Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Типирование герпесвирусов лошадей методом рестрикционного анализа ДНК и изыскание вакционного штамма

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Типирование герпесвирусов лошадей методом рестрикционного анализа ДНК и изыскание вакционного штамма"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я.Р.КОВАЛЕНКО

; 2 ' ' 10ПЗ УДК 619:616.98.578.083.2/825.1:636.1.

ЗАБЕГИ НА ЕКАТЕРИНА ФЕДОРОВНА

ТИПИРОВАНИЕ ГЕРПЕСВИРУСОВ ЛОШАДЕЙ МЕТОДОМ РЕСТРИКЦИОННОГО АНАЛИЗА ДНК И ИЗЫСКАНИЕ ВАКЦИННОГО ШТАММА

ОД

на правах рукописи

03.00.06. - вирусология

^ Автореферат па соискание учепой степени кандидата биологических паук

Москва - 1998

Работа выполнена в лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота и лошадей Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко.

Научный руководитель - Константин Павлович Юров, доктор ветеринарных наук, профессор.

Оффициальные оппоненты:

- Борис Григорьевич Орлянкин, доктор ветеринарных наук, профессор (Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко),

- Закир Фасахутдинович Богаутдинов, кандидат биологических наук (Всероссийский Государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации « сертификации ветеринарных препаратов).

Ведущеее учреждение - Московская Государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина.

Зашита диссертации состоится < яе ► ЛЛСиЯ 1998 года в

оо

"часов на заседании диссертационного совета Д 020.28.01. при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринар™ им. Я.Р.Коваленко по адресу: 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан < 2. ОИ^СЛ?) 1998 года.

Ученый секретарь диссертационного совета - кандидат ветеринарных наук Федор Григорьевич Терешков.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Коневодство в России и странах СНГ имеет важное значение как одна из отраслей сельскохозяйственного производства. При современном ведении коневодства, когда основное внимание уделяется разведению особо ценных пород лошадей, первейшей задачей является предохранение их от инфекционных заболеваний, которые наносят значительный экономический ущерб и существенно влияют на селекционную работу.

К числу наиболее распространенных и опасных вирусных болезней лошадей относятся герпесвирусные инфекции, в том числе ринопневмония (вирусный аборт). Заболевание характеризуется множественностью форм клинического проявлещш . (аборты у кобыл, массовое респираторное заболевание жеребят, а также нервная и генитальная формы), сложным патогенезом и достаточно универсальным механизмом передачи возбудителя (контактно, аэрогенно, трансплацентарно).

Возбудителем ринопневмонии является герпесвирус лошадей тип 1 (ВГЛ1), принадлежащий . к роду УапсеНоу^иэ подсемейства А^ЬаЬегреэуШпае семейства НегрезуШсЬе (Ргапск1 с соавт.,1991). В отличие от ряда других герпетических вирусов, поражающих животных и человека, ВГЛ1 характеризуется значительной гетерогенностью по ряду свойств.

Впервые о неоднородности популяций возбудителя сообщили БЫпиги с соавт. в 1959 году, отметив, что существует 2 подтипа вируса -респираторный и фетальиьш - в соответствии с их тропизмом к респираторным и гешпальным органам. Практически с этого времени ведется работа по изысканию маркеров для дифференциации респираторных и фетальных штаммов вируса. В последние годы для изучения вируса

ринопневмонии лошадей используют методы молекулярной биологии и биохимии, основанные на анализе состава генома вируса, и в частности, рестрикционный анализ вирусной ДНК.

Явные различия между этими двумя вирусами позволили сделать вывод о том, что фетальные и респираторные штаммы являются самостоятельными типами (5Ьис1(1е11: с соавт.,1981), и с 1991 года подтипы 1 (фетальньш) и 2 (респираторный) ВГЛ1 были официально переименованы в ВГЛ1 (вирус аборта лошадей) и ВГЛ4 {вирус ринопневмонии лошадей) соответственно (Ргалс1а с соавт., 1991). Оба вируса иммунологически и антигенно весьма близки, однако, заболевания, вызываемые ими, различаются по эпизоотологическим данным.

В связи с этим, изучение генома эпизоотических штаммов вируса ринопневмонии лошадей, находящихся в активной циркуляции в последнее время на территории страны, является весьма актуальной задачей с разных точек зрения: выяснения некоторых вопросов патогенеза и иммуногенеза инфекции, идентификации штаммов, отбора наиболее перспективных штаммов для их использования в качестве производственных при разработке длагностикумов и вакцин нового поколения.

Цель и задачи исследования

Целью исследований являлось: сравнительное изучение структуры генома эпизоотических штаммов ВГЛ1, выделенных в последнее время в ряде регионов страны, выяснение возможной изменчивости популяции этогс возбудителя, отбор наиболее перспективных вирусов для разработки инактивированной вакцины.

Исходя из поставленной цели, необходимо было решить следующие задачи.

1. Изучить основные биологические свойства (инфекционность, способность размножаться в различных культурах клеток, антигенные свойства) эпизоотических штаммов герпесвирусов лошадей, выделенных из абортированных плодов и органов дыхания жеребят.

2. Изучить структуру генома эпизоотических штаммов герпесвируса лошадей методом рестрикционного анализа ДНК и провести их идентификацию.

3. Основываясь на данных рестрикционного анализа, отобрать наиболее типичный штамм для конструирования инактивированной вакцины.

4. Изготовить лабораторные серии вакцины и испытать ее в коневодческом хозяйстве.

Научная новизна исследования

Изучена структура генома эпизоотических штаммов герпесвирусов лошадей, выделенных в различные годы в России и бывшем СССР. На основе полученных методом рестрикционного анализа ДНК данных проведена идентификация вирусов. Установлено, что в популяции лошадей на территории страны циркулируют вирусы герпеса лошадей 1-го и 4-го типов. Причем, доминирующее положение занимает вирус 1-го типа -возбудитель массовых абортов у кобыл и респираторной инфекции у жеребят.

Выявлены особенности изменения популяции ВГЛ1 на основе изучения его генома.

Впервые в России выделен и идентифицирован аденовирус лошадей.

Практическая значимость исследований

Основываясь на данных рестрикционного анализа вирусной ДНК, идентифицированы эпизоотические штаммы герпесвирусов лошадей 1-го и 4-го типов, аденовирус лошадей, что имеет практическое значение при планировании противоэпизоотических мероприятий.

Из числа штаммов ВГЛ1 отобран наиболее перспективный штамм (учитывая направленность изменений популяции этого вируса). Отобранный штамм использован для разработки двухвалентной вакцины против ринопневмошш и гриппа лошадей.

Разработана и испытана в коневодческом хозяйстве инактивированная вакцина против ринопневмошш и гриппа лошадей.

Показано, что при штраназальной апшшкащш инактивпрованного вируса достигается выработка секреторного иммунного ответа на ВГЛ1 и сенсибилизация клеток иммунной системы, ответственных за гуморальный ответ, что способствует получению более выраженной реакции сывороточных антител при парентеральном введении вакцины. На основании этого предложена схема иммунизации новорожденных жеребят против ринопневмошш.

Материалы диссертации использованы при составлении научно-технической документации (НТД) на опытно-промышленное производство вакцины.

Публикация научных исследований

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, 1 находится в печати, получено 1 авторское свидетельство.

s

Апробация работы

Материалы, вошедшие в диссертацию, доложены на Всесоюзном :импозиуме •«Биохимия сельскохозяйственных животных и 1родовольственная программа» в Киеве в 1989 г., на заседании Московского »тделения Всесоюзного биохимического общества на кафедре биохимии МВА 1М.К.И.Скрябина в 1990 г., на XXIV-м Всемирном ветеринарном конгрессе в Зразилии (Рио де Жанейро) в 1991 г., на 7-ой Международной конференции го инфекционным болезням лошадей в Японии (Токио) в 1994 г., на XXV-m Всемирном ветеринарном конгрессе в Японии (Йокогама) в 1995 г., на 2-м Международном Дубайском симпозиуме по изучению лошади в О.А.Э. Дубай) в 1997 г., на 5-м Конгрессе всемирной ветеринарной ассоциации по [зучению лошади (WEVA) в Италии (Падуя) в 1997 г. и на 8-ой Международной конференции по инфекционным болезням лошадей в О.А.Э. Дубай) в 1998 г.

Структура и объем работы

Материалы диссертации изложены на 143 страницах машинописного екста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, гатериалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение 1езультатов, выводы, практические предложения, список литературы и риложение. Список литературы содержит 205 отечественных и иностранных аучных источников. Диссертация иллюстрирована 4 таблицами, 10 ютографиями и 21 рисунком.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы

В работе использовали 1 штамм аденовируса лошадей и 13 штаммов герпесвирусов лошадей (включая один референтный и один вакцинный штамм ВГЛ1), выделенных из абортированных плодов и респираторных органов больных жеребят в период с 1954 по 1993 гг. и хранящихся в музее вирусных штаммов лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота и лошадей ВИЭВ.

Культуры клеток

Использовали первично-трипсинизированные и субкультуры клеток почки эмбриона лошади и почки эмбриона свиньи, перевиваемые линии фибробластов кожи эмбриона лошади, клеток почки поросенка, печени крольчонка, почки эмбриона собаки. Были отобраны наиболее чувствительные культуры клеток.

Накопление вируса

Накопление вируса проводили в культурах клеток почки эмбриона свиньи и почки поросенка по общепринятой методике. Для получения вирусной ДНК использовали штаммы, накопленные преимущественно в первичных и субкультурах клеток эмбриона лошади.

Очистка и концентрирование вируса

Очистку вируса проводили центрифугированием при 8 тыс. об. в течение 30 мин. с последующей обработкой ультразвуком при 20 кгц в течение 60 сек.

Концентрирование вируса проводили двумя методами: ультрацентрифугированием при 28 тыс. об. в течение 2 час. или высаливанием с помощью полиэтиленгликоля-6000 с последующим центрифугированием при 8 тыс. об. в течение 30 мин.

Выделение вирусной ДНК

Для выделения вирусной. ДНК использовали суспензию с содержанием вируса примерно 8-9 lg ТЦД 50/мл. Выделение вирусной ДНК проводили по общепринятой методике (Маниатис с соавт., 1984).

Рестрикционный анализ вирусной ДНК

Рестрикцию вирусной ДНК проводили с помощью эндонуклеаз BamHI, EcoRI, HindHI и Sali, полученных из НПО «Фермент» (г.Вильнюс), с последующим проведением электрофореза в 0,7% агарозных гелях, окрашиванием гелей и фотографированием результатов электрофоретического разделения ДНК.

Изготовление лабораторных серий инактивированноь вакцины против ринопневмонии лошадей

Для изготовления вакцины использовали вирус (штамм КБ-1) с инфекционным тиром не менее 7 ТЦД 50/мл. Инактивацию вирусг проводили с помощью мертиолята натрия (1:10000), этония (1:20000) с добавлением 6%-ной гидроокиси алюминия в качестве адьюванта ил! экспериментального адьюванта ЭМ.

Препарат проверяли на полноту инактивации, стерильность, безвредносп и иммуногенность.

Серологические исследования

В работе использовали следующие серологические тесты: реакцию торможения гемагглютинации (для определения антигемагглютининов к ВГЛ1 в сыворотке крови и носовых секретах жеребят), реакцию нейтрализации со специфической к ВГЛ1 сывороткой (для идентификации вирусных штаммов и оценки иммунного ответа у вакцинированных жеребят), а также реакцию гемагглютинации (для идентификации аденовируса лошадей).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выделение и рестрикционный анализ вирусной ДНК

В работе по рестрикционному анализу вирусной ДНК использовали только те штаммы вируса, которые накапливали в культуре клеток эмбриона лошади, т.к. при пассировании вируса ринопневмонии лошадей в

гетерологичных культурах клеток возможны частичные изменения вирусной ДНК.

Характеристика исследованных нами штаммов по их происхождению приводится в таблице.

Как видно из таблицы, рестрикционный анализ вирусной ДНК проводили со штаммами, выделенными как при массовых абортах, так и при респираторном заболевании жеребят. Штаммы были выделены в различных регионах России и бывшего СССР в течение 20 лет и поддерживались в отделе вирусологии ВИЭВ. Один из штаммов, Кентуки-Долл (Ку-Д), является референтным, полученным из США.'

Учитывая литературные данные и собственные результаты, мы пришли к выводу, что наиболее показательные результаты можно получить с ферментом BamHI. Эта рестриктаза расщепляет ДНК ВГЛ1 на 15-16 фрагментов, а ДНК ВГЛ4 на 6-11 фрагментов, характеризующихся большей по сравнению с ДНК ВГЛ1 электрофоретической подвижностью. Для дополнительных исследований применяли ферменты EcoRI, Sali и HindHI. Так, штаммы СВ-69 и КБ-1 были исследованы с помощью трех ферментов: BamHI, EcoRI и Sali. ДНК обоих штаммов при этом разделилась на 15, 11 и 8 фрагментов соответственно, что подтверждает принадлежность этих штаммов к ВГЛ1.

Штамм Пан был также изучен с помощью трех рестриктаз: BamHI, EcoRI и HindHI, с которыми было получено 16, 11 и 14 фрагментов соответственно. Такие же результаты были получены с ДНК штамма Каж-2.*

Результаты наших исследований совпали с данными, ранее опубликованными рядом исследователей (Allen с соавт., 1982, 1986; Studdert с соавт., 1984, 1995 и др.).

Таблица. Характеристика штаммов, использованных в исследованиях, п< их происхождению.

№ Название штамма Характер заболевания Место выделения Год выделения

1 Зара массовые аборты Рязанская обл. 1972

2 Пан массовые аборты Рязанская обл. 1972

3 Восход-Ж респираторная инфекция жеребят Краснодарский край 1985

4 Hyp массовые аборты Казахстан 1988

5 Кар-Л массовые аборты Архангельская обл. 1993

6 Каж-2 респираторная инфекция жеребят Ростовская обл. 1977

7 Ст-75 массовые аборты Ставропольский край 1975

8 Кентуки-Долл массовые аборты США,штат Кентуки 1954

9 Марс массовые аборты Ставропольский край 1977

10 СВ-69 массовые аборты Саратовская обл. 1969

11 КБ-1 массовые аборты Кабардинобалкария 1980

12 Дуб-3 респираторная инфекция жеребят Украина 1987

13 МКЗ-1С респираторная инфекция жеребят Московская обл. 1987

14 Эргоне респираторная инфекция жеребят Краснодарский край 1988

По характеру рестрикции ДНК ( по BamHI) штаммы разделили на 3 руппы: в первую вошли штаммы Зара, Пан, Восход-Ж, Нур, Кар-Л, Марс, Саж-2, Ст-75, СВ-69, КБ-1 и Ку-Д (фетальные, или штаммы ВГЛ1); во торую группу вошли штаммы Дуб-3 и МКЗ-1С (респираторные, или атаммы ВГЛ4); к третьей группе отнесли один штамм - Эргоне, картина 1естрикции ДНК которого была нетипична для герпесвирусов (после »следующей дополнительной идентификации этот штамм определили как деновирус лошадей).

Все исследованные штаммы ВГЛ1 имеют сходную структуру генома, ;оличество фрагментов их ДНК варьирует от 15 до 16. По числу фрагментов IHK мы разделили штаммы этой группы на 2 подгруппы.

К первой подгруппе отнесли штаммы Восход-Ж, Марс, Кар-Л, СВ-69, iyp, Каж-2 и КБ-1, ДНК которых при рестрикции BamHI давала •асщепление на 15 фрагментов, т.е. можно говорить о потери одной из точек (асщепления ДНК эндонуклеазой и, вследствие этого, о потери одного из фрагментов.

ДНК референтного американского штамма Ку-Д при проведенной нами юстрикции ферментом BamHI так же разделялась на 15 фрагментов.

Ко второй подгруппе мы отнесли штаммы Пан, Зара и Ст-75, ДНК :оторых при рестрикции BamHI имела на одну точку рестрикции больше, .е. 16 фрагментов.

При этом интересно отметить, что превалирующие штаммы первой юдгруппы выделены в различные годы (после 1975 г.) и в различных ierионах. В числе этих штаммов оказались два, выделенных из легких ■серебят, павших от бронхопневмонии (Каж-2 и Восход-Ж), что

подтверждает известное мнение о высокой вирулентности ВГЛ1 не только для плодов, но и для новорожденных жеребят.

Штаммы второй подгруппы были выделены только из абортированных плодов. Следует отметить, что во время заболевания, вызванного ВГЛ1 в период до 1975 г. включительно, в популяции лошадей ( на территории СССР), по-видимому, превалировали штаммы, аналогичные штаммам Зара и Пан (их можно считать прототипными), и только позже появились вирусы с частично измененной структурой ДНК. Возможно, эти штаммы представляют собой эпизоотически актуальные варианты возбудителя, вызвавшие эпизоотию, затухание которой пришлось на начало-середину 70-х годов. Зарегистрированные в последующие годы некоторые изменения в структуре генома вируса могли найти отражение в формах проявления инфекции.

Сравнивая результаты, полученные нами, с данными американских исследователей (Allen, Bryans, 1983), можно отметить, что штаммы, вошедшие во вторую подгруппу, близки по характеру рестрикции ДНК штаммам, циркулировавшим в поголовье лошадей США в течение 20 лет, обозначенным как прототипные (prototype) и являвшимся причиной 66% абортов от общего числа исследованных случаев. Первая же подгруппа штаммов соответствует штаммам, которые по данным тех же авторов обозначены как вариантные (variant) штаммы.

В связи с этим, мы сочли необходимым провести параллельную оценку данных, полученных при рестрикционном анализе генома различных штаммов вируса герпеса лошадей, с их характеристиками по клинико-эпизоотологическим показателям.

Сравнительная характеристика исследованных штаммов герпесвирусов лошадей по клинико-эпизоотологическим показателям

К числу штаммов ВГЛ1, одними из первых выделенных на территории бывшего СССР, относятся штаммы, выделенные К.П.Юровым в 1972 г. в Рязанской обл. В период этой вспышки в хозяйстве абортировали 42% кобыл, отход жеребят, инфицированных внутриутробно, составил 28%. Продолжительность болезни жеребят составляла 1-10 дней с симптомами повышения температуры тела, вялости, гиперемии видимых слизистых оболочек, бронхопневмонии. Через 4 недели после начала вспышки заболевание проявлялось преимущественно абортами на 8-10 месяцах жеребости.

В течение указанной вспышки получены 5 изолятов вируса, которые в РН со специфическими сыворотками были идентифицированы как вирус герпеса лошадей 1. В нашей работе мы использовали 2 штамма вируса, полученные в период нарастания и спада эпизоотии в хозяйстве: Зара и Пан, выделенные из паренхиматозных органов павшего жеребенка и абортированного плода соответственно. Проведенный рестрикционный анализ ДНК указанных штаммов определил их идентичность и принадлежность к ВГЛ1.

При анализе документации 1972-75 гг. мы установили, что две вспышки инфекции ВГЛ1, наблюдавшиеся в одном и том же поголовье в 1972 и 1975 гг. (опытный конньш завод) существенно' различались по клинико-эпизоотологическим показателям. Первая вспышка характеризовалась преимущественно абортами во второй стадзш жеребости (7-10 месяцев), рождением нежизнеспособных жеребят. Повторная эпизоотия в 1975 г. отличалась преобладанием респираторной формы инфекции (лихорадка, ринит, бронхит, катаральная бронхопневмония), аборты у кобыл

регистрировали в единичных случаях. При этом, несмотря на существенные изменения в течении эпизоотии, во время обеих вспышек были получены изоляты вируса, характер рестрикции ДНК которых оказался аналогичным, и только в 1977 г. зарегистрированы штаммы, у которых отмечено изменение структуры генома (штаммы первой подгруппы: Восход-Ж, Кар-Л, Каж-2, Марс и КБ-1, выделенные в 1977-1993 гг. в различных регионах).

В хозяйствах, где циркулировали указанные штаммы, преимущественно наблюдалась респираторная форма ВГЛ1. Заболевали новорожденные и 3-6-месячные жеребята. Во всех хозяйствах наблюдались единичные случаи абортов у кобыл. В целом, подобная картина свойственна для ВГЛ4. Однако, данные рестрикционного анализа свидетельствуют о том, что все эти штаммы имели структуру генома, характерную для ВГЛ1. Из этого следует, что форма проявления инфекции в данном случае определялась не столько -особенностями структуры генома возбудителя, сколько наличием остаточного иммунного фона к ВГЛ1 у конематок.

В двух других случаях острых вспышек ВГЛ-инфекции в респираторной форме „у жеребят (в Дубровском конном заводе и в Московском конном заводе №1), по-видимому, можно говорить об особенностях клинического проявления инфекции герпесвируса лошадей 4-го типа, поскольку два штамма, выделенные во время этих вспышек, имели укороченный геном, свойственный герпесвирусу 4-го типа.

Рестрикционный анализ как метод идентификации ДНК-содержащих вирусов

В процессе работы по рестрикционному анализу ДНК эпизоотических герпесвирусов лошадей мы выявили вирус (штамм Эргоне, выделенный из носовой слизи больного жеребенка), картина рестрикции ДНК которого

оказалась нехарактерной для известных герпетических вирусов лошадей. Изучив литературные данные и проведя дальнейшие исследования по его идентификации, мы пришли к выводу, что этот штамм является аденовирусом лошадей.

При рестрикционном анализе с помощью фермента ВатН1 его ДНК расщеплялась на 7 фрагментов с характерной электрофоретической подвижностью, что соответствует данным, получаемым для аденовируса лошадей с ВатН1 (Ыиуата с соавт., 1986).

Нами было . проведено несколько опытов по определению чувствительности штамма Эргоне к эфиру. Титр вируса, обработанного эфиром, оставался тем же, что и до обработки. Известно, что аденовирусы не чувствительны к эфиру.

Нами были приготовлены и окрашены по Романовскому-Гимза препараты культуры клеток почки эмбриона лошади, зараженной штаммом Эргоне. Характер ЦПД соответствовал таковому, описываемому для аденовирусов.

Таким образом, сопоставив клинические признаки заболевания, вызванного штаммом Эргоне, данные рестрикционного анализа вирусной ДНК и серологических исследований (РН, РГА), некоторые физико-химические свойства этого вируса, мы получили основание считать данный изолят аденовирусом лошадей.

Вышеуказанное подтверждает мнение о том, что метод рестрикции вирусной ДНК эндонуклеазами очень показателен при идентификации ДНК-содержащих вирусов и может быть использован также для их дифференциации.

Исследования по разработке инактивированной вакцины против ринопневмонии лошадей

Идентификация эпизоотических штаммов ВГЛ1 и 4, находящихся в активной циркуляции, позволила установить доминирующие варианты, типичным представителем которых является штамм КБ-1 ВГЛ1, характеризующийся к тому же высокой (по сравнению с другими штаммами) биологической активностью. На основании этого штамм был отобран для разработки инактивированной вакцины.

Для изготовления лабораторных серий вакцины накопление вируса проводили в первично-трипсинизированной культуре клеток почки эмбриона свиньи. Использовали партии сырья с инфекционным титром вируса не менее 7,3-7,5 ^ ТЦД 50/мл.

Проводили контроль на отсутствие бактериальной и грибковой контаминации.

С целью инактивации вируса добавляли формалин в конечной концентрации 0,025% при содержании 36% формальдегида.

Проводили контроль на полноту инактивации, для чего 0,2 мл препаратг вносили в 50-мл-вые флаконы со сформировавшимся монослоем культурь клеток, адсорбировали 1 час при комнатной температуре, промывали I заливали поддерживающей средой, таким образом проводили 3 пассажа. Пр1 отсутствии видимых цитопатических изменений клеток монослоз инактивацию считали полной.

Приготовление лабораторных образцов вакцины

Готовили два варианта вакцины: для интраназального и внутримышечноп применения.

Для интраназального применения использовали вакцину в виде культуральной жидкости с титром вируса до инактивации не менее 7,3-7,5 ^ ТЦД 50/мл и содержащей поверхностно-активное вещество этоний в конечной концентрации 1:20000.

Для внутримышечного применения инактивированную вируссодержащую жидкость смешивали"с адьювантом - гидроокисью алюминия (6%-ного).

После контроля на стерильность указанные образцы вакцины испытывали в опытах на жеребятах в условиях Московского конного завода №1.

Изучение антигенных свойств лабораторных образцов вакцины против ринопневмонии лошадей на жеребятах

В Московском конном заводе №1, в котором испытывалась вакцина, в течение ряда лет регистрировались массовые респираторные заболевания новорожденных жеребят. Вирусологическими и серологическими исследованиями был установлен диагноз на респираторную форму ринопневмонии лошадей.

В крови кобыл обнаруживали антитела, которые с молозивом передавались жеребятам. Однако, наличие колостральных антител у жеребят не обеспечивало их защиты от инфекции ВГЛ1.

В связи с этим, в хозяйстве проводились исследования по изысканию оптимальных методов и схем иммунизащш новорожденных жеребят. Наша работа представляет собой фрагмент • указанных исследований, проводившихся в лаборатории, целью которых являлось изучение возможности формирования у новорожденных жеребят невосприимчивости к респираторной ' вирусной инфекции на фоне пассивного колострального иммунитета.

Учитывая то обстоятельство, что воротами инфекции для вируса ринопневмонии лошадей часто является респираторный тракт, было решено проверить эффективность вакцинации путем . интраназального и внутримышечного введения вакцины.

Для опыта были подобраны 2 группы жеребят в возрасте 2-4 месяцев. Жеребятам подопытной группы (10 жеребят) вакцина прививалась шпраназально и внутримышечно. Жеребята контрольной группы (10 жеребят) не иммунизировались.

Интраназально вакцина вводилась в объеме 2 мл путем распыления в правую и левую полости носа. Внутримышечно вакцину вводили в объеме 2 мл в верхней трети шеи.

До иммунизации и в различные сроки после вакцинации от жеребят получали пробы сыворотки крови и носовые секреты, которые исследовали в РТГА и РН со специфическим антигеном.

Жеребята до иммунизации имели относительно высокий уровень гуморальных и секреторных антител, в среднем по группе 1:14 и 1:4,4 соответственно. . ■

После интраназальной аппликации вакцины на 10-е сутки тит£ гуморальных антител составил 1:32 по группе, а количество секреторньо антител увеличилось почти в 4 раза (1:16).

Повторную прививку вакцины провели внутримышечно, в результате чек через три недели титр гуморальных антител в среднем по группе состава) 1:43,7, а секреторных 1:18,6, а на 62-е сутки - 1:40,3 и 1:12,4 соответственно.

Внутримышечная реиммунизация вновь привела к повышению уровш гуморальных и секреторных антител.

Иммуногенная (антигенная) активность инактивированного вируса ринопневмонии лошадей в составе двухвалентной вакцины против гриппа и ринопневмонии лошадей

Иммуногенную активность вакцины изучали в контролируемом производственном опыте в Московском конном заводе №1 в условиях неблагополучия хозяйства по ринопневмонии и угрожаемой эпизоотической ситуации по гриппу лошадей. Возможность возникновения гриппозной инфекции в хозяйстве обуславливалась регистрацией гриппа лошадей 2-го tima (штамм А/лошадь 2/ Битца/85) в ряде конно-спортивных обществ и ипподромов.

Всего в опыте наблюдались 68 жеребят в возрасте от 2-4 месяцев до их отъемного возраста (6-7 месяцев).

Первая группа жеребят (38 голов) иммунизировалась двухвалентной Вакциной интраназально и через 21 день внутримышечно той же дозой по количеству вирусных антигенов, но с включением в ее состав адыованта (гидроокиси алюминия). Повторно внутримышечно эти жеребята вакцинировались через 2 месяца.

Вторую группу жеребят (19 голов) иммунизировали двукратно (контроль вакцины).

Третья группа жеребят (6 голов) подлежала однократной внутримышечной иммунизации (применяли биофабричную серию вакцины).

Четвертая, контрольная, группа (5 жеребят) иммунизации не подвергалась.

В различные сроки от подопытных жеребят получали пробы сыворотки крови и носовой слизи, которые исследовали на наличие антител к вирусу ринопневмонии в РН и РТГА.

Кроме того, часть этих проб исследовали на наличие антител к вирусу гриппа лошадей 2-го типа. Исследования на грипп не являлись нашей непосредственной задачей, однако, их использовали в качестве дополнительного метода для сравнительной оценки динамики иммунного ответа на прививку вакцины жеребятам.

В сыворотке крови жеребят обнаруживали антитела к ВГЛ1 в среднем по группе в титрах 1:8-1:16. Антитела, по-видимому, являлись пассивно приобретенными (колостральными) вследствие проводившейся вакцинации конематок. Возможно также, что часть кобыл имела постинфекционный иммунитет.

Интраназальная иммунизация жеребят инактивированной вакциной существенно не повлияла на уровень антител в сыворотке крови. В то же время, в секретах носовой полости антитела к ВГЛ1 у подопытных жеребят выявить (в диагностическом титре) не представлялось возможным.

Распыление в полости носа инактивированной вакцины привело к появлению секреторных антител, уровень которых к 10 суткам составил 1:81:16, после чего постепенно снижался к 21 дню.

Внутримышечная иммунизация жеребят способствовала новому повышению (в течение 3 недель) уровня специфических секреторных иммуноглобулинов.

В группе жеребят, в которой интраназальная аппликация вакцины не проводилась, появление антител в секретах носовой полости в низких титрах отмечается к 40-му дню опыта после внутримышечной прививки.

Уровень гуморальных антител у этих же жеребят в первой подопытной группе возрастал только после парентеральной прививки вакцины, существенно увеличиваясь после ревакцинации через 2 месяца.

Исследования динамики гуморального и секреторного ответа к вирусу гриппа лошадей .в основном выявляет те же закономерности.

Таким образом, проведенные исследования показали достаточно высокую иммуногенность вакцины против ВГЛ1 и гриппа лошадей.

Интраназальная иммунизация вызывает образование местного иммунитета в верхних дыхательных путях (ворота инфекции) и, по-видимому, сенсибилизирует иммунокомпетентные клетки, поскольку последующим внутримышечным введением вакцины достигается более активный гуморальный ответ в сравнении с жеребятами второй группы, которых иммунизировали только внутримышечно.

Длительные наблюдения (в течение 6 месяцев) показали, что в условиях неблагополучного по ВГЛ1 хозяйства вакцинация жеребят заметно атжает заболеваемость в течете первых 6 месяцев, т.е. в возрасте, наиболее восприимчивом к респираторной инфекции ВГЛ1.

ВЫВОДЫ

1. Методом рестршсцпошюго анализа исследован геном эпизоотических штаммов герпесвирусов лошадей, изолированных из абортированных плодов а органов дыхания больных жеребят в различных регионах России и 5ьпзшего СССР.

2. Установлена циркуляция двух типов герпесвирусов лошадей: вируса герпеса лошадей 1 (ВГЛ1) и вируса герпеса лошадей 4 (ВГЛ4).

3. Доминирующим возбудителем является герпесвирус лошадей 1, который вызывает массовые аборты у жеребых кобыл и вспышки респираторного заболевания у молодняка.

4. Выявлена внутри 1 иловая неоднородность генома штаммов ВГЛ1, полированных в различные годы. Все исследованные штаммы ВГЛ1 по <олпчеству сайтов рестрикции разделены на две группы. Более ранние 13оляты имеют на один сайт рестрикции больше при обработке

эндонуклеазой ВашН1. С 1977 года зарегистрировано появление нового варианта вируса, ДНК которого содержит на один сайт рестрикции меньше. В последующие годы указанный изолят становится превалирующим в популяции ВГЛ1.

5. Подтверждено, что рестрикционный анализ является достоверным методом типирования вирусов герпеса лошадей на основе изучения структуры их ДНК и позволяет выяснять некоторые вопросы экологии возбудителей.

6. Показано, что рестрикционный анализ может быть применен для идентификации ДНК-содержащих вирусов. Этим методом впервые в России идентифицирован аденовирус лошадей.

7. С помощью метода рестрикционного анализа вирусной ДНК отобран типичный штамм ВГЛ1, который использован для изготовления инактивированной двухвалентной вакцины против гриппа и ринопневмонии лошадей.

8. В опытах на жеребятах установлено, что вакцина вызывает образование иммунного ответа при интраназальном и внутримышечном введении.

9. Интраназальная аппликация вакцины способствует образованию местных (секреторных) антител в воротах инфекции при отсутствии 'заметной реакции гуморальных антител. Повторная внутримышечная прививка стимулирует выработку гуморальных и секреторных антител.

ю. Разработанная вакцина оказалась эффективной при ее испытании в производственных условиях. Применение вакцины снижало заболеваемость жеребят респираторной инфекцией в 2-3 раза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Идентифицирован и охарактеризован на основе изучения генома методом рестрикционного анализа типичный штамм вируса герпеса лошадей 1 (ринопневмонии или вирусного аборта лошадей) КБ-1, который может бьггь использован в качестве референтного, а также производственного штамма возбудителя.

Разработана и испытана инактивированная двухвалентная вакцина против гриппа и ринопневмонии лошадей (в соавторстве с К.П.Юровым, В.И.Лопаревым, Е.В.Ярных и Н.М.Белкиной). На опытно-промышленное производство вакцины разработана и утверждена нормативно-техническая документация.

На разработанную вакцину получено авторское свидетельство № 1608893 от 22 июля 1990 года.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ РАБОТ

1. Забегина Е.Ф., Морозов И.А., Юров К.П. Применение рестриктного шализа вирусного генома для дифференциации эпизоотических штаммов ЗГЛ1. //Биохимия сельскохозяйственных животных и Продовольственная фограмма: Матер. Всесоюзн. Симп. - Киев, УСХА, 1989, с.38-39.

2. Юров К.П., Лопарев В.И., Ярных Е.В., Забегина Е.Ф., Белкина Н.М. Закцина для профилактики гриппа и ринопневмонии лошадей и способ ее грименения.//Авторское свидетельство № 1608893 от 22 июля 1990 года, 8

3. Yurov К.P., Zabegina E.F. Restriction analysis for studies of the nolecular epizootology of equine herpesvirus 1. //XXIV World Vet. Congr. -iiode Janeiro, Brazil, 1991, abstr. 21.1.7., p.182.

4. Yurov К.P., Zabegina E.F. Epizootiology of equid herpesvirus-1, structure of the DNA and antigenic differences of the strains isolated in Russia and CIS. //Equine Infectious Diseases VII: Proc. 7th Int. Conf. on Equine Inf. Dis. - Tokyo, Japan, 1994, p. 348.

5. Yurov K.P., Zabegina E.F., Loparev V.I. Efficiency of intranasal vaccination of foals against equine influenza vims. //XXV World Vet. Congr, - Yokohama, Japan, 1995, abstr. FC2.9.1.

6. Amirbekov M., Yurov K.P., Zabegina E.F. Epizootology of the lamb; respiratory infections in the Republic of Tajikistan. //XXV World Vet Congr. - Yokohama, Japan, 1995, abstr. FC1.5.4.

7. Yurov K.P., Zabegina E.F. Equine influenza in Russia and efficiency o: vaccination. //5th World Equine Vet. Ass. Congr. - Padova, Italy, 1997, abstr PA 1/6, p. 13.

8. Yurov K.P., Zabegina E.F. Vaccination of the pregnant mares agains equine rhinopneumonia and risk factor for the appearance of respiratory diseasi in foals. //5th World Equine Vet. Ass. Congr. - Padova, Italy, 1997, abstr PO 57, p.72. ' .

9. Zabegina E.F., Loparev V.I., Yurov K.P. Immune response in foals t< intranasal and intramuscular application of inactivated viruses of equm rhinopneumonia and equine influenza. //8th Int. Conf. on Equine Inf. Dis. Dubai, U.A.E., 1998, abstr. 17, p.93.

to. Забегана Е.Ф., Лопарев В.И., Юров К.П. Эффективност комбинированной иммунизации жеребят для профилактики вирусны: респираторных инфекций. // Труды ВИЭВ, 1998, в печати.