Роль цитомегаловирусной инфекции в патологии плода и новорожденного. Поиск новых противовирусных средств

Адиева, Айна Ахмедовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль цитомегаловирусной инфекции в патологии плода и новорожденного. Поиск новых противовирусных средств
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Роль цитомегаловирусной инфекции в патологии плода и новорожденного. Поиск новых противовирусных средств"

а и - л

3054

На правах рукописи

АДИЕВА АИНА АХМЕДОВНА

РОЛЬ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ В ПАТОЛОГИИ ПЛОДА И НОВОРОЖДЕННОГО. ПОИСК НОВЫХ ПРОТИВОВИРУСНЫХ СРЕДСТВ.

03.00.06. - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2009 г.

Работа выполнена в Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

доктор медицинских наук, профессор

КУЩ Алла Александровна

НИСЕВИЧ Лия Львовна

МИЛЛЕР Галина Генриховна

БРАГИНА Елизавета Ефимовна

ЧЕШИК Святослав Георгиевич

Ведущая научная организация: НИИ переливания крови Гематологического научного центра РАМН

Защита состоится « 21 » декабря 2009 г. в 12 часов на заседании Диссертационного Совета Д.001.020.01 при Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: 123098 Москва, ул. Гамалеи, д. 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Автореферат диссертации разослан » 009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

БУРЦЕВА Елена Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Внутриутробная инфекция (ВУИ) занимает одно из ведущих мест в структуре перинатальной смертности, являясь основной причиной смерти или осложняя течение основного заболевания у 37,5% умерших новорожденных [Цинзерлинг и др., 2002]. Достоверных данных об истинной распространенности ВУИ нет, однако согласно данным ряда исследователей, инфекционные заболевания выявляют у 50-60% госпитализированных доношенных и 70% недоношенных новорожденных [Володин и др., 2004; Сидорова и др., 2006].

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) является одной из наиболее распространенных внутриутробных инфекций, вызывающих тяжелые патологии, вплоть до гибели ребенка [Gibson et.al., 2008; Kenneson et.al., 2007; Kriebs et.al., 2008].

Прогресс в изучении ЦМВИ связан с разработкой п широким внедрением в практику здравоохранения принципиально новых диагностических технологий -высокочувствительных и специфичных методов иммунохимии, молекулярной и клеточной биологии. В связи с этим оценка эффективности современной специфической диагностики ЦМВИ приобретает особую актуальность.

Трудности анте - и постнатальиой диагностики ЦМВИ связаны с неоднозначностью возможной реализации инфекционного процесса из-за особенностей иммунной системы новорожденных и неспецифичностью клинических проявлений. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные этой проблеме, устоявшихся канонов пренатальной диагностики ЦМВИ в мире не существует. Разработка четких и общепринятых рекомендаций по лабораторному обследованию недоношенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией с подозрением на ЦМВИ и в России остается нерешенной задачей. Высокая инфицированность недоношенных новорожденных детей ЦМВ ставит вопрос о своевременной диагностике ЦМВИ у беременных женщин и о вертикальной передаче вируса. В связи с этим тактика ведения беременных женщин с высоким риском инфицирования плода должна включать эффективную диагностику и своевременное начало лечения ЦМВИ.

На клеточном уровне цитопатический эффект ЦМВ проявляется в изменении морфологии клетки и ядра, в образовании многоядерных клеток и в появлении внутриядерных включений [Mocarski et.al, 2001]. В связи с этим, исследования, направленные на анализ действия ЦМВ на клеточную пролиферацию, вызывают особый интерес. Так, группой авторов было показано, что ЦМВ стимулирует репликацию клеточной ДНК в зараженных клетках [Hume et.al., 2008; Kalejta et.al., 2003; McElroy et.al.

2000; Prichard et.al., 2008]; описывалось существенное возрастание митотического индекса в инфицированной культуре [Sanchez et.al., 2003; Tran et.al., 2008; Wiebusch et.al., 2005]. Позже появились работы, опровергающие эти данные. Было показано, что вирус может блокировать прохождение клеточного цикла клетками в нескольких точках, включая переход из G| - периода в фазу синтеза ДНК [Lu and Shenk, 1999; Murphy et.al., 2000; Sinclar et.al., 2000] и переход из стадии Од в M, в точке, обозначаемой как G2/M [Castillo et.al., 2005; Lu and Shenk, 1999; Sanchez et.al., 2006]. Таким образом, данные о влиянии ЦМВ на клеточную пролиферацию оказались противоречивыми и требовали дальнейшего исследования.

Фундаментальные данные о влиянии ЦМВ на клеточные структуры и жизненный цикл клетки необходимы для понимания процессов, приводящих к патологии при внутриутробном развитии детей и их смерти, а также для выбора адекватной терапевтической тактики для новорожденных с ЦМВИ. Существующие на сегодняшний день единичные патентованные препараты, обладающие противовирусной активностью в отношении ЦМВ, не применяются у новорожденных и детей раннего возраста вследствие их высокой токсичности. Кроме того, эффективность лечения существующими препаратами снижена из-за развития лекарственной устойчивости, часто возникающей при длительном их применении [Biron et.al., 2006; Chou et.al., 1999]. Поэтому поиск эффективных и нетоксичных анти-ЦМВ агентов, перспективных в качестве химиотераиевтических средств при ЦМВИ, остается важной проблемой. Все вышеизложенное в совокупности явилось обоснованием для проведения данного исследования.

Цель исследования.

Цель настоящей работы состояла в изучении маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей с сочетанной перинатальной патологией при рождении и в материалах аутопсии; мониторинга метаболической и иммунной терапии; в изучении антивирусной активности аминокислотных производных фуллерена С(,о; в исследовании действия ЦМВ жизненный цикл инфицированных клеток.

Задачи:

выявить прямые (ДНК и инфекционно активный вирус) и непрямые маркеры (специфические IgM, IgG и индекс авидности IgG антител) ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей и изучить динамику их выявления в течение первого года жизни.

установить возможность выявления инфекционно - активного ЦМВ с помощью быстрого культурального метода (БКМ) в материалах аутопсии плодов, умерших новорожденных и детей, умерших на первом году жизни.

разработать метод ПЦР in situ для выявления ДНК ЦМВ на отпечатках различных органов. Оценить эффективность использования различных методов лабораторной диагностики при детекции ЦМВ в материалах аутопсии.

установить частоту выявления ЦМВ у беременных из группы высокого риска по перинатальному инфицированию плода и новорожденного. Оценить эффективность использования метаболических препаратов в предгравидарной подготовке и во время беременности.

оценить эффективность использования Виферона у беременных с ОАГА со второго триместра беременности и у недоношенных детей с клиническими проявлениями ВУИ.

изучить цитотоксичность и антивирусную активность аминокислотных производных фуллерена Сбо (АПФ) на модели экспериментальной ЦМВИ in vitro. Сравнить эффективность указанных соединений при использовании лечебной, профилактической и вирулицидной схем воздействия. Оценить сочетанный эффект АПФ и Виферона и продукцию вируса под действием АПФ.

изучить изменение пролиферативной активности в асинхронно - делящейся и синхронизированной культуре фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ) под влиянием ЦМВ. Определить способность клеток ФЛЭЧ, инфицированных в разные периоды клеточного цикла, вступать в митоз.

оценить развитие патологии митоза при инфицировании ЦМВ в присутствии ингибитора репликации вирусной ДНК и при инфицировании ЦМВ инактивпрованным УФ.

Научная новизна.

Впервые разработан и использован алгоритм комплексного обследования недоношенных новорожденных с клиническими признаками ВУИ вирусологическими методами (БКМ) и с помощью генодиагностики (ПЦР, ПЦР - real time) для выявления возбудителей герпесвирусных инфекций.

Впервые разработан метод ПЦР in situ для выявления ДНК ЦМВ на отпечатках и парафиновых срезах органов мертворожденных и детей, умерших на первом году жизни, который сочетает морфологический и молекулярный подходы и позволяет не только выявлять внутриклеточную вирусную ДНК в инфицированных клетках, но и оценить её относительное количество.

Впервые установлено, что в материалах аутопсии плодов (мертворожденных) и умерших новорожденных чаще определяется инфекционно активный ВПГ, а у детей, умерших на первом году жизни - инфекционно активный ЦМВ.

Впервые показана низкая цитотоксичность и высокая антивирусная активность аминокислотных производных фуллерена Сс,о — натриевой соли аминокапроновой кислоты

(Cr,o-Na-AKK) и натриевой соли аминомасляной кислоты (Cto-Na-AMK); химнотерапевтпческий индекс в различных схемах воздействия для Ceo-Na-AKK равен 260-2600; для CHrNa-AMK - 2500-5450.

Впервые установлено, что в клетках, инфицированных в S-фазе клеточного цикла, удлиняется период синтеза ДНК; при этом клетки сохраняют способность вступать в митотическое деление. Остановка деления происходит в метафазе митоза.

Впервые показано, что патология митоза развивается в одинаковой степени в клетках, инфицированных интактным вирусом, при подавлении репликации ДНК ЦМВ, а также при заражении ЦМВ, инактивированным УФ облучением.

Практическая значимость.

На основании полученных данных о распространенности ЦМВ инфицирования среди недоношенных детей с сочетанной перинатальной патологией представлено обоснование для организации лабораторного скрининга в отделениях патологии новорожденных.

Установлено, что для достоверной диагностики ЦМВИ у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста необходимо использование БКМ и ПЦР для исследования различных биологических жидкостей (кровь и моча). Серологические методы диагностики у недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, рекомендованы для уточнения фазы течения инфекции. Показана эффективность определения авидности анти-ЦМВ.

Впервые при изучении динамики маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей в течение первого года жизни доказана необходимость проведения неоднократного вирусологического обследования до года.

У недоношенных новорожденных, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, с клиническими признаками врожденной инфекции обосновано использование Виферона с первых дней жизни.

Применение Виферона у беременных со второго триместра беременности показало возможность более ранней антенатальной коррекции иммунопатологических состояний плода и отсутствие и/или снижение количества рецидивов ГВИ у беременных с ОАГА.

Предложен новый современный метод диагностики аутопсийного материала и плацент - ПЦР in situ, позволяющий оценить количество внутриклеточной ДНК и тканевую тропность, что особенно важно в изучении патогенеза ЦМВИ.

Впервые на представительном материале в системе мать-плацента-плод выявлены основные факторы риска внутриутробного инфицирования плода, патологии и смерти в перинатальном и младенческом возрасте.

Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения.

Результаты работы стали основой ряда документов, применяющихся в практическом здравоохранении: Методические рекомендации «Быстрый культуральный метод диагностики герпесвирусных инфекций», Роспотребнадзор. - №02.030-08. - Москва, 2008. Методические рекомендации по использованию Виферона у недоношенных новорожденных с клиническими признаками ВУИ с первых дней жизни (2009, в печати).

Практические рекомендации используются в работе отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных ГБ №8 КЗ г. Москвы и ДКБ №13 им. Филатова г. Москвы.

Материалы диссертационной работы включены в курс лекций и практических занятий для студентов, клинических ординаторов и интернов кафедры клинической лабораторной диагностики РГМУ, кафедры неонатологии РГМУ, аспирантов и ординаторов НИИ педиатрии НЦЗД РАМН.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Маркеры ЦМВИ у недоношенных маловесных новорожденных с сочетанной врожденной патологией выявляются существенно чаще, чем у доношенных новорожденных. Недоношенные маловесные новорожденные являются группой риска по развитию ЦМВИ на первом году жизни, что диктует необходимость проведения неоднократного вирусологического обследования этих детей.

2. ПЦР in situ - информативный, точный и быстрый метод, открывающий новые возможности в диагностике герпесвирусных инфекций, позволяющий оценить относительное количество внутриклеточной ДНК и тропность вируса к определенным тканям при изучении отпечатков органов. Метод эффективен для диагностики и

■ изучения патогенеза инфекций, вызываемых ЦМВ и ВПГ при фетоинфантильных потерях и летальных врожденных дефектах развития. Верификация инфекционных агентов при мертворождении, при выявлении врожденных пороков развития, несовместимых с жизнью, способствует адекватной терапии женщин с мертворождениями в анамнезе и прогнозированию исходов будущих беременностей.

3. Аминокислотные производные фуллерена Сзд эффективно подавляют экспрессию поздних структурных белков ЦМВ в зараженных клетках. Синергизм Виферона с АПФ дает основание для разработки принципиально новых схем комбинированной терапии ЦМВИ, позволяющих снизить терапевтические концентрации лекарственных соединений.

4. ЦМВ увеличивает длительность S - периода в инфицированных диплоидных фибробластах легкого эмбриона человека. Клетки, находящиеся в момент заражения в

S - периоде клеточного цикла способны вступить в митоз, но необратимо блокируются в метафазе. 5. Для развития патологии митоза достаточно взаимодействия вирусной частицы с клеточной мембраной и/или проникновения вирусных белков в клетку. Синтез вирусной ДНК не является обязательным условием формирования патологических митозов.

Апробация работы.

Основные положения работы были представлены на 5 международной конференции «Русский журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы» (С.-Петербург, 2000), на Ежегодном конгрессе клинической вирусологии (Glasgow, Шотландия, 2000; Saariselka, Финляндия, 2008); на II, 12, 13 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2001; 2002; 2003); на 3 Российском научном форуме "Актуальные проблемы акушерства, гинекологии и перинатологии" (Москва, 2001), на 3 Международной конференции "Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем" (Махачкала, 2001), на 5 Международной конференции "Фуллерены и атомные кластеры" (С.-Петербург, 2002), на 8 Съезде всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002), на Международной конференции "Геном ика, протеомика и биоинформатика для медицины" (Москва, 2002), на Российском конгрессе "Генитальные инфекции и патология шейки матки" (Москва,

2004), на 3, 4 Конгрессе педиатров-инфекционистов "Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей" (Москва, 2004; 2005), на 8 Российском Форуме "Мать и дитя" (Москва,

2005), на 10, 11, 13 Конгрессе педиатров России "Актуальные проблемы педиатрии" (Москва, 2006; 2007; 2009), на Международном конгрессе «Новые технологии в медицине и экспериментальной биологии» (Pattaya-Bangkok, Таиланд, 2007), на VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007), на VI Конгрессе детских инфекционистов России "Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики" (Москва, 2007), на 111 Ежегодном конгрессе и VI Съезде Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины «Современная перинаталогия: организация, технология и качество» (Москва, 2008).

В завершенном виде доклад по диссертационной работе прошел предварительную экспертизу на совместном заседании Отдела прикладной вирусологии и иммунологии, Отдела молекулярной вирусологии и лаборатории биохимии института экспериментальной ветеринарии и Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ Учреждения РАМН НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН от 14 сентября 2009 года.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 66 научных работ, в том числе 23 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, статей за рубежом - 1, в сборниках международных конгрессов за рубежом - 3, в сборниках материалов международных конгрессов и форумов - 38.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, 6-ти глав с изложением результатов собственных исследований, их обсуждения и выводов. Работа изложена на 285 страницах текста, иллюстрирована 26 таблицами и 46 рисунками. Список цитированной литературы включает 124 отечественных и 325 иностранных источников.

Степень личного участия автора: разработка дизайна обследования беременных женщин, недоношенных новорожденных и материалов аутопсии; изучение влияния ЦМВ на пролиферативную активность клеток и антивирусной активности АПФ; организация работы на всех этапах: от определения возбудителей ВУИ различными методами до систематизации и анализа, а также статистическая обработка результатов проведены лично автором.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Культура клеток. В работе использовали диплоидные фибробласты легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ), полученные из лаборатории клеточных культур НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН и из Медико-генетического научного центра РАМН (Москва). Культуру клеток выращивали в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2мМ L-глутамина, 50мкг/мл гентамицина.

Вирус. Использовали референс штамм ЦМВ человека AD 169, любезно предоставленный доктором D. Emanuel (США). Вирус поддерживали путем пассирования на культуре клеток ФЛЭЧ. Определение инфекционной активности вируса проводили модифицированным методом «черных» бляшек. Очаги инфицированных клеток (бляшек) выявляли иммуноцитохимическим методом с использованием смеси моноклональных антител (МКА) к белкам 1Ер72 и рр65. Окрашенные бляшки идентифицировали и подсчитывали с помощью светового микроскопа. Титр вируса выражали в количестве бляшкообразующих единиц, содержащихся в 1 мл (БОЕ/мл).

Пациенты. Объектами исследования были женщины репродуктивного возраста, беременные и новорожденные дети, а также материалы аутопсии различных органов плодов, умерших новорожденных и детей, умерших на первом году жизни. Объел) исследований представлен в таблице 1. Для обследования пациентов использовали комплекс лабораторных методов: ПЦР (HCMV, HSV, Chlam.trach., Мус. gen.,Ureapl„ HPV

16/18, Neis.gon., Trich.vag.); ПЦР real time (HCMV); ПЦР in situ (HCMV; HSV); Б KM (HCMV); РИФ (HCMV, HSV, энтеровирусы: Коксаки A 23 серотипов, объединенных в 5 пулов, Коксаки В 6 серотипов (1 пул), энтеровирусы 68-71 серотипов (1 пул), краснуха, вирусы гриппа, парагриппозные вирусы 1-3 серотипов, аденовирусы, Мус. pneum., RSV, C'hlam. Pneum.); ИФА; микробиологический посев флоры, патологоанатомические исследования органов и плацент и анализ анамнестических данных матерей умерших детей.

Таблица 1.

Группы Количество обследованных Количество анализов

Ретроспективный анализ анамнестических данных матерей плодов и умерших новорожденных п=705

С крининговое обследование беременных и небеременных женщин в РИФ с поиском широкого спектра вирусных антигенов п=3796 п=18675

Исследование материалов аутопсии плодов и умерших новорожденных в РИФ с поиском широкого спектра вирусных антигенов п=650 п=9750

Исследование плацент п=181 п=665

Мониторинг включения метаболической терапии (п=260) и Виферона (п=74) в комплексное лечение беременных и небеременных женщин с ОАГА п=260 п=74 п=5980 п=1314

Комплексное обследование доношенных и недоношенных новорожденных детей (11=204), в динамике до года(п=174) п=204 п=2850

Исследование материала аутопсии плодов и детей, умерших на первом году жизни на ГВИ п=135 п=1764

Клинический материал. Объектами исследования у новорожденных служили моча, кровь, слюна и ликвор (по показаниям); в случаях смерти ребенка - отпечатки и лизаты от 3-5 органов. У беременных женщин исследовали кровь, мочу и урогенитальный соскоб.

Выявление возбудителей ВУИ в материалах аутопсии. Выявление возбудителей ВУИ в материалах аутопсии плодов и умерших новорожденных, у которых при жизни или при патологоанатомическом исследовании возникло подозрение на врожденную инфекцию, проводили четырьмя методами; иммуноцитохимическим, быстрым культуральным методом (БКМ), ПЦР и ПЦР in situ. Исследовали материалы аутопсии мозга, сердца, легких, печени, почек, селезенки, тимуса, плаценты. Детекцию антигенов энтеровирусов, краснухи, герпес вирусов, респираторных вирусов, в мазках - отпечатках органов осуществляли прямым и непрямым методом иммунофлюоресценцми (РИФ) с помощью антител, разработанных в НИИ гриппа РАМН (ООО «Предприятие по производству диагностических препаратов», Санкт-Петербург). Антигены HSV 1,2 и HCMV определяли с помощью МКА к белкам р72, ррб5 и gB HCMV, 4AI и gB HSV,

полученных ранее в лаборатории клеточной инженерии (НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва). Антигены энтеровирусов выявляли в РНИФ с помощью ПКА (ФГУП «ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН», Москва).

Быстрый культуральный метод (БКМ). Для определения инфекционной активности ЦМВ в клиническом материале использовали количественный вариант БКМ, который проводили согласно Методическим рекомендациям Роспотребнадзора №02.03008 [Москва, 2008]. Для обнаружения ЦМВ использовали МКА к белкам ЦМВ [Макарова и др., 1994]. Выявляющими антителами служили антимышиные антитела, коньюгированньге с FITC или конъюгированные с пероксидазой хрена. Подсчет окрашенных клеток проводили на 2,5x105 клеток ФЛЭЧ. Положительные результаты представляли в количестве вирусных частиц (в.ч.) на 0,2 мл клинического материала. Чувствительность БКМ соответствовала активности 5 вирусных частиц в 1 мл [Адиева и др., 2008].

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Выделение ДНК производили с помощью сертифицированных коммерческих наборов «ДНК-сорб-А-М», «ДНК-сорб-В», «ДНК-сорб-С» и «Реамикс» согласно инструкции фирмы-производителя. ПЦР в качественном варианте проводили с помощью коммерческих наборов ООО НПФ "Геитех» и ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора согласно инструкции фирмы-производителя. Исследование материалов аутопсии проводили с помощью модифицированного совместно с НПФ "Литех" nested варианта ПЦР. Чувствительность определения ДНК составила 103 молекул вирусной ДНК в 1 мл.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР real time). ДНК ЦМВ из лизированных клеток выделяли с помощью «ДНК-сорб-АМ» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. ПЦР - амплификацию проводили с применением набора реагентов для выявления ДНК цитомегаловируса человека (HCMV) в клиническом материале методом ПЦР с гибридизационно - флуоресцентной детекцией «АмплиСенс* CMV-FL» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Детекцию продуктов ПЦР - амплификации в количественном варианте осуществляли при помощи прибора «iQ iCycler» (Bio-Rad, США), согласно рекомендации производителя тест-систем.

Полимеразная цепная реакция in situ (ПЦР in situ). Метод ПЦР in situ был модифицирован и использован для анализа фиксированных препаратов-отпечатков материалов аутопсии и препаратов монослойных культур клеток. В качестве положительных контролей использовали зараженные клетки ФЛЭЧ и Vero. В работе были использованы праймеры, направленные к гену ДНК-полимеразы ВПГ и к консервативному сверхраннему региону ЦМВ. Визуализацию проводили с помощью светового микроскопа. В препаратах от пациентов, инфицированных ВПГ и ЦМВ, наблюдались темно-коричневые точки - метки на поверхности или внутри клеток. Далее

подсчитывали количество клеток, содержащих метку, и общее количество клеток на препарате.

Твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА). Определение антител к ЦМВ классов М и G в сыворотке крови проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА), используя коммерческие тест-системы НПО «Диагностические системы» (Нижний Новгород). Для выявления антител класса IgM использовали тест-систему «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-М», для выявления антител класса IgG «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G. Анализ и интерпретацию результатов осуществляли в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

Авидность антител. Индекс авидности (ИА) специфических IgG к ЦМВ в сыворотке крови определяли с помощью тест-систем «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G Авидность» (НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород). Оценку результатов осуществляли в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ). Клетки ФЛЭЧ, неинфпцированные и инфицированные ЦМВ, промывали 0,1 М фосфатно-солевым буфером pH 7,4 и фиксировали. Использовали различные способы фиксации в зависимости от поставленных задач: для анализа препаратов при пероксидазном окрашивании фиксировали абсолютным метанолом в течение! 0 мин при -20°С; для РНИФ - охлажденным ацетоном в течениеЮ мин при +4°С; для анализа морфологии клеток - 3% параформальдегидом на фосфатном буфере в течение15 мин при комнатной температуре с последующей обработкой 0,1% раствором Тритона Х-100 на буфере PBS в течение 8 мин.

На фиксированные препараты наносили моноклональные антитела (МКА) и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Затем клетки промывали буфером PBS и инкубировали с антителами, конъюгированными с флуорохромом ФИТЦ в течение 30 минут при 37°С, с пероксидазой хрена - в течение 1 часа при 37°С (DakoCytomation, Дания). Для окраски хроматина ядер использовали флуорохром DAPI в концентрации 1мкг/мл. После окраски стекла заключали в глицерин или в мовиол. Препараты анализировали с помощью флюоресцентного/светового микроскопа Olympus ВХ - 51 (Япония), оснащенного объективами 4х, 1 Ох, 40х и цифровой камерой Olympus U-CMAD3.

Интерфероновый статус. Изучение интерферонового статуса проводили в лаборатории онтогенеза и коррекции системы интерферона НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (зав. лаб. - д.б.н., проф. В.В. Малиновская). Концентрации альфа-ИФН и гамма-ИФН определяли методом твердофазного ИФА. Для альфа-ИФН использовали тест-систему производства ООО «Протеиновый контур» (С.Петербург, Россия), для тестирования гамма-ИФН применяли набор реагентов Biosource

№N0 (Бельгия). В качестве индукторов использовали: для альфа-ИФН - вирус болезни Ньюкасла (ВБН), для гамма-ИФН - ФГА. Чувствительность тест-систем для иммуноферментного определения альфа-ИФН составляла 5 пкг/мл, для определения гамма-ИФН - 3 пкг/мл.

Определение цитотоксичности производных фуллерена. Цитотоксичность определяли по влиянию на жизнеспособность клеток ФЛЭЧ, которую оценивали методом исключения витального красителя трепанового синего. Цитотоксичность (ЦД) характеризовали как концентрацию каждого из тестируемых соединений, вызывающую гибель подавляющего большинства клеток или 50% клеток в популяции (ЦД95 и ЦДзо, соответственно) на 4-е сутки после внесения АПФ - так называемая хроническая цитотоксичность или (ЦД50). Определяли также концентрацию, вызывающую гибель 50% клеток в течение 24 часов, соответствующую острой цитотоксичности (ОДД50).

Пролиферативная активность клеток ФЛЭЧ в присутствии АПФ. Влияние АПФ на репликацию ДНК ФЛЭЧ анализировали методом радиоавтографии. Клетки ФЛЭЧ вносили в 24-луночные панели в низкой концентрации (6х104кл./мл). На следующий день после посадки вносили АПФ в различных концентрациях. Через 24, 48 и 72 часа инкубации вносили в культуральную жидкость радиоактивно меченый тимидин (3Н-ТД). За 50%-ую ингибируюшую дозу (ИД5о) принимали концентрацию препарата, вызывающую 50% подавление включения радиоактивного тимидина в ДНК клеток.

Определение антивирусной активности АПФ. Для определения анти-ЦМВ активности использовали три схемы воздействия АПФ: лечебную, профилактическую и вирулицидную.

Лечебная схема. Монослой клеток заражали вирусом с различной множественностью инфицирования (1,0 БОЕ/кл. - 0,001 БОЕ/кл). После адсорбции в течение 1 часа при'ОТдважды промывали и вносили поддерживающую среду, содержащую 2% сыворотки и аминопроизводные фуллерена в различных концентрациях.

Профилактическая схема. На клеточный монослой вносили среду поддержки, содержащую АПФ в различных концентрациях, и инкубировали в течение 24 часов. После обработки клетки дважды промывали и заражали вирусом с различной множественностью инфицирования (1,0 БОЕ/кл. - 0,001 БОЕ/кл) в течение 1 часа при 37°С. Монослой клеток дважды промывали и вносили среду поддержки.

Вирулицидная схема. Вирус с МИ 0,01 БОЕ/кл инкубировали совместно с АПФ в различных концентрациях в течение 1 часа при 37°С. Затем вирус, инкубированный с АПФ, наносили на монослой клеток и выдерживали в течение 1 часа. Монослой клеток дважды промывали и вносили среду поддержки.

Антивирусную активность во всех схемах оценивали по способности ЦМВ к бляшкообразованию и по цитопатогенному действию вируса (ЦПД). Концентрацию вещества, вызывающую подавление ЦПД вируса на 50% по отношению к контролю, принимали за 50%-ую эффективную дозу (ЭД50). ХТИ или индекс селективности (ИС), рассчитывали как отношение концентрации препарата, вызывающей клеточную деструкцию (ЦД50) или снижающую синтез клеточной ДНК на 50% (ИД50), к концентрации, вызывающей 50% антивирусный эффект (ЭД50).

Определение продукции инфекцномно активного вируса. Для определения влияния АПФ на репродукцию ЦМВ клетки заражали вирусом с МИ 0,1 БОЕ/кл. и 0,01 БОЕ/кл. После адсорбции вносили АПФ в различных концентрациях. При развитии в контроле (без АПФ) 100%-ого ЦПД отбирали культуральную среду из опытных и контрольных культур и заражали неинфицированные клетки ФЛЭЧ, которые культивировали в среде Игла с 2% сыворотки без АПФ. Об активности вируса судили по цитопатогенному действию в динамике инфекционного процесса.

Изучение динамики накопления ДНК ЦМВ методом ПЦР в реальном времени. Монослой ФЛЭЧ заражали ЦМВ с МИ 0,01 БОЕ/кл. После адсорбции вируса вносили изучаемые вещества в соответствующей концентрации. На 4, 7 и 10-е сутки осадок клеток обрабатывали лизируюшим буферным раствором и исследовали методом ПЦР real-time.

Радиоавтография. В клетки ФЛЭЧ, выращенные на покровных стеклах в 24-луночных панелях, вносили радиоактивно меченый 3Н-ТД на 1 час в концентрации 1 мкКю/мл для включения в реплицирующуюся ДНК. Фиксацию проводили через различные интервалы времени смесью этилового спирта и концентрированной уксусной кислоты в соотношении 3:1 в течение 40 минут. Затем стекла с клетками обрабатывали холодной 5% трихлоруксусной кислотой 3 раза в течение 5-10 минут для удаления невключившегося предшественника и промывали водой. После высушивания на воздухе покровные стекла монтировали на предметные стекла клетками вверх. Все препараты с радиоактивной меткой покрывали фотоэмульсией типа М (НИИ химфотопроект, Москва) и экспонировали в течение 6-7 дней в темноте. Проявляли амидоловым проявителем и окрашивали гематоксилином Карацци.

Статистическая обработка. Для статистической обработки полученных результатов использовали пакет программ Statistika V6.0. Статистическую значимость межгрупповых различий оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни, Вилкоксона и по t-критерию для независимых выборок с неравными дисперсиями. Анализ различия частот встречаемости маркеров ГВИ в группах пациентов проводили с помощью точного критерия Фишера и Хи-квадрат. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Для изучения перинатальных факторов риска инфицирования плода, патологии и смерти в перинатальном и младенческом возрасте был проведен ретроспективный анализ анамнестических данных матерей 705 плодов и умерших новорожденных. Было установлено, что всего 35% матерей считали себя практически здоровыми. Даже среди матерей до 20 лет, где были и подростки, здоровых было только 51,2%. С увеличением возраста матерей количество здоровых снижалось, и уже в возрасте от 25 до 30 лет их оказалось достоверно меньше (40%; р<0,001), чем среди молодых матерей (до 20 лет), а среди женщин старше 30 лет здоровыми себя считали только 20,9%. Подавляющее большинство имели те или иные хронические болезни, среди которых наиболее частыми были болезни мочеполовой системы.

У большинства матерей умерших был ОАГА. В анамнезе у женщин было отмечено большое количество искусственного прерывания беременности. Даже у женщин до 20 лет их количество составило 12,8%. С увеличением возраста женщин количество искусственного прерывания беременности значительно увеличивалось, и у женщин старше 30 лет их количество достигло 69,6% (по 2 и более раз). Кроме искусственного прерывания беременности в анамнезе отмечались выкидыши, мертворождения, замершая беременность, смерть ребенка в раннем неонатальном периоде, в том числе и у женщин моложе 20 лет. Настоящая беременность и роды независимо от возраста практически у всех (94%о) протекали с обострением хронических болезней, с острыми респираторными заболеваниями, с различными осложнениями (анемия, угроза прерывания часто на протяжении всей беременности, маловодие, многоводие, длительный безводный промежуток, слабость родовой деятельности, стремительные роды), которые могли стать причиной острой или хронической гипоксии плода. В подавляющем большинстве случаев женщины не проходили предгравидарную подготовку.

Скрининговое вирусологическое исследование 3796 небеременных и беременных женщин показало значительную инфицированность различными возбудителями, в том числе герпесвирусными инфекциями. Клетки осадка мочи исследовали на наличие антигенов вирусов Коксаки А, В, энтеровирусов 68-71 типов, ВПГ 1 и 2 типов, ЦМВ и краснухи в РИФ. Установлено, что в клетках осадка мочи у женщин выявляется смешанная вирусная инфекция. Одним из компонентов смешанной инфекции является один, а чаще всего два и более энтеровирусов. Энтеровнрусы были выявлены до 90% случаев (в том числе, антигены Коксаки В - в 38% случаев, антигены энтеровирусов 6871 серотипов - у 40%), антигены вируса краснухи были обнаружены у 19-23% обследованных. Частота определения антигенов ВПГ составила 11-13%. В 7,8% случаев в обеих группах была выявлена папиломавирусная инфекция, ВПЧ преимущественно 16

типа. Важно отметить, что ЦМВ был обнаружен в 19,1% случаев у небеременных женщин и значительно чаще у беременных женщин (26,2%; р=0,001).

При гистологическом исследовании 150 плацент как мертворожденных, так и 31 последа при рождении живых новорожденных то или иное поражение плаценты и/или пуповины выявлено в 100% случаев. Чаще всего выявлялась гипоплазия плаценты (79%), в 51,3% - морфологическая незрелость; в том числе в 76% случаев - патологическая незрелость. Кроме того, выявлены преждевременное старение плаценты, кровоизлияния, тромбоз сосудов, флебит пупочной вены, краевое прикрепление, абсолютно короткая или длинная пуповина, тощая пуповина, хроническая фетоплацентарная недостаточность.

В плаценте и пуповине выявлялись различные воспалительные изменения (базальный и париетальный децидуит, интервиллузит, хориоамнионит, фуникулит, мембранит), которые достоверно чаще отмечались в случаях преждевременных родов, чем при родах в срок (68,6% и 39,4%, р<0,001).

Изменения в плаценте имели как альтеративно-продуктивный, так и гнойный характер, в ряде случаев с некрозом. Некротические изменения возникали при инфицировании плаценты вирусными и бактериальными агентами. При выборочном исследовании методом ПЦР 34 плацент от мертворожденных и 30 плацент от живорожденных ДНК ЦМВ была выявлена в 14 случаях у мертворожденных и в 1 случае от живорожденных. ДНК ВПГ была выявлена в 10 случаях у мертворожденных и ни в одном случае у живорожденных.

Одним из косвенных показателей внутриутробного инфицирования являются различные изменения в тимусе. Изучение частоты выявленных изменений в тимусе у доношенных и недоношенных плодов и детей, умерших на первом году жизни показало, что частота изменений в тимусе зависит от срока гестации. У доношенных плодов частота выявленных изменений в тимусе была в два раза больше (66,7% и 32,4%; р<0,001), чем у недоношенных вследствие более длительной антигенной стимуляции в антенатальном периоде. С увеличением возраста количество умерших с наличием изменений в тимусе увеличивается. У умерших на первом году жизни частота выявленных изменений в тимусе у доношенных и недоношенных была практически одинаковой (89,5% и 80,3%). При выборочном вирусологическом исследовании отпечатков тимуса 60 умерших в 48 (80%) были выявлены антигены различных вирусов, в том числе ЦМВ - в 9 (15%) случаях, ВПГ - в 4 случаях, что составило 6,7%.

После проведения патологоанатомических исследований ВУИ была диагностирована у 69,2% умерших в пери - и неонатальном периодах и у 53,5% умерших на первом году жизни. ВУИ носила характер как острого инфекционного заболевания, клинически протекающего как менингоэнцефалит, пневмония, миокардит, гепатит, панкреатит, так и

имела хроническое перснстирующее течение с формированием множественных эмбриофетодисплазий, стигм дизэмбриогенеза и пороков развития. Острое течение ВУИ в период новорожденное™ отмечалось в 13,1% случаев. При этом у недоношенных остро текущий инфекционный процесс был отмечен в 20% случаев, а у доношенных в 3% (р<0,001). У умерших на первом году жизни в подавляющем большинстве случаев инфекция имела хронический персистирующий характер без выраженных воспалительных изменений.

Таким образом, значительное ухудшение состояния женщин с возрастом, многочисленные аборты, отсутствие предгравидарной подготовки и инфекционные заболевания, в числе которых ЦМВИ занимает существенное место, являются факторами риска перинатального инфицирования плода, патологии и смерти в перинатальном и младенческом возрасте. Вышеперечисленные факторы приводят к хроническому кислородному голоданию, обострению эндогенной инфекции, поражению плаценты, развитию хронической фетоплацентарной недостаточности и инфицированию плода и к преждевременным родам.

Разработка алгоритма диагностики ЦМВИ у новорожденных детей с осложненным течением раннего неонатального периода. Недоношенные новорожденные представляют особую группу риска по развитию внутриутробной ЦМВИ, однако до настоящего времени нет общепринятого алгоритма диагностики ЦМВИ у новорожденных детей с признаками ВУИ. В связи с этим были обследованы 204 новорожденных ребенка, родившихся в ГБ №8 Департамента здравоохранения города Москвы. Обследованные дети были разделены на 4 группы: первую группу (группа 1) составили недоношенные новорожденные (п= 107) с гестационным возрастом (ГВ) 29,8±2,8 недель с клиническими признаками ВУИ. Во вторую группу были включены недоношенные новорожденные дети без клинических признаков ВУИ (18 детей, ГВ - 34,6±1,2 недель). Контрольную группу (группа 3) составили доношенные новорожденные дети без признаков ВУИ (32 ребенка, ГВ -38,9±0,8 недель). Анализ частоты выявления маркеров ЦМВ у детей у детей первых трех групп был проведен в первую неделю жизни. Четвертую группу составили 47 детей с признаками ВУИ, впервые обследованные в возрасте 1-3 месяцев. Ребенка рассматривали как инфицированного, если маркеры ЦМВИ были обнаружены, по крайней мере, в одном из полученных от него образцов клинического материала. Данные по частоте выявления маркеров ЦМВИ приведены в таблице 2.

Анализ показал, что ДНК ЦМВ была выявлена во всех группах, в том числе доношенных и недоношенных новорожденных без признаков ВУИ. Наиболее часто ДНК ЦМВ выявлялась в 4-й группе, даже значительно чаще (р<0,001), чем у новорожденных с ВУИ, обследованных на первой неделе жизни.

Таблица 2. Выявление прямых маркеров ЦМВИу новорожденных детей.

Группы детей ДНК (ПЦР) Инфекционно активный вирус (БКМ)

группа 1 недоношенные с ВУИ (п=107) 17(15,9%) 18(16,8%)

группа 2 недоношенные без ВУИ (п=18) 1 (5,6%) 0 (0%)

группа 3 доношенные (п=32) 2 (6,3%) 0 (0%)

группа 4 дополнительная (п=47) 22 (46,8%) 14 (29,7%)

Инфекциоино активный вирус был выявлен только у детей с ВУИ и ни в одном случае во 2 и 3 группах. Более частое выявление ДНК и инфекционно активного вируса в 4 группе может свидетельствовать об обострении врожденной инфекции или о постнатальном инфицировании.

Если учитывать результаты обследования двумя методами, то ДНК и/или инфекционно активный вирус у новорожденных с ВУИ, обследованных на первой неделе жизни, был выявлен у 28 из 107 обследованных (26,2%), то есть на 9-10% чаще, чем каждым методом отдельно. Таким образом, обследование двумя метода повышает эффективность лабораторной диагностики.

При анализе выявления маркеров ЦМВИ в различных биологических средах было установлено, что наиболее часто инфекционно активный ЦМВ выявлялся в моче (14,5%), а в крови только в 1 % случаев. ДНК ЦМВ в моче выявлялась в 18,7%, и несколько реже -в крови 13,3%. Суммарно тем или другим методом в моче ЦМВ обнаружен в 41% случаев, в слюне - в 27%, в крови и в ликворе у 14-18% детей с признаками ВУИ. Наши данные согласуются с результатами других исследователей, которые показали, что в моче ЦМВ обнаруживается в количествах в 180 раз больших, чем в крови [Halwachs-Baumann G., 2002]. В целом ДНК ЦМВ выявлялась в 12,4% (88 / 710), а инфекционно активный вирус -в 7,3%) (52 /710). Выявленные различий достоверны (р=0,003).

Данные количественного изучения ЦМВ во всех положительных образцах показали,

что большая часть образцов, в которых был обнаружен инфекционно активный ЦМВ,

содержали по 10-50 вирусных частиц; максимальные значения достигали 5000 вирусных

частиц. Это свидетельствует о большой вирусной нагрузке при инфицировании

недоношенных новорожденных. Сходная тенденция была выявлена в результате анализа

ДНК. У детей с признаками ВУИ вирусная нагрузка и инфекционная активность ЦМВ

были достоверно выше по сравнению с контрольной группой. Прямая корреляция между

величиной вирусной нагрузки и интенсивностью клинических симптомов при врожденной

ЦМВИ была недавно установлена в работе исследователей США [Arav-Boger R., Pass R., 2007].

Для выяснения связи между данными БКМ и ПЦР был проведен анализ относительного количества ДНК в клинических образцах методом ПЦР - RT. Вычисляли значение порогового цикла Ct для каждого образца путем определения точки, при которой флюоресценция превышала фоновое значение; затем сравнивали результаты для проб, в которых с помощью БКМ была обнаружен инфекционно активный ЦМВ, с результатами для проб, отрицательных по БКМ. Анализ показал, что в образцах, положительных по данным БКМ, вирусная нагрузка была достоверно больше, чем в пробах, отрицательных по результатам БКМ. Данные настоящей работы совпадают с результатами исследователей, изучавших прямые маркеры герпесвирусных инфекций методами ПЦР -RT и БКМ [J.van Doornum G., 2003].

Изучение показателей специфического гуморального иммунитета у новорожденных детей (выявление антител классов IgG и IgM и определение индекса авидности специфических антител) представлено в таблице 3.

Таблица 3. Результаты обследования новорожденных детей с помощью серологических методов.

Выявление Выявление Авидиость аити-ЦМВ-IgG-AT

Группы детей анти-ЦМВ анти-ЦМВ (ИА)

IgM-AT IgG-AT <0,6 >0,6

1-я 0,93% 91,6% 38,6% 61,4%

(основная) (1/107) (98/107) (32/83*) (51/83*)

2-я 0% 83,3% 33,3% 66,7%

(сравнения) (0/18) (15/18) (5/15*) (10/15*)

3-я 0% 90,6% 13,8% 86,2%

(контрольная) (0/32) (29/32) (4/29*) (25/29*)

4-я 23,4% 80,9% 33,3% 66,7%

(дополнительная) (11/47) (38/47) (12/36*) (24/36*)

* авидность определяли только у детей, у которых было достаточно материала и в сыворотках крови которых были выявлены АТ к ЦМВ класса 1°С;

Анализ показал, что у подавляющего большинства детей всех групп присутствовали антитела класса IgG. У 1 ребенка из основной группы на первой неделе жизни были идентифицированы маркеры острого инфекционного процесса - антп-ЦМВ-IgM. Невысокая частота выявления анти-ЦМВ класса IgM у новорожденных детей отмечалась и другими авторами [Nelson et.al., 1997]. В 4-й группе (впервые обследованные в 1-3 мес.) показатель частоты выявления анти-ЦМВ IgM составил 23,4% (р<0,001). Важно отметить, что у 9 из 11 детей с анти-ЦМВ-IgM антитела класса G отсутствовали, но были выявлены ДНК и инфекционно активный вирус.

Оценка авидности IgG-AT показала, что у большинства обследованных во всех группах были выявлены высокоавидные AT. Антитела с низким или промежуточным значением ИА выявлялись практически с одинаковой частотой у детей с ВУИ и в группах сравнения. В контрольной группе была отмечена наиболее низкая частота выявления низкоавидных антител (13,8%; р=0,026). Необходимо отметить, что у 65,4% детей с ВУИ, в крови которых AT класса IgG отсутствовали, либо обладали ИА<0,6, были выявлены прямые маркеры ЦМВ.

При количественном анализе IgG анти-ЦМВ в группе детей с признаками инфицирования (группа I и 4) выявлялись антитела с низкой концентрацией достоверно чаще, чем в группах без ВУИ (р<0,05).

Анализ прямых и непрямых маркеров ЦМВИ (рис. 1) при оценке риска развития инфекционного процесса у новорожденных детей показал, что в группе инфицированных детей ДНК и инфекционно активный вирус выявляются в больших количествах, антитела IgG - в низкой концентрации и с низким индексом авидности. У детей без признаков инфицирования инфекционный вирус не выявляется, ДНК вируса обнаруживается в низких количествах и в небольшом проценте случаев (5-6%). IgG антитела характеризуются высокой концентрацией и ИА>60.

Наличие низких концентраций материнских типоспецифических нейтрализующих антител у новорожденных детей увеличивает риск постнатального инфицирования ребенка [Hill J. and Roberts S., 2005]. Необходимо учитывать, что у недоношенных новорожденных детей доля антител, обладающих нейтрализующими свойствами, зависит от гестационного возраста. Так, только к 34-й неделе гестации 99% нейтрализующих материнских антител обнаруживаются в периферической крови плода [Karen et.al., 2006]. Это указывает на то, что специфическая диагностика ЦМВИ при оценке риска развития активного инфекционного процесса у новорожденных детей, особенно у недоношенных, требует использования комплекса лабораторных методов.

Изучение маркеров в динамике показало, что через 1-3 месяца после рождения у 19,2%, отрицательных при первичном обследовании, вирус был обнаружен впервые, а через 4-7 мес. еще у 11,5% детей, отрицательных по ЦМВ при рождении впервые появились прямые маркеры ЦМВИ. Эти данные свидетельствуют о том, что для достоверной диагностики ЦМВИ необходимо неоднократное обследование.

Таким образом, на первом году жизни у недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ в 65,4% случаев в разные сроки были выявлены прямые маркеры ЦМВИ, что согласуется с результатами других исследований [Maschmann et.al., 2001; Меджидова и др., 2005], подтверждающими высокий риск развития ЦМВИ у этой группы новорожденных детей. Следует отметить, что в целом при повторных исследованиях количество вирусной нагрузки увеличивалось. Это может быть связано с инфицированием в неонатальном периоде при вскармливании грудным молоком

[Lawrence et.al, 2006], а также с отсроченным проявлением внутриутробной бессимптомной ЦМВИ, которое отмечалось рядом авторов [Barbi et.al., 2003; Maligner et.al., 2003].

Частота выявления серологических показателей и вирусных маркеров в динамике у 75 недоношенных детей с ВУИ из 1-й группы представлена на рисунке 2.

Изучение маркеров в динамике показало прямую корреляцию между обнаружением или отсутствием ЦМВ и серологическими показателями. При активации ЦМВИ в 68,4% случаев при повторном исследовании происходило либо выведение высокоавидных (по всей видимости, материнских IgG-AT), появление собственных низкоавидных IgG-AT с ИА<0,6 (52,6%), либо резкое снижение активности IgG-AT и выявление анти-ЦМВ IgM (15,8%). Это и могло служить основной причиной обнаружения ЦМВ в клинических материалах и развития ЦМВИ при последующих исследованиях. В 75% случаев элиминация вируса сопровождалась появлением собственных анти-ЦМВ IgG или сменой низкоавидных IgG-AT (50%) на высокоавидные или повышением активности IgG антител в несколько раз (25%).

Известно, что иизкоавидные антитела циркулируют в периферической крови приблизительно в течение 20 недель после первичной инфекции, затем авидность IgG-AT увеличивается и остается высокой в течение всей жизни [Lazzarotto Т., 2008].

За время проведения исследования в 1-й группе отмечено 12 летальных исходов (11,2%); при этом у 7 из 12 детей (58,3%) были выявлены прямые маркеры ЦМВИ. В контрольной группе летальных исходов не было.

Для анализа частоты выявления ЦМВИ в различных органах было исследовано 147 органов от 47 мертворожденных и 252 органа от 88 умерших, умерших на первом году жизни. Патологоанатомические исследования проводились сотрудниками кафедры патологической анатомии (зав. кафедрой - д.м.н., проф. Талалаев А.Г.) и патологоанатомами прозектуры Морозовской больницы (зав. отделением - Каск Л.Н.). Данные представлены в таблице 4.

При патологоанатомическом исследовании у умерших были выявлены признаки врожденной генерализованной вирусной инфекции, которая проявлялась как различными воспалительными изменениями (менингит, энцефалит, гепатит, миокардит, пневмония и др.), так и фетодиспластическими изменениями и/или с пороками развития органов. Анализ показал, что ЦМВ выявляется практически во всех исследованных органах: легкие, сердце, печень, почки, мозг. При этом в материалах аутопсии обнаружены как ДНК вируса (ПЦР), так антигены (РНИФ) и инфекционно активный ЦМВ (БКМ).

Таблица 4. Выявление ЦМВ в различных органах у мертворожденных и детей, умерших в течение первого года жизни.

Изученные органы Мертворожденные Дети, умершие на первом году жизни

Общее число проб (П) Число положительных проб Р Общее число проб (п) Число положительных проб

мозг 41 9 (21,9%) р=0,33 61 20 (32,8%)

печень 37 7(18,9%) р<0,02 55 25 (45,5%)

легкое 33 5 (15,2%) р<0,0001 48 44 (91,6%)

почка 27 7 (25,9%) р<0,03 43 24 (55,8%)

сердце 9 1 (11,1%) р=0,87 45 9 (20,0%)

Всего 147 29 (19,7%) р<0,0001 252 122 (48,4%)

В целом у умерших на первом году жизни маркеры ЦМВ обнаруживались значительно чаще, чем у мертворожденных (48,4% против 19,7%, р<0,0001), в том числе и инфекционно активный вирус (р<0,05). Если говорить о суммарном выявлении прямых маркеров ЦМВИ хотя бы одним из методов в любом из исследованных органов, то у детей, умерших на первом году жизни ЦМВ был обнаружен в 61,5% случаев, в случаях мертворождения - в 35,4% случаев.

Более частое выявление ЦМВ в материалах аутопсии детей, умерших на первом году жизни, может свидетельствовать о реактивации врожденной инфекции (учитывая положительные результаты быстрого культурального метода, который позволяет выявить инфекционно активный вирус). Но при этом нельзя исключить и факт постнатального инфицирования.

Проведенное вирусологическое исследование отпечатков органов мертворожденных и плацент с использованием сывороток к широкому спектру антигенов показало совпадение частоты выявления одних и тех же возбудителей в 82% случаев. При параллельном исследовании отпечатков органов умерших и клеток осадка мочи их матерей вскоре после мертворождения или смерти ребенка в раннем неонатальном периоде ВПГ и ЦМВ существенно чаще (р=0,002) выявлялись у плодов и умерших в течение первых суток новорожденных, чем в клетках осадка мочи их матерей, что может свидетельствовать об активном инфекционном процессе в организме плода.

Выявленные изменения в тканях и органах плодов и умерших детей в подавляющем большинстве случаев являются следствием ассоциированного (одновременного или последовательного) инфицирования различными возбудителями в разные сроки гестации.

В подавляющем большинстве случаев у плодов и умерших новорожденных выявлялась смешанная вирусная инфекция.

Если учитывать только результаты выявления герпесвирусных инфекций, то смешанная ВПГ и ЦМВ инфекция одновременно у мертворожденных была выявлена в 45,4%, тогда как, у умерших на первом году жизни в 86%. То есть частота смешанной ВПГ и ЦМВ инфекции с увеличением возраста умерших детей существенно возрастает (р=0,001).

Нами был впервые использован метод ПЦР in situ для выявления ЦМВ в отпечатках органов. Метод ПЦР in situ был разработан на основе двух методов - метода полимеразной цепной реакции и метода гибридизации in situ и сочетал в себе их достоинства: высокую чувствительность с возможностью морфологического исследования. Сравнительный анализ эффективности различных лабораторных методов показал, что метод ПЦР in situ обладает не меньшей чувствительностью по сравнению с классическим методом ПЦР. Анализ количества инфицированных клеток в препаратах методом ПЦР in situ показал, что наиболее интенсивно накопление ДНК ЦМВ происходит в тканях мозга и почек.

Таким образом, для повышения эффективности диагностики врожденной ЦМВИ и прогноза ее развития у недоношенных новорожденных детей необходимо использовать комплекс методов, в том числе определение авидности анти-ЦМВ; при вирусологическом обследовании недоношенных детей с признаками ВУИ недостаточно однократного изучения клинических материалов на первой неделе жизни. У большинства новорожденных ЦМВ элиминировал к 1-3 мес. жизни; в ряде случаев вирус впервые обнаруживался лишь через 1-3 мес. после рождения или в возрасте 4-7 мес. Предпочтительным объектом скринингового исследования для диагностики внутриутробной ЦМВИ является моча, в которой вирус накапливается чаще всего и в больших количествах, чем в других клинических материалах; выявление высокоавидных антител к ЦМВ имеет положительное прогностическое значение, так как у большинства обследованных детей в динамике оно сопровождалось отсутствием выявления прямых маркеров ЦМВ. Отсутствие анти-ЦМВ или присутствие низкоавидных антител к ЦМВ имеют отрицательное прогностическое значение, так как ассоциируются с появлением маркеров ЦМВ через 1-6 месяцев после рождения; метод ПЦР in situ обладает не меньшей чувствительностью по сравнению с классическим методом ПЦР и позволяет оценить не только интенсивность синтеза вирусной ДИК, но также выявить индивидуальную внутритканевую и внутриклеточную локализацию вирусов.

С учетом вышеизложенного, предлагается следующий алгоритм лабораторного обследования недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ и материала аутопсии плодов и умерших детей:

- анализ мочи на 1-й неделе жизни (до 3 недель жизни) методом БКМ для выявления внутриутробной ЦМВИ;

- исследование клинических материалов в динамике через 1, 3 и 6-7 месяцев после рождения для установления возможной реактивации ЦМВИ и развития инфекции у недоношенных новорожденных детей с ВУИ;

- определение активности и авидности специфических антител класса IgG в совокупности с определением прямых маркеров ЦМВ для оценки риска развития активного инфекционного процесса у новорожденных детей;

- при обнаружении ЦМВ в клинических материалах БКМ в количествах, превышающих по инфекционной активности 10-50 и более вирусных частиц в 1 мл, оценивать необходимость использования терапевтических средств;

- использование молекулярно-биологических методов, основанных на выявлении ДНК (ПЦР и ПЦР in situ) для установления этиологического агента и изучения патогенеза ЦМВИ в материалах аутопсии.

В 76,5% случаев у недоношенных детей с подозрением на ВУИ диагноз был подтвержден на первой неделе жизни. При этом ВУИ вирусной этиологии встречалась значительно чаще, чем бактериальной (34,6% против 18,5%). У недоношенных новорожденных с клиническими признаками ВУИ показатели индуцированной продукции альфа-ИФН и гамма-ИФН значительно варьировали и потому особый интерес представлял вопрос о влиянии лечения Вифероном на интерфероновый статус недоношенных новорожденных с признаками ВУИ при рождении (Рис.3).

Анализ уровней ИФН-альфа и ИФН-гамма до лечения и через 1 - 2 месяца после лечения был проведен при обследовании 30 детей. Было установлено, что уровни сывороточного и спонтанного альфа-ИФН были низкими и не различались до и после лечения (медианы 5 пкг/мл).

В связи с высокой вариабельностью значений индуцированного альфа-ИФН дети данной группы были разделены на 2 подгруппы: в подгруппу 1А (п=13) вошли дети с исходно высоким уровнем (>100 пкг/мл) индуцированного альфа-ИНФ, в подгруппу 1Б (п=17) - с низким уровнем цитокина (<100 пкг/мл) до лечения.

Количественный анализ альфа-ИНФ показал, что в подгруппе 1А в результате базового лечения с применением Виферона уровень альфа-ИНФ снижался в 4 раза. В подгруппе 1Б выявлено увеличение уровня индуцированного альфа-ИНФ, который приближался к уровню в контрольной группе. У детей без Виферона уровни альфа-ИНФ

РИС. 1. Частота выявления прямых и непрямых маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных.

100 90

г 80

[70

I 60

I 50 £ 40

5 зо

5 20 5

0 10 0

0,7 - 4,5 Ед/мл

ИА< 0.6

I I

инфек. вирус ДНК

■ новорожденные без ВУИ

конц. авидность 1§б

новорожденные с ВУИ

РИС. 2. Динамика выявления серологических маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей.

РИС. 3. Изменение уровня индуцированного альфа-ИФН у новорожденных детей с клиническими признаками БУИ в результате базового лечения с применением Вифероиа.

Подгруппа 1А Подгруппа 1Б Подгруппа 1В Контроль

■ до лечения через 1-2 мес. после лечения

По вертикали - значения медианы альфа-ИФН, пкг/мл; По горизонтали - недоношенные новорожденные дети с ВУИ: подгруппа А - дети с исходно высоким уровнем альфа-ИФН, получавшие базовое лечение с Вифероном; подгруппа Б - дети с исходно низким уровнем альфа-ИФН, получавшие базовое лечение с Вифероном; подгруппа В - дети, получавшие базовое лечение без Виферона; контроль - здоровые доношенные дети.

РИС. 4. Частота обнаружения маркеров ГВИу беременных женщина на различных сроках беременности.

12-16 нед.

26-32 нед.

37-39 нед. гестации

I суммарное выявление маркеров ГВИ первичное выявление маркеров ГВИ

РИС. 5. Динамика выявления белка в ЦМВ-инфицированных фибр облает ах человека в присутствии различных химиопрепаратов.

число клеток, окрашенных МКА, %

• / ' 'I

' ' > ■ > -- /У'.

I ' «. ¡о».. V

>. ' '

' ' ■ л?

у ./>» ✓

* ' " ь» '

Клетки окрашены МКА к белку gB ЦМВ: а - контроль инфицированных клеток без АПФ; б - инфицированные клетки, культивированные в присутствии АПФ.

РИС.6. Включение ЗН - тимидина в ядра клеток ФЛЭЧ, инфицированных в периоде.

РИС. 7. Включение ЗН - тимидина в ядра клеток ФЛЭЧ, инфицированных в Б - периоде.

РИС. 8. Митотический индекс в культуре клеток ФЛЭЧ, инфицированных в Б - периоде клеточного цикла.

-неинфицированная культура инфицированная культура

■ норм.митозы в инфиц. культуре — патолог, митозы в инфиц. культуре

время после стимуляции из СО, часы

■контрольная культура ^^""инфицированная культура

О 6 12 18 24 30 36 42 54 60----------96 ----- 102

0 12 18 24 30 36 42 48---------------102

яремя после пмхопа пч О

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

фактически не изменялись. Полученные данные свидетельствуют об иммунокорригирующем действии Виферона. Оно проявлялось в разнонаправленном изменении уровней индуцированной продукции альфа-ИФН лейкоцитами недоношенных детей.

Результаты повторного обследования детей представлены в таблице 5.

Таблица 5. Результаты повторного исследования биологических сред у детей методом БКМ на ЦМВ и ВПГ.

Базисная терапия + Виферон Базисная терапия

Элиминация вирусов 38,5% 23,1%

Снижение кол-ва ЦМВ и ВПГ 30,8% -

Прежнее кол-во ЦМВ и ВПГ 30,7% 76,9%

Положительная динамика 69,3% 23,1%

Исследование показало, что при применении базисной терапии элиминация вирусов отмечена в 23,1%, а при включении Виферона - в 38,5%. В целом, при использовании Виферона в 69,3% случаев у недоношенных детей обнаружена положительная динамика (снижение количества инфекционного вируса или его элиминация), тогда как при базисной терапии - только в 23,1% случаев.

Совместно с д.м.н., проф. Дегтяревой М.В. для оценки эффективности действия Виферона дополнительно были обследованы две группы детей с ВУИ при различных жизнеугрожакнцих состояниях неонатального периода. Первую группу составили недоношенные новорожденные (п=241) с клиническими признаками ВУИ, получавшие Виферон в дополнение к базовой терапии. Во вторую группу (п=108) были включены дети, получавшие только базовую терапию. Анализ показателей смертности при всех изученных патологических состояниях показал, что уровни летальности между группами леченых и не леченых Вифероном детей в большинстве случаев различались в 2-3 раза.

В таблице 6 представлено количество летальных исходов у детей с энтероколитом, пневмонией и с ВУИ смешанной этиологии.

Таблица 6. Сравнение показателей летальности у детей с ВУИ, получавших и не получавших терапию Вифероном.

Патологические состояния Количество летальных исходов (базисная терапия + Виферон) Количество летальных исходов (базисная терапия) 2-сторонний точный критерий Фишера

Энтероколит 2/45 (4,4%) 6/20 (30%) 0,008

Пневмония 2/63 (3,2%) 7/29 (24,1%) 0,004

ВУИ смешанной этиологии 4/81 (4,9%) 7/38 (18,4%) 0,036

При использовании базисной терапии умерло 20 из 87 детей (22,3%), тогда как при терапии с применением Виферона показатель летальности был существенно ниже и составил 4,2% (8/189). Таким образом, применение Виферона позволило снизить показатели летальности при этих состояниях в 5,3 раза.

Анализ включения метаболической и иммунной терапии в комплексное лечение беременных женщин и недоношенных детей.

Исследование биологических сред новорожденных детей с признаками ВУИ и материалов аутопсии плодов и умерших новорожденных методом БКМ показало присутствие инфекционно-активного ЦМВ в 16,8% - 49% случаев. Высокий процент выявления ЦМВ требует мероприятий по укреплению неспецифического иммунитета и противовирусной терапии. При этом существенное значение имеет состояние здоровья беременных, которым при выявлении активной вирусной инфекции назначают специфические противовирусные препараты, которые в большинстве случаев являются высокотоксичными для плода и не всегда разрешены во время беременности. Возможной альтернативой этому является использование иммунокорригирующей и метаболической терапии. В данном разделе работы проведена сравнительная оценка влияния метаболической терапии и Виферона на течение и исход беременности женщин с ОАГА.

При изучении влияния метаболических препаратов в предгравидарной подготовке было обследовано 260 женщин, инфицированных ЦМВ в возрасте от 22 до 28 лет, у которых проведен анализ анамнестических данных, мониторинг течения беременности, и прослежены исходы родов. Работа проведена на базе научно-консультативного центра при НПО «Питательные среды» (директор - проф., академик РАМНТ Меджидов М.М.). Женщины состояли на учете в ЖК №2 г. Махачкалы и были обследованы совместно с к.м.н. Сулеймановой И.Г. Женщины были разделены на три группы; основную группу (1) составили 106 женщин с ОАГА в возрасте 22-28 лет, взятых под наблюдение за 2-4 месяца до наступления настоящей беременности. На основании выявления наиболее значимых факторов риска внутриутробного инфицирования проводилась комплексная традиционная терапия, после чего была запланирована беременность. Женщины основной группы кроме традиционной терапии получали метаболическую терапию до беременности и во время беременности. Продолжительность терапии составляла 10-12 дней в месяц. Вторую группу (п=82) составили женщины с ОАГА, находившиеся под наблюдением с конца И триместра беременности и прошедшие неполный курс метаболической терапии. В третью группу вошли 72 женщины с ОАГА, взятые на учет с первых недель беременности без подготовки к ней. Женщины этой группы были обследованы, получали специфическое лечение, коррекцию биоценоза, но не получали метаболическую терапию.

Обследование проводили дважды - при постановке на учет в женскую консультацию и за З-б недель до родов. По выявлению возбудителей ИППП при первом обращении все группы были идентичны. При повторном обследовании частота обнаружения микоплазмы, уреаплазмы и вторичной бактериальной флоры у женщин в первой группе была значительно ниже. Обследование женщин второй группы перед родами показало достоверно более высокую частоту выявления микоплазмоза и ВПГ. У женщин третьей группы чаще обнаруживали микоплазмы, уреаплазмы, ВПГ и другую патогенную и условно-патогенную флору.

Анализ течения беременности показал, что угроза прерывания беременности в сравниваемых группах отмечалась в 1,8-1,9 раз достоверно чаще, чем у женщин 1-й группы. Женщины из 2 и 3-й группы в три раза чаще, чем женщины 1-й группы болели острыми респираторными вирусными инфекциями, протекающими в более тяжелой форме. Острые респираторные заболевания могли быть одной из причин обострения хронических болезней, которые в группах сравнения наблюдались у каждой второй женщины (56,1% и 55,6%) по сравнению с 21,7% случаев в 1-й группе. Хроническая гипоксия и задержка внутриутробного развития плода отмечались во 2 и 3-й группах значительно чаще (р<0,005). Преждевременные роды в группах сравнения отмечались в 2,5 раза достоверно чаще, чем в основной группе. В 1-й группе 65% родов прошли без каких-либо акушерских осложнений, в то время как в группах сравнения различные осложнения в родах и послеродовом периоде были отмечены у большинства женщин (76,4%-78%). Из 260 живыми родились 258 младенцев. Исходы родов у женщин сравниваемых групп представлены в таблице 7.

Таблш/а 7. Состояние новорожденных в сравниваемых группах.

Состояние 1 группа 2 группа 3 группа

новорожденных (п=106) (п=82) (ч=72)

Родились живыми 106 80 72

Умерли в пери- и

неонат. периодах 0% ±1,9 8,5% ±3,1 (р< 0,02) 13,9%± 4,1(р< 0,01)

Недоношенные 9,4%± 2,8 23,2%± 4,7(р<0,02) 23,6±%5,0 (р< 0,02)

Масса тела донош. 3486,2 ±548,3 3322,2 ±340,1 3322,2± 341,1

Оценка по шкале 0%± 1,9 31,3%±5,2(р< 0,001) 38,9%± 5,8(р< 0,001)

Апгар: 6-7 баллов

7-8 баллов 58,5%±4,8 31,3%± 5,2 (р<0,001) 27,8%±5,3(р<0,001)

8-9 баллов 40,6%± 4,7 37,5%± 5,4 33,3% ±5,5

Гипотрофия 2,8% ± 1,6 8,8% ±3,2 (н/з) 11,1%± 3,7 (р< 0,05)

Клинические

признаки ВУИ 23,6% ±4,1 63,8% ±5,4 (р<0,001) 66,7± 5,6 (р< 0,001)

Примечание: Оценка по шкале Апгар, относительное количество новорожденных с признаками гипотрофии и внутриутробного инфицирования во второй группе вычислялся от числа живорожденных (п=80).

У 23,6% новорожденных 1-й группы были отмечены признаки ВУИ. В группах сравнения 63,8% - 66,7% детей, родились с признаками ВУИ. У 26 новорожденных из второй группы (32,5%i) и 34 новорожденных из третьей группы (47,2%) через 2,5-36 часов состояние здоровья резко ухудшилось, нарастали симптомы сердечной и легочной недостаточности и инфекционного токсикоза, что требовало перевода их в отделение реанимации новорожденных. Всего в отделение реанимации было переведено 46 детей, из которых в 61,3% случаев было подтверждено ВУИ.

Таким образом, проведение предгравидарной подготовки за 2-4 месяца до беременности с использованием метаболической терапии приводит к существенному снижению осложнений в родах и послеродовом периоде, снижает вероятность внутриутробного инфицирования плода и новорожденного. Позволяет улучшить течение периода адаптации новорожденных и ведет к снижению перинатальной и младенческой смерти.

В ранее проведенных исследованиях была показана высокая эффективность применения генно-инженерного рекомбинантного препарата Виферон с третьего триместра беременности, начиная с 28 недель [Тареева Т.Г., 2000]. Для обоснования возможности более ранней иммунокоррекции при помощи Виферона мы провели сравнительный анализ включения препарата в комплексное лечение беременных, начиная со второго триместра беременности. Работа проводилась совместно с лабораторией онтогенеза и коррекции системы интерферона НИИ эпидемиологии и микробиологии им. 11.Ф. Гамалеи (зав. лаб. - д.б.н., проф. В.В. Малиновская) и 2-м акушерским отделением МОНИИАГ МЗ РФ (зав. отд. - д.м.н. C.B. Новикова).

Под наблюдением находилось 74 беременные с ОАГА. Исследования проводились в динамике: с 12-16 недель беременности до родов. Были применены общеклинические, ультразвуковые, вирусологические (ПЦР, ПЦР-RT, БКМ, ИФА) и иммунологические (определение альфа-ИФН, гамма-ИФН) методы исследования. Исследования проводились до начала терапии Вифероном, после окончания лечебного курса и накануне родоразрешения. У 40,9% женщин во время предыдущих беременностей отмечено обострение герпесвирусной инфекции (ГВИ), вызванной ВПГ и/или ЦМВ. Смешанная урогенитальная инфекция была выявлена у 42 из 74 беременных (56,8%).

Частота суммарного обнаружения маркеров ГВИ у беременных женщин в динамике представлена на рисунке 4. Женщину считали инфицированной при обнаружении маркеров ГВИ в любом из исследованных биологических сред хотя бы одним из методов.

При обследовании на 12-16 неделе у 15 из 74 женщин (20,3%) были выявлены прямые маркеры ГВИ, при повторном обследовании (26-32 неделя беременности) у 18 из

46 женщин (39,1%; р=0,008). Надо отметить, что у 8 из 18 женщин маркеры ГВИ были впервые обнаружены при повторном обследовании на 26-32 неделях беременности.

При третьем обследовании (37-39 недели беременности) маркеры ГВИ были выявлены у 8 из 23 беременных, что составило 34,8%. У 4 из 8 женщин маркеры ГВИ впервые были обнаружены при третьем обследовании (непосредственно перед родами).

Из 27 случаев первичного обнаружения маркеров ГВИ на разных сроках беременности 15 случаев было выявлено к концу 1 триместра, 8 случаев - в конце 2 триместра и 4 случая - в конце третьего триместра. Как видно из рисунка 4, почти у четверти беременных женщин (26,1%) вирус впервые обнаруживается к концу 2 и 3 триместра беременности. Это указывает на необходимость неоднократного обследования беременных на наличие маркеров ГВИ. Исследование, проведенное в динамике, показало, что с увеличением срока гестации частота выявления маркеров ЦМВ и ВПГ сохраняется на относительно высоком уровне, при этом вирусная нагрузка остается низкой.

Для выявления различных форм ЦМВИ мы пользовались классификацией, предложенной ранее [С.Г. Чешик и др., 2001]. Латентная форма ГВИ, при которой определяются только антитела была выявлена у 40,3% женщин. Реактивированная форма ГВИ, при которой определяются специфические антитела класса ^М одновременно с была диагностирована у 2,9% женщин. Персистирующая форма ГВИ, характеризующаяся вирусовыделением при отсутствии антител класса ^М в крови, на разных сроках беременности впервые была установлена в 51,4% случаев.

В дополнение к базисной терапии с 14 недели беременности 28 женщин получали Виферон-500000 МЕ по следующей схеме: ежедневно в течение 10 дней по 1 свече 2 раза в день (20 свечей); затем дважды в неделю по 1 свече 2 раза в день - 10 свечей. Базисную терапию получали 46 беременных. Результаты повторного вирусологического обследования женщин представлены в таблице 8.

Таблица 8. Результаты повторного обследования беременных на наличие маркеров ЦМВ и ВПГ.

Базисная терапия + Виферон Р Базисная терапия

Элиминация вирусов 8 (28,5%) р=0,025 3 (6,5%)

Реактивация ЦМВ и ВПГ 0 (0%) р=0,014 11 (23,9%)

Прежнее кол-во ЦМВ и ВПГ 3 (10,7%) р >0,05 5 (10,9%)

Анализ показал, что у 28,5% беременных, получавших в дополнение к базисной терапии препарат Виферон, вирус элиминировал из организма. В группе беременных, не получавших Виферон, вирус элиминировал только в трех наблюдениях из 46 (6,5%). Ни в одном случае у женщин, получавших Виферон, не отмечено реактивации ЦМВ и ВПГ

инфекции во время беременности, в то время как у женщин, получавших только базисную терапию, реактивация инфекции была зарегистрирована почти у четверти (23,9%). В прежнем количестве ЦМВ и ВПГ сохранялись почти у 11% обследованных из обеих групп.

Суммируя результаты применения метаболической и иммунной терапии у беременных можно констатировать:

- статистически значимую элиминацию вируса при повторных лабораторных исследованиях биологических сред после применения метаболической и иммунной терапии по сравнению с базисной терапией;

- отсутствие и/или снижение количества рецидивов ВПГ и ЦМВ - инфекций у беременных с ОАГА;

- снижение общего числа случаев внутриутробной инфекции более чем в 3 раза, в том числе тяжелых ее форм (внутриутробная пневмония, сепсис) с 26,1% до 5,2%;

- уменьшение с 25% до 11,3% случаев перинатальной патологии неинфекционного генеза (ЗВУР, хроническая гипоксия, асфиксия при рождении, нарушение мозгового кровообращения);

- снижение в 2-2,5 раза общей частоты осложнений беременности (ФПН, гестоз, угроза прерывания беременности).

Поиск новых субстанций природного происхождения, обладающих противовирусной активностью в отношении ЦМВ человека in vitro.

Новые препараты для лечения ЦМВИ у беременных и новорожденных, несомненно, должны обладать высокой антивирусной активностью в сочетании с незначительной токсичностью для клеток и организма в целом. Поэтому поиск природных, натуральных веществ, представляется весьма перспективным для создания лекарственных средств нового поколения.

В последнее время выявлены уникальные свойства фуллеренов и соединений на их основе, которые повышают устойчивость клеток к токсическим соединениям, образуют аддукты, являются антиоксидантами, обладают адъювантными свойствами, не вызывают аллергенных реакций, проникают через липидные мембраны, модулируя трансмембранный перенос ионов, обладают нейропротективными свойствами. Расширение спектра веществ, обладающих анти-ЦМВ активностью, позволило бы решить проблему резистентности, неизбежно возникающую при применении химиопрепаратов однонаправленного действия.

Часть работы была посвящена изучению противовирусной активности аминокислотных производных фуллерена и оценке возможности использования АПФ в комбинированной терапии вместе с патентованными препаратами для лечения ЦМВИ в

системе in vitro. Три водорастворимые аминокислотные производные фуллерена -аминокапроновая кислота (Cf,0-AKK), Na - соли аминокапроновой кислоты (Саг Na -АКК) и Na - соли аминомасляной кислоты (Cr,o- Na - АМК) были синтезированы в ИНЭОС им. С.И. Несмеянова РАН и любезно предоставлены к.х.н. Романовой B.C.

Исследование цитотоксического действия АПФ на фибробласты человека показало, что степень цитотоксического действия АПФ выраженная в 50% цитотоксическои дозе (СС50) составила для См-Ыа-АКК- 1500мкг/мл и Cai-Na-AMK- 1200 мкг/мл, а для Ссо-АКК - 100мкг/мл.

Изучение противовирусной активности всех трех АПФ в лечебной схеме показало, что соли АПФ оказывают более выраженное антивирусное действие по сравнению с Сг,о-АКК. Анализ кривых позволил определить эффективную концентрацию препаратов, необходимую для подавления вирусной активности на 50% (эффективная доза - ЭД50). ЭД5() для Сбо-Na-AKK составила 0,6 мкг/мл, ЭД50 для Сг,о-АКК - 2,7 мкг/мл, а для C<-,n-Na-АМК- 22 мкг/мл. Низкая токсичность и выраженный антивирусный эффект C(,o-Na-AMK и Caj-Na-AKK определили наш выбор этих препаратов для дальнейшего анализа, где был определен индекс пролиферации (IP50), который подтвердил, что изученные вещества обладают относительно низким антипролиферативным действием. 1Р50 для Сбо-Na-AKK составил 160 мкг/мл, а для Cso-Na-AMK - 550 мкг/мл. По совокупности полученных данных соли АПФ представлялись весьма перспективными, и в дальнейшем было изучено их влияние на репродукцию инфекционно активного вируса в культуре клеток. Заражение клеток ЦМВ с ИМ 0,01БО£/кл. позволило установить, что Cr,o-Na-AKK вызывает 50% подавление инфекционной активности вируса при концентрации 1,3 мкг/мл, a Cm-Na-АМК - при 2,2 мкг/мл, ХТИ = 1153 и 545, соответственно.

. Анализ показал, что АПФ достоверно подавляют инфекционную активность ЦМВ. выявленную в культуральной жидкости от клеток, зараженных с высокой и низкой множественностью. При этом степень подавления репродукции вируса находилась в зависимости от концентрации вещества и инфекционной множественности ЦМВ.

Для определения профилактического противовирусного эффекта АПФ культуру клеток обрабатывали за 24 часа до инфекции. При заражении с МИ 0,001 БОЕ/кл и концентрации Сбо-Na-AMK от 22мкг/мл до 0,022 мкг/мл, 100% вирусспецифпческое поражение клеток в обработанном АПФ варианте задерживалось на 1-2 дня. При 220 мкг/мл - на 7 дней. 50% подавление бляшкообразования отмечалось при концентрации 0,22 мкг/мл при МИ 0,001 БОЕ/кл. ХТИ составил 5454. При постановке опытов по профилактической схеме с Cr,o-Na-AKK заметного изменения по времени появления и по проценту пораженных клеток в опыте и контроле не наблюдалось.

При вирулицидной схеме воздействия вирус (МИ 0,01 БОЕ/кл) инкубировали в течение I часа при 37°С с различными концентрациями веществ - Сбо-Na-AKK в концентрациях от 0,1 до 10 мкг/мл; a Ceo-Na-AMK в концентрациях от 0,022 до 220 мкг/мл. При использовании Ceo-Na-AMK в концентрации 220 мкг/мл инактивация вируса происходила полностью. В течение времени наблюдения (14 дней) не отмечалось появление характерного ЦПД вируса, в то время как в контроле в 100% клеток наблюдалось ЦПД. При концентрации Ct,o-Na-AMK 22 мкг/мл активность вируса была снижена на 2,0 lg. Подсчет БОЕ показал, что 50% ингибирующая доза соответствует 0,22 мкг/мл. ХТИ составил 5454. При использовании этой концентрации наблюдали задержку в развитии ЦПД на 4 суток. Аналогичная постановка опыта для См-Na-AKK при различных концентрациях (10,0, 1,0 и 0,1 мкг/мл) показала, что 50% подавление образования бляшек наблюдается при 1,0 мкг/мл. ХТИ = 1500. Сбо-Na-AKK в концентрации 0,1 мкг/мл не влияла на вирусную активность, а в концентрации 10 мкг/мл снижала титр вируса на 0,97 lg.

Таким образом, 2 из 3-х производных фуллерена являются высокоэффективными ингибиторами репродукции ЦМВ человека в системе in vitro. ХТИ в различных вариантах схем и концентраций для Ci,o-Na-AKK составил 1150-2600; для Cai-Na-AMK - 545-5450.

Одной из задач исследования была оценка сочетаиного антивирусного эффекта фуллерена и Виферона in vitro. Для этого АПФ и Ганцикловир вносили в культуральную среду однократно через час после заражения в концентрации 1 мкг/мл, Q,o-Na-AMI< вносили в концентрации 0,22 мкг/мл. Для Виферона использовали профилактическую схему, когда клетки обрабатывали за 24 часа до заражения раствором, содержащим 50МЕ Виферона. При комбинированной схеме Ганцикловир вносили в концентрации 0,24 мкг/мл, т.е. в концентрации в 4 раза меньшей, чем рекомендовано в инструкции. АПФ использовали в концентрации 0,1 мкг/мл. Концентрация Виферона в комбинированной схеме также была уменьшена до 10 МЕ/мл.

При иммуноцитохимическом исследовании на 7 сутки после заражения в контрольной инфицированной культуре было 42,8% (900/2100) пораженных клеток. Анализ показал, что все вещества значительно подавляют развитие ЦПД по сравнению с зараженной культурой (Р<0,0005). В культуре, обработанной Ганцикловиром, количество зараженных клеток не превышало 8,0% (186/2300), фуллереном 9,2% (211/2300). При обработке Вифероном количество инфицированных клеток было больше 498/2900 (17,1%)). При изучении сочетаиного эффекта фуллерена с Вифероном и Ганцикловира с Вифероном оказалось, что антивирусный эффект более выражен у пары ганцикловир+Виферон. Количество инфицированных клеток при обработке культуры ганцикловиром и Вифероном не превышало 2,1% (50/2300), в культуре обработанной

Вифероном и АПФ обнаружено 3,6% (85/2300) инфицированных клеток. Данные однозначно указывают на то, что при комбинированном использовании препаратов достижение противовирусного эффекта происходит при снижении концентраций соединений, что имеет явное преимущество перед использованием анти-ЦМВ препаратов в отдельности.

Для суждения о механизме действия АПФ на ЦМВИ in vitro были проведены дальнейшие опыты. Эффективность Cr,o-Na-AMK в профилактической и в вирулицндной схемах позволила предположить, что вещество действует на ранних этапах взаимодействия вирус - клетка. Для проверки данного предположения фибробласты инфицировали ЦМВ в присутствии исследуемого соединения и фиксировали через 2 часа после внесения вируса, а затем окрашивали МКА к белку ЦМВ рр65, который в случае инфицирования вирусом клетки уже через час обнаруживается в ее ядре [Landolfo S., 2003]. Было установлено, что при МИ 0,01 БОЕ/кл. Cf,o-Na-AMK в концентрации 22 мкг/мл достоверно подавляло проникновение ЦМВ в клетки на 69,8% (р<0,0005) по отношению к инфицированной культуре (48% окрашенных клеток в контроле против 14,5%) в присутствии АПФ).

Для того, чтобы выяснить, на какие стадии жизненного цикла вируса оказывают влияние АПФ, было проведено иммуноцитохимическое окрашивание клеток с использованием МКА к сверхраннему, раннему и позднему белкам ЦМВ. В качестве положительного контроля были использованы Фоскарнет и Ганцикловир. Известно, что подавляя активность вирусной ДНК полимеразы, данные препараты ингибируют репликацию ДНК ЦМВ и блокируют экспрессию поздних генов, кодирующих структурные белки в ЦМВ - инфицированных клетках [De Clercd, 2001].

. При концентрации 2,2 мкг/мл Сш-Na-AMK снижала количество клеток окрашенных МКА к 1Ер72 и рр65, на 37% и 62%, соответственно. Эти значения находятся на уровне снижения экспрессии этих белков в инфицированных клетках в присутствии Фоскарнета, Cso-Na-AKK не влияла на синтез сверхранних и ранних белков. Наиболее эффективно вещества подавляли экспрессию поздних генов. Динамика экспрессии позднего структурного белка gB ЦМВ в культуре ФЛЭЧ в присутствии различных химиопрепаратов представлена на рисунке 5. В инфицированной культуре около 40% клеток на 5 сутки экспрессировали gB. В культуре обработанной АПФ количество клеток экспрессируюших gB достигало только 8-9% (р<0,0001). В культуре, обработанной Ганцикловиром или Фоскарнетом, экспрессия gB отмечалась в 6-7,5%. Полученные результаты позволяют заключить, что АПФ подавляют синтез поздних вирусных белков подобно Ганцикловиру и Фоскарнету, что является косвенным свидетельством ингнбирования репликации вирусной ДНК.

Для подтверждения данного вывода прямым методом была проведена серия

экспериментов по количественному изучению динамики накопления ДНК ЦМВ в

культуре инфицированных фибробластов методом ПЦР в реальном времени (таблица 9).

Таблица 9. Накопление ДНК ЦМВ в инфицированных клетках методом ПЦР в реальном времени при действии различных веществ.

Дни после заражения Виферон Фуллерен Фуллерен+ Виферон Ганцикловир Ганцикловир+ Виферон Контроль вируса

4 сутки отр отр отр отр отр 26,80*

7 сутки 27,23 25,96 отр 27,55 26,62 18,73

10 сутки 19,22 21,70 22,97 22,60 26,09 13,72

Значение О. Положительный контроль тест-системы (С1 =19.11) соответствует 20000 копий ДНК/мл.

В качестве препаратов сравнения были использованы Виферон и Ганцикловир. Результаты ПЦР и ПЦР real - time показывают, что АПФ, Виферон и Ганцикловир препятствуют накоплению вируса в клетке до 7 суток после заражения. Надо отметить, что значения Ct на 7 сутки для всех использованных веществ были на уровне нижнего предела использованной тест-системы (25,96 - 27,55). На 7 сутки количество ДНК в исследованных образцах было снижено на 2,0 lg. Ингибирующая активность проявлялась также и через 10 дней после заражения. При совместном использовании Виферона с АПФ и Ганцикловиром ингибирующий эффект был более длительным и выраженным.

Суммируя полученные данные, можно заключить, что в ЦМВ - инфицированных клетках существует несколько вирусных мишеней воздействия для Cf,0-Na-AKK и Coo-Na-АМК, направленных на подавление инфекционного процесса в пермиссивных клетках in vitro. Для раскрытия молекулярных механизмов антивирусного действия каждого из изученных соединений необходимы дальнейшие исследования.

Возможность комбинирования Виферона с другими лекарственными средствами специфической противовирусной терапии дает основание для разработки принципиально новых схем комбинированной терапии цитомегаловирусной инфекции, позволяющих снизить терапевтические концентрации лекарственных соединений и, следовательно, избежать проявления побочных токсических эффектов при сохранении высокой противовирусной эффективности. Использование препаратов с различными механизмами действия позволит также избежать появления устойчивых к терапии мутантных штаммов вируса. Для того, чтобы выявить клеточные мишени, на которых направлено действие C(,o-Na-AKK и Cco-Na-AMK, необходимо понимать процессы, происходящие в инфицированной клетке после проникновения внутрь клетки и влияние вируса на

жизненный цикл клетки. Для этого были проведены опыты, описанные в следующем разделе работы.

Действие ЦМВ иа пролиферативную активность клеток ФЛЭЧ.

В инфицированной культуре к концу первого дня инфекции наблюдались митотические фигуры, в которых расположение хромосом и их морфология не соответствовали ни одной из нормальных стадий митоза и характеризовались неправильным расположением хромосом, повышенной степенью их конденсации и фрагментацией части хромосом. Доля патологических митозов среди общего числа митотических клеток к 40 часам после заражения достигала 80%.

Было высказано предположение, что митотические клетки с аномальной морфологией не способны завершить деление. Подсчет митотических фигур, соответствующих стадиям анафазы и телофазы, показал, что если в контрольной культуре ФЛЭЧ их доля от общего числа митозов составляла в среднем 17%, то на 3-й и 4-й день суммарная доля анафазных и телофазных пластинок снижалось до 1%.

На тех же препаратах проводился подсчет клеток на единицу площади. Оказалось, что в то время как в контрольной культуре эта величина возрастала с 1-го по 4-й день культивирования, в инфицированной культуре число клеток на единицу площади существенно не увеличивалось. Следовательно, в ЦМВ-инфицированной культуре наблюдалась остановка деления клеток. Возможно, что блок клеточного цикла наблюдается на стадии митоза и связан с появлением патологии митотических клеток. Аномальные митотические фигуры при инфицировании активно делящихся клеток ФЛЭЧ появлялись в течение первых суток после заражения. Это наводило на мысль, что патология митоза развивается вне зависимости от синтеза вирусной ДНК, репликация котцрого начинается, в среднем, через 24 часа после проникновения вируса в клетку.

Для ответа на вопрос, связана ли патология митозов с репликацией вирусной ДНК и экспрессией вирусных белков была проведена серия опытов. Культуру заражали ЦМВ в присутствии Ганцикловира, являющегося ингибитором репликации вирусной ДНК и вирусом, предварительно инактивированным УФ. Степень подавления синтеза ДНК ЦМВ оценивали по числу клеток, содержащих поздний вирусный белок gB с помощью МКА. На 3-й сутки после заражения интактным вирусом 35% клеток содержали белок gB. В культуре обработанной Ганцикловиром число клеток, содержащих поздний антиген, не превышало 3%. Проникновение вирусных частиц внутрь клеток контролировали путем окраски МКА к белку рр65, который является мажорным белком тегумента. Было обнаружено, что 82% клеток содержали белок рр65 после обработки культуры инактивированным вирусом. Обработка вируса ультрафиолетом (УФ) приводила к

снижению экспрессии сверхранних и ранних генов в 15 раз. При этом, появление патологических митозов в одинаковой степени наблюдалось во всех трех культурах.

Результаты подсчета митотического индекса и доли патологических митозов во всех культурах на 3 сутки показали, что в контрольной культуре было 9,3700, в инфицированной культуре 19,8700, из которых 9,7°/00 (48,9%) были патологическими. В культуре, зараженной вирусом, обработанным УФ, митотический индекс составил 15,7 700, из них 7,2 7„„ (45,9%) митозов были с различной степенью патологии. В культуре, обработанной Ганцикловиром, митотический индекс был несколько меньшим и составил 10,6 700. Патология митоза наблюдалась в 6,0 700, т. е. в 56,6% из всех митотических фигур в культуре. К 5-м суткам в культуре клеток после заражения вирусом обработанным УФ и в присутствии Ганцикловира, также как и в культуре, инфицированной интактным вирусом, количество митозов с аномальной морфологией было близким и превышало 50%>. Таким образом, было установлено, что подавление репликации ДНК ЦМВ, а также инактивация УФ транскрипции вирусных генов не препятствуют появлению патологических митозов.

Для изучения влияния ЦМВ на митотический цикл была использована система с индуцированной пролиферацией: клетки вводили в состояние покоя 00, затем стимулировали к делению сывороточными ростовыми факторами. Заражали в различных стадиях клеточного цикла (Со, 0| и Б).

Данные, полученные при заражении фибробластов, находившихся в момент инфицирования в состоянии покоя Со, представлены на рисунке 6, где точка 0 соответствует 48 часам после удаления сыворотки (во - период) и является моментом заражения клеток. Подсчет меченых клеток в контрольной культуре показал стандартный характер увеличения числа клеток, содержащих 3Н - тимидин. В зараженной культуре доля меченых клеток оставалась на низком уровне. Очевидно, что клетки инфицированной культуры не смогли выйти из состояния покоя и вступить в фазу синтеза ДНК после стимуляции. Подсчет митотических клеток в инфицированной культуре, также показал снижение количества митозов с 3% в момент заражения до 0% и оставался на этом уровне.

Сходные данные были получены при заражении ФЛЭЧ в стадии в] клеточного цикла. Только 8% клеток инфицированных в О] - периоде клеточного цикла включают ЗН-тимидиновую метку при стимуляции к делению.

Данные литературы о пролиферативной активности клеток, инфицированных в йь противоречивы. Так, в ряде работ приведены данные, свидетельствующие об остановке ЦМВ - инфицированных клеток на границе С5]/3 [ОШтег апё Мосаге1а, 1997; Ка^а еЫ., 2003: 8а1уап1 т. а!., 1999]. \Veibusch апб ^-щете/ег полагают, что к блоку клеточного цикла

на стадии Gi может приводить экспрессия сверхраннего вирусного белка IE2 - 86 [Weibusch and Hagemeier, 1999]. Murphy и соавторы (2000г.) показали, что 1Е2р86 не препятствует вхождению в S период пермиссивных к ЦМВ клеток. В пользу этого говорят данные, полученные ранее Bresnahan с соавт., что 1Е2р86 активизирует промотор гена циклина Е и увеличивает уровень этого циклина, необходимого для вступления клетки в S - период [Bresnahan et. al., 1998]. Показано также, что ЦМВ приводит к деградации ингибитора циклин-зависпмых киназ р21 С1Р| и, таким образом, индуцирует вхождение клеток в S - фазу [Bresnahan et. al., 1996; Sinclair et.al., 2000; Chen et. al., 2001]. Таким образом, наши данные подтверждают способность клеток, инфицированных в G| -периоде преодолевать границу Gi/S и дополняют их. Нами установлено, что лишь часть Gi - клеток способны вступить в стадию синтеза ДНК после заражения ЦМВ, но они не способны вступить в митоз.

Динамика вступления клеток в фазу синтеза ДНК в культуре, инфицированной ЦМВ в S - периоде клеточного цикла, приведена на рисунке 7. Точка 24 соответствует моменту заражения клеток и 24 часам после добавления сыворотки (S - период). Подсчет меченых клеток показал, что в инфицированной культуре максимальное число клеток в стадии синтеза ДНК было достигнуто на 6 часов позднее, чем в контрольной популяции. Это позволяет предположить, что длительность S фазы в инфицированных клетках увеличивается.

Результаты по подсчету митотического индекса представлены на рисунке 8, где точка 0 соответствует моменту заражения клеток и 24 часам после добавления сыворотки.

Количество митозов в контрольной и инфицированной культурах на протяжении 48 часов наблюдения практически не отличалось. Через 12 часов после заражения в культуре былц зарегистрированы митотические фигуры с аномальным расположением хромосом, число которых постоянно возрастало. К 42 часам их число составило половину от общего количества митозов.

Таким образом, в культуре ФЛЭЧ, инфицированной в S-фазе, клетки способны завершить период синтеза ДНК, хотя и с замедлением. Установлено, что, по крайней мере, в первые часы после заражения инфицированные клетки, находившиеся в S-периоде, способны войти в стадию G2, преодолеть границу G2/M и вступить в митоз подобно неинфицированной культуре. Данные литературы свидетельствуют о том, что под действием ЦМВ пролиферирующие клетки проходят S - период и останавливаются до вступления в митотическую фазу клеточного цикла на границе G2/M [McElroy et.al, 2000; Prichard et.al., 2008].

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что по крайней мере, в первые часы после проникновения ЦМВ, вирус не препятствует вхождению в митоз клеток,

находящихся в периоде синтеза ДНК. Полученные результаты находят подтверждение в работе Jault с соавт., которые установили, что в инфицированных фибробластах, находящихся в момент заражения в S - фазе клеточного цикла, регистрируется высокий уровень содержания циклима В и соответствующей циклин - зависимой киназы cdk-2 [Jault et. al., 1995]. Заключение авторов о блоке Gi/M в ЦМВ - инфицированных клетках был сделан на основе данных проточной цитометрии ДНК, который не позволяет дифференцировать клетки, Находящиеся в фазе G2 и в митозе, так как обе популяции содержат одинаковое (удвоенное) количество ДНК. Использованные нами методы (радиоавтографическое выявление S - фазных клеток и морфологический анализ митотических фигур) позволил доказать, что клетки зараженные в S - фазе, способны вступить в митоз.

Предположение о том, что в ЦМВ инфицированных ФЛЭЧ прохождение S-фазы клеточного цикла происходит медленнее, чем в неинфицированной популяции, было проверено в дальнейших экспериментах с использованием метода меченых митозов (рис. 9).

РИС. 9. Изменение доли меченых митозов после импульсного внесения 3Н-тимидшш в культуре диплоидных фибробластов человека, инфицированной ЦМВ.

аремя после заражения и отмывки метки,ч контроль —* - ЦМВ 1БОЕ/КЛ

В обеих культурах митотические клетки, содержащие метку над хромосомами, впервые наблюдались через 4 ч после отмывки ЗН-тимидина, что соответствует продолжительности фазы Сз в диплоидных фибробластах человека. Это свидетельствует о том, что ЦМВ не влияет на прохождение стадии Сэ клеточного цикла по крайней мере в первые часы после заражения - до 14 часов. Позже динамика меченых митозов существенно различалась в двух культурах. Снижение их доли до 50% было отмечено

через 28 ч после начала опыта, в то время как в контроле этот показатель был достигнут уже к 18 часам.

Более медленное снижение числа меченых митозов в инфицированной культуре по сравнению с контрольной подтверждает высказанное предположение об увеличении длительности S-фазы в клетках, инфицированных ЦМВ. Расчеты по графику показали, что S период для контрольной культуры ФЛЭЧ составил 8 часов, а для культур, инфицированных ЦМВ - 18 часов.

Приблизительно половина всех меченых митозов имели отклонения от стандартной морфологии. Другая половина патологических митозов оставалась немеченой. Как было установлено, около половины патологических митозов возникают при инфицировании клеток, находящихся в S - периоде клеточного цикла. Учитывая отсутствие митозов при инфицировании клеток в G| - фазе, можно заключить, что остальные, немеченые патологические митозы возникают при инфицировании клеток в стадии, предшествующей митозу - G2 или после вступления клеток в митоз.

Подводя итог данному разделу можно заключить, что полученные новые данные свидетельствуют о том, что действие ЦМВ на клеточный цикл зависит от стадии в жизненном цикле клетки в момент ее заражения. Патологические процессы на клеточном уровне развиваются в непосредственной связи с клеточной пролиферацией.

ВЫВОДЫ.

1. Сравнительная оценка эффективности лабораторных методов выявления маркеров ЦМВИ у 204 недоношенных новорожденных детей показала, что частота определения ДНК ЦМВ методом ПЦР составила 15,9%, методом БКМ - 16,8%, двумя методами -26,2%. Анализ авидности противовирусных антител выявил прогностическую значимость выявления низкоавидных антител. Показана необходимость комплексного использования перечисленных методов.

2. Впервые разработан и использован для диагностики внутриутробной ЦМВИ метод ПЦР in situ при исследовании отпечатков органов и тканей умерших новорожденных. Метод позволяет визуализировать инфицированные клетки, оценить локализацию и сравнительное количество внутриклеточной вирусной ДНК.

3. У новорожденных с признаками внутриутробного инфицирования (ВУИ) прямые маркеры ЦМВ обнаруживаются в 26% случаев, а у новорожденных без признаков ВУИ - в 5 раз реже (в 5% случаев). Через 1-3 месяца у 68% внутриутробно инфицированных происходит элиминация ЦМВ. У 19,2% неинфицированных детей маркеры ЦМВ появляются впервые к трем месяцам, а еще у 1 1,5% - к 6 месяцам. Эти данные свидетельствуют о том, что для достоверной диагностики ЦМВИ необходимо неоднократное обследование.

4. Установлено, что применение Виферона со второго триместра беременности приводит к снижению частоты осложнений беременности в 2-2,5 раза и к снижению патологии у новорожденных с 26,7% до 5,2%. Включение Виферона в комплексное лечение недоношенных новорожденных с клиническими признаками ВУИ оказывает

4В

иммунокорригирующий эффект и снижает смертность при жизнеугрожающих состояниях неонатального периода.

5. Использование в предгравидарной подготовке женщин метаболической терапии за 2-4 месяца до наступления беременности позволяет существенно улучшить течение беременности, состояние плода и исходы родов. Использование метаболической терапии только в период беременности по этим показателям является недостаточной.

6. Впервые установлено, что развитие ЦМВИ in vitro зависит от фазы клеточного цикла в момент заражения. ЦМВ блокирует вступление клеток ФЛЭЧ в S-период при заражении в Go- и Gi-периодах клеточного цикла; в клетках, зараженных в S-периоде, удлиняется период синтеза ДНК, сохраняется способность вступить в митоз, который блокируется в метафазе.

7. Индукция патологических митозов ЦМВ может происходить при действии на клетки вируса, инактивированного УФ, а также при подавлении синтеза вирусной ДНК ганцикловиром, что демонстрирует определяющую роль сигнальной трансдукции в регуляции вирусом митотических генов.

8. Впервые установлено, что водорастворимые аминокислотные производные фуллерена См (Na соль аминомасляной - Cf,o-Na-AMI< и Na соль аминокапроновой кислот - С<,и-Na-AKK) являются высокоэффективными ингибиторами репродукции ЦМВ в системе in vitro. Химиотерапевтический индекс (ХТИ) при различных схемах воздействия для Cc,o-Na-AKK составил 1150-2600; для Cr,u-Na-AMK - 545-5450, что выше значений ХТИ для известных анти-ЦМВ препаратов.

9. Установлена синергидность антивирусного действия аминокислотных производных фуллерена и Виферона на модели ЦМВИ в культуре клеток. Это указывает на перспективность разработки комбинированного лекарственного средства, сочетающего антивирусные, иммуномодулирующие и антиоксидантные свойства.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Влияние цнтомегаловируса на прохождение клеточного цикла и формирование патологических митозов в культуре диплоидных фнбробластов человека. // Онтогенез - 2001. - Т.32, №1. - С.29-34. / соавт.: Барсукова A.C., Федорова Н.Е., Зацепина О.В., Кущ A.A.

2. Сравнение эффективности лабораторных методов выявления цнтомегаловируса в аутопснйном материале. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии -2002. - Т.2. - С.63-69. / соавт.: Нисевич Л.Л., Федорова Н.Е., Ильина E.H., Талалаев А.Г., Адуева С.М., Хижнякова Т.М.., Малахова М.В., Говорун В.М., Кущ A.A.

3. Острые респираторные вирусные заболевания и синдром внезапной смерти у детей раннего возраста. // Пульмонология - 2002. - №5. - С.6-9. / соавт.: Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Яцык Г.В., Парсегова Т.С., Туманова Е.Л.

4. Подавление цитомегаловирусной инфекции в клеточной системе аминокислотными производными фуллерена. // Вопросы вирусологии - 2002. - Т.47, №1. - С.30-34. / соавт.: Федорова II.Е., Адуева С.М., Романова B.C., Парнес З.Н., Галегов Г.А., Куш A.A.

5. Врожденные вирусные инфекции и маловесные дети. // Вопросы современной педиатрии - 2002. - Т.1, №4. - С.9-13. / соавт.: Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.II., Мпрошок О.В., Парсегова Т.С., Туманова Е.Л., Кущ A.A., Климова P.P., Федорова II.Е.

6. Иммуноцнтохимическая реорганизация ядрышка в условиях цитомегаловирусной инфекции. // ДАН - 2002. - Т.387, №3. - С.589-592. / соавт.: Жарская О.О., Федорова U.E., Кущ A.A., Зацепина О.В.

7. Активация транскрипции рибосомных генов при цитомегаловирусной инфекции фибробластов эмбриона человека in vitro. // Цитология - 2003. - Т.45, №7. - С. 690-701. / соавт.: Жарская О.О., Барсукова A.C., Федорова Н.Е., Кущ A.A., Зацепина О.В.

8. Nanobionics of pharmacologically active derivatives of fullerene C60. // Jornal of Nanoparticle Research, Netherlands - 2003. - Vol. 5. - P.561-566. / соавт.: Kotelnikova R.A., Bogdanov G.N., Frog E.G., Kushch A.A., Fedorova N.E., Miller G.G

9. Блок клеточной пролиферации и патология митоза о клетках, инфицированных цитомегаловирусом: роль периода клеточного цикла в момент заражения. // ДАН -2003. - Т.392, №4. - С.552-555. / соавт.: Федорова Н.Е., Меджндова М.Г., Кущ А.А

10. Значение врожденных вирусных инфекции как причины перинатальной и младенческой смертности. // Вопросы современной педиатрии - 2005. - Т.4, №2. - С.19-25. / соавт.: Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Парсегова Т.С., Туманова Е.Л., Мирошок О.В., Кущ A.A.

11. Выявление прямых маркеров цитомегаловируса и противовирусных антител у детей раннего возраста. // Вопросы вирусологии - 2005. - Т.50, №1. - С.14-19. / соавт.: Алямовекая Г.А., Кешишян Е.С., Адуева С.М., Федорова Н.Е., Pustowoit В., Малахова ¡VI.В., Ильина E.H., Говорун В.М., Кущ A.A.

12. Антивирусная активность липосомных препаратов антибиотика гелиомицина. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2005. - Т.139, №3. - С.330-333. / соавт.: Подольская C.B., Нарышкина H.A., Сорокоумова Г.М., Каплун А.П., Федорова Н.Е., Кущ A.A., Швец В.И

13. Лабораторная диагностика врожденных вирусных инфекций. // Детские инфекции -2006. - Т.5, №2. - С. 12-18. / соавт.: Нисевич Л.Л., Бахмут Е.В., Аширова A.A., Кущ A.A., Коноплева Т.Н., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Парсегова Т.С., Туманова Е.Л.

14. Влияние аминокислотных производных фуллерена С60 на развитие цитомегаловирусной инфекции. // Технологии живых систем - 2006. - Т.З, №2. - С.42-46. / соавт.: Фрог Е.С., Котельникова P.A., Богданов Г.Н., Штолько В.Н., Файнгольд И.И., Кущ A.A., Федорова Н.Е., Романова B.C.

15. Перинатальные факторы риска внутриутробного инфицирования плода, патологии и смерти в перинатальном и младенческом возрасте. // Вопросы акушерства, гинекологии и перннатологии - 2007. - Т.6, №4. - С.13-17. / соавт.: Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Парсегова Т.С., Туманова Е.Л., Кущ A.A.

16. Преконцепционная подготовка женщин к беременности и ее влияние на плод и новорожденного. // Педиатрическая фармакология - 2008. - Т.5, № 6. - С.45-51. / соавт.: Нисевич Л.Л., Меджидова Д.Б., Суленманова И.Г., Гаджиева З.С., Шищенко В.М., Куш

A.A.

17. Быстрый культуральный метод диагностики герпесвирусных инфекции. Методические рекомендации - Москва - 2008. - С.21 / соавт.: Кущ A.A., Федорова Н.Е.. Климова P.P.

18. Интерфероновый статус недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками внутриутробной инфекции и его коррекция вифероном. // Российский аллергологическнй журнал - 2008. - №6. - С.74-81. / соавт.: Малиновская В.В., Гусева Т.С., Паршина О.В., Гаджиева Ч.С., Павлова М.В., Климова P.P., Володин H.H., Гетпп Е.Г., Солдатова И.Г., Дегтярева М.В., Кущ A.A.

19. Динамика маркеров герпесвирусных инфекций у недоношенных новорожденных детей в отделениях реанимации и интенсивной терапии. // Педиатрия - 2008. - Т..87, j\ï3. -С.143-144. / соавт.: Гаджиева З.С., Павлова М.В., Гетия Е.Г., Н.Н.Володнн, Ж.В. Евсегнеева, С.Н. Щербо, E.H. Выжлова, P.P. Климова, Н.Е. Федорова, М.В. Дегтярева,

B.В. Малиновская, A.A. Кущ.

20. Внутриутробная инфекция: мать-плацеита-плод. // Детские инфекции - 2008. - Т.7, JY»2. - С.9-13. / Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Туманова Е.Л., Парсегова Т.С., Куш A.A.

21. Алгоритм вирусологического лабораторного обследования недоношенных новорожденных детей с врожденной цитомегаловирусной инфекцией в течение первого года жизни и влияние терапии Вифероном на исход внутриутробной инфекции. // Педиатрия - 2009. - Т.87, №2. - С.55-62. / соавт.: Павлова М.В., Федорова Н.Е., Гаджиева З.С., Евсегнеева Ж.В., Щербо С.Н., Гетия Е.Г.. Солдатова И.Г., Дегтярева М.В., Володин H.H., Малиновская В.В., Кущ A.A.

22.

23.

24.

25.

26.

27,

28,

29,

30,

31,

32.

33.

34.

35.

37,

Выявление прямых маркеров ВПГ н ЦМВ в аутоисийном материале плодов и умерших новорожденных. // Детские инфекции - 2009. - Т.8, №3. - С.16-21. / соавт.: Нисевич Л.Л., Гаджиева З.С., Цибизов А.С., Климова Р.Р., Куш А.А. Эффективность лечения рекомбинантным интерфероном -2 (Вифероном®) недоношенных детей с тяжелыми внутриутробными инфекциями // Детские инфекции - 2009. - №3. - С.40-44. / соавт.: Кущ А.А., Дегтярева М.В., Малиновская В.В., Солдатова И.Г., Климова Р.Р., Серова Е.В., Гетия Е.Г., Цибизов А.С., Гаджиева З.С. Герпесвирусные инфекции и перинатальная патология. // Русский педиатрический журнал - 2010. - №6. - С. / Алиева А.А.

Nontoxic fullerene analogs, effectively suppressing of HIV and CMV infectivity. // Russian Jornal of HIV/AIDS and related problems; Vol.4, №1 Sankt-Petersbourg - 2000, p. 179-180. / соавт.: Kuschch A., Parues Z, Romanova V., Pokidysheva L., Titova I., Makarova N., Adueva S. Involvement of congénital cytomegalovirus-infection in têtus and infant mortality. // Jornal of Clinical Virology. Vol.18, Nos.1-3, Glasgow, Scotland - 2000, p.195-196. / соавт.: Kushch A., Adueva S., Talalaev A., Fedorova N., Nisevich L.

Изменение параметров митотического цикла в диплоидных фибробластах человека под действием цитомегаловируса. // Межд. конференция "Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем"- Махачкала - 2001, стр. 102103. / соавт,: Барсукова А., Федорова Н.

Использование диплоидных фибробластов человека для изучения противовирусной активное™ аминокислотных производных фуллерена. // Межд. конференция "Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем"- Махачкала -2001, стр. 101-102. / соавт.: Федорова Н., Адуева С., Романова В., Парнес 3., Галегов Г. Нетоксичные производные фуллерена, эффективно подавляющие инфекционную активность ЦМВ in vitro. // 5 Межцунар. конференция "Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы", Т.4, №1 Санкт-Петербург - 2000, стр. 76-77. / соавт.: Кущ А.А., Парнес З.Н., Романова B.C., Макарова Н.Е., Адуева С.М.

Выявление маркеров цитомегаловирусной инфекции у детей раннего возраста. // 3 Межд. конференция "Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем"- Махачкала - 2001, стр.105-106. / соавт.: Адуева С., Федорова Н., Алямовская Г., Сахарова Е., Кешишян Е.

Острые респираторные вирусные заболевания и синдром внезапной смерти. // 11 Нац. конгресс по болезням органов дыхания - Москва - 2001, стр.180. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л., Парсегова Т., Туманова Е., Мирошок О., Кущ А., Климова Р. Острые и хронические внутриутробные вирусные инфекции в перинатальной и младенческой смерти. // Мат. 3 Рос. Научного форума "Актуальные проблемы акушерства, гинекологии и перинатологии" - Москва - 2001, стр.358-361. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Кущ А., Климова Р., Федорова Н., Корнюшин М.

Различная чувствительность эмбриональных клеток человека к цитомегаловирусу. // Межд. конференция "Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем"- Махачкала - 2001, стр. 103-104. / соавт.: Адуева С., Хижнякова Т., Смирнова Т., Федорова Н.

Сравнение эффективности методов лабораторной диагностики для выявления ЦМВ в аутопсийных материалах. // Межд. конференция "Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем"- Махачкала - 2001, стр. 106107. / Нисевич Л., Федорова Н., Адуева С., Говорун В., Ильина Е., Малахова М. Использование методов лабораторной диагностики при оценке роли цитомегаловируса человека в смертности новорожденных и детей раннего возраста. // 8 Съезд всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов,- Москва - 2002, стр.301. / соавт.: Нисевич Л., Федорова Н., Адуева С., Говорун В., Ильина Е., Малахова М., Кущ А. Nanobionics of farmacologicaly active derivates of fullerene C60. // 5 Международная конференция "Фуллерены и атомные кластеры", С.-Петербург - 2002, 15-18 мая. / соавт.: Котельникова Р., Богданов Г., Фрог Е„ Котельников А., Романова В., Андреев С., Кущ А., Федорова Н., Миллер Г.

Врожденные аномалии легкого и бронхов у детей с внутриутробной инфекцией. // 12 Нац. Конгресс по болезням органов дыхания, Москва - 2002, стр.166. / соавт.: Нисевич Л., Кущ А., Мирошок О., Парсегова Т., Туманова Е.

38. Значение острых респираторных вирусных заболеваний в танатогенезе новорожденных и детей первого года жизни. // 12 Нац. Конгресс по болезням органов дыхания, Москва - 2002. стр.201. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л., Кущ А., Миронюк О., Корнюшин М.

39. Применение метода полимеразной цепной реакции для диагностики цптомегаловируснои инфекции. // Межд. конференция "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины", Москва - 2002, стр.251-252. / соавт.: Малахова М„ Ильина Е., Федорова Н., Адуева С., Кущ А., Нисевич Л., Талалаев А.

40. Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции у детей раннего возраста. // Научн. - практ. симпозиум "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении", Москва - 2002, стр.249-251. /' соавт.: Адуева С., Меджидова М., Федорова Н., Кущ А., Ильина Е., Малахова М., Говорун В., Алямасольская Г., Кешишян Е., Воронцова Ю., Солдатова И., Дегтярева М.

41. Врожденные пороки развития желудочно-кишечного тракта у детей с внутриутробной инфекцией. // 8 Конгресс Педиатров России "Детская гастроэнтерология: настоящее и будущее", Москва - 2002, стр. 199-200. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л., Миронюк О., Кущ А.

42. К вопросу лабораторной диагностики урогенитальных инфекций. // 4 Межд. конференция "Разработки и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем ", Махачкала - 2003, стр.81-83. / соавт.: Акаева Ф., Омарова С., Меджидов М., Алиева С.

43. Нарушения клеточного цикла фибробластов человека, инфицированных цитомегаловирусом. // Цитология, С-Петербург - 2003, стр.939-940. / соавт.: Федорова Н„ Меджидова М., Кущ А.

44. Поражение бронхолегочной системы в перинатальной и младенческой смерти. // 13 Нац. конгресс по болезням органов дыхания, С-Петербург - 2003, стр.225. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л., Парсегова Т., Туманова Е., Кущ А.

45. Поражение ЦНС при врожденных инфекциях по данным п/а и вирусологических исследований. // Научно - практ. конф. педиатров России и фармакотерапия в педиатрии. Москва - 2004, стр.28-29. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л., Миронюк О., Парсегова Т., Туманова Е., Кущ А.

46. Применение биологически активных добавок в лечении урогенитальных инфекций. /7 Всероссийская научно - практ. конф. "Медицинская микробиология-xxl век", Саратов -2004, стр.7-9. / соавт,: Акаева Ф., Омарова С., Меджидов Ш., Алиева С.

47. Использование метода биорезонансного тестирования в лабораторной диагностике урогенитальных инфекций. // Всероссийская научно - практ. конф. "Медицинская микробиология-xxl век", Саратов - 2004, стр.12-13. / соавт.: Акаева Ф., Омарова С.

48. Выявление количественного состава ассоциаций хламиднй при смешанной урогенитальнон инфекции. // Росс, конгресс "Генитальные инфекции и патология шейки матки", Москва -2004, стр.77. / соавт.: Сулейманова И., Омарова С., Меджидов М., Акаева Ф., Алиева С.

49. -Клинико-диагностическая значимость ЦМВИ в развитии патологий плода и

новорожденных. // Росс, конгресс "Генитальные инфекции и патология шейки матки", Москва - 2004, стр. 15-16. / соавт.: Сулейманова И.

50. Поражения тимуса при внутриутробном инфицировании по результатам п/а и вирусологических исследований. // 3 Конгресс педиатров-инфекционистов "Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей", Москва - 2004, стр.163. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Парсегова Т., Туманова Е., Кущ А.

51. Клинико-диагностические аспекты хламидийных уретритов у мужчин в городе Махачкале. // Всеросс. научн. конф "Медицинские иммунобиологические препараты в 21 веке: разработка, производство и применение", Уфа - 2005, стр.185-187. / соавт.: Акаева Ф., Омарова С.. Садуллаева А., Гаджиева 3., Алиева С., Меджидов М.

52. Поражение ж/к тракта у детей с внутриутробной инфекцией по результатам аутопсий. // 10 Съезд педиатров России "Пути повышения эффективности медицинской помощи детям", Москва - 2005, стр.379-380. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л.. Парсегова Т., Туманова Е., Миронюк О., Кущ A.A.

53. Удельный вес внутриутробных вирусных инфекций. // 8 Росс. Форум "Мать и дитя", Москва - 2005, стр.581-582. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л.

54. К вопросу о роли пневмоний в танатогенезе детей с внутриутробной инфекцией. // 4 Конгресс педиатров-инфекционистов России, Москва - 2005, стр.133. / соавт.: Нпсевич Л., Талалаев А., Каск Л., Парсегова Т., Туманова Е., Кущ А.А.

55. Врожденный сифилис у детей с внутриутробной инфекцией (по результатам п/а и вирусологических исследований). Нисевич Л., Меджидова А., Талалаев А., Каск Л., Парсегова Т., Туманова Е., Миронюк О., Кущ А.А,- 10 Конгресс педиатров России "Актуальные проблемы педиатрии", Москва - 2006, стр.423.

56. Факторы риска развития патологии и смерти в перинатальном и младенческом возрасте. //11 Конгресс педиатров России "Актуальные проблемы педиатрии", 5-8февраль, Москва - 2007, стр.488-489. / соавт.: Нисевич Л, Талалаев А., Каск Л., Туманова Е., Парсегова Т., Сулейманова И., Меджидова Д.

57. Значение врожденной вирусной инфекции в формировании аномалий развития по результатам аутопсий. // Астраханский медицинский журнал, Том 2, № 2. Астрахань - 2007, стр. 133. / соавт.: Нисевич Л., Талалаев А., Каск Л. Н., Туманова Е., Парсегова Т., Кущ А.

58. Гепатиты при врожденной вирусной инфекции. // Научно - практ. конф. и школа по инфекционной патологии, 20-24 ноябрь, Москва - 2007. / соавт.: Нисевич Л, Талалаев А., Каск Л., Туманова Е„ Парсегова Т., Куш А.

59. Risk factors of intrauterine infection, preventive measures. // Proc.of international scientific-practical interdisciplinary workshop "New technology in medicine and experimental biology", Thailand (Pattaya-Bangkok) - 2007, p.49-50. / соавт.: Nisevich L., Medjidova D., Suleimanova 1., Kushch A.

60. Цитомегаловирусная инфекция у недоношенных новорожденных детей: количественные методы лабораторного анализа. // VIII Международный конгресс "Здоровье и образование в XXI веке: концепции болезней цивилизации", 14-17 ноябрь, РУДН, Москва - 2007, стр.473474. / соавт.: Павлова М.В., Федорова Н.Е., Гаджнева З.С., Гетия Е.Г., Дегтярева М.В., Щербо С.Н., Евсегнеева Ж.В., Гущин B.C., Выжлова Е.Н., Малиновская В.В., Кущ А.А.

61. Выявление маркеров герпесвирусных инфекций у недоношенных новорожденных детей. // VI Конгресс детских инфекционистов России "Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики". 13-14 декабрь, Москва - 2007, стр.18-19. / соавт.: Гаджиева З.С., Павлова М.В., Климова P.P., Федорова Н.Е., Щербо С.Н., Евсегнеева Ж.В., Гущин B.C., Выжлова Е.Н., Малиновская В.В., Кущ А. А, Гетия Е.Г., Дегтярева М.В.

62. Персистенция герпесвирусов у детей с осложненным течением раннего неонатального периода изменяет цитокиновый статус новорожденных детей. // Мат. III Ежегодного конгресса и VI Съезда Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины «Современная перинаталогия: организация, технология и качество» (29-30 сентября) в журнале «Вопросы практической педиатрии», Москва - 2008, Том 3, №5, стр. 17-18. / соавт.: Гетия Е.Г., Паршина О.В., Гусева Т.С., Кущ А.А., Климова P.P., Гаджиева З.С., Павлова М.В., Володин Н.Н., Малиновская В.В., Дегтярева М.В.

63. Quantitative methods of analysis of cytomegalovirus infection in preterm infants during the 6 months. // Clinical Virology Annual Meeting, Saariselkfl, 12-15 March, Lapland, Finland - 2008, p.28. / соавт.: Pavlova M.V., Fedorova N.E., Gadzhieva Z.S., Kushch A.A. Getiya E.G., Degtyareva M.V., Malinovskaya V.V., Shcherbo S.V., Evsegneeva Zh.V.

64. Врожденные пневмонии как одно из проявлений внутриутробной инфекции. // Сборник материалов XVI съезда педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии», 16-19 февраль, Москва - 2009, стр.285. / соавт.: Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Парсегова Т.С., Кущ А.А.

65. Проявления внутриутробного инфицирования у доношенных и недоношенных детей (по материалам аутопсии). // Сборник материалов XVI съезда педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии», 16-19 февраль, Москва - 2009, стр.286. / соавт.: Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Парсегова Т.С., Кущ А.А.

66. Perinatal risk factors for fetal contamination (infection) pathologies and death in the perinatal and infantile period. // Abstracts 4"' Europaediatrics, Moscow - 2009, p. / соавт. Nisevich L., Talalaev A., Kask L., Kushch A,

Список использованных сокращений

АГ- антиген

АПФ - аминокислотные производные фуллерена Cf,o AT - антитело

БКМ - быстрый культуральный метод

БОЕ - бляшкообразующая единица

ВКЖ - вируссодержащая культуральная жидкость

ВУИ - внутриутробное инфицирование

ГВИ - герпесвирусные инфекции

ГЦВ - ганцикловир

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИА - индекс авидности

ИППП - инфекции, передаваемые половым путем ИФА - иммуноферментный анализ ИФН - интерферон

МИ - множественность инфицирования МКА - моноклональные антитела

ОАГА - осложненный акушерско-гинекологический анамнез

ПСА - поликлональные антитела

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР - IS - полимеразная цепная реакция in situ

ПЦР - RT - полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени РИФ (РНИФ) - реакция прямой (непрямой) иммунофлюоресценции УФ - ультрафиолет

ФЛЭЧ - фибробласты легкого эмбриона человека

ХТИ - химиотерапевтический индекс

ЦД - цитотоксическая доза

ЦМВ - цитомегаловирус человека

ЦМВИ - цитомегаловирусная инфекция

ЦПД - цитопатическое действие

Для заметок

Заказ № 85-аЛ 1/09 Подписано в печать 13.11.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2

. ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

У?)) www.cfr.ru ; е-таИ:info@cfr.ru

2007274S8S

2007274585

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Адиева, Айна Ахмедовна

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. ЦИТОМЕГАЛОВИРУС ЧЕЛОВЕКА. 13

1.1. Структура и репликация.

1.2. Внутриутробная инфекция и перинатальная патология.

1.3. Методы лабораторной диагностики ЦМВИ

1.4. Поиск и изучение новых противовирусных агентов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 77

Список основных реактивов и препаратов, использованных в работе

Пациенты.7В

Культура клеток.

Вирус.

Определение инфекционной активности вируса.

Исследуемый материал.

Выявление возбудителей ВУИ в материале аутопсии.

Быстрый культуральный метод (БКМ).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР real-time).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР in situ).

Реакция иммуноперципитации.

Твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА).

Авидность антител.

Анализ интерферонового статуса.

Определение цитотоксичности АПФ.

Определение антивирусной активности АПФ.

Определение продукции инфекционно активного вируса.

Радиоавтография.

Пролиферативная активность Клеток ФЛЭЧ в присутствии АПФ.

Статистические методы анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Глава 3. ФАКТОРЫ РИСКА ВНУТРИУТРОБНОГО

ИНФИЦИРОВАНИЯ ПЛОДА И НОВОРОЖДЕННОГО.94

3.1. Ретроспективный анализ историй матерей умерших детей.

3.2.Скрининговое вирусологическое обследование женщин.

3.3. Выявление патогенов на отпечатках органов умерших и плацент

Глава 4. РАЗРАБОТКА АЛГОРИТМА ДИАГНОСТИКИ ЦМВИ У НЕДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ С ОСЛОЖНЕННЫМ ТЕЧЕНИЕМ РАННЕГО НЕОНАТАЛЬНОГО ПЕРИОДА. 107

4.1. Частота обнаружения прямых маркеров ЦМВИ у новорожденных детей количественным вариантом БКМ, ПЦР real-time и ПЦР.

4.2. Частота обнаружения маркеров ЦМВИ у новорожденных детей методами серодиагностики.

4.3. Выявление маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей в течение первого года жизни.

Глава 5. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЧАСТОТЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ЦМВИ У ПЛОДОВ И ДЕТЕЙ, УМЕРШИХ НА ПЕРВОМ ГОДУ ЖИЗНИ. 123

5.1. Сравнительный анализ выявления ЦМВИ у плодов, умерших новорожденных детей и детей, умерших на первом году жизни.

5.2. Сравнительный анализ выявления антигенов ЦМВ в материале аутопсии различными иммунореагентами.

5.3. Использование метода ПЦР in situ для выявления ДНК ЦМВ и ВПГ на отпечатках органов.

Глава 6. АНАЛИЗ ВКЛЮЧЕНИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ И ИММУНО-МОДУЛИРУЮЩЕЙ ТЕРАПИИ В КОМПЛЕКСНОЕ ЛЕЧЕНИЕ БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН И НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ.134

6.1. Влияние прекондепдионной подготовки женщин с ОАГА на течение беременности и исходы родов.

6.2. Использование Виферона у беременных с ОАГА со второго триместра беременности до родов .:.

6.3. Анализ включения Виферона в комплексное лечение ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей.

Глава 7. ПОИСК НОВЫХ СУБСТАНЦИЙ ПРИРОДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, ОБЛАДАЮЩИХ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ЦМВ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO. 163

7.1. Изучение цитотоксичности АПФ.

7.2. Изучение антивирусной активности АПФ.

7.3. Влияние АПФ на синтез вирусных белков в инфицированных клетках.

7.4. Сочетанный эффект АПФ и Виферона.

Глава 8. ВЛИЯНИЕ ЦМВ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ КЛЕТОК И КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ. 183

8.1. Влияние экспрессии вирусных белков на развитие патологии митоза в инфицированной культуре.

8.2. Изменение пролиферативной активности клеток культуры, зараженной ЦМВ в Go, Gi и S периодах клеточного цикла.

8.3. Влияние ЦМВИ на продолжительность клеточного цикла в асинхронно -делящейся культуре.

8.4. Развитие ЦПД вируса в клетках, инфицированных в состоянии покоя и в S-фазе клеточного цикла.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. 206

ВЫВОДЫ. 237

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль цитомегаловирусной инфекции в патологии плода и новорожденного. Поиск новых противовирусных средств"

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) является одной из наиболее часто встречающихся инфекций у новорожденных и детей раннего возраста, вызывающих тяжелые патологии, вплоть до гибели ребенка [31; 65; 90; 228].

По данным отечественных и зарубежных специалистов от 0,5 до 5% детей появляются на свет с врожденной ЦМВИ, из них около 90% детей, являются асимптоматичными носителями [144; 145; 228].

Прогресс в изучении ЦМВИ связан с разработкой и широким внедрением в практику здравоохранения принципиально новых диагностических технологий — высокочувствительных и специфичных методов иммунохимии, молекулярной и клеточной биологии. В связи с этим оценка эффективности современной специфической диагностики ЦМВИ приобретает особую актуальность.

Трудности анте - и постнатальной диагностики ЦМВИ связаны с неоднозначностью возможной реализации инфекционного процесса из-за особенностей иммунной системы новорожденных и неспецифичностью клинических проявлений. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные этой проблеме, устоявшихся канонов пренатальной диагностики ЦМВИ в мире не существует. Разработка четких и общепринятых рекомендаций по лабораторному обследованию недоношенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией с подозрением на ЦМВИ и в России остается не решенной задачей. Высокая инфицированность недоношенных новорожденных детей ЦМВ ставит вопрос о своевременной диагностике ЦМВИ у беременных женщин и о вертикальной передаче вируса. В связи с этим тактика ведения беременных женщин с высоким риском инфицирования плода должна включать эффективную диагностику и своевременное начало лечения ЦМВИ.

На клеточном уровне цитопатический эффект ЦМВ проявляется в изменении морфологии клетки и ядра (увеличение размера, изменение формы), в образовании многоядерных клеток и в появлении внутриядерных включений [330].

В последние 15—20 лет основное внимание исследователей было обращено на молекулярно — биологические аспекты развития вирусной инфекции. Были идентифицированы ДНК-последовательности, кодирующие ряд белков ЦМВ человека, и установлено функциональное значение некоторых из них. Идентифицированы последовательности вирусного генома, кодирующие так называемые латентно-ассоциированные транскрипты (LAT), которые обеспечивают поддержание состояния латенции. Получены новые данные о механизмах программируемой гибели клеток под действием ЦМВ (апоптоз).

Особый интерес представляют исследования, направленные на анализ действия ЦМВ на клеточную пролиферацию. Так, группой авторов было показано, что ЦМВ стимулирует репликацию клеточной ДНК в зараженных клетках [128; 160; 205], описывали существенное возрастание митотического индекса в инфицированной культуре [124; 340]. В середине 90-х годов появилось несколько работ, опровергающих эти данные. Было показано, что вирус может блокировать прохождение клеточного цикла клетками в нескольких точках, включая переход из Gi — периода в фазу синтеза ДНК [167; 210; 268] и переход из стадии G2 в М, в точке, обозначаемой как G2/M [307; 376]. Таким образом, данные о влиянии ЦМВ на клеточную пролиферацию оказались противоречивыми и требовали дальнейшего исследования.

Фундаментальные данные о влиянии ЦМВ на клеточные структуры и жизненный цикл клетки необходимы для понимания процессов, приводящих к патологии при внутриутробном развитии детей и их гибели. Эти данные могут пролить свет на изменения, которые происходят на органном и организменном уровнях и существенно дополнить представления о механизмах развития ЦМВИ. В то же время сведения об инфицированности органов и тканей погибших детей были немногочисленными или отсутствовали. Это в особенности относится к недоношенным новорожденным детям, представляющим группу риска по развитию ЦМВИ.

Одной из сложных задач является выбор адекватной терапевтической тактики для новорожденных с ЦМВИ. Существующие на сегодняшний день единичные патентованные препараты, обладающие противовирусной активностью в отношении ЦМВ, не применяются у новорожденных и детей раннего возраста вследствие их высокой токсичности. Кроме того, эффективность лечения существующими препаратами снижена из-за развития лекарственной устойчивости, часто возникающей при длительном их применении [154; 193]. Поэтому поиск эффективных и нетоксичных анти-ЦМВ агентов, перспективных в качестве химиотерапевтических средств при ЦМВИ, остается важной проблемой. Все вышеизложенное в совокупности явилось обоснованием для проведения данного исследования.

Цель и задачи исследования:

Цель настоящей работы состояла в изучении маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей с сочетанной перинатальной патологией в течение первого года жизни и в материалах аутопсии; мониторинга метаболической и иммунной терапии; в изучении антивирусной активности аминокислотных производных фуллерена Сбо; в исследовании действия ЦМВ жизненный цикл инфицированных клеток.

Для достижения цели ставились следующие задачи: 1. Выявить прямые (ДНК и инфекционная активность) и непрямые маркеры (специфические IgM, IgG и индекс авидности IgG антител) ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей и изучить динамику их выявления в течение первого года жизни.

2. Установить возможность выявления инфекционно - активного ЦМВ с помощью быстрого культурального метода (БКМ) в материалах аутопсии плодов, умерших новорожденных и детей, умерших на первом году жизни.

3. Разработать метод ПЦР in situ для выявления ДНК ЦМВ на отпечатках различных органов. Оценить эффективность использования четырех методов лабораторной диагностики при детекции ЦМВ в материалах аутопсии.

4. Установить частоту выявления ЦМВ у беременных из группы высокого риска по перинатальному инфицированию плода и новорожденного. Оценить эффективность использования метаболических препаратов в предгравидарной подготовке и во время беременности.

5. Оценить эффективность использования Виферона у беременных с ОАГА со второго триместра беременности и у недоношенных детей с клиническими проявлениями ВУИ.

6. Изучить цитотоксичность и антивирусную активность аминокислотных производных фуллерена Сбо (АПФ) на модели экспериментальной ЦМВИ in vitro. Сравнить эффективность указанных соединений при использовании лечебной, профилактической и вирулицидной схем воздействия. Оценить сочетанный эффект АПФ и Виферона и продукцию вируса под действием АПФ.

7. Изучить изменение пролиферативной активности в асинхронно -делящейся и синхронизированной культуре фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ) под влиянием ЦМВ. Определить способность клеток ФЛЭЧ, инфицированных в разные периоды клеточного цикла, вступать в митоз.

8. Оценить развитие патологии митоза при инфицировании ЦМВ в присутствии ингибитора репликации вирусной ДНК и при инфицировании ЦМВ инактивированным УФ.

Научная новизна.

1. Впервые разработан и использован алгоритм комплексного обследования недоношенных новорожденных с клиническими признаками ВУИ вирусологическими методами (БКМ) и с помощью генодиагностики (ПЦР, ПЦР - real time) для выявления возбудителей герпесвирусных инфекций.

2. Впервые разработан метод ПЦР in situ для выявления ДНК ЦМВ на отпечатках и парафиновых срезах органов мертворожденных и детей, умерших на первом году жизни, который сочетает морфологический и молекулярный подходы и позволяет не только выявлять внутриклеточную вирусную ДНК в инфицированных клетках, но и оценить её сравнительное количество.

3. Впервые установлено, что в материалах аутопсии плодов (мертворожденных) и умерших новорожденных чаще определяется инфекционно активный ВИГ", а у детей, умерших на первом году жизни — инфекционно активный ЦМВ.

4. Показано, что антигены ЦМВ в моче у беременных обнаруживаются значительно чаще, чем у небеременных женщин детородного возраста.

5. Показано, что включение Виферона в комплексное лечение недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками внутриутробного инфицирования корректирует способность лимфоцитов к индукции синтеза ИФН-альфа, приближая его к уровню здоровых доношенных новорожденных.

6. Впервые показана низкая цитотоксичность и высокая антивирусная активность аминокислотных производных фуллерена Сбо — натриевой соли аминокапроновой кислоты (Сбо-Na-AKK) и натриевой соли аминомасляной кислоты (Сбо-Na-AMK); химиотерапевтический индекс в различных схемах воздействия для Сбо-Na-AKK составил 260-2600; для Ceo-Na-AMK - 2500-5450.

7. Впервые установлено, что в клетках, инфицированных в S-фазе клеточного цикла, удлиняется период синтеза ДНК, при этом клетки сохраняют способность вступать в митотическое деление. Остановка деления происходит в метафазе митоза.

8. Впервые показано, что патология митоза развивается в одинаковой степени в клетках, инфицированных интактным вирусом, при подавлении репликации ДНК ЦМВ, а также при заражении ЦМВ, инактивированным УФ облучением.

Практическая значимость.

На основании полученных данных о распространенности цитомегаловирусного инфицирования среди недоношенных детей с сочетанной перинатальной патологией представлено обоснование для организации лабораторного скрининга в отделениях патологии новорожденных, реанимации и интенсивной терапии.

У недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, с клиническими признаками врожденной инфекции обосновано использование Виферона с первых дней жизни.

Применение Виферона со второго триместра беременности показало отсутствие и/или снижение количества рецидивов ГВИ у беременных с ОАГА и возможность более ранней антенатальной коррекции иммунопатологических состояний плода.

Впервые на презентативном материале в системе мать-плацента-плод показаны основные факторы риска внутриутробного инфицирования плода, патологии и смерти в перинатальном возрасте неинфекционного и инфекционного генеза с выявлением широкого спектра антигенов.

Предложен новый современный метод диагностики материалов аутопсии и плацент — ПЦР in situ, позволяющий оценить количество внутриклеточной ДНК и тканевую тропность, что особенно важно в изучении патогенеза ЦМВИ.

Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения.

Методические рекомендации по использованию Виферона у недоношенных новорожденных с клиническими признаками ВУИ с первых дней жизни (2009, в печати).

Основные положения, выносимые на защиту.

3. Аминокислотные производные фуллерена Сбо эффективно подавляют экспрессию поздних структурных белков ЦМВ в зараженных клетках. Синергизм Виферона с АПФ дает основание для разработки принципиально новых схем комбинированной терапии ЦМВИ, позволяющих снизить терапевтические концентрации лекарственных соединений.

4. ЦМВ увеличивает длительность S — периода в инфицированных диплоидных фибробластах легкого эмбриона человека. Клетки, находящиеся в момент заражения в S — периоде клеточного цикла способны вступить в митоз, но необратимо блокируются в метафазе.

5. Для развития патологии митоза достаточно взаимодействия вирусной частицы с клеточной мембраной и/или проникновения вирусных белков в клетку. Синтез вирусной ДНК не является обязательным условием формирования патологических митозов.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Адиева, Айна Ахмедовна

выводы

1. Сравнительная оценка эффективности лабораторных методов выявления маркеров ЦМВИ у 204 недоношенных новорожденных детей показала, что частота определения ДНК ЦМВ методом ПЦР составила 15,9%, методом БКМ - 16,8%, двумя методами — 26,2%. Серологический анализ авидности противовирусных антител выявил прогностическую значимость низкоавидных антител. Показана необходимость комплексного использования перечисленных методов.

2. Впервые разработан и использован для диагностики внутриутробной ЦМВИ метрд ПЦР in situ при исследовании отпечатков органов и тканей умерших новорожденных. Метод позволяет визуализировать инфицированные клетки, оценить локализацию и сравнительное количество внутриклеточной вирусной ДНК.

3. У новорожденных с признаками внутриутробного инфицирования (ВУИ) прямые маркеры ЦМВ обнаруживаются в 26% случаев, а у новорожденных без признаков ВУИ - в 5 раз реже (в 5% случаев). Через 1-3 месяца у 68% внутриутробно инфицированных происходит элиминация ЦМВ. У 19,2% к трем месяцам, еще у 11,5% к 6 месяцам неинфицированных детей маркеры ЦМВ появляются впервые. Эти данные свидетельствуют о том, что для достоверной диагностики ЦМВИ необходимо неоднократное обследование.

4. Установлено, что применение виферона со второго триместра беременности приводит к снижению частоты осложнений беременности в 2-2,5 раза и к снижению патологии у новорожденных детей с 26,7% до 5,2%. Включение Виферона в комплексное лечение недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ оказывает иммунокорригирующий эффект и снижает смертность при жизнеугрожающих состояниях неонатального периода.

5. Использование в предгравидарной подготовке женщин метаболической терапии за 2 - 4 месяца до наступления беременности позволяет существенно улучшить течение беременности и исходы родов. Использование метаболической терапии только в период беременности по этим показателям является недостаточной.

6. Впервые установлено, что развитие ЦМВИ зависит in vitro от фазы клеточного цикла в момент заражения. ЦМВ блокирует вступление клеток ФЛЭЧ в S-период при заражении в Go- и Gi-периодах клеточного цикла; в клетках, зараженных в S-периоде, удлиняется период синтеза ДНК, сохраняется способность вступить в митоз, который блокируется в метафазе.

8. Впервые установлено, что водорастворимые аминокислотные производные фуллерена Сбо (Na соль аминомасляной - C6o-Na-AMK и Na соль аминокапроновой кислот - C6o-Na-AKK) являются высокоэффективными ингибиторами репродукции ЦМВ в системе in vitro. Химиотерапевтический индекс (ХТИ) при различных схемах воздействия для C6o-Na-AKK составил 1150-2600; для C6o-Na-AMK - 5455450, что выше значений ХТИ для известных анти-ЦМВ препаратов.

9. Установлена синергидность антивирусного действия аминокислотных производных фуллерена и виферона на модели ЦМВИ в культуре клеток. Это указывает на перспективность разработки комбинированного лекарственного средства, сочетающего антивирусные, иммуномодулирующие и антиоксидантные свойства.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Адиева, Айна Ахмедовна, Москва

1. Адиева А., Гаджиева 3., Павлова М., Гетия Е., Володин Н. и др. Динамика маркеров герпесвирусных инфекций у недоношенных новорожденных детей в отделениях реанимации и интенсивной терапии. // Педиатрия - 2008. - Том.87, №3. С.143-144.

2. Александровский А.В., Кудашов Н.И., Ванько Л.В. Герпесвирусная инфекция у новорожденных детей. // Юж. рос. медицинский журнал -1999.-№2-3.-С.51-56.

3. Андреев С., Бабахин А., Петрухина А. и др. Иммуногенные и аллергенные свойства конъюгатов фуллерена с аминокислотами и белком. // ДАН. 2000. - Т.370, №2. - С.261-264.

4. Баранова И.П. Внебольничная смерть детей в связи с врожденными пороками и органическими поражениями нервной системы. // Журнал неврологии и психиатрии. 2000. - №3. — С.53-56.

5. Боровкова Е.И., Сидорова И.С. и др. Факторы и условия, влияющие на процесс инфицирования плода на разных сроках беременности. // Вестник РАМН 2004. - №1. - С.48-50.

6. Боровкова Е.И. Взаимодействие возбудителей инфекции с организмом беременной как фактор риска внутриутробного инфицирования плода. // Российский вестник акушера гинеколога — 2005. — Т.4, №5. С. 14-18.

7. Бочарова И.И. Клинико-иммунологические варианты патологических состояний у новорожденных, родившихся у матерей с урогенитальнойинфекцией (диагностика, прогнозирование, технологии ведения). // Автореф. дисс. . .д.м.н. — Москва — 2009. С.47.

8. Вабищевич Н.К., Полетаев А.Б. К вопросу о переносе особенностей иммунного статуса матери ее потомству. // Медицинская консультация. -1998. Том. 18, №2. - С.14-16.

9. Вашукова С.С., Макарова Н.Г. Особенности лабораторной диагностики внутриутробных инфекций методом иммуноферментного анализа. // Проблемы репродукции. 1997. - Т.З, №4. - С.78-81.

10. Винницкий О. И. Вопросы диагностики, клиники, патогенеза неразвивающейся беременности // Автореф. дисс. .д.м.н. Киев -1988.-С.34.

11. Виноградская Г.Р., Новикова JI.H., Башмакова М.А. Оптимизация ПЦР для обнаружения цитомегаловируса в моче новорожденных. // Вопросы вирусологии. 1994. - Т.4. - С.171-174.

12. Володин Н.Н. Перинатология. Исторические вехи, перспективы развития. (Актовая речь, подготовленная в связи с 100-летием Российского государственного медицинского университета). // Вопросы практической педиатрии. 2006.- Т.1, №3.- С.5-24.

13. Володин Н.Н. Показатели смертности и рождаемости в Российской Федерации. // Педиатрия: Журнал им. Г. Н. Сперанского. 2006. - № 1 . -С.5-8.

14. Володин Н.Н., Дегтярев Д.Н. Методологические аспекты лабораторной диагностики внутриутробных инфекций у детей. // Клиническая лабораторная диагностика. 2003. - №3. - С.7-10.

15. Володин Н.Н. Протоколы диагностики, лечения и профилактики внутриутробных инфекций у новорожденных детей. — РАСПМ. -Москва. 2002.

16. Владимирова Н.Ю., Наговицына Е.Б., Сятковская A.JI. и др. Эпидемиологические аспекты репродуктивных потерь. // Проблемы репродукции 2001. — Т.7, №3. - С.54-57.

17. Вольпин М.Е., Парнес З.Н., Романова B.C. Химия природных соединений и биоорганическая химия. // Известия академии наук. Серия химическая. 1998. - №5. - С.1050-1055.

18. Воронцова Ю.Н., Володин Н.Н., Дегтярев Д.Н. и др. Сравнительный анализ клинических и лабораторных характеристик врожденной цитомегаловирусной инфекции у недоношенных детей. // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2004. - Т.49, № 2. - С.60-65.

19. Выжлова Е.Н. Антивирусная активность новой лекарственной формы интерферона для местного применения. / Авт. дисс. .к.б.н. Москва — 2008. - С.23.

20. Гаджиева З.С., Адиева А.А., Климова Р.Р., Кущ А.А. и др. Сравнительный анализ маркеров герпесвирусных инфекций у недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками внутриутробной инфекции. // Герпес. — 2009. — №3. С. 19-23.

21. Гатич Р.З., Колобухина JI.B., Исаева Е.И., Бурцева Е.И. и др. Эффективность Виферона при гриппе у взрослых больных. // Русский медицинский журнал. 2004. - Т. 12, №14. - С.898-900.

22. Григорян С.С., Ершов Ф.И. Методологические принципы определения интерферонового статуса. В книге: Система интерферона в норме и при патологии. -М.: Медицина. — 1996. — С.147-155.

23. Гришаев М.П. Цитомегаловирусная инфекция и ее лабораторная диагностика. // Новости Вектор-Бест. 1996. - №1. - С.46.

24. Дегтярев Д.Н., Дегтярева М.В., Ковтун И.Ю., Шаламова Л.В. Принципы диагностики внутриутробных вирусных инфекций у новорожденных и тактика ведения детей группы риска. // Перинатология сегодня. 1997. - №3. - С. 18-24.

25. Демидова С.А., Семенова Е.И. и др. Цитомегаловирусная инфекция человека. Москва. Медицина. - 1976. - С. 167.

26. Дёмина Ю.А. Отдаленный катамнез детей, рожденных от матерей с цитомегаловирусной инфекцией. // Российская оториноларингология. — 2005.-№5 (18).-С.51-53.

27. Дёмина Ю.А. Цитомегаловирусная инфекция как одна из причин нейросенсорной тугоухости у детей (краткое сообщение). // Российский вестник перинатологии и педиатрии. — 2006. — Т.51, №1. С.57.

28. Диагностика и лечение внутриутробных инфекций: Методические рекомендации для врачей — неонатологов. Под. ред. Володина Н.Н., Дегтярева Д.Н. Москва. 1998.

29. Дроздова С. Г., Долгих Т. И., Белослюдцева JI. Н. и др. Внутриутробные инфекции в структуре заболеваемости и смертности новорожденных городского клинического перинатального центра. // Детские инфекции. -2004. № 1 . - С.60-62.

30. Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и при патологии. — М.: Медицина. 1996. - С.240.

31. Заводнова О.С., Безроднова С.М. Особенности развития у новорожденных и детей первых месяцев жизни цитомегаловирусного менингоэнцефалита // Научно-практический журнал Союза педиатров России «Вопросы современной педиатрии» 2005. — С. 179.

32. Ивановская Т.Е., Леонова Л.В. Патологическая анатомия болезней плода и ребенка. М.: Медицина. 1989. - С. 266-272.

33. Ивахнишина Н.М., Островская О.В., Когут Е.П. Оптимальный метод выделения нуклеиновых кислот вирусов в аутопсийном материале. // Дальневосточный медицинский журнал. 2008. - №4. - С. 104-105.

34. Каражас Н.В. Цитомегаловирусная инфекция — типичный представительIоппортунистических инфекций. // Вестник РАМН. — 1997. №2. — С.34-38.

35. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. // Изд-во «Фолиант» Москва 2008. - С.392.

36. Кирилочев O.K. Клинические проявления цитомегаловирусной инфекции у новорожденных детей. // В сборнике: Астрах, гос. мед. акад. Астрахань. 1996. - Т.2, №4. - С.148-150.

37. Кистенева Л.Б. Цитомегаловирусная инфекция как проблема перинатальной патологии: классификация, клинические проявления, дифференциальный диагноз, лечение, профилактика. // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2003. - №5. - С.52-56.

38. Кистенева Л.Б., Мартынова К.А., Хижнякова Т.М., Чешик С.Г. Цитомегаловирусная инфекция у беременных. Диагностика, трактовка результатов обследования. // Вопросы вирусологии. 2003. - №6. - С.4-7.

39. Кицак В.Я. Вирусные инфекции у беременных: патология плода и новорожденных // Методические рекомендации. Кольцово — 2005.

40. Клишо В.Е., Арестова И.М. Прогнозирование реализации перинатальных инфекций и повреждений у новорожденных детей. // Internat. Euro-asian congress on infection diseases. Раздел: патогенез инфекционных болезней. Vitebsk — 2008. - С.93.

41. Клиническая иммунология: В 3-х т. Под ред. Акад. РАМН Е.И.Соколова. -М.: Медицина. 1998. - С.228.

42. Ковальчук Л.В., Макаров О.В., Ганковская JI.B. и Бахарева И.В. Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет — Москва-2007.-С. 176.

43. Ковтун И.Ю. Характер и течение перинатальной патологии у детей, внутриутробно инфицированных вирусами семейства герпеса. // Автореф. дисс. .к.м.н. Москва. 2000. - С.24.

44. Колесникова И. К. Состояние иммунитета на системном уровне и в эндометрии у женщин с невынашиванием беременности ранних сроков инфекционного и гормонального генеза. // Авт. дисс. .к.м.н — Иваново. -2004.-С.25.

45. Комиссарова И.А. Информативность ферментного статуса лейкоцитов крови в оценке организма в норме и при патологии у детей. // Автореф. дис. .д.м.н. Москва. - 1983. —С.34.

46. Коровина Н.А., Заплатников А.Л., Чебуркин А.В., Захарова И.Н. Цитомегаловирусная инфекция у детей раннего возраста (Клиника, диагностика, современные возможности терапии). // Руководство для врачей. Москва. 2001. - С.64.

47. Кочергина С.А., Теплова С.Н., Русанова Н.Н., Малиновская В.В., Посевая Т.А. Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции у детей первых месяцев жизни. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2000. - №2. - С. 116-118.

48. Кравченко Л.В., Афонин А.А., Ефанова Е.А., Пастельная О.А., Крутящая И.Б. Клинико-иммунологические аспекты цитомегаловирусной инфекции у новорожденных. // Современные технологии в педиатрии и детской хирургии. 2003. - С.196-197.

49. Кулаков В.И., Гуртовой Б.Л. и др. Цитомегаловирусная инфекция в акушерстве. // Москва, Гэотар-мед. 2001. - С.32.

50. Кутбутдинова М.Х., Кусельман А.И., Мац А.Н. Иммунотерапия новорожденных с пневмониями. // Аллергология и иммунология. — 2003. Т.4, №4. - С.12 — 17.

51. Макарова Н.Е., Кущ А.А., Атанадзе С.Н., Масалова О.В. и др. Получение моноклональных антител к сверхранним белкам цитомегаловируса человека и их применение для выявленияинфицированных клеток. // Вопросы вирусологии.- 1996. Том 41, № 1. -С.28-32.

52. Малиновская В.В. Виферон и его применение в перинатологии и педиатрии при инфекционной патологии. // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2004. - Т.44, №3. - С.36-43.

53. Малиновская В.В. Результаты клинических испытаний рекомбинантных интерферонов и перспективы их применения. / В кн. Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и при патологии. — М.: Медицина. — 1996. С.171-195.

54. Малкова Е.М., Гришаева О.Н. Диагностика внутриутробных инфекций у новорожденных детей методом полимеразной цепной реакции. — 2004. — Томск. С.38.

55. Манзенюк О.Ю. Москалец О.В. Цитомегаловирусная инфекция у детей с различной инфекционно-воспалительной патологией. // Медицинская иммунология. 2003. - №3/4. - С.305-306.

56. Матвеев В.А. Цитомегаловирусная инфекция у детей (клинико-эпидемиологические и иммунологические аспекты). // Автореф. дисс. . .д.м.н. СПб. - 1997. - С.67.

57. Меджидова А.А. Выявление белков цитомегаловируса в клетках и тканях плодов и умерших детей. Патологическое действие цитомегаловируса на клеточный цикл и структуры митотического аппарата. // Автореф. дисс. . .к.б.н. — Москва. 2002. - С.25.

58. Меджидова М.Г., Адуева С. М., Федорова Н. Е. и др. Выявление маркеров вирусов простого герпеса и цитомегалии у новорожденных и детей раннего возраста. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2005. - №5. - С.74-80.

59. Медицинская вирусология. Рук. Под редакцией Львова Д.К. — Москва — 2008.-С.656.

60. Миллер Г.Г., Романова B.C., Покидышева JI.H., Титова И.В и др. Аминокислотные и дипептидные производные фуллерена С60 подавляют репродукцию ВИЧ. // Антибиотики и химиотерапия. — 2004. — Т. 49, №12. — С.3-8.

61. Московская И.А., Деленян Н.В., Атяшева Л.Н. и др. Опыт применения рекомбинантного интерферона альфа — 2 в лечении перинатальных вирусных гепатитов. // Детский доктор. — 2000. №4. — С. 12-14.

62. Нарциссов Р.П. Цитохимия ферментов лейкоцитов в педиатрии. // Автореф. дис. .д.м.н. Москва. - 1970. - С.48.

63. Нисевич Л. Л., Талалаев А. Г., Каск Л. Н. и др. Значение врожденных вирусных инфекций как причины перинатальной и младенческой смертности. // Вопросы современной педиатрии. 2005. - Том 4, № 2 . -С. 19-25.

64. Нисевич Л.Л., Бахмут Е.В., Королькова Е.Л., Косидеева С.Г., Гришина М.Э., Умарова А.А. К вопросу о диагностике внутриутробной инфекции у новорожденных. // Акушерство и гинекология. 1998. - №3. - С. 16-20.

65. Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.Н. и др. Значение различных вирусных инфекций в невынашивании, мертворождении, перинатальной и младенческой смертности. // Педиатрия. 1999. - №1. - С.4-10.

66. Носик Н.Н., Кондраншна Н.Г., Григорьева А.Ю., Лялина И.К., Раснецов Л.Д. Фуллевир. Изучение противогерпетической эффективности in vivo и in vitro. // Вопросы вирусологии. — 2009. №1. - С.15-18.

67. Ожегов A.M., Мальцев С.В., Мякишев Л.С. Клинико-иммунологическая характеристика активной цитомегаловирусной и сочетанной с нейинфекции у детей первого года жизни. // Педиатрия. 2001. - №2. - С.26-31.

68. Орехов К.В., Голубева М.В., Барычева Л.Ю. Врожденная цитомегаловирусная инфекция. // Детские инфекции. — 2004. №1. - С. 49.

69. Орехов К.В., Яненко И.А., Безроднова С.М. Факторы риска развития внутриутробной герпетической инфекции // В сборнике: Здоровье и болезнь как состояние человека. Ставрополь. 2000. - С. 225-227.

70. Островская О.В. Внутриутробные инфекции, клинико-морфологическая оценка современной специфической диагностики. // Автореф. дисс. .д.м.н. Хабаровск. - 2009. - С.45.

71. Пенкина Н.И., Шкляева Е.Ю., Лопатина Л.Н. и др. Внутриутробные инфекции в структуре младенческой смертности. В кн.: Проблемы внутриутробной инфекции плода и новорожденного. Москва. 2000. -С.334.

72. Перламутров Ю.Н., Чернова Н.И. Применение "Панавира" в лечении цитомегаловирусной инфекции с активацией процесса в области малого таза. // Доклады научно-практической конференции — Саратов. — 2006.

73. Пестрикова Т.Ю., Юрасова Е.А., Бутко Т.М. Перинатальные потери. Резервы снижения. — Литера 2008. — С. 208.

74. Пиотровский Л.Б., Козелецкая К.Н., Медведева Н.А. и др. Влияние комплекса фуллерена Сбо с поливинилпирролидоном на репродукцию вирусов гриппа. // Вопросы вирусологии. 2001. - №3. — С.38-42.

75. Попов С.Д. Патологическая анатомия и молекулярно-биологическая диагностика цитомегаловирусной инфекции. // Автореф. дисс. . к.м.н. -СПб. 1993.-С.32.

76. Пустовойт Б., Герман Ф., Макарова Н. и др. Динамика иммунного ответа при первичной ЦМВИ и при реактивации цитомегаловируса у больных после аллотрансплантации органов. // Вопросы вирусологии. 2001. -№3. - С.23-29.

77. Пустотина О.А., Бубнова Н.И. Диагностика внутриутробной инфекции (компоненты последа и амниотической жидкости). // Акушерство и гинекология. 1999. - №4. - С.3-5.

78. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Руководство по применению прикладных программ Statistica. // Москва -2006.-С.305.

79. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ. // Москва: Мир 2007. - С. 592, с ил.

80. Росляков А.Д., Андриевский Г.В., Петренко и др. Цитотоксические и антиоксидантные свойства водных растворов нативных фуллеренов в системах in vitro. // Журнал АМН Украины. 1999. - Т.5, №2. - С.338-346.

81. Самохин П.А. Цитомегаловирусная инфекция у детей: Клинико-морфологические аспекты. М.: Медицина. 1991. - С. 165.

82. Самсыгина Г.А., Буслаева Г.Н. Гематологическая и иммунологическая характеристика внутриутробных инфекций у детей. // Педиатрия. 1997. - №4. - С.59-62.

83. Самсыгина Г.А., Герасимова Н.В., Першина Г.Д. Врожденная вирусная инфекция: динамика за 10 лет. Современные технологии в педиатрии и детской хирургии. // Материалы Конгресса. 2003. - С.207-208.

84. Сербии А.В. Пути создания биоселективных полимерных систем комбинированного противовирусного действия. // Автореф. дисс. . д.х.н. Москва. - 2004. - С.48.

85. Серова О.Ф. Предгравидарная подготовка женщин с невынашиванием беременности. // Автореф. дисс. . д.м.н. Москва. — 2000. — С.46.

86. Сидельникова В.М. Привычная потеря беременности. — М.Триада — X. — 2002.-С.304.

87. Сидельникова В.М., Сухих Г.Т. Иммунологические аспекты привычного невынашивания беременности. Иммунология и иммунопатология системы мать плод — новорожденный. - Москва. - 2001 — С. 104.

88. Сидорова И.С., Макаров И. О., Воеводин С. М. Диагностика и лечение внутриутробной инфекции в различные периоды беременности. // Акушерство и гинекология 2004 - №2. - С.40-45.

89. Талалаев А.Г., Самсыгина Г.А. Перспективы снижения перинатальной и младенческой смертности. // Педиатрия. 1992. - №1. - С.7-10.

90. Талалаев А.Г., Нисевич Л.Л. Основные причины смерти новорожденных в кн.: Руководство по педиатрии. Неонатология (под редакцией Яцык Г.В., Самсыгиной Г.А.) Москва - 2007 - С. 464.

91. Тареева Т.Г. Перинатальные аспекты смешанной урогенитальной инфекции (патогенез, прогнозирование, профилактика). // Автореф. дисс. . .д.м.н. Москва. — 2000. — С46.

92. Тимофеев Д.И., Перминова Н.Г., Сербии А.В., Тимофеев И.В. Мембранотропные соединения и препараты, воздействующие на ранние стадии ВИЧ-инфекции. // Антибиотики и химиотерапия. 2003. — Т.48, №2. — С.32-35.

93. Тютюнник B.JI. Особенности течения беременности, родов и послеродового периода при плацентарной недостаточности инфекционного генеза. // Акушерство и гинекология 2004 - №5. - С.13-17.

94. Тютюнник В.Д., Логинова Н.С. Влияние иммунокорригирующей терапии на течение и исход беременности у пациенток с вирусной инфекцией и плацентарной недостаточностью. // Российский вестник акушерства и гинекологии. 2001. - Т.4, №6. - С.9-12.

95. Учайкин В.Ф., Чередниченко Т.В., Ковалев О.Б. Комбинированная терапия при хронических вирусных гепатитах у детей. // Детские инфекции.-2003. -№1.-С. 13-16.

96. Федорова Н.Е., Меджидова М.Г., Воронцова Ю.Н., Дегтярев Д.Н. и др. Количественные лабораторные методы для диагностики цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей. // Вопросы вирусологии. 2005 - Т.50, № 1. - С.9-14.

97. Хахалин Л.Н. ВВЗ и ЦМВ-инфекции у беременных и новорожденных // Неизвестная инфекция: Герпес. - Смоленск. - 1997. - С.93-99.

98. Цинзерлинг А.В. Современные инфекции: Патологическая анатомия и вопросы патогенеза. СПб.: Сотис. 1993. — С.93.

99. Цинзерлинг В.А., Мельникова В.Ф. Перинатальные инфекции. (Вопросы патогенеза, морфологической диагностики и клинико-морфологических сопоставлений). // Практич. руков. СПб. Элби СПб. — 2002.

100. ПЗ.Чешик С.Г. Внутриутробная цитомегаловирусная инфекция. Метод. Реком № 12. Москва. - 2001. - С.18-32.

101. Чешик С.Г., Кистенева Л.Б., Стаханова В.М. и др. Диагностика и лечение цитомегаловирусной инфекции у беременных женщин. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2005. - №5. - С.27-33.

102. Чешик С.Г., Малышев Н.А., Досев Л.Д. Внутриутробное инфицирование плода вирусом цитомегалии и форма инфекции у новорожденных. // Рос. вест, перинатологии и педиатрии. 1995. - № 2. - С.20-24.

103. Шабалдин А.В., Балянова Л.А., Казакова Л.М., Симонова Т.А., Брусина Е.Б., Райхель В.В. Применение полимеразной цепной реакции в диагностике внутриутробных инфекций у плодов и новорожденных. // Педиатрия. 2000. - №3. - С.38-41.

104. Шарапова О.В., Кокорина Е.В. Состояние здоровья детей и женщин в Российской Федерации. // Вопросы практической педиатрии. 2006. -Т.1, №3. - С.25-29.

105. Шахгильдян В.И., Шипулина О.Ю., Каражас Н.В. и др. Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2001. - №1.- С. 36-39.

106. Шищенко В.М. Клинико-цитохимические основы прогнозирования здоровья, роста и развития новорожденных и детей раннего возраста. // Автореф. дисс. докт. мед наук. Москва. - 1988. - С.48.

107. Юрасова Е.А. Преждевременные роды. //Дальневосточный медицинский журнал. 2008. - № 3 - С.118-122.

108. Abraham К.A., O'Kelly P., Spencer S., Hickey D.P. et. al. Effect of cytomegalovirus prophylaxis with acyclovir on renal transplant survival. // Ren. Fail. -2008. Vol.30, №2. -P.141- 146.

109. Abraham В., Lastere S., Reynes J., Bibollet-Ruche F. et al. Ganciclovir resistance and UL97 gene mutations in cytomegalovirus blood isolates from patients with AIDS treated with ganciclovir. // J. Clin. Virol. 1999. -Vol.13.-P.141-148.

110. AbuBakar S., Au W.W., Legator M.S., Albrecht T. Induction of chromosome aberrations and mitotic arrest by cytomegalovirus in human cells. // Environ. Mutagen. 1988. - Vol.12. - P. 409 - 420.

111. Acs N., Banhidy F., Puho E. and Czeizel A.E. No association between maternal recurrent genital herpes in pregnancy and higher risk for congenital abnormalities. // Acta Obstet. Gynecol. Scand. 2008. - Vol.87, №3. - P.292 -299.

112. Ahn J., and Hayward G. The major immediate-early proteins IE1 and IE2 of human cytomegalovirus colocalize with and disrupt PML-associated bodies at very early times in infected permissive cells. // J. Virol. 1997. - Vol.71. - P. 4599 - 4613.

113. Aigner С., Jaksch P., Winkler G., Czebe K. et. al. Initial experience with oral valganciclovir for pre-emptive cytomegalovirus therapy after lung transplantation. // Wien. Klin. Wochenschr. 2005. - Vol.117, №13-14. - P. 480-484.

114. Albercht Т., Nachtigal M., St. Jeor S.C., Rapp F. Induction of cellular DNA synthsis and increased mitotic activity in Syrian hamster embryo cells abortively infected with human cytomegalovirus. // J. Gen. Virol. 1976. -Vol.30.-P.167-177.

115. Albrecht Т., Li J., Speelman D., Ball R., Fons M., Lee С. H. et. al. Cellular responses of human cytomegalovirus infection // Birth defects: Original Article Series. 1984. - Vol.20. - P.21-34.

116. Anders D.G., Kacica M.A., Pari G., Punturieri S.M. Boundaries and structure of human cytomegalovirus oriLyt, a complex origin for lytic-phase DNA replication. // J. Virol. 1992. - Vol.66. - P.3373-3384.

117. Anders D.G., McCue L.A. The human cytomegalovirus genes and proteins required for DNA synthesis. // Intervirology. 1996. - Vol.39. - P.378-388.

118. Andrei G., De Clercq E., Snoeck R. Novel inhibitors of human CMV. // Curr. Opin. Investig. Drugs. 2008. - Vol.9, №2. - P. 132 - 145.

119. Andrei G., De Clercq E., Snoeck R. Drug targets in cytomegalovirus infection. // Infect. Disord. Drug Targets. 2009. - Vol.9. - №2. - P.201 -222.

120. Andronikou S., Kostoula A., Ioachim E. et. al. Perinatal Ebstein Barr virus infection in a premature infant. // Scand. J. Infect. Dis. 1999. - Vol.31, №1. -P.96-98.

121. Angela M. Caliendo, B. Yen-Leberman, J. Babtista, J. Andersen et. al. Comparison of Molecular Tests for Detection and Quantification of Cell-Associated Cytomegalovirus DNA. // J. CI. Microbiology. 2003. - Vol.41, №8. - P.3508-3513.

122. Агаша V., Vladareanu R., Mihailescu R. et. al. Seroprevalence and risk factors associated with herpes simplex virus infection among pregnant women. // J. Perinat. Med. 2008. - Vol.36, №3. - P.206 - 212.

123. Arav-Boger R, Pass R. Viral load in congenital cytomegalovirus infection. // Herpes. 2007. - Vol.14, №1. - P. 17 - 22.

124. Archimbaud C., Chambon M., Bailly J.L. et. al. Impact of rapid enterovirus molecular diagnosis on the management of infants, children, and adults with aseptic meningitis. // J. Med. Virol. 2009. - Vol.81, №1. - P.42 - 48.

125. Aukrust P., Meuller F. et.al. Modulation of lymphocyte and monocyte activity after intravenous immunoglobulin administration in vivo. // Clin. Exp. Immunol. 1997. - Vol.107, №1. -P.50 - 56.

126. Aukrust P., Hestdal K. et.al. Effects of intravenous immunoglobulin in vivo on abnormally increased tumor necrosis factor alpha activity in human immunodeficiency virus type 1 infection. // J. Infect. Dis. — 1997. — Vol.176, №4. — P.913 - 923.

127. Baccard-Longere M., Freymuth F., Cointe D. et.al. Multicenter evaluation of a rapid and convenient method for determination of cytomegalovirus immuniglobulin G avidity // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunilogy. 2001. - Vol.8.-P.429-431.

128. Bain M. and J. Sinclair. The S phase of the cell cycle and its perturbation by human cytomegalovirus. // Rev. Med. Virol. 2007. - Vol.17. - P.423 - 434.

129. Baldick C. J., & Shenk T. Proteins associated with purified human cytomegalovirus particles. // J. Virol. 1996. - Vol.70. - P.6097- 6105.

130. Barbi M., Binda S., Caroppo S., Primache V. Neonatal screening for congenital cytomegalovirus infection and hearing loss. // J. Clin Virol. — 2006. Vol.35, №2. - P.206 - 209.

131. Barbi M., Binda S., Caroppo S. Diagnosis of congenital CMV infection via dried blood spots. // Rev. Med. Virol. 2006. - Vol.16. - P.385-392.

132. Barbi M., Binda S., Caroppo S. et. al. A wider role for congenital cytomegalovirus infection in sensorineural hearing loss. // Pediatric Infect. Dis. 2003. - Vol.22. - P.3SM2.

133. Barbi M., Binda S., Caroppo S. et. al. Multicity Italian study of congenital cytomegalovirus infection. // Pediatric Infect. Dis. J. — 2006. Vol.25. -P.156-159.

134. Barinsky I.F., Krentsel B.A., Gribencha S.V., Serbin A.V. et. al. Furan-maleic anhydride copolymers and their potential uses in the chemotherapy of viral infections. // Sov. Med. Rev. Virology Reviews. - 1991. - №4. -P.79 - 102.

135. Benco D.M., Gibson W. Primate cytomegalovirus glycoproteins lectin-binding properties and sensitivities to glycosidases. // J. Virol. 1986. -Vol.59. - P. 703 - 713.

136. Benharrosh J., Dauphin H., Porcheret H. et. al. Comparison of two ELISA tests to study the seroprevalence of herpes simplex 1 et 2 infection in a maternity near Paris. // Ann. Biol. Clin. (Paris). 2008. - Vol.66, №6. - P.665 -670.

137. Biri A., Bozdayi G., Cicfti В., Dine В., Yocel A., Rota S. The detection of CMV in amniotic fluid and cervicovaginal smear samples by real-time PCR assay in prenatal diagnosis. // Arch. Gynecol. Obstet. 2006. - Vol.273, №5. -P.261-266.

138. Biron K.K. Antiviral drugs for cytomegalovirus diseases. // Antiviral Res. -2006.-Vol.71, №2-3.-P.154- 163.

139. Biron K.K., Harvey R.J., Chamberlain S.C. et al. Potent and selective inhibition of human cytomegalovirus replication by 1263W94, a benzimidazole 1-riboside with a unique mode of action. // Antimicrob. Agents Chemother. 2002. - Vol.46. - P. 2365-2372.

140. Bodeus M., Van Ranst M., Bernard P. et. al. Anticytomegalovirus IgG avidity in pregnancy: prospective study. // Fetal Diagnosis Therapy. — 2002. Vol.17. - P.362 - 366.

141. Boeckh M., Huang M., Ferrenberg J., Stevens-Ayers T. et. al. Optimization of quantitative detection of cytomegalovirus DNA in plasma by real-time PCR. // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol.42, №3. - P.l 142 - 1148.

142. Boeckh M., G. Boivin. Quantitation of cytomegalovirus: methodologic aspects and clinical applications. // Clinical Microbiol. Rewiews. 1998. -Vol.l 1, №3. - P.533—554.

143. Boldogh I., AbuBakar S., Albrecht T. Activation of proto-oncogenes: an immediare early event in human cytomegalovirus infection. // Science. -1990. Vol.247. - P.561 - 564.

144. Bonin L.R., McDougall J.K. Human cytomegalovirus DE2 86-kilodalton protein binds p53 but does not abrogate Gi checkpoint function. // J. Virol. -Aug. 1907. V.71, №8. - P.5861 - 5870.

145. Bosi S., Da Ros Т., Spalluto G., Balzarini J., Prato M. Synthesis and anti-HIV properties of new water-soluble bis-functionalized 60. fullerene derivatives. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003. - Vol.13, №24. - P.4437 - 4440.

146. Boutell С., and R. D. Everett. Herpes simplex virus type 1 infection induces the stabilization of p53 in a USP7- and ATM-independent manner. // J. Virol.- 2004. Vol.78. - P.8068 - 8077.

147. Bresnahan W. A., T. Albrecht and E. A. Thompson. The cyclin E promoter is activated by human cytomegalovirus 86-kDa immediate early protein. // J. Biol. Chem. 1998. - Vol.273. -P.22075 - 22082.

148. Bresnahan W. A., Thompson E. A., and T. Albrecht. Human cytomegalovirus infection results in altered Cdk2 subcellular localization. // J. Gen. Virol. -1997. №78. -P.1993 - 1997.

149. Bresnahan W.A., Boldogh I., Thompson E.A., Albrecht T. Human cytomegalovirus inhibits cellular DNA synthesis and arrests productively infected cells in late Gl. // Virology. 1996. - Vol.224. - P.l50-160.

150. Bresnahan, W. A., & Shenk, T. UL82 virion protein activates expression of immediate early viral genes in human cytomegalovirus infected cells. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol.97. - P.14506- 14511.

151. Britt W.J., Auger D. Synthesis and processing of the envelope gp55-116 complex of human cytomegalovirus. // J. Virol. 1986. - Vol.58. - P.185-191.

152. Britt W.J., Mach M. Human cytomegalovirus glycoproteins. // Intervirology.- 1996. Vol.39. - P.401-412.

153. Browne E.P., Shenk Т. Human cytomegalovirus UL83-coded pp65 virion protein inhibits antiviral gene expression in infected cells. // Proc. Nat. Acad. Sci. -2003. Vol.100, №20. — P.11439 - 11444.

154. Burkhardt C., Himmelein S., Britt W., Winkler Т., Mach M. The glycoprotein N subtypes of human cytomegalovirus induce a strain-specific antibody response during natural infection. // J. Gen. Virol. 2009. - May 6. Epub ahead of print.

155. Burshtein M., Serbin A., Bukrinskaya A. Effect of different adamantane and norbornene derivatives on HIV-l infection in vitro. // Antiviral Research. -2006.-70(1).-P.45.

156. Bystrevskaya V., Lobova Т., Smirnov V., et al. Centrosome injury in cells infected with human cytomegalovirus // J. Struct. Biol. 1997. - Vol.120. - P. 52 - 60.

157. Caliendo A. M., B. Yen-Leberman, J. Babtista, J. Andersen, C. Crumpacker et. al. Comparison of Molecular Tests for Detection and Quantification of Cell-Associated Cytomegalovirus DNA. // J. CI. Microbiology. 2003. -Vol.41, №8.-P.3508-3513.

158. Caliendo A.M., Kirsten G., Allega J. et al. Distinguishing Cytomegalovirus (CMV) Infection and Disease with CMV Nucleic Acid Assays. // Journal of Clinical Microbiology. 2002. - Vol.40. - P. 1581 - 1586.

159. Canestri A., Ghosn J., Wirden M. et. al. Foscarnet salvage therapy for patients with late-stage HIV disease and multiple drug resistance. // Antivir. Ther. — 2006. Vol.11, №5. -P.561 - 566.

160. Castillio J. P., Kowalika T. F. Human cytomegalovirus immediate early proteins and cell growth control. // Gene. 2002. - Vol.290. - P. 19-34.

161. Castillio J.P., Kowalika T.F. HCMV infection modulating the cell cycle and cell death. // Inter. Rev. of Immunology. 2004. - Vol.23. - P.l 13 - 139.

162. Castillo J., Yurochko A. and Kowalik T. Role of human cytomegalovirus immediate- early proteins in cell growth control. // J. Virol. 2000. - Vol. 74. - P. 8028 - 8037.

163. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Knowledge and practices of obstetricians and gynecologists regarding cytomegalovirus infection during pregnancy-United States, 2007. // MMWR Morb. Mortal. Wkly Rep. -2008. - Vol.57, №3. - P.65 - 68.

164. Chakrabarti S., Collingham K.E., Osman H., Fegan C.D., Milligan D.W. Cidofovir as primary pre-emptive therapy for post-transplant cytomegalovirus infections. // Bone Marrow Transplant. 2001. - Vol.28, №9. - P.879 - 881.

165. Chen K.T., Tuomala R.E., Chu C. et. al. No association between antepartum serologic and genital tract evidence of herpes simplex virus-2 coinfection and perinatal HTV-1 transmission. // Am. J. Obstet. Gynecol. — 2008. — Apr. — Vol.198, №4.-P.l -5.

166. Chen Z., Knutson E., Kurovsky A. and Albrecht T. Degradation of p21c,pl in cells productively infected with human cytomegalovirus. // J. Virol. — 2001. Vol. 75.-P. 3613 -3625.

167. Cherrington J.M., Khoury E.L., Mocarski E.S. Human cytomegalovirus ie2 negatively regulates alpha gene expression via a short target sequence near the transcription start site. // J. Virol. 1991. - Vol.65. - P.887 - 896.

168. Cherrington J.M., Mocarski E.S. Human cytomegalovirus iel transactivates the alpha promoter-enhacer via an 18-base-pair repeat element. // J. Virol. -1989. Vol.63. - P.1435 - 1440.

169. Child S. J., Hakki M., De Niro K. L. et al. Evasion of cellular antiviral responses by human cytomegalovirus TRS1 and IRS1. // J. Virol. 2004. -Vol.78, № 1. -P.197 - 205.

170. Chin K.C., Cresswell P. Virepin (cig5), an IFN-inducible antiviral protein protein directly induced by human cytomegalovirus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2001.-Dec 18. Vol.98, №26. - P.15125 - 15130.

171. Chou S. Antiviral drug resistance in human cytomegalovirus. // Transplant. Infection Disease. 1999. - Vol.1. - P.105 - 114.

172. Chou S., Marousek G.I. Maribavir Antagonizes the Antiviral Action of Ganciclovir on Human Cytomegalovirus. // Antimicrob. Agents and Chemother. 2006. - Vol.50, №10. - P.3470 - 3472.

173. Ciesla S.L., Trahan J., Wan W.B., Beadle J.R. et. al. Esterification of cidofovir with alkoxyalkanols increases oral bioavailability and diminishes drug accumulation in kidney. // Antiviral Res. 2003. - Vol.59. - P. 163 - 171.

174. Compton T. An Immortalized human fibroblasts cell line is permissive for human cytomegalovirus infection. // J. Virol. 1993. - Vol.67. - P.3644 -3648.

175. Corey L. Herpes simplex virus. In Mandell G.L., Bennet J.E., Dolin R., Doglas R.G. Principles and practice of infectious diseases. // Philadelphia: Elsevier Churchil Livinstone 2005. - P.1762 - 1780.

176. Cvetkovic R.S., Wellington K. Valganciclovir: a review of its use in the management of CMV infection and disease in immunocompromised patients. // Drugs. 2005. - Vol.65, №6. - P.859 - 878.

177. Dangel V., Bader U., Enders G. Improvement of cytomegalovirus avidity testing by adjusting the concentration of CMV-specific IgG in test samples. // J. Clin. Virol. 2006. - Vol.35, №3. - P.303-309.

178. Davis G.L., Spector G.J. Strauss M., Middlekamp J.N. Cytomegalovirus endolabyrinthitis. // Arch. Patol. Lab. Med. 1977. - Vol.101, №3. - P. 118121.

179. De Clercq E. Therapeutic potential of HPMPC as an antiviral drug. // Rev. Med. Virol. 1993. - Vol.3. - P.86 - 96.

180. De Clercq E., Holy A. Acyclic nucleoside phosphonates: a key class of antiviral drugs. // Nat. Rev. Drug Discov. 2005. - №4. - P.928 - 940.

181. De Wit D., Olislagers V., Goriely S., Vermeulen F. et. al. Blood plasmacytoid dendritic cell responses to CpG oligodeoxynucleotides are impaired in human newborns. // Blood. 2004. - Feb 1. - Vol.103, №3. - P. 1030-2.

182. DeMarchi J.M. Correlation between stimulation of host cell DNA synthesis by human cytomegalovirus and lack of expression of a subset of early virus genes. // Virology. 1983. - Vol.129. - P.274 - 286.

183. DeMarchi J.M., Kaplan A.S. Replication of human cytomegalovirus DNA: Lack of dependence on cell DNA synthesis. // J. Virol. 1976. - Vol.18. -P. 1063 - 1070.

184. DeSmet M.D., Meenken C.J., Van den Horn G.J. Fomivirsen: a phosphorothioate oligonucleotide for the treatment of CMV retinitis. // Ocul. Immunol. Inflamm. 1999. - Vol.7. -P.l 89 - 198.

185. DeVries J. The ABCs of CMV. // Adv Neonatal Care. 2007. - Vol.7(5). - P. 248 - 57.

186. Distefano A.L., Alonso A., Martin F., Pardon F. Human cytomegalovirus: detection of congenital and perinatal infection in Argentina. // BMC Pediatrics. 2004. - Vol.4. - P.4-11.

187. Dittmer D., Mocarski. Human cytomegalovirus infection inhibits Gj/S transition. // J. Virol. Feb.1997. - Vol.71, №.2. - P.1629 - 1634.

188. Dugan L., Turetsky M., Du Ch. et al. Carboxyfullerenes as neuroprotective agents. // PNAS USA. 1997. - Vol.94. - P.9434 - 9439.

189. Ducroux A., Cherid S., Benachi A., Ville Y. et.al. Evaluation of new commercial real-time PCR quantification assay for prenatal diagnosis of cytomegalovirus congenital infection. // J. Clin. Microbiol. 2008. - Vol.46, №6. — P.2078 - 2080.

190. Egorov Y., Serbin A., Alikhanova O., Burshtein M., Lupandin S., Bukrinskaya A. Raft-tropic Antivirals: 1. Synthesis and anti-HTV-1 Evaluation of Cholesten-containing Polyanions. // Antiviral Research. 2007. - 74(3). — P.49.

191. Elizabeth K. Stehel, Angela G. Shoup et al. Newborn Hearing Screening and Detection of Congenital Cytomegalovirus Infection. // Pediatrics. 2008. -Vol.121.-P.970-975.

192. Emery V.C., Hassan-Walker A.F. Focus on new drugs in development against human cytomegalovirus. // Drugs. 2002. - Vol.62, №13. - P.1853 - 1858.

193. Erice A. Resistance of human cytomegalovirus to antiviral drugs. // J. Clin. Microbiol. Rev. 1999. - №12. - P.286-289.

194. Ertl P.F., Powell K.L. Physical and functional interaction of human cytomegalovirus DNA polymerase and its accessory protein (ICP36) expressed in insert cells. // J. Virol. 1992. - Vol.66. - P.4126 - 4133.

195. Faulds D., Heel R.C. Ganciclovir. A review of its antiviral activity, pharmacokinetic properties and therapeutic efficacy in cytomegalovirus infections. // Dugs. 1990. - Vol.39. - P.597 - 638.aL

196. Fields Virology, 5 Edition. Knipe David M., Howley Peter M. // Lippicott Williams&Wilkins 2007. - P.3092.

197. Fitzgerald-Bocarsly P., Dai J., Singh S. Plasmacytoid dendritic cells and type IIFN: 50 years of convergent history. // Cytokine & Growth Factor Reviews. -2008.-Vol.l9.-P.3 19.

198. Fortunato E. A., & Spector, D. H. Regulation of human cytomegalovirus gene expression. // Adv. Virus Res. 1999. - Vol.54. - P.61 - 128.

199. Fortunato E. A., A. K. McElroy, I. Sanchez, and D. H. Spector. Exploitation of cellular signaling and regulatory pathways by human cytomegalovirus. // Trends Microbiol. 2000. - №8. - P. 111-119.

200. Fowler K.B., Stagno S., Pass R.F. Maternal immunity and prevention of congenital cytomegalovirus infection. // JAMA. 2003. - Vol.289. - P. 1008 -1011.

201. Francisci D., Tosti A., Baldelli F. et al. The pp65 antigenaemia test as a predictor of cytomegalovirus-induced end-organ disease in patients with AIDS. // AIDS. 1997. - Vol.11. - P.1341 - 1345.

202. Furnari B.A., Poma E., Kowalik Т.Е., Huang S.M., Huang E. Human cytomegalovirus immediate-early gene 2 protein interacts with itself and with several novel cellular proteins // J. Virol. 1993. - Vol.67. - P.4981 -4991.

203. Gardella С., Barnes J., Magaret A.S. et. al. Prenatal herpes simplex virus serologic screening beliefs and practices among obstetricians. // Obstet Gynecol. 2007. - Vol.110, №6. - P.1364 - 1370.

204. Gaytant M.A., Steegers E.A., Semmekrot B.A. et. al. Congenital cytomegalovirus infection: review of the epidemiology and outcome // Obstet. Gynecol. Surv. 2002. - Vol.57. - P. 245 - 256.

205. Galli L., Novelli A., Chiappini E., Gervaso P. et. al. Valganciclovir for congenital CMV infection: a pilot study on plasma concentration in newborns and infants. // Pediatr. Infect. Dis J. 2007. -Vol.26, №5. - P.451-453.

206. Gibson C.S., Goldwater P.N., MacLennan A.H. et. al. Fetal exposure to herpesviruses may be associated with pregnancy-induced hypertensive disorders and preterm birth in a Caucasian population. // В JOG. — 2008. — Mar. Vol.115, №4. - P.492 - 500.

207. Gibson W. Structural and nonstructural proteins of strain Colburn cytomegalovirus. // Virology. 1981. - Vol.111. - P. 516 - 537.

208. Gibson W. Structure and assembly of the virion. // Intervirology. 1996. -Vol.39. - P.389 - 400.

209. Gibson W., Hall M.R. Assemblin, an essential herpesvirus proteinase. // Drug Design Discov. 1997. - Vol.15. - P.39 - 47.

210. Gleaves C.A., Hursh D.A., Meyers J.D. Detection of human cytomegalovirus in clinical specimens by centrifugation culture with a nonhuman cell-line. // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol.30. - P.1045 - 1048.

211. Goedhals D., Kriel J., Hertzog M.L., Janse van Rensburg M.N. Human cytomegalovirus infection in infants with prolonged neonatal jaundice. // J. Clin. Virol. 2008. - Oct. - Vol.43, №2. - P.216 - 218.

212. Grnga A, Silverio C, Ferreira JP, Brito A, Almeida S, Paixao P, Pinheiro L. Congenital or neonatal cytomegalovirus infection? // Acta Med. Port. 2004. - Jul-Aug; 17(4). -P.335 - 340.

213. Grangeot-Keros L., Cointe D. Diagnosis and prognostic markers of HCMV infection // J. Clin. Virol. 2001. - Vol.21. - P.213 - 221.

214. Gretch D.R., Gehrz R.C., Stinski M.F. Characterization of a human cytomegalovirus glycoprotein complex (gcll). // J. Virol. 1988. - Vol.69. -P. 1205 - 1215.

215. Gretch, D. R., Kari, В., Rasmussen, L., Gehrz, R. C., & Stinski, M. F. Identification and characterization of three distinct families of glycoprotein complexes in the envelopes of human cytomegalovirus. // J. Virol. — 1988. — Vol.62. -P.875- 881.

216. Griffiths D., Coscia A., Prandi G., Borgione S., Leone A. et. al. CRIB score: mortality, morbidity, and long-term neurologic development // Acta Biomed. Aten. Parmense. 2000. - Vol.71. - P.637 - 640.

217. Guo AH, Lu M. Two cases of congenital nephrotic syndrome resulting from cytomegalovirus infection. // Zhonghua Er Ke Za Zhi. 2007. - Vol.45. -№11. - P.872-873.

218. Guo В., Dai J.R., Ng S. et.al. Cytonic acids A and B: Novel tripepside inhibitors of HCMV protease from the endophytic fungus Cytonaema Species. // J. Med. Chem. 2000. - Vol.63. - P.602-604.

219. Haddow L.J., Dave В., Mindel A. et. al. Increase in rates of herpes simplex virus type 1 as a cause of anogenital herpes in western Sydney, Australia, between 1979 and 2003.// Sex.Transm.Infect. 2006. - Vol.82. - P.255-259.

220. Hagemeier C., R. Caswell, G. Hayhurst, J. Sinclair, and T. Kouzarides. Functional interaction between the HCMV IE2 transactivator and the retinoblastoma protein. // EMBO J. 1994. - Voll3. - P.2897-2903.

221. Halwachs-Baumann G., Genser В., Pailer S., Engele H. et. al. Human cytomegalovirus load in various body fluids of congenital infected newborns. // J. Clin. Virol. 2002. - Vol.25. - P.681-687.

222. Hamprecht K., Maschmann J., Jahn G., Poets C.F., Goelz R. Cytomegalovirus transmission to preterm infants during lactation. // J. Clin. Virol. — 2008. — Vol.41, №3.-P. 198-205.

223. Hamzeh F.M., Lietman P.S., Gibson W., Hayward G.S. Identification of the lytic origin of DNA replication in human cytomegalovirus by a novel approach utilizing ganciclovir-induced chain termination. // J. Virol. 1990. -Vol.64.-P.6184-6195.

224. Hassan J, Connell J. Translational mini-review series on infectious disease: congenital cytomegalovirus infection: 50 years on. // Clin. Exp. Immunol. —2007. Aug; 149(2). - P.205-210.

225. Hertel, L., S. Chou, and E. S. Mocarski. Viral and cell cycle-regulated kinases in cytomegalovirus-induced pseudomitosis and replication. // PLoS Pathog. —2008.-Vol.82.-P. 10-19.

226. Hill J. and Roberts S. Herpes simplex virus in pregnancy: new concepts in prevention and management. // Clin. Perinatol. — 2005. Vol.32. - P.657-670.

227. Ho E.S., Lin D.C., Mendel D.B., Cihlar T. Cytotoxicity of antiviral nucleotides adefovir and cidofovir is induced by the expression of humanrenal organic anion transporter 1. //J. Am. Soc. Nephrol. 2000. — Vol.11. — P.383-393.

228. Holub M., Labska K., Roubalova K. Recurrent genital herpes. // Klin. Mikrobiol. Inf. Lek. 2008. - Vol.14, №2. -P.52-59.

229. Holwerda B.C. Herpesvirus proteases: tagets for novel antiviral drugs. // Antiviral. Research. 1997. - Vol.35. - P. 1-21.

230. Honess R.W., Roizman B. Regulation of herpesvirus macromolecular synthesis. I. Cascade regulation of the synthesis of three groups of virus proteins. // J. Virol. 1974. - Vol.14. - P.8-19.

231. Horacek J., Brucek P., Otova B. Detection of nuclear cytomegalovirus antigen in cell-culture as compared to classical virus isolation. // Acta Virol. 1991. -Vol.35.-P. 187-189.

232. Howard J., Hall В., Brennan E. et. al. Utility of newborn screening cards for detecting CMV infection in cases of stillbirth. // J. Clin. Virol. 2009. — Vol.44. -P.215-218.

233. Hsu M.L., Cheng S.N., Huang C.F., Jan C.I. et. al. Perinatal cytomegalovirus infection complicated with pneumonitis and adrenalitis in a premature infant. // J. Microbiol. Immunol. Infect. 2001. - Vol.34, №4. - P.297-300.

234. Huang E.S., Pagano J.S. Nucleic acid hybridization technology and detection of pro viral genomes. // Methods Virol. 1977. - Vol.6. - P.457-497.

235. Hume A.J., J. S. Finkel, J. P. Kamil, D. M. Coen, M. R. Culbertson, and R. F. Kalejta. Phosphorylation of retinoblastoma protein by viral protein with cyclin-dependent kinase function. // Science. 2008. - Vol.320. - P.797-799.

236. J.van Doornum G., Guldemeester J., Osterhaus A. D., Niesters H.G. Diagnosing Herpesvirus Infections by Real-Time Amplification and Rapid Culture. // J. of Clin. Microbiol. 2003. - Vol.41, №2. - P.576-580.

237. Iskenderian AC, Huang L, Reilly A. et al. Four of eleven loci required for transient complementation of human cytomegalovirus DNA replication cooperate to activate expression of replication genes. // J. Virol. — 1996. — Vol.70. -P.383-392.

238. Istas A.S., Demmler Y.J. et al. Surveillance for congenital cytomegalovirus diseases: a report from the National Congenital Cytomegalovirus Diseases Registry. // Clin. Infect. Dis. 1995. - Vol.20,№3. - P.665-669.

239. Jensen A., Wilson S., Schuster D. Biological Applicatins of fullerenes. // Bioorganic&Medical Chemistry. 1996. - Vol.4, №6. - P.767-779.

240. Kaiser 1., Perrin L., Halaya K. et al. Improved monitoring of cytomegalovirus infection after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation by an ultrasensitive plasma DNA PCR assay. // J. CI. Microbiology. 2002. -Vol.40, №1. - P.4251-4255.

241. Kalejta R. F. and T. Shenk. Manipulation of the cell cycle by human cytomegalovirus. // Front Biosci. 2002. - №7. - P.295-306.

242. Kamiya S., Tanaka J., Ogura Т., Ogura H., Sato H. et. al. Rabbit kindey cells abortively infected with human cytomegalovirus are arrested in mitotic phase. // Arch. Virol. 1986. - Vol.89. - P.131-144.

243. Kanich R.E., Craighead J.E. Human cytomegalovirus infection of cultured fibroblasts. II. Viral replicative sequence of a wild and an adapted strain. // Lab. Invest. 1972. - Vol.27. -P.237-282.

244. Karen B. Fowler., Robert F. et.al. Risk factors for congenital cytomegalovirus infection in the offspring of young women: exposure to young children and recent onset of sexual activity. // Pediatrics. 2006. - Vol.l 18. - P.286-292.

245. Kari В., Gehrz R. A human cytomegalovirus glycoprotein complex designated gC-II is a major heparin-binding component of the envelope. // J. Virol. 1992. - Vol.66. - P. 1761-1764.

246. Kari В., Gertz R. Characterization of cytomegalovirus glycoproteins in a family of complexes designated gC-П with murine monoclonal antibodies. // Arch. Virol. 1990. - Vol.l 12. - P.55-65.

247. Kaspzak A., Zabel M., Wysocki J. et. al. Detection of DNA, mRNA and early antigen of the human cytomegalovirus using the immunomax technique in autopsy material of children with intrauterine infection. // Virch. Arch. 2000. - Vol.437, №5. - P.482-490.

248. Kenneson A, Cannon MJ. Review and meta-analysis of the epidemiology of congenital cytomegalovirus (CMV) infection. // Rev. Med. Virol. 2007. -Jul-Aug; 17(4). - P.253-276.

249. Kiezebrink-Lindenhovius H.H., van den Berg Y.L., Sprikkelman A.B., Weel J.F., Veenhoven R.H. Cytomegalovirus infection: congenital or postnatallyacquired? Importance of the Guthrie card. //Ned. Tijdschr. Geneeskd. 2001. - Vol.45, №26. — P.1259-1261.

250. Kimberlin D.W. Herpes simplex virus infections in newborn. // Semin.Perinatol. 2007. - Vol.31. - P. 19-25.

251. Kimberlin D.W., Lin C.Y. Effect of ganciclovir therapy on hearing in symptomatic congenital cytomegalovirus disease involving the central nervous system: a randomized, controlled trial. // J. Pediatr. — 2003. — Vol.143.-P.16-25.

252. Kociecki J., Kociecka W., Dmitriew A: Cytomegalovirus infection—selected aspects of clinical pathology. // Klin Oczna. 2007. - 109 (1-3). - P.74-8.

253. Kotelnikova R., Bogdanov G., Romanova V. et al. Features of the effect of C60 amino acid derivates on the structure and functions of biomembranes. // Mol.Mat. 1998. - Vol.11. - P.l 11-116.

254. Kotelnikova R., Kotelnikov A., Bogdanov G. et al. Membranotropic properties of the water soluble amino acid and peptide derivates of fullerene C60. // FEBS Letters. 1996. - Vol.389. - P.l 11-114.

255. Kovacs A.S., Churchill M.A., Wood D., et al. Molekular and epidemiologic evaluations of a cluster of cases of Menetriers disease associated with cytomegalovirus // Pediatrics Infectious Disease Journal (R). 1993. - Vol. 12, №12.-P.1011-1014.

256. Kriebs J.M. Breaking the cycle of infection: TORCH and other infections in women's health. // J. Midwifery Womens Health. 2008. - Vol.53, №3. -P. 173-174.

257. Kriebs J.M. Understanding herpes simplex virus: transmission, diagnosis, and considerations in pregnancy management. // J. Midwifery Womens Health. -2008. Vol.53, №3. - P.202-208.

258. Kronschnabl M., M. Marschall and T. Stamminger. Efficient and tightly regulated expression systems for the human cytomegalovirus majortransactivator protein Ш2р86 in permissive cells. // Virus Res. 2002. — Vol.83. - P.89-102.

259. Krosky P.M., Baek M.C., Coen D.M. The human cytomegalovirus UL97 protein kinase, an antiviral drug target, is required at the stage of nuclear egress. // J. Virol. 2003. - Vol.77. - P.905-914.

260. Isaacson M.K., Compton T. Human cytomegalovirus glycoprotein В is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress. // J. Virol. 2009. - Vol.83, №8. - P.3891-3903.

261. L. Landolfo S., Gariglio M., Gribaudo G., Lembo D. The human cytomegalovirus. // Pharmacology & therapeutics. — 2003. — Vol.98. — P.269-297.

262. Lanari M., Lazzarotto Т., Venturi V., Papa I. et. al. Neonatal cytomegalovirus blood load and risk of sequelae in symptomatic and asymptomatic congenitally infected newborns. // Pediatrics. 2006. - Vol.117, №1. - P.76-83.

263. Powers C., DeFilippis V., Malouli D., Fruh K. Cytomegalovirus immune evasion. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2008. - Vol.325. - P.333-359.

264. Landry M.L., Ferguson D. Comparison of quantitative cytomegalovirus antigenemia assay with culture methods and correlation with clinical disease. // J. Clin. Microbiol. 1993. - Vol.31. - P.2851-2856.

265. Landolfo S., Gariglio M., Gribaudo G. et al. The human cytomegalovirus. // Pharmacology & therapeutics. 2003. - Vol.98. - P.269-297.

266. Lazzarotto Т., Guerra В., Lanari M., Gabrielli L., Landini M.P. New advances in the diagnosis of congenital cytomegalovirus infection. // J. Clin. Virol. -2008.-Vol.41, №3.-P.192-197.

267. Lazzarotto Т., Varani S., Guerra В., et al. Prenatal indicators of congenital cytomegalovirus infection. // Journal of Pediatrics. 2000. - Vol.137, №1. — P.345-347.

268. Lee J.Y., Irmiere A., Gibson W. Primate cytomegalovirus assembly: evidence that DNA packaging occures subsequent to B-capsid assembly. // Virology. 1988. - Vol.167. - P.87-96.

269. Li Z., Yan C., Liu P. et. al. Prevalence of serum antibodies to TORCH among women before pregnancy or in the early period of pregnancy in Beijing. // Clin Chim Acta. 2009. - Mar 17. - P. 87-92.

270. Liu В., Stinski M.F. Human cytomegalovirus contains a tegument protein that enhances transcription from promoters with upstream ATF and AP-1 cis-acting elements. // J. Virol. 1992. - Vol.66. - P.4434-4444.

271. Lombardi G., Stronati M. Infezione congenital da cytomegalovirus. // Minerva pediat. 2005. - Vol.57. - P.213-227.

272. Long A.A., Komminoth P. In situ PCR. An overview. // Methods Mol. Biol. -1997.-Vol.71.-P.141-161.

273. Lu M. and Shenk T. Human cytomegalovirus UL69 protein induces cells to accumulate in GI phase of the cell cycle. // J. Virol. 1999. - Vol.73. - P.676-683.

274. Lu Y., Weng X. and Gu Z. Human cytomegalovirus infection and congenital malformation. // J. Infect. Deas. 2008. - Mar; 33 (3). - P.132-135.

275. Maeda-Takekoshi F., Takekoshi M., Tanaka S. Expression of the immediate early antigens of human cytomegalovirus is responsible for virus proliferation, an intracellular immunization approach. // Tokai. J. Exp. Clin. Med. 1992. - Vol.17. - P.75-83.

276. Maidji E, McDonagh S, Genbacev O, Tabata T, Pereira L. Maternal antibodies enhance or prevent cytomegalovirus infection in the placenta by neonatal Fc receptor-mediated transcytosis. // Am. J. Pathol. 2006. - Apr; 168(4).-P.1210-1226.

277. Malinger G., Lev D., Zahalka N., Ben Aroia Z., Watemberg N., Kindron D., Sira L.B., Lerman-Sagie T. Fetal cytomegalovirus infection of the brain: the spectrum of sonographic findings // AJNR (Am. J. Neuroradiol.). — 2003. -Vol.24. P.28-32.

278. Malm G, Engman ML. Congenital cytomegalovirus infections. // Semin. Fetal Neonatal Med. 2007. - Jun; 12(3). - P.154-159.

279. Margolis M.J., Pajovic S., Wong E.L. et al. Interaction of the 72-kilodalton human cytomegalovirus IE1 gene product with E2F1 coincides with E2F-dependent activation of dihydrofolate reductase transcription. // J. Virol. -1995. Vol.69. - P.7759-7767.

280. Martin D.F., Kuppermann B.D., Wolitz R.A. et. al. Oral ganciclovir for patients with cytomegalovirus retinitis treated with a ganciclovir implant. // Engl. J. Med. 1999. - Vol.340, №14. - P. 1063-1070.

281. Maschmann J., Yamprecht K., Dietz K., Jahn G., Speer C.P. Cytomegalovirus infection of extremely low-birth weight infants via breast milk. // Clinical Infection Deseases. 2001. - Vol.33. - P.1998-2001.

282. Masse M.J., Messerle M., Mocarski E.S. The location and sequence composition of the murine cytomegalovirus replicator (oriLyt). // Virology. — 1997. Vol.230. - P.350-360.

283. McGavran M.H., Smith M.G. Ultrastructural, cytochemical and microchemical observations on cytomegalovirus (salivary gland virus) infection of human cells in tissue culture. // Exp. Mol. Pathol. 1965. -Vol.4.-P. 1-10.

284. McSharry J.J., McDonough A., Olson В., Hallenberger S. et. al. Susceptibilities of human cytomegalovirus clinical isolates to BAY 38-4766, BAY 43-9695, and ganciclovir. // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. -Vol.45. - P.2925-2927.

285. McVoy M. A., & Adler, S. P. Human cytomegalovirus DNA replicates after early circularization by concatemer formation, and inversion occurs within concatemer. //J. Virol. 1994. - Vol.68. -P.l 040-1051.

286. Meine Jansen C.F., Toet M.C., Rademaker C.M., Ververs T.F., Gerards L.J., van Loon A.M. Treatment of symptomatic congenital cytomegalovirus infection with valganciclovir. // J. Perinat. Med. 2005. - Vol.33, №4. -P.364-366.

287. Mendez J.C., Sia I.G., Tau K.R., Espy MJ. et. al. Novel mutation in the CMV UL97 gene associated with resistance to ganciclovir therapy. // Transplantation. 1999. - Vol.67. - P.755-757.

288. Meisel R.L., Alvarez M., Lynch L., Chitkara U. et. al. Fetal cytomegalovirus infection: a case report. // Am. J. Obstet. Gynecol. — 1990. — Vol.162, №3. — P.663-664.

289. Meyer J.D., Ljungman P., Fisher L.D. Cytomegalovirus excretion as a predictor of cytomegalovirus disease after marrow transplantation: importance of cytomegalovirus viremia. // J. Infect. Dis. 1990. - Vol.162. -P.373-380.

290. Michaels M.G. Treatment of congenital cytomegalovirus: where are we now? // Expert. Rev. Anti. Infect. Ther. 2007. - Vol.5, №3. - P.441-448.

291. Mieng J., Kong H., Wang C., Zhu G., Xie S., Xu H. Enchancement of nanofibrous scaffold of multiwalled carbon nanotubes/polyurethane composite to the fibroblasts growth and biosynthesis. // J. Biomed. Mater. Res. 2009. - Vol.88, №1. - P. 105-116.

292. MMWR Centers for Disease Control and Prevention. Enterovirus surveillance—United States, 1970-2005. // MMWR - Morb. Mortal. Wkly. Rep. - 2006. - Vol.55. - P. 1-20

293. Mocarski E. S., & Courcelle С. T. Cytomegalovirus and their replication. In D. Knipe, & P. Howley (Eds.), Fields Virology. 2001. - P.2629- 2673.

294. Mocarski E.S. Cytomegalovirus: biology and replication. // In book: The human herpesviruses. Ed. by Roizman В., Whitley R.J., Lopez C., New York. -1993.-P. 173-226.

295. Mocarski ES, Liu AC, Spaete RR. Structure and variability of the sequence in the genome of human cytomegalovirus (Towne strain). // J. Gen. Virol. -1987. Vol.68. - P.2223-2230.

296. Movis DJ. CMV pneumonia — a concequence of immunosuppression and pre-exitiung lung. // Resp. Med. 1993. - Vol.87, №5. - P.345-351.

297. Mulamba G.B., Hu A., Azad R.F., Anderson K.P., Coen D.M. Human cytomegalovirus mutant with sequence-dependent resistance to thephosphorothioate oligonucleotide fomivirsen (ISIS 2922). // Antimicrob. Agents Chemother. 1998. - Vol.42. - P.971-973.

298. Muller A., Eis-Hubinger A.M., Brandhorst G., Heep A., Bartmann P., Franz A.R. Oral valganciclovir for symptomatic congenital cytomegalovirus infection in an extremely low birth weight infant. // J. Perinatol. — 2008. — Vol.28, №l,-P.74-76.

299. Munro S.C., Hall В., Whybin L.R. et al. Diagnosis of and screening for cytomegalovirus infection in pregnant women. // J. Clin. Microbiol. — 2005. -Vol.43.-P.4713-4718.

300. Murata H., Nih R., Ito M., Ihara Т., Komada Y. Quantitative detection of HCMV DNA in saliva from infants and breast milk by real time PCR assay. // Pediatr. Int. 2009. - Mar 31. Epub ahead of print.

301. Murphy, E. A., Streblow, D. N., Nelson, J. A., & Stinski, M. F. The human cytomegalovirus IE86 protein can block cell cycle progression after inducing transition into the S phase of permissive cells. // J. Virol. 2000. — Vol.74. -P.7108—7118.

302. Namangala В., Inoue N., Kohara J., Kuboki N. et. al. Evidence for the immunostimulatory effects of low-dose orally delivered human IFN-alpha in cattle. // J. Interferon Cytokine Res. 2006. - Vol.26, №9. - P.675-681.

303. Nachtigal M., Nachtigal S. Interactions between human herpesvirus and host cell chromosomes. // Arch. Roum. Pathol. Exp. Microbiol. 1978. - Vol.37. - P.223-249.

304. Nelson C.T., Demmler G.J. Cytomegalovirus infection in the pregnant mother, fetus and newborn infant. // Clin. Perinatol. 1997. - Vol.24. - P. 151160.

305. Nieuwenhuis R.F., van Doornum G.J., Mulder P.G. et.al. Importance of herpes simplex virus type 1 (HSV-1) in primary genital herpes. // Acta Derm.Venereol. 2006. - Vol.86. - P.129-134.

306. Noris, E., С. Zannetti, A. Demurtas, J. Sinclair, M. De Andrea, M. Gariglio, and S. Landolfo. Cell cycle arrest by human cytomegalovirus 86-kDa Ш2 protein resembles premature senescence. // J. Virol. 2002. — Vol.76. — P.12135-12148.

307. Novotny J., Rigoutsos I., Coleman D., & Shenk T. In silico structural and functional analysis of the human cytomegalovirus (HHV5) genome. // J. Mol. Biol.-2001.-Vol.310.-P.1151-1166.

308. Painter G.R., Hostetler K.Y. Design and development of oral drugs for the prophylaxis and treatment of smallpox infection. // Trends Biotechnol. -2004. Vol.22. -P.423-427.

309. Paradowska E., Prezikevich M., Nowakowska D. Detection of cytomegalovirus in human placental cells by polymerase chain reaction. // APMIS. 2006. - Vol.114, №11. - P.764-771.

310. Paixao P., Almeida S., Gouveia P., Vilarinho L., Vaz Osorio R. Prevalence of human cytomegalovirus congenital infection in Portuguese newborns. // Euro Surveill. 2009. - Vol.14, №9. - P.13-15.

311. Pass R.F., Fowler K.B., Boppana S.B., Britt W.J., Stagno S. Congenital cytomegalovirus infection following first trimester maternal infection: symptoms at birth and outcome. // J Clin Virol. 2006. - Vol.35, №2. -P.216-220.

312. Pass RF. Cytomegalovirus. In: Knipe D, Howley P, editors. Fields virology 4th ed. Philadelphia (PA): Lippincott Williams & Wilkins 2001. - P.2675-2705.

313. Perol Y., Саго V., Mazeron M.C. Cytomegalovirus antigenemia assay: therapeutic usefulness and biological significance. // Nouv Rev Fr Hematol. -1993. Vol.35, №1. - P.95-98.

314. Perry C.M., Balfour J.A. Fomivirsen. // Drugs. 1999. - Vol.57, №3. -P.375-380.

315. Petrik, D. Т., К. P. Schmitt, and M. F. Stinski. Inhibition of cellular DNA synthesis by the human cytomegalovirus IE86 protein is necessary for efficient virus replication. // J. Virol. 2006. - Vol.80. - P.3872-3883.

316. Pignatelli S., Monte D. Zini N. et. al. Immunoelectron microscopy analysis of HCMV gp UL73 (gN) localization. // Arch. Virol. 2002. - Vol.147, №6. -P. 1247-1256.

317. Pignatelli S., Monte D., Landini M. gp UL73 (gN) genomic variants of human cytomegalovirus isolates are clustered into four distinct genotypes. // J. Gen. Virol. 2001. - Vol.82. - №11. - P. 2777-2784.

318. Pignatelli S., Dal Monte P. Epidemiology of human cytomegalovirus strains through comparison of methodological approaches to explore gN variants. // New Microbiol. 2009. - Vol.32, №1. - P. 1-10.

319. Poma E., Kowalik Т., Zhu L. et. al. The human cytomegalovirus IE1-72 protein interacts with the cellular pi07 protein and relieves p 107-mediated transcriptional repression of an E2F-responsive promoter. // J. Virol. 1996. -Vol.70. - P.7867-7877.

320. Powers C., DeFilippis V., Malouli D., Friih K. Cytomegalovirus immune evasion.// Curr. Top. Microbiol. Immunol. -2008. Vol.325. -P.333-359.

321. Prichard M.N., Duke G.M., Mocarski E.S. Human cytomegalovirus uracil DNA glycosylase is required for the normal temporal regulation of both DNA synthesis and viral replication. // J. Virol. 1996. - Vol.70. - P.3018-3025.

322. Pustowoit В., Herman F., Макарова H. и др. Динамика иммунного ответа при первичной ЦМВИ и при реактивации цитомегаловируса у больныхпосле аллотрансплантации органов. // Вопросы вирусологии. 2001. 3. С.23-29.

323. Pusztai R. Cytomegalovirus infection in pregnancy. // Orv. Hetil. — 2009. — Vol.150, №21. — P.963-968.

324. Rafailidis P.I., Mourtzoukou E.G., Varbobitis I.C., Falagas M.E. Severe cytomegalovirus infection in apparently immunocompetent patients: a systematic review. // J. Virol. 2008. - Vol.27, №5. - P.47-49.

325. Rahav G. Congenital cytomegalovirus infection a question of screening. // Isr. Med. Assoc. J. - 2007. - May; 9(5). - P.392-394.

326. Razonable R.R., Emery V.C. Management of CMV infection and disease in transplant patients consensus article—IHMF® management recommendations. // Herpes. 2004. - Vol.11. - P.77-86.

327. Reefschlaeger J., Bender W., Hallenberger S. et al. Novel non-nucleoside inhibitors of cytomegaloviruses (BAY 38-4766): in vitro and in vivo antiviral activity and mechanism of action. // J. Antimicrob. Chemother. 2001. — Vol.48.-P.757-767.

328. Revello M.G., Gerna G. Diagnosis and management of human cytomegalovirus infection in the mother, fetus and newborn infant // Clin. Microbiol. Rev. 2002. - Vol.15. - P.680-715.

329. Revello M.G., Zavattoni M., Furione M. et. al. Preconceptional primary human cytomegalovirus infection and risk of congenital infection. // J. Infect. Dis. 2006. - Vol.193, №6. - P.783-787.

330. Roby С., Gibson W. Characterization of phosphoptoreins and protein kinase activity of virions, noninfectious enveloped particles and dense bodies of human cytomegalovirus. // J. Virol. 1986. - Vol.59. - P.714-727.

331. Roizman В., Sear A.E. Herpes simplex viruses and their replication. In book: Virology, Ed. by Fielda B.N., Knipe D.M., Chanock R.M., Hirsch M.S., Melnick J.L., MonathT.P., New York. - 1990. - P. 1795-1841.

332. Romanowski M.J., Shenk T. Characterization of the human cytomegalovirus irsl and trsl genes: A second immediate-early transcription unit within irsl whose product antagonizes transcriptional activation. // J. Virol. — 1997. — Vol.71. -P.1485-1496.

333. Rosen P.P. Cytomegalovirus infection in cancer patients. // Pathol. Annu. -1978.-Vol.13.-P.175-208.

334. Ross S.A., Novak Z., Ashrith G., Rivera L.B. et. al. Association between genital tract cytomegalovirus infection and bacterial vaginosis. // J. Infect. Dis. 2005. - Vol.192, №10. - P.1727-30.

335. Ruger В., Klages S., Walla B. et al. Primary structure and transcription of the genes coding for the two virion phosphoproteins pp65 and pp71 of human cytomegalovirus. // J. Virol. 1987. - Vol.61. - P.446-453.

336. Ruiz J.E., Kwak J.Y. et.al. Intravenous immunoglobulin ingibits NK cell activity in vivo in women with recurrent spontaneous abortion. // Am. J. Reprod. Immunol. 1996. - Vol.35, №4. -P.370-375.

337. Salvant В., Fortunato E., Spector D. Cell cycle dysregulation by human cytomegalovirus: influence of the cell cycle phase at the time of infection and effects on cyclin transcription. // J. Virology. 1998. - P.3729-3741.

338. Sanchez V. and D. H. Spector. Exploitation of host cell cycle regulatory pathways by HCMV. In M. J. Reddehase (ed.), Cytomegaloviruses. // Caister Academic Press, Norfolk, U.K. 2006. - P.205-230.

339. Sanchez V., A. K. McElroy and D. H. Spector. Mechanisms governing maintenance of Cdkl/cyclin B1 kinase activity in cells infected with human cytomegalovirus. //J. Virol. 2003. - Vol.77. - Р.1321Ф-13224.

340. Sauerbrei A., Wutzler P. Herpes simplex and varicella-zoster virus infections during pregnancy: current concepts of prevention, diagnosis and therapy. Part 1: herpes simplex virus infections. // Med. Microbiol. Immunol. — 2007. -Vol.196, №2.-P.89-94.

341. Schepf N., Boiteau N., Petit F., Alain S. et. al. Rapid determination of antiviral drug susceptibility of human cytomegalovirus by real-time PCR. // Antiviral Res. 2009. - Vol.81. - P.64-67.

342. Schulzke S., Biihrer C. Valganciclovir for treatment of congenital cytomegalovirus infection. // Eur. J. Pediatr. 2006. - Vol.165, №8. - P.575-576.

343. Scoular A., Norrie J., Gillespie G. et. al. Longitudinal study of genital infection by herpes simplex virus type 1 (HSV-1) in Western Scotland over 15 years. //BMJ-2002. Vol.324. -P.1366-1367.

344. Seale H., Maclntyre C.R., Gidding H.F. et. al. National serosurvey of cytomegalovirus in Australia. // Clin. Vaccine Immunol. 2006. - Vol.13. — P.l 181-1184.

345. Simmen K., Singh J., Mattias B. et. al. Global modulation of cellular transcription by human cytomegalovirus is initiated by viral glycoprotein В // PNAS. 2001. - Vol.98. - Issue 13. - P.7140-7145.

346. Sinclar J., Baillie J., Bryan T. et. al. Human cytomegalovirus mediates cell cycle progression though GI into entry S phase in terminally differentiated cells. // J. Gen.Virol. 2000. - Vol.81. - P.1553-1565.

347. Sindre H., Rollag H., Olafsen M.K., Degre M., Hestdal K. Human cytomegalovirus induced apoptosis in the hematopoietic cell line M07e. // APMIS. -2000. Vol.108. - P.223-230.

348. Singh N. Antiviral drugs for cytomegalovirus in transplant recipients: advantages of preemptive therapy. // Rev. Med. Virol. 2006. - Vol.16, №5. -P.281-287.

349. Sinzger C., Muntefering H., Loning T. et. al. Cell types infected in human cytomegalovirus placentitis identified by immunohistochemical double staining. // Pathol. Anat. histopatol. 2001. - Vol.423. - P.249-256.

350. Smith J.D., DeHarven E. Herpes simplex virus and human cytomegalovirus replication in WI-38. II. An ultrastructural study of viral penetration. // J. Virol. 1974. - Vol.14. - P.945-956.

351. Snoeck R., Andrei G., De Clercq E., Gerard M. et. al. A new topical treatment for resistant herpes simplex infections. // N. Engl. J. Med. 1993. -Vol.329, №13. - P.968-969.

352. Somerset D., Zeng Y., Kilby M. et. al. Normal human pregnancy is associated with an elevation in the immune suppressive CD4, CD25 regulatory T-cell subset. // Immunology 2004. - Vol.112. - P. 38-43.

353. Sommer M.H., Scully A.L., Spector D.H. Transactivation by the human cytomegalovirus IE2 86-kilodalton protein requires a doman that binds to both the TATA-box-binding protein and the retinoblastoma protein. // J. Virol. 1994. - Vol.68. - P.6223-6231.

354. Song Y. J. and M. F. Stinski. Effect of the human cytomegalovirus ПЕ86 protein on expression of E2F-responsive genes: a DNA microarray analysis. // Proc. Natl. Acad. Sci. 2002. - Vol.99. - P.2836-2841.

355. Song Y. J., and M. F. Stinski. Inhibition of cell division by the human cytomegalovirus IE86 protein: role of the p53 pathway or cyclin-dependent kinase 1/cyclin Bl. // J. Virol. 2005. - Vol.79. - P.2597-2603.

356. Spaete R.R., Gehrz R.C., Landini M.P. Human cytomegalovirus structural proteins. // J. Gen. Virol. 1994. - Vol.75. - P.3287-3308.

357. Spaete R.R., Mocarski E.S. The sequence of the cytomegalovirus genome functions as a cleavage/packaging signal for herpes simplex virus defective genomes. // J. Virol. 1985. - Vol.54. - P.817-824.

358. Speir E., Modali R., Huang E.S., Leon M.B., Shawl F. et al. Potential role of human cytomegalovirus and p53 interaction in coronary restenosis. // Science. 1994. - Vol.265. - P.391-394.

359. St. Jeor S.C., Albercht Т., Funk F.D., Rapp F. Stimulation of cellular DNA synthesis by human cytomegalovirus. // J. Virol. 1974. - Vol.13. - P.353-362.

360. Stamminger Т., Fleckenstein В. Immediate-early regulation of human cytomegalovirus. In dook: Current topics in microbiology and immunology. Ed. by McDougall J.K. Berlin, Heidelberg, New York. - 1990. - Vol.154. -P.3-19.

361. Staras S., Flanders W., Dollard S., Pass R. et.al. Cytomegalovirus seroprevalence and childhood sources of infection: a population — based study among pre-adolescents in the U.S. // J. Clin. Vir. 2008. - Vol.43. - P.266-271.

362. Steininger C. Novel therapies for cytomegalovirus disease. // Recent Patents Anti-Infect Drug Disc. 2007. - Vol.2, №1. - P.53-72.

363. Stinski M.F., Mocarski E.S., Thomsen D.R. DNA of human cytomegalovirus: size heterogeneity and defectiveness resulting from serial undiluted passage. // J. Virol. 1979. - Vol.31. - P.231-239.

364. Suneja M., Nair R. Cytomegalovirus glomerulopathy in a kidney allograft with response to oral valganciclovir. // Am. J. Kidney Dis. 2008. - Vol.52, №1. — P.l-4.

365. Suzuki Y., Toribe Y., Mogami Y., Yanagihara K., Nishikawa M. Epilepsy in patients with congenital cytomegalovirus infection. // Brain Dev. 2008. -Vol.30, №6.-P.420-424.

366. Tagawa M, Moriuchi H. Epidemiology of congenital cytomegalovirus infection. // Nippon Rinsho. 2006. - Mar; 64. - Suppl 3:455-459.

367. Tamer G.S., Dundar D., Caliskan E. Seroprevalence of Toxoplasma gondii, rubella and cytomegalovirus among pregnant women in western region of Turkey. // Clin Invest Med. 2009. - Feb.l. - Vol.32. - P.43-47.

368. Tarakanova V. L., V. Leung-Pineda, S. Hwang, C. W. Yang, K. et. Al. Gamma-herpesvirus kinase actively initiates a DNA damage response by inducing phosphorylation of H2AX to foster viral replication. // Cell Host Microbe. 2007. - Vol.1. - P.275-286.

369. Theiler R. N. & Compton T. Characterization of the signal peptide processing and membrane association of human cytomegalovirus glycoprotein O. // J. Biol. Chem. 2001. - Vol.276. - P.39226- 39231.

370. Topilko A., Michelson S. Morphological and cytochemical analysis of human cytomegalovitus inoculums. Correlation of free particles in inoculum with counterparts in infected cells. // Res. Virol. 1994. - Vol.145. - P.65-73.

371. Torres-Madriz G., Boucher H.W. Perspectives in the Treatment and Prophylaxis of Cytomegalovirus Disease in Solid-Organ Transplant Recipients. // Clin. Infect. Dis. 2008. - №7. Jul 24. - P. 1234-1239.

372. Townsend L.B., Devivar R.V., Turk S.R., Nassiri M.R. and Drach J.C. Design, synthesis, and antiviral activity of certain 2,5,6-trihalo-l-(beta-dribofuranosyl) benzimidazoles. // J. Med. Chem. 1995. - Vol.38. - P.4098-4105.

373. Toungous M., Denis C., Dupont E. Ingibition of HLA-DR mediated cytokines production by intravenous immunoglobulins. // Brit. J. Haematol. — 1994. -Vol.87. №1. - P.206.

374. Underwood M.R., Ferris R.G., Selleseth D.W., Davis M.G. et. al. Mechanism of action of the ribopyranoside benzimidazole GW275175X against human cytomegalovirus. // Antimicrob. Agents Chemother. 2004. — Vol.48. — P. 1647-1651.

375. Underwood M.R., Harvey R.J., Stanat S.C., Hemphill M.L. et. al. Inhibition of human cytomegalovirus DNA maturation by a benzimidazole ribonucleoside is mediated through the UL89 gene product. // J. Virol. 1998. -Vol.72.-P.717-725.

376. Valcyte (valgancyclovir hydrachloride tablets) package insert. // Roche laboratories Inc. 2003.

377. ViroPharma Inc. ViroPharma announces presentation of Phase 1 clinical data for maribavir. Available: http://www.viropharma.com/ (accessed January, 31, 2006).

378. ViroPharma Inc., ViroPharma Completes Enrollment in Phase 2 clinical study of maribavir in bone marrow transplant patients. Available: http://www.viropharma.com/ (accessed January 31, 2006).

379. Vistide (cidofovir injection) package insert. // Gilead Sciences Inc. 1996.

380. Wade E.J., Klucher K.M., Spector D.H. An AP-1 binding site is the predominant cis-acting regulatory element in the 1,22-kilobase early RNA promoter of human cytomegalovirus. // J. Virol. 1992. - Vol.66. - P.2407-2417.

381. Wang J., Froeyen M., Hendrix C., Andrei G. et. al. The cyclohexenylguanine. // J. Med. Chev. 2000. - №43. - P.736-745.

382. Weber O., Bender W., Eckenberg P. et al. Inhibition of murine cytomegalovirus and human cytomegalovirus by a novel non-nucleosidic compound in vivo. // Antiviral Res. 2001. - Vol.49. - P. 179-189.

383. Weclawiak H., Kamar N., Mengelle C., Guitard J. et. al. Cytomegalovirus prophylaxis with valganciclovir in cytomegalovirus-seropositive kidney-transplant patients. // J. Med. Virol. 2008. - Vol.80, №7. - P.1228-1232.

384. Westerberg B.D., Atashband S., Kozak F.K. A systematic review of the incidence of sensorineural hearing loss in neonates exposed to Herpes simplex virus (HSV). // Int. J. Pediatr. Otorhinolaryngol. 2008. - Jul. - 72 (7). -P.931-937.

385. Wiebusch L. and C. Hagemeier. Human cytomegalovirus 86-kilodalton IE2 protein blocks cell cycle progression in Gl. // J. Virol. 1999. - Vol.73. -P.9274—9283.

386. Wiebusch L. and C. Hagemeier. The human cytomegalovirus immediate early 2 protein dissociates cellular DNA synthesis from cyclin-dependent kinase activation. // EMBO J. 2001. - Vol.20. - P. 1086-1098.

387. Wiebusch L., M. Bach, R. Uecker and C. Hagemeier. Human cytomegalovirus inactivates the G0/G1-APC/C ubiquitin ligase by Cdhl dissociation. // Cell Cycle. 2005. - Vol.4. - P. 1435-1439.

388. Winkler M., Rice S.A., Stamminger T. UL69 of human cytomegalovirus, an open reading frame with homology to ICP27 of herpes simplex virus, encodes a transcativator of gene expression. // J. Virol. 1994. - Vol.68. -P.3943-3954.

389. Wolf D.G., Courcelle C.T., Prichard M.N., Mocarski E.S. Distinct and separate roles for herpesvirus-conserved UL97 kinase in cytomegalovirus NA synthesis and encapsidation. // PNAS. 2001. Vol.98. - P. 1895-1900.

390. Wright H.T., Goodheart C.R., Lielausis A. Human cytomegalovirus. Morphology by negative staining. // Virology. 1964. - Vol.23. - P.419—424.

391. Yamagishi Y., Miyagawa H., Wada K. et al. CMV DNA detection in dried blood spots for diagnosing congenital CMV infection in Japan. // J. Med. Virol. 2006. - Vol.78. - P.923-925.

Информация о работе

Адиева, Айна Ахмедовна
доктора биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.06

Диссертация

Роль цитомегаловирусной инфекции в патологии плода и новорожденного. Поиск новых противовирусных средств - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы