Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Получение антигенов Brucella melitensis Rev-1 и Brucella abortus 19 BA и оценка перспективности их использования в качестве основы противобруцеллезной вакцины

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Получение антигенов Brucella melitensis Rev-1 и Brucella abortus 19 BA и оценка перспективности их использования в качестве основы противобруцеллезной вакцины"

КРЫКАНОВ Артем Александрович

Получение антигенов Brucella melitensis Rev-1

и Brucella abortus 19 В А и оценка перспективности их использования в качестве основы противобруцеллезной вакцины

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология. 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2010

004605056

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (ФГОУ ВПО МГАВМиБ)

Научный руководитель: член-корреспондент РАСХН,

доктор биологических наук, профессор Девришов Давуд Абдулсемедович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук

Скляров Олег Дмитриевич; доктор биологических наук, профессор Кузнецов Дмитрий Павлович

Ведущая организация - ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности»

Защита диссертации состоится «£9» илОил 2010 г. в «-Щ » часов на заседании диссертационного совета Д.220.042.01 в ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23. тел. (495) 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».

Автореферат разослан «<33 » ичо &_2010 г. и размещен

на сайте http://mgavm.ru.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Грязнева Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема ликвидации бруцеллеза животных в Российской Федерации окончательно не решена, что подтверждается возникновением новых очагов данного заболевания в различных регионах России (Янышев А.А., 2007, Скляров О.Д., 2008).

Наиболее значимым элементом в системе профилактики бруцеллеза является вакцинопрофилактика болезни (Литвинов О.Б., 2007).

В нашей стране и за рубежом проводятся исследования по разработке и оценке эффективности различных препаратов для специфической профилактики бруцеллеза. Несмотря на это, в РФ до настоящего времени официальное признание имеет живая вакцина на основе штамма В. abortus 19. С 1952 года данная вакцина широко используется для иммунизации животных. В то же время установлено, что напряженность иммунитета, обусловленного введением живой вакцины на основе аттенуированного штамма В. abortus 19, с течением времени быстро снижается. Это определяет сравнительно невысокий ее защитный эффект.

В качестве альтернативы живым вакцинам разрабатываются инактиви-рованные вакцины против бруцеллеза животных. В этом направлении поиск преимущественно направлен на изыскание щадящих способов инактивации микроорганизмов, а также на разработку методов выделения структурных компонентов бруцелл, сохраняющих полноценными их иммуно-генные свойства.

Поэтому, выбор оптимальной антигенной основы для создания проти-вобруцеллезных вакцин для животных является актуальной задачей для ветеринарии.

Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований - получить различные антигены культур штаммов Brucella melitensis Rev-1 и Brucella abortus 19 BA и оценить перспективность их использования в качестве основы противобруцеллезной вакцины для мелкого рогатого скота.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

з

1. Получить посевные культуры штаммов В. те1кегшз Яеу-1 и В.аЬоПиз 19 ВА при культивировании их на плотных и жидких питательных средах.

2. Провести культивирование В. теШег^Б Яеу-1 и В.аЬоПш 19 ВА в биореакторах марки «Биор 0,25» и сконцентрировать их биомассу методом ультрафильтрации.

3. Получить субклеточные фракции культур штамма В. теШег^э различной функциональной направленности.

4. Получить корпускулярные антигены культур штаммов В.теМегтаБ Яеу-1 и В.аЬоЛш 19 ВА и приготовить комбинированный корпускулярный антиген изучаемых бруцелл.

5. Смоделировать инфекционный процесс при бруцеллезе на лабораторных животных и разработать метод обострения течения инфекции.

6. Изучить иммуногенность приготовленных антигенов бруцелл в опытах на лабораторных животных.

7. Изучить иммуногенность комбинированного инактивированного корпускулярного антигена в опытах на овцах.

Научная новизна. Впервые получен комбинированный инактивиро-ванный корпускулярный антиген на основе культур штаммов В. теШег^ Леу-1 и В.аЬоЛш 19 ВА в соотношении 1:2, обладающий иммуногенными свойствами. Титр антител у иммунизированных морских свинок и овец составил не менее 1:50.

Применение комбинированного инактивированного корпускулярного антигена для специфической профилактики бруцеллеза у овец позволяет предотвратить заражение бруцеллезом 80% животных.

Полученные методом гель-хроматографии белковые фракции В. теШ-еп51з Яеу-1 с молекулярной массой (135±15) кД, (50±10) кД и (25±5) кД обладают слабыми иммуногенными свойствами и являются не перспективными для создания на их основе вакцинных препаратов для специфической профилактики бруцеллеза животных.

Впервые установлено, что введение иммунодепрессанта циклофосфана в дозе 200 мг/кг веса животного на 21-30 сутки после инфицирования возбудителем бруцеллеза обеспечивает обострение инфекционного процесса и

4

повышает на 20% информативность бактериологического метода обследования искусственно зараженных морских свинок и овец.

Применение усовершенствованного бактериологического метода выявления больных бруцеллезом животных с обострением инфекционного процесса при использовании циклофосфана позволило доказать высокую антибактериальную эффективность пефлоксацина в отношении бруцелл у зараженных бруцеллезом морских свинок. Терапевтическая эффективность пефлоксацина в условиях смоделированного инфекционного процесса при бруцеллезе составила 90%.

Впервые разработан метод глубинного культивирования культур штаммов В. теШегшБ Ясу-1 и В.аЬоЛш 19 ВА с использованием биореакторов марки «Биор-0,25». Выход биомассы при выращивании культуры штамма В.теЖегшБ Яеу-1 был выше в 1,3 раза, чем В.аЬоШ« 19 ВА.

Практическая значимость. На производственном участке ООО «Аг-ровет» (г. Киров-200) воспроизведена технология глубинного культивирования культур штаммов В. теШеп51з Леу-1 и В.аЬогШэ 19 ВА с использованием биореакторов марки «Биор-0,25». Получено по 3 серии культур штаммов бруцелл с высоким выходом бактериальной массы.

На базе лицензированной по работе с микроорганизмами 1-1У групп па-тогенности лаборатории НИИ микробиологии МО РФ (г. Киров) успешно проведено моделирование инфекционного процесса при бруцеллезе морских свинок и овец. Разработан метод обострения инфекционного процесса с использованием иммунодепрессанта циклофосфана.

Разработанный комбинированный инактивированный корпускулярный антиген на основе культур штаммов В. теШепз18 Яеу-1 и В.аЬоЛш 19 ВА в соотношении 1:2 является перспективным для создания на его основе вакцинного препарата для специфической профилактики бруцеллеза животных.

По результатам исследований составлены и утверждены в установленном порядке 2 отчета о научно-исследовательской работе (промежуточный и заключительный) на тему: «Создание иммунобиологических средств защиты животных на основе корпускулярных коньюгированных и субъеди-

5

ничных компонентов микроорганизмов-возбудителей бактериальных и грибковых (Trichophyton) заболеваний».

Разработаны методические рекомендации: «Технология глубинного культивирования вакцинных штаммов B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА», «Метод обострения инфекционного процесса при бруцеллезе животных», «Получение растворимых и корпускулярных антигенов бруцелл».

Материалы исследований используются в учебном процессе в ФГОУ ВПО МГАВМиБ при изучении дисциплин «Иммунология», «Ветеринарная микробиология» и «Биотехнология».

Личный вклад соискателя. Автору принадлежит непосредственное участие во всех этапах работы, в т.ч. в культивировании бруцелл поверхностным и глубинным методами, в получении различных белковых фракций бруцелл методом гель-хроматографии, создании комплексного корпускулярного инактивированного антигена изучаемых бруцелл, моделировании инфекционного процесса при бруцеллезе на морских свинках и овцах, определении реактогенности и иммуногенности полученных антигенов с использованием лабораторных животных и овец, анализе и обобщении полученных результатов исследований.

В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве с микробиологом производственного участка ООО «Агро-вет», доктором биологических наук, профессором Кузнецовым С.М., которому выражаю глубокую благодарность за помощь и поддержку.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты исследований доложены на научно-практической конференции молодых ученых (Москва, 2006); на XV Московском международном ветеринарном конгрессе, на секции «Болезни крупного рогатого скота» (Москва, 2008); на международной конференции «Наука и образование для целей биобезопасности» (Пущино, 2008); на международной научно-практической конференции «Проблемы увеличения производства продуктов животноводства в России и пути их решения» (г. Дубровицы, 2008).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 4 статьи, в т.ч.

3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК.

6

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 129 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение полученных результатов, практическое использование полученных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (121 источник, в т.ч. 39 - иностранных авторов). Работа содержит 25 таблиц, 14 рисунков, 10 страниц приложений.

На защиту вносятся следующие положения и результаты:

1. Способ получения биомассы культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 В А, методы ее инактивации, дезинтеграции и выделение антигенной основы.

2. Результаты изучения иммуногенности комбинированного корпускулярного антигена В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 В А в опыте на лабораторных и сельскохозяйственных животных.

3. Метод обострения инфекционного процесса при бруцеллезе животных с помощью иммунодепрессанта циклофосфана и повышение информативности бактериологического метода обследования зараженных возбудителем бруцеллеза животных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа была выполнена в 2005-2009 г.г. на кафедре иммунологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ, в лицензированной по работе с микроорганизмами I-IV групп патогенности лаборатории НИИ микробиологии МО РФ (г. Киров), а также на производственном участке ООО «Агровет» (г. Киров-200).

Для получения различных видов антигенов в работе были использованы вакцинные штаммы В. melitensis Rev 1 и В. abortus 19 ВА.

Для моделирования инфекционного процесса на морских свинках и овцах использовали референтный штамм В. melitensis 16 М.

Всего в опытах было использовано 120 белых мышей, 310 морских свинок и 6 баранов.

Было исследовано 64 пробы паренхиматозных органов от морских свинок и 35 проб - от овец, 320 проб сыворотки крови животных, в т.ч.

7

290 - от морских свинок и 60 - от овец.

Работу с бруцеллами проводили в ламинарном боксе Jouan 2-го класса биологической безопасности, с вертикальным потоком MSC 9/12.

Биомассу бруцелл концентрировали на установке УПЛ-0,6.

При получении суммарных белков клеток бруцелл дезинтеграцию культуры штамма В. melitensis Rev-1 проводили методом «замораживания-оттаивания», а также методом УЗД с помощью ультразвукового дезинтегратора MSE.

Гель-хроматографию дезинтегратов бруцелл проводили с использованием колонок размером 1,5x100, заполненных сефадексомв 100.

Для отработки условий культивирования бруцелл в биореакторах была использована аппаратурно-техническая линия корпуса № 2 НИИ микробиологии МО РФ.

Исследования проводили с применением культурально-морфологичес-ких, серологических, бактериологических, иммунологических методов.

Моделирование инфекционного и вакцинального процессов проводили на беспородных морских свинках и баранах романовской породы.

Экспериментальные данные обрабатывали методом корреляционного, вариационного и факторного статистического анализа с использованием пакета компьютерных программ «Statgraphics Plus for Windous», «Statistica 6,0».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение посевных культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА при культивировании их на плотных и жидких питательных средах

Для получения достаточного количества биомассы бруцелл при культивировании их в биореакторах, перед нами стояло 2 задачи: подобрать оптимальный состав жидких и плотных питательных сред для культивирования В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА и получить посевные микробные культуры. Для поверхностного культивирования бруцелл использовали плотную питательную среду на основе Ft- агара, при культивировании на

которой бруцеллы не диссоциируют. Жидкую питательную среду для выращивания бруцелл в бутылях, емкостью 20,0 дм3, готовили на основе гид-ролизата мяса, с содержанием аминного азота 130- 150 мг%.

Посевы культур бруцелл инкубировали при температуре 36-38°С на плотной среде в течение 72-96 ч, в жидкой - в течение 48-82 ч.

Установлено, что более высокой накопительной способностью обладает культура штамма B.melitensis Rev-1. Концентрация живых клеток бруцелл в 1 см3 жидкой питательной среды, полученной при культивировании в бутылях объемом 20 дм3 (B.melitensis Rev-1 - (13±5)х109 м.к./см3; B.abortus 19 ВА - (11±4)х109 м.к./см3), обеспечивает возможность использования бактериальных суспензий бруцелл в качестве посевных культур для выращивания в биореакторах марки «Биор 0,25».

Культивирование В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в биореакторах марки «Биор 0,25»

Следующий этап исследований был направлен на отработку режимов глубинного культивирования культур штаммов B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 В А с использованием биореакторов марки «Биор-0,25».

Питательная среда для выращивания бруцелл в биореакторах была аналогична той, которую использовали при выращивании посевного материала. Посевной материал вносили в биореактор из расчета 1 млн. живых бруцелл на 1,0 см3 питательной среды.

Разработанная технология выращивания культур штаммов B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в биореакторах марки «Биор-0,25» при температуре (37±1)°С, давлении (0,10±0,05) МПа, коэффициенте аэрации (0,7±0,1) дм3/мин, частоте вращения мешалки 120 об/мин, продолжительности культивирования 28 ч, была воспроизводимой.

Было получено по 3 серии культур штаммов B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА с высоким выходом биомассы микробных клеток -(27±7)х109 м.к./см3 и (21±5)х109 м.к./см3 соответственно. Выход биомассы культуры штамма B.melitensis Rev-1 был выше в 1,3 раза, чем B.abortus 19 ВА.

Концентрирование нативных культур изучаемых бруцелл методом ультрафильтрации

На следующем этапе исследований по получению антигенов изучаемых бруцелл, перспективных для использования в качестве основы вакцинных препаратов, необходимо было провести очистку культуральной жидкости от продуктов метаболизма бруцелл и компонентов питательной среды, а также сконцентрировать биомассу бруцелл. С этой целью была использована ультрафильтрационная установка УПЛ-0,6.

Всего было получено около 3 дм3 концентрированной микробной суспензии (KMC) культуры штамма B.melitensis Rev-1, с концентрацией бруцелл (120±20)х109 м.к./см3, и 3 дм3 KMC культуры штамма B.abortus 19 ВА с концентрацией бруцелл (100±20)х109 м.к. /см3.

Получение субклеточных фракций культуры штамма В. melitensis Rev-1

Для получения субклеточных фракций культуры штамма В. melitensis Rev-1 исходным материалом служили дезинтегрированные клетки.

Для дезинтеграции B.melitensis Rev-1 в сравнительном аспекте использовали 2 метода: метод «замораживания-оттаивания» и метод ультразвуковой дезинтеграции.

Было проведено 10 циклов «замораживания-оттаивания» KMC бруцелл. После каждого цикла проводили контроль полноты инактивации бруцелл методом высева проб на чашки Петри с плотной средой на основе Ft-arapa, а также микроскопировали окрашенные по Граму мазки.

Было установлено, что бруцеллы устойчивы к замерзанию и последующему оттаиванию микробной суспензии и только проведение 10 циклов «замораживания-оттаивания» позволяет получать дезинтегрированные культуры штамма B.melitensis Rev-1, не содержащие живые клетки.

Дезинтегрированная культура бруцелл, полученная методом «замораживания-оттаивания» была центрифугирована при 15000 об\мин в течение 30 мин. Часть осадка оставили не отмытой, другую часть осадка дважды отмывали 0,9%-ным раствором NACI методом центрифугирования при

ю

10000 об/мин. 25 мин. Концентрация белка в осадке составила 60 мг/мл. Для фракционирования суммарных белков клеток бруцелл (СБК) использовали осадок и надосадочную жидкость (НОЖ) дезинтеграта (рис. 1).

Рисунок 1. Схема выделения белков B.melitensis Rev-1

Выделение антигенных комплексов B.melitensis Rev-I из дезинтеграта проводили методом гель-хроматографии с использованием колонок размером 1,5x100, заполненных сефадексом G 100. Высота геля составила 80 см. Колонка была уравновешена 0,9%-ным раствором NACI с рН 6,0-6,2.

На рис. 2 представлены белковые фракции бруцелл, разделенные методом гель-хроматографии.

Номер пробы

Рисунок 2. Белковые пики элюата бруцелл

Таким образом, были получены 5 антигенов бруцелл: суммарные белки клеток (СБК) не отмытые; СБК дважды отмытые физраствором; фракция I - (135±15) кД; фракция II - (50±10) кД; фракция III - (25±5) кД.

Полученные антигены не обладали острой токсичностью для белых мышей.

Получение корпускулярных антигенов культур штаммов B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА и приготовление комбинированного корпускулярного антигена бруцелл

Для получения корпускулярных антигенов B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 В А микробную суспензию инактивировали двукратным нагреванием с добавлением формальдегида в течение 1 часа. Применяли температурные режимы 35, 45, 50, 55, 60°С и формальдегид в концентрациях 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5%.

Было установлено, что при добавлении в концентрированную микробную суспензию бруцелл формальдегида до конечной концентрации 0,4% и двукратное нагревание суспензии до 48°С в течение 1 часа приводит к полной инактивации бруцелл и сохранению целостности клеток.

При разработке комбинированного корпускулярного антигена бруцелл в

качестве основы противобруцеллезной вакцины было определено соотношение концентрированной бактериальной суспензии культур штаммов В.теШег^ Леу-1 и В.аЬогШэ 19 ВА, равное 1:2.

Полученные корпускулярные антигены бруцелл не обладали острой токсичностью для белых мышей.

Дальнейшие исследования были направлены на изучение иммуногенно-сти и реактогенности полученных антигенных препаратов бруцелл.

Моделирование инфекционного процесса при бруцеллезе на лабораторных животных

На данном этапе работы перед нами стояли следующие задачи: провести моделирование инфекционного процесса на лабораторных животных и разработать метод обострения течения бруцеллеза; усовершенствовать бактериологический метод диагностики бруцеллеза у зараженных животных; оценить терапевтическую эффективность антибактериальных препаратов при экспериментальном бруцеллезе животных.

Морских свинок в количестве 70 гол. заражали подкожно в паховую область культурой штамма В. теШеп515 16 М, разведенного физраствором, в объеме 1,2 см3 с концентрацией бруцелл 102 м.кл/мл. Контролем служили 10 животных, которым аналогично вводили физраствор.

На 30 сутки после инфицирования 90% зараженных морских свинок положительно реагировало в РА на бруцеллез.

Для обострения инфекционного процесса при бруцеллезе с целью повышения информативности бактериологического метода обследования зараженных животных использовали гормональные, противовоспалительные препараты, иммунодепрессанты.

Для этого зараженных морских свинок разделили на 7 групп по 10 голов в каждой - 6 опытных, 1 контрольная (контроль 1). В качестве «чистого» контроля (контроль 2) использовали 10 морских свинок, которым аналогично опытным группам, вводили физраствор.

Препараты вводили зараженным морским свинкам опытных групп на 30 сутки после инфицирования. Животным обеих контрольных групп вводили

аналогично физраствор. Бактериологическое обследование морских свинок осуществляли перед введением препаратов (на 30 день после заражения), а также через 5, 10 и 20 суток после применения препаратов. От морских свинок отбирали пробы крови и делали посевы крови на Б^агар, эритрит-агар и сывороточно-декстрозный агар (табл 1).

Таблица 1. Результаты иммунодепрессивного действия различных групп фармакологических препаратов на организм инфицированных культурой штамма В. теШегшэ 16 М морских свинок

Кол-во Положительно Положительный

Группа живот- реагирующие результат бактерио-

фармакологических ных в до введения логического обследо-

препаратов опыте препаратов, % вания после введения

препаратов, %.

5 сут 10 сут 20 сут

Гормоны гидрокортизон 10 100 50 40 40

кортизон 10 80 50 40 30

ПВП индометацин 10 80 40 30 20

вольтарен 10 100 50 40 40

Иммуноде-прессанты циклофосфан 10 100 50 70 50

саркализин 10 70 40 60 40

Контроль 1 - 10 100 40 40 40

Контроль 2 - 10 0 0 0 0

Установлено, что введение циклофосфана в дозе 200 мг на кг веса животного способствовало обострению течения инфекционного процесса при бруцеллезе у 50% морских свинок на 5 сутки и у 70% - на 10 сутки после введения препарата.

Для дополнительного подтверждения перехода хронического течения бруцеллеза у морских свинок в острое под действием циклофосфана были проведены опыты по оценке лечебного действия антибиотиков, относящихся к хлорамфениколам (левомицетин) и фторхинолонам (пефлокса-цин). Опыты проводили на 30 морских свинках, которых разделили на 3 группы, по 10 голов в каждой - 2 опытные и 1 контрольная.

Морских свинок всех групп заражали культурой штамма В.те1иепз\5 16 М. На 35 сутки после инфицирования всем животным вводили циклофос-фан. На 40 сутки с момента заражения животным 1 опытной группы вво-

дили ежедневно перорально левомицетин в дозе 15 мг/гол., животным 2 опытной группы - пефлоксацин в дозе 8 мг/гол., животным контрольной группы - физраствор.

Через 3 суток после окончания лечения животных опытных и контрольной групп усыпляли хлороформом и проводили бактериологические исследования печени, легких, селезенки, лимфатических узлов.

Было установлено, что пефлоксацин обеспечивает излечение 90% животных, что свидетельствует об обострении инфекционного процесса при использовании циклофосфана.

Для сравнительной оценки усовершенствованного метода обострения инфекционного процесса при бруцеллезе было создано 3 группы морских свинок - 2 опытные, по 20 голов в каждой и 1 контрольная (10 голов). Животных всех групп заражали культурой штамма В.те1иепз18 16 М.

Лечение животных опытных групп антибиотиками начинали на 4-5 сутки после инфицирования. По окончании лечения 10 животным в каждой опытной группе и 5 животным контрольной группы вводили циклофосфан (усовершенствованный бакметод). Оставшимся 10 животным опытных групп и 5 животным контрольной группы вводили аналогично физраствор.

Диагностику бруцеллеза у животных проводили с использованием аллергической пробы с бруцелином ВИЭВ и проведением баканализа. Для проведения бакисследований всех животных усыпляли хлороформом, из внутренних органов делали посевы на Р1> агар (табл. 2).

Таблица 2. Эффективность усовершенствованного бактериологического метода диагностики бруцеллеза у инфицированных морских свинок

Группа животных Применяемые антибиотики Положительный результат бактериологического обследования Положит, результат аллер- гопробы, %

Существующий бакметод Усовершенствованный бакметод

кол-во жив. выявлено больных % кол-во жив. выявлено больных %

1 Левомицетин 10 3 30 10 6 60 10

2 Пефлоксацин 10 0 0 10 1 10 0

Контр. - 5 4 80 5 5 100 20

Применение усовершенствованного бакметода выявления больных бруцеллезом животных с обострением инфекционного процесса путем применения циклофосфана позволило доказать высокую антибактериальную эффективность пефлоксацина в отношении бруцелл. Введение циклофосфана после лечения животных антибиотиками вызвало угнетение иммунной системы и в случае персистенции бруцелл у 10% животных, леченных пефлоксацином и у 60% - леченных левомицетином, обеспечило их размножение и обострение инфекционного процесса.

Полученные данные свидетельствуют о том, что введение иммуноде-прессанта циклофосфана в дозе 200 мг на кг веса животных после проведенного курса лечения антибиотиками позволяет повысить на 20% информативность бактериологического метода обследования инфицированных возбудителем бруцеллеза животных.

Результаты проведенных исследований определили возможность использования усовершенствованного бактериологического метода при изучении протективного действия полученных антигенов.

Изучение иммуногенности полученных антигенов в опытах на лабораторных животных

Изучение реактогенности и оценку иммуногенных свойств полученных антигенов проводили в опытах на морских свинках.

Было создано 7 групп животных-аналогов по 10 голов в каждой - 6 опытных и 1 контрольная. Животным опытных групп вводили подкожно полученные антигены бруцелл, животным контрольной группы аналогично вводили физраствор.

На 7, 14, 21 и 28 сутки с момента постановки опыта у морских свинок отбирали пробы крови для определения наличия антител (рис. 3).

Установлено, что комбинированный инактивированный корпускулярный антиген и суммарные белки клеток (СБК) В.те1кепз18 Яеу-1 как отмытые, так и не отмытые обеспечивали иммунологическую перестройку организма морских свинок в 100% случаях на 28 сутки после введения.

Белковые фракции бруцелл по иммуногенности уступали как СБК, так и

комбинированному инактивированному корпускулярному антигену. Причем, иммуногенность белковых фракций снижалась параллельно с уменьшением их молекулярной массы.

%

суткм

0 - комбинированным инактивированным корпускулярный антиген; СБК не отмытые; о -СБК отмытые; а - фракция I; «-фракция II; сз-фракция Ш.

Рисунок 3. Процент положительно реагирующих в РА морских свинок, иммунизированных полученными антигенами бруцелл

Для определения защитных свойств антигенов животных опытных и контрольной групп инфицировали культурой штамма В.теШегшз 16 М.

Через 30 сут. после заражения животных исследовали серологическим, аллергическим и усовершенствованным бактериологическим методами (табл. 3).

Таблица 3. Профилактическая эффективность приготовленных антигенов бруцелл в опыте на морских свинках

Антиген, используемый для иммунизации Кол-во иммунизированных животных % положительных проб с использованием методов Кол-во заболевших животных Профилактическая эффективность,%

серологический аллергический бактериологический

1 2 3 4 5 6 7

Комбинированный инактивиро-ванный корпускулярный антиген 10 10 0 20 2 80

СБК не отмытые 10 30 0 60 6 40

1 2 3 4 5 6 7

СБК отмытые 10 40 0 60 6 40

Фракция I 10 90 30 90 9 10

Фракция II 10 90 50 90 9 10

Фракция Ш 10 100 60 100 10 0

Контроль 10 100 60 100 100 0

Из данных таблицы следует, что наиболее высокой профилактической эффективностью (80%) обладает комбинированный инактивированный корпускулярный антиген бруцелл.

Данный антиген, полученный на основе комбинации в соотношении 1:2 инактивированных цельноклеточных культур В. melitensis Rev-1 и В. abortus 19 В А, является наиболее перспективным для создания вакцинных препаратов для профилактики бруцеллеза животных.

Результаты изучения иммуногенности комбинированного

инактивированного корпускулярного антигена в опытах на овцах

Для изучения иммуногенности комбинированного антигена использовали 6 здоровых баранов романовской породы.

Животных опытной группы (4 гол.) иммунизировали комбинированным антигеном однократно, подкожно, в дозе, содержащей 6х109 микробных клеток в объеме 2 мл. В качестве контроля использовали 2 баранов, которым аналогично вводили физраствор. У всех баранов 2 раза в день измеряли ректально температуру. На 21 и 30 сутки после введения антигена всех овец исследовали серологически в пробирочной РА.

Было установлено, что у иммунизированных комбинированным антигеном баранов через 21 сутки после иммунизации титр антител у 75% баранов составил 1:25, у 25% баранов -1:50. На 30 сутки после иммунизации титр антител у баранов оставался на прежнем уровне.

Через 30 сут. после иммунизации баранов опытной и контрольной групп заражали культурой В. melitensis 16Mb дозе 2,0 мл с концентрацией бруцелл 2хЮ6 м.к. У всех животных до заражения, а также через 10 и 20 сут после заражения отбирали сыворотку крови и определяли титр антител в РА. На 30 сут. после инфицирования проводили бруцеллинизацию (рис. 4).

Титр антител

200-Л 2

после заражения после заражения исследования

т - баран N2 1; ®-6аран№2; баран № 3; баран № 4; а-6араи№5; ^ баран N2 6.

Рисунок 4. Титр антител у инфицированных культурой штамма В. теШздшв 16 М баранов в разные периоды исследований

Было установлено, что у баранов опытной группы на 10 сутки после заражения титр антител вырос в 2 раза у 25% животных и составил до заражения 1:25, после заражения - 1:50. На 20 сутки после заражения у 75% иммунизированных баранов титр антител составил 1:50. У барана № 3 титр антител увеличился с 1:25 до заражения, до 1:50 - на 10 сутки и до 1:100 -на 20 сутки исследований.

Результаты серологического обследования баранов контрольной группы показали нарастание величины титров антител с 0 - до заражения, до 1:50 -1:100 на 10 сутки после заражения и 1:100 - 1:200 на 20 сутки после инфицирования.

У всех контрольных животных на 30 сутки после инфицирования аллергическая реакция на бруцеллин была положительной.

У животного № 3 наблюдался кратковременный подъем температуры и положительная сероконверсия при отрицательной бруцелиновой пробе.

Для обострения инфекционного процесса всем животным был введен циклофосфан (табл. 4).

Таблица 4. Титр антител у инфицированных баранов после введения

циклофосфана

Группа животных № животного Величина титров специфических антител в РА

до введения циклофосфана через 10 сут после введения циклофосфана

Иммунизированные 1 1:50 1:50

2 1:50 1:50

3 1:100 1:200

4 1:50 1:50

Контрольные 5 1:100 1:400

6 1:200 1:800

Было установлено, что у баранов контрольной группы и у барана № 3 опытной группы на 4-6 сутки после введения циклофосфана отмечался подъем температуры на 0,6°С. Продолжительность гипертермического периода составила 5-8 суток.

На 10 сутки после введения циклофосфана у барана № 3 опытной группы титр антител увеличился в 2 раза (с 1:100 до 1:200), у баранов № 5 и 6 контрольной группы титр антител увеличился в 4 раза (с 1:100 до 1:400 - у барана № 5 и с 1:200 до 1:800 - у барана № 6).

На 10 сутки после введения циклофосфана проводили также бруцелли-низацию баранов опытной и контрольной групп.

На 15 сутки после введения циклофосфана бараны опытной и контрольной групп были подвергнуты убою.

При патологоанатомическом обследовании у барана № 3 опытной группы и у баранов № 5 и № 6 контрольной группы было выявлено увеличение размеров печени, селезенки, регионарных лимфатических узлов.

При бактериологическом обследовании органов животных от барана № 3 опытной группы и от баранов № 5 и № 6 контрольной группы были выделены чистые культуры бруцелл.

Таким образом, комбинированный инактивированный корпускулярный антиген на основе культур штаммов В. melitensis Rev-1 и В.abortus 19 В А в соотношении 1:2 обладает протективными свойствами и позволяет предотвратить заражение бруцеллезом 80% овец.

выводы

1. Методами гель-хроматографии, ультразвуковой дезинтеграции, «замораживания-оттаивания» и термохимического инактивирования получены растворимые и корпускулярные антигены двух штаммов бруцелл B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА (суммарные белки B.melitensis Rev-1; белковые фракции B.melitensis Rev-1 с молекулярными массами 135±15, 50±10 и 25±5 кД; инактивированные корпускулярные антигены B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 В А; комбинированный инактивированный корпускулярный антиген на основе культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 В А в соотношении 1:2), обладающие иммуногенными свойствами.

2. Полученные методом гель-хроматографии на сефадексе G-100 белковые фракции B.melitensis Rev-1 с молекулярными массами 135±15, 50±10 и 25±5 кД содержали от 12,0±0,09% до 25,0±0,2% белка и от 13,2±0,9 до 31,0 ±0,9% нейтральных Сахаров при отсутствии липополиса-харидов. Данные фракции вызывали выработку антител у морских свинок в титре 1:10, но не обладали протективными свойствами.

3. Бруцеллы устойчивы к замораживанию и последующему оттаиванию микробной суспензии и получение дезинтегрированных культур штамма B.melitensis Rev-1, не содержащих живые клетки бруцелл, возможно только после проведения 10 циклов «замораживания-оттаивания». Концентрация суммарных белков бруцелл при этом составляет 60 мг/мл.

4. При получении инактивированного корпускулярного антигена добавление в концентрированную микробную суспензию бруцелл формальдегида до конечной концентрации 0,4% и двукратное нагревание суспензии до 48°С в течение 1 часа приводит к полной инактивации бруцелл и сохранению целостности клеток.

5. Комбинированный инактивированный корпускулярный антиген на основе культур штаммов В. melitensis Rev-1 и В.abortus 19 В А в соотношении 1:2 вызывает у иммунизированных морских свинок и овец образование агглютининов в титре 1:50 и является перспективным в качестве основы вакцинного препарата. Применение данного антигена для специфи-

ческой профилактики бруцеллеза у овец позволяет предотвратить болезнь у 80% животных.

6. Применение иммунодепрессанта циклофосфана в дозе 200 мг/кг веса животного на 21-30 сутки после инфицирования возбудителем бруцеллеза обеспечивает обострение инфекционного процесса и повышает на 20% информативность бактериологического метода обследования искусственно зараженных морских свинок и овец.

7. Применение усовершенствованного бактериологического метода выявления больных бруцеллезом животных с обострением инфекционного процесса при использовании циклофосфана позволило доказать высокую антибактериальную эффективность пефлоксацина в отношении бруцелл у зараженных бруцеллезом морских свинок. Терапевтическая эффективность пефлоксацина в условиях смоделированного инфекционного процесса при бруцеллезе составила 90%.

8. Технология выращивания культур штаммов B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в биореакторах марки «Биор-0,25» при температуре (37±1)°С, давлении (0,10±0,05) МПа, коэффициенте аэрации (0,7±0,1) дм3/мин, частоте вращения мешалки 120 об/мин, продолжительности культивирования 28 ч, в питательной среде на основе гидролизата мяса с содержанием аминного азота 130-150 мг% является воспроизводимой. Получено по 3 серии культур штаммов B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА с высоким выходом биомассы микробных клеток - (27±7)х109 м.к./см3 и (21±5)х109 м.к./см3 соответственно.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ

РЕЗУЛЬТАТОВ

1. По результатам проведенных экспериментов составлены 2 отчета:

- «Создание иммунобиологических средств защиты животных на основе корпускулярных коньюгированных и субъединичных компонентов микроорганизмов-возбудителей бактериальных и грибковых (Trichophyton) заболеваний» (промежуточный, утв. в 2007 г);

- «Создание иммунобиологических средств защиты животных на ос-

нове корпускулярных коньюгированных и субъединичных компонентов микроорганизмов-возбудителей бактериальных и грибковых (Trichophyton) заболеваний» (заключительный, утв. в 2008 г);

2. Разработанные режимы глубинного культивирования культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в биореакторах марки «Биор-0,25» используются на производственном участке ООО «Агровет» (г. Киров-200) для получения биомассы бруцелл с целью приготовления вакцинных препаратов.

3. Разработанный метод обострения инфекционного процесса с использованием иммунодепрессанта циклофосфана применяется лабораторией НИИ микробиологии МО РФ (г. Киров), лицензированной по работе с микроорганизмами I-IV групп патогенности, при моделировании инфекционных процессов при особо опасных болезнях человека и животных.

4. Разработанный комбинированный инактивированный корпускулярный антиген на основе культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в соотношении 1:2 является основой для создания вакцинного препарата для специфической профилактики бруцеллеза животных.

5. Разработанные методические рекомендации «Технология глубинного культивирования вакцинных штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА», «Метод обострения инфекционного процесса при бруцеллезе животных», «Получение растворимых и корпускулярных антигенов бруцелл» используются в учебном процессе в ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» при изучении дисциплин «Иммунология», «Ветеринарная микробиология» и «Биотехнология».

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Рекомендовать научно-производственным учреждениям комбинированный инактивированный корпускулярный антиген на основе культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в соотношении 1:2 в качестве основы для создания вакцинного препарата для специфической профилактики бруцеллеза животных.

2. Отработанные технологические параметры и режимы культивирования культур штаммов B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА с использованием биореакторов марки «Биор-0,25» рекомендуются для приготовления вакцинных препаратов на основе других микроорганизмов.

3. Методические рекомендации «Технология глубинного культивирования вакцинных штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА», «Метод обострения инфекционного процесса при бруцеллезе животных», «Получение растворимых и корпускулярных антигенов бруцелл» рекомендуется использовать в учебном процессе по дисциплинам «Иммунология», «Ветеринарная микробиология» и «Биотехнология».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Девришов Д.А., Кузнецов С.М., Шведов Д.В., Крыканов A.A. Сравнительная оценка ростовых свойств питательной среды для приготовления живой бруцеллезной вакцины из штамма REV-1 //Ветеринарная медицина.- 2007.- № 1.- С. 6-7.

2. Девришов Д.А., Кузнецов С.М., Крыканов A.A. Изучение иммуно-генности комбинированного антигена бруцелл на морских свинках и овцах /Проблемы увеличения производства продуктов животноводства в России и пути их решения: материалы международной научно-практической конференции,- Дубровицы: ВИЖ.- 2008.- С. 439-450.

3. Девришов Д.А., Крыканов A.A., Ахмедов М.М. Усовершенствованный метод обследования животных, зараженных возбудителем бруцеллеза //Ветеринарная медицина.- 2009.- № 4,- С. 17-18.

4. Крыканов A.A. Изучение лечебного действия пефлоксацина и левоми-цетина при бруцеллезе в опытах на морских свинках //Ветеринария и кормление,- 2009,- № 6,- С. 62-63.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 20.05.2010 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,0 Печать авторефератов (495)730-47-74,778-45-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Крыканов, Артем Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Эпизоотическая ситуация по бруцеллезу в РФ на современном этапе развития животноводства.

1.2. Характеристика антигенной структуры бруцелл.

1.3. Особенности иммунного ответа при бруцеллезе.

1.4. Вакцины, применяемые для специфической профилактики бруцеллеза животных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1.1. Материалы.•.

2.1.2. Методы исследований.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.2.1. Получение посевных культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА при культивировании их на плотных и жидких питательных средах.

2.2.2. Культивирование В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в биореакторах марки «Биор 0,25».

2.2.3. Концентрирование нативных культур изучаемых бруцелл методом ультрафильтрации.

2.2.4. Получение субклеточных фракций культуры штамма

В. melitensis Rev-1.

2.2.5. Получение корпускулярных антигенов культур штаммов В.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 В А и приготовление комбинированного корпускулярного антигена бруцелл.

2.2.6. Моделирование инфекционного процесса при бруцеллезе на лабораторных животных.

2.2.7. Изучение иммуногенности полученных антигенов в опытах на лабораторных животных.

2.2.8. Результаты изучения иммуногенности комбинированного инактивированного корпускулярного антигена в опытах на овцах.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4. ВЫВОДЫ.

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАННОЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Получение антигенов Brucella melitensis Rev-1 и Brucella abortus 19 BA и оценка перспективности их использования в качестве основы противобруцеллезной вакцины"

Актуальность темы. Совершенствование эпизоотологического надзора за бруцеллезной инфекцией, создание отвечающих современным требованиям средств диагностики и специфической профилактики имеет определяющее значение в борьбе с этой инфекцией. Решение данных проблем невозможно без фундаментальных и прикладных разработок по эпизоотологии, эпидемиологии, микробиологии и иммунологии, активной научной поддержки практической деятельности по обеспечению санитарно-эпидемического и эпизоотического благополучия населения и животноводства.

Успехи, достигнутые в ликвидации бруцеллеза в Российской Федерации, несмотря на их научную и практическую значимость, не позволяют в настоящее время сделать заключение о том, что проблема ликвидации бруцеллеза животных в стране окончательно-решена. Это подтверждается возникновением новых очагов данного заболевания в различных регионах РФ (10,16,71,73).

По данным Григорьевой Г.И. (26), Склярова О.Д. (69), Сочнева В.В. (72), Юсковец М.К. (77) и др., инфекция наносит значительный ущерб животноводству, который складывается из потери воспроизводительной способности, выбраковки ценных в племенном отношении животных, абортов и рождении слабого, нежизнеспособного потомства.

Современная система профилактики инфекционных заболеваний основывается на проведении общих ветеринарно-санитарных мероприятий, выявлении источников инфекции - больных животных и их удалении, применении средств специфической иммунопрофилактики (1, 32, 98, 112).

Наиболее значимым элементом в системе предупреждения бруцеллезной инфекции является вакцинопрофилактика болезни.

Однако, по мнению Панина А.Н. (55), Девришова Д.А. (33), Джупина г

С.И. (34), Литвинова О.Б. (50) и др. значительные трудности в решении данного вопроса создают циркулирующие измененные варианты возбудителя бруцеллеза: R, RS, SR и клетки с дефектной клеточной стенкой (L- формы), о существовании которых сообщали многие отечественные и зарубежные ученые. Применение антибиотиков, а также появление вышеуказанных атипичных форм, значительно снижают эффективность бактериологического исследования, которое также связано с многообразием плотных питательных сред, необходимых для идентификации бруцелл. •

Измененные формы бруцелл, несмотря на их пониженную патогенность, способны к реверсии в исходные формы и могут вызвать вспышки бруцеллеза. •

В нашей стране и за рубежом проводились и ведутся исследования по разработке и оценке эффективности различных препаратов для специфической профилактики бруцеллеза у животных. Несмотря на это, в РФ до настоящего времени официальное признание имеет живая вакцина на основе аттенуированного штамма В. abortus 19, которая была предложена в 1946 году Вершиловой П.А. (18). С 1952 года данная вакцина широко используется для иммунизации животных.

В то же время многими исследователями (21, 25, 40, 49, 81, 97) напряженность иммунитета, обусловленного введением живой вакцины на основе аттенуированного штамма В. abortus 19, с течением времени быстро снижается. Это определяет сравнительно невысокий ее защитный эффект.

Вершилова П.А. (18) указывает, что через 1, 4 и 12 месяцев после прививки уровень заболеваемости составляет, соответственно, 17,3%, 32,7% и 50,0%. Через 1 год после иммунизации положительные серологические и аллергические реакции обнаруживаются лишь^у 25-50% привитых. При этом в экспериментах на животных было показано, что предлагаемая вакцина защищает от небольших доз возбудителя (1-5 ИД50).

Кроме того, длительная персистенция возбудителя в организме создает значительные трудности в разграничении иммунного и инфекционного процессов.

В качестве альтернативы живым вакцинам неоднократно предпринимались попытки создания химических и инактивированных вакцин против бруцеллеза (36, 45, 65). Одним из достоинств использования их в медицине считается возможность одновременного применения подобных вакцин с антибактериальными препаратами. В основе предлагаемых химических вакцин используются полученные различными методами экстракции растворимые антигены микробных клеток.

Другим решением задачи специфической профилактики бруцеллеза представляется создание инактивированных вакцин на основе убитых культур бруцелл. Подобные препараты в настоящее время находят применение в ветеринарной практике. К их числу можно отнести вакцину 53Н38 - «Абро-лан», которая представляет собой суспензию инактивированных формалином микробных клеток В. melitensis, штамм Н3£ находящихся в S-форме, и полидисперсного адъюванта; вакцину 45/20 - «Абортос», состоящую из суспензии инактивированных формалином микробных клеток В. abortus, штамм 45/20 (R-форма) и полидисперсного адъюванта (53).

В последние годы Шумиловым К.В. и Калмыковым В.В. (76) запатентована «Вакцина против бруцеллеза крупного'рогатого скота». Она содержит в р , своем составе инактивированную формалином с гидратом окиси алюминия бактериальную массу (300-400* 109 микробных клеток в 1 мл B.abortus, штамм № KB 17/100 в R-форме и неполный адъювант Фрейда. По данным авторов, эта вакцина, не индуцирующая образование S-антител, способна обеспечивать защиту от бруцеллеза 69-80% морских свинок при заражении их вирулентными культурами В. abortus через 3 месяца после вакцинации.

В этих условиях современная иммунология стремится к совершенствованию и созданию новых вакцинных препаратов на принципиально новых подходах, основанных на использовании знаний о клеточных и молекулярных механизмах развития иммунитета, точных данных о структуре антигенов и кодирующих их генах, на применении современных методов биотехнологии и компьютерного анализа.

В настоящее время в РФ проводятся исследования по созданию Сплит-вакцины (split - англ. расщеплять), состоящей из антигенов бруцелл, полученных химическими и физическими методами. Сплит-вакцины не являются гомогенными, содержат примесь отдельных органических соединений или комплексы, состоящие из белков, полисахаридов и липидов.

Поиск высокоэффективных и безопасных для человека и животных средств иммунопрофилактики бруцеллеза в последние годы преимущественно направлен на изыскание щадящих способов инактивации микроорганизi мов, а также методов выделения структурных компонентов бруцелл, сохраняющих полноценными их иммуногенные свойства (89, 95, 106).

Поэтому, выбор оптимальной антигенной основы для создания противо-бруцеллезных вакцин для животных является актуальной задачей для ветеринарии.

Цель и задачи исследований.

Цель настоящих исследований - получить различные антигены культур штаммов Brucella melitensis Rev-In Brucella abortus 19 В А и оценить перспективность их использования в качестве основы противобруцеллезной вакцины для мелкого рогатого скота.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить посевные культуры штаммов В. melitensis Rev-1 и В.abortus 19 ВА при культивировании их на плотных и жидких питательных средах.

2. Провести культивирование В. melitensis Rev-1 и В. abortus 19 В А в биореакторах марки «Биор 0,25» и сконцентрировать их биомассу методом ультрафильтрации. ^ А

3. Получить субклеточные фракции культур штамма В. melitensis Rev-1 различной функциональной направленности.

4. Получить корпускулярные антигены культур штаммов В.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 В А и приготовить комбинированный корпускулярный антиген изучаемых бруцелл.

5. Смоделировать инфекционный процесс при бруцеллезе на лабораторных животных и разработать метод обострения течения инфекции.

6. Изучить иммуногенность приготовленных антигенов бруцелл в опытах на лабораторных животных.

7. Изучить иммуногенность комбинированного инактивированного корпускулярного антигена в опытах на овцах. •

Научная новизна.

1. Впервые получен комбинированный инактивированный корпускулярный антиген на основе культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в соотношении 1:2, обладающий иммуногенными свойствами. Титр антител у иммунизированных морских свинок и овец составил не менее 1:50.

2. Применение комбинированного инактивированного корпускулярного антигена для специфической профилактики бруцеллеза у овец позволяет предотвратить заражение бруцеллезом 80.% животных.

•

3. Полученные методом гель-хроматографии белковые фракции В. melitд ensis Rev-1 с молекулярной массой (135±1,5) кД, (50±10) кД и (25±5) кД обладают слабыми иммуногенными свойствами^и являются не перспективными для создания на их основе вакцинных препаратов для специфической профилактики бруцеллеза животных.

4. Впервые установлено, что введение иммунодепрессанта циклофосфаI на в дозе 200 мг/кг веса животного на 21-30 сутки после инфицирования возбудителем бруцеллеза обеспечивает обострение инфекционного процесса и повышает на 20% информативность бактериологического метода обследования искусственно зараженных морских свинок и овец. л •

5. Применение усовершенствованного бактериологического метода выявления больных бруцеллезом животных с обострением инфекционного процесса путем подкожного введения циклофосфана позволило доказать высокую антибактериальную эффективность пефлоксацина в отношении бруцелл у зараженных бруцеллезом морских свинок. Терапевтическая эффективность пефлоксацина в условиях смоделированного инфекционного процесса при бруцеллезе составила 90%.

6. Впервые разработан метод глубинного культивирования культур штаммов В. melitensis Rev-1 и В.abortus 19 ВА с использованием биореакторов марки «Биор-0,25». Выход биомассы при выращивании культуры штамма B.melitensis Rev-1 был выше в 1,3 раза, чем В.abortus 19 ВА.

Практическая значимость.

1. На производственном участке ООО «Агровет» (г. Киров-200) воспроизведена технология глубинного культивирования культур штаммов В. melitensis Rev-1 и В.abortus 19 В А с использованием биореакторов марки «Биор-0,25». Получено по 3 серии культур штаммов бруцелл с высоким выходом бактериальной массы.

2. На базе лицензированной по работе с микроорганизмами I-IV групп патогенности лаборатории НИИ микробиологии МО РФ (г. Киров) успешно проведено моделирование инфекционного процесса при бруцеллезе морских свинок и овец. Разработан метод обострения инфекционного процесса с использованием иммунодепрессанта циклофосфана.

3. Разработанный комбинированный инактивированный корпускулярный антиген на основе культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19

ВА в соотношении 1:2 является перспективным для создания на его основе j вакцинного препарата для специфической профилактики бруцеллеза животных.

4. По результатам исследований составлены и утверждены в установленном порядке 2 отчета о научно-исследовательской работе (промежуточный и заключительный) на тему: «Создание иммунббиологических средств защиты животных на основе корпускулярных коньюгированных и субъединичных компонентов микроорганизмов-возбудителей бактериальных и грибковых (Trichophyton) заболеваний».

5. Разработаны методические рекомендации: «Технология глубинного культивирования вакцинных штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА», «Метод обострения инфекционного процесса при бруцеллезе животных», «Получение растворимых и корпускулярных антигенов бруцелл».

6. Материалы исследований используются в учебном процессе в ФГОУ ВПО МГАВМиБ при изучении дисциплин «Иммунология», «Ветеринарная микробиология» и «Биотехнология».

Личный вклад соискателя. Автору принадлежит непосредственное участие во всех этапах работы, в т.ч. в культивировании бруцелл поверхностным и глубинным методами, в получении различных белковых фракций бруцелл методом гель-хроматографии, создании комплексного корпускулярного инактивированного антигена изучаемых бруцелл, моделировании инфекционного процесса при бруцеллезе на морских свинках и овцах, определении реактогенности и иммуногенности полученных антигенов с использованием лабораторных животных и овец, анализе и обобщении полученных результатов исследований.

В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве с микробиологом производственного участка ООО «Агровет», доктором биологических наук, профессором Кузнецовым С.М., которому выражаю глубокую благодарность за помощь и поддержку.

Апробация результатов диссертации: Основные результаты исследований доложены на научно-практической конференции молодых ученых (Москва, 2006); на XV Московском международном ветеринарном конгрессе, на секции «Болезни крупного рогатого скота» (Москва, 2008); на международной конференции «Щука и образование для целей биобезопасности» (Пущино, 2008); на международной научно-практической конференции «Проблемы увеличения производства продуктов животноводства в России и пути их решения» (г. Дубровицы, 2008).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 4 статьи, в т.ч. 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК (Ветеринарная медицина, Ветеринария и кормление).

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 129 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение полученных результатов, практическое использование полученных научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (121 источник, в т.ч. 39 - иностранных авторов). Работа содержит 25 таблиц, 14 рисунков, 10 страниц прилржений.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Крыканов, Артем Александрович

4. ВЫВОДЫ

1. Методами гель-хроматографии, ультразвуковой дезинтеграции, «замораживания-оттаивания» и термохимического инактивирования получены растворимые и корпускулярные антигены двух штаммов бруцелл B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА (суммарные белки B.melitensis Rev-1; белковые фракции B.melitensis Rev-1 с молекулярными массами 135±15, 50±10 и 25±5 кД; инактивированные .корпускулярные антигены B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 В А; комбинированный инактивированный корпускулярный антиген на основе культур штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в соотношении. 1:2), 9бладающие иммуногенными свойствами.

2. Полученные методом гель-хроматографии на сефадексе G-100 белко * * » вые фракции B.melitensis Refv-1 с молекулярными массами 135±15, 50±10 и

25±5 кД содержали от 12;0±0,09% до 25,0±0,2%, белка и от 13,2±0,9 до 31,0 * I *

0,9% нейтральных Сахаров при отсутствии • лйпополисахаридов. Данные фракции вызывали выработку антител у морских свинок в титре 1:10, но не обладали протективными свойствами. "

3. Бруцеллы устойчивы к замораживанию и последующему оттаиванию микробной < суспензии и получение дезинтегрированных культур штамма B.melitensis Rev-1, не.содержащих Лживые клетки бруДелл, возможно только после проведения 10 циклов «замораживания-оттаивания». Концентрация • 1 ф суммарных белков бруцелл при этом составляет 60 мгУмл. \ *«

4. При получении инактивированного корпускулярного антигена добавление в концентрированную микробную суспензию бруцелл формальдегида

Л > ' 0 до конечной концентрации 0,4% и двукратное нагревание суспензии до 48 С I в течение 1 'часа приводит к полной инактивации бруцелл и сохранению це

1 . % лостности клеток. *

• ч *

5. Комбинированный инактивированный корпускулярный антиген на ос

• к нове культур штаммов В', melitensis Rev-1 и B.abortus 9 ВА в соотношении

1:2 вызывает у иммунизированных морских свинок и овец образование агглютининов в титре 1:50 и является перспективным в качестве основы вакцинного препарата. Применение данного антигена для специфической профилактики бруцеллеза у овец позволяет предотвратить болезнь у 80% животных. 0

6. Применение иммунодепрессанта циклофосфана в дозе 200 мг/кг веса животного на 21-30 сутки после инфицирования возбудителем бруцеллеза обеспечивает обострение инфекционного процесса и повышает на 20% информативность бактериологического метода обследования искусственно заt * • • раженных морских свинок и овец.

7. Применение усовершенствованного бактериологического метода выявления болы£ых бруцеллезом животных с обострением инфекционного про

• * • t цесса при использовании циклофосфана позволило доказать высокую анти> . бактериальную эффективность пефлоксацина в отношении бруцелл у зараженных бруцеллезом морских свинок. Терапевтическая эффективность пефлоксацина в .условиях смоделированного инфекционного процесса при бруцеллезе составила 90%. • < i

8. Технология выращивания культур щтаммов B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в биореакторах марки «Биор-0,25» при температуре (37±1)°С, давлении (0,10±0,05) МПа, коэффициенте аэрации (0,7±0Д) дм3/мин, частоте ч вращения -мешалки 120 об/мин, продолжительности культивирования 28 ч, в питательной среде на- основе гидролизата мяса с содержанием аминного азота

13 0-1 fit) мг% является воспроизводимой. Получено по 3 серии культур штаммов B.meHtensis Rev-1, и B.abortus 19 В А с высоким выходом биомассы микробный; клеток - (27±7)х109 м.к./см3 и (21±5)х10® м.к./см3 соответственно.

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. По результатам проведенных экспериментов составлены 2 отчета:

- «Создание иммунобиологических средств защиты животных на основе корпускулярных коньюгированных и субъединичных компонентов микроорганизмов-возбудителей бактериальных и грибковых (Trichophyton) заболеваний» (промежуточный, утв. в 2007 г);

- «Создание иммунобиологических средств защиты животных на основе корпускулярных коньюгированных и субъединичных компонентов микроор-ганизмов-дозбудителей бактериальньГх и грибковых (Trichophyton) заболеваний» (заключительный, утв. в 2008 г); *

2. Разработанные режимы "глубинного культивирования культур штам

II * • мов В. melitensis Rev-1 и .B.abortus 19 ВА в биореакторах марки «Биор-0,25» используются на производственном участке ООО «Агровет» (г. Киров-200) для получения биомассы бруцелл с целью приготовления вакцинных препаратов. ' «

3. РазраС&танныи мето!ц обострения инфекционного процесса с испольг зованием иммунодепрессанта циклофосфана применяется лабораторией НИИ микробиологии МО РФ (г. Киров), лицензированной по работе с микроорганизмами I-JV групп патогенности, при моделировании инфекционных про, ' t цессов при особо опасных болезнях человека и животных.

4. Разработанный комбинированный инактивирд^занный корпускулярный антиген на основе культур штаммов .В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в соотношенйи 1:2 является' основой дця создания вакцинного препарата для специфической профилактики бруцеллеза животных.

5. Разработанные методические рекомендации «Технология глубинного культивирования вакцинных штаммов В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19

I '

ВА», «Метрд обострения инфекционного процесс^ при бруцеллезе животных», «Получение растворимых и корпускулярных антигенов бруцелл» используются в учебном процессе в ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» при изучении дисциплин «Иммунология», «Ветеринарная, микробиология» и

Биотехнология», f

6. РЕКОМЕНДАЦИЙ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ' ВЫВОДОВ

1. Рекомендовать научно-производственным учреждениям комбинированный инактивированный корпускулярный антиген йа основе культур штаммор В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА в соотношении 1:2 в качестве ь основы для создания вакцинного препарата для' специфической профилактики бруцеллеза животных!.

2. Отработанные технологические параметры и режимы культивирования культур штаммов B.melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА с использованием биореакторов марки «Биор;0,25» рекомендуются' для приготовления бвак-цинных препаратов на основе других микроорганизмов.

3. Методические рекомендации «Технология глубинного культивирования вакцинных штамм9в В. melitensis Rev-1 и B.abortus 19 ВА», «Метод обо» '

• » • > v * стрения инфекционного процесса при бруцеллезе животных», «Получение 1 . . растворимых и корпускулярных антигенов бруцеЛл» рекомендуется использовать в учебном процессе по дисциплинам «Иммунология», «Ветеринарная микробиология» и «Биотехнология».

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Крыканов, Артем Александрович, Москва

1. Авилов В.М. Эпизоотологический надзор при бруцеллезе крупного рогатого скота в современных условиях: Автореф. дисс. доктора вет. наук. С-Пб, 1977. - 49 с. ;

2. Авилов В.М., Селиверстов В.В. Бруцеллёз животных и его специфическая профилактика //Ветеринария. 1997.- № 7.- С. 3-13.

3. Артемов Б.Т. Экспериментальное изучение иммуногенных свойств противобруцеллезной вакцины из штамма В-1 //Иммунитет сельскохозяйственных животных. 1973. - С. 178-183.I

4. Ассонов Н.Р. Микррбиология.- М.: Колос.- 2002.- 350 с.

5. Аутоиммунные процессы у больных различными формами хронического бруцеллеза /О. Ц. Мололкина, А.А. Шульдяков, Е.Г. Гладилина и др. //Успехи современного естествознания. 2006. - № 2. - С. 60.

6. Бажин М.А. Иммунологичесь&я память и толерантность у телят прибруцеллезе //Ветеринария. 1'984. - № 1. -С. 29-30.9

7. Базиков И.А., Бондаренко А.И: Ультраструктура L-форм бруцелл и культур-ревертантов Г/ Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.1991.-№ 1.'-С. i7-20.%

8. Белоусов Е.С., Ощепков В.Г. Иммуноферментный метод для диагностики бруцеллеза КРС. //Сельскоозяйственная биология. 1986. - № 11. - С.i *122.132.

9. Богословский С.Н., Григорьева Г.И. Применение многомерного статистического анализа для сравнительного изучения белковых спектров бактеtрий // Биохим. ц биофиз. микроорг. Горький, 1977. -С. 116-119.

10. Бруцеллы и (руцеЗшез. Микробиология, иммунология, биотехнология /Григорьева Г.И., Сочнев В.В., Бацанов Н.П. и др. /Под ред. Чл.-корр. РАСХН Сочнева В.В.- Н.Новгород: НГСХА.- 1998.- 246 с.

11. Бруцеллез. СП 3.1.085-96, ВП 13.3.1302-96 /Сборник санитарных и ветеринарных правил "Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных".

12. Бруцеллез 'собак, вызываемый В.canis— ретроспективный анализ встречаемости по С.-Петербургу за 2006-2007 г. /Яшин А.В., Кузина Т.Б., Климанов А.И. И др. // Ветеринарная практика. 2007.- № 4. - С. 23-26.

13. Буткин Е.И. Бруцеллез! В кн. Эпизоотология с микробиологией под ред. Бакулова И.А.- М.: Колос,- 1981.- С. 145-152.9 .

14. Вагина JI.A. Диагностика бруцеллеза северных рленей методом им-мунофлуоресценции //Ветеринария. 1972. - № 1. - С. 14-17.

15. Вагина JI.A., Никулина В.И., Гоппе А. С Стабильость свойств

16. Br. rangifere В :209 //Диагностика, профилактика и терапия болезней жи«вотных на крайнем Севере: Сб.науч.тр.- Новосибирск: НГУ,- 1983. С. 3-8.

17. Вашкевич Р.Б., Касьянов И.А. Изучение «ротивобруцелленой вакцины из штамма Rev-1 северных оленях //Диагностика, профилактика и терапия болезней животных на крайнем Севере: Сб.науч.тр.- Новосибирск: НГУ.--1983.-С. 13-16. •

18. Векслер И. Г\ Сравнительное изучение влияния некоторых специфических стимуляторов на иммунный ответ организма // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1990.-№ 7. - С. 64-67.

19. Воробьев А.А., Яяшенко В.А. Иммунобиологические препараты: настоящее и будущее //Журнал^микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.1995.-№ 6.-С. 105-111. \ ' Л'" «'" ' ' *

20. Выделение,и идентификация культур В. canis /Скляров О.Д., Клима1.V .нов А.И., Шумилов К.В. и др. // Сборник научных трудов ФГУ «ВГНКИ».

21. М.: ВГНКИ.- 2007-Т. 68.- С. 125- 126.

22. Глонти Т.М. Аллерическое состояние овец, привитых разными вакцинами против бруцеллеза.- Тр. ВГНКИ. 1973. -19.- С. 84-88.

23. Глотов Г.Н!, Глотова Г.И. Опыт оздоровления овец от бруцеллеза //Ветеринария.- 2005. № 3.- С.22-25.

24. Григорьева Г.И., Йгнатовч'П.Е. Протективные антигены как факторы патогенности при конструировании вакцин // Сельскохозяйственная биология. 1987. - N 12. - С. 100-104/

25. Григорьева Г.И., .Игнатов П.Е., Федоров А.И. Спороб получения анfтигенов из бактерии рода ВпюеИа // А.с. 1631786 СССР. 15.09.88. Опубл.oi.ii.9o. . ' ;1.■

26. Григорьева Г.И., Сочнев В.В. Тихомирова Е.А-.'Способ определенияУпротивобруцеллезных антител в биологических жидкостях //А.с. 1387661

27. СССР. 07.г08.86.-'Опубл, 08.12.87. 'f

28. Григорьева Г.И., Сочнев В.В., Игнатов П.Е. Оптимизация биотехнологии получения антигенов бруцелл //Всесоюзн. иммунолог, съезд. Сочи, 1989. - С. 147.

29. Григорьева Г.И., Улицкая А.А. Применение иммуноферментного анализа для определения противобруцеллезных антител в сыворотке крови крупного рогатого • скота'//• Вестник сельскохоз.науки. 1990, № 2. -С. 8691. . -'/■ • ■

30. Демина Т.А., < Сочнев В'.В., Григорьева Г.И. Изучение гостальности1 * возбудителя бруцеллеза крупного рогатого скота-/Профил. и лечен, заболев.сельскохоз. животн. в Нечерноз. зоне РСФСР: Сб.нйуч.тр. Горький:1. ГСХИ.- 1985.-С. 13-14.

31. Девришов Д.А., Янышев А.А. Результаты эпизоотологического анализа по бруцеллёзу животных //Ветеринария. 2006. - №. 6 - С. 30.г

32. Деврйшов Д.Д., Янышев А.А. Эпизоотическая обстановка по бруцел' *лёзу животных в Российской Федерации и Республике Дагестан //Ветери• * * • •нарная медицина. 2007. - С. , 16-17.•9 *

33. Драновская Е.А.* Биологические свойства бруцелл и получениедиагностического и профилактического антивена: Автореф. дисс. докт.* »мед. наук. М., 1'97'6. - 44 с.• *• « «

34. Драновская Е.А.,-Вершилова П.А., Чернышева М.И. К вопросу о1. С- * *структуре и биологических свойствах антигенов, выделенных из бруцелл• ••• 1 1

35. Желудкбв fM.M., Павлова И.П., Курманова К.Б. Определение специфических, циркулирующих в крови иммуннщх комплексов при бруцеллезной инфекции // Журнал микробиол., иммунол. и эпидемиол. 1988. - N 8.i 1 ' . , . . -С. 59-62. • ' 't- V

36. Захарова И.Я., Косенко JI.B. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев: АН УССР. - 1982. - 165 с.

37. Зинова А.А. Диагностика бруцеллеза собак, вызываемого В. canis. //Ветеринарная патология. 2006.- № 3 (18) - С. 11-14.

38. Игнатов П.Е. Перспективы конструирования вакцин против бруцеллеза на основе их протективного антигена //Бюллетень.ВИЭВ. 1983. - Вып. 50.-С. 3-6.

39. Игнатов П.Е. Обоснование разработки иммуноактивных препаратов для лечения профилактики инфекционных болезней: Автореф. дисс. докт.биол. наук.'- С-Пб. 1994.*- 36 с.• *

40. Игнатов П.Е., Федоров А.И. Способ получения бруцеллезного антигена: А.с. N 1256258 (СССР). 1984.I

41. Климаноь' А.И.', Малахова Т. И., Шумилов К. В. Результаты изучения биологических свойств. штамма Br. abortus 82 // Сборник научных трудов1. ВГНКИ. 1983.- С: 14-19. •

42. Колычев Н.М., ГоСманов Р.Г. Ветеринарная микробиология и иммунология.-М.: Колос.- 2003.- 432 с. .f

43. Косилов И.А., Новицкий А.А. Меры борьбы с бруцеллёзом и туберкулёзом крупного рогатого скота //Ветеринария.- 1987.- № 7.- С. 6-8.1

44. Клинико-лабораторная эффективность циклоферона в комплексном лечении больных Хроническим бруцеллезом /О.Н. Мололкина, А.А. Шульдяг"

45. Костюкова Н.И., Езепчук Ю.В. Методические подходы к конструированию химических вакцин против бактериальных инфекций //Журнал мик-робиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1984. N 8. - С.3-8.

46. Литвинов О.Б:, Девришов Д.А., Янышев А.А. Бруцеллёз в России //Ветеринарная жизнь. 2007. - № 2 - С. 14.

47. Малйков В.Е. Роль липополисахарида бруцелл в формировании ги>перчувствительности замедленного типа //Журнал микробиол., эпидемиол. ииммунобиол. 1986. - № 2. - С. 112-114.♦ *

48. Малышева Л.А. Система противоэпизооТических ' мероприятий при бруцеллезе крупного рогатого скота в зоне интенсивного ведения животноводства: Айтореф. дисс. докт. вет. наук.- С-Пб., 1995. 36 с.' i

49. Механизм действия и применение циклоферона в клинике инфекционных болезней /Е.П. Ляпина, О.Г. Шульдякова, О.Н. Мололкина и др. //Вестник. Санкт-Петербургской государственной академии им. И.И. Мечникова.- 2005,- № 1.- С. 182-185.f

50. Методические рекомендации по диагностике бруцеллеза собак, вызываемого B.canis: ут'вёрждены директором ФГУ «ВГНКИ» Паниным А.Н.

51. М.: ВГНКИ.-2009.-46 с. ' •' •

52. Перспективные вакцины против бруцеллёза крупного рогатого скотаI

53. К.В.Шумилов, О.Д.Скляров, А.И.Климанов и др. // Ветеринария Кубани. -№ 4. 2008. - С. 2-Ч:1.! «

54. Перспективы изучения цитокинового статуса при хроническом бруцеллезе / Е.П. Ляпина, О.Н. Мололкина, И.А. Бережнова и др. //Успехи современного естествознания. — 2004. № 12. - С. 55-56.

55. Прогнозирование рецидивов заболевания у больных хроническим бруцеллезом /Е.Г. Гладилина, Е.П. Ляпина, А.А. Шульдяков т др. //Успехи современного естествознания. 2006. - № 1. - С. 53.

56. Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей.- ГТСВ РФ: Методические указания.- утверждены 30.01.2003.- № МУ 3.1.7.1189-03.

57. Показатели цитокинового профиля у больных различными формами хронического бруцеллеза /Е.Г. Гладилина, А.А. Шульдяков, Е.П. Ляпина идр. //Успехи современного естествознания. 2006. - № 1. - С. 54.

58. Показатели интерфероногенеза у больных различными формами хронического бруцеллеза /О.Н. Мололкина, Е.Г. Гладилина, А.А. Шульдяков и др. // Успехи современное естествознания. 2006. - № 2. - С. 60-61.г

59. Рачкова О.Ф., Григорьева Г.И., Лазовская А.Л. Экспресс-идентификация бруцелл Методом газо-жидкостной хроматографии жирных кислот //Актуальн. вопр. профил: бруцеллеза: Сб.науч.тр. Нрвосбирск: НГУ.- 1989.-с. 129-130. '

60. Рягузов В.П., Потатуркин П.М. Изучение на овцах иммуногенности жидкой и сухой вакцины из штамма Br. abortus 21 //Сборник научных трудов Донского СХИ. 1976. - 711. - Вып. 2. - С. 105-109.

61. Ряплова И.В. Современные эпидемиологические особенности бруцеллеза в Оренбургской области //Здоровье наоелени^ и среда обитания. — 2007.-№ 9.'-С. 39-43.- х

62. Ряплова И.В., Скачков М.В. Эпидемиологическая характеристикаф * ' iвспышек бруцеллёза в Оренбургской области за 1990 2006 гг. //Здоровьенаселения и среда обитания. 2007. - № 11. - С. 37 - 39.-

63. Ряплова И.В. Заболеваемость бруцеллезом городского населения Оренбургской области //Материалы IX съезда Всерос. -науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и'паразитологов. М.: Санэпидмедиа.- 2007. -Т. 1.-С. 191. . ' '

64. Ряплова И.В., Скачков М.В. Вспышки бруцеллеза в Оренбургской области //Организация противоэпидемических мероприятий по профилактике геморрагической лихорадки с почечным синдромом: Материалы Всерос. на-уч.-практ. конф. Оренбург,'2007. - С. 138 - 140.

65. Самыгин В.М., Зыкин Л.Ф., Степанов В.М. Газохроматографиче-ский анализ жирнокислотного состава бактерий //Журнал микробиол,, эпидемиол. и иммунобиол. 1994.- № 4.- С. 10-12.

66. Скляров О.Д., Логинов Й.А., Серегин И.Г. Бруцеллез животных. Диагностика, профилактика, меры борьбы и ветеринарно-санитарная экспертиза.-М.: МГУПБ.-2008.-256 с."

67. Синдром эндотоксикоза у больных различными формами хронического бруцеллеза / Е.Г. Гладилина, О. Н. Мололкина, А.А. Шульдяков и др.

68. Успехи современного естествознания. 2006. - № 1. - С. 54-55.1.'

69. Совершенствование дйагностики хронического бруцеллеза: Информационное письмо'.- Утв. МЗ Сарат. обл. /сост: А.А. Шульдяков, О.Н. Мололкина, Е.Г. Гладилина! Саратов: Агро.- 2006. - 6 е.

70. Сочнев В'.В. Проявление бруцеллеза крупного рЬгатого скота в свежем эпизоотическом очаге //Методы профилактики и лечения инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных в Нечерноземье.- Горький: НИВИ.- 1984. -С.'21-27.1.'

71. Сочнев В.В.' Григорьева Г.И., Горчакова Н.Г. Нетрадиционные методы исследований при дифференциальной диагностике бруцеллеза живот' * * . •ных.- Н.Новгород: ДСХА.- 1997. 96 с.

72. Таран И.Ф., Лямкин- Г.И. Бруцеллез (Микробиология, иммунология, эпидемиологияj"профилактика). Ставрополь, 1996. - 176 с.

73. Шевкопляс В.Н. Обеспечение эпизоотического благополучия и безопасности в ветеринарно-санитарном отношении продукции животного происхождения российского производства в Краснодарском крае // Ветеринария Кубани.-№5.-2008.-С. 2-5. ,г

74. Юсковец М.К. Бруцеллез сельскохозяйственных животных.- М.: Колос. 1960. - 228 с.'.' "• *

75. Юсковец М.К., Комсова Д-.И. Данные по испытанию вакцины противбруцеллеза из штамма Br. abortus 68 // Труды ГНКИ вет. препаратов. 1955. 5.-С. 84-93..

76. Янышев А.А. Бруцеллёз крупного и мелкого рогатого скота в Южном федеральном округе: эпизоотологичекий мониторинг и совершенствование против9эпи-зо-отичеСких мероприятий.// Автореф. дисс. канд. вет. наук. -Москва. 2007. -21 с.

77. Янышев А-А. Эффективности вакцинопрофилактики против бруцеллёза сельскохозяйственных животных в Южном Федеральном округе //Деп. в

78. ВИНИТИ 25.04.2007 № 472-В 2007. . * ;1.. • • •

79. Яременко. Н.А. Эпи5осГгическая ситуация в мире и Российской Федерации. М.: Знание. - 200li ^ 48 с.

80. Яковлев • А.Г. Эп'изоотолого-эпидемиологическая характеристика бруцеллеза в Оренбургской области //Актуальные -проблемы здоровья населения Сибири: Сб.науч.тр. Ом.ск: ОГУ.- 2004. - Т. 1. - С. .382 - 385.• • *

81. Afzai М., Brodie S.J.,Tengerdy R.P. Isolation and antigenic activity of

82. Brucella ovis outer membrane proteins //J. Clin. Microbiol., .1987.-25. - P. 2132* . f *2137. ' ' '

83. Aldret-Servent A., Bourg G., Ramus M. DNA polymorphism in strains of the genus Brucella //J.Bacterid. 1989. - 170. - № 10 - P. 4603-4607.

84. Antczak D.F., Winter A.J. Evaluation of lymphocyte blastogenesis for diagnosis of bovine brucellosis // 3rd Inter. Symp. on Brucellosis. Algiers, Algeria., 1983. Envelop, biol.- Standard. - 1984. - V.56. - P.357-370.1. V *

85. Baldwin C.L.y Verstreate D.R., Winter A.J. Immune response of cattle to

86. Brucella abortus outer membrane proteins measured by lymphocyte blastogenesis //Vet. Immun. Immunopathol. 1985. -9. - P.383-388.

87. Bertram A.F., Eter C., Canning J.A. et al. Preferential inhibition of primary granule release from bovine neutrophilis by a brucella abortus extract // Inf. Imm. 1986. -V.52. - No.l. - P.285 - 292.

88. Berman D.T., Kurtz R.S. Relationship of biological activities to structures of brucella abortus endotoxin and LPS // Ann. Inst. Pasteur. Microbiol 1987. -138. -№ 1. P. 98-101."

89. Berman D.T., Wilson Ei.L, Moreno E. Characterization of Brucella abortus soluble antigen employed in immunoassay // J. Of Clinical Microbiol. 1980. -№ 11.-P. 355-362.'

90. Bosseray-N. Infection du placenta de la souris par Brucella pathogenie etimmunite // 3rd Inter. Symp. on Brucellosis. Algiers, Algeria., 1983. Develop, biol

91. Standard.- 1984. -V.56.- P!- 283-293.i

92. Canning P.C,., Roth J.A.,' Deyoe B.L Release of 5-guanosin monophos*»phate and adenin by B. abortus and their role in the intracellular survival of bacteria // J. Infeqt. Dis. 1986. - ,154.'. p 414. ' ^

93. Chen I.M., Thoen CQ.5jPietz D.E. Application often enzyme-linked im%munosorbent assay for detection of Brucella antigenes in vaginal discharge of cows //Amer. J. Vet. Res. 1984.- V. 45. - № 1 - P. 32-34.

94. Chukwu ,C.C. Comparison .of the brucellin skin test with the lymphocytef' • . ' . ;transformation test in bovine brucellosis // J. Hyg. 1986.- 96. - № 3. - P. 403-413.

95. Corbel M. J. Brucella phages : advances in the development of A reliable phage typing system smooth and non-smooth brucella isolates //2rd Forum in Microbiology Brucella and brucellosis Ann. Inst. Pasteuer Microbiol. 1987. - V. 138 .-№ l.-P. 70-75.

96. Corbel M. J. Brucellosis: An Overview // Emerg. Infect. Dis. 1997.

97. Apr; 3. P. 213-22 12. Lang R., Banai M., Lishner M., Rubinstein E. Brucellosis //1.ternational J. of Antimicrobial Agents. 1995. - 5. - N 4. - P.203-208

98. Dubray G Proective antigens in brucellosis // 2 rd Forum in Microbiology Brucella and brucellosis: Ann. Inst. Pasteur Microbiol. 1987. - V. 138 .- № 1.- P. 84-87.•t *

99. Frenchick P.J., Markham R.J., Cochrane A.M. Inhibition of phagosome-lysosome fusion in macrophages by soluble extracts of virulent Brucella abortus //1. У t ' • . •

100. Am. J. Vet. Res. 1985. - 46 3^2-338.i .

101. Juszczyk J. Brucella abortus infection as a-clinical problem // Hexagon1. F • % щ

102. Roche. 1984.- 12.- № 6. - P. 11-16. * • *i t * ,

103. Isbert R.R., Voorchis'D.L., Falkow S. Identification of invasin a protein that allows enteric bacteria to penetrate cultured mammalian Cells // Cell.- 1987.50. P. 769-775. •• ' , f ' •

104. Lord V.R., Rolo M.R., Cherwonogrodzky J. W. Evaluation of humoral immunity to Brucella spp. in cattle by use of an agar-gel immunodiffusion test containing a polysaccharide antigen // Amer. j. Veter. Res. 1989.,- V. 50. - № 11. - p. 1813-1816. ; .r

105. Lubani M., Sharda D., Helin T. Probable transmission of brucellosis from breast milk to a newborn // Trop. Geogr. Med. 1988. - 40. - P. 151-152.

106. Marx A., Jonescu J., Pop A. Immunochemical studies on Brucella abortus lipopolysaccarides //Zbl. Bakt.'; I. Abt. Orig. 1983. - 253. - P.544-553.к• r •

107. Meyer M.E. Inter and'intra-strains variants in the genus Brucella // 3rd Inter. Symp. on Brucellosis , Algiers, Algeria., 1983. - Develop, biol Standard .1984. V. 56".-P.79-83.

108. Montaraz J'.A., Winter A.J., Hunter D.M . Protection against Brucella abortus m mice with O-polysaccharide-specific monoclonal antibodies I I Infect. Immun. 1986. - 51.- P. '961-963. Jt » •л . "

109. Morgan W.J.B. Brucella classification and regional distribution // 3rdi1.ter. Symp. On Brucellosis , Algiers, Algeria., 1983. Develop, biol Standard . -1984. - V. 56. - P.45-53.

110. Nielsen K„ Wright P. F., Cherwonogrodzky J., Duncan J. R. Enzyme immunoassay for diagnosis of bovine brucellosis // 2rd Forum in Microbiology Brucella and brucellosis: Ann. Inst! Pasteur Microbiol. 1987. - V. 138 .- № 1.-P.75-79. - ' * •; ' T

111. Plommet M. Brucellosis and immunity : Humoral .and cellular compoTnents in mice// 2rd Forum in Microbiology Brucella and'brucellosis: Ann. Inst. Pasteur Microbiol-. 1987. - V. 138 .- № 1 . P.105-110.1

112. Riley L,'Robertson D. Ingestion and intracellular survival of Brucellaabortus in human and bovine, polymorphonuclear leukocytes // Infect, and Immun.- 1984. 46. - № 1. - P-224-230. i

113. Ryter A., Chastelli.er C. Phagocyte Pathogenic Microbe Interactions

114. Anternat. Review of Cytology, 1983. - 85. - P. 287-327.

115. Santos J. М.м Verstreate D. R., Perera V. V., Winter A. J. Outer membrane proteins from rough strains of four Brucella species // Infect. Immun. 1984. -46. -P. 188-194:

116. Smith L. D., Ficht T. A. Pathogenesis of Brucella // Crit. Rev. In Microbiology. 1990. - 17. -№ 3. - P. 209-230.

117. Tabatabai'L В., Deyoe B.L Specific Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Detection of Bowine Antibody to Brucella abortus // J. Ctin. Microbiol. -1984. 20. - № 2. - P. 209-213.'

118. Verstreate D.R. Creasy M.T., Caveney N.T. Outer membrane proteins of Brucella abortus isolation and characterization // Infect. Immun. 1992. - 35. -P. 979-984. . ' \

119. Winter A.J-., Rowe G.E., Duncan J.R. Effectivenes of natural and syn?thetic complexes of porin arid О polysaccharide as vaccines against Brucella abortus in mice // Infect, and Immun: -2002.- 56.- № 11.- P. 2808-2817.•

120. Worthington R., Weddelt A.,'Penrose M. Comparision three serologica.l methods for , detecting B.ovis infected ovises // New Zeland Vet. J. 1994. - 32. -P. 58-60.