ Т.-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина.

Вирус. Использовали рефереис штамм ЦМВ АО 169, любезно предоставленный доктором Ь. Регата (США). Вирус поддерживали путем пассирования на культуре клеток ФЛЭЧ.

Определение инфекционной активности вируса. Определение инфекционной активности вируса проводили модифицированным методом «черных» бляшек. Для титрования готовили возрастающие десятикратные разведения вируса. Очаги инфицированных клеток (бляшек) выявляли иммуноцитохимическим методом с использованием смеси моноклональных антител (МКА) к белкам 1Е1-72 и рр65. Окрашенные бляшки индентифицировали и подсчитывали с помощью светового микроскопа. Титр вируса выражали в количестве бляшкообразующих единиц, содержащихся в 1 мл (БОЕ/мл).

Синхронизация ФЛЭЧ. Стадия СО. Синхронизацию ФЛЭЧ проводили лишением клеток сывороточных ростовых факторов (Федорова и др., 2003). Для этого клетки высаживали в концентрации 50 тысУмл на покровные стекла, помещенные на дно 24-луночных панелей. В течение 48 часов фибробласты инкубировали в среде с 10% ЭТС. Затем клетки промывали, вносили среду с 0,2% сыворотки и продолжали инкубацию 48 часов. При этих условиях культивирования клетки выходят из клеточного цикла и останавливаются в фазе <30 и/или на границе 00/01. На этой стадии клеточного цикла фибробласты заражали ЦМВ с МИ 1 -5 БОЕ/кл. Далее опытные и контрольные популяции были разделены на две группы. Первую группу клеток после адсорбции вирус помещали в «старую» кондиционную среду с 0,2% ЭТС, отобранную перед заражением, для того, чтобы предотвратить стимуляцию к делению. Вторую группу клеток, как контрольную, так и инфицированную, стимулировали к делению, внесением свежей среды с 15% ЭТС. Стадия в. Для синхронизации ФЛЭЧ в стадии в клетки останавливали в фазе 00, как указано выше. Для индукции пролиферации вносили свежую среду с 15% ЭТС. Как установлено ранее через 24 часа после стимуляции клетки находились в стадии синтеза ДНК. В этот момент фибробласты заражали вирусом (МИ 1-5 БОЕ/кл.) и культивировали в среде с 15% ЭТС.

Иммуноцнтохнмнческнй метод. Неинфицированные и инфицированные ЦМВ клетки ФЛЭЧ, промывали 0,1 М фосфатно-солевым буфером рН 7,4. Для фиксации клеток использовали три различных способа в зависимости от поставленных задач: фиксировали абсолютным метанолом 20 мин (-20°С); охлажденным ацетоном в течение 10

мин при +4°С и 3% параформальдегидом (Sigma) 20 мин при комнатной температуре с последующей обработкой 0,1% раствором Тритона Х-100 на буфере PBS в течение 20 мин. На фиксированные препараты наносили очищенные МКА и инкубировали в течение 1 часа при 37"С. Затем клетки промывали буфером PBS и инкубировали с антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена в течение 1 часа при 3ТС.

Определение целостности цнтоплазматической мембраны фибробластов.

Целостность мембран клеток была определена методом исключения витальных красителей: трипаиового синего и пропидием йодистым. Количество клеток с поврежденной мембраной (окрашенных) выражали в процентах от общего числа клеток.

Выявление Вс1-2, цитохромя С, активированной каспазы-З н фрагментароваииой ДНК. Обнаружение каспазы-З проводили иммуноцитохямическим методом с использованием кроличьих AT (Promega, США). Для выявления Вс1-2 и цитохрома С использовали МКА направленные к BcL-2 (Novocastra, Англия) и к цитохрому С (Promega, США), соответственно.

Для обнаружения нуклеосомных разрывов в ДНК использовали набор DeadEnd"" Colorimetric TUNEL System (Promega, США). Реакцию проводили согласно рекомендуемому протоколу.

Пациенты. В 2002 - 2004 г.г. были обследованы 64 недоношенных новорожденных и детей раннего возраста на базе специализированного акушерского отделения при клинической городской больнице №8 департамента здравоохранения г. Москвы, детской городской клинической больницы №13 им. Н.Ф.Филатова и Центра коррекции развития детей раннего возраста Московского НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ.

Быстрый культуральиый метод (БКМ). Для определения инфекционной активности ЦМВ в клиническом материале использовали быстрый культуральиый метод. Клетки ФЛЭЧ высаживали в 24-луночные панели в концентрации 250 тыс. клеток в 1 мл. Через 48 часов культивирования, вносили образцы осадка мочи или лейкоцитарной фракции крови и проводили совместное центрифугирование клеток ФЛЭЧ с клиническими образцами в течение 35 мин. при 2 500 об./мин. Фибробласты инкубировали в течение 24 часов, затем фиксировали охлажденным метанолом (-20" С) в течение 20 мин. Детекцию ЦМВ-инфицированных клеток проводили с помощью антител к 1Ер72 и рр65 ЦМВ. Выявляющими антителами служили антимыпшные антитела, коньюгироваиные пероксидазой хрена (DAKO, Швеция). Результаты выявления ЦМВ с помощью БКМ выражали в количестве окрашенных клеток на 2,5xlOJ клеток ФЛЭЧ.

Твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА). Определение антител классов М и G (ЦМВ) в крови проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА), используя коммерческие наборы. Для выявления IgM использовали три

тест-системы: «ВектоЦМВ-IgM -стрип» (Вектор-Бест, Россия); «CYTOMEGALOVIRUS HUMAN-ELISA-IgM-Antibody-Test» (HUMAN, Германия) и «Enzygnost Anti-CMV/IgM» (Behringer, Германия). Для определения IgG применяли четыре тест-системы: «ЦМВ-скрин» (Биосервис, Россия); «ВектоЦМВ-IgG -стрип» (Вектор-Бест, Россия); «CYTOMEGALOVIRUS HUMAN-ELISA-IgG-Antibody-Test» (HUMAN, Германия); «Enzygnost Anti-CMV/IgG» (Behringer, Германия). Анализ и интерпретацию результатов осуществляли в соответствии с инструкциями фирм.

Иммуноблот. Спектр анти-ЦМВ IgM и IgG определяли в реакции иммуноблота, используя коммерческую тест-систему фирмы "Enclit" (Германия) согласно инструкции фирмы-производителя.

Авидностъ антител. Индекс авидности (ИА) специфических IgG определяли с помощью тест-системы «Для выявления низкоавидных иммуноглобулинов G к цитомегаловирусу» фирмы «Биосервис» (Россия), а также трех наборов для обнаружения анти-ЦМВ IgG (1 -«ВектоЦМВ-IgG -стрип», 2-«CYTOMEGALYOVIRUS HUMAN-ELISA-IgG-Antibody-Test» и 3-«Enzygnost Anti-CMV/IgG»). Оценку результатов осуществляли согласно рекомендациям фирм производителей.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ДНК ЦМВ в количественном варианте выявляли с помощью сертифицированных коммерческих наборов Медицинского центра "Авиценна" (Москва, Россия), в качественном варианте - с помощью коммерческих наборов ООО НПФ "Литех" и ООО НПФ "ГЕНтех".

Определение мРНК генов Вс1-2 и Fas-Ag полуколичественным методом ОТ-ПЦР. Выделение РНК из фибробластов проводили методом гуанидин-тиоционат-фенол-хлороформ (Chomczynski, Sacchi, 1987). Реакцию обратной транскрипции (ОТ) проводили ва суммарном препарате РНК с универсальными праймерами Вс1-2 и Fas Ag (Соколова, 2005). Для ПЦР использовали аликвоты полученных кДНК вместе со специфическими праймерами, рассчитанными по известной первичной структуре Вс1-2 и Fas- Ag (Соколова, 2005). ДНК-амплификаты анализировали электрофорезом в агарозных гелях по окраске бромистым этидием. Данные исследования были проведены в лаб. энзимологии, института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, д.б.н., вед. и. с. Соколовой Т.М..

Статистическая обработка результатов. Подсчет средних значений и стандартных ошибок проводили с использованием компьютерной программы "BOISTAT" (Мс Graw-Hill, Inc.1993). Достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента. Различия считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Выявление маркеров ЦМВ у недоношенных я маловесных новорожденны! детей с использованием количественных вариантов БКМ, ПЦР н методов серодиагностики.

В ходе выполнения работы было проведено комплексное исследование маркеров ЦМВИ у 31 недоношенных и маловесных новорожденных с клиническими симптомами перинатального инфицирования. Масса детей при этом составляла в среднем 1515+189 г, гестационный возраст - 31+4 недели.

Для определения инфекционно активного ЦМВ и вирусной ДНК использовали количественные варианты БКМ и ПЦР, соответственно.

С помощью двух методов на первой неделе жизни у 25 детей из 31 новорожденных был выявлен ЦМВ в образцах крови и мочи, что составило 81% (табл. №1). При этом у 8 детей было обнаружено более 100 АГ-положительных клеток на 2x10^ кл. с помощью БКМ и более 2000 копий вирусной ДНК в 1 мл методом ПЦР. У 17 детей количество вирусной ДНК не превышало 1000 копий/мл и 3-х АГ-положительных клеток. Обнаружение ЦМВ лабораторными методами у ребенка на первой недели жизни свидетельствует о внутриутробной передаче вируса от матери к ребенку (ЛеуеНо, 2002). Таким образом, можно утверждать, что у 81% недоношенных и маловесных новорожденных с клиническими симптомами перинатального инфицирования была выявлена внутриутробная ЦМВИ.

Таблица №1. Выявление прямых маркеров ЦМВИ у недоношенных и маловесных

новорожденных.

1-я неделя 2-я неделя

Выявление ЦМВ БКМ и/или ПЦР 81% (25/31) 90% (28/31)

>100 АГ-ПОЛ.КЛ. и >2000 копий/мл 26% (8/31) 23% (7/31)

1-3 АГ-пол-кл. и <1000 копий/мл 55% (17/31) 68% (21/31)

Отрицательные результаты БКМ и ПЦР 19% (6/31) 10% (3/31)

При повторном обследовании у большинства детей, вирус сохранялся в течение всего периода обследования (табл. №1). У 3-х детей, у которых в первую неделю жизни не был обнаружен ЦМВ, при повторном анализе результаты методов ПЦР и БКМ были положительные. Возможно, это связано с отсроченным проявлением внутриутробной бессимптомной ЦМВИ, которое отмечалось рядом авторов. (Barbi, 2003; Malinger, 2003). Не исключено также, что инфицирование этих детей произошло уже в

неонаташьном периоде- Таким образом, для достоверной диагностики ЦМВИ у новорожденных необходимо неоднократное обследование. Совокупность полученных данных показала, что у 28 из 31 детей определялись прямые маркеры ЦМВ, что составило 90%.

Сравнительный анализ выявления ЦМВ с помощью количественных вариантов БКМ и ПЦР позволили установить, что при исследовании образцов крови и мочи, несовпадение результатов двух методов составило 44,9% и 52%, соответственно. БКМ обнаруживал чаще ЦМВ, чем ПЦР, как в образцах крови (35 против 23 положительных образцов), так я в образцах мочи (30 против 10 положительных образцов). Полученные результаты позволяют утверждать, что БКМ является более чувствительным методом для диагностики ЦМВИ.

Для изучения состояния специфического гуморального иммунитета новорожденных детей были использованы серологические методы диагностики: тИФА, определение индекса авидности специфических АТ (ИА), иммуноблотинг (ИБ). Полученные данные представлены в таблице №2.

Таблица №2 Обследование недоношенных н маловесных новорожденных детей с

помощью серологических методов исследования.

БКМ и/или ПЦР

>100 АГ-пол-кл. и >2000 копий/мл 1-3 АГ-пол.кл. и <1000 копий/мл Отрицательные результаты.

Анти-ЦМВ ^ АТ 12% (1/8) 0% (0/20) 0% (0/3)

Анти-ЦМВ ДО АТ 100% (8/8) 100% (20/20) 100% (3/3)

ИБсДО, количество выявленных полос 4-8 пол. 29% (2/7) 28% (5/18) 50% (1/2)

10-27 пол 71% (5/7) 72% (13/18) 50% (1/2)

Индекс авидности (ИА) <0,6 37% (3/8) 17% (3/17) 0% (0/2)

>0,6 63% (5/8) 83% (14/17) 100% (0/2)

АТ класса в высоких титрах были обнаружены у всех обследованных детей (табл. №2).

АТ класса IgM были обнаружены только у одного новорожденного, что свидетельствовало об остром течении ЦМВИ у этого ребенка. Невысокая частота выявления анти-ЦМВ класса М у новорожденных также отмечается другими авторами (Оошюг, 1993; Иекюп, 1997).

Таким образом, можно утверждать, что данные определения анти-ЦМВ АТ не позволяют судить об активности течения ЦМВИ у недоношенных детей.

С помощью реакции ИБ было показано, что у большинства детей (70%) определяется широкий спектр анти-ЦМВ АТ которые реагировали с 10-27

вирусными белками с М м от 14 кДа до 200 кДа (рис. 1а). В сыворотках остальных 8-ми детей из 31 (30%) были обнаружены АТ, взаимодействующие с 4-8 белками М.м. 28-160 кДа(рис.1б).

_ 212

— 170

— 116

Рис 1. Взаимодействие антител яз сывороток детей с белками ЦМВ. а,б) «нта-ЦМВ антитела класса С; в) отрицательный контроль (антитела к ЦМВ в сыворотке отсутствуют); г) положительный контроль. Цифры справа - маркеры М.м. (кДа), "ЕвсШ" (Германия).

При сравнительном анализе данных ИБ с результатами БКМ и ПЦР было показано, что как при узком, так и широком спектре анти-ЦМВ у большей части детей были выявлены небольшие количества копий ДНК и низкая инфекционная активность вируса.

Из полученных результатов можно заключить, что данные ИБ не позволяют однозначно судить о вирусной нагрузке и активности инфекционного процесса у недоношенных новорожденных детей.

При сравнении ИА АТ класса и количественных показателей результатов БКМ и ПЦР было установлено, что в сыворотках детей, у которых отсутствовали или были выявлены небольшие количества копий ДНК и низкая инфекционная активность вируса, содержались высокоавидные анти-ЦМВ ДО (у 100% и 83% детей, соответственно).

Полученные данные указывают, что высокая авидность анти-ЦМВ коррелирует с низкой вирусной нагрузкой и слабой инфекционной активностью ЦМВ. Таким образом, можно предположит, что высокоавидные материнские АТ защищают в первую неделю жизни большую часть новорожденных от развития ЦМВИ.

Выявление маркеров ЦМВИ у детей раннего возраста.

Как было показано ранее, серологические методы не всегда позволяют адекватно оценивать состояние иммунной системы новорожденных детей с ЦМВИ. В связи с этим большой интерес представлял оценить эффективность методов серодиагностики при ЦМВИ у детей раннего возраста, у которых, как известно, идет процесс замещения материнских АТ собственными, а также провести сравнительный анализ информативности выявления прямых маркеров ЦМВ методами БКМ и ПЦР.

С этой целью было обследовано 33 ребенка в возрасте от одного месяца до одного года (в среднем от 4-х до 7-и месяцев), которые были разделены на две группы: на детей имеющих клинические признаки ЦМВИ (п=20) и на детей неспецифической клинической симптоматикой (п=13).

С помощью тИФА анти-ЦМВ АТ класса IgM были обнаружены в сыворотках 50% (9 из 18 обследованных) детей с клиническими признаками (табл. №3). У 1-го ребенка из них были выявлены только АТ класса М, что свидетельствует об острой первичной ЦМВИ. У 8 детей наряду с IgM, также выявлялись анти-ЦМВ ДО, что может свидетельствовать как об острой первичной инфекции, так и о процессе реактивации недавно перенесенной ЦМВИ у этих детей (Коченгина, 2000). АТ класса ДО были обнаружены у 18 из 19 обследованных детей из группы с клиническими признаками, что составило 94%.

У детей без специфических клинических симптомов, сыворотки которых были изучены на присутствие анти-ЦМВ АТ, отсутствовали АТ класса 1дМ. У 7 (54%) детей были определены специфические ДО в высоких -Петрах (табл. №3).

Полученные результаты позволяют утверждать, что у детей раннего возраста данные определения анти-ЦМВ 1дМ и 1вО, достоверно коррелируют с проявлением клинических симптомов.

Определение ИА анти-ЦМВ ДО показало, что у детей без клинических симптомов АТ с низкой авидностью не были обнаружены (табл. №3), в то время как у 20% детей с клиническими признаками выявлялись низкоавидные АТ.

С помощью ИБ было показано, что в сыворотках большинства детей с клиническими симптомами (77,8%; 14 из 18 обследованных), присутствуют АТ класса 1(50, взаимодействующие с 1-3 белками ЦМВ. Согласно существующим данным обнаружение у ребенка узкого спектра анти-ЦМВ к 1-3 белкам свидетельствует о недавнем инфицировании ЦМВ. При этом у 85% детей без клинических симптомов определялся широкий спектр АТ, которые взаимодействовали с 4-мя и более вирусными белками. Таким образом, данные определения ИБ достоверно коррелировали с проявлением клинических симптомов. На основании полученных результатов можно заключить что, ИА в совокупности с данными ИБ позволяет определить у детей раннего возраста продолжительность инфицирования, дифференцировать первичную инфекцию от реактивации и характеризовать компетентность специфического иммунного ответа.

Таблица №3. Проявление маркеров ЦМВИ у детей раннего возраста с подозрением

наЦМВИ

Дети с клиническими признаками (п-20) Дети без клинических признаков (п=13)

Анти-ЦМВ AT IgM 50% * (9/18) 0%* (0/13)

Анти-ЦМВ AT IgG 94%* (18/19) 54% * (7/13)

ИБсДО количество выявленных полос 1-3 полосы 77,8%» (14/18) 14,2%* (1/7)

4 и более полос 22,2%* (4/18) 85,3%* (6/7)

Индекс авидности (ИА) <0,6 20% (3/15) 0% (0/7)

>0,6 80% (12/15) 100% (7/7)

БКМ и/или ПЦР 65,0%« (13/20) 23,1%* (3/13)

*- Статистически достоверные различия (р<0,05)

Для выявления прямых маркеров ЦМВ у детей раннего возраста были использованы методы ПЦР и БКМ. С помощью БКМ и/или ПЦР был выявлен ЦМВ у 65% детей из группы с клиническими признаками. У всех детей, у которых обнаружили тот или иной вирусный маркер, были обнаружены или АТ класса 1£М или узкий был выявлен узкий спектр АТ класса ДО (к 1-3 белкам).

У детей без клинических симптомов прямые маркеры ЦМВИ были выявлены только у 3 детей, что составило 23%. Следует отметить, что у всех детей этой группы инфекционно активный вирус в крови не был обнаружен.

Таким образом, положительные результаты БКМ и/или ПЦР, у детей раннего возраста достоверно коррелируют с проявлением клинических симптомов.

Суммируя полученные результаты выявления маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста можно сделать ряд выводов:

1. У недоношенных новорожденных не выявлено прямой корреляции между спектром AT и обнаружением прямых маркеров ЦМВ, в то время как у детей раннего возраста определение узкого спектра AT коррелирует с обнаружением прямых маркеров ЦМВ.

2. Высокая авидность AT коррелирует с низкой вирусной нагрузкой и слабой инфекционной активностью ЦМВ.

3. Для достижения эффективности выявления ЦМВИ у новорожденных и детей раннего возраста необходимо комплексное обследование, включающее как минимум два метода БКМ и ПЦР.

Сравнение эффективности выявления ЦМВ в клинических образцах методом ПЦР и БКМ. В ходе данной работы обратило на себя внимание расхождение полученных результатов БКМ и ПЦР при выявлении ЦМВИ. Для уточнения расхождения результатов, был проведен сравнительный анализ одних и тех же клинических образцов от новорожденных детей методами БКМ и ПЦР в 3-х независимых ПЦР-лаборагориях. Сравнение данных БКМ и ПЦР, обнаружило, что совпадение результатов двух ПЦР-лабораторий с БКМ составляло 88% и 87%, а с третьей лабораторией - 72%.

Так же был проведен сравнительный анализ выявления ДНК ЦМВ в двух ПЦР-лаборагориях. Результаты совпали для 51 образца из 64 изученных образцов (80%), при этом было показано, что совпадение отмечалось только при отрицательных результатах.

Полученные данные подтверждаются многочисленными литературными источниками в которых показано, что результаты ПЦР выполненные в разных лабораториях часто не совпадают (Caliendo А.М., 2003; Kaiser 1, 2002; Tarrago D., 2004). Вероятно, это объясняется различной чувствительностью тест-систем ПЦР, используемых в лабораториях, которая зависит от применяемых праймеров, количества циклов амплификации ДНК. Исходя из полученных данных очевидно необходимость введения методов стандартизирующие тест-системы, используемые в клинических лабораториях.

Сравнительный анализ коммерческих тест-систем, выявляющих анти-ЦМВ антитела класса IgG и IgM. Для определения антивирусного гуморального иммунного ответа важной задачей является выбор тест-систем, сочетающих высокую чувствительность и специфичность. В связи с этим представляло интерес сравнить результаты выявления анти-ЦМВ антител классов IgM и IgG в сыворотках от матерей и новорожденных. Для выявления IgM использовали три тест-системы: «ВектоЦМВ-IgM -стрип» (Вектор-Бест, Россия); «CYTOMEGALOVIRUS HUMAN-ELISA-IgM-Antibody-Test» (HUMAN, Германия) и «Enzygnost Anti-CMV/IgM» (Behrmger, Германия). Для определения IgG применяли четыре тест-системы: «ЦМВ-скрин» (Биосервис, Россия); «ВектоЦМВ-IgG -стрип» (Вегтор-Бест, Россия); «CYTOMEGALOVIRUS HUMAN-

ELISA-IgG-Antibody-Test» (HUMAN, Германия); «Enzygnost Anti-CMV/IgG» (Behringer, Германия).

Было показано, что наиболее эффективное выявление анти-ЦМВ AT классов IgM, и IgG обеспечивают тест-системы фирмы «Enzygnost Anti-CMV/IgG» (Behring). При определении анти-ЦМВ IgG, не уступает им по чувствительности и специфичности тест-система фирмы «ВЕКТОР-БЕСТ» («ВектоЦМВ-ДО-члрип» (Россия). Наибольшую специфичность при выявлении низкоавидных антител продемонстрировали немецкие тест-системы «CYTOMEGALOVIRUS HUMAN-ELISA-IgG-Antibody-Test» и «Enzygnost Anti-CMV/IgG».

Активная ЦМВИ часто приводит к серьезным патологиям у детей. Изучение механизмов гибели ЦМВ-инфицированных клеток может прояснить причины нарушений в развитии плода, и различных патологий у новорожденных и детей раннего возраста. В связи с этим вторая часть нашей работы была посвящена изучению влияния ЦМВ на гибель клеток.

Развитие питопатогеиного действия ЦМВ в клетках, инфицированных в состояния покоя или в активной пролиферации. В первой серии экспериментов было проанализировано продолжительность и характер течения ЦМВИ в трех популяциях клеток ФЛЭЧ, различающихся как по пролиферативной активности в момент заражения, ■ж и по воздействию факторов роста на клетки после инфицирования. Фибробласты первой популяции в момент заражения находились вне клеточного цикла, в состоянии покоя (Go), и после проникновения вируса в культуру вносили 15% ЭТС. Вторая группа клеток также находилась в стадии Go при инфицировании, но после заражения не проводили стимуляцию сывороточными ростовыми факторами. В третьей культуре в момент заражения не менее 30% клеток находились в стадии синтеза ДНК (S-период клеточного цикла). Гибель клеток определяли клеток в поле зрения (60x10).

Сравнительный анализ показал, что вирусное ЦПД наиболее эффективно развивается в клетках, зараженных в стадии GO с последующей стимуляцией сывороточными ростовыми факторами. В этой же культуре гибель клеток, которую оценивали по количеству жизнеспособных, прикрепленных к субстрату фибробласгов, была зарегистрирована раньше (на 5-е сутки после заражения), чем в других инфицированных популяциях (рис. 2). В клетках, инфицированных в состоянии покоя, но без последующей стимуляции к делению, гибель всех фибробласгов наблюдалась на 7-е сутки инфекции, а в популяции, клетки которой находились в момент заражения в S-фазе, - только на 10 сутки.

[

Рис. 2. Изменение количества жизнеспособных фиброблястов в популяциях, инфицированных ЦМВ в различных фазах клеточного цикла.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют, что развитие ЦПД и гибель клеток зависят от стадии клеточного цикла в момент заражения и от наличия стимуляторов роста.

Экспрессия вирусных белков в клетках ФЛЭЧ, инфицированных в <50 и в-фязе клеточного цикля. Мы предположили, что зарегистрированные различия в эффективности развития ЦПД и сроках гибели клеток связаны с разной степенью экспрессии вирусных белков в исследуемых культурах. Для проверки этого предположения выявляли наличие сверхраннего (Ш1-р72), раннего (рр65) и позднего (¿В) вирусных белков в фибробластах инфицированных на различных стадиях клеточного цикла.

Сверхранние, ранние и поздние белки наиболее эффективно экспрессировались в фибробластах, инфицированных в покое с последующей стимуляцией ростовыми факторами. Через 24 часа после заражения более 90% клеток инфицированных в состоянии покоя с последующей стимуляцией 15% ЭТС, содержали сверхранние вирусные белки (1Е-р72 и рр65) и 48% клеток содержали поздний вирусный белок gB. В клетках ФЛЭЧ, находящихся в момент заражения в (50 и не стимулированные ростовыми факторами, динамика накопления Ш-р72 и рр65 не отличались от таковой в предыдущей культуре. Однако задерживался синтез гликопротеина gB содержание которого на 24 часа было в 2 раза ниже, чем в первой популяции и не превышало 20%. Наименее эффективный синтез вирусных белков наблюдался в фибробластах, инфицированных в

стадии синтеза ДНК. В этой популяции клеток, содержание белков 1Е-р72, ррб5 и gB, через 24 часа после проникновения вируса составляло 52%, 23% и 7%, соответственно.

Полученные данные свидетельствуют, что степень проявления патологического действия ЦМВ на клетки находится в зависимости от динамики накопления вновь синтезированных вирусных белков. Существенные различия в сроках синтеза вирусных белков в пролиферирующих клетках можно объяснить несовместимостью репликации клеточной ДНК и синтеза сверхранних белков ЦМВ, как было установлено Fortunato Е.А. с соавторами (Fortunato, 2002). Авторами были получены данные, свидетельствующие о том, что инициация репликации клеточной ДНК предотвращает экспрессию сверхранних генов ЦМВ. В свою очередь, отсроченный синтез Ш белков, необходимый для начала регогакативиого цикла вируса, влечет за собой выявленное отставание экспрессии ранних и поздних вирусных белков в фибробластах, инфицированных в стадии синтеза ДНК.

Определение целостности цитоплязматической мембраны инфицированных фибробластов. Патологическое действие ЦМВ на клетки сопровождается деструктивными изменениями в клетках с последующей гибелью. Известно два варианта гибели клеток - путем апоптоза и некроза. Определение целостности мембран клетки является одним из наиболее простых и доступных методов, позволяющих дифференцировать апоптоз и некроз.

Использование метода прижизненного окрашивания пропидием йодистым показало, что независимо от пролиферативной активности во всех трех популяциях, инфицированных ЦВМ, не нарушается целостность цитоплазматических мембран на протяжении всего периода исследования. Даже в терминальной стадии инфекции, не более 12% клеток окрашивались прижизненным красителем. Изучение морфологии открепившихся фибробластов обнаружило апоптозные тельца, представляющие собой продукты фрагментации клеток на мембранные везикулы с внутриклеточным содержимым.

Таким образом, анализ целостности мембран инфицированных фибробластов позволяет заключить, что под действием ЦВМ клетки погибают путем апоптоза и патологическое действие вируса зависит от пролиферативного состояния клеток в момент заражения.

Гибель ЦВМ-инфицированных клеток может реализовываться через различные механизмы регуляции клеточных белков и может являться результатом как подавления экспрессии аитиапоптозных белков, так и индукцией функциональной активности проапоптозных белков. В связи с этим представляло интерес изучить экспрессию ряда проалоптозных и аитиапоптозных клеточных генов и белков, выявить характерные маркеры программированной клеточной гибели в динамике инфекционного процесса в

ЦМВ-инфицированных фибробластов человека, находящихся в момент заражения в различных физиологических состояниях.

Транскрипционная активность гена, кодирующего рецептор Fas. Один из путей программированной клеточной гибели реализуется через взаимодействие физиологических индукторов с клеточными рецепторами, предназначенными для включения программы апоптоза, к которым относится рецептор Fas. Для того чтобы охарактеризовать изменение транскрипционной активности гена Fas определяли уровень мРНК полуколичественным вариантом ОТ-ПЦР. Было показано, что через 48 часов после заражения в фибробластах, инфицированных в состоянии покоя с последующей стимуляцией ростовыми факторами, уровень транскрипции мРНК fas снижалось примерно в 10 раз. В то время как, в клетках, инфицированных в S-периоде, наблюдалось увеличение активности гена fas по сравнению контрольной, незараженной культурой (рис.

3).

По литературным данным известно, что ЦМВ влияет на внутриклеточный уровень белка р53, активация которого приводит к увеличению экспрессии гена fas (Hickman, 2002). Возможно, что в фибробластах, инфицированных в покое, эффективное накопление вирусных белков способно нейтрализовать р53-зависимую активацию гена fas. В клетках, инфицированных в S-фазе, синтез вирусных белков менее эффективен и, вероятно, на момент исследования содержание вирусных белков не достаточно для ингибирования активности белка р53.

К- ЦМВ К- ЦМВ м

ШШШ юоо

532 щщт-ФШ-»

Рнс. 3 Экспрессия мРНК Рая^ в клетках ФЛЭЧ, зараженных ЦМВ в состоянии покоя (<Зо) и синтеза ДНК (в)

К- - контрольные клетки, без заражения; ЦМВ - инфицированные клетки, 48ч. после заражения; М • Маркер ДНК 100-1900 н.п. а - ФЛЭЧ, находящиеся в момент заражения в в-фазе; б - ФЛЭЧ, негодящиеся в момент заражения в фазе Со.

500 200

Влияние ЦМВ на экспрессию антиапоптозного белка Вс1-2 и на транскрипционную активность гена, кодирующего белок Вс1-2. Другой путь реализации апоптоза в клетках, инфицированных вирусом, связан с повреждением митохондриальиых мембран клетки. Этот процесс регулируется белками семейства Bei. Трансмембранный белок Вс1-2 относится к этому семейству, является антиапоптозным белком и играет ключевую роль в ингибировании митохоидриального пути развитии апоптоза (Goldmacher, 1999). Имеются немногочисленные данные о влиянии ЦМВИ на экспрессию Вс1-2, и до настоящего времени не была исследована экспрессия Вс1-2 в диплоидных фибробластах человека.

В связи с этим представляло интерес определить влияние ЦМВ на экспрессию антиапоптозного белка Вс1-2 в фибробластах, инфицированных в различных пролиферативных состояниях. Определение белка Вс1-2 с помощью иммуноцитохимического окрашивания показало, что заражение ЦМВ индуцирует синтез антиапоптозного белка в клетках ФЛЭЧ. Наиболее эффективно накопление белка Вс1-2 происходило в клетках, инфицированных в состоянии G0 с последующей стимуляцией ростовыми факторами (рис. 4). В этой культуре уже через 12 часов после заражения около 90% клеток содержали Вс1-2. В культурах, зараженных в стадиях G0 без последующей стимуляция и в S-периоде, накопление Вс1-2 протекало медленнее. Однако почти все клетки в этих популяциях были окрашены МКА на 3-е и на 5-е сутки после адсорбции вируса, соответственно. В не инфицированных фибробластах окраска МКА к Вс1-2 не наблюдалась.

1/8 1/4 1/2 1 2 3 4 5 7 9

Ярам прел* ааражамия, ву,

а Китай ФЛЭЧ, инЦкциромнные • фааа во с посладущай стимуляцией ростовыми фнпорамй

а Клетки ФЛЭЧ, инфицфоаншма * фам Оо Ом стимуляции роспммм факторами □ Платки ФЛЭЧ. инфицирсмним» ■ фа»а 8

Рис. 4. Экспрессия белка Вс1-2 в ЦМВ-ннфицированных фибробластах, находящиеся в момент заражения в различных пролиферативных состояниях.

Определение мРНК Ьс1-2 с помощью полуколичественного варианта метода ОТ-ПЦР через 6-48 часов после заражения показало, что в ЦМВ-инфицироваиных

фибробтастах экспрессия белка Вс1-2 нарастало параллельно изменению транскрипционной активности гена Ьс1-2 Так, в культуре, инфицированной в состоянии покоя с последующей стимуляцией 15% сывороткой, максимальное количество кДНК выявлялось, начиная с 12 часов после заражения (рис. 5). В этот же период в культуре было обнаружено 88% клеток, содержащих белок Вс1-2 (рис.4). В культуре, инфицированной в фазе Б, обнаружение первых клеток окрашенных МКА к Вс1-2 наблюдалось на 48 часов и сопровождалось стимуляцией транскрипционной активности гена относительно контроля

Таким образом, под действием ЦМВ в фибробластах человека индуцируется транскрипция и трансляция гена Ьс!-2 Наибольший стимулирующий эффект проявляется в клетках, инфицированных в состоянии покоя с постед>ющей стимуляцией сывороточными ростовыми факторами Динамика экспрессии клеточного белка зависит от физиологического состояния клеток в момент заражения и коррелирует с развитием ЦПД вируса.

а б

Рис. 5. Изменение уровня экспрессии мРНК Ьс1-2 в клетках ФЛЭЧ, зараженных ЦМВ в состоянии покоя (Со) и синтеза ДНК (8).

1 - мРНК Ьс!-2 до заражения ЦМВ; 2 - контрольные клетки, 6ч; 3 - инфицированные клетки, 6ч. после заражения; 4 - контрольные клетки, 12ч; $ - инфицированные клетки, 12ч. после заражения; 6 - контрольные клетки, 48ч; 7 - инфицированные клетки, 48ч. после заражения; М-Маркер ДНК 100-1000 н.п.; а - ФЛЭЧ, находящиеся в момент заражения в 5-фазе; б - ФЛЭЧ, находящиеся в момент заражения в фазе Со.

Выявление цитоплазматического цитохрома С в зараженных клетках.

Программированная гибель клеток может сопровождаться нарушением целостности митохондриалышх мембран, в результате которого в цитоплазму клеток высвобождаются растворимые белки межмембранного пространства. К ним относится цитохром С, который является одним из апоптогенных факторов. Представляло интерес исследовать наличие цитохрома С в цитоплазме ЦМВ-инфицированиых фибробластов. Иммуноцитохимическими методами было показано, что под действием ЦМВ в инфицированных культурах наблюдается увеличение количества клеток с цитоплазматической локализацией цитохрома С. Во всех трех культурах количество клеток с цитоплазматической локализацией цитохрома С возрастало в процессе развития ЦМВИ. В двух популяциях, инфицированных в состоянии <50, почти все фибробласты содержали цитохром С в цитоплазме на 3-е сутки после проникновения вируса (рис. б). В клетках, находящихся в момент инфицирования в в-периоде, этот показатель был достигнут через 8 суток после заражения.

100

4 5 7 9 Время поел* заражения, сут

■ Клетки ФЛЭЧ, инфицированные ■ фазе Оо с последующ«* стимуляцией ростовыми факторами

в Клетки ФЛЭЧ, инфицированные в фазе во без стимуляции ростоаыми факторами □ Клетки ФЛЭЧ, иифщироваииые в фазе в

Рис 6. Освобождение цитохрома С из митохондрий в цитоплазму клеток ФЛЭЧ, инфицированных в различных пролнферативных состояниях.

Таким образом полученные результаты показали, что заражение ЦМВ клеток ФЛЭЧ приводит к освобождению цитохрома С из межмембраниого объема митохондрий в цитоплазму. Развитие ЦПД вируса сопровождается увеличением количества клеток с цитоплазматической локализацией этого проапоптозного фактора.

Выявление каспазы-3 в инфицированных фнбробластах. Высвобождение цитохрома С в цитоплазму запускает каскад протеолитической активации эффекторных

каспаз, в том числе каспазы-3. В связи с этим в дальнейших экспериментах было исследовано влияние ЦМВИ на активацию каспазы-3. С помощью иммуноцитохимического метода было показано, что в фиброб ластах инфицированных в фазе (Зо на 2-е сутки более 90% клеток содержали активированную каспазу-3, в фиброб ластах инфицированных в фазе в только на 7-е сутки 90% клеток содержали окраску (рис. 7).

Таким образом, под действием ЦМВ в зараженных фибробластах происходит протеолитическая активация каспазы-3. Динамика появления каспазы-3 коррелирует с динамикой высвобождения цитохрома С в цитоплазму.

4 5 7 9

с Время посла заражения, сут

■ Клетки ФЛЭЧ, инфицированные в фазе (Зо с последующей стимуляцией ростовыми факторами.

а Клетки ФЛЭЧ, инфицированные в фазе Со без стимуляции ростовыми факторами □ Клетки ФЛЭЧ, инфицированные в фазе в.

Рис. 7. Активация каспазы-3 в клетках ФЛЭЧ, инфицированных в различных нролнфератнвных состояниях.

Выявление межнуклеосомной фрагментации ДНК. Каспаза-3 вызывает активацию каспаз-зависимой ДНК-азы, которая разрезает хроматин на нуклеосомные фрагменты (Liu, 1997). Кроме того, повреждение митохондриальных мембран высвобождает эндонукпеазу G, также участвующую в фрагментации ДНК (Liu, 2001). Результаты, свидетельствующие о том, что в ЦМВ-инфицированных клетках нарушается целостность митохондриальных мембран и активируется каспаза-3, позволили предположить, что под действием вируса происходит межнуклеосомная фрагментация клеточной ДНК. Для проверки этого предположения клетки от трех вариантов ЦМВ-инфицированных культур были окрашены с помощью модифицированного метода TUNEL. В качестве контрольной культуры были использованы фиброб ласты, обработанные индукторами апоптоза, фактором некроза опухоли (ФНО) в концентрации 50 нг/мл совместно с циклогексимидом (ЦГМ) 30 мкг/мл. Известно, что эти вещества

вызывают фрагментацию клеточной ДНК (Goldmacher, 1999). Полученные результаты показали, что на протяжении всего инфекционного периода в ЦМВ-инфицированных фибробластах количество клеток с фрагмевгтированной ДНК не превышало 1-2% при изучении трех исследуемых культур. В то время как в фибробластах, обработанных ФНО и ЦГМ, уже через 24 часа после воздействия доля окрашенных клеток составила 23% от общего числа клеток в популяции.

Полученные данные свидетельствуют о том что, в ЦМВ-инфицированных фибробластах не происходит межнуклеосомной фрагментации клеточной ДНК. В тоже время известно, что ЦМВ обладает выраженным цитотоксическим эффектом. Вероятно, при ЦМВИ повреждение хроматина обусловлено не межнуклеосомными разрывами активированных клеточных нуклеаз, а связано с участием дополнительных факторов, действие которых направлено на другие мишени.

Влияние ЦМВИ на структуру цнгоскелега. Программированная гибель клеток сопровождается разрушением белков цитоскелета, являющихся субстратом эффекторных каспаз, к которым относится каспаза-3 (Hengartner, 2000). Обнаружение активация каспазы-3 в зараженных фибробластах побудило к изучению влияния вируса на сеть микрофиламентов клеток.

С помощью иммуноцитохимичекого окрашивания с использованием фаллоидина было обнаружено, что в ЦМВ-инфицированных культурах происходит дезорганизация актиновых волокон. Об этом свидетельствовало появление диффузного окрашивания фаллоидина в фибробластах, инфицированных вирусом.

1/8 1/4 1/2 1 2 3 4 5 в 7 8 9

Время поел* заражения, сут ■ Клетки ФЛЭЧ, иифицироваиньи • фаз* Go с последующей стимуляцией ростовыми факторами.

в клетки ФЛЭЧ, инфицированные в фаза во баз стимуляции ростовыми факторами, пКлетки ФЛЭЧ, инфицированные в фаза S.

Рис. 8. Изменение количества клеток с диффузным характером окрашивания микрофиламентов.

Первые клетки с нарушением структуры микрофиламентов наблюдались уже через б часов в культуре, инфицированной ЦМВ в фазе ОО с последующей стимуляцией 15% ЭТС (рис. 8). Их доля от общего числа клеток составляла 4%. В популяции покоящихся фибробластов без стимуляции сывороткой единичные клетки (1%) с- диффузным окрашиванием были выявлены через 12 часов после заражения. При инфицировании клеток в в-цериоде фибробласты с измененной структурой микрофиламентов (27%) были зарегистрированы начиная, с 1 суток инфекции. В ходе вирусной инфекции доля клеток с диффузным характером окрашивания нарастала и достигала почти 100% к 2,3 и 5 суткам инфекции в трех инфицированных популяциях, соответственно. В контрольных клетках разрушение актиновых микрофиламентов не было обнаружено.

Таким образом, под действием ЦМВ разрушаются микрофибриллярные структуры клеточного цитоскелета. Динамика дезорганизации актиновых волокон совпадает с активацией эффекторной каспазы-3 в инфицированных фибробластах и коррелирует с изменением морфологии клеток.

Совокупность полученных данных позволяет заключить, что заражение ЦМВ запускает внутриклеточные механизмы апоптоза, параллельно с активацией антиапоптозных процессов для достижения полноценной репликации и продукции вируса. Скорость развития процессов апоптоза находится в зависимости от факторов, контролирующих пролиферативную активность инфицированной клетки. Наиболее выраженная активность большинства изученных про- и антиапоптозных белков Вс1-2, цитохрома С, каспазы-3 выявлена в клетках, инфицированных в состоянии покоя с последующей стимуляцией ростовыми факторами. В клетках, находящихся в момент заражения в фазе синтеза ДНК, вирус-индуцированные изменения задерживаются и проявляются значительно позднее.

ВЫВОДЫ

1. Выявление ЦМВ в клинических образцах от новорожденных и детей раннего возраста показало, что наиболее информативным и чувствительным является быстрый культуральный метод. Частота выявления инфекционной активности ЦМВ составила 68% и оказалась более выссжой, чем с помощью ПЦР (41%).

2. У недоношенных и маловесных новорожденных с клиническими симптомами перинатального инфицирования прямые маркеры ЦМВ выявляются значительно чаще, в 90% случаев.

3. Впервые установлено, что через 48 часов после заражения ЦМВ индуцирует транскрипционную активность гена /аз в клетках, инфицированных в состоянии

активной пролиферации. При заражении покоящихся клеток с последующей стимуляцией ростовыми факторами уровень мРНК гена fas снижается.

4. Впервые установлено, что в ЦМВ-инфицированных фибробластах повышается экспрессия мРНК антиапоптозного гена bcl-2 и белка Вс1-2. В клетках, инфицированных в состоянии пролиферативного покоя с последующей стимуляцией ростовыми факторами, повышенный уровень мРНК гена bcl-2 и белка Вс1-2 наблюдается через 6-12 часов, в то время как в клетках инфицированных в стадии синтеза ДНК, - через 48 часов.

5. Активация каспазы-3 и транслокация цитохрома С в большинстве ЦМВ-инфицированных фибробластов (90%) наблюдается на 3-е сутки при заражении клеток в состоянии покоя с последующей стимуляцией ростовыми факторами и на 7-е сутки при заражении клеток в фазе синтеза ДНК.

6. Заражение ЦМВ приводит к повреждению хроматина, при этом генотоксический эффект ЦМВ не связан с межнуклеосомными разрывами ДНК.

7. В ЦМВ-инфицированных фибробластах индукция процессов апоптоза зависит от пролиферативного состояния клеток в момент заражения. В фибробластах, инфицированных в состоянии пролиферативного покоя, программированная гибель клеток развивается достоверно быстрее, чем в делящихся клетках.

Список опубликованных работ по теме диссертация.

1. Федорова Н.Е., Меджидова A.A., Меджидова М.Г., Кущ A.A. / Блок клеточной пролиферации и патология митоза в клетках, инфицированных цитомегаловирусом: роль периода клеточного цикла в момент заражения. // ДАН, 2003,392, (4), 552-555.

2. Воронцова Ю.Н., Володин НЛ., Дегтярев Д.Н., Кущ A.A., Федорова Н.Е., Меджидова М.Г., Асади Мобархан А.Х., Асади Мобархан С.М., Ряполова И.В. / Особенности клинических проявлений врожденной цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных. // Российский вестник перинагояогии и педиатрии, 2004, том 49, №2, стр 60-66.

3. Алямовская Г.А., Кепшщян Е.С., Адуева С.М., Меджидова A.A., Федорова Н.Е., B.Pustowoit, Малахова М.В., Ильина E.H., Говорун В.М., Кущ A.A. / Выявление прямых маркеров цитомегаловируса и противовирусных антител у детей раннего возраста. // Вопросы вирусологии, 2005, №1, с.14-19.

4. Федорова Н.Е., Меджидова М.Г., Воронцова Ю.Н., Дегтярев Д.Н., B.Pustowoit, Асади Мобархан С.М., Саматова М.М., Кущ A.A., Володин H.H. / Количественные лабораторные методы для диагностики цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей. // Вопросы вирусологии, 2005, №1, Т.50, №1, с.9-14.

5. Меджидова М.Г., Адуева С.М., Федорова Н.Е., Климова P.P., Воронцова Ю.Н., Дегтярева М.В., ДегтяревД.Н., Володин RH., Алямовская Г.А., Кешищян Е.С., Малахова М.В., Ильина E.H., Говорун В.М., Земляная Н.Ю., Щербо С.В., Асадн Мобархан С.М., Асади Мобархан А.Х., Кущ A.A. / Выявление маркеров инфекций, вызванных вирусом простого герпеса и цитомегаловирусом, у новорожденных и детей раннего возраста. // ЖМЭИ, 2005, №1, с.14-19

Тезисы

6. Адуева С.М., Меджидова АЛ., Меджидова М.Г., Федорова Н.Е., Кущ A.A., Ильина E.H., Малахова М.В., Говорун В.М., Алямасольская Г.А., Кешищян Е.С., Воронцова Ю.Н., Солдатова ИТ., Дегтярева М.В. / Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции у детей раннего возраста. // Мат. научно-практического симпозиума "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении" в рамках Международной конференции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины", Москва, 20-21 июня, 2002, с. 249-251.

7. Н. Е. Федорова, А. А. Меджидова, М. Г. Меджидова, А. А. Кущ. / Нарушения клеточного цикла фибробластов человека, инфицированных цитомегаловирусом. // Цитология, 2003, том 45, №9, с 939-940.

8. Меджидова М. Г, Федорова Н. Е., Кущ А. А. / Повышение эффективности выявления инфекционно активного цитомегаловируса в клинических образцах. // Международный конгресс " Прогрессивные научные технологии для здоровья человека", Феодосия, 8-9 Июня 2003, с 102-104.

9. Меджидова М.Г., Федорова Н.Е., Воронцова Ю.Н., Асади Мобархан С.М., Саматова М.М., Дегтярева М.В., Дегтярев Д.Н., Кущ A.A. / Диагностика цитомегаловирусной инфекции у недоношенных детей. // Материалы VI Российского Съезда врачей-инфекционистов, 2003, с.221.

10. Абдуллаева М.В., Фролов А.Ф., Меджидова М.Г., Федорова Н.Е., Кущ A.A. / Выявление анти-ЦМВ антител и прямых маркеров цитомегаловируса у детей раннего возраста. // IV МЬкнародна конференщя "Бюресурси i eipycn", Ки1в, 2004, с. 45.

11. Меджидова М.Г., Адуева С.М., Федорова Н.Е., Воронцова Ю.Н., Дегтярева М.В., Дегтярев ДН., Земляная Н.Ю., Малахова М.В., Ильина E.H., Говорун В.М., Асади Мобархан С.М., Саматова М.М. / Выявление прямых маркеров цитомегаловируса человека у новорожденных недоношенных детей. // XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, 2004, С. 461.

№20 909

РНБ Русский фонд

2006-4 18493

Заказ №342. Объем 1 пл. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Меджидова, Марина Гудовна

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Цитомегаловирус человека: структура и репликация.

1.1. Структура и организация генома

1.2. Репликация цитомегаловируса

Глава 2. Методы лабораторной диагностики цитомегаловирусной инфекции.

2.1. Культуральные методы

2.2. Непосредственное определение вирусных антигенов в клинических образцах

2.3. Определение нуклеиновых кислот вируса

2.4. Серологические методы

Глава 3. Действие цитомегаловируса на программированную клеточную гибель.

3.1. Ингибирование апоптоза в ЦМВ инфицированных клетках.

3.2. Влияние вирусных белков на программированную клеточную гибель.

3.3. Анализ клеточных факторов, участвующих в апоптозе.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Основные реактивы и препараты, используемые в работе

Культура клеток и вирус

Определение инфекционной активности вируса

Синхронизация ФЛЭЧ

Иммуноцитохимический метод

Определение целостности цитоплазматической мембраны фибробластов 51 Выявление активированной каспазы-3 и фрагментированной ДНК

Пациенты

Исследуемый материал

Быстрый культуральный метод (БКМ)

Твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА)

Иммуноблот

Авидность антител

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 5. Выявление маркеров ЦМВ у новорожденных и детей раннего возраста.

5.1.Повышение чувствительности выявления инфеционно активного вируса с помощью БКМ.

5.2.Частота обнаружения маркеров ЦМВ у недоношенных и маловесных новорожденных детей с использование количественных вариантов БКМ, ПЦР и методов серодиагностики. JT^

5.3. Выявление маркеров ЦМВ у детей раннего возраста.

5.4. Сравнение эффективности выявления ЦМВ в клинических образцах методом ПЦР и БКМ.

5.5. Сравнительный анализ коммерческих тест-систем, выявляющих анти-ЦМВ антитела IgG и IgM.

Глава 6. Влияние ЦМВИ на гибель диплоидных фибробластов человека.

6.1. Динамика гибели фибробластов человека, инфицированных в различных фазах клеточного цикла.

6.2. Экспрессия мРНК генов Bcl-2, Fas и белка Вс1-2 в клетках, инфицированных ЦМВ в различных пролиферативных состояниях.

6.3. Активация каспазы-3 и транслокация цитохрома С в цитоплазму зараженных клеток.

6.4. Влияние ЦМВ на целостность цитоскелета клетки. 100 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 103 ВЫВОДЫ 136 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список использованных сокращений.

АГ- антиген AT - антитела

БКМ - быстрый культуральный метод

ИА - индекс авидности

ИБ - иммуноблот

ИФА - иммуноферментный анализ

МИ -множественность инфицирования

МКА - моноклональные антитела

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ФЛЭЧ - фибробласты легкого эмбриона человека

ЦМВ - цитомегаловирус человека

ЦМВИ - цитомегаловирусная инфекция

ЦПД - цитопатическое действие

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление маркеров цитомегаловируса у новорожденных и детей раннего возраста. Развитие апоптоза при цитомегаловирусной инфекции in vitro"

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) является одной из наиболее часто встречающих инфекций у новорожденных и детей раннего возраста, вызывающих тяжелые патологии, вплоть до гибели ребенка (15; 95). По данным отечественных и зарубежных специалистов от 0,5 до 5% детей появляются на свет с врожденной ЦМВИ, из них около 90% детей, являются асимптоматичными носителями (36; 95; 155).

В настоящее время активно изучается влияние ЦМВ на программированную клеточную гибель. Однако основное внимание большинства исследователей направлено на поиск и изучение индивидуальных вирусных белков, обладающих антиапоптозными свойствами (100; 202). В результате установлено, что белки ЦМВ (vICA, vMIA) ингибируют развитие апоптоза на нескольких уровнях (57; 100). Вместе с тем в ряде работ показано, что механизмы реализации апоптоза связаны с пролиферативной активностью клеток. Установлено, что в регуляции этих процессов участвуют одни и те же клеточные факторы (56; 64). В то же время, практически отсутствуют данные о реализации процессов апоптоза под влиянием ЦМВ в клетках, находящихся на различных стадиях клеточного цикла. В связи с этим изучение действия ЦМВ на программированную клеточную гибель в зависимости от пролиферативной активности клеток представляет важную задачу.

Цель исследования.

Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:

1. Выявить прямые маркеры ЦМВ у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста с подозрением на ЦМВИ.

2. Изучить спектр и индекс авидности противовирусных антител у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста.

4. Изучить динамику гибели ЦМВ-зараженных клеток, инфицированных в различных фазах клеточного цикла.

6. Проследить изменение экспрессии белка Bcl-2, активацию каспазы-3 и освобождение цитохрома С из митохондрий в цитоплазму в клетках, находящихся в момент заражения в различных фазах клеточного цикла.

7. Изучить действие ЦМВ на целостность цитоскелета и хроматина клетки.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Установлено, что при выявлении ЦМВ у новорожденных и детей раннего возраста, наиболее информативным и чувствительным является быстрый культуральный метод (БКМ).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Показана высокая частота выявления ЦМВ И у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста с подозрением на ЦМВИ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Меджидова, Марина Гудовна

Выводы

3. Впервые установлено, что через 48 часов после заражения ЦМВ индуцирует транскрипционную активность гена fas в клетках, инфицированных в состоянии активной пролиферации. При заражении покоящихся клеток с последующей стимуляцией ростовыми факторами уровень мРНК гена fas снижается.

4. Впервые установлено, что в ЦМВ-инфицированных фибробластах повышается экспрессия мРНК антиапоптозного гена bcl-2 и белка Вс1-2. В клетках, инфицированных в состоянии пролиферативного покоя с последующей стимуляцией ростовыми факторами, повышенный уровень мРНК гена bcl-2 и белка Bcl-2 наблюдается через 6-12 часов, в то время как в клетках инфицированных в стадии синтеза ДНК, - через 48 часов.

6. Заражение ЦМВ приводит к повреждению хроматина, при этом генотоксический эффект ЦМВ не связан с межнуклеосомальными разрывами ДНК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Меджидова, Марина Гудовна, Москва

1. Аракелов С.А., Сонькина А.А., Мартынова В.Н., Исаченко В.А., Стаханова

2. B.М Иммуноферментная тест-система для выявления антител к вирусу цитомегалии (ЦМВ) // В кн.: Герпесвирусные инфекции (диагностика и лечение). Под ред. Баринский И.Ф., Бикбулатова P.M., М, 1990, С.82-86.

3. Виноградская Г.Р., Новикова Л.Н., Башмакова М.А. Оптимизация ПЦР для обнаружения цитомегаловируса в моче новорожденных. //Вопросы вирусологии.-1994.-Т.4.- С. 171 -174.

4. Гришаев М.П. Цитомегаловирусная инфекция и ее лабораторная диагностика. // Новости Вектор-Бест.- 1996.- №1.

5. Кудашов Н.И., Помелова В.Г., Зубков В.В. Клинико-иммунологические критерии диагностики герпесвирусной инфекции новорожденных. // Российский вестник перинатологии и педиатрии,- 1998.- №5.- С. 12-18.

6. Каражас Н.В. Цитомегаловирусная инфекция типичный представитель оппортунистических инфекций. // Российские медицинские вести.- 1997.- №2.1. C.35-38.

7. Коровина Н., Заплатников А., Чебуркин А. и др. / Пособие для врачей. // Москва.-1999.- С.27-32.

8. Коровина Н.А., Заплатников A.JT., Чебуркин А.В. и др. Цитомегаловирусная инфекция у детей раннего возраста (Клиника, диагностика, современные возможности терапии). // Руководство для врачей.- М. Медпрактика-М. 2001.- С. 64.

9. Коченгина С.М., Теплова С.Н., Русанова Н.Н. и др. Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции у детей первых месяцев жизни. // ЖМЭИ.-2000.-№2.- С.116-118.

10. Ю.Меджидова А.А. Выявление белков цитомегаловируса в клетках и тканях плодов и умерших детей. Патологическое действие цитомегаловируса на клеточный цикл и структуры митотического аппарата. // Автореф. кан. биол. наук. -М. 2002.- С. 25.

11. П.Меджидова А.А., Нисевич JI.JI., Федорова Н.Е. и др. Сравнение эффективности лабораторных методов выявления цитомегаловируса в аутопсийном материале // ЖМЭИ. 2002. - Т.2. - С.63-69.

12. Самохин П.А. Цитомегаловирусная инфекция у детей. М. Медицина.- 1987.-С.160.

13. Пустовойт Б., Герман Ф., Макарова Н. и др. / Динамика иммунного ответа при первичной ЦМВИ и при реактивации цитомегаловируса у больных после аллотрансплантации органов. // Вопросы вирусологии.- 2001.- №3.-С.23-29.

14. Соколова Т.М., Бибикова О.В., Быстров Н.С. и др. Экспрессия генов системы интерферона и клеточного апоптоза в пробах крови человека. // Вопросы вирусологии.- 2005.- Т.50.- No 1.- С. 19-23.

15. Федорова Н.Е., Меджидова А.А., Меджидова М.Г., Кущ А.А. Блок клеточной пролиферации и патология митоза в клетках, инфицированных цитомегаловирусом: роль периода клеточного цикла в момент заражения. // ДАН.- 2003.- Т.392.- С.552-555.

16. Шабалдин А.В., Балянова JI.A., Казакова JI.M. и др. Применение полимеразной цепной реакции в диагностике внутриутробных инфекций у плодов и новорожденных. // Педиатрия.- 2000.- №3.- С. 38-41.

17. Шахгильдян В.И. Цитомегаловирусная инфекция. // Новый медицинский журнал.- 1997.- №2.- С. 2-6.

18. Шахгильдян В.И., Шипулина О.Ю., Каражас Н.В. и др. / Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов.// Эпидемиология и инфекционные болезни.- 2001.-№1.- С.36-39.

19. Шипулина О.Ю., Шахгильдян В.И., Шипулин Г.А., и др. Полимеразная цепная реакция в диагностике цитомегаловирусной инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов. // Вопросы вирусологии.- 1998.- №2.- С. 91-95.

20. Adair R, LiebischGW, Colberg-Poley AM. Complex alternative processing of human cytomegalovirus UL37 pre-mRNA. // J Gen Virol.- 2003.- V.84.- P.3353-3358.

21. Alcami, A., and U. H. Koszinowski. Viral mechanisms of immune evasion. // Trends Microbiol.- 2000.-V.8.- P.410-418.

22. Allart S, Martin H, Detraves C, et al. Human cytomegalovirus induces drug resistance and alteration of programmed cell death by accumulation of deltaN-p73 alpha. // J Biol Chem.- 2002.-V.277.- P.29063-29068.

23. Anders DG, Kacica MA, Pari G, et al. Boundaries and structure of human cytomegalovirus oriLyt, a complex origin for lytic-phase DNA replication. // J. Virol.-1992.-V.66.- P.3373-3384.

24. Anders DG, McCue LA. The human cytomegalovirus genes and proteins required for DNA synthesis. // Intervirology.- 1996.- V.39.- P.378-388.

25. Andoniou СЕ, Andrews DM, Manzur M, et al. A novel checkpoint in the Bcl-2-regulated apoptotic pathway revealed by murine cytomegalovirus infection of dendritic cells. // J Cell Biol.- 2004.- V.166.- P.827-837.

26. Arase H, Mocarski ES, Campbell AE, et al. Direct recognition of cytomegalovirus by activating and inhibitory NK cell receptors. // Science.- 2002.- V.296.- P. 1323-1326.

27. Arnoult D, Bartle LM, Skaletskaya A, et al. Cytomegalovirus cell death suppressor vMIA blocks Bax- but not Bak mediated apoptosis by binding and sequestering Bax at mitochondria. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2004.- V.101.- P.7988-7993.

28. Baccard-Longere M., Freymuth F., Cointe D., et al. Multicenter evaluation of a rapid and convenient method for determination of cytomegalovirus immuniglobulin G avidity // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunilogy. 2001. - V.8. - P.429-431.

29. Baillie J, Sahlender DA, Sinclair JH. Human Cytomegalovirus Infection Inhibits Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-alpha) Signaling by Targeting the 55-Kilodalton TNF-alpha Receptor. // J Virol.- 2003.- V.77.- P.7007-7016.

30. Baldick, C. J. and Shenk, T. Proteins associated with purified human cytomegalovirus particles. // J Virol.- 1996.- V.70.- P.6097- 6105.

31. Balint E., Vousden K.H. Activation and activities of the p53 tumor suppressor protein. // British Journal of Cancer.- 2001.- V.85.- P.1813-1823.

32. Barbi M., Binda S., Caroppo S., et al. A wider role of congenital cytomegalovirus infection in sensorineural hearing loss // Pediatr. Infec. Dis. 2003. - V.22. - P.39-42.

33. Beg AA, Baltimore D. An essential role for NF-kappaB in preventing TNF-alpha-induced cell death. // Science.-1996.- V.274.- P.782-784.

34. Benco D.M., Gibson W. Primate cytomegalovirus glycoproteins lectin-binding properties and sensitivities to glycosidases. // J. Virol.-1986.-V.59.-P.703-713.

35. Billstrom Schroeder M, Christensen R, Worthen GS. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. // J Clin Virol.-2002.- V.25.- P.149-157.

36. Bitsch A., Kirchner H., Dupke R., Bein G. Cytomegalovirus transcripts in peripheral blood leukocytes of actively infected transplant patients detected by reverse transcription polymerase chain reaction // J. Infect. Dis.-1993.-V.167.-P.740-743.

37. Bodeus M., Van Ranst M., Bernard P. et al. Anticytomegalovirus IgG avidity in pregnancy: prospective study // Fetal Diagnosis Therapy. 2002. - V.17. - P.362-366.

38. Boeckh M, Huang M, Ferrenberg J, Stevens-Ayers T, Stensland L, Nichols WG, Corey L Optimization of quantitative detection of cytomegalovirus DNA in plasma by real-time PCR. // J Clin Microbiol.- 2004.- V.42.- No.3.- P.1142-1148.

39. Boeckh M., G. Boivin. Quantitation of cytomegalovirus: methodologic aspects and clinical applications // Clinical Microbiol. Rewiews.- 1998.- V.ll.- No. 3,- P.533-554

40. Bold R.J., Termuhlen P.M., McConkey D.J. Apoptosis, cancer and cancer therary. // Surg, Oncol.-1997.- V.6.- P.133-142.

41. Braud V.M., Tomasec P., Wilkinson G.W. Viral evasion of natural killer cells during human cytomegalovirus infection. // Curr Top Microbiol Immunol.- 2002.- V.269.-P.l 17-129.

42. Bresnahan W.A., Boldogh I., Thompson E.A., et al. Human cytomegalovirus inhibits cellular DNA synthesis and arrests productively infected cells in late GI. // Virilogy.-1996.- V.224.- p.150-160.

43. Bresnahan W. A., and Shenk T. UL82 virion protein activates expression of immediate early viral genes in human cytomegalovirusinfected cells. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2000.- V.97.- P.14506- 14511.

44. Britt W.J., Auger D. Synthesis and processing of the envelope gp55-116 complex of human cytomegalovirus. //J. Virol.-1986.-V.58.-P.185-191.

45. Britt WJ, Mach M. Human cytomegalovirus glycoproteins. // Intervirology.- 1996.-V.39.-p.401^12.

46. Browne E.P., Shenk T. Human cytomegalovirus UL83-coded pp65 virion protein inhibits antiviral gene expression in infected cells. // Proc Natl Acad Sci.- 2003.-V.100.-No.20.-P.l 1439-11444.

47. Bystrevskaya V. В., Lobova Т. V., Smirnov V. N., et al. Centrosome injury in cells infected with human cytomegalovirus. // J. Struct. Biol.-1997.- V.120.- P.52-60.

48. Caliendo A. M., Yen-Leberman В., Babtista J., et al. Comparison of Molecular Tests for Detection and Quantification of Cell-Associated Cytomegalovirus DNA. // J. CI. Microbiology.- 2003.- V.41.- N0.8.- P. 3508-3513.

49. Caliendo A.M., Kirsten G.St., Allega J. et al. Distinguishing Cytomegalovirus (CMV) Infection and Disease with CMV Nucleic Acid Assays. // Journal of Clinical Microbiology, May 2002, p. 1581-1586, Vol. 40, No.

50. Campbell K.J., Rocha S., Perkins N.D. Active repression of antiapoptotic gene expression by RelA(p65) NF-kappa B. // Mol Cell.- 2004.- V.13.- P.853-865.

51. Castillio J. P., Kowalika, T. F. / HCMV infection modulating the cell cycle and cell death. // International Reviews of Immunology.-2004.- V.23.- P. 113-139.

52. Castillio J. P., Kowalika, T. F. Human cytomegalovirus immediate early proteins and cell growth control. // Gene.- 2002.- V.290.- P.19-34.

53. Castillo J.P., Yurochko A.D., Kowalik T.F. Role human cytomegalovirus immediate-early proteins in cell growth control. // J.Virol.- 2000.- V.74.- P.8028-8037.

54. Castillo JP, Kowalik TF. HCMV infection: Modulating the cell cycle and cell death. // Int Rev Immunol.- 2004.- V.23.- p.l 13-139.

55. Cebulla C.M., Miller D.M., Zhang Y. et al. Human cytomegalovirus disrupts constitutive MHC class II expression. // J. Immunol.- 2002.- V.169.- P.167-176.

56. Chee, M. S., Bankier A.T., Beck S. et al. Analysis of the protein-coding content of the sequence of human cytomegalovirus strain AD 169. // Curr. Top. Microbiol. Immunol.- 1990-. V.154.- P.125-170.

57. Chen F., Castranova V., Shi X. New insights into the role of nuclear factor-kB in cell growth regulation. // American Journal of Pathology.- 2001.- V.159.- P.387-397.

58. Cheng EH, Wei MC, Weiler S, et al. BCL-2, BCL-X(L) sequester BH3 domain-only molecules preventing В AX- and ВАК-mediated mitochondrial apoptosis. // Mol Cell 2001.- V. 8.- P.705-711.

59. Cherrington J.M., Khoury E.L., Mocarski E.S. Human cytomegalovirus ie2 negatively regulates alpha gene expression via a short target sequence near the transcription start site. // J.Virol.-1991.-V.65.-P.887-896.

60. Child S. J., Hakki M., De Niro K. L. et al. Evasion of cellular antiviral responses by human cytomegalovirus TRS1 and IRS1. Journal of virology., 2004.- V.78.- № 1.- P. 197-205

61. Chin K.C., Cresswell P. Virepin (cig5), an IFN-inducible antiviral protein protein directly induced by human cytomegalovirus. // Proc. Natl. Acad. Sci.- 2001.- V.-98(26).- P.15125-15130.

62. Chio S.H., Liu J.H., Chen S. et al. Apoptosis of human retina abd retinal pigment cells induced by human cytomegalovirus unfection. // Ophthalmic Res.- 2002.- V.34, P.77-82.

63. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. // Anal, biochem.- 1987.- V.162.- P.156-159.

64. Cinatl JJr., Cinatl J., Vogel J.U., et al. Persistent human cytomegalovirus infection induces drug resistance and alteration of programmed cell death in human neublastoma cells. // Cancer Res.-1998.- V.15.- P.367-372.

65. Colberg-Poley AM, Patel MB, Erezo DP, et al. Human cytomegalovirus UL37 immediate-early regulatory proteins traffic through the secretory apparatus and to mitochondria. // J Gen Virol.- 2000.- V.81.- P.1779-1789.

66. Colberg-Poley AM. Functional roles of immediate early proteins encoded by the human cytomegalovirus UL36-38, UL115-119, TRS1/IRS1 and US3 loci. // Intervirology.- 1996.- V.39.- 350-360.

67. Compton T. An Immortalized human fibroblasts cell line is permissive for human cytomegalovirus infection. // J. Virol.-1993.-V.67.-P.3644-3648.

68. Cory S, Huang DC, Adams JM. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. // Oncogene.- 2003.- V.22(53).- P.8590-607.

69. Datts S.R., Brunet A., Greenberg M.E. Cellular survival: a play in tree Akts. // Genes. Dev.-1999,- V.13.- P.2905-2927.

70. Deng Y,Wu X. Peg3/Pwl promotes p53-mediated apoptosis by inducing Bax translocation from cytosol to mitochondria. // Proc Natl Acad Sci.- 2000.- V.97.-P.12050-2055.

71. Distefano A.L., Alonso A., Fabian Martin et al. Human Cytomegalovirus: detection of congenital and perinatal infection in Argentina. // BMC Pediatrics.- 2004.- 4:11 doi:10.1186/1471-2431-4-ll

72. Domnina L.V., Ivanova O.Y., Cherniak B.V. et al. Effects of the ingibitors of dynamics of cytosceletal structures on the development of apoptosis induced by the tumor necrosis factor. // Biokhimiya.- 2002.- V.67

73. Donner C., Leisnard C., Content J., et al. Prenatal diagnosis of 52 pregnancies at risk for congenital cytomegalovirus infection // Obstet. Gynecol. 1993. - V.82. - P.481-486.

74. Erster S, Mihara M, Kim RH, et al. In vivo mitochondrial p53 translocation triggers a rapid first wave of cell death in response to DNA damage that can precede p53 target gene activation. // Mol Cell Biol.- 2004.- V.24.- P.6728-6741.

75. Ertl P.F., Powell K.L. Physical and functional interaction of human cytomegalovirus DNA polymerase and its accessory protein(ICP36) expressed in insert cells. // J.Virol.-1992.-V.66.-P.4126-4133.

76. Foghsgaard L, Jaattela M. The ability of BHRF1 to inhibit apoptosis is dependent on stimulus and cell type. // JVirol.- 1997.- V.71.- P.7509-7517.

77. Fortunato EA, Spector DH. p53 and RPA are sequestered in viral replication centers in the nuclei of cells infected with human cytomegalovirus. // J Virol.- 1998.- V.72.-P.2033-2039.

78. Fortunato, E. A., Spector, D. H. Regulation of human cytomegalovirus gene expression. // Adv Virus Res.- 1999.- V.54.- P.61-128.

79. Fortunato, E. A., and D. H. Spector. Viral induction of site-specific chromosome damage. // Rev. Med. Virol.- 2003.- V.13.- P.21-37.

80. Fortunato, E. A., McElroy, A. K., Sanchez V., et al. Exploitation of cellular signalling and regulatory pathways by human cytomegalovirus. // Trends Microbiol.- 2000.-V.8.- P.Ill 119.

81. Fowler R.B., Stagno S., Pass R.F., et al. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status // N. Engl. J. Med. 1992. - V.326. -P.663-667.

82. Francisci D, Tosti A, Baldelli F, et al. The pp65 antigenaemia test as a predictor of cytomegalovirus-induced end-organ disease in patients with AIDS. // AIDS.- 1997.-V.ll.- P.1341-1345.

83. Furman M.H., Ploegh H.L., Tortorella D. Membrane-specific, host-derived factors are required for US2- and US 11-mediated degradation of binding maojr histocompatibility complex class I molecules. // J. Biol. Chem.- 2002.- V.277.-P.3258-3267.

84. Furnari B.A., Poma E., Kowalik Т.Е., et al. Human cytomegalovirus immediate-early gene 2 protein interacts with itself and with several novel cellular proteins // J. Virol.-1993.-V.67.-P.4981-4991.

85. Gaytant M.A., Steegers E.A., Semmekrot B.A., et al. Congenital cytomegalovirus infection: review of the epidemiology and outcome // Obstet. Gynecol. Surv. 2002. -V.57. - P.245-256.

86. Gibson W. Structural and nonstructural proteins of strain Colburn cytomegalovirus. // Virology.-1981.- V.111.-P.516-537.

87. Gibson W. Structure and assembly of the virion. / /Intervirology.- 1996.- V.39.-P.389-400.

88. Gilberg M.J., Riddell S.R., Plachter В., Greenberg P.D. Cytomegalovirus selectively block antigen processing and presentation of its immediate-early gene prudact, Nature, 1996, V.383, P.720-722.

89. Gleaves C.A., Hursh D.A., Meyers J.D. Detection of human cytomegalovirus in clinical specimens by centrifugation culture with a nonhuman cell-line. // J. Clin. Microbiol.-1992.-V.30.-P.1045-1048.

90. Goldmacher V.S. Cell death suppression by cytomegalovirusrs. // Apoptosis.- 2005.-V.10.- P.251-263.

91. Goldmacher VS, Bartle LM, Skaletskaya A, et al. A cytomegalovirus-encoded mitochondria-localized inhibitor of apoptosis structurally unrelated to Bcl-2. // Proc Natl Acad Sci.-1999.- V.96.-12536-12541.

92. Goldmacher VS. Cell death suppressors encoded by cytomegalovirus. // Prog Mol Subcell Biol.- 2004.- V.36.- P.l-18.

93. Grangeot-Keros L., Cointe D. Diagnosis and prognostic markers of HCMV infection // J. Clin. Virol. 2001. - V.21. - P.213-221.

94. Gretch D.R., Gehrz R.C., Stinski M.F. Characterization of a human cytomegalovirus glycoprotein complex (gcll). // J. Virol.-1988.-V.69.- P.1205-1215.

95. Gretch, D.R., Kari, В., Rasmussen, L., et al. Identification and characterization of three distinct families of glycoprotein complexes in the envelopes of human cytomegalovirus. // J Virol.- 1988.- V.62.- P.875- 881.

96. Griffiths, P. D., Panjwani, D. D., Stirk, P. R., et al. Rapid diagnosis of cytomegalovirus infection in immunocompromised patients by detection of early antigen fluorescent foci. // Lancet.-1984.- P.1242-1245.

97. Guerra B, Lazzarotto T, Quarta S, et al. Prenatal diagnosis of symptomatic congenital cytomegalovirus infection. // Am J Obstet Gynecol.- 2000.- V.183(2).-P.476-82.

98. Guo M., Hay B.A. Cell proliferation and apoptosis. // Current Opinion in Cell Biology.-1999.- V.ll.- P.745-752

99. Hagemeier C., Walker S.M., Sissons P.J., et al. The 72K IE1 and 80K IE2 proteins of human cytomegalovirus independently trans-activate the c-fos, c-myc and hsp70 promoters via basal promoter elements // J. Gen. Virol.-1992.-V.73.-P.2385-2393.

100. Halwachs-Baumann G., Genser В., Pailer S., Engele H., Rosegger H.,Schalk A., Kessler H.H., Truschnig-Wilders M. Human cytomegalovirus load in various body fluids of congenital infected newborns. // J. Clin. Virol.- 2002.- V.25.- P.S81-87.

101. Hamzeh FM, Lietman PS, Gibson W, et al. Identification of the lytic origin of DNA replication in human cytomegalovirus by a novel approach utilizing ganciclovir-induced chain termination. // J Virol.-1990.- V.64.- Р.618Ф-6195.

102. Harkins L, Volk A.L., Samanta M, et al. Specific localisation of human cytomegalovirus nucleic acids and proteins in human colorectal cancer. // Lancet.-2002.- V.360.- P.1557-1563.

103. Hayajneh WA, Colberg-Poley AM, Skaletskaya A, et al. The sequence and antiapoptotic functional domains of the human cytomegalovirus UL37 exon 1 immediate early protein are conserved in multiple primary strains. // Virology.- 2001.-V.279.- P.233-240.

104. Hengartner M.O. The biochemistry of apoptosis. // Nature.- 2000.- V.407(6805).-P.770-776.

105. Hershko Т., Chaussepied M., Oren M., Ginsberg D. Novel link between E2F and p53: proapoptotic cofactors of p53 are transcriptionally upregulated by E2F. // Cell Death and Differentiation.- 2005.- V.12.- P.377-383.

106. Hickman E.S., Moroni M.C., Helin K. The role of p53 and pRB in apoptosis and cancer. // Current Opinion in Genetics & Development.- 2002.- V.12.- P.60-66.

107. Honess R.W., Roizman B. Regulation of herpesvirus macromolecular synthesis. I. Cascade regulation of the synthesis of three groups of virus proteins. // J. Virol.-1974.-V.14.- P.8-19.

108. Horacek J., Brucek P., Otova B. Detection of nuclear cytomegalovirus antigen in cell-culture as compared to classical virus isolation. // Acta Virol.- 1991.- V.35.-P.187-189.

109. Huang E.S., Kowalik T.F. The pathogenicity of human cytomegalovirus: an overview. In book: Molecular aspects of human cytomegalovirus diseases, ed. by Becker Y., Darai G.-1993.- P.3-45.

110. Huang E.S., Pagano J.S. Nucleic acid hybridization technology and detection of proviral genomes. // Methods Virol.- 1977.-V.6.- P.457-497.

111. Ito M., Watanabe M., Ihara Т., et al. Fas antigen and bcl-2 expression on lymphocytes cultured with cytomegalovirus and varicella-zoster virus antigen. // Cell Immunol.- 1995.- V.160.- P.173-177.

112. Iskenderian AC, Huang L, Reilly A, et al. Four of eleven loci required for transient complementation of human cytomegalovirus DNA replication cooperate to activate expression of replication genes. // J Virol.-1996.- V.70.- P.383-392.

113. Jault M. F., Jault J.-M., F. Ruchti, et al. Cytomegalovirus infection induceshigh levels of cyclins, phosphorylated Rb, and p53, leading to cell cyclearrest. // J. Virol.-1995.- V.69.- P.6697-6704.

114. Johnson D. C., Hegde N. R. Inhibition of the MHC class II antigen presentation pathway by human cytomegalovirus. // Curr. Top. Microbiol. Immunol.- 2002.-V.269.- P.101-115.

115. Kaiser 1, Perrin L, Halaya K, et al. Improved monitoring of cytomegalovirus infection after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation by an ultrasensitive plasma DNA PCR assay, // J. CI. Microbiology.- 2002.- V.40(l).- P. 4251-4255.

116. Kalejta R. F., Bechtel J.T., Shenk Т., Mutations that abolish the ability of HCMV pp71 protein to induce DNA synthesis in quiescent cell do not affect its ability to accelerate G1 phase cell cycle progression. // J Virol.- 2003.- V.77.- P.3451-3459.

117. Kanich R.E., Craighead J.E. Human cytomegalovirus infection of cultured fibroblasts. II. Viral replicative sequence of a wild and an adapted strain. // Lab. Invest.-1972.-V.27.-P.237-282.

118. Kari В., Gertz R. Characterization of cytomegalovirus glycoproteins in a family of complexes designated gC-II with murine monoclonal antibodies. // Arch. Virol.-1990.-V.112.-P.55-65.

119. Kari В., Gehrz R. A human cytomegalovirus glycoprotein complex designated gC-II is a major heparin-binding component of the envelope. // J. Virol.-1992.-V.66.-P.1761-1764.

120. Keisari, Y. A colorimetric microtiter assay for the quantitation of cytokine activity on adherent cells in tissue culture. //J. Immunol. Methods.- 1992.- V.146.-P.155-161.

121. Kim J., Kwon Y.J., Park E.S., et al. Human cytomegalovirus (HCMV) IE1 plays role in resistance to apoptosis with etoposide in cancer cell line by Cdk2 accumulation. // Microbiol Immunol.- 2003.- V.47.- P.959-967.

122. Kouzarides Т., Bankier A.T., Satchwell S.C., et al. An immediate early gene of human cytomegalovirus encodes a potential membrane glycoprotein./ / Virology.-1988.- V.165.- P.151-164.

123. Kovacs A., Weber M.L., Burns L.J, et al. Cytoplasmic sequestration of p53 in cytomegalovirus-infected human endothelial cells. // Am J Pathol.- 1996.- V.149.-P.1531-1539.

124. Kovacs A.S., Churchill M.A., Wood D., et al. Molekular and epidemiologicevaluations of a cluster of cases of Menetrier s disease associated with cytomegalovirus // Pediatrics Infectious Disease Journal (R).- 1993.- V. 12.- №12.- P. 1011-1014.

125. Kowalik Т., DeGregori J., Schwarz J.K. E2F1 overexpression in quiescent fibroblasts leads to induction of cellular DNA synthesis and apoptosis. // J. Virol.1995.-V.69.-P.2491-2500.

126. Krueger A, Baumann S, Krammer PH, et al. FLICE nhibitory proteins: Regulators of death receptor-mediated apoptosis. // Mol Cell Biol.- 2001.- V.21.- P.8247-8254.

127. Kyritsis C., Gorbulev S., Hutschenreiter S., et al. Molecular mechanism and structural aspects of transporter associeted with antigen processing inhibition by the cytomegalovirus protein US6. // J.Biol. Chem.- 2001.- V.276.- P.48031-48039.

128. Landolfo S, Gariglio M., Gribaudo G., et al. The human cytomegalovirus. // Pharmacology & therapeutics.- 2003.- V.98.- P.269-297.

129. Landry M.L., Ferguson D. Comparison of quantitative cytomegalovirus antigenemia assay with culture methods and correlation with clinical disease. // J. Clin. Microbiol.-1993.- V.31.- P.2851-2856.

130. Lazzarotto Т., Varani S., Gabrielli L., et al. New advances in the diagnosis of congenital cytomegalovirus infection // Intervirology. 1999. - V.42. - P.390-397.

131. Lazzarotto Т., Varani S., Guerra В., et al. Prenatal indicators of congenital cytomegalovirus infection // Journal of Pediatrics.- 2000.- V.137. No.l

132. Lee J.Y., Irmiere A., Gibson W. Primate cytomegalovirus assembly: evidence that DNA packaging occures subsequent to B-capsid assembly. // Virology.-1988.-V.167.- P.87-96.

133. Lee S., Yoon J., Park В., et al. Structural and functional dissection of human cytomegalovirus US3 in binding maojr histocompatibility complex class I molecules. // J.Virol.- 2000.- У.12.- P.11262-11269.

134. Leicht M., Marx G., Karbach D., et al. Mechanism of cell death of rat cardiac fibroblasts induced by serum depletion. // Mol Cell Biochem.- 2003.- V.251.- P.119-126.

135. Levrevo M., De Laurenzi V., Costanzo A., et al. The p53/p63/p73 famaly of transcription factors: overlapping and distinct functions. // J. Cell Science.- 2000.-V.113.- P.1661-1670.

136. Lin M.F., Wei G.Q., et al. Huang H.,Human cytomegalovirus induces alteration of beta-actin mRNA and microfilaments in human embryo fibroblast cells. // J Zhejiang Univ Sci.- 2004.- V.5(6).- P.733-737.

137. Liu ZG, Hsu H, GoeddelDV, et al. Dissection of TNF receptor 1 effector functions: JNK activation is not linked to apoptosis while NF-kappaB activation prevents cell death. Cell 1996; 87: 565-576

138. Maeda-Takekoshi F., Takekoshi M., Tanaka S. Expression of the immediate early antigens of human cytomegalovirus is responsible for virus proliferation; an intracellular immunization approach. // J. Exp. Clin. Med.-1992.- V.17.- P.75-83.

139. Maeda-Takekoshi F., Takekoshi M., Tanaka S. Expression of the immediate early antigens of human cytomegalovirus is responsible for virus proliferation; an intracellular immunization approach. //Tokai. J. Exp. Clin. Med.-1992.-V.17.-P.75-83.

140. Malinger G., Lev D., Zahalka N., et al. Fetal cytomegalovirus infection of the brain: the spectrum of sonographic findings // AJNR (Am. J. Neuroradiol.). 2003. - V.24. -P.28-32.

141. Margolis M.J., Pajovic S., Wong E.L., et al. Interaction of the 72-kilodalton human cytomegalovirus IE1 gene product with E2F1 coincides with E2F-dependent activation of dihydrofolate reductase transcription. // J Virol.- 1995,- V.69.- P.7759-7767.

142. Maschmann J., Yamprecht K., Dietz K., et al. Cytomegalovirus infection of extremely low-birth weight infants via breast milk // Clinical Infection Deseases, 2001.- V.33.- P.1998-2003.

143. Masse M.J., Messerle M., Mocarski E.S. The location and sequence composition of the murine cytomegalovirus replicator (on'Lyt). // Virology.-1997.-V.230.- P.350-360.

144. Mavinakere M.S., Colberg-Poley A.M. Dual targeting of the human cytomegalovirus UL37 exon 1 protein during permissive infection. // J Gen Virol .2004.- V.85.- P.323-329.

145. McCormick A.L., Smith V.L., Chow D., et al. Disruption of mitochondrial networks by the human cytomegalovirus UL37 gene product viral mitochondrion-localized inhibitor of apoptosis. // J. Virol.- 2003.- V.77.- P.631-641.

146. McGavran M.H., Smith M.G. Ultrastructural, cytochemical and microchemical observations on cytomegalovirus (salivary gland virus) infection of human cells in tissue culture. // Exp Mol Pathol.- 1965.- V.4.- P.l-10.

147. McVoy, M. A., Adler, S. P. Human cytomegalovirus DNA replicates after early circularization by concatemer formation, and inversion occurs within concatemer. // J Virol.-1994.- V.68 1040-1051.

148. Meyer J.D., Ljungman P., Fisher L.D. Cytomegalovirus excretion as a predictor of cytomegalovirus disease after marrow transplantation: importance of cytomegalovirus viremia. //J. Infect. Dis.-1990.- V.162.- P/373-380.

149. Mocarski E.S. Cytomegalovirus: biology and replication. // In book: The human herpesviruses. Ed. by Roizman В., Whitley R.J., Lopez C., New York.- 1993.- P.173-226.

150. Mocarski ES, Liu AC, Spaete RR. Structure and variability of the a sequence in the genome of human cytomegalovirus (Towne strain). // J Gen Virol.- 1987.- V.68.-P.2223-2230.

151. Mocarski, E. S., & Courcelle, С. T. Cytomegalovirus and their replication. // In book: Fields Virology Ed. by D. Knipe, P. Howley.- 2001.- P.2629- 2673.

152. Moroni M.C., Hickman E.S., Lazzerini D. E., et al. Apaf-1 is a transcriptional target for E2F and p53. // Nature cell biology.- 2001.- V. 3.- P.552-558.

153. Muganda P, Mendoza O, Hernandez J, et al. Human cytomegalovirus elevates levels of the cellular protein p53 in infected fibroblasts. // J Virol.- 1994.- V.68.- P.8028-8034.

154. Murphy, E.A., Streblow, D.N., Nelson, et al. The human cytomegalovirus IE86 protein can block cell cycle progression after inducing transition into the S phase of permissive cells. // J Virol.- 2000.- V.74.- P.7108- 7118.

155. Mussi-Pinhata M.M., Pinto P.C., Yamamoto A.Y., et al. Placental transfer of naturally acquired maternal cytomegalovirus antibodies in term and preterm neonates // J. Med. Virol. 2003. - V.69. - P.232-239.

156. Nelson C.T., Demmler G.J. Cytomegalovirus infection in the pregnant mother, fetus and newborn infant // Clin. Perinatol. 1997. - V.24. - P.151-160.

157. Novotny, J., Rigoutsos, I., Coleman, D., et al. In silico structural and functional analysis of the human cytomegalovirus(HHV5) genome. // J Mol Biol.- 2001.-V.310.- P.1151-1166.

158. O'Brien V. Viruses and apoptosis. // J Gen Virol.- 1998.- V.79(Pt 8).- P.1833-1845.

159. Pajovic S., Wong E.L., Black A.R., Azizkhan J.C. Identification of a viral kinase that phosphorylates specific E2Fs and pocket proteins. // Mol. Cell. Biol.- 1997.-V.17.- P. 6459-6464.

160. Patterson CE, Shenk T. Human cytomegalovirus UL36 protein is dispensable for viral replication in cultured cells. // J Virol.- 1999.- V.73.- P.7126-7131.

161. Perol Y., Саго V., Mazeron M.C. Cytomegalovirus antigenemia assay: therapeutic usefulness and biological significance. // Nouv Rev Fr Hematol.- 1993.- V.35(l).-P.95-98.

162. Peter M.E., Heufelder A.E., Hengartner M.O. Advances in apoptosis research. // Proc. Natl. Acad. Sci.-1997.- V.94.- P.12736-12737.

163. Pignatelli S., Monte D., Zini N. et. al. Immunoelectron microscopy analysis of HCMV gp UL73 (gN) localization. // Arch. Virol.- 2002.- Vol. -147(6).- P.1247-1256.

164. Plachter В., Jahn G. Cytomegalovirus diagnostics: standard procedures and perspectives. // Biotest Bulletin.-1990.- V.4.- P.107-118.

165. Poma E., Kowalik Т., Zhu L., et. al. The human cytomegalovirus IE1-72 protein interacts with the cellular pl07 protein and relieves p 107-mediated transcriptional repression of an E2F-responsive promoter. // J.Virol.-1996.- Vol.-70.- P. 7867-7877.

166. Poncet D., Larochette N., Pauleau A.L., et al. An anti-apoptotic viral protein that recruits Bax to mitochondria. // J Biol Chem.- 2004.- V.279.- P.22605-22614.

167. Powers J.T., Hong S., Mayhew C.N., et al. E2F1 uses the ATM signaling pathway to induce p53 and Chk2 phosphorylation and apoptosis. // Mol. Cancer Res.- 2004.-V.2.- P.203-214.

168. Prichard M.N., Duke G.M., Mocarski E.S. Human cytomegalovirus uracil DNA glycosylase is required for the normal temporal regulation of both DNA synthesis and viral replication. // J Virol.- 1996.- V.70.- P.3018-3025.

169. Raftery M.J., Schwab M., Eibert S.M., et al. Targeting the function of mature dendritic cells by human cytomegalovirus; a multilayered viral defense strategy. // Immunity.- 2001.- V.15.- P.997-1009.

170. Reboredo M., Greaves R.F., Hahn G. Human cytomegalovirus proteins encoded by UL37 exon 1 protect infected fibroblasts against virus-induced apoptosis and are required for efficient virus replication. // J Gen Virol.- 2004.- V.85.- P.3555-3567.

171. Revello M.G., Gerna G. Diagnosis and management of human cytomegalovirus infection in the mother, fetus and newborn infant // Clin. Microbiol. Rev. 2002. -V.15. - P.680-715.

172. Roby C., Gibson W. Characterization of phosphoptoreins and protein kinase activity of virions, noninfectious enveloped particles and dense bodies of human cytomegalovirus. // J. Virol.-1986.-V.59.-P.714-727.

173. Roizman В., Sear A.E. Herpes simplex viruses and their replication. In book: Virology, Ed. by Fielda B.N., Knipe D.M., Chanock R.M., Hirsch M.S., Melnick J.L., Monath T.P., New York.- 1990.- P.1795-1841.

174. Romanowski M.J., Shenk T. Characterization of the human cytomegalovirus irsl and trsl genes: A second immediate-early transcription unit within irsl whose product antagonizes transcriptional activation. // J Virol.- 1997.- V.71.- P.1485-1496.

175. Rosen P.P. Cytomegalovirus infection in cancer patients. // Pathol. Annu.-1978.-V.13.- P.175-208.

176. Roulston A., Marcellus R.C., Branton P.E. Viruses and apoptosis. // Annu. Rev. Microbiol.-1999.- V.53.- P.577-628.

177. Ruger B, Klages S, Walla B, et al. Primary structure and transcription of the genes coding for the two virion phosphoproteins pp65 and pp71 of human cytomegalovirus. //J Virol.- 1987.- V.61.- P.446-453.

178. Sahara S., Aoto M., Eguchi Y. et al. Acinus is a caspase-3-activated protein required for apoptotic chromatin condensation. // Nature.- 1999.- V.401.- P.168-173.

179. Salvant B.S., Fortunato E.A., Spector D.H. Cell cycle dysregulation by human cytomegalovirus: influence of the cell cycle phase at the time of infection and effects on cyclin transcription. // J. Virol.- 1998.- V.70.- P.7867-7877.

180. Scaffidi C, Fulda S, Srinivasan A, et al. TwoCD95(APO-l/Fas) signaling pathways. // Embo J.- 1998.- V.17.- P.1675-1687.

181. Schmitz M.L., Mattioli I., Bliss H., et al. NF-kB: a multifaceted transcription factor regulated at several levels. // Chem. Bio. Chem.- 2004.- V.5.- P.1348-1358.

182. Scorrano L., Oakes S.A., Opferman J.T., et al. BAX and ВАК regulation of endoplasmic reticulum Ca2+: A control point for apoptosis. // Science.- 2003.-V.300.- P.135-139.

183. Simmen K., Singh J., Mattias B. et. al. Global modulation of cellular transcription by human cytomegalovirus is initiated by viral glycoprotein B. // PNAS.-2001.-V.98.-P.7140-7145.

184. Sindre H., Rollag H., Olafsen M.K., et al. Human cytomegalovirus indudes apoptosis in the hematopoietic cell line M07e. // APMIS.- 2000.- V.108.- P.223-230.

185. Skaletskaya, A., Bartle, L. M., Chittenden, Т., et al. A cytomegalovirus-encoded inhibitor of apoptosis that suppresses caspase-8 activation. // Proc Natl Acad Sci.-2001.- V.98.- P.7829-7834.

186. Smith J.D., DeHarven E. Herpes simplex virus and human cytomegalovirus replication in WI-38. II. An ultrastructural study of viral penetration. // J. Virol.-1974.-V.14.- P.945-956.

187. Smyth M.J., Kelly J.M., Sutton V.R., et al. Uclocking the secrets of cytotoxic granule proteins. // J. Leukocyte Biol.- 2001.- V. 20.- P.18-29.

188. Song, Y., Stinski, M. F. Effect of the human cytomegalovirus IE86 protein on expression of E2F-responsive genes: a DNA microarray analysis. Proc Natl Acad Sci USA.- 2002.- V.99.- P.2836- 2841.

189. Spaete R.R., Gehrz R.C., Landini M.P. Human cytomegalovirus structural proteins. // J Gen Virol.-1994.- V.75.- P.3287-3308.

190. Spaete R.R., Mocarski E.S. The a sequence of the cytomegalovirus genome functions as a cleavage/packaging signal for herpes simplex virus defective genomes. // J Virol.-1985.- V.54.- P.817-824.

191. Speir E., Modali R., Huang E.S., et al. Potential role of human cytomegalovirus and p53 interaction in coronary restenosis. // Science.-1994.- V.265.- P.391-394.

192. Stamminger Т., Fleckenstein B. Immediate-early regulation of human cytomegalovirus. In dook: Current topics in microbiology and immunology. Ed. by McDougall J.K. Berlin, Heidelberg, New York.,- 1990.- V.154.- P.3-19.

193. Stasiak P.C., Mocarski E.S. Transactivation of the cytomegalovirus ICP36 gene promoter requires the alpha gene product TRS1 in addition to IE1 and IE2. // J. Virol.- 1992.- V.66.- P.1050-1058.

194. Stinski M.F., Mocarski E.S., Thomsen D.R. DNA of human cytomegalovirus: size heterogeneity and defectiveness resulting from serial undiluted passage. // J. Virol.-1979.-V.31.-P.231-239.

195. Susin S.A., Daugas E., Ravagnan L., et al. Two distinct pathways leading to nuclear apoptosis. // J Exp Med.- 2000.- V.192(4).- P.571-580.

196. Tanaka K., Zou J.P., Takeda K., et al. Effects of human cytomegalovirus immediate-early proteins on p53-mediated apoptosis in coronary artery smooth muscle cells. // Circulation.-1999.- V.99.- P.1656-1659.

197. Terrasson J., Allart S., Martin H., et al. p73-depended apoptosis through death receptor: impairment by human cytomegalovirus. // Cancer Res.- 2005.- V.65.-P.2787-2794.

198. Theiler R. N., Compton T. Characterization of the signal peptide processing and membrane association of human cytomegalovirus glycoprotein O. // J Biol Chem.-2001.- V.276.- P.39226- 39231.

199. Topilko A., Michelson S. Morphological and cytochemical analysis of human cytomegalovitus inoculum. Correlation of free particles in inoculum with counterparts in infected cells. // Res. Virol.-1994.-V.145.-P.65-73.

200. Tsai H.L., Kou G.H., Chen S.C., et al. Human cytomegalovirus immediate-early protein IE2 tethers a transcriptional repression domain to p53. // J Biol Chem.- 1996.-V.271.- P.3534-3540.

201. Van Antwerp D.J., Martin S.J., Kafri Т., et al. Suppression of TNF-alpha-induced apoptosis by NF-kappaB. // Science.- 1996.- V.274.- P.787-789.

202. Wallach D., Varfolorneev E.E., Malinin N.L., et al. Tumor necrosis factor receptor and Fas signaling mechanisms. // Annu. Rev. Immunol.-1999.- V.17.- P.331-367.

203. Wang C.Y., Mayo M.W., Baldwin A.S. TNF- and cancer therapy-induced apoptosis: Potentiation by inhibition of NFkappaB. // Jr.Science.-1996.- V.274.- P.784-787.

204. Wang E.C., Borysiewicz L.K. The role of CD8+, CD57+ cells in human cytomegalovirus and other viral infections. // Scand J Infect Dis Suppl.- 1995.- V.99.-P.69-77.

205. Wang J., Marker P.H., Belcher J.D., et al. Human cytomegalovirus immediate early proteins upregulate endothelial p53 function. // FEBS Lett.- 2000.-V.474.- P.213-216.

206. Wei G.O., Lin M., Huang H. et al. Human cytomegalovirus protects multople myeloma cells line KM3 cells from apoptosis indused by growth factor withdrawal. // Chin. Med. J.- 2004.- V.117.- P.903-907.

207. Winkler M., Siepen D., Stamminger T. Functional interaction between pleiotropic transcativator pUL69 of human cytomegalovirus and the human homology of yeast chromatin regulatory protein SPT6. // J. Virol.-2000.-V.74.-P.8053-8064.

208. Wright H.T., Goodheart C.R., Lielausis A. Human cytomegalovirus. Morphology by negative staining. // Jr,Virology.- 1964.- V.23.- P.419-424.

209. Yurochko A.D., Kowalik T.F., Huong S.M., et al. Human cytomegalovirus upregulates NF-kappa В activity by transactivating the NF-kappa В pl05/p50 and p65 promoters. // J Virol.-1995.- V.69.- P.5391-5400.

210. Yurochko, A. D., Mayo, M. W., Poma, E. E., et al. Induction of the transcription factor Spl during human cytomegalovirus infection mediates upregulation of the p65 and pl05/ p50 NF-kB promoters. // J Virol.- 1997.- V.71.- P.4638- 4648.

211. Zhu H, Shen Y, Shenk T. Human cytomegalovirus IE1 and IE2 proteins block apoptosis. J Virol 1995; 69: 7960-7970.

212. Zhu, H., J. P. Cong, G. Mamtora, T. Gingeras, and T. Shenk. 1998. Cellular gene expression altered by human cytomegalovirus: global monitoring with oligonucleotide arrays. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14470-14475.

213. Zong W.X., Li C, Hatzivassiliou G, et al. Bax and Bak can localize to the endoplasmic reticulum to initiate apoptosis. //J Cell Biol.- 2003.- V.162.- P.59-69.

214. Zhang Z., Huong S., Wang X., et al. Interactions between human cytomegalovirus IE1-72 and cellular pl07: functional domains and mechanisms of up-regulation of cyclin E/cdc2 kinase activity. // J. Virol.- 2003.- V.77.- P.12660-12670.

Информация о работе

Меджидова, Марина Гудовна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.03

Диссертация

Выявление маркеров цитомегаловируса у новорожденных и детей раннего возраста. Развитие апоптоза при цитомегаловирусной инфекции in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы