Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии концентрирования глубинной культуры вакционного штамма Brucella melitensis Rev - 1 для приготовления живой сухой вакцины против бруцеллеза овец и коз

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии концентрирования глубинной культуры вакционного штамма Brucella melitensis Rev - 1 для приготовления живой сухой вакцины против бруцеллеза овец и коз"

На правах рукописи

ПИКОВ Александр Васильевич

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ГЛУБИННОЙ КУЛЬТУРЫ ВАКЦИННОГО ШТАММА BRUCELLA MELITENSIS REV - 1 ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЖИВОЙ СУХОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА ОВЕЦ И КОЗ

Специальность 03.01.06 — Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических, наук

1 8 ОКТ 2012

Щелково, 2012

005053487

005053487

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет».

Комоско Геннадий Владимирович - кандидат биологически наук, доцент, лауреат Государственной премии Российско" Федерации, полковник медицинской службы.

Скичко Николай Данилович - доктор биологических наук профессор, лауреат Государственной премии СССР, главны;" научный сотрудник отдела противобактерийных препаратов ГНГ! «Всероссийский научно-исследовательский и технологически]" институт биологической промышленности», г. Щелково. Колышкин Владимир Михайлович - доктор биологических наук, генеральный директор ООО «Промоген», г. Москва.

ФГБОУ ВПО «Московская государственная академи ветеринарной медицины и биотехнологии им К.И. Скрябина».

Защита состоится 26 октября 2012 г. В 10 часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 006.069.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН по адресу: 141142, Московская обл., Щёлковский район, пос. Биокомбината, д. 17, ВНИТИБП; тел./факс: 8(496)56-732-63; e-mail: vnitibp@mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Россельхозакадемии.

Автореферат разослан 25 сентября 2012 г.

Ученый секретарь совета: кандидат биологических наук

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Фролов Ю.Д.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из важнейших условий подъёма животноводства и обеспечения населения продуктами питания является снижение, а затем ликвидация инфекционных болезней. Одна из таких болезней, наносящих значительный ущерб экономике страны - бруцеллёз. В инфекционной патологии животных он занимает существенное место.

Бруцеллез относится к зоонозам, передающимся от больных животных человеку, и принадлежит к опасным заболеваниям, что определяет значение вопроса вакцинопрофилактики этой инфекционной патологии, который за по'следние годы приобрел особую актуальность. Это связано с рядом факторов:

- снижение уровня производства вакцинных препаратов;

- нарушение календаря профилактических прививок;

- рост заболеваемости бруцеллезом среди сельскохозяйственных животных и особенно среди овец и коз;

недостаточность финансирования исследований по разработке эффективных средств вакцинопрофилактики бруцеллеза нового поколения;

- ухудшение эпидемиологической и экологической обстановок.

Наиболее;значимым элементом в системе предупреждения бруцеллезной

инфекции является вакцинопрофилакгика.

Биологические особенности вакцинных штаммов бруцелл (повышенные питательные потребности, длительность выращивания, наличие диссоциации и др.) делают производство препаратов на их основе дорогостоящим из-за высокого процента брака, себестоимости исходного сырья и потерях на стадии концентрирования. В условиях коммерциализации эти причины привели к резкому снижению объемов производства бруцеллезных вакцин. Таким образом, приготовление препарата с необходимым содержанием количества прививочных доз во флаконе (ампуле) за счет повышения выхода микробных клеток вакцинного штамма при сохранении их свойств на этапах концентрирования и лиофилизации обеспечивает рентабельность производства препаратов и является актуальной задачей.

Цель и задачи исследований. Цель исследований: разработка технологии концентрирования глубинной культуры вакцинного штамма Brucella melitensis Rev-1 для приготовления живой сухой вакцины против бруцеллеза овец и коз. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. На основании проведенного анализа данных литературы о патогенных свойствах вакцинных штаммов бруцелл, их культурально-морфологических свойств, методах культивирования микроорганизмов обосновать выбор способа концентрирования бруцелл;

2. Обосновать выбор аппаратуры для проведения процесса концентрирования;

3. Определить режимы подготовки оборудования, параметры ведения процесса, обеспечивающие получение концентрированной бактериальной массы вакцинного штамма Br. melitensis Rev-1 при сохранении регламентированных биологических свойств;

4. Оценить качество бруцеллезной живой сухой вакцины на основе штамма Br. melitensis Rev-1 и ее полуфабрикатов, полученных с использованием вновь разработанной технологии концентрирования и выдать заключение о ее соответствии нормативным требованиям.

Научная новизна работы.

Впервые при производстве сухой бруцеллезной вакцины разработана и внедрена в практику технология концентрирования глубинных культур вакцинного штамма Br. melitensis Rev-1 на пористых мембранах в режиме проточной фильтрации.

Теоретически и экспериментально обоснован материал мембран и их порог задержания.

Практическая значимость работы.

Разработана технология концентрирования глубинных культур вакцинного штамма Br. melitensis Rev-1 для приготовления живой сухой вакцины против бруцеллеза овец и коз.

Из полученных микробных концентратов приготовлены партии вакцины живой сухой, проведены исследования на соответствие препаратов требованиям НД. Показано соответствие готовых вакцинных препаратов основным требованиям НД.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Возможность концентрирования глубинных культур вакцинного штамма Brucella melitensis Rev-1, с использованием установки «Сартокон - 2».

2. Параметры подготовки и стерилизации оборудования.

3. Параметры процесса концентрирования, обеспечивающие получение микробных концентратов бруцелл в промышленных условиях и воспроизведение технологического процесса концентрирования.

4. Возможность получения готового препарата вакцины против бруцеллеза овец и коз, отвечающего требованиям НД, на основе микробных концентратов, полученных мембранным способом.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всероссийской научной конференции молодых ученых «Наука. Производство. Экология» (г.Киров, 2010).

Публикации научных исследований. По результатам диссертации опубликовано 4 печатных работы, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 109 страницах компьютерного текста. Диссертационная работа включает: введение, аналитический обзор, выбор направления исследований, теоретические и экспериментальные исследования, обобщение результатов исследований, выводы и заключение. Список использованной литературы включает 123 источника, из них 100 отечественных, 17 - иностранных и 6 - материалы из сети Интернет. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 19 рисунками, содержит 2 приложения.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Животные. Для оценки безвредности микробных концентратов использовали аутбредных белых мышей обоего пола, 35 - 40 дневного возраста, весом 35 - 40 г.

Питательные среды и растворы. В работе использовали 50%-й раствор глюкозы с витаминами, МПБ, МПА, бруцеллагар, сахарозо-желатиновую защитную среду, физраствор. Для глубинного культивирования бруцелл использовали культуральную среду на основе ферментативного гидролизата мяса,

Штаммы микрорганюмов. Использовали вакцинные штаммы Br. melitensis Rev-1 и Bacillus anthracis 55-ВНИИВВиМ, полученные из ФГБУ ВГНКИ Ветеринарных препаратов.

Основное оборудование. Глубинные культуры бруцелл выращивали в бутылях объемом 20 дм3 и в биореакторах БИОР-0,25 м3 (ОКБ ТБМ, г. Кириши Ленинградской обл.), оснащенных перемешивающим устройством магнитного типа.

Для концентрирования глубинных культур вакцинного штамма Br. melitensis Rev-1 использовали установки микрофильтрации "Сартокон-мини" и "Сартокон-2" (производства предприятия "Владисарт", г.Владимир, Россия), мембранные модули "Ультрасарт" на основе полисульфона с порогом задержания 300 кДа, мембранные модули «Микросарт» на основе ацетата целлюлозы с размером пор 0,2 мкм, мембранные модули на основе полипропилена с размером пор 0,2 мкм, мембранные модули на основе полипропилена с размером пор 0,45 мкм (производства предприятия

"Владисарт", г.Владимир).

Замораживание препарата для лиофилизации осуществлялась в низкотемпературной морозильной камере производства фирмы «Frigera» (Чехословакия). Лиофилизация препарата осуществлялась в сублимационной установке LZ - 45.27 производства фирмы «Frigera» (Чехословакия).

Методы оценки качества препаратов. Для изучения свойств микробных суспензий и приготовленной на их основе вакцины применяли методы оценки качества по следующим показателям:

- содержание живых микроорганизмов в 1 см3 микробной суспензии (биологическая концентрация, БК)определяли методом высева на плотную питательную среду;

- оптическая концентрация (ОК) бруцелл в 1 см3 микробной суспензии по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича;

- наличие и степень диссоциации бруцелл определялась в пробах с акрифлавином и по Уайт - Вилсону;

- реакцию среды рН определяли потенциометрическим методом;

- безвредность препаратов определялась введением белым мышам препаратов бруцелл подкожно в соответствии с рекомендациями Стандарта организации «Вакцина против бруцеллеза овец и коз и инфекционного эпидидимита баранов из штамма B.melitensis Rev - 1 живая сухая» СТО 00494189-0001-2004.

- остаточная влажность готовой формы препарата определяли гравиметрическим методом;

- наличие посторонней микрофлоры определяли микроскопией окрашенных по Граму мазков и методом выращивания на плотной питательной среде;

- определение остаточной концентрации формалина в промывных водах установки «Сартокон-2» проводили сульфитным методом.

Обработка результатов. Результаты экспериментальных исследований представлены в виде среднего арифметического значения с определением доверительного интервала при уровне вероятности, равном 95%. Достоверность различий определялась согласно рекомендациям ГОСТа 15895-77 и в соответствии с рекомендациями И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева.

2.2. Результаты собственных исследований

2.2.1. Изучение возможности применения мембранной техники для концентрирования нативных культур Brucella melitensis Rev -1

Концентрирование осуществлялось на лабораторной установке «Сартокон-мини» путем циркуляции нативной культуры с отводом фильтрата в промежуточную емкость (стерильная стеклянная бутыль вместимостью 20,0 дм3). Концентраты получены из экспериментально приготовленных глубинных культур, выращенных в бутылях объемом 20 дм3. Концентрация бруцелл в бутылях составляла 15-20 млрд.м.к.*см"3, объем нативной культуры в бутыле 15-17 дм3 (1 бутыль - 1 концентрат).

В экспериментах использовались следующие типы мембранных модулей:

1) мембрана «Ультрасарт» на основе полисульфона с порогом задержания 300 кДа;

2) мембрана «Микросарт» на основе полипропилена с размером пор 0,2 мкм;

3) мембрана «Микросарт» на основе ацетата целлюлозы с размером пор 0,2 мкм;

4) мембрана «Микросарт» на основе ацетата целлюлозы с размером пор 0,45 мкм.

Использование мембраны с диаметром пор 0,45 мкм показало свою нецелесообразность ввиду уноса бруцелл с фугатом, что приводит не только к потерям целевого продукта, но и к быстрому забиванию мембраны дисперсной фазой и невозможности длительного использования ее в производстве.

Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1. Среднее время концентрирования представлено, как среднее арифметическое времени концентрирования бутыли после отмывки мембран рекомендуемыми средствами. G — производительность мембраны по дистиллированной воде от номинала после 5 циклов концентрирования с отмывкой мембраны рекомендуемыми средствами после каждого цикла концентрирования.

Таблица 1

Характеристика концентрированных культур Br.melitensis Rev -1, полученных мембранным способом на установке "Сартокон-мини", (п=5) Наименование показателя

Концентрат, полученный с использованием мембраны

ОК, млрд.

м.к.*см"3

БК, млрд. м.к.*см"3

рн

концентрата, ед. рН

Среднее время концентрирования, мин

Полисульфон,3 300 кДа

Полипропилен, 0,2 мкм

125± 12

120±10

6,95±0,10

70

122± 10

118±9

6,99±0,11

95

Ацетат целлюлозы 0,2 мкм

122±5

120±7

6,87±0,04

120

Экспериментальные данные, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о принципиальной возможности концентрирования мембранным способом глубинных культур Br. melitensis Rev - 1 и целесообразности проведения дальнейших исследований в экспериментально-производственных условиях с использованием мембран «Ультрасарт» на основе полисульфона с диаметром пор 300 кДа.

2.2.2. Разработка промышленной технологии мембранного концентрирования глубинных культур Br. melitensis Rev -1

При выборе конкретного микрофильтрационного оборудования учитывали воспроизводимость технологии и ее способность адекватно отвечать требованиям, которые предъявляются условиями изготовления тех или иных препаратов. Вместе с тем, технология должна быть универсальной, мобильной,

отличаться относительно низкой стоимостью капитальных затрат и применяемого оборудования, а также обеспечивать удобство в эксплуатации.

С учетом вышеизложенного выбор был сделан в пользу установки микрофильтрации "Сартокон-2", снаряженную кассетными модулями.

Кассетный (мембранный) модуль «Ультрасарт» на основе полисульфона с порогом задержания 300 кДа выбран в качестве разделяющей мембраны вследствие его биологической инертности и на основе проведенных ранее исследований по концентрированию нативных глубинных культур Br.melitensis Rev -1 на лабораторной установке «Сартокон — мини».

Теоретическая и практическая ценность использования установки основаны на исключительно важных для производства критериях, а именно:

- высокой удельной производительности;

- практическом отсутствии концентрационной поляризации;

- высоких значениях фильтрационного потока при низкой рециркуляции;

- возможности стерилизации химическим и другими способами;

биологической инертности материалов и соответствии их международным требованиям ВОЗ;

- герметичности исполнения;

- простоте обслуживания и аппаратурного оформления.

Таким образом, анализ конструкции установки и кассетных мембранных модулей позволяет сделать заключение о том, что наиболее приемлемым из доступного оборудованием для концентрирования вакцинного штамма Br. melitensis Rev-1 на современном этапе развития мембранной техники может служить установка микрофильтрации "Сартокон-2".

2.2.2.1. Выбор метода и отработка режима стерилизации установки микрофильтрации "Сартокон-2"

Способность мембран к стерилизации служит важным показателем их эксплуатационных свойств. Устойчивость материала мембраны к действию тепловой и химической стерилизации оказывается существенно различной. При стерилизации паром возможно возникновение повреждений поверхности ма-

териала мембран. Большинство мембран подвергаются химической стерилизации. Эффективность, простота и экономичность были взяты за основу при выборе способа стерилизации. Исходя из этого, выбор был сделан в пользу химического способа стерилизации.

Из анализа данных литературы и технических характеристик мембранных модулей "Ультрасарт" на основе полисульфона определили наиболее эффективные, доступные и дешевые химические вещества. К их числу относятся дезинфицирующие композиции на основе формальдегида, с раствором которого проводили эксперименты.

Предварительно установка с коммуникационными узлами и смонтированной мембраной подвергалась контаминации спорами сибиреязвенного микроба вакцинного штамма Bacillus anthracis 55 ВНИИВВиМ. Контаминация осуществлялась путем циркуляции через установку суспензии спор концентрацией 200±10 млн.спор*см"3 объемом 10 дм3 в течение 20 минут. По окончании контаминации установка разбиралась для взятия проб на контаминированность спорами Bacillus anthracis 55 ВНИИВВиМ. Пробы отбирались стерильными ватными тампонами путем смыва со следующих поверхностей: входной штуцер линии концентрата; выходной штуцер линии концентрата; отверстия ввода и вывода микробной культуры мембранного фильтра. Затем смывы высевались на скошенный мясопептонный агар в пробирках и инкубировались в течение суток. Во всех случаях на скошенном агаре наблюдался типичный рост культуры Bacillus anthracis 55 ВНИИВВиМ, при микроскопии приготовленных и окрашенных препаратов обнаружены типичные для данной культуры вегетативные клетки. Установка после контаминации монтировалась и подвергалась обработке растворами формалина с концентрацией 2% при температуре 20-25 °С, путем циркуляции раствора через установку. Удаление остатков стерилизующего раствора из установки, мембранных модулей и коммуникаций проводили стерильной дистиллированной водой. Для этого очистку проводили кратными объемами стерильной дистиллированной воды (5,0;10,0; 15,0; 20,0 дм3). По

результатам исследований промывных вод установили зависимость концентрации остаточного формальдегида от расхода воды. Результаты исследований представлены на рисунке 1.

О воды, л

Рис. 1. Зависимость остаточной концентрации формальдегида (С, %) от расхода промывных вод (О, л) Как видно из представленной на рисунке 1 графической зависимости, с

увеличением расхода воды (О) остаточная концентрация формальдегида (С)

уменьшалась. При использовании объемов воды 15,0 и 20,0 л остаточная

концентрация формальдегида, определенная сульфитным методом составляет

менее 0,01%, что свидетельствует о достаточной полноте отмывки от остатков

формальдегида. Был сделан вывод, что минимально необходимый объем

стерильной дистиллированной воды, необходимый для отмывки установки от

остатков формальдегида составляет 20 л.

Конечные порции воды с линии выхода концентрата были высеяны на

скошенный мясопептонный агар. Об эффективности стерилизации судили по

наличию выросших колоний микроорганизмов на скошенном агаре. Результаты

исследований по эффективности стерилизации представлены в таблице 2.

Таблица 2

Эффективность стерилизации установки микрофильтрации "Сартокон-2"

Концентрация раствора, % Время циркуляции, мин Наличие микрофлоры

2 20 есть

2 40 нет

Из представленных в таблице 2 данных следует, что применение 2%-ного раствора формальдегида при температуре 20-25 °С и времени циркуляции раствора через установку не менее 40 минут обеспечивает достижение необходимых асептических условий для ведения процесса получения концентрированной микробной суспензии.

Однако следует отметить, что в процессе переработки промышленных объемов нативных культур наблюдался эффект спрессовывания накопившейся биомассы в местах установки манометров. В этой связи целесообразно химический способ стерилизации сочетать с периодической (не реже, чем через 4 рабочих цикла) механической очисткой и последующей термической обработкой всех съемных элементов фильтрационного аппарата.

На основании результатов исследований выбраны и предлагаются технологические значения параметров режима стерилизации установки "Сартокон-2", которые приведены в таблице 3.

Таблица 3

Технологические параметры режима стерилизации

Наименование параметра Значение параметра

Раствор формальдегида (содержание основного вещества), % 2

Объем дезинфектанта, л не менее 15, 0

Время циркуляции раствора, мин не менее 40

Температура дезинфектанта, °С 20...25

Расход воды для промывки, дм3 не менее 15, 0

Давление при циркуляции на линии входа в установку/на линии выхода из установки, МПа /МПа 0,15-0,2/0-0,05

Периодичность механической и термической обработки съемных элементов установки, цикл 4

Параметры, представленные в таблице 3, подобраны экспериментально в производственных условиях и обеспечивают надежную стерилизацию установки и ее узлов для возможности проведения процесса концентрирования, исключающего контаминацию посторонней микрофлорой.

2.2.2.2. Отработка режима и параметров мембранного концентрирования глубинных культур Вг. теШеп$1$ Яел>-1 в производственных условиях

Исходя из анализа литературных данных, основное внимание было сосредоточено на режимах концентрирования, которые определяют производительность процесса.

При проведении экспериментальных исследований по обоснованию возможности использования мембранного способа концентрирования глубинных культур Вг. теШепяй Леу-1 представлялось целесообразным решить следующие задачи:

- определить площадь фильтрующей поверхности, позволяющей переработать заданный объем нативной культуры;

- определить зависимость производительности фильтрации от величины перепада давления.

Концентрированию на установке «Сартокон - 2» подвергались глубинные культуры Вг. теШепз1з Леу-], выращенные в ферментерах "Биор-0,25". Основные характеристики глубинных культур представлены в таблице 4. Культивирование проводилось до выхода культуры бруцелл в стационарную фазу роста, определяемую как отсутствие прироста оптической концентрации микробов в пробах, отличающихся по времени культивирования на 1 час.

Таблица 4

Характеристики глубинных культур Вг. теШети -1, выращенных в

ферментерах «Биор-0,25», (п=7)

Определяемые показатели ОК, млрд. м.к.*см'3 БК, млрд. м.к.*см"3 рН, ед. рН Наличие ПМФ

глубинные культуры 30±4 27±4 7,0±0,1 не содержат

Контроль. (требования НД) не ниже 25 не ниже 22 6,8-7,2 не допускается

Как видно из данных, представленных в таблице 4, нативные глубинные культуры Вг. теШетк Яеу-], выращенные в ферментерах «Биор-0,25», полностью соответствуют по основным биологическим и физико-химическим характеристикам нормируемым уровням.

Для решения поставленных задач в экспериментах по концентрированию культур Вг. теШетгз Яе\>—1 применяли от одного до трех мембранных модулей «Ультрасарт» на основе полисульфона с размером пор 300 кДа и площадью фильтрующей поверхности 0,6 — 1,8 м2.

В результате проведенных экспериментов были получены концентрированные микробные культуры, основные характеристики которых представлены в таблице 5.

Таблица 5

Характеристики концентрированных культур Br. melitensis Rev -1, полученных

на установке микрофильтрации "Сартокон-2", (п=7)

Наименование показателя Значения показателя концентрата Контроль (требования НД)

Оптическая концентрация, млрд.м.к.*см'3 160±10 не ниже 150

Биологическая концентрация, млрд.ж.м.к.*см" 150±10 не ниже 140

Степень концентрирования по объему, разы 5-6 j не нормируется

Степень концентрирования по биологической концентрации, разы 5-6 не нормируется

Реакция среды, ед.рН 6,9±0,1 6,8-7,2

Наличие ПМФ, КОЕ не содержат не допускается

Как видно из данных, представленных в таблице 5, глубинные культуры концентрируются в 5-6 раз с высоким уровнем содержания жизнеспособных клеток. Результаты исследований свидетельствуют о том, что концентрированные микробные культуры, полученные мембранным способом, по основным показателям соответствуют требованиям НД.

Движение потоков микробных культур при концентрировании осуществляется следующим образом: глубинная культура по линии выхода из ферментера через предфильтр под давлением 0,04 - 0,06 МПа поступает в промежуточную нержавеющую емкость, далее через ротационный насос установки культура поступает в кассетный модуль, затем по линии выхода че-

рез мембранный вентиль возвращается обратно в емкость, тем самым образует замкнутую систему, в которой и происходит концентрирование нативной культуры. Фильтрат по линии выхода поступает в бутыль.

Требуемая площадь рабочей поверхности мембраны выбиралась исходя из заданной производительности процесса концентрирования нативных культур. Задача решалась путем деления объема исходной нативной культуры в ферментере "Биор-0,25" - 115,0 дм3 на принятое нами время процесса, равное 8 часам.

По условию задачи через мембрану с размером пор 300 кДа требовалось профильтровать 115,0 дм3 нативной культуры, при этом процесс следовало провести не более, чем за 8 часов при давлении ОД МПа.

На рисунке 2 показана зависимость времени фильтрации от площади фильтрующей поверхности, построенная по средним значениям двух опытов для каждой точки.

Тф,ч

Рисунок 2 - Зависимость времени фильтрации - тф от площади фильтрующей поверхности - Бф.

Как следует из зависимости, прел § ф, ю3 см2 а рисунке 2, для концентрирования нативной культуры в объеме 115,0 дм3 в течение 8 часов потребуется площадь фильтрующей поверхности не менее 18 * 103 см2.

Была проведена экспериментальная оценка производительности процесса в зависимости от величины значения перепада давления. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6

Показатели производительности мембранного концентрирования

Величина показателя давления, МПа " ч Производительность, дм3*ч"'

Рвх Рвых Рперепад

0,10 0 0,10 10,5±1,0

0,10 0,05 0,05 12,0±1,0

0,20 0 0,2 12,5±1,5

0,20 0, 05 0,15 14,0±1,5

0,20 0,120 0,08 16,0±1,0

0,25 0,170 0,08 15,0±2,0

0,30 0,200 0,1 15,0±1,0

Из данных, приведенных в таблице 6, следует, что производительность микрофильтрационного концентрирования нативных культур Вг. теШепяЬ Яеч-1 достигала наибольшей величины (16,0±1,0) дм3*ч"' при значении перепада давления 0,08 МПа при давлении на входе в установку 0,20 МПа, на выходе из установки - 0,12 МПа. При этом отмечалось, что увеличение значения показателя давления на входе в фильтрующий элемент до 0,3 МПа приводило к пропорциональному росту величины давления на выходе фильтрующего модуля, тем самым повышая перепад давления, но не приводило к какому-либо заметному увеличению скорости фильтрации.

На основании полученных результатов предложены граничные значения параметров процесса концентрирования нативных культур Вг. теШетк Деу - 1 на установке микрофильтрации "Сартокон-2", которые представлены в таблице 7.

Таблица 7

Технологические параметры процесса концентрирования нативных культур Вг. теНсетй Деу -1 на установке микрофильтрации "Сартокон-2"

Наименование параметра Значение параметра

Производительность фильтрации, дм3*ч"' 14,0±2,0

Площадь фильтрующей поверхности, см"2 не менее 18*103

Количество мембранных модулей «Ультрасарт», шт. не менее 3

Давление: на входе фильтрующего модуля/ на выходе фильтрующего модуля, МПа 0,1-0,2/0,05-0,12

Кратность концентрирования (по объему), разы не менее 6

Температура процесса, С° 15-21

Таким образом, проведенные экспериментальные исследования подтверждают возможность создания технологии концентрирования нативных культур Br. melitensis Rev - 1 на основе мембранного способа разделения жидких биологических дисперсных систем.

В качестве сравнения были выполнены исследования по концентрированию нативных культур регламентным способом осаждения с использованием 0,2% раствора натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы и микрофильтрацией, на установке "Сартокон-мини".

Результаты сравнительной оценки свойств концентрированных микробных культур, полученные вышеуказанными способами концентрирования, представлены в таблице 8.

Таблица 8

Сравнительная оценка свойств концентрированных микробных культур, полученных осаждением и мембранным способами разделения, (п=5)

Наименование показателя характеристики культур, полученных способом...

осаждения мембранным

Оптическая концентрация, млрд.м.к.*см'"* 35±5 125±12

Биологическая концентрация (чашечным методом), млрд.ж.м.к.*см"3 30±2 120±10

Диссоциация культуры, % отсутствует отсутствует

Степень концентрирования по БК, разы 2 7

Концентрация водородных ионов, ед.рН 6,80±0,15 6,80±0,10

Потери при концентрировании, % 30 отсутствуют

Наличие ПМФ, КОЕ не содержит не содержит

Из приведенных в таблице 8 данных следует, что концентрированные микробные культуры, полученные мембранным способом, не только не уступают по показателям качества концентратам, приготовленным способом осаждения, но и превосходят их. При этом отмечается значительное снижение потерь содержания бруцелл на стадии концентрирования. Кроме того, время приготовления микробного концентрата с использованием мембран сократилось в 30 - 40 раз по сравнению с регламентным методом осаждением КМЦ, что является предпочтительным, особенно в условиях реального производства.

Были проведены теоретические расчеты экономической целесообразности использования мембранной технологии концентрирования в сравнении со

способом седиментации с использованием КМЦ. На основе полученных расчетов был сделан вывод о снижении затрат на 30 % при изготовлении концентрата, достаточного для приготовления 10 млн. доз вакцины методом микрофильтрации по сравнению с использованием КМЦ.

Дня внедрения предложенной технологии концентрирования в производство вакцины против бруцеллеза овец и коз из штамма Br. melitensis Rev - 1 живой сухой с применением мембранного концентрирования необходимо было установить безвредность, полученных концентратов, приготовить из полученных концентрированных микробных культур вакцинные препараты и оценить их соответствие требованиям научной документации.

2.23. Определение безвредности микробных концентратов культур Brucella melitensis Rev -1, полученных мембранным способом

В соответствии с требованиями, предъявляемыми к ВИБП, безвредность является одним из наиболее важных показателей, определяющих возможность использования препарата в качестве иммуно-биологического.

Безвредность глубинных культур и концентратов определяли на белых мышах.

На безвредность оценивались 7 глубинных нативных культур штамма Br. melitensis Rev—1, выращенных в ферментерах «Биор-0,25» и 7 микробных концентратов, полученных на установке «Сартокон - 2». Каждую глубинную культуру и концентрат проверяли на 5-ти белых мышах. Пробы глубинных культур и концентратов разводили стерильным физиологическим раствором до концентрации 1 млрд. живых бруцелл в 1 см3 и вводили подкожно мышам в дозе 250 млн. в объеме 0,25 см3.

Одновременно с этим выполнены исследования, в которых пробы глубинных культур и концентратов разводили стерильным физиологическим раствором до концентрации 2 млрд. живых бруцелл в 1 см3 и вводили подкожно мышам в дозе 500 млн. в объеме 0,25 см3. За мышами наблюдали в течение 10 суток.

В ходе проведения исследований установлено что, при заражении опытных животных рекомендуемыми для проверки безвредности препарата Стандартом организации СТО 00494189-0001-2004 дозами бруцелл глубинные культуры и микробные концентраты выдерживают испытание на безвредность.

При увеличении инфицирующей дозы в 2 раза на введение нативной культуры у некоторых животных наблюдался отказ от пищи и снижение двигательной активности. Это говорит о том, что испытание выдержали только микробные концентраты, полученные с применением установки «Сартокон-2».

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о целесообразности выбранного способа концентрирования бруцелл и его использования с целью получения концентрированного препарата микробной биомассы.

2.2.4. Оценка качества вакцин, приготовленных на основе концентратов, полученных мембранным способом

На данном этапе экспериментальных исследований были изучены биологические и физико-химические свойства вакцин, приготовленных с использованием концентратов, полученных мембранным способом.

Для того, чтобы оценить качество вакцины бруцеллезной живой сухой, приготовленных на основе концентратов, полученных мембранным способом, необходимо было провести высушивание полуфабриката вакцины на оборудовании и по режимам, соответствующим требованиям регламента.

Эксперимент по получению готовой формы препарата проводился на оборудовании ООО «Агровет» и Вятского государственного университета.

Технология высушивания соответствовала регламенту производства. В результате проведенных работ были получены три серии вакцины бруцеллезной живой сухой с показателями качества, представленными в таблице 7, которые полностью отвечают требованиям НД.

Таблица 9

Оценка качества живых сухих вакцин, приготовленных с использованием микробных концентратов, полученных мембранным методом, (п=3)_

Наименование показателя Значение показателя в вакцине Контроль (требования НД)

Внешний вид Кристаллическая сухая масса Аморфна? или кристаллическая сухая масса

Цвет Светло-серый Светло-серый с коричневатым оттенком

Наличие плесени, ■ посторонней примеси, следов оттаивания Отсутствуют Не допускается

Ресуспендируемость Испытание выдерживает Должна ргсуспендирсьаться в физиологическом растворе или специальном разбавителе з течение 1 - 2 мин с образованием однородной взвеси сзетло-серого цвета без неразбизающихся хлопьев к осадка

Массовая доля влаги, %, в пределах 2,4±0,5 1,2-3,0

Бактериальная чистота ПМФ отсутствует Не должна ссдерх-сать ПМФ

Выживаемость бруцелл при выпуске, % 75±10 не ниже 50,0

Выживаемость бруцелл в течение срока годности, % 60+10 не ниже 50,0

Количество диссоциированных колоний, %, не более отсутствуют 5,0

Безвредность безвредна Должна быть безвредной

Из вышеизложенного можно сделать вывод, что с использованием разработанной технологии концентрирования, возможно получать кондиционные препараты вакцины бруцеллезной живой сухой.

На основе полученных данных были составлены ведомости изменения к регламенту производства на вакцину бруцеллезную живую сухую и «Инструкция по подготовке установки «Сартокон - 2» и проведению процесса концентрирования нативной культуры штамма Brucella melitensis Rev-1 на установке «Сартокон - 2».

3. ВЫВОДЫ

1. Выбран и обоснован мембранный способ концентрирования бруцелл.

2. Выбран способ и отработаны режимы стерилизации установки «Сартокон-2».

3. Отработаны режимы концентрирования глубинных культур Br. melitensis Rev-1 на установке мембранной фильтрации «Сартокон-2».

4. Разработана технология концентрирования глубинных культур вакцинного штамма В г. melitensis Rev-1, с использованием установки мембранной фильтрации «Сартокон-2».

. 5. Приготовленные вакцинные препараты на основе микробных концентратов, полученных с использованием разработанной технологии концентрирования, отвечают требованиям НД.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ

Результаты проведения исследовательских работ реализованы составлением: ведомости изменения № 1 к регламенту производства РП №938420-017-46392258 «Вакцина бруцеллезная живая сухая для подкожного применения» и «Инструкции по подготовке установки «Сартокон -2» и проведению процесса концентрирования нативной культуры штамма Brucella melitensis Rev-1 на установке «Сартокон - 2», утвержденными заместителем генерального директора ООО «Агровет» по производству 19.03.2011 г.

Полученные научные результаты используются в учебном процессе производственной практики в ФГБОУ ВПО «Вятский государственный университет» при подготовке специалистов по специальности 03.01.06 -биотехнология (в том числе бионанотехнологии).

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Комоско Г.В., Пиков A.B., Коржавина С.П. Обоснование состава жидкой питательной среды для глубинного культивирования вакцинного штамма Brucella melitensis Rev-1. Ветеринарная медицина. - 2008. - № 1.- С. 8-9.

2. Пиков A.B. Оценка методов концентрирования клеток Brucella melitensis Rev-1 для получения полуфабриката противобруцеллезной вакцины. Ветеринарная медицина. - 2009. - № 1-2. - С. 14-16.

3. Пиков A.B. Оценка различных фильтрующих модулей в технологии мембранного концентрирования нативных культур клеток Brucella melitensis Rev-1 для получения полуфабриката противобруцеллезной вакцины. Ветеринарная медицина. - 2009. - № 4. - С. 4-6.

4. Комоско Г.В., Пиков A.B., Коржавина С.П. Мембранные методы концентрирования в биотехнологии. // Тезисы докладов Всероссийской научной конференции молодых ученых «Наука. Производство. Экология» -Киров,-2010.

Пиков Александр Васильевич

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ГЛУБИННОЙ КУЛЬТУРЫ ВАКЦИННОГО ШТАММА BRUCELLA MEUTENSIS-1 ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЖИВОЙ СУХОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА ОВЕЦ И КОЗ

Подписано в печать 20.09.2012. Формат 60x84 V Объем пл. 1,75 Гарнотура Times New Roman. Тираж 100 экз. Заказ Нч 86

Издательство МГАКХиС 109029, Москва, Ср. Калитниковская ул., д.30 Тел. 911-58-03, факс 670-71-80. E-mail: 9115803@rambler.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пиков, Александр Васильевич

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,

СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

ВВЕДЕНИЕ

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Возбудители бруцеллеза сельскохозяйственных животных 13 1.1.1 Номенклатура и классификация

1.1.2 ПАТОГЕННОСТЬ

1.2 Средства специфической профилактики бруцеллеза

1.2.1 Специфическая иммунопрофилактика бруцеллеза

1.2.2 Вакцина на основе штамма Brucella melitensis Rev

1.3 Способы концентрирования микробных культур

1.4 ОСНОВНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОЦЕССА ФИЛЬТРАЦИИ И ОСОБЕННОСТИ МЕМБРАННОГО ОБОРУДОВАНИЯ, ИСПОЛЬЗУЕМОГО ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ МИКРОБНЫХ КУЛЬТУР

2 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 46 2.1. Материалы и методы

2.2 Экспериментальное изучение возможности применения мембранной техники для концентрирования глубинных культур

Brucella melitensis Rev -1.

2.3 Разработка промышленной технологии мембранного концентрирования глубинных культур Brucella melitensis Rev

2.4 Выбор метода и отработка режима стерилизации установки микрофильтрации мСартокон-2"

2.5 Отработка режима и параметров мембранного концентрирования глубинных культур Brucella melitensis Rev -1 в производственных условиях

2.6 Определение безвредности микробных концентратов культур Brucella melitensis Rev — 1, полученных мембранным способом 82 2.7 Оценка качества вакцин, приготовленных на основе концентратов, полученных мембранным способом

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка технологии концентрирования глубинной культуры вакционного штамма Brucella melitensis Rev - 1 для приготовления живой сухой вакцины против бруцеллеза овец и коз"

Бруцеллез (Brucellosis) - инфекционная, зооантропонозная, преимущественно хронически протекающая болезнь, вызываемая бактериями рода Brucella, проявляющаяся абортами, задержанием последа, эндометритами и расстройством опорно-двигательной системы (бурситы), у самцов -орхитами. Известно, что такое инфекционное заболевание как бруцеллёз, имеет не только ветеринарное, но и медико-санитарное значение. С развитием человеческого общества искоренение бруцеллёза является одной из актуальных проблем. В настоящее время перед медицинской и ветеринарной наукой и практикой в ближайшие годы стоит задача содействовать сокращению этой болезни среди животных. Указанная задача является вполне реальной, поскольку подтверждена практическим опытом борьбы с данным заболеванием в ряде стран ближнего и дальнего зарубежья.

Уровень производства продуктов животноводства играет большую роль в экономическом развитии человечества, а животные являются национальным богатством каждой страны. По данным ВОЗ и МЭБ, бруцеллез человека и животных в современном мире распространен сравнительно широко. Только в последнем десятилетии он регистрировался в 28 странах Европы, в 18 странах Америки, в 12 странах Азии, в 21 стране Африки и в 3 странах Океании. На всех континентах наиболее широко распространен бруцеллез крупного рогатого скота.

По данным ВОЗ и МЭБ за последние годы произошли существенные изменения в эпизоотической ситуации по бруцеллезу во многих странах мира. На сегодняшний день 38 государств освободились от этой болезни, в 5 странах болезнь встречается как исключение, в 50 - в виде единичных вспышек, в 38 -как эпизоотия.

Успехи, достигнутые в ликвидации бруцеллеза в Российской Федерации, несмотря на их научную и практическую значимость не позволяют в настоящее время сделать заключение о том, что проблема ликвидации бруцеллеза сельскохозяйственных животных окончательно решена. Это подтверждается возникновением новых очагов данного заболевания в различных регионах РФ. Инфекция наносит значительный ущерб животноводству, который складывается из потери воспроизводительной способности, выбраковке ценных в племенном отношении животных, абортов и рождении слабых, нежизнеспособных сельскохозяйственных животных.

Бруцеллез относится к зоонозам, передающимся от больных животных человеку, и принадлежит к опасным заболеваниям, что определяет значение вопроса вакцинопрофилактики данной инфекционной патологии, который за последние годы приобрел особую актуальность. Это связано с рядом факторов:

- снижением уровня производства вакцинных препаратов;

- нарушением календаря профилактических прививок;

- ростом заболеваемости бруцеллезом среди сельскохозяйственных животных и особенно среди овец и коз; недостаточностью финансирования исследований по разработке эффективных средств вакцинопрофилактики бруцеллеза нового поколения;

- ухудшением эпидемиологической и экологической обстановок.

Современная система профилактики инфекционных заболеваний основывается на проведении общих ветеринарно-санитарных мероприятий, выявлении источников инфекции - больных животных и ликвидации источников, применении средств специфической иммунопрофилактики. Наиболее значимым элементом в системе предупреждения бруцеллезной инфекции является вакцинопрофилактика.

Что касается Российской Федерации в отношении бруцеллеза животных, то наиболее неблагополучным по бруцеллезу мелкого и крупного рогатого скота остаются Южный и Северо-Кавказский Федеральные округа. В них с 1991 года по 2005 год было выявлено 740 неблагополучных пунктов по бруцеллезу крупного рогатого скота и 183 пункта по бруцеллезу мелкого рогатого скота, в которых заболело бруцеллёзом 139790 голов крупного рогатого скота и 21252 головы мелкого рогатого скота. Например, только в 2003 году в этом регионе выявлено 103 неблагополучных населенных пункта, в которых зарегистрировано 8527 больных животных, в то время, как в 1992 году числилось неблагополучными по бруцеллёзу мелкого рогатого скота всего 20 пунктов.

С сохранением эпизоотической напряженности в регионах с развитым животноводством (особенно овцеводства) эпидемиологическая обстановка остаётся сложной. Так, по данным Госсанэпиднадзора в Российской Федерации ежегодно регистрируется от 400 до 700 человек больных бруцеллёзом, у которых впервые установлен диагноз. Больные регистрируются преимущественно на территориях с развитым овцеводством, что в значительной степени связано с особенностями уклада жизни у людей и потреблением продуктов от инфицированных овец и коз (молоко, мясо, сыр).

В среднем 47% больных от общего числа на территории Российской Федерации бруцеллезом людей выявляются в Северо-Кавказском Федеральном округе и до 15% в Приволжском Федеральном округе.

По данным Госсанэпиднадзора, пик заболеваемости людей бруцеллёзом зарегистрирован в 1993 году. Было выявлено 755 человек вновь инфицированных. В течение последнего десятилетия почти в 3 раза увеличилось число заболевших детей в возрасте до 14 лет в общей заболеваемости «впервые диагностированного» бруцеллеза с 5 до 15%, что является показателем напряженной эпидемиологической ситуации по бруцеллезной инфекции. Периодически регистрируются коллективные заболевания людей с числом заболевших 10 и более человек.

Ослабление контроля за проведением противобруцеллезных мероприятий на животноводческих объектах, несоблюдение руководителями животноводческих хозяйств и владельцами скота в частном секторе ветеринарного законодательства способствуют появлению и распространению скрытых очагов инфекции, о чем свидетельствует регистрация больных людей на территориях, где выявлены больные бруцеллезом сельскохозяйственные животные. Проведение умелых, научно обоснованных, подтверждённых опытом и практикой прошлых лет, противоэпизоотических мероприятий позволит достичь желаемого результата.

Не менее важным является ликвидация бруцеллёза в эпидемиологическом отношении, так как больные бруцеллезом животные являются источником инфекции для людей. Однако ликвидация этой болезни представляет большую проблему, требующую значительных трудозатрат и материальных средств на проведение комплекса ветеринарно - санитарных и организационно -хозяйственных мероприятий.

Восприимчивость к бруцеллёзу всех видов домашних животных, а так же человека, определяет его социально - экономически значимой инфекцией. Бруцеллёз регистрируют наиболее часто в регионах Поволжья, Урала и Северного Кавказа.

В соответствии с целями и задачами утвержденной 27 октября 2008 г. председателем Правительства Российской Федерации В.В.Путиным федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы)» необходимо разрабатывать и внедрять современные методы, средства защиты и технологии производства для обеспечения защиты населения и окружающей среды от негативных влияний и угроз, вызванных факторами химического и биологического характера, что делает решение рассматриваемого вопроса актуальным.

В общем комплексе оздоровительных мероприятий при бруцеллезе важную роль занимает вакцинация животных. В борьбе с бруцеллезом крупного рогатого скота нашли свое применение вакцины на основе штаммов В.abortus из штаммов 19, 82, 75/79 - АВ, а так же адъювантная вакцина с использованием штамма В. abortus KB 17/100, и мелкого рогатого скота на основе штамма В. abortus 19 и B.melitensis Rev-1.

По данным сотрудников ООО «Агровет» потребность в вакцине против бруцеллеза на основе штамма B.melitensis Rev-1 на территории Российской Федерации и стран ближнего зарубежья составляет более 10 млн. доз в год, что также является серьезной предпосылкой для совершенствования технологии ее приготовления.

Биологические особенности микробных культур вакцинных штаммов бруцеллеза (повышенные питательные потребности, длительность выращивания, наличие диссоциации и др.) делают производство препаратов на их основе дорогостоящим из-за высокого процента брака, довольно высокой себестоимости исходного сырья и значительных потерь на стадии концентрирования. В условиях коммерциализации эти причины привели к резкому снижению объемов производства бруцеллезных вакцин.

Таким образом, приготовление препарата с необходимым содержанием количества прививочных доз во флаконе (ампуле) за счет повышения выхода микробных клеток вакцинного штамма при сохранении их видовых и иммуногенных свойств на этапах концентрирования и лиофилизации обеспечивает рентабельность производства и является актуальной задачей.

Цель настоящей работы состоит в разработке технологии концентрирования глубинной культуры вакцинного штамма Brucella melitensis Rev-1 для приготовления живой сухой вакцины против бруцеллеза овец и коз.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. На основании проведенного анализа данных литературы о патогенных свойствах вакцинных штаммов возбудителя бруцеллеза, его культуральноморфологических свойствах, методах культивирования микроорганизмов обосновать выбор способа концентрирования бруцелл;

2. Обосновать выбор аппаратуры для проведения процесса концентрирования;

3. Определить режимы подготовки оборудования, параметры ведения процесса, обеспечивающие получение концентрированных микробных культур вакцинного штамма Brucella melitensis Rev - 1 при сохранении регламентированных биологических свойств;

4. Оценить качество бруцеллезной живой сухой вакцины и ее полуфабрикатов, полученных с использованием вновь разработанной технологии концентрирования, и выдать заключение о ее соответствии нормативным требованиям.

На защиту выносятся следующие основные научные положения и результаты исследования:

1. Возможность концентрирования глубинных культур вакцинного штамма Brucella melitensis Rev-1, с использованием установки «Сартокон - 2».

2. Параметры подготовки и стерилизации оборудования.

3. Параметры процесса концентрирования, обеспечивающие получение микробных концентратов бруцелл в промышленных условиях и воспроизведение технологического процесса концентрирования.

4. Возможность получения готового препарата вакцины против бруцеллеза овец и коз, отвечающего требованиям НД, на основе микробных концентратов, полученных мембранным способом.

Научная новизна заключается в том, что впервые при производстве сухой бруцеллезной вакцины разработана и внедрена в практику технология концентрирования глубинных культур вакцинного штамма Brucella melitensis Rev-1 на пористых мембранах в режиме проточной фильтрации; теоретически и экспериментально обоснован материал мембран и диаметр их пор; отработаны режимы подготовки оборудования и параметры ведения процесса, обеспечивающие получение вакцинного препарата с высоким содержанием иммунизирующих доз в единице объема и отвечающего требованиям нормативной документации.

Практическая значимость работы состоит в том, что на основании предложенных автором технологических решений и методических приемов, обосновано включение в действующий регламент производства РП №938420017-46392258 стадии концентрирования с использованием установки «Сартокон - 2», определены последовательность выполняемых операций, точки и показатели контроля ведения процесса концентирования, обеспечивающие воспроизведение технологического процесса приготовления вакцины, соответствующей требованиям НД.

По результатам диссертации опубликовано 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК.

Материалы диссертации доложены на Всероссийской научной конференции молодых ученых «Наука - производство - технология -экология.» (г.Киров, 2010).

Полученные результаты реализованы в следующих документах:

1. Ведомость изменений № 1 к регламенту производства РП №938420-01746392258 «Вакцина против бруцеллеза овец и коз и инфекционного эпидидимита баранов из штамма Brucella melitensis Rev-1 живая сухая»; утверждена заместителем генерального директора ООО «Агровет» по производству 19.03.2011 г.

2. Инструкция по подготовке установки «Сартокон - 2» и проведению процесса концентрирования глубинной культуры штамма Brucella melitensis

Яеу-1 на установке «Сартокон - 2»; утверждена заместителем генерального директора ООО «Агровет» по производству 19.03.2011 г.

Автор лично участвовал в планировании и проведении экспериментов по отработке технологии концентрирования и получения конечной формы вакцины бруцеллезной живой сухой.

Сухая живая бруцеллезная вакцина, приготовленная с использованием мембранного метода концентрирования, испытывалась совместно с З.М. Бедоевой, Г.В.Комоско, С.М.Кузнецовым, С.П.Коржавиной.

Результаты совместных исследований приводятся с согласия соавторов.

Работа была выполнена в период 2006 - 2012 гг. на базе Межвузовского научно-исследовательского центра коллективного пользования ВятГУ и ООО «Агровет» (Кировская обл., пгт Левинцы).

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 109 страницах машинописного текста. Диссертационная работа включает: введение, аналитический обзор, выбор направления исследований, теоретические и экспериментальные исследования, обобщение результатов исследований, выводы и заключение. Список использованной литературы включает 123 источника, из них 100 отечественных, 17 - иностранных и 6 - материалы из сети Интернет. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 17 рисунками, содержит 2 приложения.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Пиков, Александр Васильевич

выводы

1. Выбран и обоснован мембранный способ концентрирования бруцелл.

2. Выбран способ и отработаны режимы стерилизации установки «Сартокон-2».

3. Отработаны режимы концентрирования глубинных культур Brucella melitensis Rev-1 на установке мембранной фильтрации «Сартокон-2».

4. Разработана технология концентрирования глубинных культур вакцинного штамма Brucella melitensis Rev-1, с использованием установки мембранной фильтрации «Сартокон-2».

5. Приготовленные вакцинные препараты на основе микробных концентратов, полученных с использованием разработанной технологии концентрирования, отвечают требованиям НД.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

И в заключение следует отметить, что в начале 2000-х годов в России сложилась напряженная обстановка с обеспечением средствами профилактики, лечения и диагностики бруцеллеза мелкого рогатого скота.

Как известно, одним из основных средств профилактики бруцеллезной инфекции является вакцина бруцеллезная живая сухая из штамма Brucella melitensis Rev - 1. Однако используемая в технологии производства недостаточно стандартная схема концентрирования нативных культур не всегда позволяет гарантированно получать полуфабрикаты бруцеллезной вакцины.Решение этой проблемы представлялось возможным с помощью новых технологий, предусматривающих внедрение мембранной техники.

Учитывая вышеизложенное, основной целью настоящей работы являлась разработка технологии концентрирования культуры глубинной культуры вакцинного штамма Brucella melitensis Rev-1 для приготовления живой сухой вакцины против бруцеллеза овец и коз.

На первом этапе настоящей работы была оценена возможность использования мембранной техники для получения концентратов вакцины, оценены материалы мембран, способ и режимы их стерилизации. Показано, что использование мембран «Ультрасарт» на основе полисульфона с диаметром пор 300 кДа позволяет получать кондиционные концентраты, отвечающие требованиям НД. Также показана целесообразность использования мембран на основе полисульфона с диаметром пор 300 кДА, по сравнению с другими типами изученных мембран.

Исследовано влияние параметров процесса стерилизации на показатели качества подготовки мембранной техники.

На заключительном этапе работы были получены серии вакцины бруцеллезной живой сухой, приготовленной с использованием разработанной технологии концентрирования. Образцы препаратов, как свидетельствуют их испытания, по показателям качества полностью соответствовали требованиям НД.

Таким образом, в результате проведенных исследований разработаны требования к материалам мембран, выбрана установка, отработаны режимы ее стерилизации и концентрирования, позволяющие получать полуфабрикаты вакцинных штаммов возбудителей бруцеллеза и готовить на их основе вакцину бруцеллезную живую сухую, соответствующую требованиям на вакцинный препарат.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пиков, Александр Васильевич, Щёлково

1. М.В. Гусев, Минеева Л.А. Микробиология.-М.: Академия, 2003. -464 с.

2. Бруцеллез сельскохозяйственных животных. Под редакцией профессора И. А. Косилова.- Новосибирск, 1999.

3. Авилов В.М, Бруцеллез животных и его специфическая профилактика /В.М. Авилов, В.В. Селиверстов, В.Ф. Пылинин и др.// Ветеринария.- 1997.-№7.-С. 3-13.

4. Авилов В.М. Состояние и перспектива специфической профилактики бруцеллеза овец /В.М. Авилов, И.А. Косилов, П.К. Аракелян Ветеринария. -1999. №3. С. 8-12.

5. Шумилов К.В. Бруцеллёз животных и его специфическая профилактика / Шумилов К.В., Авилов В.М., Калмыков В.В// Ветеринария. -1997.-№4.-С. 3-13.

6. Шумилов К.В., Скляров О.Д. Бруцеллез животных в России и его специфическая профилактика// Сб. науч. тр. ВГНКИ.-М., 2005.-С. 182-187.

7. Авилов В.М. Специфическая профилактика при бруцеллезе овец в экспериментальных условиях /В.М. Авилов, И.А. Косилов, П.К. Аракелян// Ветеринария.- 2002. № 11.- С. 9-12.

8. Таран И.Ф. Бруцеллез (микробиология, иммунология, эпидемиология, профилактика) / Таран И.Ф., Лямкин Г.И. // Ставрополь: БОТХН, 1996.-176с.

9. Кассал Б.Ю. «Бруцеллёз сельскохозяйственных животных». Омск 1989 г. С. 88-98.

10. Ашепа М.Б. Опыт оздоровления хозяйств от бруцеллеза /М.Б. Ашепа, Н.В. Маковеев, А.Т. Баннов//Ветеринария. -1973. -№2.-С.47-48.

11. Иванов М.М. Оценка эффективности противобруцеллезных вакцин из штаммов 82, 89/23, Н-12 и Rev-1 /М.М.Иванов // Ветеринария. 1971. -№7.-С. 32-34.

12. Иванов A.A. Сравнительная характеристика противоэпизоотической эффективности некоторых противобруцеллезных вакцин в овцеводческих хозяйствах. Автореф. дис. к.в.н. Омск, 1996.-20 с.

13. Юсупов О.Ю. Результаты испытания вакцины из штамма B.melitensis Rev-1 для иммунизации овцематок и ярок /О.Ю. Юсупов, JI.B. Малушко, Г, Хаитов //Труды ДагНРГОИ. 1984. С. 7-9.

14. Абылдаев М.А. Материалы сравнительного производственного испытания вакцин из штаммов 53Н38 и 45/20, 19 и Рев-1 /Абдылдаев М. А., Шумилов К.В., Ким В.И. и др. //Меры борьбы с болезнями с.-х. животных и птиц в Киргизии.-1988.-Вып. 2.- С. 52-60.

15. Бруцеллез. Под редакцией Вершиловой П.А. -М.: Медицина, 1972 г.-439 с.

16. Уласевич П.С. Стабильность свойств штамма B.melitensis Rev-1. /П.С. Уласевич//Труды ВИЭВ,- 1965.- Т.31,- 18-25.

17. Alton G.G. Rev.l Brucella melitensis vaccine. The stability of the degree of attenuation /G.G. Alton S.S. Elberg., D. Crouch, J.Comp.// Path.- 1967.-Vol.77.- P.293-300.

18. K.B. Шумилов. Эталонная серия вакцинного штамма B.melitensis Rev-1. / K.B. Шумилов, У.Э. Ниязов, H.A. Михайлов и др.// Сборник научных трудов ВГНКИ. М. -1983. С. 3-11.

19. Бровик Е.А. Реактогенность овец при различных способах иммунизации вакциной из штамма B.melitensis Rev-1 Е.А. Бровик Бюл.ВИЭВ, 1990.-ВЫП.75.-С.25-27.

20. Клочков Г.С., Скореев A.A. Реактогенность вакцины из штамма Рев-1. Пути совершенствования профилактики и диагностики бруцеллеза с.-х. животных Сб. науч. тр, Омск, 1990. 58-62.

21. Уласевич П.С., Аливердиев A.A., Юсупов О.Ю. и др. Сравнительное изучение на овцах иммуногенных свойств бруцеллезных вакцин из штаммов B.melitensis Rev-1 и В.abortus 19. Сб.науч.тр. ДагНИВИ.-1972. Т.5. 70-80.

22. Уласевич П.С., Аливердиев A.A., Юсупов О.Ю. Иммунизация овец вакциной из штамма Brucella melitensis Rev-1 //Ветеринария.-1975.-№12.-С. 57-59.

23. Иванов Н.П. и др. Состояние иммунитета против бруцеллеза у овец в различные сроки после вакцинации и ревакцинации вакциной из штамма Рев-1//Меры борьбы с туберкулезом и бруцеллезом с.-х. животных в Казахстане.- Алма-Ата, 1986.- С. 16-26.

24. Юсупов О.Ю. Опыт борьбы с бруцеллезом овец//Ветеринария.-1983.-№6.-С. 15-16.

25. Шумилов К.В., Акулов А.В. Изучение вакцинных штаммов Brucella abortus 104-М, Brucella melitensis Rev-1, Brucella abortus 82. //Tp. ВИЭВ.-1977.-T.45.-C.29-36.

26. Скляров О.Д. Влияние инертных газов на сохранность свойств бруцелл в вакцине из штамма Brucella abortus 19. Дис к.в.н. на правах рукописи. Москва, 1990.- 117 с.

27. Щукин Е.Д., Перцов А.В., Амелина Е.А. Коллоидная химия. М.: Высшая школа, 1992.

28. Уонг Д., Кооней Ч., Демайн А. и др. Ферментация и технология ферментов. Пер. с англ. М.: Легкая и пищевая пром. 1983г. 336 с.

29. AL-Malack М.Н. Technical and economic aspects of crossflow microfiltration// Desalimination, 2003, V. 155, No. 1, P. 89-94.

30. Соколов В.И. Современные промышленные центрифуги. М.: Машиностроение. 1967. 522 с.

31. Т. Брок. Мембранная фильтрация. М.: Мир, 1987.-464 е., с ил.

32. Свитцов А.А. Введение в мембранные технологии. М.: ДеЛи принт, 2007, 280 с.

33. Mulder М. Basic principles of membrane technology. Dodrecht: Kluwer Academic, 1995.

34. Кисиленко П.Н. Разработка электрофлотационной технологии концентрирования биосуспензий из технологических растворов и сточных вод. Автореф. дис. к.т.н., 2002.- 21 с.

35. О.В.Смирнов, С.В.Воробъева. Биосистемы. Реферат. Тюменский центр Международной Академии наук экологии и безопасности жизнедеятельности.// Режим доступа: www.roman.by|r-12984.html.

36. А.А.Баран, А.Я. Тесленко. Флокулянты в биотехнологии. Ленинград, «Химия», Ленинградское отделение, 1990.

37. Тесленко А .Я., Гирфанова Ф.А., Медведев Ю.В., Концентрирование суспензий микроорганизмов с помощью флокулянтов.- М., 1984.

38. Тимофеева С. Сточные воды предприятий молочной промышленности и современные методы их обезвреживания. Химия и технология воды, 1992, т.14,№8-С. 610-618.

39. Равич-Щербо М.И., Анненков Г.А. Физическая и коллоидная химия. М.:1968, 240 с.

40. Фридрихсберг Д.А. Курс коллоидной химии. Л.:Химия, 1984, 368 с.

41. Бортников И.И., Босенко A.M. Машины и аппаратымикробиологических производств. -Минск: Вышэйшая школа, 1982. -400 с.

42. Шкоп Я.Я. Фомченко Н.В. Агрегация клеток микроорганизмов в процессе разделения микробных суспензий.- М.: ИНТИТЕЙ микробпром, 2002.-60с.45.3апольский А.К., Бирни А.А. Коагулянты и флокулянты в процессе очистки воды.-Л.: Химия, 1987, -203 с.

43. Бабенко Ю.Д. Очистка воды коагулянтами.- М.:Наука, 2000.- 487 с.

44. Золотов Ю.А. Основы аналитической химии в двух книгах. Книга 1. Общие вопросы. Методы разделения. Учеб. для вузов.-2-е изд., перераб. и доп.- М.: Высш. шк., 2000.- 351 е., с ил.

45. Р.Г. Кочаров, Г.Г. Каграманов. Расчет мембранного разделения жидких смесей. РХТУ им. Д.И. Менделеева.-М.,2001.-128 с.

46. Bowen W.R., Jenner F. Theoretical descriptions of membrane filtrations of colloids and fine particles: an assessment and review// Adv. Colloid Interface Sci., 1995, V. 56, P. 141-200.

47. Жужиков B.A. Фильтрование. M.: Химия, 1971.

48. Патент РФ № 2077216 A23C19/02 A23C19/024 1997. Способ осаждения белков молока.5 2. Патент РФ № 2065703 A23J1/20 A01J11/00 1996. Способ изоэлектрической коагуляции белков молочной сыворотки и электролизер для его осуществления.

49. Измайлова В.Н. Нарушение устойчивости дисперсных систем -основа очистки сточных вод// Итоги науки и техники. М.: ВИНИТИ, 1988. -20,- 6-33.

50. Мархасин И.Л., Утящева Л.Х., Назаров В.Д. Физико-химические методы очистки сточных вод// Итоги науки и техники. -М.:В1ШИТИ, 1977. 20.-С. 34-59.

51. C.B. Яковлев, И.Г. Краснобородько, В.М. Рогов. Технология электрохимической очистки воды. Ленинград. Стройиздат. Ленинградское отделение, 1987.

52. Господинов Д.Г., Шкарин A.B., Способ электрохимической очистки сточных вод от взвешенных частиц и нефтепродуктов. Патент РФ № 2307797.

53. Патент РФ № 2094384 С 02 F 1/463, 1/465, 1997. Электрохимический способ очистки белковосодержащих жидких сред и устройство для его осуществления.

54. Кисиленко П.Н., Тушев A.A., Колесников В.А. Разработка электрофлотационной технологии концентрирования белковых веществ из растворов. Успехи в химии и химической технологии: Тез. докл.: Вып. XIV: Ч.5./РХТУ им. Д.И. Менделеева. М., 2000., с.40.

55. Дытнерский Ю.И. Мембранные процессы разделения жидких смесей. М., «Химия», 1975, 232 с.

56. Дытнерский Ю.И. Обратный осмос и ультрафильтрация. М.: Химия, 1978,- 352 с.

57. С.Т. Хванг, К. Каммермейер. Мембранные процессы разделения. М.: Химия, 1981.

58. М. Мудлер. Введение в мембранную технологию. М.: Мир, 1999, 513 с.

59. Лейси P.E., Леб С. Технологические процессы с применением мембран. М.: Мир, 1976, С. 240-269.

60. М.Т. Брик. Энциклопедия мембран в двух томах. «Киево-Могилевская академия» 2005 Г.-660 с.

61. Н.П. Блинов. Основы биотехнологии. Издат.: Наука, 1995. 600 с.

62. Начинкин О.И. Полимерные микрофильтры. М.: Химия, 1985.-216 е., с ил.

63. Концентрирование белоксодержащих растворов.// Режим доступа: www.septech.ru.

64. Ультра и микрофильтрация.// Режим доступа: www.membrane.msk.ru.

65. Новый подход к управлению рисками при производстве ЛС.// Режим доступа: www.healtheconomics.ru.

66. Крашенюк А.И. Способ получения живой гриппозной вакцины. Патент РФ №2033182.

67. Новиков В.И., Баталова Т.А. Способ получения антитоксической сыворотки. Патент РФ № 2062617.

68. Казьянин A.B. Стратегия и тактика использования отечественных медицинских иммунобиологических препаратов в системе эпидемиологического контроля за HBV-инфекцией. Автореф. дисс. на соиск. уч.ст. дмн. на правах рукописи, 2005.

69. Петров В.Ф., Николаева A.M., Казьянин A.B., Пархоменко Т.Г., Борисова В.Н., Мельников В.А., Буданов М.В. Противовирусный препарат и способ получения иммуноглобулина для профилактики и лечения вирусных заболеваний. Патент РФ №2144379.

70. Долгов Д.Л. Конструирование ассоциированной пятивалентной вакцины против вирусных болезней птиц инактивированной эмульсионной. Автореф. дисс. на соиск. уч.ст. к.в.н. на правах рукописи, 2008.

71. Анкер С.С., Лещенко А.А., Комоско Г.В., Шевцов А.Н., Савельев С.П. Способ концентрирования споровых культур в производстве сибиреязвенных вакцинных препаратов. Патент РФ № 2151798.

72. Брык М.Т., Цапюк Е.А. Ультрафильтрация. АН УССР. Ин-т коллоидной химии и воды им. А.В. Думанского.- Киев: Наук, думка, 1989, 283 с.

73. Стромберг А.Г., Семченко Д.П. Физическая химия. -4-е изд., испр. -М.: Высш. шк., 2001. 527 С., с ил.

74. Jonson G, Dialisis// Synthetic membranes: science, engineering and applications/ Ed. by P.M. Bungay, H.K. Lonsdale and M.N. de Pinto. Dordrecht: D. Reidel Publishing company, 1986.

75. Polotsky A.E., Cherkasov A.N. Mechanism of selective transport through ultrafiltration membranes from the standpoint of generalized sieving model // 41st Microsymposium on Polymer Membranes. Praque, July 15-19, 2001. Book of Abstracts, p. 57.

76. Lee S., Park G., Amy G., Hong S.-K., Moon S.-H., Lee D.-H., Cho J. Determination of membrane pore size distribution using the fractional rejection of nonionic and charged macromolecules// J. Membr. Sci., 2002. V. 201, No. 1-2, P. 191-201.

77. Nakao S. Determination of pore size and pore size distribution. 3. Filtration membranes // J. Membr. Sci. 1994. V. 96, p. 131-165.

78. Sleytr U.B., Sara M. Ultrafiltration membranes with uniform pores from crystalline bacterial cell envelope layers (Mini-review) // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1986. V. 25, p. 83-90.

79. Cornelissen E.R., van den Boomgaard Th., Strathmann H. Physicochemical aspects of polymer selection for ultrafiltration and micro filtration membranes// Colloids and Surfaces, Ser. A, 1998, V. 138, No. 2-3, P. 283-289.

80. Drioli. Membrane Science And Technology. Elsevier Science. 2005. 516 P.

81. Baker R.W. Membrane Technology and Applications. Wiley. 2004.

82. Rijn C.J. Nano and Micro Engeneered Membrane Technology. Elsevier Science & amp; Technology Books. 2004. P. 399.

83. Z.F. Gui, H.S. Muralidhara. Membrane Technology. ButterworthHeinemann. 2010. P. 312.

84. Поляков B.C., Максимов Е.Д., К вопросу моделирования процесса проточной микрофильтрации// ТОХТ, 1995, Т. 29, №3, С. 300-308.

85. Поляков С.В., Максимов Е.Д., Поляков B.C. Об одномерной модели микрофильтрации// ТОХТ, 1995, Т. 29, №4, С. 357-361.

86. Поляков Ю.С., Казенин Д.А., Максимов Е.Д., Поляков С.В. Кинетическая модель объемной фильтрации с обратимой адсорбцией// ТОХТ, 2003, Т. 37, №5, С. 471-478.

87. Баренблатт Г.И., Ентов В.М., Рыжик В.М. Теория нестационарной фильтрации жидкости и газа. М., «Недра», 1972.

88. И.В. Тихонов, Е.А. Рубан, Т.Н. Грязнева, А.Я. Самуйленко, В.А. Гаврилов. Биотехнология. СПб.: ГИОРД, 2005.

89. Поляков С.В. Концентрационная поляризация в узком канале с полупроницаемыми стенками и турбулизатором// ТОХТ, 1992, Т. 26, №4, С. 534-539.

90. Briant P.L.T. Concentration polarization in reverse osmosis desalimination with variable flux and incomplete salt resection// Ind. Eng. Chem. Fundam., 1965, V. 4, No. 4, Р/ 439-445.

91. Поляков C.B., Максимов Е.Д. К расчету процесса ультрафильтрации в плоском канале при образовании геля на поверхности мембраны// ТОХТ, 1986, Т. 20, №4, С. 448.

92. Bowen W.R., Yousef H.N.S., Calvo J.I., Dynamic crossflow ultrafiltration of colloids: a deposition probability cake filtration approach// Separ. Purif. Technol., 2001, V. 24, P. 297-308.

93. Hong S., Faibish R.S., Elimelech M. Kinetics of Permeate Flux Decline in Crossflow Membrane Filtration of Colloidal Suspensions// J. Colloid Interface Sci., 1997, V. 196, No. 2, P. 267-277.

94. H.C. Орлов. Ультра- и микрофильтрация. Теоретические основы. М. МХТИ. 1990.

95. Дытнерский Ю.И. Баромембранные процессы. Теория и расчет. М.: Химия, 1986, 272 с.

96. Черкасов А.Н., Пасечник В. А. Мембраны и сорбенты в биотехнологии. -JL: Химия, 1991.-240 с.

97. Chercasov A.N., Pokotsky А.Е., Critical partical-to-pore size ratio in ultrafiltration//J. Membr. Sci., 1995, V. 106, No. 1-2, P. 161-166.

98. Дубяга В.П., Перепечкин Jl.П., Каталевский Е.Е. Полимерные мембраны. М.:. Химия, 1981.-231 с.

99. Jonsson С., Jonsson A.-S. Influense of the membrane material on the adsorptive fouling of ultrafiltration membranes// J. Membr. Sci., 1995, V. 108, No. 1-2, P. 79-87.

100. McGure K.S., Lawson K.W., Lloyd D.R. Pore size distribution determination from liquid permeation through microporous membranes// J. Membr. Sci., 1995, V. 99, No. 2, P.127-137.

101. Использование ультрафильтрации в процессе переработки молока.// Режим доступа: www.worldreferat.ru .

102. Установки микрофильтрационные.// Режим доступа: www.chemanalitica.com .

103. Ковалев С.В., Хрипков Ю.И. Процессы и аппараты биотехнологии.-М.: ВАХЗ, 1998.

104. Поляков Ю.С. Ультра- и микрофильтрация в половолоконных аппаратах с образованием осадка на поверхности мембран. Дис. на соиск. уч. ст. к.т.н. Москва, 2004, 150 с.

105. Лялин В.А. Теория, практика создания и внедрения аппаратов и установок для ультрафильтрации биологических растворов и сушкиполучаемых растворов. Автореф. дис. на соиск. учен. степ. д.т.н.- М., 1991.-53 с.

106. Зенов Н.И. Совершенствование технологии производства вакцины против бруцеллеза из штамма Brucella abortus 82. Автореф. дис. на соиск. учен. степ, канд.вет.наук.- М., 1992.-18 с.

107. Рахимбаев С.Ж. Технология непрерывного культивирования Brucella melitensis Rev-1 в биологических реакторах. Дисс. на соиск. уч.ст. к.вет.н. Алма-Ата, 2007.- 140 с.

108. Регламент производства РП №938420-017-46392258 «Вакцина против бруцеллеза овец и коз и инфекционного эпидидимита баранов из штамма Brucella melitensis Rev-1 живая сухая» ООО «Агровет», 2007.

109. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях.- Л.: Медгиз, 1962.

110. Инструкция по эксплуатации установки «Сартокон-мини», Владимир, «Владисарт», 2001.

111. Паспорт на мембрану «Ультрасарт» на основе полисульфона с диаметром пор 300 кДа для установки «Сартокон-мини», Владимир, Владисарт, 2007.

112. Паспорт на мембрану «Микросарт» на основе полипропилена с диаметром пор 0,2 мкм для установки «Сартокон-мини», Владимир, Владисарт, 2007.

113. Паспорт на мембрану «Микросарт» на основе ацетата целлюлозы с диаметром пор 0,2 мкм для установки «Сартокон-мини», Владимир, Владисарт, 2007.

114. Паспорт на мембрану «Микросарт» на основе ацетата целлюлозы с диаметром пор 0,45 мкм для установки «Сартокон-мини», Владимир, Владисарт, 2007.

115. Инструкция по эксплуатации установки ультра-микрофильтрации «Сартокон-2», Владимир, «Владисарт», 2001.

116. Дж. Ф. Уокер. Формальдегид, пер. с англ. П.П. Коржева. М.: 1957, 608 с.

117. Парр Г.С., Рожанская Т.И. Ультрафильтрационные процессы выделения биологически активных веществ. М.: ЦБНТИ Медбиопрома, 1986. Вып. 6, 32 с.

118. Паспорт на мембрану «Ультрасарт» на основе полисульфона с диаметром пор 300 кДа для установки «Сартокон-2», Владисарт, 2007.

119. ВЕДОМОСТЬ ИЗМЕНЕНИИ №1 к регламенту производства РП №938420-017-46392258 «Вакцина против бруцеллеза овец и коз и инфекционного эпидидимита баранов из штамма Brucella melitensis Rev-1 живая сухая»г. Киров, 2011

120. УТВЕРЖДАЮ» Заместитель генерального директор ООО «Агровет Комоско Г ВТ^уЛ^^2/^г2011 г

121. Инструкция по подготовке установки «Сартокон-2» и проведению процесса концентрирования глубинной культуры штамма Brucella melitensis Rev-1 на установке «Сартокон-2»г. Киров, 2011