Разработка компонентов набора для определения уровня антител к вирусу ринопневмонии лошадей методом иммуноферментного анализа

Коржов, Василий Васильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка компонентов набора для определения уровня антител к вирусу ринопневмонии лошадей методом иммуноферментного анализа
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка компонентов набора для определения уровня антител к вирусу ринопневмонии лошадей методом иммуноферментного анализа"

На правах рукописи

Коржов Василий Васильевич

Разработка компонентов набора для определения уровня антител к вирусу ринопневмонии лошадей методом иммуноферментного анализа

03.00.23 - биотехнология Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Шелково - 2006 г.

А í.

Ъ13>Ъ

На правах рукописи

Коржов Василий Васильевич

03.00.23 - биотехнология Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Шелково - 2006 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (ВНИТИБП) Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный руководитель:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Кузнецова Светлана Владимировна доктор ветеринарных наук Литвинов Олег Борисович

доктор биологических наук, Клюкина Валентина Ивановна

доктор биологических наук, Верховский Олег Анатольевич

Ведущее учреждение:

Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина (МГАВМиБ, г. Москва).

Защита состоится 24 марта 2006 года в 12 часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (141142, г. Щелково, Московская область, пос. Биокомбинат, ВНИТИБП).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан 22 февраля 2006г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандид^йМ— Ю .Д.Фролов

БИБЛИОТЕКА I

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Одним из движущих факторов развития экономики нашей страны является научно-технический прогресс, способствующий ускорению развития народного хозяйства путем интенсификации науки и производства, внедрения новых технологий. Процесс интенсификации охватывает и биологию в самом широком смысле слова.

В связи с развитием конного спорта и увеличением количества коневодческих хозяйств в нашей стране, становится актуальной проблема диагностики и ликвидации ряда инфекций. Инфекционная ринопневмония (РПЛ) - одна из наиболее распространенных инфекционных болезней в коневодстве. В естественных условиях вирус РПЛ поражает лошадей, ослов и мулов, независимо от пола, породы и возраста. Отмечено, что чистокровные лошади более восприимчивы, чем полукровки и местные породы.

Инфекционная ринопневмония лошадей наносит значительный экономический ущерб коневодству, который складывается из потери воспроизводительной способности конематок, недополучения приплода, выбраковки ценных в племенном отношении лошадей и проведения ветеринарно-санитарных мероприятий. Возникнув в коневодческом хозяйстве любого типа (конный завод, племенная конеферма, ипподром, конноспортивный комплекс и др.), РПЛ принимает характер стационарной инфекции. Острое течение инфекции чередуется с периодами стертого атипичного проявления болезни, что крайне осложняет диагностику заболевания. Изучение РПЛ в течении последнего времени показало актуальность данной проблемы.

Поэтому в системе мер, направленных на борьбу с ринопневмонией лошадей, важное значение имеют быстрые и точные методы лабораторной диагностики. Используемые в настоящее время в ветеринарной практике серологические методы диагностики имеют определенные недостатки. Предварительная клиническая диагностика респираторной формы болезни затруднительна, так как симптомы заболевания сходны с клиникой других вирусных и бактериаль-

ных болезней, особенно таких, как грипп лошадей, вирусный артериит, бруцеллез или вообще клиника не проявляется (88).

Диагностика инфекционной ринопневмонии включает клинический осмотр, учет нарастания случаев абортов во второй половине жеребости, выделение и идентификацию вируса на культуре клеток, выявление антител различными методами диагностики (РИФ, РН, ПЦР, РТГА, РГА, РСК).

Несмотря на то, что ветеринарная практика имеет в своем распоряжении большой набор диагностических сывороток и диагностикумов, улучшения качества и стандартизация диагностических препаратов для практических лабораторий по-прежнему остается важной задачей.

При диагностике вирусных и бактериальных инфекций в ветеринарии все более широкое применение находят такие современные и высокоточные методы, как молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако ввиду их высокой стоимости, сложности в постановке и необходимости дорогостоящего оборудования и реактивов метод определения антигенов и антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) при оптимальном соотношении себестоимость-чувствительность остается действенным инструментом в ветеринарной лабораторной практике. Высокая разрешающая способность этого метода обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих наблюдаемый эффект. Таким образом, очистка и концентрирование вирусов является решающим условием при изготовлении диагностикумов и получении высокоактивных иммунных сывороток, используемых при создании компонентов, необходимых для проведения иммуноферментного анализа.

Для получения антивидовых иммуноглобулинов животных, меченых пе-роксидазой из хрена (ПХ), необходимо наличие чистых препаратов иммуноглобулинов О, М и А классов.

прикладных задач в области ветеринарии сдерживается отсутствием коммерческих моноспецифических антисывороток. Идеальным условием получения моноспецифических антисывороток представляется иммунизация продуцентов чистыми антигенами.

Ключевым моментом в отработке твердофазного непрямого ИФА является получение коньюгата, то есть иммуноглобулина меченого пероксидазой. Качество получаемого коньюгата находится в прямой зависимости от серологической активности иммуноглобулина, активности фермента и условий связывания этих компонентов.

Быстрый и точный диагноз инфекционной ринопневмонии лошадей является решающим условием организации необходимых мер борьбы с этим заболеванием.

Перечисленные выше обстоятельства явились основополагающими в создании иммуноферментной тест- системы для определения уровня антител к вирусу РПЛ, что позволит решить проблему массового эпизоотологического обследования поголовья лошадей.

1.2. Цели и задачи исследования.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлась разработка тест-системы на основе концентрированных и аффинно-очищенных антигенов вируса РПЛ, штамм СВ/69, при использовании их в качестве компонента набора для постановки серологических реакций и иммуноферментного анализа при определении уровня антител к вирусу РПЛ в сыворотке крови лошадей.

Решались следующие задачи: 1.2.1. Разработать метод получения очищенного и концентрированного вируса РПЛ, штамм СВ/69, репродуцированного в культуре клеток ПТ-80 и изучить его биологические свойства;

1.2.2. Выделить поверхностные антигены вируса РПЛ, изучить их состав в элек-

трофорезе и активность в иммуноблотинге и получить на их основе им-муносорбент на сефарозу

1.2.3. Выделить 1§С лошади, получить анти-^в лошади антисыворотки на кроликах, выделить анти-^С лошади антитела и синтезировать анти-^в лошади иммунопероксидазный коньюгат

1.2.4. Выделить на полученном сорбенте специфические к антигенам вируса РПЛ антитела и иммобилизовать их в качестве лиганда на ВгСЫ сефарозу

1.2.5. Разработать тест - систему для определения уровня антител к вирусу РПЛ на основе аффинно-очищенных антигенов вируса РПЛ методом иммуно-ферментного анализа

1.2.6. Провести сравнительную оценку определения уровня анти-РПЛ антител в серологических реакциях (РН, РТГА) и разработанной иммунофермент-ной тест - системе

1.3. Научная новизна.

- Разработан метод получения очищенных и концентрированных поверхностных антигенов вируса РПЛ, репродуцированного в культуре клеток ПТ-80, с помощью препаративной аффинной хромотографии на анти-РПЛ 1ёС ВгСЫ Сефарозе

- Выявлено 10 структурных гликопротеинов вируса РПЛ, штамм СВ/69 с молекулярной массой от 24 до 260 кД, которые отщепляются Тритоном Х-100

- В иммуноблотинге показано, что 10 белков вируса РПЛ, отщепляющиеся при обработке Тритоном Х-100, индуцируют выработку анти-РПЛ антител в организме животных

- Разработана тест-система для определения уровня антител к вирусу РПЛ методом иммуноферментного анализа на основе аффинно очищенных антигенов вируса РПЛ, штамма СВ/69.

1.4. Практическая значимость работы.

Результаты проведенных исследований позволили разработать инструкцию по изготовлению и проект нормативно-технической документации на «Тест-систему для определения уровня антител к вирусу ринопневмонии лошадей методом иммуноферментного анализа». Набор предназначается для индикации и количественного определения анти-РПЛ антител в сыворотках крови лошадей.

Внедрение в практику ветеринарии иммуноферментной тест - системы для определения уровня антител к вирусу РПЛ позволит решить проблему массового эпизоотологического обследования поголовья лошадей, на территории РФ так и на территориях других стран, составляющего основу мероприятий по предотвращению, ликвидации и предупреждении распространения инфекционной ринопневмонии лошадей.

Внедрение в практику «Тест-системы для определения уровня антител к вирусу РПЛ в иммуноферментном анализе» позволит проводить диагностику РПЛ в племенных и пользовательских хозяйствах (ипподромов, заводов, частных конеферм и др.) в качестве профилактических мер по предупреждению РПЛ, что будет способствовав оздоровлению хозяйств, обеспечению эпизоотологического благополучия, повышению сохранности молодняка и продуктивности поголовья.

1.5. Апробация работы.

Материалы исследований доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ВНИТИБП (2003 - 2005 г.г.), на 3-й международной научно-практической конференции «Современные технологические и селекционные аспектыразвития животноводства в России», Дубровицы (2005 г.), на междуна-

родном симпозиуме «Защита животных отэкотоксннов, радионуклидов и воз-будитеей опасных инфекционных заболеваний», Казань (2005 г.)

По материалам диссертации опубликовано 3 работы.

1.6. Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 143 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические предложения, список литературы, содержащий 90 отечественных и 144 зарубежных источника и приложение. В приложении представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую ценность. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами, 24 рисунками и 1 схемой.

Автор выражает глубокую благодарность академику РАСХН, профессору А.Я. Самуйленко и профессору Кузнецову Д.П. за научно-методическую помощь в организации и проведении исследований.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

Работа выполнена во ВНИТИБП в 2002 -2005 гг. в рамках Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской федерации на 2000 - 2005г.

В работе использовали:

Вирус ринопневмонии лошадей (РПЛ), штамм «СВ/69», репродуцированный в перевиваемой культуре клеток почки теленка (ПТ-80), первично-трипсинизированной культуре клеток почки эмбриона коровы (ПЭК), перевиваемой культуре клеток почки свиньи (СПЭВ) и перевиваемой культуре клеток почки кошки (СгБК).

Питательные среды: среда Игла, 199, ГЛАХ (институт полиомиелита, г. Москва); сыворотка КРС для культуральных работ (ООО Фуро), фетальная сыворотка коров (ООО Фуро).

Животные: кролики массой 2,5 - 3,0 кг. Содержание и кормление кроликов проводили согласно принятым нормам.

Дезинтеграцию клеточных суспензий осуществляли на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 10 секунд импульсивно 6 раз.

Концентрирование вируса РПЛ проводили осаждением ПЭГ с различной молекулярной массой и в различных концентрациях, высаливанием сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах и осаждением ультрацентрифугированием при различных скоростях и продолжительности.

В работе по очистке вируса РПЛ от баластных белков использовали ульт-раценгрифугироваиие в градиентах сахарозы и Фикола-400. Плотность каждой фракции определяли на рефрактометре RL по составленным калибровочным кривым. В качестве контроля использовали дезинтегрированные ультразвуком незараженные вирусом РПЛ клетки ПТ-80.

Титр инфекционности вируса определяли по ТЦД50/МЛ на культуре клеток ПТ-80 в 24-луночных микропланшетах для культуральных работ. Результаты оценивали по цитопатическому действию через 3-5 суток после заражения клеток и рассчитывали титр вируса по методу Ашмарина И.П.

Г'емагглютинирующую активность определяли по методу Крюкова H.H. и др. с оценкой реакции по общепринятой крестовой системе. В реакции использовали, эритроциты лошади, сыворотки лошадей с подтвержденным диагнозом и предварительно протестированные в РТГА.

РТГА проводили согласно инструкции по применению Набора для диагностики РПЛ.

Поверхностные антигены вируса РПЛ, штамм «СВ/69» отщепляли путем обработки вирус-содержащей суспензии Тритоном Х-100.

Общий белок определяли по методу Лоури и на спектрофотометре СФ-26. Процент очистки вируса рассчитывали на инфекционную дозу.

Вируснейтрализуюшую активность сывороток определяли в реакции ви-руснейтрализации на 96-ти луночных микропланшетах по методу Florent G.

Электрофорез в ДСН - ПААГ проводили по методу Лаэмли.

Электроперенос белков после окончания электрофореза в ДСН - ПААГ осуществляли по методике Тоубина.

Иммуноиндикацию антигенов вируса РПЛ на нитроцеллюлозных мембранах проводили в непрямом методе ИФА.

Гипериммунные антисыворотки к IgG лошади получали по методу разработанному в лаборатории иммунологии и утвержденному на методическом совете ВНИТИБП.

Иммуноглобулины класса G (IgG) выделяли из цельной сыворотки лошадей высаливанием сернокислым аммонием с последующим обессоливанием препарата гельфильтрацией на сефадексе G-25 и очисткой ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-Трисакрил-М.

Очистку анти-IgG проводили с помощью аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными на BrCN-Сефарозу 4В очищенными иммуноглобулинами.

Контроль чистоты препаратов IgG осуществляли с помощью диск-электрофореза в 7,5 % полиакриламидном геле (ПААГ).

Однородность и специфичность препаратов IgG проверяли с помощью иммуноэлектрофореза.

Для получения коньюгатов анти-IgG лошади с пероксидазой из хрена использовали перийодатный метод Nakane Р. При проверке активности коньюгатов использовали метод прямого твердофазного ИФА. Рабочее разведение коньюгата определяли согласно временной инструкции по изготовлению и контролю антивидовых иммуноглобулинов, меченных пероксидазой, утвержденной Главбиопромом Агропрома СССР в 1986г. Реакцию учитывали на автоматическом спектрофотометре.

В работе использовали стандартные методы прямого и непрямого твердофазного ИФА на 96 луночных микропланшетах по Engvall и др., а также метод конкурентного ИФА по Van Weemen и др. Результаты анализа учитывали визуально и фотометрически через 10-15 минут после внесения субстратного раствора.

Результаты исследований обрабатывали статистически в программе Microsoft Excel.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выбор культуры клеток для репродукции вируса ринопневмонии лошадей, штамм «СВ/69»

Вирус РПЛ, штамм СВ/69 репродуцировали в перевиваемой культуре клеток почки теленка - ПТ-80, в первично-трипсинизированной культуре клеток почки эмбриона коровы (ПЭК) (на уровне 5 - 30-го субпассажа)

Клетки выращивали на культуральной среде содержащей половину среды Игла, половину среды 199, 10% сыворотки КРС для культуральных работ, предварительно протестированной на наличие антител к вирусу ИРТ, либо 5% фе-тапьной сыворотки КРС, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия и 40 единиц гентамицина на литр среды.

После образования монослоя клеток ПТ-80 его трижды отмывали раствором Хенкса и инокулировали вирус РПЛ, штамм СВ/69, в течение часа при 20 °С из расчета 0.1-1 ТЦДзд на клетку. Затем добавляли бессывороточную среду ГЛАХ (гидролизат лактальбумина на растворе Хенкса), содержащую 40 единиц гентамицина на литр среды.

Первые признаки цитопатического действия вируса РПЛ, штамм СВ/69, на перевиваемой культуре клеток ПТ-80 проявлялись через 12 часов. После проявления 80% ЦПД, через 72 часа, клетки разрушали однократным замораживанием-оттаиванием, культуральные матрасы встряхивали и осаждали клеточный детрит центрифугированием при 5000 об/мин в течение часа. Надоса-дочную вируссодержащую среду исследовали на инфекционную и гемагглюти-нирующую активность.

Определение титра инфекционности вируса РПЛ проводили в 24-луночных панелях по ТЦД50/ИЛ на культуре клеток ПТ-80. Посевная концентрация клеток составила 120-150 тыс/мл. После формирования монослоя из лунок

удаляли ростовую среду, однократно промывали раствором Хенкса и вносили вирус (предварительно раститрованный на среде поддержки без сыворотки от 10"2 до 10"8) в количестве 1 мл на лунку. Результаты оценивали по цитопатиче-скому действию через двое - трое суток после заражения клеток и рассчитывали титр вируса по методу Ашмарина И. П.

Вирус РПЛ, выращенный в перевиваемой культуре ПТ-80, проявлялся в реакции РГА в титрах 1:8-1:16, обладал инфекционностью на уровне 6.9-7.1 ^ТЦДед/ил, 80% цитопатический эффект проявлялся на 3 сутки культивирования. Ни в одном эксперименте не удалось репродуцировать вирус РПЛ, штамм СВ/69, в перевиваемой культуре клеток - СПЭВ. При репродукции вируса РПЛ в первично-трипсинизированных культурах клеток почки эмбриона коровы, вирус накапливался в титрах 5.6-6.1 ^ТЦДю/щ, и проявлялся в РГА в титрах от 1:4 до 1:8. При репродукции вируса РПЛ в перевиваемой культуре почки кошки - СгИС, вирус проявлялся в реакции РГА в титрах 1:2-1:4, обладал инфекционностью на уровне 5.8-6.4 ^ ТЦДЬо/чл, 80% цитопатический эффект проявлялся на 4 сутки культивирования.

В образцах первично-трипсинизированной культуры клеток почки эмбриона коровы (ПЭК), инфицированных дозой 0.1-1 ТЦД50/клетку, вирусные частицы с типичной для вируса РПЛ морфологией обнаруживаются уже через 12 ч, достигая максимума к 72 ч культивирования.

Очистка и концентрирование вируса РПЛ.

Для получения очищенных и концентрированных препаратов вируса РПЛ было использовано несколько принципов выделения вируса из вируссодержа-щих суспензий.

При концентрировании вируса РПЛ, штамм «СВ/69», были изучены различные условия осаждения его полиэтиленгликолем (ПЭГ) с различным молекулярными массами: 3000, 6000 и 20 000 дальтон в концентрации 5.0, 7,5 и 10,0%.

При концентрировании вируса РПЛ, штамма СВ/69, ПЭГ очистка вируса достигает 88.1 - 97.6%. Потеря вируса равна 36.9 - 84.2%. Лучшие результаты

получены в случае применения ПЭГ с молекулярной массой 6000 дальтон в концентрации 7.5%. Очистка вируса равна 97.6%, а потеря 36.9%.

Для концентрирования вируса РПЛ также был использован принцип осаждения вируса высаливанием. Для этой цели использовали 40% сульфат аммония. До 59.4% вируса РПЛ, штамма СВ/69, осаждается 40% сульфатом аммония при концентрировании в 10 раз. Очистка от балластных белков составляет в этом случае 71.6 %.

Метод ультрафильтрации позволяет концентрировать препараты вируса РПЛ в 10-50 раз. Особенностью концентрирования вирусной суспензии на ядерных фильтрах является снижение в концентрате количества общего белка. При концентрировании вирусной суспензии по объему в 10 -50 раз количество белка в расчете на инфекционную дозу вируса снижается на 85.0 - 87.4%. Однако общее количество белка в концентрате приэтом многократно увеличивается, что не позволяет добиться очистки вируса. При концентрировании препарата в 10 раз потерь вируса не наблюдалось, с повышением кратности концентрирования до 50 раз потеря вируса составляла 20.4%.

Наряду с концентрированием вышеописанными методами испытывался также метод осаждения вируса высокоскоростным ультрацентрифугированием. Вирус из предварительно осветленной низкоскоростным центрифугированием культуралыюй жидкости осаждали при 90000§ в течение I, 2, 3, 4 и 5 часов. Высокоскоростное центрифугирование при 90000g в течение 5 часов позволяет практически полностью без потерь осадить вирус РПЛ из вируссодержащей суспензии. Очистка при этом достигает 97,2

Концентрированный и частично очищенную вируссодержащую культу-ральную среду центрифугировали при 90000g в ступенчатом градиенте сахарозы от 15 до 55% с диапазоном изменения концентрации в 10%. По окончании ультрацентрифугирования собирали фракции по 1 мл. В каждой фракции измеряли рефрактометрический индекс, титр инфекционности, титр гемагглютини-рующей активности и титр в ИФА. Пик инфекционной активности приходится на фракции с плотностью 1,20г/см\ соответствующий уровню 45% сахарозы, с

выходом вируса до 63,8%. Одновременно происходит очистка на 97,1%. Максимумы активности в ИФА и РСК совпадают с пиком инфекционной активности.

Определение плавучей плотности вируса РПЛ, штамм «СВ/69», позволило при очистке вируса использовать центрифугирование на «подушке» сахарозы или иначе на градиентную интерфазу. На дно центрифужной пробирки помещали «подушку» из 55% сахарозы с плотностью 1.25г/см3, затем наслаивали 45% сахарозу с плотностью 1.20г/см3, а сверху - 25% сахарозу с плотностью 1. Юг/см \ На такой преформированный ступенчатый градиент наслаивали вирусный препарат. Центрифугирование проводили при 161000g в течение 90 минут.

Вирус локализовался в интерфазе между 25% и 55% сахарозы. Посторонние компоненты, с меньшей плавучей плотностью (белки и нуклеиновые кислоты), через зону 45% сахарозы не проходят и остаются в верхней части центрифужной пробирки. При этом достигается не только очистка на 99.6% (3.2мг/мл белка в исходном препарате и 0.19мг/мл - в конечном), но и концентрирование его в 6 - 7 раз. Выход вируса составил 84.2%.

Таким образом, ультрацентрифугирование вируса РПЛ в градиенте плотности 15% - 55% и на «подушке» сахарозы позволяет получить высокоочищен-ный и концентрированный препарат вируса РПЛ. Плавучая плотность вируса РПЛ, штамм СВ/69, в растворе сахарозы равна 1.20Г/СМ3.

Была также определена плавучая плотность вируса РПЛ в градиенте Фи-колл - 400. Для этого очищенный и концентрированный вирус на этапе осаждения ПЭГ М-6000 ресуспендировали в 0.06М трис-HCl буфере, содержащем 0.1М NaCl и 1мМ ЭДТА (THE буфер), рН 6.8 и осветляли низкоскоростным центрифугированием при 5000g в течении 10 минут. Вирус из надосадка осаждали ультрацентрифугированием при 90000g в течение 4 часов. Осадок ресуспендировали в THE буфере и наносили на линейный 10% - 40% градиент Фи-колла-400. Центрифугирование проводили при 90000g в течение 4 часов.

По окончании центрифугирования собирали фракции по 1мл. В каждой фракции измеряли рефрактометрический индекс, титр инфекционности, титр гемагглютинирующей активности и активность в непрямом твердофазном ИФА. Результаты представлены на рисунке 5.

Вирус РПЛ концентрировался в двух зонах, соответствующих 19% и 29% Фиколла-400 с плотностью 1.065 и 1.098г/см\ соответственно, так как здесь были наивысшие титры инфекционности вируса, его гемагглютинирующая активность, и активность в ИФА.

Фракции, содержащие вирус РПЛ, объединяли. Степень очистки определяли по отношению титра инфекционности вируса к количеству общего белка. В результате проведенной работы вирус был очищен в 156 раз, потери составили 49%.

Таким образом, в линейном 10% - 40% градиенте плотности Фиколла-400 вирус РПЛ штамм «СВ/69» располагался в двух зонах и имел плавучую плотность 1.065 и 1.098г/см3, соответственно.

Суммируя результаты экспериментов по концентрированию и очистке вируса РПЛ, штамм СВ/69, репродуцированного в культуре клеток ПТ-80, (Таблица 11) можно заключить, что осаждение вируса ПЭГ с молекулярной массой 6000 Д в концентрации 7.5% наиболее приемлемый способ для первоначального концентрирования и очистки вируса, так как при концентрировании в 10 раз позволяет, во-первых, удалить более 95% балластного белка при потере не более 37% инфекционных частиц вируса, во-вторых, работатьединовременно с большим объемом вируссодержащей суспензии. Сульфат аммония осаждает вместе с вирусным материалом большее количество баластного белка - очистка не превышает 71%. Ультрафильтрация, несмотря на возможность работы с большими объемами вируссодержащего материала и сохранения до 85% инфекционных вирусных частиц не позволяет добиться одновременной очистки, так как количество балластного белка, в расчете на инфекционную дозу, увеличивается при концентрировании в 50 раз на 42%. Процесс осаждения вируса ультрацентрифугированием при 90000g в течение 5 часов позволяет практиче-

ски без потерь осадить вирус на дно центрифужной пробирки при очистке до 96%, но очень трудоемок и позволяет единовременно очищать не более 40 мл вируссодержащей культуральной среды. Тоже самое можно отметить относительно ультрацентрифугирования в градиентах сахарозы и Фиколла-400.

Определив условия концентрирования вируса РПЛ, штамм СВ/69, репродуцированного в культуре клеток ПТ-80, вышеописанными методами, была составлена схема получения концентрированного и очищенного вируса, включающая осаждение вируса из культуральной среды ПЭГ с молекулярной массой 6000 Д в концентрации 7.5%, переосаодение осадка ультрацентрифугированием при 90000g в течение 5 часов и осаждение полученного материала на градиентную интерфазу сахарозы.

Таким образом, получены препараты вируса РПЛ, которые использовались для изучения белкового состава вируса, выделения гликопротеинов, обладающих антигенной активностью, с целью синтеза иммуносорбента для выделения анти-РПЛ антител из сывороток естественно переболевших животных.

При определении условий хранения вируса РПЛ, штамм «СВ/69», репродуцированного в культуре клеток ПТ-80, его помещали в условия, при которых, температура соответствовала -50°, -20°, -7°, +4°, +20° и +37°С.

Вирус РПЛ хранится в условиях температуры от +4° до -50°С практически без снижения титра инфекционности в течение 1 месяца. При дальнейшем хранении вируса происходит снижение титра инфекционности на 1 ^ ТЦДзд/ш практически ежемесячно.

В течение первых суток титр инфекционности вируса РПЛ, штамм «СВ/69», репродуцированного в культуре клеток ПТ-80, снижается с 5,75 до 5,5 в условиях температуры +20° и до 4,5 - при +37°С. Далее при температуре +37°С титр инфекционности снижается до 0 через 4 суток и до 2,25 ^ при +20°С.

Антиген вируса РПЛ для определения уровня антител методом им• муноферментного анализа

Для изучения поверхностных гликопротеинов вируса РПЛ, их выделяли из концентрированной вируссодержащей суспензии, которую обрабатывали 1% тритоном Х-100 и инкубировали при +20 °С в течение 60 минут на шейкере. Нуклеокапсид и неразрушенные вирусные частицы осаждали центрифугированием при 100 тыс. g в течение четырех часов, а надосадок концентрировали ультрафильтрацией на мембране с пределом исключения 3 кД до концентрации 500 мкг/мл. Далее белки разделяли электрофорезом в ДСН-ПААГ.

Тритоном Х-100 отщепляется 10 белков с ММ 260, 150, 138, 90, 87, 65,62, 50,46,24 кД.

Вирусные белки, индуцирующие выработку анти-РПЛ антител у восприимчивых к ринопневмонии животных, определялись посредством иммунобло-тинга с индикацией белков в непрямом методе ИФА. В качестве анти-РПЛ антисыворотки использовали сыворотку от переболевших животных в разведении 1:50 (титр в непрямом ИФА 1:25600). У переболевших животных вырабатываются антитела к 10 (ММ 260,150,138,90,87,65,62,50,46,24 кД) белкам.

Таким образом, в составе вируса РПЛ, штамм «СВ/69», выявлено 10 гликопротеинов, отщепляющихся при обработке Тритоном Х-100 с ММ от 24 до 260 кД, которые индуцируют выработку анти-РПЛ антител у зараженных ри-нопневмонией лошадей.

Концентрированные ультрафильтрацией белки вируса РПЛ, отщепленные Тритоном Х-100 были иммобилизованы на BrCN Сефарозу 4В по стандартной методике.

Полученный таким образом иммуносорбент был использован для аффинного выделения анти-РПЛ антител из сывороток естественно переболевших животных. Элюированные с колонки анти-РПЛ IgG сразу переводили с помощью гель-хроматографии на Сефадексе G-25 в буфер для иммобилизации на носителе, концентрировали ультрафильтрацией и осветляли центрифугированием при 5000g в течение 30 минут. Очищенные и концентрированные анти-РПЛ IgG пришивали к активированной BrCN-Сефарозе 4В в количестве 6мг белка на 1мл геля, согласно инструкции производителя.

Колонку с анти-РПЛ иммуносорбентом трижды промывали 0.1М глицин-НС! и ЗФР, затем уравновешивали ЗФР, содержащим 0.1% Тритон Х-100 и через подготовленную таким образом колонку пропускали вируссодержащую суспензию в режиме замкнутого реактора в течение ночи при +4 °С. После отмывки колонки десятью объемами ЗФР, содержащим 0.1% Тритона Х-100, и пятью объемами ЗФР элюировали вирусные белки 0.1М глицин НС1, рН 2,0. Элюат немедленно нейтрализовали Ш №ОН. Элюируемые фракции контролировали путем отбора 5 - 50мкл из собираемой фракции для неколичественного анализа по Бредфорду. Во фракции опредиляли содержание белка, объединяли и немедленно концентрировали для дальнейшего исследования ультрафильтрацией в ячейке ФМ001 на мембране с пределом исключения ЗкД при давлении О.ЗмПа до концентрации 0.1мг/мл. Затем колонку уравновешивали адсорбирующим буфером содержащем 0.02% азида натрия.

Степень очистки полученого препарата определяли с помощью электрофореза в 7.5% ДСН-ПААГ. С помощью аффинной хроматографии удается выделить гликопротеины вируса РПЛ практически без примесей.

Специфичность аффинно очищенных гликопротеинов определяли в им-муноблотинге с анти-РПЛ сывороткой лошади после электрофореза в 7.5% ДСН-ПААГ. Все гликопротеины сохранили свою антигенную активность после аффинной очистки на иммуносорбенте с анти-РПЛ ^О.

Таким образом была получена матрица для одностадийной очистки антигенов вируса ринопневмонии лошади из вируссодержащих суспензий, использование которой позволяет практически без потерь выделять поверхностные белки вируса РПЛ.

Оптимизация условий проведения иммуноферментного анализа для определения уровня антител к вирусу РПЛ

С целью оптимизации условий постановки реакции ИФА, необходимо подобрать концентрации используемых компанентов. Оптимальную концентрацию антигена для ИФА установили его титрованием с положительной (спе-

цифичной к вирусу РПЛ) и отрицательной (от здоровых животных) сыворотками в разведении 1:100 в непрямом ИФА.

Оптимальная концентрация антигена составила 1 мкг/мл, что обеспечивало высокий уровень оптической плотности и достоверное различие результатов со специфической (ОП490 1.8 - 1.6) и контрольной сыворотками (ОП490 0.150 -0.200).

Для установления пороговой чувствительности ИФА определяли зависимость величины ОП490 в реакции ИФА от разведения контрольных сывороток при оптимальной концентрации сорбированного антигена вируса РПЛ. Двукратные разведения сывороток начинали с разведения 1:50. Достоверно регистрируемое различие в показаниях ОП490 (более чем в 2 раза) наблюдалось при разведении специфической и контрольной сывороток с 1:400. При разведении ниже 1:400 наблюдается неспецифическое взаимодействие, что сказывается на результатах реакции.

Таким образом, была определена концентрация антигена вируса РПЛ и положительных сывороток, которые были использованы для определения уровня антител к вирусу РПЛ иммуноферментным методом.

Выявление антител к вирусу РПЛ методом иммуноферментного анализа.

Методом ИФА было исследовано 235 сыворотки лошади, полученных из различных хозяйств и по наличию специфических антител к вирусу РПЛ были определены благополучные и неблагополучные по РПЛ хозяйства.

Из всех положительных сывороток с установленным титром антител в ИФА произвольно взяли 107 и исследовали в реакции вируснейтрализации и торможения гемагглютинации.

Сравнительные исследования 107 сывороток лошади в реакциях РН и ИФА показали, что 93 образца, которые имели в реакции нейтрализации титр антител 1:4 и выше, давали в ИФА титры не менее, чем 1:400. Кроме того, титр 14-ти отрицательных в реакции вируснейтрализации сывороток (титры не более, чем 1:2) не превышали в ИФА - 1:200.

Результаты, полученные в ИФА, сравнивали с результатами, полученными в РТГА. 28 сывороток отрицательных в РТГА (т.е. титр < 1:4) давали в ИФА титр не более, чем 1:200, что позволяет отнести их с отрицательный или сомнительным. Обе методики ставятся без использования культуры клеток, быстры и позволяют исследовать большое количество сывороток. Преимуществом метода ИФА является инструментальный учет результатов, что исключает субъективность их оценки.

Таким образом, при сравнительной оценке уровня анти-РПЛ антител, полученных различными методами (РТГА, РН и ИФА), установлено, что результаты титрования сывороток в ИФА имеют высокий коэффициент корреляции (г = 0.94) с результатами РН и РТГА (г = 0.86), чувствителен, быстр в исполнении и может быть использован при определении уровня анти- РПЛ антител при обследовании большого количества животных.

Набор для определения уровня антител к вирусу РПЛ в иммунофер-ментном анализе

В результате проведенных исследований были получены компоненты набора для определения уровня антител к вирусу РПЛ, определены условия постановки тест-системы ИФА и создан набор опредиляющий уровень анти-РПЛ антител. Набор предназначен для массового серологического обследования поголовья лошадей на наличие антител к вирусу РПЛ методом ИФА.

Сущность иммуноферментной реакции заключается в специфическом взаимодействии антител и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу антивидового иммуноглобулина, меченного ферментом, способным вызвать разложение субстрата с образованием цветного продукта ферментативной реакции.

Набор представляет собой комплект биологических и химических компонентов, использующихся при постановке реакции, и полистироловой 96-луночной микропанели, сенсибилизированной антигеном вируса РПЛ и положительной и отрицательной контрольными сыворотками.

Биологические компоненты:

№1. Разборный иммунологический планшет сенсибилизированный антигеном вируса РПЛ - 2 шт.

№2. Позитивная контрольная сыворотка ОД см3 - 1фл.

№3. Нормальная контрольная сыворотка 0,1 см} - 1фл.

№4. Коньюгат иммунопероксидазный анти-IgG лошади 1 см1, - 1 фл.

Химические компоненты:

№5. Буфер для растворения коньюгата 1,5 см4, -1 фл

№6. Буфер инкубационный 20 кратный концентрат, 20 см\ - 2 фл.

№7. Однокомпонентный субстрат (ТМБ), 25 см1, - 1 фл

№8. Стоп- реагент (1 М H2S04), 11 см1, - 1фл.

На основании проведенной работы была разработана и утверждена «Временная инструкция по изготовлению тест системы для определения уровня антител к вирусу РПЛ в иммуноферментном анализе. Отзывы о диагностикуме положительные. Поступили просьбы о необходимости промышленного производства наборов и обеспечение ими потребностей ветеринарных служб.

"Тест система для определения уровня антител к вирусу РПЛ в иммуноферментном анализе " предназначена для эпизоотологического обследования поголовья в племенных и пользовательных хозяйствах при организации оздоровительных в отношении РПЛ мероприятий в ветеринарных лабораториях республиканского и областного масштаба, на пунктах пограничного ветеринарного контроля для проведения проверки импортируемых животных. Внедрение в практику ветеринарии иммуноферментного диагностикума на РПЛ позволит решить проблему массового эпизоотологического обследования поголовья лошадей, составляющего основу мероприятий по ликвидации и предупреждению распространения данного заболевания. Диагностикум может быть предложен для экспорта в страны со стационарным неблагополучием скота по РПЛ.

Внедрение в практику набора по определению уровня антител к вирусу РПЛ в иммуноферментном анализе позволит повысить эффективность диагностики, что будет способствовать в комплексе мер оздоровлению хозяйств от

инфекционной ринопневмонии лошадей, обеспечению эпизоотологического благополучия, улучшению качества продукции.

Экономический эффект от применения наборов для диагностики ринопневмонии лошадей скота составит 830 тыс. рублей на тысячу исследований (в ценах 2005г).

Выводы.

Разработан метод концентрирования и очистки вируса РПЛ, штамм «СВ/69», репродуцированного в культуре клеток ПТ-80, позволяющий получать препараты с титром инфекционности вируса выше, чем в исходной суспензии на 2.0 - 2.5 1§ ТЦЩо/щ, и очищенных от балластных белков на 97-98%.

При изучении состава поверхностных антигенов вируса РПЛ, штамм «СВ/69», полученных при обработке вируссодержащей суспензии Тритоном Х-100, в иммуноблотинге выявлено 10 структурных гликопротеинов с ММ от 24 до 260 кД, индуцирующх выработку анти-РПЛ антител в организме зараженных вирусом ринопневмонии лошадей. Показана возможность одноэтапной препаративной очистки антигенов вируса РПЛ из вируссодержащих суспензий с помощью аффинной хроматографии на анти-РПЛ ^О Сефарозе 4В.

На основе очищенных и концентрированных антигенов вируса РПЛ разработаны компоненты набора для определения уровня анти-РПЛ антител в сыворотках лошадей в иммуноферметгном анализе. При сравнительной оценке различных методов определения уровня анти-РПЛ антител установлено, что в ИФА и РТГА, коэффициент корреляции равен г=0,86, в ИФА и РН - г=0,94. Преимуществом метода ИФА при определении антител к вирусу РПЛ в сыворотках крови лошадей является возможность инструментального учета результатов. Разработана тест-система для определения уровня антител к вирусу РПЛ методом иммуноферментного анализа на основе аффинно-очищенного антигена вируса РПЛ, штамм «СВ/69».

7. Практические предложения.

На основе проведенной работы представлена нормативная документация:

«Временная инструкция по изготовлению и контролю компонентов набора для определения уровня антител к вирусу ринопневмонии лошадей на основе аффинно очищенных антигенов вируса РПЛ, штамм «СВ/69», утверждена директором ВНИТИБП 10 сентября 2005 г.

Проект технических условий на «Набор для определения уровня антител к вирусу ринопневмонии лошадей в иммуноферментном анализе».

Проект «Инструкции по применению набора для определения уровня антител к вирусу ринопневмонии лошадей в иммуноферментном анализе», утвержденная директором ВНИТИБП 10 сентября 2005 г.

«Методические рекомендации по определению уровня антител к вирусу ринопневмонии лошадей в иммуноферментном анализе», рекомендованы на заседании секции «Ветеринарная медицина» 14 февраля 2006 г. для утверждения РАСХН в установленном порядке.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Коржов В.В., Самуйленко АЛ., Кочиш И.И., Кузнецов Д.П. II Изучения репродукции вируса РПЛ в первично трипсинизированной культуре клеток почки теленка, перевиваемой культуре клеток ПТ-80, СПЭВ, CrFK // Материалы 3-й международной научно-практической конференции «Современные технологические и селекционные аспекты развития животноводства России», Дубровича 2005. Научные труды ВИЖ. Выпуск 63. Том 2, с. 257- Л 260

2. Коржов В.В., Кузнецов Д.П., Кочиш И.И. // Разработка тест-системы для детекции антител к вирусу инфекционной ринопневмонии лошадей методом ИФА // Материалы международного симпозиума 28-30 ноября «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» Казань, 2005. Том 2, с. 193-197.

3. Коржов В.В., Кузнецов Д.П., Кочиш И.И. // Концентрирование и очистка вируса ринопневмонии лошадей. // Материалы международного симпозиума 28-30 ноября «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» Казань, 2005. Том 2, с. 198-202.

2006А

Отпечатано ООО Мещера Зак.559 тир 100

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Коржов, Василий Васильевич

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Общая характеристика семейства герпесвирусов

2.2. Инфекционная ринопневмония лошадей

2.2.1. Разновидности и распространение герпесвирусов лошадей

2.2.2. Клинические проявления ринопневмонии лошадей

2.2.3. Пути передачи вируса РПЛ 19 ф 2.2.4. Иммунитет при ринопневмонии лошадей

2.3. Культивирование вируса ринопневмонии лошадей

2.4. Морфология и химический состав вируса РПЛ.

2.5. Антигенное родство и различие герпесвирусов и штаммов вируса РПЛ

2.6. Концентрирование и очистка вируса РПЛ

2.7. Очистка фракции иммуноглобулинов класса в 28 ( 2.8. Лабораторная диагностика ринопневмонии лошадей

2.8.1. Индикация вируса

2.8.2.Гемагглютинирующая активность вируса РПЛ

2.8.3. Серологическая идентификация вируса

2.8.4. Серодиагностика и ретроспективная диагностика

2.8.5. Иммуноферментный анализ 37 ~ 2.9. Заключение по обзору литературы

3. Материалы и методы.

4. Собственные исследования. 52 4.1. Выбор культуры клеток для репродукции вируса ринопневмонии лошадей, штамм «СВ/69» ф 4.2. Очистка и концентрирование вируса РПЛ

4.3. Биологические свойства вируса РПЛ

4.4. Получение коньюгата анти-^в лошади с пероксидазой из хрена

4.4.1. Выделение иммуноглобулина класса в из сыворотки крови лошади

4.4.2. Получение анти-^в лошади из анти-^в сыворотки.

4.4.3. Выделение антивидовых иммуноглобулинов анти-^в лошади)

4.4.4. Мечение антивидовых иммуноглобулинов анти-^в лошади) ферментом пероксидазой из хрена

4.5. Тест-система для определения уровня антител к вирусу РПЛ в иммуноферментном анализе

4.5.1. Получение антигенов вируса РПЛ для иммуноферментного анализа.

4.5.2.0птимизация условий проведения иммуноферментного анализа РПЛ

4.6. Выявление антител к вирусу РПЛ методом иммуноферментного анализа

4.7. Набор для определения уровня антител к вирусу

РПЛ в иммуноферментном анализе

5. Обсуждение результатов

6. Выводы.

7. Практические предложения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка компонентов набора для определения уровня антител к вирусу ринопневмонии лошадей методом иммуноферментного анализа"

Одним из движущих факторов развития экономики нашей страны является научно-технический прогресс, способствующий ускорению развития народного хозяйства путем интенсификации науки и производства, внедрения новых технологий. Процесс интенсификации охватывает и биологию в самом широком смысле слова.

Инфекционная ринопневмония лошадей наносит значительный экономический ущерб коневодству, который складывается из потери воспроизводительной способности конематок, недополучения приплода, выбраковки ценных в племенном отношении лошадей и проведения ветеринарно-санитарных мероприятий. Возникнув в коневодческом хозяйстве любого типа (конный завод, племенная конеферма, ипподром, конноспортивный комплекс и др.), РПЛ принимает характер стационарной инфекции. Острое течение инфекции чередуется с периодами стертого атипичного .проявления болезни, что крайне осложняет диагностику заболевания. Изучение РПЛ в течении последнего времени показало актуальность данной проблемы.

Поэтому в системе мер, направленных на борьбу с ринопневмонией лошадей, важное значение имеют быстрые и точные методы лабораторной ( » диагностики. Используемые в настоящее время в ветеринарной практике серологические методы диагностики имеют определенные недостатки.

Предварительная клиническая диагностика респираторной формы болезни затруднительна, так как симптомы заболевания сходны с клиникой других вирусных и бактериальных болезней, особенно таких, как грипп лошадей, вирусный артериит, бруцеллез или вообще клиника не проявляется (88).

Для получения антивидовых иммуноглобулинов животных, меченых пероксидазой из( хрена (ПХ), необходимо наличие чистых препаратов иммуноглобулинов в, М и А классов.

Методы выделения иммуноглобулинов из сыворотки человека разработаны детально, но применительно к иммуноглобулинам животных они не всегда эффективны. Использование многих иммунологических методов для решения прикладных задач в области ветеринарии сдерживается отсутствием коммерческих моноспецифических антисывороток. Идеальным условием получения моноспецифических антисывороток представляется иммунизация продуцентов чистыми антигенами.

Ключевым моментом в отработке твердофазного непрямого ИФА является получение . коньюгата, то есть иммуноглобулина меченого пероксидазой. Качество получаемого коньюгата находится в прямой зависимости от серологической активности иммуноглобулина, активности фермента и условий связывания этих компонентов.

Цели и задачи исследования.

Решались следующие задачи:

1. Разработать метод получения очищенного и концентрированного вируса РПЛ, штамм СВ/69, репродуцированного в культуре клеток ПТ-80 и изучить его биологические свойства.

2. Выделить поверхностные антигены вируса РПЛ, изучить их состав в электрофорезе и активность в иммуноблотинге и получить на их основе иммуносорбент на ВгСЫ сефарозе.

3. Выделить лошади, получить анти-^в лошади антисыворотки на кроликах, выделить анти-^О лошади антитела и синтезировать анти-^в лошади иммунопероксидазный коньюгат.

4. Выделить на полученном сорбенте специфические к антигенам вируса РПЛ антитела и иммобилизовать их в качестве лиганда на ВгСЫ сефарозу.

5. Разработать тест - систему для определения уровня антител к вирусу РПЛ на основе аффинно-очищенных антигенов вируса РПЛ методом иммуноферментного анализа.

6. Провести сравнительную оценку определения уровня анти-РПЛ антител в серологических реакциях (РН, РТГА) и разработанной иммуноферментной тест - системе.

Научная новизна.

1. Разработан метод получения очищенных и концентрированных поверхностных антигенов вируса РПЛ, репродуцированного в культуре клеток ПТ-80, с помощью препаративной аффинной хромотографии на анти-РПЛ ДО ВгСЫ Сефарозе.

2. Выявлено 10 структурных гликопротеинов вируса РПЛ, штамм СВ/69 с молекулярной массой от 24 до 260 кД, которые отщепляются Тритоном X-100.

3. В иммуноблотинге показано, что 10 белков вируса РПЛ, отщепляющиеся < при обработке Тритоном Х-100, индуцируют выработку анти-РПЛ антител в организме животных.

4. Разработана тест-система для определения уровня антител к вирусу РПЛ методом иммуноферментного анализа на основе аффинно очищенных антигенов вируса РПЛ, штамма СВ/69.

Практическая значимость работы.

Внедрение в практику «Тест-системы для определения уровня антител к вирусу РПЛ в иммуноферментном анализе» позволит проводить диагностику РПЛ в племенных и пользовательских хозяйствах (ипподромов, заводов, частных конеферм и др.) в качестве профилактических мер по предупреждению РПЛ, что будет способствовать оздоровлению хозяйств, обеспечению эпизоотологического благополучия, повышению сохранности молодняка и продуктивности поголовья.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Коржов, Василий Васильевич

6. Выводы.

6.1. Разработан метод концентрирования и очистки вируса РПЛ, штамм

СВ/69», репродуцированного в культуре клеток ПТ-80, позволяющий получать препараты с титром инфекционности вируса выше, чем в исходной суспензии на 2.0 - 2.5 lg ТЦД5о/мл и очищенных от балластных белков на 97-98%.

6.2. При изучении состава поверхностных антигенов вируса РПЛ, штамм

СВ/69», полученных при обработке вируссодержащей суспензии Тритоном Х-100, в иммуноблотинге выявлено 10 структурных гликопротеинов с ММ от 24 до 260 кД, индуцирующих выработку анти-РПЛ антител в организме зараженных вирусом ринопневмонии лошадей.

6.3. Показана возможность одноэтапной препаративной очистки антигенов вируса РПЛ из вируссодержащих суспензий с помощью аффинной хроматографии на анти-РПЛ IgG Сефарозе 4В.

6.4. На основе очищенных и концентрированных антигенов вируса РПЛ разработаны компоненты набора для определения уровня анти-РПЛ антител в сыворотках лошадей в иммуноферментном анализе.

6.5. При сравнительной оценке различных методов определения уровня анти

РПЛ антител установлено, что в ИФА и РТГА, коэффициент корреляции равен 1=0,86, в ИФА и РН - г=0,94. Преимуществом метода ИФА при определении антител к вирусу РПЛ в сыворотках крови лошадей является возможность инструментального учета результатов.

6.6. Разработана тест-система для определения уровня антител к вирусу РПЛ методом иммуноферментного анализа на основе аффинно-очищенного антигена вируса РПЛ, штамм «СВ/69».

Практические предложения.

На основе проведенной работы представлена нормативная документация:

Временная инструкция по изготовлению и контролю компонентов набора для определения уровня антител к вирусу ринопневмонии лошадей на основе аффинно очищенных антигенов вируса РПЛ, штамм «СВ/69», утвержденная директором ВНИТИБП 10 сентября 2006 г.

Методические рекомендации по определению уровня антител к вирусу ринопневмонии лошадей в иммуноферментном анализе», рекомендованы на заседании секции «Ветеринарная медицина» 14 февраля 2006 г. для утверждения РАСХН в установленном порядке. 4

БЛАГОДАРНОСТЬ

Выражаю глубокую признательность и благодарность администрации ВНИТИБП за предоставленную возможность провести научные исследования по представленной теме, руководителю работы доктору биологических наук Кузнецовой C.B., заведующему отделом молекулярной биологии доктору биологических наук, профессору Кузнецову Д.П., сотрудникам отдела Ярыгиной Е.И., Сазановой Э.Я. и всему коллективу отдела за помощь в проведении и оформлении работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коржов, Василий Васильевич, Шелково

1. Авилов B.C., Матюгина Н.И. // Влияние дозы и очистки вируса ИРТ КРС на антителообразование при иммунизации кроликов. // Акт. пробл. вет. вирус., тр. ВИЭВ, 1981, 53, 60-62

2. Авилов B.C., Мникова Л.А., Сологуб В.К., Коромыслов Г.Ф., Дзантиев Б.Б., Сорокина Н.В., Егоров A.M. // Иммуноферментный анализ // Ветеринария, 1981, 8, 33-35

3. Авророва Р.И. // Усовершенствование и применение реакции пассивной гемаглютинации в практике лабороторных исследований при гриппе. // Автореферат дис. канд. мед. наук. М. 1967

4. Амекбеков M.4I Иммуногенные и реактогенные свойства вирусвакцины против ринопневмонии лошадей. //. Авториф. дисс. кандид. вет. наук, Москва, 1982, 25 с.

5. Амирбеков М., Юров К.П., Крюков H.H. // Иммуногенные свойства вирус-вакцины против ринопневмонии лошадей. // Ветеринария, 1984; Т. 8, с. 2830

6. Амирбеков М., Юров К.П. // Иммунодепрессивные свойства вируса ринопневмонии лошадей. // Тр. ВИЭВ Всесоюзный институт экспериментальной ветеринарии, 1983; Т. 57, - с. 110-112

7. Атамась В.А. // Инфекционные и инвазиозные болезни сельскохозяйственных животных. // Одесса 1982, с. 7-11

8. Атамась В.А., Лаврова И.Г. // Изучение гуморальных поствакцинальных антител у крупного рогатого скота, иммунизированного живой и инактивированной вакцинами против инфекционного ринотрахеита. // Инф. и инвазион. Болезни с/х жив. Одесса, 1982, с. 11-15

9. Ахметсадыков H.H. // Комплексная иммунопрофилактика ринопневмонии и сальмонеллезного аборта кобыл живыми вакцинами // Алма-Ата, 1988, 22

10. Басалгина, С.А. // Совершенствование тест-систем для диагностики хламидиозов на основе непрямого иммунофлуоресцентного и иммуноферментного анализа // Дис. канд. мед. наук: 03.00.07 Ин-т экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН Пермь. 2003

11. Баранов O.K. и др. // Изготовление реагентов для иммуноферментного анализа: Метод, рекомендации. // ВАСХНИЛ, Сиб. отд-ние, Ин-т эксперим. ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Новосибирск: СО ВАСХНИЛ, 1987

12. Белозеров С.С., Архипов З.С. // Динамика ТВ- лимфоцитов у больных вирусом гепатитом. // Клин. Мед. 1976, т. 54, №. 1. с. 24-26

13. Бобкова А.Ф., Чирков С.Н. // Применение иммуноферментного анализа для диагностики вирусных заболеваний растений (Обзор). // С/х биология, 1983,5,32-36

14. Будулов Н.Р. // Иммуногенная активность респираторного и фетального штаммов вируса ринопневмонии для жеребят. Актуал. вопр. диагностики и борьбы с болезнями с.-х. животных. // Ставрополь, 1999, С. 47-49

15. Бусол В.А., Галатюк А.Е., Мандыгра Н.С. // Эпизоотическая ситуация в отрасли коневодства Украины. // Новосибирск, 1997, С. 52-53

16. Быкова H.H., Лукина В.А., Бойко A.A. // Сравнительная оценка иммуноглобулинов, меченых пероксидазой (иммуноферментных конъюгатов). // Передовой науч.-производст. Опыт в биологической промышленности, 1985, 9, 8-11

17. Вершняк T.B. // Условно-патогенная микрофлора в птицехозяйствах и диагностика эшерихиоза птиц на основе тест-системы иммуноферментного анализа. // Дис. канд. биол. наук Щелково, 2003 150 с.

18. Галатюк O.E. // Серолопчна д1агностика ринопневмонн коней у РГГА и РНГА. // Лаб. вет. медицина: ф!з. xiM. методи дослщ. - Р1вне, 1998, - С. 54-58

19. Галатюк О. // Нервова форма ринопневмонн коней та диференщйна д1агностика хвороби. // Вет. медицина Украши, 2000; N 2, С. 21-23

20. Грязин В.Н. // Диагностика некоторых вирусных инфекций КРС в Новосибирской области. // Лекция. Новосибирский аграрный университет. Новосибирск. 1992. - с. 29-36

21. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б Б., Гаврилова Е.М. // Теория и практика иммуноферментного анализа. // М.: Высш. шк., 1991

22. Забегина Е.Ф. // Типирование герпесвирусов лошадей методом рестрикционного анализа ДНК и изыскание вакцинного штамма. // Диссертация, Москва. ВИЭВ, 1998. с. 51-58

23. Зудилина З.Ф. // Изучение биологических свойств парамикровируса и вирусов группы герпес крупного рогатого скота. // Авореф. дисс.канд. биол. наук, М., 1970, 15 с.

24. Зьентара С. // Ринопневмония лошадей (молекулярная биология, диагностика и профилактика). // Ветеринар, 2001; N 6, С. 4-8

25. Кадыкоев Р.Т. // Использование полимеразной цепной реакции (ГТЦР) для выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей. // Дис. канд. биол. наук. Всерос. НИИ вет. вирусологии и микробиологии. Покров, 1999

26. Карахан, Н.М. . // Методы молекулярной гибридизации, иммунофлюоресценции и иммуноферментного анализа в диагностике (herpes simplex (человек) virus). // Дис. канд. биол. наук: 03.00.07. М., 1996

27. Каныпина A.B. // Разработка методов иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней. // Дис. канд. вет. наук Владимир, 2004 123 с

28. Кицак В.Я. // Твердофазный иммуноферментный анализ в вирусологии. Обзор литературы. // МРЖ, 1988, разд.М., I, 20-23

29. Кочиш Т.Ю. // Разработка набора реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе. // Дис. .канд. биол. наук. Шелково, 2004 156 с.

30. Коромыслов Г.Ф. // Иммуноферментный анализ в ветеринарии. // М.: ВИЭВ, 1985

31. Кривошия П.Ю., Галатюк O.E., Кот Л.Б. // Цитопатогенна та аглютинуюча актившсть in'vitro деяких пптив Bipycy ринопневмони. // Вет. медицинаЛн-т експеримл юишч. вет.медйцини УААН, 2000; Вип.78,т.1, С. 190-192

32. Крюков H.H. // В кн. Инфекционные болезни КРС. // М. 1974, С. 83-93

33. Крюков H.H. и Юров К.П. // Авторское свидетельство №1187303. // М. 1985

34. Крюков H.H. // Ринопневмония лошадей. В кн.: Инфекционные и инвазионные болезни лошадей. Составитель Ф.М. Орлов М., // Колос, 1976, с. 90-98.;

35. Крюков H.H., Юров К.П. // Выделение вируса аборта кобыл. // Труды ВИЭВ, 1970, т. 37, с. 141-145;

36. Кузнецов Д.П. // Разработка набора для диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа. // Дис. канд. биол. наук / ВИЭВ М., 1990;

37. Кузнецов Д.П., Самуйленко А.Я., Кузнецова C.B., Бойко A.A., Блехерман Б.Е. // Тест-система иммуноферментного анолиза для диагностики инфекционного ринотрахеита КРС // Ветеринария, 1990, 10, с.50-51

38. Кузнецов П.П. Иванов. B.C. и др // Rabien Vaccine from virus-fix strain adapted to established BHK-21/13 cell lines // XXI Всемирный вет. конгрес. 1979,3;

39. Кумекбаева Ж.Ж., Юров К.П. // Иммунологические реакции у лошадей на введение инактивированного вируса ринопневмонии. // Ветеринария, 1988; Т. 5, с. 24-26

40. Кэрстак Э. // Успехи в разработке иммуноферментных методов: получение реагентов, планирование экспериментальных исследований и интерпретации результатов. // Семинар ВОЗ по проблеме получения вирусных реагентов, М., СССР, 11-24/XII, 1983.

41. Лебедев П.Т. // Заразный катар верхних дыхательных путей. // Коневодство й кон. спорт. 1999; N 4, С 9

42. Люлькова Л.С. // Инфекционная анемия: разработка диагностических тест-систем РДП и ИФА на основе антигена культурального вируса. // Автореф. дис. канд. биол. наук. Всерос. н.-и. и технол. ин-т биол. пром-сти. Щелково, 2001, 26 е., ил

43. Мельниченко Л.П. // Диагностика инфекционного эпидидимита баранов методами флуоресцирующих антител и иммуноферментного анализа. // М, 1991,-23

44. Музычин С.И., Шинко С.И., Ковалев H.A. // Иммунный ответ у телят при аэрозольной вакцинации против парагриппа 3. // В кн. Инфекционные болезни КРС и меры борьбы с ними. - Минск - 1982 - с. 77 — 81

45. Нго Т.Т., Ленхоффа Г. Иммуноферментный анализ. // Пер. с англ М.; Мир, 1988,-444 е., ил

46. Непоклонова И.В. // Применение метода ELISA для обнаружения антигена вируса ИРТ. // Проблемы вет. иммунол., под ред. академика ВАСХНИЛ Урбана В.П., М., Агропромиздат, 1985, 152-153

47. Непоклонова И.В., Васильев A.B. // ИФА для выявления вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и антител к нему. // Бюл. ВИЭВ, 1985, 58,30-35

48. Непоклонова И.В, // Выявление антигена вируса ИРТ и антител к нему методом ИФА. // Автореф. дисс. вет. наук. М., 1985, 19

49. Носков Ф.С. Коникова P.E., Баяр Г. А. // Лиофилизированные эритроцитарные диагностикумы для реакции непрямой гемаглютинации. // Военно-медицинский журнал 1973 - №5 - с. 52 - 58

50. Нужнов С.А. // Реактогенные и иммуногенные свойства вируса ринопневмонии лошадей при гетерологичной иммунизации телят против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. // ВИЭВ. М. 1989, -22 с.

51. Нужнов С.А. // Диагностические исследования на инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота в хозяйстве, неблагополучном по респираторным болезням телят// Бюл. ВИЭВ, 1989; Т. 71 с. 32-33

52. Петкова К., Текерлеков П., Антонов П., Цветков П. // Използване на реакция коаглутинация при контрол на ваксина срещу ринопневмонита по конете. // Ветер. Мед. 1996; T.2,N 4, С. 233-235

53. Пешкус Ю.К., Моркунас А.Б., Диканене И.П. // Применение иммуносорбентов для получения специфических антисывороток к иммуноглобулинам IgGI и IgG2 коров. // Метаболизм и его регуляция биол. активн. веществами, Вильнюсь, 1979, 237-241

54. Покровский В.И., Шабалина C.B. // Веер. Хим. Об-ва им. Д.И. Менделеева, 1989, 34, 1

55. Пурэвцэрэн Б. // Проблемы диагностирования ринопневмонии лошадей. // НИИВ Новосибирск, 1998, С. 82

56. Пурэвцэрэн Б. // Репродукция штамм НН1, ринопневмоний лошадей в клеточных культурах. // Новосибирск, 1999, С. 27-28

57. Сазанова Э. Я. и др. // Иммуноферментный анализ при индикации вируса бешенства и определении уровня антител. //Ветеринария. 1991. 8.

58. Сазанова Э. Я. и др. // Сравнительная оценка иммуногенности вируса бешенства методом иммуноферментного анализа и в реакции нейтрализации по NIH. // Всесоюзный симпозиум «26-28 сент.,», 1989, с. 65

59. Сазанова Э.Я., Кузнецов Д.П., Кузнецова C.B., Байко A.A. // Выделение анти-IgG лошади из сыворотки крови кролика методом аффинной хроматографии. // передовой науч.-проиводст. Опыт в биол. промыш., 1986, 12,1-3

60. Самуйленко А.Я., Кузнецов Д.П., Кузнецова C.B. // Иммуноферментный анализ в ветеринарной медицине. // ВНИиТИБП. 2001, с. 20-23

61. Сансызбаев А.Р. // Влияние некоторых химических соединений на иммуногенность вируса ринопневмонии при создании инактивированнойвакцины. -// Соврем, пробл. профилактики зооноз. болезней и пути их решения. Минск, 1987, - С. 62-63

62. Сансызбаев А.Р. // Методы инактивации вируса ринопневмонии лошадей. //ВИЭВ, 1983; Т. 32, с. 13-15

63. Сергеев В.А., Орлянкин Б.Г. // Структура и биология вирусов животных. // М. Колос, 1983,-336 с.

64. Соковых Л.И., Горбунова A.C., Исаченко В.А. // Реакция пассивной гемаглютинации при вирусных инфекциях. // Вопросы вирусологии 1966 -№ 3 - С. 254 - 258

65. Строкина Г.М., Белкина Н.М., Федорова Е.С. // Гидролизатные среды на основе ГСБМ для выращивания вирусов. // Материалы конференции молодых ученых. М, 1986, с. 203-206

66. Сюрин В.Н. // Конструирование диагностикумов и противовирусных вакцин: современные биотехнологии. // Вестник с/х науки, 1986, 2, 141-148

67. Сюрин В.Н., Самуйленко А. Я. // Вирусные болезни животных. // М; ВНИТИБП, 1998. - 928 с, ил 1998

68. Таранов А.Г. // Диагностические тест системы: Радиоиммун. и иммунофермёнт. методы диагностики. // Новосиб. гос. мед. Акад. Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та, 2002

69. Тарасишин Л.А. // Мол. Генетика, микробиология и вирусол. // 1986, 5.

70. Татаров Г., Диловски М. // Създаване на авирулентен и имуногенен мутант от вируса на ринопневмонита. // Вет. мед. Науки, 1986; Т. 23. N 7, с. 33-40, ил. 2.табл. 5

71. Филиппов С.Ю. // Разработка иммуноферментного набора для определения уровня антител к вирусу парагриппа 3 крупного рогатого скота. // Щёлково, 2004 135 с.

72. Ходун JI.M и др. // Иммуноферментный анализ для диагностики туберкулеза животных. Приготовление реагентов тест-системы и методика постановки реакции. // Моск. НИИ туберкулеза Омск, 1990, 11 с.

73. Цыбанов С.Ж., Цыбанова Л.Я., Кадыкоев Р.Т., Калабеков М.И. // Идентификация вируса ринопневмонии лошадей с помощью ПЦР. // ВНИИВВиМ. Ветеринария, 2000, N 12, С. 20-24

74. Цыбанова Л.Я., Цыбанов С.Ж., Балышев В.М., Щетникова Л.А., Кадыкоев Р.Т., Калабеков М.И. // Очистка вируса ринопневмонии лошадей. // Всероссийский НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии; г. Покров1998,-С. 74

75. Цыбанова Л.Я., Кадыкоев Р.Т., Чевелева Т.С., Калабеков М.И. // Изучение динамики инактивации вируса ринопневмонии лошадей. // ВНИИВВиМ; г. Покров. М., 1999, - С. 11-12

76. Чайка H.A. // Иммуноферментный анализ в вирусологии 2 Ч. // Ленингр. НИИЭМ им. Пастера, 1986

77. Чайка. H.A. // Иммуноферментный анализ в вирусологии: Библиогр. указ, отеч. и зарубеж. лит. Ч. 4'. // Ленингр. НИИЭМ им. Пастера, 1986

78. Ченчев И., Мартинов С. // Проучване разпространението на инфекцията с херпесвирус 1 при еднокопитни в България за перирда 1994-1996 година. // Ветер. Мед. 1997; T.3,N 3, С. 121-123;

79. Щетникова JI.A. // Получение чистых антител и иммуноглобулинов классов М и G КРС методом аффинной хроматографии на сефарозе. // Сб. научн.тр. МВА, 1979, 107, 34-35

80. Юров К.П., Лопарев В.И., Ярных Е.В., Забегина Е.Ф., Белкина Н.М. // Вакцина для профилактики гриппа и ринопневмонии лошадей и способ ее применения. // Авторское свидетельство, N 1608893 от 22 июня 1990 г. 8 с.

81. Юров К.П. // Инфекционные болезни лошадей. // Москва, 1988 г., с. 87

82. Юров К.П., Амирбеков М.А. // Поствакцинальный иммунитет при ринопневмонии у жеребых кобыл. // Тр. ВИЭВ Всесоюзный институт экспериментальной ветеринарии, 1984; Т. 61, - с. 72-76

83. Яковлев Ю.С., Трусова Л.И., Воробьева Ж.И., Павлова А.Ф., Бродецкая С.Е., Гангалюк Е.А. // Получение препарата иммуноглобулина неспецифического с помощью полиэтиленгликоля. // Передов, науч.-произв.опыт в биол.промыш., 1985, 10, 5-6.

84. Adair В.М., // Immuno fluorescence in the serological of parainfluenza type 3 and respiratory synciytial virus in calves. // Res. Vet. Sci. 1986. - V. 41 - P. 414 -416

85. Adeyefa C.A. // Serological evidence of equine herpesvirus type 1 (EHV-1) activity in polo horses in Nigeria. // Zentralbl Veterinarmed B. 1992;39(8):628-30

86. Alkahalaf A.N., Halvorson D.A., Saif Y.M. // Comparison of enzyme-linked immunosorbent assays and virus neutralization test for detection of antibodies to avian pneumovirus. //Avian Dis., 2002; Vol.46,N 3, P. 700-703

87. Allen P.G.'// Respiratory Infections by Equine Herpesvirus Types 1 and 4. //Department of Veterinary Science, University of Kentucky, Lexington, KY, USA 2002. Publisher: International Veterinary Information Service (www.ivis.org), Ithaca, New York, USA

88. Alvarado J.F., Dolz G., Herrero M.V., McCluskey В., Salman M. // Comparison of the serum neutralization test and a competitive enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibodies to vesicular stomatitis virus

89. New Jersey and vesicular stomatitis virus Indiana. // J.veter.diagnostic Investig., 2002; Vol. 14,N 3, P. 240-242

90. Andrews C.H. // Viruses of Vertebrates // London. Bailliere. Tindall and Cox. -1964.-423 p

91. Arnatadt K.L., Berg D. // Sensitive enayme immunoassay for progesterone in human plasma and soliva. // J.Clin.Chem. and Clin.Biochem., 1981, 19.8, 602-603

92. Arsci Z.I, Wisnewski J. // Poziom przeciweial III dla wirusa parainfluenzy-3 w surowicach bydla w woj olsztynskim, gdanskim i bydgoskim. // Med. Wet. 1972. - v 28-n. 8-p. 456-459

93. Audonett J.C., Winslow J., Allen G.P., Paoletti E. // Equine herpesvirus type I unique short fragment encodes glycoproteins with gomology to herpes simplex virus type I gD, gl and gE. // J.Gen. Virol., 1990, v. 71, p.2969-2978

94. Avrameas S. // Enzyme immunoassay and related techniques: development and limitations. // Curr.Top.Microbiol. and Immunol., 1983, 104, 93-99

95. Avrameas S. Ternynck T. // Peroxidase labeled antibody and Fab conjugates with enchanced intracellular penetration. // Immunochemistry. 1971, 8, 1175-1179

96. Banbura M., Chmielewska A., Tucholska A., Malicki K. // Test PCR w diagnostyce wirusowego zakaznego ronienia klaczy. // Med.weter., 1998; R.54,N 11,-S. 772-774

97. Bartha A., Hajdu G., Aldasy P., Paczolay G. // Occurence of encephalitis cauced by infectious bovine rhinotracheitis virus among cawes in Hungary. // Acta Vet. Acad. Set. Hung.- 1969.-19.-2.-145-151;

98. Bartha A., Fener D. // On Equine virus abortion // Acta. Jen. Acod. Sei. Hund., 1955, N. 5, p. 203-214;

99. Beccaria E. // Rapid detection of antibodies to Infectious Bovine Rhinotracheitis by "macro" and "micro" "ELISA". // Rev. Biolog.Stand., 1982, 52. 141-146

100. Bernadac M. // Note sur l'episode de rhinopneumonie de Cagnes-sur-Mer. // Bull. Soc. Veter. Prat. Fr, 1994; T.78,N 5, P. 271-280

101. Bioveta, n.p., Nitra, CSSR. // Immunoprofylaxia, 3/1983. // Bratislava; Priroda., 1983,-99 c.

102. Bitsch V. // Resistance of infection with IBR virus in Danish cattle heard. // Nord.Vet.Med., 1978, 45, 175-185

103. Blue W.T. abd Plummer G. // Antigenic relatioship among four herpesviruses. // Infect. Immun. 1973, 7, h. 1000

104. Bognar Karoly, Wassan Badr, Hassan Ali, Autal Tibor, Kicsera Laszio. // A szarvasmarha fertpzp rhinotracheitise es as Aujeszky-tele betegseg elleni aktiv immunizatolas // Magy. allatorv. Lapja. 1986. T.41, N.l 1, p. 647-657;

105. Bolton D.C., Chu H.J., Ardans A.A., Kelly B., Zee X.C. // Evaluation of the critical parameters of a sensitive ELISA test using purified infections bovine (IBR) virus antigens. // Vet.Microbiol., 1981, 6, 265-279.

106. Bommell W.R., Kihm U., Lazarowicz M., Steck. F. // Rapid detection of antibodies to infectious bovine rhinotracheitis (IBR) virus by microenzyme linked immuno-sorbent assay (microELISA). // Proc.2. Int.Symp. Vet.Lab.Diagnost., 1980.235-239

107. Browning G.F., Studdert M.J. // Physical mapping of a genome of equine herpesvinis 2 (equine cytomegalovirus ). // Arch. Virology, 1989, v. 104, n.l-2, p. 77-86

108. Bryans J.T., Allen G.P. // Equine viral rhinopneumonitis. // Rev. scient. techn. Off. Intern. Epizoot, 1986; T. 5. N 4, p. 837-847;

109. Budulov N.R., Galnbek T.V., Taktashev S.S. // Sensitivity odf diploid cell cultures from porcine thyroid to equine herpesvirus type 1. // Trudy Vsesouuyznogo Instituía Eksperimentalnoi veterinarii.//!987,64, p. 34-35

110. Burki F., Nowotny N., Hinaidy B., Pallan C. // Die Ätiologie der Lipizzanerseuche in Piber 1983: Equines Herpesvirus 1. // Wien, tierarztl. Mschr, 1984; T. 71. N11,- S. 312-320

111. Busbnell S.E., Edwards S. // The development and standartization of an enzyme-linned immunosorbent assay for the detection of antibodies to bovine herpesvirus 2. //J.ofBiol.Standard., 1988, 16, 45-53

112. Carmichael L.E., Barnes F.D. // Serological comparisons between infectious canine hepatitis virus and human adenovirus types. // Proc. Soc. Exp. Biol. N. Y., 1961.- 107.-214-218

113. Chowdhury S.I., Ludwig H., Bunk H.J. // Molecular biological characterization of equine herpes virus type I (EHV-I) isolates from ruminants hosts. // Virus Research, 1988, v.2, n.ll,p. 127-139.

114. Collard A. // Isolation and purification of bovine immunoglobulins: Use of sephacryl S-300 filtration avods protein pricipitation steps. // Ann.Rech.Veter., 1984,15,4,497-501

115. Collins A. // Equine herpesvirus. // Veterinary Record, 1989, v.124, n.18, p.496

116. Corbella E. // Vaccini e vaccinazioni nel cavallo. // ODV Obiettivi Doc. veter, 1985; T. 5, -p. 29-33

117. Coulson B.S., Holmes A.H. // Restriction endonuclease analysis oi herpes simpiex virus from recrydescent lesions, from latent infection and during passage in the skin and nervous system of mice. // J.Virol. Methods, 1984, 8, 165

118. Crabb B.S., MacPherson CM., Studdert M.J., Drummer H.E. // A type-specific serological test to distinquish anthybodies to equine herpesvirus 4 and 1. // Arch. Virology, 1993,140, p.245-258

119. Dannacher G., Perrin V., Perrin B. // Utilisation d'une techniques d'hemagglutination passive pour la detection des antico corps countre le virus de la rhinotracheite bovine infectieuse. // Rec.Med.Vet., 1979. 155, 7-8, 633-637.

120. Dawson L.J. // Equine viral rhinopneumonitis. Equine Pract, 1984; T. 6. N 10, -p. 12-16

121. Doll E.R., Bryans I. T. // Development of complement-fixing and virus neutralizing antibodies in viral rhinopneumonitis of horses // Am. J. Veter. Res. 1962, T. 23, N. 95, p. 843-846

122. Doll E.R., Knoppenbereu R.E., Bryans I.T. // An outbreak of abortion caused by the Equine Arteritis virus. // Cornell Vet., 1957., T. 47, N. 1, p. 69-75

123. Doll E.R. // Infection immunity in equine virus abortion. // Cornell Veter. 1955 T. 45, N. 3, p. 387-410

124. Doll E.R. et. al. // Infection periods for abortion in Equine viral rhinopneumonitis. // Am. J. Veter. Med. Assn., 1962, T. 111, N. 3, p. 351-354

125. Duncan J, MCGeoch,. Dolan A, and Ralph A. // Toward a Comprehensive Phytogeny for Mammalian and Avian // Journal of Virology, Nov. 2000, p. 10401— 10406

126. Durham P.J.K., Sillars H.M. // Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for serodiagnosis of infectious bovine rhinotracheitis infeciton, withHresults of a preliminary survey. // New.Zeland Vet.J., 1986, 34, 3, 27-34

127. Dutta S. K., Alurup A.,'Bumgardner M. K. // Lymphocyte responses to virus and mutogen in ponies during experimental infection with Equine Herpesvirus 1. // Am. J. Vet. Res. 1980, T. 41, N. 12 p. 2066-2068

128. Ebner D., Heider G. // Forischritle in der serodiagnostik von virusinfektionea. // * Mh. Vet.-Med.-1986. -V. 41 -P. 11- 14

129. Edington N. // Latency of equine herpes virus 4. // Vet. Records, 1988 6, v. 123, n. 25, p. 653-654

130. Elbers rnut et.al. // Equine viral rhinopneumonitis // Vet. Med. Gmd H № ^ 00103241:51.2000

131. Engvall E., Perlmann P.// Specificity of cieavage in replicative-form DNA of bovine herpesvirus 1.//Immunochemistry, 1971,8,8,871-874

132. Erol N. // Vergleich verschiedener Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA) zum Nachweis von Antigen des Klassischen Schweinepestvirus. Inaug. // -Diss. Hannover, 2000, VI, 131 c., Ta6ji

133. Fey H., Peister H., Messerly I., Grolimund F. // Methods of Isolation, Purification and Quantitation of Bovine Immunoglobulins. // Zbl.Vet.Med., 1976, 3, 23, 269-300

134. Fields S., Winter G., Brownlee G.G. // European isolates of bovine herpesvirus 1: a comparison of restriction endonuclease sites, polypeptides, and reactivity with monoclonal antibodies. //Nature, 1981, vol. 290, p. 213-217

135. Fitzpatrick D.R., Studdert M.J. // Immunologic relationships between equine rhinopneumonitis virus. // Am. J. veter. Res, 1984; T. 45. N 10, p. 1947-1952

136. Florent G., De Marnette. // Enzyme linned immunosorbent assay used to monitor serum antibodies to bovine respiratory disease viruses. // Vet.Microbiol., 1986,11,4,309-317

137. Forletta R. // Le piu importanti virosi respiratore del cavallo. // Ann. Fac. Med. Veter. Pisa, 1988; T. 40:1987, p. 143-149

138. Frank C. // Equine herpesvirus outbreaks. // Veterinary Record, 1989, v. 124, n.17, p.471

139. Frilsen A.D. // Process for preparing purified immune globulin (IgG). // Path. 1201063, Canada, MKI A61 K/39/395.^Gobbagy A. // Fluoresczeinsotiocian attat jelzett IgG, tilzett IgG tisztitasa gelfiltratassal. // Kiserl. Orvostub., 1976, 28, 1, 79* 86

140. Ghram A., Chabchoub A., Boussetta M., Baazaoui S., Ibn Amor H., Landolsi F. // Enquete seroepidemiologique de la rhinopneumonie des equides en Tunisie. // Rev. Elevage Med. veter. Pays trap., 1997; An.50, N 4. P. 273-276

141. Gilkerson J., Jorm-L.R., Love-D.N., Lawrence-G.L., Whalley-J.M. // Epidemiologic Investigation of Equid Herpesvirus-4 (EHV-4) Excretion Assessed by Nasal Swabs Taken from Thoroughbred Foals. // Veterinary Microbiology, 1994, V. 39, n. 3-4, p. 275-283.

142. Glavits R., Molnar T., Palfi V. // A lovak rhinopneumonitis-virus okazta vetelesevel kapcsolatos megfigyelesek. // Magyar allatorv. Lapja, 1984; T. 39. N 6, -p. 361-365

143. Griffiss J.M., Bertrem M.A., Broud D.D. // separation and purification of immunoglobulins M, A and Q from small volumes of human sera by a continuous, inline chromatographic process.//J.Chromatogr., 1978, 156, 1, 121-130.

144. Heider O., Hlinan A., Prusas Christine, Brichel Annelle. // Entwicklung eines Zweiseitenbindungs ELISA zum Nachweis von Antikörpern gegen das virus der Aviaren Encephalomyelitis. // Monatsh.Veter., 1988, 43, 13, 475-477

145. Herring A.I., Nettieton P.F., Burrells C. // A microenzymelinked immunosorbent assay for the detection of antibodies to infectious bovine rhinotracheitis virus. // Veterinary Ree., 1980, 107, 7, 155-156.,

146. Herrmann R., Wiedemann C. // Ein neuer Kombinationsimpfstoff gegen equine Influenza und Rhinopneumonitis Cavallon IR Prakt. // Tierarzt, 1995; Jg.76,N 1, -S. 18-26

147. Higgins W.P., Gillespie J.H., Robson D.S. I I Studies of maternally-acquired antibodies in the foal to equine influenza A1 and A2, and equine rhinopneumonitis. // Equine veter. Sc, 1987; T. 7. N 4, p. 207-210

148. Hmidouch A., Harrak M., Chakri A., Ouragh L., Lotfi C., Bakkali-Kassimi L. // Etude epidemiologique de la rhinopneumonie chez les equides au Maroc. //. Rev.Elevage Med.veter.Pays trop., 1997; T.50, N 3, P. 191-196

149. Holloway S.A. et al., // Equine herpesvirus. // Arch. Virol. 1999 v. 144 №2 p 287-307

150. Ishirava R. // Enzyme immunoassay of insulin by fluometry of insulin-glikoemylase complex. // J.Biochem., 1973, 75, 1319-1321

151. Jana A.M., Pandya G., Rao K.M. // Evidence of complement fixing anthybodies against equine rhynopneumonitis virus in army horses and mules. // Current Sciences, Banglacore, India, 1980, v.49, n.17, p.675-677

152. Johnson M.A., Tyack S.G. // Molecular Evolution of Infectious Laryngotracheals Virus (Iltv, Gallid-Herpesviras-1) Ancient Example of the Alphaherpesviridae .// Vet.Microbiology, 1995, V.46, N. 1 -3, p. 221 -231.

153. Jolken R.H., Leister F.I. // Staphylococcal protein A-enzyme immunoglobulin conjugates: verstile tools for ensyme immunoassaya. // J.Immunol.Health, 1981, 33,2,209-218

154. Karbe A. // Vergleichende Untersuchungen zur Diagnose der Paratuberkulose des Rindes mittels KBR, ELISA und AGIDT. // Giessen, 1988, 4, 191 c., hji -133

155. Karlin S., Mocarski E.S., Schachtel G. // A Molecular Evolution of Herpesviruses -Genomic and Protein-Sequence Comparisons. // J. Virology, 1994, V.68,N.3, p. 1886-1902

156. Kemeny D.M. // ELISA and other solid phase immunoassays: theoretical and practical aspects. // Chichester etc; Wiley., 1988, 8, 367 c.

157. Kirisawa R., Ui S., Takahashi A., Kawakami Y., Iwai H. // Comparison of the Genomes of Attenuated Equine Herpesvirus-1. Strains with Their Parent Virulent-Strain. // Z. Virology, 1994, V. 200, N.2, p. 651-660

158. Kotiw M., Wilks C.R., May J.T. // The Effect of Serial in-Vivo Passage on the Expression of Virulence and DN A Stability of an Infectious Laryngotracheitis Virus-Strain of Low Virulence. // Vet. Microbiology, 1995, V.45, N.I, p. 71-80

159. Kukreja A., Walker C., Fitzmaurice T., Awan A., Love D.N., Whalley J.M., Field H.J. // Protective effects of equine herpesvirus-1 (EHV-1) glycoprotein B in a murine model of EHV-1-induced abortion. // Veter.Microbiol., 1998; Vol.62,N 4, -P. 303-311

160. Kumekbaeva Zn.Zn., Budulov N.R. // Sensitivity of various cell culture to equine rhinopneumonitis herpesvirus. // Bulleten Vsesouyznogo Instituta Eksperimentalnoi Veterinarii. 1987,61, p. 54-56

161. Kundsen K.A. // Host defense mechanisms against infectious bovine rhinotracheitis virus. II. Inhibition of plaque formation by immune peripheral blood lymphocytes. //Proc Natl.Acad.Sci., USA, 1981, 78, 6071

162. Kurstak E. // Application of the immunoperoxidase technique in virology and cancer virology light and electron microscopy. // Virol.immunol., N.J., Acad.Press, 1974,3-30

163. Livingstone D.M. // Defense mechanisms against bovine herpesvirus: Relationship of virus-host cell events to susceptibility to antibody-complement lysis. // Methods enzymol., 1974, 34, 723

164. Matsumura T., Smith R.H., Callaghan DJ. // DNA sequence and transcriptional analysis of the region of the equine herpesvirus type I Kentucky A strain genome encoding glycoprotein Q. // J. Virology, 1993, v. 193, p. 910-923

165. MakKowiak M.et.al. // Bull. Soc. // Veter. Prakt. Fr. 1990, 74 :4

166. Mayr A.//Schutzimpfung der Pfirde gegen virus abortierarztl // Umsch. 1970, T. 25 N. 3

167. Mayr A. // Vaccination of horses against equine herpes virus. // Int. Conf. Equine Inf. Diseases. Paris, 1969, p 41-45

168. Mayr A., Thein P. // Aktuelle Viruskrankheiten des Pferdes. // Tierarztl. Praxis, 1984; T. 12. N4,- S. 481-488

169. McCollum W. H., Doll E. R., Ruans I. T. // Agglutination of horse erythrocytes by tissue extracts from hamstersinfected with equine abortion virus. // Am. J. Veter. Res. 1956. N. 17, p. 267-270

170. Messerschmid S. // Untersuchungen zur Eignung verschiedener ELISA-Systeme fur die Diagnose einiger phytopathogener Viren. // Hohenheim 1995, -VI, 157 c.

171. Mihajlovic B., Rogan D., Krstic L. // Vrusni pobacaj kobila. 1. Izolovanje i identifikacija virusa. // Veter. Glasnik, 1987; T. 41. N 10, s. 741-744

172. Miranda Q.R., Bailey G.D., Fräser A.S., Tenoso H.J. // Solid phase ensyme immunoassay for herpes simplex virus. // J.Infect.Diseases, 1977, 36, 3, 304-310.

173. Moraillon A., Moraillon R. // Results of an epidemiological investigation on viral arteritis in France and some other European and African countries. // Ann Rech Vet. 1978;9(l):43-54

174. Moraillon A., Pastoret P.P. // A propos de la maladie des lipizzans: actualite de , la rhinopneumonie equine. // Ann. Med. veter, 1984; T. 128. N 8, p. 625-639

175. Morris C.M., Field H.J. // Application of cloned fragments of equine herpesvirus type-I for detection of virus-specific DNA in equine tissue. // Equine Vetetrinary J. 1988. v. 20, n.5, p. 341-346

176. Nagesha H.S., Crabb B.S., Studdert M.J. // Analysis nucleotide sequence of five genes at the left end of the unique short region of the equine herpesvirus 4 genome. //Virology, 1993,191, p. 143-154

177. Nakane PK, Pierce G.B. // Enzyme-labeled antibodies; preparation and localization of antigens. // J Histochem Cytochem 1966; 14; 929 -931

178. Nakane P.K., Kawaoi A. // Peroxidase-labelled antibody a new method of conjugation.//J.Histochem,Cytochem., 1974, 22, 12, 1084-1091

179. Nosetto E.O., Galosi C.M., Oliva G.A. // Obtención de antigeno para el diagnostico de rinoneumonitis equina (HVE-1) por la prueba de doble inmunodifiision en agar (DIDA). // Rev. Med. Veter, 1985; T. 66. N 5, p. 298301

180. Paweska J.T., Gerdes T., Van Heerden J. // Serological relationship between a donkey alphaherpesvirus (isolate M7/91) and equid herpesvirus type 1 and 4. // J S Afr Vet Assoc. 1994;65(2):64-6.

181. Payment P., Assat R., Trudel N., Marois P., // Enzyme-linked immunosorbent assay for serology of infectious bovine rhinotracheitis virus infectious. // J.Clin.Microbiol., 1979, 10, 5, 633-636.

182. Pertoft H., Johnsson A., Warmegard B., Seljelid R. // Separation of human monocytes on density gradients of Percoll. // J Immunol Methods. 1980;33(3):221-229

183. Pierson R.E., Vair C.A. // The economic loss associated with infectious bovine rhinotracheitis in dairy heard. // J. Amer. Vet. Med. Assoc. 1965 t. 147, p 350-352

184. Pitre J. 11 Contribution du laboratoire a la connaissance de T'etiologie des avortements et de la mortinatalite chez les juments. // Prat, veter. equine, 1984; T. 16. N4,-p. 163-182

185. Purchio A.F., Larson R., Collett M.S. // Characterization of bovine viral diarrhea virus proteins. // J Virol. 1984;50(2):666-669

186. Purdy C.W., Ford S.J., Porter R.C. // Equine rhinopneumonitis vaccine: Immunogenicity and safety in adult horses, including pregnant mares. // Am J Vet Resl978;39:377-383.

187. Purdy C.W., Porter R.C., Ford S.J. // Equine rhinopneumonitis vaccine: Immunogenicity and safety in foals. // Am J Vet Res 1978;39:745-752

188. Rosenberg G.L., Farber G.L., Notkins A.L. // In vitro stimulation of sensitized lymphocytes by Herpes simplex virus and vaccine virus. // Proc. Nat. Acad. Sei. 1972. N. 69, p 756

189. Rosenberg G.L., Notkins A.L. // Induction of cellular immunity to Herpes simplex virus: Relationship to the humoral immune response. // J. Immunol. 1974, n. 112, p. 1019

190. Rosenberg G.L., Wohlenberg C., Nahmias A.I., Notkins A.L. // Differentiation of type 1 and type 2. Herpes simplex virus by in vitro stimulation of immune lymphocytes. // J. Immunol. 1972. N. 109, p. 413

191. Rydbeek R., Orvell C., Love A., Norrby. // Characterization of four parainflluenza virus type 3 proteins by use of monoclonal antibodies. // J. Gen. Virol. 1986. - V. 76 - P. 1531 - 1542

192. Sabine M., Robertson G.R., Whaley J.M. // Differentiation of subtypes of Equine Herpesvirus type 1 by restriction endonuclease analysis. // Aust. Vet. J., 1981, V.57,p. 148-152.

193. Schwarts Warren E. // Process-scale isolation and purification of immunoglobulin. // LC and GC, 1986, 4, 5, 442-444, 446, 448.

194. Sharma A. et al. // VII Inter. Cjnf, on Defin. Immunobiol. Immunoenz. Studies and Rel. Techn., Niagara Falls N. Y., 1982, 12. 27

195. Shimizu M., Saton K., Nisliioka N. // Monoclonal antliibodies with neutralizing activity to equine herpesvirus I. // Arch. Virology, 1989, v. 104, n. 1-2, p. 169-174

196. Shimizi T. et. al. // Experimental infection of colts with Equine Rhinopneumonitis. //Nat. Inst. Anim. Heth. Quart. 1961. N. 1, h 119-125

197. Sinclair R., Cook R.F., Mumford J.A. // The characterization of neutralizing and non-neutralizing monoclonal anthibodies against equid herpesvirus type I. // J.Gen. Virology, 1989, v.70, n.2, p. 455-459

198. Solsona M., Porrin B., Porrin M., Noussa A. // Recherche des anticorps Contre le virus de la rhinotracheite bovine infectieuse par la methode ELISA. // Bui.Acad.Ve.France, 1980, 53, 215-255.

199. Soula A., Laurent N., Tixier G.et Moreen Y. // ELISA IBR expression d'un titre ELISA 50%. //Develop.Biol.Stand., 1982, 52, 147-157.

200. Spieck M. // Immunodiffusions test zum Nachweis von Antikörpern der infektiösen bovine Rhinotracheitis in Vergleich mit Neutralisations und Ensum test. // Tierarstl, Umschan, 1986, 41, 958-961

201. Spear P. A., Roizman B. // Proteus specified by herpes simplex virus. V. Purification and strucnural proteus of the herpesvirion. // J. Vir. 1972. N. 9, p. 143-159

202. Stokes A., Allen G.P., Pullen L. A, Murrey P.K. // A hamster model of equine herpesviras type I infection: passsive protection by monoclonal anthibodies totheEHV-I glycoproteinsB, 14 and 17/18. // J.Gen. Virology, 1989, v.70, n.5, p. 1173-1183

203. Studdert M.J., Simpson T., Roizman B. // Differentiation of Respiratory and Abortigenic isolates of Equine Herpes 1 by restriction endonuclease analysis. //Science, 1981,V.214, p. 562

204. Studdert M.J., Fitzpatrick D.R., Horner G.W. // Molecular epidemiology and pathogenesis of some equine herpesvirus type 1 (equine abortion virus) and type 4 (equine rhinopneumonitis virus) isolates. // Austral, veter. J, 1984; T. 61. N 11, p. 345-348

205. Telford E.A.R., Watson M.S., Perry J., Cullinane A.A., Davison A.J. // The DNA sequence of equine herpesviras-4. // J.Gen. Virology, 1998, v.79, p. 11971203

206. Telford E.A.R., Watson M.S., McBride K., Davison A.J. // The DNA sequence of Equine Herpesvirus I. // Virology, 1992, 189, p. 304-316

207. Towbin H., Staehelin T., Gordon Y. // Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1979, 76, 4350-4354

208. Thein P., Ludwig H., Meyer H. // Beitrag zur molekularen Epizootologie equiner Herpesviren. // Tierarztl. Umsch, 1987; T. 42. N 1, S. 23-27

209. Turtinen L.W., Allen G.P. // Identification of envelope surfase glicoproteins of Equine Herpesvirus type 1. // J. of Gener. Virol. 1982 T. 63, N. 2, p. 481-486

210. Urov K.P., Zabegina E.K. // Restriction analysis for studies of the molecular epizootology of equine herpes virus I. // XXIV World Vet. Congr. Rio de Janeiro, Brazil, 1991,abstr. 21.1.7. p. 182

211. Voller A. // In: A revien of recent developments with abstracts microplate applications.//London, 1980, 2, 126

212. Wilson M.B., Nakome P.K., Knapp W.P. // Immunofluorescence and related staining techniques. // Amsterdam, Elsevier/North Holland, 1978, 215-224

213. Wilks C.R. and Coggins L. // Immunity to equine herpesvirus type 1 ( rhinopneumonitis): in vitro lymphocyte response. // Amer. J. Vet. Res. 1976, T. 37, N. 5, p 487-492

214. Yanai T., Sakai,T., Fukushi H., Hirai K., Narita M., Sakai H. and Masegi T. // Neuro-pathological study of Gazelle Herpesvirus 1 (Equine Herpesvirus 9) infection in Thomson Gazelles (Gazella thomsoni). // J. Comp. Pathol. 119: 158168, 1998

215. Yesildere T., Gurel A., Arun S.S. // Turkiye'de Izmit yoresinde ozel haralardaki kisraklarda rhinopneumonitis equi'nin patolojisi uzerine calismalar. // Istanbul Univ.Veter.Fak.Derg., 1994; Cilt20,sayi 1,- S. 151-160

216. Zaghawa A.A. // Direkte und indirekte Immunperoxidase-Techniken zum Nachweis von Antikörpern gegen Hundestaupe-, Rinderpest- und Seehundstaupevirus. // Hannover, 1989, 111 c

217. Zemp K., Steck F. // Comparison of serum neutralization and the ELISA-technique in the detection of antibodies to IBRIMP-virus in cattle. // Experientia, 1981, 37, 1229

Информация о работе

Коржов, Василий Васильевич
кандидата биологических наук
Шелково, 2006
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка компонентов набора для определения уровня антител к вирусу ринопневмонии лошадей методом иммуноферментного анализа - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Разработка компонентов набора для определения уровня антител к вирусу ринопневмонии лошадей методом иммуноферментного анализа - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы