Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование полимеразной цепной реакции для выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кадыкоев, Руслан Тутович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Современнные сведения о ринопневмонии лошадей.

2.2. Диагностика ринопневмонии лошадей.

2.2.1. Лабораторная диагностика.

2.3.Современные методы анализа генома герпесвирусов.

2.3.1. Рестрикционный анализ ДНК герпес-вирусов.

2.3.2. Использование молекулярной гибридизации для выявления ДНК герпесвирусов.

2.3.3. Определение первичной последовательности нуклеиновых кислот.

2.3.4. Использование метода ПЦР для выявления нуклеиновых кислот при герпесвирусных инфекциях.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование полимеразной цепной реакции для выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей"

Инфекционная ринопневмония лошадей наносит значительный экономический ущерб коневодству, который складывается из потери воспроизводительной способности конематок, выбраковки ценных в племенном отношении животных, проведения ветеринарно-санитарных мероприятий.

Ринопневмония лошадей, возникнув в коневодческом хозяйстве, принимает характер стационарной инфекции. Острое течение инфекции чередуется с периодами стертого атипичного проявления болезни, что крайне осложняет диагностику заболевания. В естественных условиях вирус ринопневмонии поражает лошадей, ослов и мулов, независимо от пола, породы и возраста. Отмечено, что чистокровные лошади более восприимчивы, чем полукровки и местные породы.

Поэтому в системе мер, направленных на борьбу с ринопневмонией лошадей, важное значение имеют быстрые и точные методы лабораторной диагностики. Используемые в настоящее время в ветеринарной практике серологические методы диагностики имеют определенные недостатки. Предварительная клиническая диагностика респираторной формы болезни затруднительна, так как симптомы заболевания сходны с клиникой других вирусных болезней, особенно гриппа лошадей.

Диагностика инфекционной ринопневмонии включает клинический осмотр, учет нарастания случаев абортов во второй половине жеребости, выделение и идентификация вируса на культуре клеток, выявление антител методами ретроспективной диагностики (МФА, РН, ИФА, РТГА, РГА, РСК).

В последние годы проводятся интенсивные исследования по разработке новых методов диагностики ринопневмонии лошадей, которые основаны на достижениях молекулярной биологии. Особенностью этих методов является то, что в их основе лежит изучение структурной организации генома герпесвирусов животных или продуктов его экспрессии - вирусспецифических белков.

В настоящее время для идентификации герпесвирусов животных широко применяют такие высокочувствительные методы исследования генома, как рестрикционный анализ, молекулярная гибридизация, секвенирование и полимеразная цепная реакция.

На территории Кабардино-Балкарской Республики (КБР) размещается три государственных конных завода, около десяти племенных конеферм, Государственная Заводская Конюшня, Республиканский ипподром и свыше 30 конеферм, где разводят в основном местную породу. Кроме, местной, кабардинской породы, в республике разводят племенные английскую и арабскую чистокровные породы, а также полукровных лошадей этих пород, которые выращиваются в основном для спорта и продажи.

За последние 3-4 года в КБР наблюдается тенденция сокращения поголовья лошадей. Так, на 1 января 1996 года в республике насчитывалось лошадей свыше 12 тыс. голов, к началу 1997 года сократилось до 8,5 тыс. голов. К концу 1998 года поголовье лошадей уменьшилось до 6428 голов. Ежегодно в республике отмечаются вспышки гриппа, ринопневмонии, мыта жеребят, лептоспироза, случной болезни лошадей.

Анализ воспроизводства лошадей в двух племенных конефермах Чегемского района КБР ( Коллективно-Долевое Хозяйство "Чегем" и Акционерное Общество "Шаджем") показал, что в КДХ "Чегем" за 1995, 1996, 1997 годы выход жеребят составил 45 %, 49%, 51% , а в АО "Шаджем" за этот же период (1995-1997 гг) выход составил 52%, 57%, 43% „соответственно. При этом падеж молодняка в возрасте до одного года равнялся от 42 до 45 % от количества всех павших лошадей. Помимо скрытых и поздних абортов среди конематок, отмечается высокий уровень заболевания молодняка респираторными заболеваниями. При исследовании материалов от абортированных плодов в Республиканской ветеринарной лаборатории возбудителей вирусных болезней лошадей традиционными методами не выявлено, в то же время исходя из клинико-эпизоотологических данных и результатов серологических исследований, очевидно, что одной из причин такого положения может быть хроническая форма ринопневмонии лошадей. Эти данные свидетельствуют о необходимости разработки более чувствительных и специфичных диагностических тест-систем, особенно для выявления латентных и персистирующих форм вируса ринопневмонии лошадей.

Перечисленные выше обстоятельства явились основополагающими в определении выбора темы диссертационной работы.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение возможности использования ПЦР для выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей и применения этого метода для диагностики болезни.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить факторы, влияющие на уровень накопления референс-штамма «Кентукки-Д» вируса ринопневмонии лошадей в перевиваемых клетках, и определить оптимальные параметры его культивирования;

2. Провести рестрикционный анализ ДНК вируса ринопневмонии лошадей (референс-штамм «Кентукки-Д») , выращенного в монослое перевиваемых клеток МДВК;

3. Подобрать специфичные праймеры и оптимизировать условия постановки полимеразной цепной реакции для выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей;

4. Разработать «Набор препаратов .» для выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей в пробах патматериала на основе метода полимеразной цепной реакции и оценить его специфичность и чувствительность;

5. Изучить возможность использования полимеразной цепной реакции для оценки полноты инактивации вируса ринопневмонии лошадей .

Научная новизна работы. Научная новизна работы заключается в следующем: впервые, применительно к вирусу ринопневомнии лошадей подобраны специфичные праймеры комплементарные гену гликопротеина , выявляющие ДНК вирулентного и вакцинного штаммов вируса, определены оптимальные параметры постановки ПЦР для обнаружения вирусной ДНК с целью диагностики; с помощью рестрикционного анализа установлена генетическая однородность референс-штамма «Кентукки-Д» вируса ринопневмонии лошадей; впервые изучен механизм инактивации вируса ринопневмонии лошадей сернокислой медью.

Практическая значимость. По результатам исследований разработаны: - «Набор препаратов для выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей методом ПЦР», временное наставление и методические указания по постановке ПЦР для выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей в пробах органов, утвержденные директором ВНИИВВиМ;

- метод рестрикционного анализа генома вируса ринопневмонии лошадей, который может быть использован для идентификации и дифференциации штаммов вируса, паспортизации производственных и референс-штаммов, а также для контроля за изменениями вируса в процессе культивирования; способ оценки полноты инактивации вируса ринопневмонии лошадей сернокислой медью, заключающийся в определении целостности вирионной ДНК методами полимеразной цепной реакции и электрофореза в геле агарозы.

Положения выносимые на защиту: оптимизация параметров культивирования и рестрикционного анализа ДНК референс- штамма «Кентукки-Д» вируса ринопневмонии лошадей; результаты разработки «Набора препаратов» для выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей в пробах патматериала методом полимеразной цепной реакции; способ контроля полноты инактивации вируса ринопневмонии лошадей сернокислой медью методом полимеразной цепной реакции. Апробация результатов исследований. Материалы исследований доложены и обсуждены на: - заседании ученого совета Кабардино-Балкарской Государственной сельскохозяйственной академии 1998 г; Всероссийских научных конференциях по ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии, г. Москва, ВИЭВ,1998 г; ВНИИВВиМ, г. Покров , 1998 г.

Публикация результатов исследований. По результатам исследований опубликовано 5 статей. Исследования по теме диссертации выполнены по теме 01.03.02.М. в лаборатории Биофизики ВНИИВВиМ и на кафедре Акушерства и незаразных болезней КБГСХА. Отдельные фрагменты экпериментальных исследований выполнены совместно с сотрудниками лаб. «Биофизики» и «Музейных штаммов» ВНИИВВиМ Цыбановой Л.Я., Чевелевой Т.С., Щетниковой Л.А., Балышевым В.М., которым автор выражает искреннюю благодарность.

Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на £ {9 стр. страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, приложение и список литературы, содержащий 35 отечественных и 120 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами и 9 рисунками.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Кадыкоев, Руслан Тутович

5.ВЫВОДЫ

5.1. Определены оптимальные параметры накопления референс-штамма «Кентукки-Д» вируса ринопневмонии лошадей в монослое перевиваемой культуры клеток МДВК, обеспечивающие максимальный урожай возбудителя (6,75 -7,25 lg ТЦД 50/мл); посевная концентрация клеток 100 - 120 тыс/мл; множественность заражения ОД - 1,0 ТЦД 50/клетка; питательная среда Игла MEM со сменой после заражения (без сыворотки); температура (37+1 С); продолжительность выращивания 2-3 суток.

5.2. Картина рестрикции ДНК вируса ринопневмонии лошадей (рефренс-штамм «Кентукки-Д»), адаптированного к перевиваемой культуре клеток МДВК, остается стабильной и не зависит от множественности заражения (0.1 - 1.0, ТЦД 50/клетка), уровня пассажа (10 -15). Схемы распределения и размеры рестрикционных фрагментов ДНК являются генетическими маркерами штамма и могут быть использованы для паспортизации и оценки стабильности производственных штаммов.

5.3. Отработаны условия постановки гнездовой полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности гена гликопротеина В. Полученный на матрице ДНК вируса ринопневмонии лошадей продукт ПЦР размером 602 п.о. специфически гибридизуется с вирионной ДНК ринопневмонии лошадей (рефренс-штамм «Кентукки-Д»). Разработанный нами Набор с использованием выбранных праймеров, пригоден для выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей в пробах инфицированной культуры клеток и в патматериалах с содержанием вируса 1-10 ТЦД50/мл и выше.

5.4. Установлено, что одной из причин абортов кобыл в двух племенных конефермах Чегемского района КДХ «Чегем» и АО «Шаджем» Республики Кабардино-Балкария может являться ринопневмония лошадей, ДНК вируса которой обнаружена с помощью ПЦР в патматериале, полученном от абортированных плодов, павших жеребят и лошадей с признаками пареза или паралича

5.5. Определены режимы инактивации референс- штамма «Кентукки-Д» вируса ринопневмонии лошадей сернокислой медью. Установлено, что сернокислая медь в концентрации 1-5 мМ, при температуре 37° С, pH 7,2-7,5 в течение 18 часов способствует разрушению нуклеиновой кислоты вируса ринопневмонии лошадей до низкомолекулярных фрагментов, не обладающих инфекционностью.

5.6. Разработан способ контроля полноты инактивации вируса ринопневмонии лошадей (рефренс-штамм «Кентукки-Д») сернокислой медью с использованием методов ПЦР и электрофоретического анализа вирионной ДНК, что позволяет с помощью указанного метода в течение 2 суток определить полноту инактивации вируса ринопневмонии лошадей и может служить тест-системой технологического контроля при изготовлении инактивированных препаратов.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

6.1. Разработанный метод идентификации возбудителя ринопневмонии лошадей на основе полимеразной цепной реакции может быть рекомендован для включения в схему лабораторных исследований с целью диагностики болезни. Разработаны «Набор препаратов» на основе полимеразной цепной реакции » пригодный для выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей в инфицированных клеточных культурах, пробах органов, спермах жеребцов- производителей и объектах ветеринарного надзора, Наставление по применению и «Методические указания.^

6.2. Рестрикционный анализ ДНК вируса ринопневмонии лошадей может быть использован для паспортизации вирулентных референс-штаммов и производственных штаммов, контроле препаратов вируса при хранении и для регистрации изменений генома в процессе культивирования и пассирования возбудителя.

6.3. Анализ целостности вирионной ДНК в инактивированных сернокислой медью препаратах вируса ринопневмонии лошадей методами ПЦР и электрофореза в геле агарозы может быть использован для оценки полноты инактивации вируса при изготовлении вакцин.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кадыкоев, Руслан Тутович, Покров

1. Альжанова А.Г., Генералова В.М. Определение нерадиоактивно-меченной фотобиотином ДНК с использованием конъюгатов стрептавидина с пероксидазой или щелочной фосфатазой.// Молекбиол., 1991, том 22, 3, с.780.

2. Андреев В. Г. Конструирование методом сайт-специфического мутагенеза кассетного вектора для изучения структуры и функции генома вируса ящура.//Диссертация, 1993, Владимирг

3. Аянот П.К. Структурно-функциональные особенности поверхностных гликопротеинов вируса чумы крупного рогатого скота.//Диссертация, 1996, Владимир, ВНИИЗЖ, с. г*- л о

4. Безбородова C.B., Дрыгин В.В., Перевозчикова H.A. Повышение чувствительности и специфичности метода ПЦР для ывявления вируса КЧС.// Тезисы научно-практической конференции ВНЙИЗЖ, г.Владимир, 1995 г., с.128.

5. Бектимиров Т.А Гибридизация нуклеиновых кислот как средство быстрой вирусологической диагностики.// Вопросы вирусологии, 1988, 1, с. 110-117.

6. Белохвостов АС. Полимеразная цепная реакция и лигазные реакции, принципы, традиционные методики и нововведения.// Мол.,генетика микробиол., вирусология, 1995, 2, с. 21-26.

7. Дрокин Д.А, Злобин В.И., Шаманин В.А. Выбор оптимальных олигонуклеотидных зондов для идентификации флавивирусов. // Итоги науки и техники. Сер. Вирусология. 1992, т.28, N2.

8. Еремин В.Ф., Попов С.А., Кучеров И.И., Рытик П.Г. Использование полимеразной цепной реакции для контроля за латентной ВИЧ-инфекцией in vitro. // Вопр. вирусол. 1991, т.36, N4, с. V.T- iff

9. Ю.Забегина Е.Ф. Типирование герпесвирусов лошадей методом рестрикционного анализаДНК и изыскание вакцинного штамма.//Диссертация , Москва. ВИЭВ, 1998аг. с. St-So,

10. Кумекбаева Ж.Ж., Юров К.П. Иммунологические реакции у лошадей на введение инактивированного вируса ринопневмонии.//Ветеринария, 1988,5, с.24-26.

11. Ломакина Н.Ф. Структура гена РНК-полимеразы и разработка метода выявления вируса ящура.//Диссертация, 1995, Владимир, ВНИЯИ.

12. Мазин АВ., Кузнеделов К.Д., Краев АС. и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии //1990, с. 116.

13. Малыгин Э.Г., Блинов В.М. Поксвирусы и иридовирусы.// Молек. биология, 1995, 3,706-714.

14. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж.// Методы генетической инженерии.// Молекулярное клонирование, 1984, с. 102-103, Москва, " Мир ".

15. Макаров В.В., Сенечкина Е.В. Рестрикционный анализ вирусной ДНК и вопросы эпизоотологии.// Вестник сельскохозяйственной науки, 1991, N 3, с. 143-146.

16. Мухаметгалиев Х.Г. Возможности использования цепной полимеразной реакции для выявления вирусов.//Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. Покров, 1990. с. 44-46.

17. Николаева Е.С, Волчек И.А Наумов В.А Метод точечной гибридизации. // Вопросы вирусологии, 1990, N5, с.385-386.

18. Устаров Р.Д. Разработка инактивированной вакцины против классической чумы свиней. // Канд. дисс., Покров, 1993.

19. Петров B.C., В.В.Располин, В.Н.Пак, И.Х.Урманов, Н.Б.Черный. Изучениеклоновых вариантов штамма Л-ИВП вируса осповакцины.// Вопр. вирусологии, 1991,3, с.235-237.

20. Перевозчикова H.A. Структура и функции генома вируса и разработка новых средств диагностики и профилактики ящура.//Диссертация, ВНИИВВиМ, Покров, 1995 г.

21. Рыбаков С.С. Структура генома вируса ящура и создание пептидных противоящурных вакцинных препаратов.//Диссертация, ВНИИВВиМ, Покров, 1992 г.

22. Селянинов Ю.О., Сенечкина Е.К. Физическое картирование генома вируса АЧС.// Доклады РАСХН, 1995, N.2, с.37-39.

23. Сосновцев C.B. Вирус ящура: первичная структура генома штамма А/22-550 и генов VPI лотечяественных производственных штаммов, экспрессия антигенных детерминант в составе В-галактозидазы Е.coli.//Диссертация, 1993, Владимир, ВНИЯИ.

24. Сюрин В.Н., Самуйленко АЯ., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных.// Москва, ВНИТИБП, 1998, с. 294-319

25. Тарантул В.З., Гольцов В,А, Газарян К.Г. Молекулярная гибридизация как метод исследования структуры и функции нуклеиновых кислот.//Итоги науки и техники. Сер. Молекулярная биология, 1979, т. 16, с. 5-53.

26. Щербаков А. В. Сравнительный анализ первичной структуры гена и белка Vpl эпизоотических, производственных и отличающихся по биологическим свойствам лабораторных штаммов вируса ящура.// Диссертация, 1995, Владимир.

27. Юров К.П. Инфекционные болезни лошадей.// Москва, 1988 г., с. 87.

28. Юров К.П., Лопарев В.И., Ярных Е.В., Забегина Е.Ф., Белкина Н.М. Вакцина для профилактики гриппа и ринопневмонии лошадей и способ ее применения .// Авторское свидетельство, N 1608893 от 22 июня 1990 г. 8 с.

29. Adrian T., Wadell J.C., Wigand R. DNA restriction analysis of adenovirus prototype 1 to 41.// Arch. Virology, 1986, 91, p. 217-220.

30. Audonett J.C., Winslow J., Allen G.P. , Paoletti E. Equine herpesvirus type I unique short fragment encodes glycoproteins with gomology to herpes simplex virus type I gD, gl and gE.// J.Gen. Virol., 1990, v. 71, p.2969-2978.

31. Andreasen J.R., J.V. Glisson, P. Villegas. Differentiation of Vaccine strain and Georgia field isolatesof Infectious Laringoptracheitis Virus by their restriction endonuclease fragments patterns.// Avian Disease, 1990,34, p.646-656.

32. Bevan I.S., Daw R.A, Day P.J.R., Ala F.A, Walker M.R. Polymerase chainreaction for detection of human cytomegalovirus infection in a blood donor population.// Brit. J. Haematol., 1991, V.78, N1, p. 94-99.

33. Blasco R., de la Vega I., Almazan F., Aguero M., Vinuela E. Genetic variation of African Swine Fever virus: variable regions near the ends of the viral DNA// Virology, 1989, V. 173, p. 251-257.

34. Bonass W.A., Hudson W.A., Elton D.M., Killington R.A, Halliburton I.W. Inter-Strain and Intra-Strain Genomic Variation in Equine Herpesvirus Type-1 Isolates.// Arch. Virology, 1994, V.134, N1-2, p. 169-178.

35. Borchers K., Slater-J. A Nested PCR for the Detection and Differentiation of EHV-I and EHV-4.// J.VIROLOGICAL METHODS .- 1993, V. 45, n. 3, p. 331-336.

36. Brock, K.V. and Potgieter, L.N.D. Detection of bovine viral diarrhea virus in serum from cattle by dot blot hybridization assay.// Vet. Microbiol., 1990, V.24, p.297-306.

37. Brown, T.M., Osorio, F.A. and Rock, D.L. Detection of latent pseudorabies virus in swine using in situ hybridization.// Vet. Microbiol., 1990, V.24, p. 273-280.

38. Browning G.F., Studdert M.J. Physical mapping of a genome of equine herpesvirus 2 (equine cytomegalovirus ).// Arch. Virology, 1989, v. 104, n.1-2, p. 77-86.

39. Bruce Christine, Chadwich Patricia, Al-Nakib Widad. Detection of rhinovirus RNA in nasal epithelial cells by in situ hybridization./ J. Virol.Meth., 1990, V.30, N1, p. 115-126.

40. Brytting Maria, Sundgvist Vivi- Anne, Stahlhandske Per, Linde Annika, Wahren

41. Britta. Cytomegalovirus DNA detection of an immediate early protein gene with nested primer oligonucleotides.//'!Virol.Methods, 1991,'V.32, N2-3,p. 127-138.

42. Buchman T.G., Roizman B., Nahmias A.J. Demonstration of Exogenous genital reinfection with Herpes simplex Vims type 2 by restriction endonuclease fingerprinting of viral DNA.// J.Infeet.Disease, 1979, V. 140, p.295.

43. Buchman T.G., Roizman B., Adams G. Restriction endonuclease fingerprinting of Herpes simplex virus DNA: a novel epidemiological tool applied to a nosocomial outbreak.//J.Infect.Disease, 1978, V. 138, p.488.

44. Budulov N.R., Galnbek T.V., Taktashev S.S. Sensitivity odf diploid cell cultures from porcine thyroid to equine herpesvirus type I.// Trudy Vsesouuyznogo Instituta Eksperimentalnoi eterinarii.//1987,64, p. 34-35.

45. Cheney I.W., Larson M.D., Mecham J.O., Wilson W.C. Geographical Genetic-Variation in the Gene Encoding Vp3 from the Alberta Isolate of Epizootic Hemorrhagic- Disease Virus.// Virus Research, 1995, V.36, N2-3, p. 279-286

46. Chowdhury S.I., Ludwig H., Bunk H.J. Molecular biological characterization of equine herpes virus type I (EHV-I) isolates from ruminants hosts. // Virus Research, 1988, v.2, n. 11, p. 127-139.

47. Chou S. and Merigan T.C. Rapid detection and quantitation of human cytomegalovirus in urine through DNA hybridization.// New England Journal of Medicine, 1985, V. 308, p. 921-925.

48. Collins A Equine herpesvirus.// Veterinary Record, 1989, v. 124, n.18, p.496.

49. Crabb B.S., MacPherson C.M., Studdert M.J., Drummer H.E. A type-specific serological test to distinquish anthybodies to equine herpesvirus 4 and l.//Arch. Virology, 1993,140, p.245-258.

50. Darville J.M., Harbour D.A, Hill T.J. Restriction endonuclease analysis of herpes simplex virus from recrudescent lesions, from latent infection and during passage in the skin and nervous system of myce.//J.Gen. Virology, 1987, V.68, p.907-911.

51. Dictor M., Renfjard E., Brun A In situ hybridization in herpetic lesions using a biotinylated DNA probe.// J. Clin. Pathol., 1990, V.2, p. 416-419.

52. Doll E.R. , Wallace M.E. Cultivation of equine abortion and equine influenza viruses on the chorio allantoic membrane of chickenembrious.// Cornell Vet., 1954, 44, p.453-461.

53. Drygin V. V., Sherbakov A.V., Perevozchikova H.A, Gusev A A Amplification and sequencing of genome segments of FMD virus using PCR.// Eur.Commun.FMD. Vienna, Austria, 19-22 Sept. 1994, p.6.

54. Dunger, C.A, Dunn, S.J., Squire, K.R.E., Stott, J.L. and Oaburn, B.I. Rapid identification of bluetongue virus by nucleic acid hybridization in solution. J. Virol. Methods, 1988, V.20, p.353-365.

55. Dunn, D.C., Blair,C.D., Ward, D.C. and Beaty, B.J. Detection of bovine herpesvirus-specific nucleic acid by in situ hybridization with biotinylated DNA probes.//Am. J. Vet. Res., 1986, V.47, p. 740-746.

56. Edington- N., Welch-HM GrifFiths-L. The Prevalence of Latent Equid Herpesviruses in the Tissues of 40 Abortion Horses.// EQUINE VETERINARY J. 1994, V. 26, n. 2, p, 140-142.

57. Edington N. Latency of equine herpes virus 4.// Vet. Records, 1988 6, v. 123, n. 25, p. 653-654.

58. Engels M., Steck F., Wyler R. Comparison of the genomes of infectious bovine rinothracheitis and infectious pustular vulvovaginitis virus strains by restriction endonuclease analysis.//Arch.Virology, 1981, V.67, p. 169-176.

59. Ermine A, Larzul D., Ceccaldi P.E., Guesdon J.-L., Tsiang H. Polymerase chain reaction amplification of rabies virus nucleic acids from total mouse brain RNA// Mol. and Cell Probes, 1990, V.4, N 3, p. 189-191.

60. Fife K.H., Ashley AF., Shields D., Satter J.D., Meyers J. Comparison of neutralization anfd DNA restriction enzyme methods for tryping clinical isolates of human adenoviruses.//!Clin.Microbiology, 1985, V.22, p.95-100.

61. Frank C. Equine herpesvirus outbreaks.// Veterinary Record, 1989, v. 124, n.17, p.471.

62. Gielkens AL. Restriction endonuclease patterns of the Genome of Aueszky disease virus isolated from latently infected pigs.//Latent Herpesvirus Infections in Veterinary Medicine (Ed. Witmann G.) Boston, 1984, p.385-389.

63. Gill M.G., Denhollander C. DNA restriction enxyme analysis of digital and genital isolates of Herpes simplex virus from three patients.// J.Infect.Disease,1988, V.158, p.242.

64. Gilkerson J., Jorm-LR Love-DN Lawrence-GL Whalley-JM. Epidemiologic Investigation of Equid Herpesvirus-4 (EHV-4) Excretion Assessed by Nasal Swabs Taken from Thoroughbred Foals.// VETERINARY MICROBIOLOGY, 1994, V. 39, n. 3-4, p. 275-283.

65. Gou Deng Fu, Kubota Hiroshi, Onuma Nisao, Kodama Hiroshi. Detection of salmonid herpes virus in fish by Southern-blot technique.// J. Vet. Med. Sci., 1991, V. 53, N1, p. 43-48.

66. Gutekunst D.E. Latent pseudorabies virus infection in swine detected by RNA-DNA hybridization.//Am.J. Vet. Res., 1979, V.40, p. 1568-1572

67. Hammerschmidt W., Ludwig H., Bunk H.J. Short repeats cause heterogeneity at genomic terminus of bovine herpes virus.//J.Virology, 1986, V.58, p. 43-50.

68. Herold B.C., WuDunn D., Soltys N., Spear P.G. Glycoprotein C of herpes simplex virus type I plays a principial role in the adsorption of virus to cells and in infectivity.//J.Virol., 1991,v.65,p. 1090-1098.

69. Jana AM., Pandya G., Rao K.M. Evidence of complement fixing anthybodies against equine rhynopneumonitis virus in army horses and mules.// Current Sciences, Banglacore, India, 1980, v.49, n.17, p.675-677.

70. Johnson M. A, Tyack S.G. Molecular Evolution of Infectious Laryngotracheitis Virus (Iltv, Gallid-Herpesvirus-1) An Ancient Example of the

71. Alphaherpesviridae .//Vet.Microbiology, 1995, V.46, N. 1 -3, p. 221-231.

72. Jouvenne, P., Dion, M. and Hamelin, C. Cloning, physical mapping and cross hybridization of the canine adenovirus types 1 and 2 genomes.// Gene, 1987, V.60, p. 21-28.

73. Karlin S., Mocarski E.S., Schachtel G. A Molecular Evolution of Herpesviruses -Genomic and Protein-Sequence Comparisons.// J. Virology, 1994, V.68, N.3, p. 1886-1902.

74. Keam L., J.J.York, M.Sheppard, K.J.Fahey. Detection of Infectious Laringotracheitis Vims in chickens using a non-radioactive DNA-probe.//Avian Disease, 1991, 35,257-262.

75. Kennedy T.P., Evermann J.F., Cheevers W.P. Restriction endonuclease patterns of bovine herpesvims type 1 isolated from bovine mammury glands.//Am.J. Vet.Res., 1986, V.47, p.2525-2530.

76. Kirisawa R., Ui S., Takahashi A, Kawakami Y., Iwai H. Comparison of the

77. Genomes of Attenuated Equine Herpesvirus-1 Strains with Their Parent Virulent-Strain./ZVirology, 1994, V.200, N.2, p. 651-660

78. Kotiw M., Wilks C.R., May J.T. The Effect of Serial in-Vivo Passage on the Expression of Virulence and DN A Stability of an Infectious Laryngotracheitis Virus-Strain of Low Virulence.//Vet. Microbiology, 1995, V.45, N.l, p. 71-80

79. Kulski, J.K. and Noral, M. Nucleic asid probes in diagnosis of viral diseases of man.// Arch. Virol., 1985, V.83, p.3-15.

80. Kumekbaeva Zn.Zn., Budulov N.R. Sensitivity of various cell culture to equine rhinopneumonitis herpesvirus.// Bulleten Vsesouyznogo Instituta Eksperimentalnoi Veterinarii.//1987,61, p. 54-56.

81. Lindenmaier W., Bauer H.J. Cosmid Cloning and Restriction-Endonuclease Mapping of the Herpesvirus of Turkeys (Hvt) Genome.// Arch. Virology, 1994, V. 135, N.l-2, p. 171-177.

82. Liu S.T., Li S.N., Wang D.C., Chang S.F., Chiang S.C., Ho W.C., Chang Y.S., Lai S.S. Rapid detection of hog cholera virus in tissues by the polymerase chain reaction.// J. Virol. Methods, 1991, V.3, p.227-236.

83. Li Y.H., van Drunen S., Babijak L. A., Liang X.P. Characterization of cell-binding properties of bovine herpes virus I glycoproteins B,C, D: identification of a dual cell-binding function of gB.// J.Virol., 1995, v.69, p.4758-4768.

84. Lockensgard J.R., Thawley D.G., Molitor T.W. Enzymatic amplification of latent pseudorabies virus nucleic acids sequences.//!Virol.Meth., 1991, V.34, N.l, p.45-55.

85. Low T., J. Shareiikin, S.Q. Yang and C.W. Dieffenbach. A computer program for selection of oliconucleotide primers for polymerase chain reaction.// 1990, p. 546-548.

86. Matsumura T., Smith R.H., Callaghan D.J. DNA sequence and transcriptional analysis of the region of the equine herpesvirus type I Kentucky A strain genome encoding glycoprotein C.// Virology, 1993, v. 193, p.910-923.

87. Mccann S.H., Mumford J.A, Binns M.M. Development of PCR Assays to Detect Genetic-Variation Amongst Equine Herpesvirus-1 Isolates as an Aid to Epidemiologic Investigation.// J. Virol., Methods, 1995, V.52, N.l-2, p. 183-194.

88. McColl K.A., Gould A.R., Pritchard L.I., Melville L., Bellis G. Phylogenetic Characterization of Bluetongue Viruses from Naturally-Infected Insects, Cattle and Sheep in Australia.// Austr. Vet. J., 1994, V.71, N4, p. 102-105

89. McCol Kenneth A, Gould Allan R. Detection and characterisation of bluetongue virus using the polymerase chain reaction.//Virus. Res. 1991. V.21, N 1, p. 19-34.

90. McFarland M.D., Hill H.T., Tabatabai L.B. Characterization of Virulent and Avirulent strains of Pseudorabies Vims for Thimidine kinase activity, virulence and restriction pattems.//Can.J.Vet.Res., 1987, V.51,p.334-350.

91. McNicol Patricia, Dodd Janice G. Detection of papillomavirus DNA in human prestatic tissue by Southern blot analysis Can. //J. Microbiol., 1990, V.36, N.5, p.359.362.

92. Meyer H.? Hubert P. Isolation and Characterization of Monoclonal Anthybodies against an Attenuated Vaccine Strain of Equine Herpesvirus Type 1 (EHV-1).// Vet. Microbiology, 1988, v.18, n.l, p.95-101.

93. Meyer R. F., Brown c.c., House C., House J. A, Molitor T. W. Rapid and sensitive detection of foot-and-mouth disease virus in tissues by enzymatic RNA amplification of the polymerase gene.// J. Virol. Meth., 1991, V.34, N2, p. 161-172.

94. MisraV., Babjuk L.A, Darcell C. Analysis of bovine herpes-virus type 1 isolates by restriction endonuclease fingerprinting.//Arch.Virology, 1983, V.76, p.341-352.

95. Metcalf Theodore G., Joseph L. Nucleic acid probes and molecular hybridization for detection of viruses in environmental samples.// Progr. Med. Virol., 1988, V.35, p. 186-214.

96. Mettenleiter T.C., Zsak L., Zuckermann FR., Sugg N., Ben-Porat T. Interaction of glycoprotein gill with a cellular heparin-like substance mediates adsorption ofpseudoreabies virus.//! Virol., 1990,64,278-286.

97. Morris C.M., Field H.J. Application of cloned fragments of equine herpesvirus type-I for detection of virus-specific DNA in equine tissue.// Equine Vetetrinary J. 1988. v. 20, n.5, p. 341-346.

98. Quan-Gen Li., G. Wadell. Comparison of 17 Genome Types of Adenovirus Type 3 Identified among Strains Recovered from Six Continents.// J.Clin.Microbiology, 1988, V.26,5, p.1009-1015.

99. Rajcani J., Labodyova A, Compel P., Roubalova K. Typing of Human Herpes Virus-6 DNA by Restriction- Endonuclease Cleavage of the Polymerase Chain-Reaction Product Source.// Acta Viriologica, 1995, V.39, N.2, p. 113-115

100. Ridpath, J., Paul, P.S. and Mengeling, W. L. Comparoson of porcine parvovirus to other parvoviruses by restriction site mapping and hybridization analysis of southern blots.//J.Gen. Virol., 1987, V.68, p. 895-900.

101. Riggio M.P., Cullinane AA., Onions D.E. Identification and nucleotide sequence of the glycoprotein gB gene in equine herpesvirus 4.// J. Virology, 1989, v.63, n. 3, p. 1123-1133.

102. Sabine M., Robertson G.R., Whaley J.M. Differentiation of subtypes of Equine Herpesvirus type 1 by restriction endonuclease analysis.//Aust. Vet.J., 1981, V.57, p. 148-152.

103. Seal B.S., St.Jeor S.C., Taylor R.E. Restriction endonuclease analysis of bovine herpesvirus 1 DNA and nucleic acids homology between isolates.//J.Gen.Virology, 1985, V.66, p.2787-2793.

104. Sharma P.C., Cullinane-AA Onions-DE Nicolson-L. Diagnosis of Equid Herpesviruses-1 and Herpesviruses-4 by Polymerase Chain-Reaction.//

105. EQUINE VETERINARY J., 1994, Vol 24, Iss 1, pp 20-2:5.

106. Shimizu M., Saton K., Nishioka N. Monoclonal antliibodies with neutralizing activity to equine herpesvirus I. //Arch. Virology, 1989, v. 104, n. 1-2, p. 169-174.

107. Sinclair R., Cook R.F., Mumford J. A The characterizatio9n of neutralizing and non-neutralizing monoclonal antliibodies against equid herpesvirus type I. // J.Gen. Virology, 1989, v.70, n.2, p. 455-459.

108. Slater J.D., Borchers-K Thackray-AM Field-HJ. The Trigeminal Ganglion Is a Location for Equine Herpesvirus-1 Latency and Reactivation in the Horse.// J. GENERAL VIROLOGY, 1994, V. 75, n.8, p. 2007-2016.

109. Stokes A., Allen G.P., Pullen L.A, Murrey P.K. A hamster model of equine herpesvirus type I infection: passsive protection by monoclonal anthibodies to the

110. EHV-I glycoproteins 13, 14 and 17/18.// J.Gen. Virology, 1989, v.70, n.5, p. 1173-1183.

111. Studdert M.J., Simpson T., Roizman B. Differentuiation of Respiratory and Abortigenic isolates of Equine Herpes 1 by restriction endonuclease analysis. //Science, 1981,V.214, p.562.

112. Summers W.C. Molecular Epidemiology of DNA Viruses: applications of Restriction endonuclease cleavage site analysis.// J.Biol.Med., 1980, V.53, p.55.

113. Telford E.A.R., M.S. Watson, K. McBride, AJ. Davison. The DNA sequence of Equine Herpesvirus I.// Virology, 1992, 189, 1,304-316.

114. Telford E.A.R., M.S. Watson, J.Perry, A A Cullinane, A J. Davison. The DNA sequence of equine herpesvirus-4.// J.Gen. Virology, 1998, v.79, p. 1197-1203.)

115. Tenover, F. C. Diagnostic deoxyribonucleic asid probes for infectious diseases.// Clin. Microbiol. Rev.,1988, V.l, 82-101.

116. Tenover, F. C. DNA Probes for Infectious Diseases. CRC Press, Inc., Boca Ration, FL, 1989, p.286.

117. Trust H.M., S.G.Tyack, M. A Johnson, C.T.Prideaux, M.Sheppard. Comparison of the genomic Short Region of a Vaccine strain (CSW-1) of Infectious Laringotracheitis Virus (Gallid-Herpesvirus).// Avian Disease, 1996, 40, 1,p. 130-139.

118. Urov K.P., Zabegina E.K. Restriction analysis for studies of the molecular epizootology of equine herpes virus I.// XXIV World Vet. Congr. Rio de Janeiro, Brazil, 1991, abstr. 21.1.7. ,p. 182.

119. Urov K.P., Zabegina E.K., Loparev V.I. Efficiency of intranasal vaccination of foals against equine influence virus.//XXV World VetCongr.- Yokogama, Japan,1995, abstr. FC 2.9.1.

120. Urov K.P., Zabegina E.K.Equine influenza in Russia and efficiency of vaccination .//5-th World Equine Vet. Ass. Congr. -Padova, Italy, 1997a, abstr. PA 1/6, p. 13.

121. Urov K.P., Zabegina E.K. Vaccination of the pregnant mares against equine rhinopneumonia and risk factor for the appearance of respiratory disease in foals.// 5-th World Equine Vet. Ass. Congr. -Padova, Italy, 19976, abstr. PO 57, p.72.

122. Vilcek S. Development of PCR Assays for Detection of EHV-1, and Pestiviruses.// Vet. Medicina, 1994, V.39,N.ll, p. 687-700.

123. Vanschie F.W., Rijsewijk F.A, Vanoirschot J.T. Excretion of Bovine Herpesvirus-1 in Semen Is Detected Much Longer by PCR Than by Vims Isolation.// J. Clin. Microbiology, 1995, V.33, N.2, p. 308-312.

124. Wadell G.M., CooneyA, de Silva L., Kennett M.L., Kono R., Ren G.F., Lindman K., Nasimento J.P., Smith C.D. Molecular Epidemiology of

125. Adenoviruses: global disri-bution of Adenovirus 7 genome types.//J.Clin.Microbiology, 1985, V.21, p.403-408.

126. Wagner W7.N., Bogdan-J Haines-D Townsend-HGG Misra-V.// Detection of Equine Herpesvirus and Differentiation of Equine Herpesvirus Type-1 from Type-4 by the Polymerase Chain-Reaction.//: CANADIAN J. MICROBIOLOGY, 1992, V. 38, n. 11, p. 1193-1196.

127. Welch H.M., Bridges-CG Lyon-AM Griffiths-L Edington-N. Latent Equid Herpesviruses-1 and 4 Detection and Distinction Using the Polymerase Chain-Reaction and Cocultivation from Lymphoid-Tissues.// J. GENERAL VIROLOGY 1992, V. 73, n,2, p. 261 -268

128. Wesley R.D., Tuthill AE. Genome relatedness among ASF viruses field isolates by restriction endonuclease analysis. .// Prev. Vet. Med., 1984, N 2, p. 53-62.

129. Whetstone C., Miller J., Bortner D., Maaten M. Change in the Restriction endonuclease patterns of Four Modified-live Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus Vaccines after one passage in Host Animal.// Vaccine, 1989, V.7, p.527-532.

130. Whelstone C.A., Seal B.S., Miller J.M. Variability Occurs in the Inverted Repeat Re-gion of Genomic DNA from Bovine Herpesvirus-1 Respiratory, Genital and Bovine Herpesvirus 5 Encephalitic Isolates.// VetMicrobiology, 1993, V.38,N. 1-2, p. 181-189

131. Whelstone C.A, Wheeler J.G., Reed D.E. Investigation of possible vaccine-induced epizootic of infectious bovine rhinotracheitis , using restriction endonuclease analysis of viral DNA.// Am. J.Vet.Res.,1986, V.47, p. 1789.

132. ОСНОВАНИЕ; Выполнение НИР по теме 01.03.02.М. и указание директора ВНИИВ-ВиМ 41 от 30 октября 1998 г.

133. Комиссия в период с 4 по 16 декабря 1998 г. провела проверку "Набора препаратов для выявления ДНК вируса ринопневмонии лошадей методом ПЦР" в соответствии программы комиссионных испытаний, утвержденной директором ВНИИВВиМ от 30 октября 1998 г.

134. Комиссионные испытания проведены на базе лаборатории "Биофизики".

135. Результаты испытаний представлены в прилагаемом протоколе.

136. Использование разработанных "Набора препаратов для выявления ДНК вируса ринопневмонии с помощью ПЦР" и нормативной документации позволяет выявлять полевые изоляты вируса ринопневмонии в пробах патматериала.1. ЦЕЛЬ ИСПЫТАНИЙ2. ЗАКЛЮЧЕНИЕ1. Председатель

137. Члены комиссии: Щетникова Л. А.1. Цыбанова Л.Я.

138. РОССИИСКАЯ АКАДЕМИЯ СКИЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИСОТЩОВЛТШЬСКИЙ ИНСТИТУТ

139. Утверждаю ^сГ7?$иректор ВНИИВВиМкорреспондент Р АСХН1. В. Вишнжов 1998г.

140. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫЯВЛЕНИЮ ДНК ВИРУСА РИНОПНЕВМОНИИ ЛОШАДЕЙ С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ1. ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ1. ПОКРОВ 1998 г.

141. С1. преподаватель Р.Т. Кадыкоевл, о кто р биологических наук С. Ж. Цыбановкавдидат ветеринарных наук ^* М.И. Калабековмл. научный сотрудник Т.С. Чевелева

142. Материалы по разработке методических указаний рассмотрены и одобрены на заседании ученого совета ВНИИВВиМ 1 фотокол N1501 ^Сь./Д .-1998 г.1. Г.П.Федоров