Молекулярно-генетические механизмы активации тромбоцитов и чувствительности к антиагрегантным препаратам

Сироткина, Ольга Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетические механизмы активации тромбоцитов и чувствительности к антиагрегантным препаратам
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические механизмы активации тромбоцитов и чувствительности к антиагрегантным препаратам"

На правах рукописи

СИРОТКИНА ОЛЬГА ВАСИЛЬЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ АКТИВАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИАГРЕГАНТНЫМ ПРЕПАРАТАМ

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ 4044308

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург - 2011

2 1 ДПР ?011

4844308

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Петербургском институте ядерной физики им. Б. П. Константинова РАН и Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия имени И. И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научные консультанты:

доктор медицинских наук Вавилова Татьяна Владимировна, . доктор биологических наук Шварцман Александр Львович.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Слозина Наталья Михайловна,

член-корреспондент РАМН, 4 заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук профессор Баранов Владислав Сергеевич,

доктор медицинских наук профессор Иванов Андрей Михайлович. Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «у^?» ¿-^¿¿¿^Я- 2011 года в часов на

заседании диссертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А. М. Никифорова» МЧС России по адресу: 194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 4/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А. М. Никифорова» МЧС России.

Автореферат разослан с.— 2011 года.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ РАБОТЫ Актуальность проблемы

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) справедливо называют эпидемией XXI века. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в 2005 году от ССЗ умерло 17,5 миллиона человек в мире, что составило 30 % всех случаев смерти. К 2015 году около 20 миллионов человек могут уйти из жизни от ССЗ, главным образом от болезней сердца и инсульта, которые, по прогнозам, останутся единственными основными причинами смерти. Наблюдается устойчивая тенденция к «омоложению» сердечно-сосудистой смертности. У лиц молодого возраста развитие артериальных тромбозов обусловлено, в первую очередь, нарушениями тромбоцитарного гемостаза (Руксин В.В., 1998; Trip M.D. et al„ 1990; Koenig W„ 1998; Ardissino D. et al., 1999; Folsom A.R., 2001). Важным фактором сохранения нормальной работы сердечно-сосудистой системы является своевременное предупреждение острых кардиологических состояний путем раннего и достоверного определения возможных рисков патологических изменений миокарда. В этой связи изучение молекулярных механизмов активации тромбоцитов, несомненно, является актуальным и имеет большое практическое значение.

В клинической практике для блокирования процессов тромбоцитарной агрегации широкое применение нашли аспирин, блокаторы гликопротеиновых Ilb-IIIa рецепторов (абциксимаб, эптифибатид, монафрам) и клопидогрел (Бокарев И.Н. и др., 2008; Phillips D.R. et al., 2005; Capodanno D„ 2010). При назначении антиагрегантных препаратов врач и пациент могут столкнуться с индивидуальной чувствительностью к лекарству, причиной которой будут служить в том числе и генетические факторы. Учитывая распространенность сердечно-сосудистых заболеваний и медико-социальную значимость их терапии и вторичной профилактики, вопросы индивидуальной чувствительности к антитромботическим препаратам встают на первое место в числе фармакогенетических исследований. В настоящее время объяснить вариабельность ответа тромбоцитов на индукцию агонистами и ингибирование селективными блокаторами известными генетическими вариантами тромбоцитарных рецепторов невозможно.

Актуальным является и поиск лабораторных критериев оценки эффективности действия антиагрегантных препаратов. Само определение аспирин- или клопидогрел-резистентности, а также индивидуальной чувствительности к блокаторам GP Ilb-IIIa рецепторов подразумевает использование адекватных лабораторных тестов для анализа функциональной активности тромбоцитов (Cattaneo М., 2007; Gurbel Р.А., Tantry U.S., 2007; Oestreich J.H. et al., 2009). В связи с этим встает вопрос о развитии современных технологий оценки действия антиагрегантных препаратов. Последние рекомендации Американской ассоциации торакальных специалистов (АССР, 2008) не предусматривают лабораторный мониторинг антиагрегантной терапии (Hirsh J. et al., 2008), тем не менее использование различных методов анализа функциональной активности тромбоцитов для

этой цели широко обсуждается. Все известные на данный момент функциональные тесты имеют свои положительные стороны и недостатки. Необходимо четкое определение пределов референтных значений и терапевтических интервалов для каждого из лабораторных методов оценки тромбоцитарной активности и эффективности антиагрегантной терапии (Paniccia R. et al., 2007; van Werkum J.W. et al., 2008; Oestreich J., Smyth S., Campbell C„ 2009; Vila P.M., Urooj Zafar M„ Badimon J.J., 2009; Combescure C. et al., 2010). Однако стандартизированного параметра, по которому можно было бы однозначно судить о гиперактивности тромбоцитов и степени ее изменения на фоне антиагрегантных препаратов, в настоящее время не существует. Исследователи в своих работах либо ограничиваются анализом агрегации тромбоцитов in vitro при действии агонистов и ингибиторов различными методами, либо анализируют клинические исходы у пациентов, принимающих антиагреганты (Sharma R.K. et al., 2009; Mansour К. et al., 2009). Очевидно, что такого подхода недостаточно. Для определения маркера «высокой реактивности тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии», который может в конечном итоге прогнозировать клинические исходы у пациентов (Hayward С.Р.М., 2009), необходимо проведение комплексных генетических, фармакогенетических и функциональных исследований, в том числе с использованием современных молекулярных технологий, что и было предпринято в данной работе.

Цели исследования Целями данной работы явилось определение молекулярно-генетических механизмов активации тромбоцитов, установление значения этих механизмов в развитии сердечно-сосудистых заболеваний и чувствительности к антиагрегантным препаратам.

Задачи исследования

1. Определить роль генетических вариантов тромбоцитарных рецепторов в активации тромбоцитов и развитии ССЗ.

2. Определить вклад количественных характеристик тромбоцитарных рецепторов (уровень экспрессии генов и количество зрелых рецепторов на поверхности клеток) в активацию тромбоцитов.

3. Разработать новые лабораторные методы оценки функционального состояния тромбоцитов на основе молекулярно-генетических технологий.

4. Определить влияние молекулярно-генетических факторов на индивидуальную чувствительность к антиагрегантным препаратам.

5. Разработать алгоритм лабораторного молекулярно-генетического исследования для оценки функционального состояния тромбоцитов у больных с ССЗ и определения индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам.

Научная новизна и теоретическая значимость полученных результатов В настоящей работе впервые проведена комплексная оценка активности тромбоцитов у пациентов с ССЗ и здоровых доноров на основании функциональных и молекулярно-генетических методов исследования, включая

генотипирование с помощью полимеразной цепной реакции, анализ уровня экспрессии генов тромбоцитарных рецепторов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, определение количества ключевых тромбоцитарных рецепторов на мембране тромбоцитов на проточном цитометре, определение активности тромбоцитов одновременно тремя методами - индуцированная агрегация, спонтанная агрегация и проточная цитометрия.

Впервые у больных с ССЗ проведен одновременный анализ генетических вариантов шести ключевых тромбоцитарных рецепторов - GP Ilb-IIIa, GP Iba, GP Ia-IIa, GP VI, P2Y12 и P2Y1, выявлены генетические факторы риска развития ССЗ в разных половозрастных группах. Впервые в российской популяции идентифицированы генетические варианты Leu40Arg GP Ша, С18Т P2Y12, G36T P2Y12 и С-154Т GP VI и охарактеризовано их влияние на функциональную активность тромбоцитов и риск развития ССЗ. Впервые измерен уровень экспрессии генов GP Ilia, GP lib, GP VI, P2Y12, P2Y1 и P2X1 в тромбоцитах здоровых доноров и больных с ССЗ. Показано влияние количественных характеристик рецепторов GP Ilb-IIIa, P2Y12, P2Y1 и Р2Х1 на функциональную активность тромбоцитов.

Впервые проведен комплексный анализ молекулярно-генетических факторов, модулирующих индивидуальную чувствительность к антиагрегантной терапии, с учетом генетических вариантов рецепторов «мишеней» и ферментов Р-450, метаболизирующих лекарственные средства. Разработан оригинальный метод оценки функциональной активности тромбоцитов и эффективности антиагрегантной терапии на основе проточной цитометрии и сформулирован алгоритм лабораторного молекулярно-генетического исследования для оценки функционального состояния тромбоцитов у больных с ССЗ и определения индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам клопидогрелу и аспирину.

Полученные результаты вносят значительный вклад в понимание фундаментальных механизмов регуляции рецепторов тромбоцитов и активации тромбоцитарного гемостаза.

Практическая значимость работы

В работе определены молекулярно-генетические факторы риска развития ССЗ и высокой функциональной активности тромбоцитов, которые позволяют формировать группы повышенного риска и проводить в этих группах патогенетически обоснованную профилактику. Выявлены молекулярно-генетические факторы, определяющие индивидуальную чувствительность к аспирину и клопидогрелу. Их учет позволит персонализировать антиагрегантную терапию у больных с ССЗ.

показало эффективность последнего в клинической практике для определения функциональной активности тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии. В результате проведенной работы показана необходимость комплексного лабораторного подхода к оценке тромбоцитарной активности с использованием функциональных и молекулярно-генетических исследований.

Для практического применения сформулирован алгоритм лабораторного молекулярно-генетического исследования для оценки функционального состояния тромбоцитов у больных с ССЗ и определения индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам клопидогрелу и аспирину.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Генетические варианты тромбоцитарных рецепторов Leu33Pro GP Illa, G36T P2Y12, С807Т GP la и T13254C GP VI вносят существенный вклад в формирование повышенной тромбоцитарной активности и увеличивают риск развития ССЗ.

2. Количество рецепторов GP Ilb-IIIa и АДФ-рецепторов P2Y12 и P2Y1 на поверхности тромбоцитов и уровень экспрессии генов GP lib, GP Illa, P2Y12 и P2Y1 влияют на функциональную активность тромбоцитов.

3. Метод проточной цитометрии может быть использован для оценки функциональной активности тромбоцитов и эффективности антиагрегантной терапии. В качестве показателей тромбоцитарной активности предложены расчетные параметры К{ и К2, которые характеризуют относительные изменения количества GP Ilb-IIIa и Р-селектина на поверхности клетки в ходе индуцированной активации.

4. Генетические варианты ЬеиЗЗРго GP Illa, С18Т P2Y12, G6986A CYP3A5 и Т13254С GP VI, A-842G СОХ-1 модулируют индивидуальную чувствительность к антиагрегантной терапии клопидогрелом и аспирином соответственно.

Апробация работы

Основные теоретические и практические положения диссертации представлены в докладах на конгрессе ассоциации кардиологов стран СНГ «Фундаментальные исследования и прогресс в кардиологии» (18-20 сентября 2003 г., Санкт-Петербург), Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики» (25-27 ноября 2003 г., Москва), на конференциях «Фундаментальные науки - медицине» (2003 г., 2008 г., 2009 г., Москва), на 8-й, 9-й и 10-й Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (17-21 мая 2004 г., 19-24 апреля 2005 г. и 17-21 апреля 2006 г., г. Пущино), на 18th, 20th и 21st International Congress on Thrombosis (June 20-24, 2004, Slovenia, Ljubljana,; June 25-28, 2008, Athens, Greece; July 6-9, 2010, Milan, Italy), семинарах политехнического симпозиума «Молодые ученые -промышленности Северо-Западного региона» (2004 г., 2007 г., Санкт-Петербург), на II и IV Всероссийских научных конференциях с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (2-4 февраля 2005 г. и 4-6 февраля 2009 г.,

Москва), на Одиннадцатом Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (23-26 октября 2005 г., Москва), на V и VI съездах Российского общества медицинских генетиков (24-27 мая 2005 г., Уфа; 15-18 мая 2010 г., Ростов-на-Дону), на XX, XXIst и XXIIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (August 6-12, 2005, Sydney, Australia; July 6-12, 2007, Geneva, Switzerland; July 11-16, 2009, Boston, US), Международном конгрессе «Гипертензия - от Короткова до наших дней» (15-17 сентября 2005 г„ Санкт-Петербург), на трех конференциях Eurepean Human Genetics Conference (May 6-9, 2006, Amsterdam, The Nederlands; June 16-19, 2007, Nice, France; May 31-June 3, 2008, Barselona, Spain), на пяти Российских национальных конгрессах кардиологов (12-14 октября 2004 г., г. Томск, 18-20 октября 2005 г., 10-12 октября 2006 г., 7-9 октября 2008 г. и 5-7 октября 2009 г., г. Москва), научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (2007 г., Санкт-Петербург), Всероссийской конференции с международным участием «Тромбозы в клинической практике: факторы риска, диагностика, терапия» (5-7 июня 2007 г., Санкт-Петербург, Россия), на 52nd GTH Congress (February 20-23, 2008, Wiesbaden), научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (28-30 сентября 2009 г., Москва), на XXI и XXIII International Symposium on Technological Innovations in Laboratory Hematology (April 28-May 1, 2008, Sydney, Australia; 10-12 May, 2010, Brighton, UK), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (21-28 июня 2009 г., Москва), Всероссийской конференции с международным участием «Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению» (26-28 ноября 2009, Москва), на Nottingham Platelet Conference «Platelets - Past, Present and Future» (15-16 July, 2010, Nottingham, UK), First European Joint Congress of EFCC and UEMS "Laboratory Medicine in Health Care" (13-16 October 2010, Lisbon, Portugal) и I Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (17-19 ноября 2010 г., Москва).

Результаты диссертационного исследования внедрены в практику лечебной и учебной работы ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия имени И. И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Публикации

По теме диссертации опубликованы 74 научные работы, из них: 15 статей в журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ, 6 статей в сборниках, 1 пособие для врачей, 1 заявка на патент.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 217 страницах машинописного текста, содержит 36 таблиц, иллюстрирована 51 рисунком и состоит из следующих разделов:

введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и обсуждения, выводы, практические рекомендации и список литературы, включающий 258 научных источников (31 - на русском языке и 227 - на иностранном).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Характеристика обследованных групп В исследование вошли лица, которые были обследованы и проходили лечение на базе Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И. И. Мечникова, Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. И. П. Павлова и Российского кардиологического научно-производственного комплекса Росмедтехнологий, подписали информированное согласие и не были связаны узами родства. Всего исследован биологический материал 991 человека. Для анализа генетических вариантов тромбоцитарных рецепторов, функциональной активности тромбоцитов, измерения количества рецепторов на мембране тромбоцитов, измерения уровня экспрессии генов тромбоцитарных рецепторов были сформированы следующие группы: 1) 207 мужчин, перенесших инфаркт миокарда (ИМ) до 45 лет, средний возраст 45±0,4 года (группа ИМм), и соответствующая контрольная группа - 195 мужчин без сердечно-сосудистых и тромбоэмболических эпизодов, средний возраст 40±0,4 года (группа Км); 2) 209 мужчин и 71 женщина, средний возраст 61±9 лет, со стабильными проявлениями ишемической болезни сердца (группа ИБС), принимающие аспирин (100 мг/сутки) или клопидогрел (75 мг/сутки), или комбинированную терапию клопидогрел (75 мг/сутки) плюс аспирин (100 мг/сутки); 3) 85 мужчин и 16 женщин, средний возраст 57+1 год, с диагнозом острый коронарный синдром (группа ОКС), принимающие аспирин (100 мг/сутки) или клопидогрел (75 мг/сутки), или комбинированную терапию клопидогрел (75 мг/сутки) плюс аспирин (100 мг/сутки); 4) 59 мужчин и 16 женщин, средний возраст 58±2 года, перенесшие инфаркт миокарда после 45 лет (группа ИМс) и принимающие комбинированную терапию клопидогрел (75 мг/сутки) и аспирин (100 мг/сутки) после нагрузочной дозы клопидогрела 300 мг; 5) 133 добровольца обоего пола без сердечно-сосудистых и тромбоэмболических эпизодов в анамнезе (группа Д), не принимающие каких-либо антиагрегантных препаратов (41 % мужчин, 59 % женщин, средний возраст 39,6±1,5 года). Критериями исключения пациентов из исследования являлись: активное внутреннее кровотечение, кардиогенный шок, тяжелые сопутствующие заболевания, самостоятельно влияющие на прогноз, анемии различного генеза, количество тромбоцитов менее 200 тыс./мкл.

Методы исследования Исследованные генетические варианты тромбоцитарных рецепторов и ферментов, отвечающих за индивидуальную чувствительность к антиагрегантным препаратам, а также количество обследованных лиц по группам представлены в табл. 1.

Таблица 1

Исследованные генетические варианты в обследованных группах_

Генетический Количество в обследованных группах, чел.

вариант ИМм Км ИБС ОКС ИМс Д

N = 207 N=195 N =280 N=101 N = 75 N=133

Leu33Pro GP Illa 207 182 280 101 57 122

Ile843Ser GP IIb 166 169 - - 51 38

C807T GP la 195 187 - - 57 126

T13254C GPVI 177 171 138 - 47 21

C-154T GP VI - - - - 47 21

Thrl45Met GP Iba 193 187 - - 96

C18TP2Y12 126 120 280 101 57 120

G36TP2Y12 126 120 280 101 57 119

A1622G P2Y1 76 98 - 80 55 39

A-842G COX-1 - - 151 101 - 70

A-293G CYP3A4 - - - 101 40 83

G6986A CYP3A5 - - - 95 46 81

G681A CYP2C19 - - - 95 45 79

ДНК выделяли из лейкоцитов крови стандартным фенол-хлороформным методом. Для идентификации однонуклеотидных замен амплифицировали (амплификатор «Терцик», НПФ «ДНК-Технология», Россия) участок гена методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом. Продукты ПЦР и рестрикции анализировали после электрофоретического разделения и визуализации в УФ-свете (Маниатис Т. и соавт., 1984). Лицам, включенным в исследование, проводился анализ агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ и/или коллагеном, стандартным фотометрическим методом (Born G.V.R., 1962; Born G.V.R., 1964; O'Brien D.K. et al., 1966), и анализ спонтанной агрегации тромбоцитов в отсутствие индукторов. Пациентам, получающим антиагрегантную терапию, проводили контроль индуцированной агрегации тромбоцитов до начала терапии и на фоне приема антиагрегантных препаратов.

Для анализа функциональной активности тромбоцитов с помощью проточной цитометрии был разработан оригинальный метод (описан в разделе «Результаты исследования»). В качестве маркеров активации тромбоцитов измеряли экспрессию Р-селектина на поверхности тромбоцитов и плотность рецепторов фибриногена гликопротеинов GP Ilb-IIIa в цельной крови до и после активации индуктором (10 мкМ АДФ).

Количество рецепторов GP Ilb-IIIa, GP Iba, GP Ia-IIa, GP VI, P2Y12, P2Y1 и P2X1 на поверхности тромбоцитов определяли методом проточной цитометрии на CYTOMICS FC 500 (Beckman Coulter, США) с помощью флуоресцентно меченых антител. Экспрессию генов тромбоцитарных рецепторов определяли как уровень мРНК, измеренный ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan технологии на амплификаторе ABI Prism 7000 Sequence detection System (Applied Biosystems, США) и амплификаторе iCycler (Bio-Rad, США). В качестве референсного гена был выбран ß-актин.

мРНК выделяли из массы тромбоцитов с использованием набора для выделения РНК RNeasy Mini Kit (Qiagen, США). Для получения кДНК использовали набор для обратной транскрипции RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Литва). Олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно меченые пробы для измерения уровня экспрессии генов P2Y12, GP lib, GP Ша и GP VI были оригинально сконструированы с помощью программного обеспечения Primer Express software. Праймеры и пробы для генов P2Y1, Р2Х1 и р-актина были описаны ранее в литературе (Wang L. et al., 2002; Czermak С. et al., 2004). Для поиска новых генетических вариантов тромбоцитарных рецепторов в программе «VectorNT» были разработаны оригинальные праймеры, и амплифицированные фрагменты ДНК подвергались секвенированию на автоматическом секвенаторе ABI 373 с использованием набора реагентов Termo Sequenase II (Amersham Pharmmacia, США).

Эксперименты по ингибированию тромбоцитарной агрегации селективными блокаторами GP ИЬ-Ша и аспирином проводились in vitro в группе доноров совместно с лабораторией клеточной адгезии Российского кардиологического научно-производственного комплекса Росмедтехнологий. Для оценки антиагрегационного эффекта лекарственных препаратов богатая тромбоцитами плазма (БТП) инкубировалась с монафрамом («Фрамон», Россия), эптифибатидом («Shering Plow»/«Cor Therapeutics», США), а также аспирином в течение 3-5 мин перед добавлением 20 мкМ АДФ. Ингибиторный эффект рассчитывался по степени уменьшения максимальной степени агрегации Т (%) по сравнению с контрольным образцом без препаратов по формуле И = (Тк-ТА+)/Тк х 100 %,

где И - ингибирование тромбоцитов, Тк - степень агрегации в контрольном образце без антагониста, ТА+ - степень агрегации при добавлении лекарственного препарата.

Результаты обрабатывали с использованием программы Statistica 7.0. Достоверность различий распределения анализируемых аллелей в группах определяли точным методом Фишера (р < 0,05 принимали за значимый уровень достоверности). Относительный риск (OR) рассчитывали с 95 % доверительным интервалом (CI) по формуле: OR = a/b х d/c, где а и b -количество больных, имеющих и не имеющих мутантный аллель, с и d -количество человек контрольной группы, имеющих и не имеющих мутантный аллель соответственно. Границы доверительного интервала вычисляли по формулам ORmin= OR0'1'96^2» и ORmax= OR(1+1'96/V*2),

где х2 = ((а х d - b х с) - 0,5n)2х (n - l)/(n0x ni xm0 x mO; im = a + b; n0 = с + d; mi = a + c; m0 = b + d; n = П] + n0 + Ш[ + m0.

Средние величины приведены со стандартным отклонением среднего значения (М ± ш). Для сравнения средних использовали непараметрические методы - U-тест Манн-Уитни, тест Крускал-Уиллиса и парный тест Вилкоксона, корреляции оценивали по Спирману.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Анализ генетических вариантов тромбоцитарных рецепторов, ассоциированных с развитием ССЗ При анализе ЬеиЗЗРго GP Illa, Ile843Ser GP Ilb, C807T GP la, T13254C GP VI и Thrl45Met GP Iba в группе ИМм и группе Км было обнаружено достоверное превалирование РгоЗЗ аллеля гена GP Illa и Metí45 аллеля гена GP Iba у больных по сравнению с контролем Км (табл. 2). Относительный риск развития ИМ у носителей данных аллелей возрастал - OR (ProPro+LeuPro против LeuLeu) = 1,94 [95 % CI 1,34-2,79] и OR (MetMet+MetThr против ThrThr) = 2,0 [95 % CI 1,26-3,16], что позволяет отнести варианты ЬеиЗЗРго GP Ша и Thrl45Met GP Iba к строгим генетическим факторам риска развития ИМ у мужчин в молодом возрасте. Исследованные аллельные варианты рецептора для фибриногена ЬеиЗЗРго GP Ша и Ile843Ser GP ИЬ, рецепторов для коллагена С807Т GP 1а и Т13254С GP VI, рецептора для фактора Виллебранда Thrl45Met GP Iba были описаны ранее, как ассоциированные высокой функциональной активностью тромбоцитов и риском развития сердечно-сосудистой и цереброваскулярной патологии (González-Conejero R. et al., 1998; Feng D. et al., 1999; Cárter A.M. et al., 1999; Santoso S. et al., 1999; Carlsson L.E. et al., 1999; Vijayan K.V. et al., 2000; Reiner A. et al., 2000; Croft S. et al., 2001;). Полученное нами распределение генотипов ЬеиЗЗРго GP Illa и Thrl45Met GP Iba согласуется с данными других исследователей (Терещенко С.Н. и соавт., 1999; Newman P.J. et al., 1989; González-Conejero R. et al., 1998). Обнаруженная ассоциация аллелей РгоЗЗ GP Illa и Metl45 GP Iba с повышенным риском развития ИМ в молодом возрасте также соответствует результатам зарубежных авторов (Weiss EJ. et al., 1996; Cárter A.M. et al., 1997; Zotz R.B. et al., 1998; González-Conejero R. et al., 1998).

Таблица 2

Распределение генетических вариантов тромбоцитарных рецепторов у больных,

перенесших ИМ до 45 лет, и в контрольной группе

Генетический ИМм Км .а

вариант частоты частоты н а и

генотипов генотипов

P к П. щ £ ° i

NN NM ММ S S С ч я ч NN NM ММ ¡2 | и Ч я Ч И g о п.

5" я 9" Я ч

ЬеиЗЗРго GPIIIa 70,3 27,2 2,5 16,2 81,9 16,5 1,6 9,8 0,006

Ile843Ser GPIIb 36,7 40,4 22,9 61,1 31,4 50,3 18,3 43,5 0,18

С807Т GPIa 31,3 51,8 16,9 42,8 38,5 50,8 10,7 36,1 0,08

T13254C GPVI 91,0 9,0 0,0 4,5 85,0 15,0 0,0 7,5 0,07

Thrl45Met GPIba 74,6 24,9 0,5 12,9 86,6 11,8 1,6 7,5 0,002

N обозначает нормальный аллель «дикого» типа, М - мутантный аллельный вариант, NN - нормальная гомозигота, NM - гетерозигота, ММ - гомозигота по мутантному аллельному варианту, значение р < 0,05 рассматривается как статистически значимое.

Мы проанализировали функциональную активность тромбоцитов в группах ИМм и Км в зависимости от генетических вариантов ЬеиЗЗРго GP Illa, С807Т GP la и Thrl45Met GP Iba, частота которых была выше у пациентов, перенесших ИМ (табл. 3). Скорость АДФ-индуцированной агрегации достоверно повышалась у пациентов с ИМ, являющихся носителями мутантного аллеля РгоЗЗ GP Illa, что позволяет отнести данный полиморфизм к генетическим факторам, определяющим высокую функциональную активность тромбоцитов. Дня С807Т GP 1а и Thrl45Met GP Iba такой зависимости не наблюдается, что можно объяснить механизмом активации данных рецепторов - индуктором для рецептора GP 1а-Па выступает коллаген, для рецептора GP Iba физиологическим агонистом выступает фактор Виллебранда, а индуктором в лабораторных исследованиях - ристоцетин.

Таблица 3

АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов у пациентов, перенесших ИМ в молодом возрасте, и в контрольной группе в зависимости от генетических вариантов тромбоцитарных рецепторов для фибриногена, коллагена и фактора

Виллебранда

-\Vmax Группы^ ЬеиЗЗРго GPIIIa С807Т GPIa Thrl45Met GPIba

LeuLeu LeuPro + ProPro CC CT+TT ThrThr ThrMet + MetMet

ИМм 0,93 ± 0,05 1,09 ±0,07* 1,07 ±0,06 0,92 ±0,05** 1,00 ±0,05 0,99 ± 0,07

Км 1,14 ±0,06 1,09 ±0,07 1,15 ±0,08 1,08 ±0,06 1,12 ±0,05 1,06 ±0,11

*р = 0,047; **р = 0,02 - достоверность различий у носителей полиморфных аллелей относительно «дикого» генотипа.

Ключевую роль в процессах агрегации тромбоцитов играют рецепторы P2Y12 и P2Y1, которые связываются с АДФ, важнейшим физиологическим индуктором агрегации тромбоцитов, который в том числе используется для анализа in vitro. Для поиска полиморфных вариантов гена P2Y12, ассоциированных с усилением агрегационных свойств тромбоцитов, были проанализированы 324 человека в возрасте до 45 лет из групп ИМм и Км. Из них для исследования выбрали 44 человека с высокими показателями АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов и без мутации гена ЬеиЗЗРго GP Illa, у которых выявили две однонуклеотидные замены в 18 и 36 положении от стартового кодона синтеза белка ATG: С18Т и G36T. Проанализировав варианты С18Т и G36T гена P2Y12 в группах ИМм и Км, мы обнаружили статистически значимое накопление аллеля Т18 в контроле по сравнению с больными - 38 % и 29 % соответственно (р = 0,04). Относительный риск развития ИМ у носителей Т18 аллеля в гомо- или гетерозиготном состоянии снижался вдвое - OR = 0,67 [95 % CI 0,50-0,89]. Одновременно наблюдалась тенденция к увеличению частоты Т36 аллеля в группе ИМм по сравнению с Км - 17 % и 12,5 % соответственно (р = 0,1). Частоты аллелей С18 и G36 в группе пациентов составили 71 % и 83 %, в контрольной группе - 62 % и 87,5 % соответственно. В группе ИМм было отмечено уменьшение скорости АДФ-индуцированной агрегации у носителей генотипов СТ18 и ТТ18 по сравнению

с генотипом СС18 - (0,84 ± 0,05) %/сек и (1,01 ± 0,08) %/сек соответственно (р = 0,03), а в группе Км - увеличение скорости агрегации у носителей генотипов GT36 и ТТ36 по сравнению с генотипом GG36 - (1,31 ± 0,16) %/сек и (1,12 ± 0,06) %/сек соответственно (р = 0,07). Аналогичные результаты были получены Fontana Р. и соавт., которые при исследовании гена P2Y12 обнаружили те же однонуклеотидные замены. Следует отметить, что эти авторы нашли ассоциацию Т36 аллеля с развитием артериальной болезни нижних конечностей, но не считали аллель Т18 функционально значимым и не рассматривали его в своей работе (Fontana Р. et al., 2003).

Мы определили, что между исследуемыми нуклеотидными заменами С18Т и G36T гена P2Y12 существует сцепление, и это утверждение статистически достоверно (коэффициенты неравновесности по сцеплению в двух группах составили DHmm= -0,0342 (х2= 5,28) и DK„ = -0,0417 (х2= 7,1)). Таким образом, нами были впервые в России выявлены нуклеотидные замены С18Т и G36T гена P2Y12, ассоциированные с изменением функциональной активности тромбоцитов, и определен протективный гаплотип T18G36, связанный с уменьшением скорости АДФ-индуцированной агрегации и снижением риска развития ИМ у мужчин в молодом возрасте.

В группе ИМс были проанализированы генетические варианты: ЬеиЗЗРго GP Illa, Ile843Ser GP IIb, C807T G Pia, T13254C GP VI, C18T P2Y12, G36T P2Y12 и A1622G P2Y1 (табл. 4).

Таблица 4

Распределение генотипов ЬеиЗЗРго GP Illa, De843Ser GP IIb, C807T GP la, T13254C GP VI, C18T P2Y12, G36T P2Y12 и A1622G P2Y1 у пациентов, перенесших

ИМ в возрасте старше 45 лет, и в группе доноров без ССЗ в анамнезе

Генетический вариант ИМс Д достоверность различий, р

частоты генотипов, % частота аллеля M,% частоты генотипов, % частота аллеля М,%

NN NM MM NN NM ММ

ЬеиЗЗРго GPIIIa 70,2 26,3 3,5 16,7 73,8 22,1 4,1 15,2 0,37

Ile843Ser GP IIb 18,9 75,4 5,7 43,4 28,9 55,3 15,8 43,4 0,19

C807T GP la 31,6 59,6 8,8 38,6 41,3 46,0 12,7 35,7 0,14

T13254C GP VI 53,2 46,8 0,0 23,4 81,0 19,0 0,0 9,5 0,026

C18TP2Y12 50,9 40,3 8,8 28,9 40,8 49,2 10,0 34,6 0,14

G36TP2Y12 84,2 12,3 3,5 9,6 80,7 17,6 1,7 10,5 0,36

A1622G P2Y1 81,8 16,4 1,8 10,0 82,0 15,4 2,6 13,8 0,6

В качестве группы сравнения были выбраны доноры-добровольцы (группа Д). Частоты ЬеиЗЗРго GP Illa, С807Т GP la, С18Т P2Y12 и G36T P2Y12 статистически не различаются у пациентов и доноров. Более того, при сравнении групп ИМс и ИМм было обнаружено достоверное накопление мутантных аллелей Т36 P2Y12 и Ser843 GP IIb у пациентов, перенесших ИМ в

возрасте до 45 лет. Частоты аллелей составили - 9,6 % и 17 % для Т36 P2Y12 в группах ИМс и ИМм соответственно (р = 0,035), 43,4 % и 61,1 % для Ser843 GP lib в группах ИМс и ИМм соответственно (р = 0,01). Напротив, у пациентов старшего возраста превалировала мутация гена GP VI. Частота аллеля С13254 GP VI была повышена в группе ИМс как по сравнению с донорами, так и с группой ИМм - 23,4 % и 4,5 % у пациентов, перенесших ИМ в возрасте старше 45 лет и моложе 45 лет соответственно (р < 0,0001). Относительный риск развития ИМ после 45 лет у носителей аллеля С13254 GP VI возрастал почти в четыре раза - OR = 3,74 [95 % CI 1,22-11,48]. Эти данные полностью согласуются с результатами зарубежных авторов (Croft S. et al., 2001; Ollikainen E. et al., 2004) и позволяют отнести мутацию Т13254С GP VI к строгим факторам риска развития ИМ у мужчин и женщин после 45 лет.

Мы проанализировали показатели коллаген-индуцированной агрегации в общей группе пациентов и доноров в зависимости от генотипов коллагеновых рецепторов (рис. 1). Степень коллаген-индуцированной агрегации не отличалась у носителей генотипов Т13254С GP VI (ТС + СС против ТТ), тогда как скорость агрегации была существенно выше у носителей мутантного аллеля. Однако различия не достигали статистической значимости (р = 0,1), возможно, вследствие недостаточного объема выборки. Аналогично влияла на коллаген-индуцированную агрегацию и мутация рецептора коллагена GP Ia-IIa. Степень агрегации не зависела от С807Т GP 1а, а скорость была достоверно выше у носителей Т807 аллеля (р = 0,04).

a. T13254CGPVI б. C807TVPla

Рис. 1. Показатели коллаген-нндуцированной агрегации в общей группе пациентов и доноров, в зависимости от генотипов GP VI (а) и GP Ia-IIa (б)

На основании проведенного сравнения можно судить о различии в патогенетических механизмах развития ИМ в молодом возрасте и после 45 лет. У пациентов старшего и пожилого возраста превалирует мутация рецептора GP VI, который активируется коллагеном - основным компонентом сосудистой стенки, индицирующим адгезию и агрегацию тромбоцитов при повреждении эндотелия, в том числе в результате разрыва атероматозной бляшки.

В группе ИБС были проанализированы следующие полиморфизмы: ЬеиЗЗРго GP Illa, Т13254С GP VI, С18Т P2Y12, G36T Р2У12 (табл. 5). Анализ данных в группе ИБС показал картину распределения генотипов ЬеиЗЗРго

GPIIIa и G36T P2Y12, аналогичную группе ИМм. С другой стороны, при сравнении групп ИБС и ИМм между собой было выявлено превалирование Т13254С GPVI у пациентов с ИБС - частота мутантного аллеля составила 11,9 % и 4,5 % в группах ИБС и ИМм соответственно (р = 0,0003).

Таблица 5

Распределение генотипов Lcu33Pro GP Illa, Т13254С GP VI, С18Т P2Y12 и G36T

P2Y12 у пациентов со стабильными проявлениями ИБС и в группе доноров

Генетический вариант ИБС д достоверность различий, р

частоты генотипов, % частота аллеля М,% частоты генотипов, % | частота аллеля М,%

NN NM ММ NN NM ММ

ЬеиЗЗРго GPIIIa 71,3 19,7 9,0 18,8 73,8 22,1 4,1 15,2 0,03

Т13254С GPVI 76,0 24,0 0,0 11,9 81,0 19,0 0,0 9,5 0,3

C18TP2Y12 44,7 39,8 15,5 35,5 40,8 49,2 10,0 34,6 0,3

G36TP2Y12 70,4 22,3 7,3 18,4 80,7 17,6 1,7 10,5 0,02

Таким образом, генетическими факторами риска развития ИБС в смешенной по полу и возрасту группе могут выступать Leu33Pro GP Illa, G36T P2Y12, а также Т13254С GP VI. При этом относительный риск развития ИБС у носителей РгоЗЗ GP Illa возрастает незначительно (OR = 1,20 [CINS 1,0-2,18]), а у носителей ТЗб P2Y12 - почти вдвое (OR = 1,75 [95 % CI 1,16-2,65]).

В группе ОКС были проанализированы генетические варианты рецепторов GP Ilb-IIIa, P2Y12 и P2Y1 (табл. 6).

Таблица 6

Распределение генотипов Leu33Pro GP Illa, A1622G P2YI, С18Т P2Y12 н G36T

P2Y12 у пациентов с ОКС и в группе доноров без ССЗ в анамнезе

Генетический вариант ОКС д достоверность различий, р

частоты генотипов, % 1 частота аллеля М,% частоты генотипов, % частота аллеля М,%

NN NM ММ NN NM ММ

Leu33Pro GPIIIa 70,3 27,7 2,0 14,9 73,8 22,1 4,1 15,2 0,3

A1622G P2Y1 78,8 21,2 0,0 10,6 82,0 15,4 2,6 13,8 0,4

C18TP2Y12 48,5 39,6 11,9 31,7 40,8 49,2 10,0 34,6 0,3

G36TP2Y12 72,3 26,7 1,0 14,4 80,7 17,6 1,7 10,5 0,09

У пациентов с ОКС только частота полиморфизма 036Т Р2У12 имела тенденцию к увеличению по сравнению с донорами без ССЗ, относительный риск развития ОКС у носителей Т36 аллеля возрастал в 1,6 раза. Частоты остальных генотипов не отличались от таковой в группах Д, ИМс, ИБС, ИМм.

В группе ОКС, так же как у мужчин, перенесших ИМ в молодом возрасте, функциональная активность тромбоцитов была выше у носителей мутации Leu33Pro GP Illa. В то же время у носителей мутантного аллеля G1622 P2Y1 степень АДФ-индуцированной агрегации оказалась ниже, чем у лиц с генотипом «дикого типа» (табл. 7). Следует отметить, что в литературе сведения о влиянии полиморфизма A1622G P2Y1 на функциональную активность тромбоцитов противоречивы. Найдено как усиление агрегационного ответа на АДФ у носителей G-аллеля (Hetherington S. et al., 2005), так и снижение агрегации при наличии GG генотипа (Fontana Р. et al., 2005).

Таблица 7

Зависимость степени АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов от генотипов Leu33Pro GP Illa, A1622G P2Y1, С18Т P2Y12 и G36T P2Y12 у пациентов с ОКС

Исследуемые генотипы Т, % Достоверность различий р (между NN и NM+MM)

NN NM+MM

Leu33Pro GPIIIa 30,5 ±2,1 40,2 ±3,5 0,02

A1622G P2Y1 33,9 ±2,4 24,7 ± 2,9 0,05

С18Т P2Y12 34,7 ± 2,6 32,2 ± 2,6 0,4

G36TP2Y12 32,0 + 2,1 36,8 ± 3,9 0,4

На основании исследования генетических вариантов ключевых тромбоцитарных рецепторов у пациентов с ССЗ можно заключить, что Leu33Pro GP Illa, Ile843Ser GP IIb, C807T GP la, T13254C GP VI, Thrl45Met GP Iba, C18T P2Y12, G36T P2Y12 и A1622G P2Y1 модулируют функциональную активность тромбоцитов и могут быть ассоциированы с риском развития сердечно-сосудистой патологии в различных половозрастных группах.

Анализ молекулярно-генетических механизмов высокой функциональной активности тромбоцитов Одним из лабораторных критериев функциональной активности тромбоцитов является их спонтанная агрегация, которая оценивается in vitro без добавления экзогенных индукторов. Наличие спонтанной агрегации является фактором риска развития ССЗ (Trip M.D. et al., 1990; Breddin H.K. et al., 1999). Для выяснения молекулярных механизмов, определяющих спонтанную агрегацию тромбоцитов, нами были проанализированы максимальный размер агрегатов (R макс) и максимальная скорость образования агрегатов (V макс, ÄR/мин) в зависимости от Leu33Pro GP Illa, Ile843Ser GP IIb, уровня экспрессии генов GP IIb и GP Illa, количества зрелых рецепторов GP Ilb-IIIa на мембране тромбоцитов (табл. 8). Максимальный уровень спонтанной агрегации у носителей аллеля РгоЗЗ GP Ша (генотипы РгоРго и LeuPro) был почти в 1,5 раза выше, чем у доноров с генотипом LeuLeu, хотя скорость агрегации в этих группах достоверно не различалась. Исследуемые параметры не различались в зависимости от мутации Ile843Ser GP IIb.

Содержание GP Ilb-IIIa на поверхности тромбоцитов и концентрация тромбоцитов были одинаковыми в исследованных группах с различными генотипами Leu33Pro GP Illa. Эти данные указывают на то, что повышение уровня спонтанной агрегации у доноров с мутацией Leu33Pro GP Illa было обусловлено изменениями функциональной активности GP Ilb-IIIa.

Таблица 8

Параметры спонтанной агрегации, содержание GP Ilb-IIIa и концентрация

тромбоцитов в БТП у доноров с различными генотипами GP Ilb-IIIa

Исследуемые ЬеиЗЗРго GP Illa Ile843SerGPIIb

параметры LeuLeu ProPro + LeuPro Ilelle IleSer+SerSer

(n = 14) (н = 11) (n = 5) (n = 6)

Я макс 1,26 + 0,06 1,80 ±0,24* 1,19 ±0,06 1,31 ±0,11

V макс (ДКУмин) 0,59 ±0,09 0,62 ±0,10 0,69 ±0,15 0,62 ±0,18

Содержание вР ПЬ-Ша (х103/на клетку) 56,4 ±1,5 60,4 ± 3,5 58,0 ±4,3 56,7 ± 2,2

Концентрация тромбоцитов в БТП (103/мкл) 224 ±10 224 ±15 258 ±9 244 ±18

*р = 0,03 - между носителями LeuLeu и LeuPro+ProPro.

Как было показано ранее в исследовании Vijayan и соавт. (Vijayan K.V. et al., 2000), выполненном на модельных клетках, замена ЬеиЗЗРго приводит к усилению сигнальных и адгезивных функций рецептора GP Ilb-IIIa. Возможно, именно эти эффекты являются причиной повышенной спонтанной агрегации у носителей аллеля РгоЗЗ GP Illa. Нами была определена существенная индивидуальная вариабельность в содержании GP Ilb-IIIa на поверхности тромбоцитов от 44,8х103 до 82,7х103 молекул на клетку, которая влияла на интенсивность спонтанной агрегации - выявлена корреляция между уровнем спонтанной агрегации и количеством GP Ilb-IIIa на поверхности тромбоцитов (R = 0,39, р = 0,05). Уровень экспрессии генов GP Ilb и GP Illa не влиял на показатели спонтанной агрегации. Полученные данные свидетельствует о том, что на интенсивность спонтанной агрегации влияет как генетический полиморфизм ЬеиЗЗРго GP Illa, так и количество рецептора GP Ilb-IIIa на мембране тромбоцитов.

Анализ соотношения количества рецепторов GP Ilb-IIIa и генотипа ЬеиЗЗРго GP Illa показал достоверные различия в группе доноров (п = 50) -количество рецептора было выше у носителей аллеля РгоЗЗ (рис. 2).

Мы проанализировали нуклеотидную последовательность промоторной области гена GP Illa у доноров с высокой плотностью рецепторов GP Ilb-IIIa и обнаружили неописанный ранее в российской популяции полиморфизм А-425С GP Illa. Генетический вариант А-425С оказался сцеплен с ЬеиЗЗРго, что согласуется с данными других исследований (Negrier С. et al., 1998; O'Halloran A. et al., 2005). Таким образом, связь между количеством рецептора и генотипом ЬеиЗЗРго GP Illa можно объяснить изменением структуры промоторной области и регуляции работы гена.

Рис. 2. Количество рецепторов GP Ilb-IIIa на мембране тромбоцитов у носителей аллельных варианов Leu33Pro GP Illa

Ни максимальный уровень спонтанной агрегации, ни ее скорость не зависели от генетических вариантов С18Т P2Y12, G36T P2Y12 и A1622G P2Y1. Не было найдено корреляции между R макс или V макс и количеством рецепторов P2Y12, P2Y1 и Р2Х1 на мембране тромбоцитов исследованных доноров. На параметры спонтанной агрегации не влиял и уровень экспрессии генов P2Y1 и Р2Х1. В то время как уровень экспрессии гена P2Y12 коррелировал со скоростью спонтанной агрегации - R = 0,61 (р = 0,047).

В группе доноров с увеличением скорости АДФ-индуцированной агрегации была ассоциирована мутация ЬеиЗЗРго GP Illa, a Ile843Ser GP IIb - с увеличением степени АДФ-индуцированной агрегации (табл. 9).

Таблица 9

Параметры АДФ-индуцированной агрегации в зависимости от генотипов

рецептора GP llb-IIIa у доноров без ССЗ в анамнезе

Исследуемые параметры ЬеиЗЗРго GP Ша IIe843SerGP IIb

LeuLeu (п=14) ProPro+LeuPro (п = 8) Ilelle (n=10) IleSer+SerSer (n = 22)

Т(%) 26,6 ±5,3 30,8 ±70,3 40,7 ± 7,8 60,3 ± 4,7*

V (%/мин) 31,7 ±3,4 47,3 ± 6,3** 29,6 ± 5,4 32,0 ±3,2

*р = 0,049 - IleSer+SerSer против Ilelle; **р = 0,08 - ProPro+LeuPro против LeuLeu.

Полученные результаты еще раз подтверждают, что генетические варианты ЬеиЗЗРго GP Ша и Ile843Ser GP IIb влияют на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов. Ранее влияние ЬеиЗЗРго GP Illa на АДФ-индуцированную агрегацию было показано в группе лиц, вошедших в Framingham Offspring Study - всего 1422 человека (Feng D. et al., 1999; Feng D. et al., 2001).

В ходе исследования при генотипировании ЬеиЗЗРго GP Ша в группе из 359 человек у 7 исследуемых (2 %) нами была обнаружена не описанная ранее мутация гена GP Ша, сцепленная с ЬеиЗЗРго GP Illa (рис. 3). Сиквенирование исследуемого участка гена GP Illa показало наличие нуклеотидной замены T1585G, что приводит к замене лейцина на аргинин в 40 положении аминокислотной последовательности белка. В результате данной мутации появляется дополнительный сайт рестрикции для эндонуклеазы Mspl.

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис.3. Электрофоретическое разделение продуктов рестрикционного анализа гена GP Illa: 1 - маркер молекулярного веса pBR322 HaelII; 2 - ПЦР-продукт;

3 - гаплотип Pro33Pro33/Leu40Arg40; 4, 5 - гаплотип Leu33Pro33/Leu40Arg40; 6 - генотип РгоЗЗРгоЗЗ; 7 - «дикий» генотип Leu33Leu33; 8 - генотип ЬеиЗЗРгоЗЗ

Анализ АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов у гетерозиготного носителя гаплотипа Leu33Pro33/Leu40Arg40 гена GP Ша выявил нетипичную картину - при индукции АДФ в любой концентрации (в том числе при низких пороговых дозах - 1,25 мкМ) возникал однотипный ответ - одноволновая кривая с максимальной амплитудой от 63 % до 80 %, характеризующей высокую степень агрегации, и с высокой скоростью агрегации. При этом отсутствовала тенденция к дезагрегации даже на малых дозах АДФ. Следует отметить, что у обследованного носителя новой мутации гена GP Ша в анамнезе не зафиксировано ни одного тромботического эпизода. Показатели коагулограммы находились в пределах нормы. Тем не менее проведенный анализ АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов позволяет предположить, что в момент тромботической агрессии вероятность формирования тромбоцитарных агрегатов и нарушения кровообращения, особенно в зоне микроциркуляции, у такого пациента выше, чем у индивидуумов с «диким» генотипом или носителей одной только мутации ЬеиЗЗРго гена GP Illa. В литературе нами было найдено единственное сообщение Bojesen S. Е. и соавт. о гетерозиготном носительстве Leu40Arg гена GP Ша, частота которого среди 9242 обследованных раковых пациентов Copenhagen City Heart Study и Danish Cancer Registry составила 0,62 % (Bojesen S.E. et al, 2003). Однако авторы не исследовали функциональную активность тромбоцитов у выявленных носителей Leu40Arg и классифицировали указанных пациентов только по их генотипу ЬеиЗЗРго GPIIIa.

В проведенном нами исследовании показатели АДФ-индуцированной агрегации строго коррелировали с количеством рецепторов GP Ilb-IIIa (R от 0,35 до 0,58; р от 0,04 до 0,001). И степень, и скорость агрегации при всех концентрациях индуктора были выше у лиц с большим числом рецепторов на поверхности тромбоцитов (рис. 4). Степень АДФ-индуцированной агрегации зависела также от количества АДФ-рецепторов (табл. 10).

мкМАДФ 0 5 и мкМАДФ

Рис. 4. Зависимость показателей АДФ-индуцированной агрегации от количества

ОР ПЬ-Ша рецепторов: 1 - > 60 тыс7клетку, 2 - 50-60 тыс^клетку, 3 - 40-50 тыс./клетку, *р < 0,05 - 2 против 3 для Т и V, **р < 0,05 - 1 против 3 и 2 против 3 для Т и V, 1 против 2 для V, ***р < 0,05 - 1 против 3 и 2 против 3 для Т и V, 1 против 2 для V, ****р < 0,05 - 1 против 3 и 1 против 2 для Т и V

Таблица 10

Корреляция степени АДФ-индуцированной агрегации (10 мкМ АДФ) с

Рецептор К Р

вР НЬ-Ша 0,37 0,01

Р2У12 0,44 0,009

Р2У1 0,39 0,02

Р2Х1 0,3 0,09

Нами было показано, что наименьший вклад в АДФ-индуцированную агрегацию вносит рецептор Р2Х1, что вполне объяснимо, так как он активируется преимущественно АТФ, а не АДФ (У1а1 С. е1 а1., 2003). Зависимость функциональной активности тромбоцитов от количества рецепторов вР ПЬ-Ша отмечали и другие исследователи, однако преимущественно у пациентов с ССЗ (ТЬсЬег^ ТЕ. е1 а1., 1994; Магигоу А.У. е1 а1., 2002). И только для Р2У1 ранее в экспериментах с трансгенными мышами была показана гиперагрегация тромбоцитов в ответ на АДФ у животных с высокой экспрессией рецептора на мембране тромбоцитов (НесЫег В. е1 а1., 2003). Степень АДФ-индуцированной агрегации также напрямую зависела от уровня экспрессии генов вР ПЬ, Р2У12 и Р2У1. Коэффициент корреляции составил: Я = 0,31 (р = 0,03) для СР ПЬ и Т(%) при 10 мкМ АДФ, Я = 0,38 (р = 0,003) для Р2У12 и Т(%) при 10 мкМ АДФ, Я = 0,33 (р = 0,005) для Р2У1 и Т(%) при 2,5 мкМ АДФ и Я = 0,28 (р = 0,02) для Р2У1 и Т(%) при 5 мкМ АДФ. Зависимость АДФ-индуцированной агрегации от уровня экспрессии генов ключевых тромбоцитарных рецепторов у доноров была установлена впервые в ходе данного исследования.

Мы не выявили корреляции между степенью и скоростью коллаген-индуцированной агрегации и количеством рецепторов вР VI и вР 1а-Па. Коллаген-индуцированная агрегация не зависела и от уровня экспрессии генов коллагеновых рецепторов. При наличии мутации Т13254С вРУ1 количество рецепторов ОР VI на поверхности тромбоцитов увеличивалось - (1,52 ± 0,04) против (1,82 ± 0,16) для ТТ и (ТС + СС) генотипов соответственно (р = 0,057).

Количество рецептора GP VI на мембране тромбоцитов исследовалось в ряде работ (Furihata К. et al., 2001; Clemetson K.J., 2003; Best D. et al., 2003; Joutsi-Korhonen L. et al., 2003; Samaha F.F. et al., 2005). Авторы указывали на ассоциацию носительства полиморфизма Т13254С с изменениями количества GP VI на поверхности клеток и функциональной активности тромбоцитов. В исследуемой нами группе доноров замена Т13254С не влияла на уровень экспрессии гена GP VI. С целью выявления полиморфных вариантов, модулирующих уровень мРНК, мы сиквенировали участок промоторной области у лиц с высокой экспрессией гена GP VI. Нами была найдена нуклеотидная замена С-154Т GP VI, которая ассоциировалась как с увеличением числа рецепторов на поверхности тромбоцита, так и с высоким уровнем экспрессии гена GP VI (рис. 5). Ранее в литературе был описан данный полиморфизм, но не было найдено каких-либо ассоциаций Т(-154) аллеля с изменением количества рецептора или функциональной активностью тромбоцитов (Croft S. et al., 2001; Best D. et al., 2003).

2 2.

5 1,8 Ь "

a 1,4

I »

* 1

0 0,8

| 0,6

S 0,4

1 0Д

| 0

Рис. 5. Количество рецептора на мембране (а) и уровень экспрессии гена GP VI (б) в зависимости от генотипов С-154Т GP VI

Скорость коллаген-индуцированной агрегации была значительно увеличена в нашем исследовании у носителей С807Т GP 1а - (7,9 ± 2,5)%/мин. и (16,9 ± 4,2)%/мин. для СС и (СТ + ТТ), что согласуется с зарубежными данными (Pontiggia L. et al., 2002).

Таким образом, генетические варианты тромбоцитарных рецепторов, уровень экспрессии их генов и плотность рецепторов на мембране влияют на индуцированную агрегацию тромбоцитов, исследуемую in vitro в лабораторных условиях.

Новый метод оценки функционального состояния тромбоцитов на основе

проточной цитометрии

Одной из задач данного диссертационного исследования явилось формирование новых лабораторных подходов к оценке функциональной активности тромбоцитов. Был разработан оригинальный метод анализа функциональной активности тромбоцитов с помощью проточной цитометрии с оценкой изменения содержания Р-селектина и гликопротеинового рецептора

вР ПЬ-Ша на поверхности тромбоцитов при индукции АДФ. Примеры цитометрического определения содержания Р-селектина и рецептора вР ПЬ-Ша на поверхности клеток приведены на рисунке 6 (а, б).

ДонорЫ.

Донор N.

MFMS.9

» Донор N.

MFI20.6

Активация ЮмкМ АДФ

Без активации

Активация Юг/.кМ АДФ

Без активации 3

Рис. 6. Экспрессия Р-селектина (а) и количество рецептора ОР ИЬ-Ша (б) на мембране тромбоцитов донора Н. до и после активации клеток 10 мкМ АДФ

Содержание рецептора СР ПЬ-Ша определялось как средняя интенсивность флуоресценции (МР1), в то время как уровень экспрессии Р-селектина определяли как % клеток, меченных соответствующим антителом СБ62Р-РЕ. Следует особо подчеркнуть, что исследование проводится в цельной крови. Анализ показал достоверное увеличение экспрессии Р-селектина и количества рецепторов ОР ПЬ-Ша после индукции 10 мкМ АДФ в группе доноров без ССЗ и тромбоэмболических заболеваний в анамнезе, не принимающих каких-либо антиагрегантных препаратов (рис. 7).

20 18 16 14 12 £Е10

5 8

6 4 2 О

...... | 4 .......т..........

1 16,5 1

ö Без индуктора о +10мкМ АДФ

*р=0,002

яа 25

Е 20

X 15

;; S 10

О 5

1.в

а Без индуктора О +10МКМ АДФ

"р<0,0001

GP llb-llla

Р-селектин

Рис. 7. Количество рецепторов GP ПЬ-Ша (а) и экспрессия Р-селектина (б) на поверхности тромбоцитов здоровых доноров до и после активации 10 мкМ АДФ

Известно, что до 80 % рецепторов GP Ilb-IIIa равномерно распределены на мембране тромбоцитов, остальные 20 % находятся на мембране открытой канальцевой системы «внутри тромбоцита» (Шитикова A.C., 2000). У исследованных нами доноров количество GP Ilb-IIIa после индукции АДФ возрастало в среднем на (17 ± 3) %, что соотносится с экспонированием рецепторов открытой канальцевой системы наружу в ходе цитоскелетной перестройки клетки в результате активации. Р-селектин - основной компонент, участвующий во взаимодействии тромбоцитов с лейкоцитами и ответственный за образование тромбоцитарно-лейкоцитарных агрегатов, экспрессируется только активированными тромбоцитами (Shantsila Е., Lip G.Y.H., 2009). В нашей работе количество клеток доноров,

экспрессирующих Р-селектин в отсутствие активации in vitro, составило около 2 %. Тогда как при активации 10 мкМ АДФ число тромбоцитов, несущих на своей поверхности молекулы Р-селектина, увеличивалось почти до 38 %. Это подтверждает положение, что не активированные тромбоциты не экспрессируют Р-селектин на своей поверхности.

Мы оценивали функциональную активность тромбоцитов в разработанном нами методе не только по количеству рецепторов GP Ilb-IIIa и экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов до и после инкубирования с АДФ, но также по расчетным показателям К\ и К2, вычисляемым по формулам

к.=—-Шг--100%,

MFI д

где МИАДФ+ - средняя интенсивность флуоресценции с антителами к GP Ilb-IIIa после инкубации с индуктором, MFI'41'1'" - средняя интенсивность флуоресценции с антителами к GP Ilb-IIIa в отсутствие индуктора;

„ %CD62P -%CD62P -РЕ^0- 1/ww

К, =-—---100% ,

где %CD62P-PEAiIO+ - количество тромбоцитов, меченных антителами к Р-селектину, после инкубации с индуктором; %С062Р-РЕДДФ" - количество тромбоцитов, меченных антителами к Р-селектину в отсутствие индуктора.

Рассчитанные параметры К\ и К2 отражают увеличение количества рецептора GP Ilb-IIIa и экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов после индукции АДФ в %. Применение таких расчетных показателей позволяет оценивать и сопоставлять функциональную активность тромбоцитов, измеренную с помощью проточной цитометрии, в различное время и с использованием различных партий реактивов. Это особенно актуально в условиях практической работы клинико-диагностической лаборатории, в том числе при мониторинге антиагрегантной терапии.

Проанализировав группу доноров без ССЗ в анамнезе, не принимавших каких-либо антиагрегантных препаратов на момент проведения исследования (п = 34), мы определили значения показателей функциональной активности тромбоцитов, измеренной методом проточной цитофлуориметрии, которые были приняты нами за референтные значения (табл. 11).

Таблица 11

Значения параметров функциональной активности тромбоцитов в группе

GPllb-llla Р-селектин

\шЛДф- 14,6 ±5,1 %CD62P-PEAA<*- 1,8 ±0,5

МР1ДДФ+ 16,5 ±1,1 %С062Р-РЕадф+ 17,8 ±3,0

К\ (%) 13 ±2 К2(%) 75 ±5

Мы сопоставили цитофлуориметрические показатели функциональной активности тромбоцитов с данными стандартной агрегатометрии в общей

группе доноров и пациентов старше 45 лет с ИМ (п = 85), и выявили корреляцию между исследуемыми параметрами (табл. 12).

Таблица 12

Корреляция между параметрами цитометрического исследования тромбоцитариой активности и стандартной агрегатометрии

Параметры цитометрии Степень агрегации Т (%) Скорость агрегации V (%/мин)

2,5 мкМ АДФ 5 мкМ АДФ 10 мкМ АДФ Колл аген 2,5 мкМ АДФ 5 мкМ АДФ 10 мкМ АДФ Колл аген

MFI^- R 0,12 0,2 0,37 0,1 0,1 0,2 0,2 0,1

Р 0,3 0,077 0,01 0,4 0,6 ОД 0,2 0,6

MFI^ R 0,2 0,25 0,36 0,1 0,1 0,2 0,2 0,1

Р 0,07 0,025 0,02 0,6 0,5 0,07 0,2 0,4

Ki (%) R 0,32 036 0,06 0,15 0,2 0,32 -0,04 0,2

Р 0,004 0,001 0,7 0,3 0,1 0,004 0,8 0,2

%CD62P .р^АДФ- R -0,13 0,08 -0,03 -0,1 -0,01 0,1 -0,1 0,15

Р 0,25 0,5 0,8 0,4 0,96 0,3 0,5 0,3

%CD62P -РЕадф+ R 0,12 0,2 0,4 -0,02 0,24 0,39 0,29 0,28

Р 0,3 0,07 0,007 0,9 0,03 0,0004 0,059 0,05 7

K2 (%) R 0,18 0,27 0,37 0,2 0,3 0,36 0,37 0,2

Р 0,1 0,015 0,01 0,2 0,007 0,001 0,01 0,2

R - коэффициент корреляции по Спирману, р - достоверность.

В литературе нет данных о сравнении фотометрического метода и проточной цитометрии. Хотя попытки применить проточную цитометрию для оценки тромбоцитариой активности предпринимались (Storey R.F. et al., 2002; Chen M.-C. et al., 2003; Okano К. et al., 2010). Все использовавшиеся до настоящего времени подходы имели целый ряд существенных недостатков. Во-первых, в большинстве описанных способов использовали богатую тромбоцитами плазму (БТП) или фиксированные клетки. Приготовление БТП делает преаналитический этап, с одной стороны, трудоемким, с другой -искажает реальную функциональную активность тромбоцитов вследствие их преждевременной активации в результате центрифугирования. При использовании фиксированных тромбоцитов нельзя с уверенностью утверждать, что результаты анализа в полной мере отражают процессы, происходящие in vivo. Во-вторых, в качестве маркера тромбоцитариой активации, измеренной с помощью проточной цитометрии, использовали в основном Р-селектин. Антитела к рецептору GP Ilb-IIIa применяли для выделения популяции тромбоцитов, но не как маркеры функциональной активности. Мы предположили, что измерение количества GP Ilb-IIIa и экспрессии Р-селектина без индукции агонистом (АДФ) не отражает способности тромбоцитов к активации. Такой подход позволяет только констатировать состояние тромбоцитов на данный конкретный момент, но не дает возможности определить способность тромбоцитов к их дальнейшей реакции, в том числе на фоне антиагрегантных препаратов. Все исследования,

проводившиеся до сих пор, включали отдельно доноров или больных ССЗ. Сравнение параметров функциональной активности тромбоцитов, измеренных методом проточной цитометрии, у здоровых лиц и пациентов не проводились; не были установлены пределы нормальных значений анализируемых показателей.

Разработанный нами метод имеет ряд преимуществ. Он исключает приготовление БТП, что упрощает пробоподготовку и минимизирует нежелательные воздействия на тромбоциты. Исследование проводится на нативных клетках, способствуя максимальному отражению процессов, происходящих in vivo. Кроме того, мы соединили принцип активации тромбоцитов АДФ, который заложен в стандартной индуцированной агрегации, и проточную цитофлуориметрию с использованием FITC- и РЕ-меченых антител к рецептору GP Ilb-IIIa и Р-селектину. Данный подход оправдал себя и позволяет предложить новые лабораторные критерии для оценки функционального состояния тромбоцитов. Сравнение с традиционным фотометрическим методом подтверждает, что параметры К\ и К2 адекватно отражают активность тромбоцитов.

Несмотря на существующее разнообразие методов и подходов, лабораторная оценка чувствительности к антиагрегантным препаратам остается в настоящее время не решенной до конца проблемой (Oestreich J.H. et al., 2009). В данной работе мы применили разработанный метод определения функциональной активности тромбоцитов с помощью проточной цитометрии дня оценки эффективности антиагрегантной терапии клопидогрелом и аспирином, для чего были сформированы три подгруппы: 1) доноры без сердечно-сосудистых заболеваний в анамнезе, не принимающие какие-либо лекарственные препараты, влияющие на функцию тромбоцитов (группа Д) -34 человека; 2) пациенты старше 45 лет, перенесшие ИМ не менее 6 месяцев назад, на момент исследования принимающие аспирин 100 мг/день (группа А), -19 человек; 3) больные старше 45 лет с диагнозом «острый ИМ», находившиеся в момент исследования на стабильной антиагрегантной терапии клопидогрелом (75 мг/день) и аспирином (100 мг/день) не менее 7 дней (группа К+А), - 32 человека. У всех лиц определяли параметры MFI^®", МР1адф* Ri (%) и %со62р.рЕАДф-, %CD62P-PE'V№+, К2 (%), а также степень АДФ-индуцированной агрегации Т (%) при 2,5 мкМ, 5 мкМ и 10 мкМ АДФ (табл. 13).

Исследование показало, что у больных, принимавших только аспирин, показатель K¡, характеризующий изменение количества рецепторов GP Ilb-IIIa в ходе активации АДФ, составил 15 %, что не отличалось от группы доноров, в то время как у пациентов, принимавших клопидогрел в комбинации с аспирином, данный показатель был менее 8 %, что можно расценивать как эффективное подавление АДФ-индуцированной активации селективным блокатором АДФ-рецептора P2Y12 - клопидогрелом. Данный показатель К\ коррелирует с параметрами стандартной АДФ-индуцированной агрегации и, так же как степень агрегации Т(%), снижен на фоне клопидогрела более чем в

1,5 раза по сравнению с контрольной группой доноров. Аналогичное 50 % ингибирование активации GP Ilb-IIIa на фоне блокатора АДФ-рецептора P2Y12 было показано в работе Braun О.О. и соавт. (Braun 0.0. et al., 2008).

Таблица 13

Параметры функциональной активности тромбоцитов на фоне антиагрегантной

терапии по данным проточной цитометрии и стандартной агрегатометрии

Исследуемый параметр Исследуемые группы

Д А К+А

GP Ilb-IIIa МНАДФ" 14,6 ± 0,9 11,3 ±1,6 10,7 ±0,7

GP Ilb-IIIa МПЛДФ+ 16,5 ±1,1 13,7 ±2,2 11,7 ±0,8

к, (%) 13,0 ±2,0 14,9 ± 2,5 7,9 ± 1,5*

%CD62P-PEAA<p- 1,8 ± 0,5*** 3,7 ±0,7 3,4 ± 0,8

%С062Р-РЕАДФ+ 17,8 ±3,0 20,1 ±3,6 6,9 ±1,1

К? (%) 75,0 ±5,0 70,3 ± 6,7 48,0 ± 6,0*

Т,% (2,5 мкм АДФ) 50,9 ± 3,8 30,3 ±2,6** 23,2 ± 2,4**

Т,% (5 мкм АДФ) 60,1 ±3,7 40,1 ±3.0** 33,5 ±3,6**

Т,% (10 мкм АДФ) 62,6 ± 5,0 48,0 ±3,1** 44,3 ±4,5**

*р < 0,05 - (К+А) против А и Д; **р < 0,05 - А и (К+Л) против Д; ***р < 0,05 -Д против А и (К+А).

Информативным и наглядным в отношении оценки функциональной активности тромбоцитов па фоне антиагрегантных препаратов оказалось экспрессирование Р-селектина на поверхности тромбоцитов. Его высокий уровень наблюдается у пациентов, резистентных к антиагрегантной терапии аспирином (Shantsila Е., Lip G.Y.H., 2009; Ferguson A., Dokainish Н., Lakkis N., 2008). В нашей работе количество клеток, экспрессирующих Р-селектин в отсутствие активации in vitro, составило у доноров около 2 %. Однако у пациентов с ССЗ даже на фоне приема антиагрегантных препаратов это значение достоверно увеличивалось вдвое, что говорит о наличии активации тромбоцитарного гемостаза у больных ИМ, несмотря на терапию. При активации in vitro число клеток, связывающихся с антителами к Р-селектину, увеличивается у доноров и больных на фоне приема аспирина - до 20 %. В то время как у пациентов, принимающих клопидогрел, число тромбоцитов, экспрессирующих Р-селектин, меняется незначительно и составляет менее 7 %, что свидетельствует об эффективном подавлении тромбоцитарной активности. Параметр К2, характеризующий изменение экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов при их активации, не различается у доноров и пациентов, принимающих аспирин, но в 1,5 раза снижен у больных на фоне приема клопидогрела. Таким образом, у пациентов, принимающих только аспирин, не происходило значимого подавления тромбоцитарной активности, несмотря на то, что степень АДФ-индуцированной агрегации, измеренной фотометрическим методом, на фоне аспирина достоверно снижалась по сравнению с контрольной группой и приближалась по своим значениям к таковой у пациентов на двойной антиагрегантной терапии - клопидогрел и аспирин (табл. 13). Наши данные показывают, что не всегда параметры

стандартной агрегатометрии адекватно отражают функциональную активность тромбоцитов у больных, принимающих антиагреганты.

На основании проведенного исследования нами предложены новые лабораторные критерии для оценки гиперагрегации тромбоцитов и эффективности действия клопидогрела и аспирина: при значении К\ < 10 % и К2 <5 0 % действие антиагрегантного препарата можно оценивать как эффективное, значения К\ >10 % и Кг >50 % могут считаться маркерами высокой реактивности тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии или неэффективности действия антиагрегантного препарата.

Наше исследование показало, что лабораторный контроль функционального состояния тромбоцитов у пациентов, принимающих антиагрегантные препараты, целесообразно проводить с помощью проточной цитометрии на 5-7 сутки. Оптимальность данного срока была апробирована у 10 пациентов, принимающих двойную антиагрегантную терапию -клопидогрел (75 мг/день) + аспирин (100 мг/день).

Снижение активности тромбоцитарного гемостаза по показателям К\ и К2 происходит уже на 5 день приема антиагрегантных препаратов (рис. 8), тогда как максимальная степень АДФ-индуцированной агрегации достоверно снижается при всех концентрациях индуктора только на 10 день, а скорость агрегации практически не изменяется (табл. 14).

12 10

90. 8070 60

........... в до начала терапии 53

6,8

О 5 день терапии

•р=0,02

К1,%

40 30 20. 100

ж: 1 'i ' <6 75,2 **

¡ 60,6

ддо начала терапии

р5 день терапии

"р<0,1

К2,%

Рис. 8. Параметры А-] (а) и К2 (б) до начала и на 5 день антиагрегантной терапии

Таблица 14

Параметры АДФ-нндуцированной агрегации в зависимости от длительности

Параметры агрегации До начала терапии 5 дней терапии 10 дней терапии

Т(%) 2,5 мкМ АДФ 44,7 ± 3,9 34,0 ±3,5 24,0 ± 3,0*

5 мкМ АДФ 56,6 ±5,2 49,9 ±4,1 31,8 ±2,8*

10 мкМ АДФ 68,5 ±3,0 54,0 ±3,8* 44,3 ±4,5*

V (%/мин) 2,5 мкМ АДФ 25,5 ±3,8 26,2 ±3,1 25,7 ±3,3

5 мкМ АДФ 30,6 ±4,5 33,7 ±3,1 25,5 ± 2,6

10 мкМ АДФ 36,0 ±3,5 30,8 ±3,9 29,1 ±2,8*

*р < 0,05 по сравнению с «до начала терапии».

Можно сделать вывод о более высокой чувствительности лабораторного метода проточной цитометрии для определения активности тромбоцитов при оценке эффективности антиагрегантной терапии клопидогрелом по сравнению со стандартной АДФ-индуцированной агрегацией. Параметры K¡ и К2 адекватно отражают активность тромбоцитов и могут быть использованы в качестве маркеров их гиперфункции. Определение таких маркеров «высокой реактивности тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии» является крайне необходимым, так как может в конечном итоге прогнозировать клинические исходы у пациентов (Hayward С.Р.М., 2009).

Мы проанализировали зависимость показателей функционального состояния тромбоцитов, измеренных методом проточной цитометрии, от молекулярно-генетических факторов тромбоцитарной активности. В общей группе доноров и больных ИМ старше 45 лет (п = 85) до и после активации 10 мкМ АДФ была выявлена положительная и достоверная корреляция между количеством рецептора GP Ilb-IIIa и количеством АДФ-рецепторов Р2Х1, P2Y1 и P2Y12 на мембране тромбоцитов. Коэффициенты корреляции по Спирману R составили от 0,34 до 0,54 при значениях р от 0,01 до 0,00003. В группе доноров количество рецепторов P2Y12 достоверно коррелировало с количеством клеток, экспрессирующих Р-селектин как в отсутствие индуктора, так и при активации АДФ - R = 0,54 (р = 0,008) и R = 0,42 (р = 0,046) соответственно. Анализ взаимосвязи между параметрами GP Ilb-IIIa MFI^0', GP Ilb-IIIa МР1ЛДФ+ и уровнем экспрессии генов Р2Х1, P2Y1 и P2Y12 выявил корреляцию между GP Ilb-IIIa МР1АДФ' и экспрессией Р2Х1 (R = 0,29; р = 0,049), между GP Ilb-IIIa MFI^°" и экспрессией P2Y1 (R = 0,25; р = 0,07) и между GP Ilb-IIIa MFI^ и экспрессией P2Y1 (R = 0,35; р = 0,01). После активации 10 мкМ АДФ наблюдалась тенденция к корреляции между уровнем экспрессии гена P2Y12 и числом клеток, экспрессирующих на своей поверхности Р-селектин - R = 0,27 (р = 0,07). Уровень экспрессии гена рецептора коллагена GP VI также имел тенденцию к корреляции с цитометрическими показателями тромбоцитарной активности К\ и К2 - R = 0,45 (р = 0,09) для обоих параметров. Полученные корреляции между цитометрическими показателями функциональной активности тромбоцитов и количественными характеристиками тромбоцитарных АДФ- и коллагеновых рецепторов, запускающих реакции активации, могут служить еще одним подтверждением того, что для полной и необратимой агрегации тромбоцитов необходима скоординированная передача сигнала через рецепторы GP VI, P2Y12 и P2Y1.

При анализе взаимосвязи между результатами цитометрического исследования тромбоцитарной активности и генетическими вариантами Leu33Pro GP Illa, Ile843Ser GP lib, C807T GP la, T13254C GP VI, C-154T GP VI, C18T P2Y12, G36T P2Y12 и A1622G P2Y1 мы получили следующие достоверные различия: значения параметра К{ в зависимости от генотипов Ile843Ser GP lib и Т13254С GP VI (рис. 9а), количества GP Ilb-IIIa до и после активации АДФ в зависимости от генотипов С-154Т GP VI (рис. 96) и

экспрессия Р-селектина до и после активации АДФ в зависимости от генотипа С807Т GP 1а (рис. 9в).

О генотип NN О генотип NM+MM

0(-154)CCGPVI °(-154)CT+TTGPVl

адф-

АДФн

_П

10,»

АДФ--

¡B

с 807CCGPla с 807CT+TTGPI«

•р-0,007 "р-0,016

адф +

Рис. 9. Зависимость цитометрических показателей от исследованных генотипов Полученные результаты позволяют заключить, что генетические варианты тромбоцитарных рецепторов влияют на функциональную активность тромбоцитов, измеренную методом проточной цитометрии, при этом у носителей мутантных аллелей функциональная активность тромбоцитов повышена.

Влияние молекулярно-генетических факторов на индивидуальную чувствительность к антиагрегантным препаратам 1. Антагонисты GP Ilb-IIIa рецепторов Известно, что индуцируемые реакции тромбоцитов пропорциональны количеству формирующихся комплексов агонист-рецептор. Ответ на антиагрегантные лекарственные препараты будет зависеть от плотности соответствующих рецепторов на мембране тромбоцитов. Исследования антагонистов GP Ilb-IIIa рецепторов показали, что интенсивность тромбоцитарной агрегации строго коррелирует с количеством свободных рецепторов на поверхности клеток (Thcheng J.E. et al., 1994; Mazurov A.V. et al., 2002). Но до сих пор остается неясным, влияют ли межиндивидуальные вариации GP Ilb-IIIa на эффективность селективных блокаторов данного рецептора.

В экспериментах in vitro мы проанализировали ингибиторный эффект антагонистов GP Ilb-IIIa - препаратов монафрам и эптифибатид. Монафрам уменьшал степень АДФ-индуцированной агрегации менее эффективно у доноров - носителей РгоЗЗ аллеля гена GP Ша, чем у доноров с генотипом

LeuLeu (рис. 10a), тогда как ингибирование агрегации тромбоцитов эптифибатидом не зависело от генотипов ЬеиЗЗРго GP Ша (рис. 106). Степень ингибирования агрегации тромбоцитов монафрамом и эптифибатидом достоверно различалась в подгруппах с высоким (> 60х103) и низким (40-50х103) содержанием рецепторов GP Ilb-IIIa на поверхности клеток (рис. 11). Различия не достигали статистической значимости при 3 мкг/мл монафрама, при этой концентрации препарата наблюдали 100 % ингибирование агрегации у 32 доноров из 35. Только 3 донора показали степень ингибирования, отличную от 100 %, однако надо сказать, что у этих индивидуумов количество рецептора GP Ilb-IIIa составило более 75х103 на клетку.

Эптифибатид, нг/ыл

Рис. 10. Ингибирование АДФ-индуцированной агрегации в зависимости от генотипа ЬеиЗЗРго GP Illa: а) монафрам; б) эптифибатид; • - генотип LeuLeu; о - генотип LeuPro+ProPro; * - р < 0,05

Монафрам, мкг/мл

Эптифибатид, нг/мл

Рис. 11. Ингибирования АДФ-индуцированной агрегации монафрамом (а) и эптифибатидом (б) в зависимости от количества рецепторов вР ПЬ-Ша на мембране тромбоцитов: 1 - > 60х103/клетку; 2 - 50-60х103/клетку; 3 - 40-

50х103/клетку

Полученные результаты позволяют заключить, что на индивидуальную чувствительность к селективным блокаторам антительной природы влияют генетические вариации рецептора СР ПЬ-Ша, так как нарушают структуру эпитопа, узнаваемого тАВ. Ранее был показан эффект «дозы гена» -гомозиготные носители РгоЗЗ аллеля демонстрируют большую реактивность тромбоцитов и, соответственно, меньший ингибиторный эффект СР ПЬ-Ша

антагонистов, чем гетерозиготы LeuPro (Feng D. et al., 1999; Michelson A.D. et al., 2000). Эти данные были получены на выборке, включающей достаточное число носителей РгоРго генотипа. В работах с малым числом исследованных гомозиготных носителей Leu33Pro GP Ша не получено достоверных различий в эффективности блокаторов GP Ilb-IIIa у лиц с различными генотипами рецептора (Lasne D. et al., 1997; Andrioli G. et al., 2000; Weber A.A. et al., 2002; Frey U.H. et al., 2003; Aalto-Setalo K. et al., 2005). Мы показали, что на чувствительность к антагонистам, как антительной, так и пептидной природы, в большей степени влияет количество рецептора GP Ilb-IIIa.

2. Аспирин

Снижение эффективности ингибирования агрегации тромбоцитов аспирином, т. е. развитие резистентности, является хорошо известным феноменом. Число пациентов, у которых наблюдается аспирин-резистентность может достигать 24-35 % и даже 57 % (Szczeklik А. et al., 2005). Активация тромбоцитов протромбогенными агонистами стимулирует образование эндогенного ТхА2, который усиливает активацию тромбоцитов и увеличивает количество активированных молекул GP Ilb-IIIa. При стимуляции агрегации АДФ действие ТхАг делает процесс образования агрегатов необратимым и вызывает развитие так называемой второй волны агрегации (Шиффман Ф.Дж., 2000). Наши результаты показали блокирование данного процесса аспирином (рис. 12).

0 1 О I

а Аспирин, мМ б Аспирин, мм

Рис. 12. Степень АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в присутствии аспирина в зависимости от количества GP Ilb-IIIa (а) и генотипа Leu33Pro GP Illa (б): а) • - > 60х103 рецепторов/тромбоцит, о - < 50х103 рецепторов/тромбоцит; б) • - генотип LeuPro+ProPro GP Illa, о - генотип LeuLeu GP Illa; *p < 0,05 и

**p < 0,01

Оказалось, что аспирин в одинаковой степени подавляет агрегацию тромбоцитов в группах с высоким и низким содержанием рецепторов GP Ilb-IIIa - в обоих случаях ~ на 50 % от контрольного уровня без добавления препарата. Однако в связи с тем, что исходный уровень агрегации был выше у лиц с высоким содержанием рецептора, уровень остаточной агрегации в присутствии препарата в этой группе также был существенно (более чем в 2 раза) выше, чем у доноров с низким содержанием GP Ilb-IIIa (рис. 12а).

При добавлении аспирина уровень АДФ-индуцированной агрегации также в одинаковой степени снижался в группах с генотипом «дикого типа» LeuLeu GP Illa и у носителей РгоЗЗ аллеля (LeuPro+ProPro) - на (55 ± 6) % и (46 ± 6) % соответственно (р > 0,1) (рис. 126). Как в контрольных образцах, так и в присутствии препарата уровень агрегации был несколько выше у носителей РгоЗЗ аллеля гена GP Illa, но эти различия не достигали статистической значимости (р = 0,07 в присутствии аспирина и р = 0,1 без препарата).

Мы проанализировали генетические варианты ЬеиЗЗРго GP Illa, Т13254С GP VI и A-842G СОХ-1 у 153 пациентов группы ИБС одновременно с измерением степени агрегации тромбоцитов, индуцированной арахидоновой кислотой (АК) и АДФ (1 мкМ и 10 мкМ) до начала терапии (AK0, 1АДФ0, 10АДФ0) и через две недели после приема препарата в стандартной дозировке 100 мг/день (АК2, 1АДФ2, 10АДФ2). Через 2 недели наблюдений на фоне приема аспирина у пациентов с ИБС наблюдалось значимое снижение степени агрегации тромбоцитов во всех тестах: (18,7 ± 1,5) % и (5,3 ± 0,6) %, (19,9 ± 1,4) % и (10,8 ± 0,9) %, (6,3 ± 0,7) % и (2,4 ± 0,3) % для AK0 и АК2, 10АДФ0 и 10АДФ2, 1АДФ0 и 1АДФ2 соответственно (р < 0,00001). Однако у 18 % больных функциональная активность тромбоцитов в ответ на аспирин по результатам анализа агрегации, индуцированной АК, не изменялась или увеличивалась, что говорило о наличии у этих пациентов аспирин-резистентности. При этом достоверных различий в распределении исследованных генотипов у больных с аспирин-резистентностью и пациентов, положительно ответивших на терапию аспирином по результатам лабораторных тестов, найдено не было (табл. 15).

Таблица 15

Распределение генотипов ЬеиЗЗРго GP Illa, Т13254С GP VI н A-842G СОХ-1 у

пациентов в зависимости от чувствительности к аспирину

Генотип Аспирин-резистентность «+» ответ на аспирин Доноры

ЬеиЗЗРго GP Ша LeuLeu 77,8 72,5 73,8

LeuPro+ProPro 22,2 27,5 26,2

Т13254С GP VI ТТ 72,0 77,3 80,9

ТС+СС 28,0 22,7 19,1

A-842G СОХ-1 АА 92,6 94,2 93,4

AG 7,4 5,8 6,6

Мы наблюдали более эффективное снижение степени АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов (АДФ 1мкМ) через 2 недели после начала терапии аспирином у носителей РгоЗЗ аллеля гена GP Illa (генотипы LeuPro и РгоРго) по сравнению с пациентами, имеющими «дикий» генотип LeuLeu: (1,4 ± 0,3) % и (2,7 ± 0,4) % соответственно (р = 0,03). Также большее снижение агрегационной активности тромбоцитов на фоне приема аспирина показали носители С13254 аллеля гена GP VI, и различия при индукции 10 мкМ АДФ (10АДФ2) имели тенденцию к достоверности: (7,5 ± 1,5) % и (11,1 ± 1,1) %, для носителей генотипов ТС и ТТ соответственно (р = 0,1).

Одновременно была показана тенденция к более высокой АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов (АДФ 10 мкМ) на фоне приема аспирина в течение 14 дней у носителей полиморфизма A-842G СОХ-1 (AG генотип по сравнению с АА генотипом): (14,3 ± 3,2) % и (10,6 ± 1,0) % соответственно (р = 0,09). Однако в дальнейшем наблюдаемые нами эффекты пропадали, и степень агрегации не отличалась у больных с различными генотипами GP Illa, GP VI и СОХ-1 через 1 и 6 месяцев приема аспирина.

Также мы проанализировали функциональную активность тромбоцитов на фоне приема аспирина у пациентов, перенесших ИМ в возрасте старше 45 лет (п = 18). В данной группе функциональная активность тромбоцитов была оценена по показателям АДФ-индуцированной агрегации (2,5 мкМ, 5 мкМ и 10 мкМ АДФ) - Т(%) и V(%/mhh), а также параметрам, измеренным на проточном цитометре - К\ и К2, в зависимости от генетических вариантов Leu33Pro GP Illa, Ile843Ser GP lib, C807T GP la, T13254C GP VI, C18T P2Y12, G36T P2Y12 и A1622G P2Y1, количества рецепторов GP Ilb-IIIa, P2Y12, P2Y1 и P2X1 на поверхности тромбоцитов и уровня экспрессии генов GP lib, GP Illa, P2Y12, P2Y1 иР2Х1.

Аналогично группе ИБС, пациенты с ИМ - носители РгоЗЗ аллеля гена GP Ша на фоне аспирина (100 мг/день)- показывали меньшую степень АДФ-индуцированной агрегации (10 мкМ АДФ) - (61,7 ± 5,2) % против (72,7 ± 2,4) % для генотипов LeuPro+ProPro и LeuLeu соответственно (р = 0,09). Полиморфизм ЬеиЗЗРго GP Ша обсуждался в литературе в связи с развитием аспирин-резистентности, но эффекты РгоЗЗ аллеля строго зависели от лабораторных методов оценки эффективности действия аспирина, примененных в различных исследованиях (Goodman Т., Ferro A., Sharma Р., 2008). Противоположные результаты были получены для Т13254С GP VI. Если обследованные нами пациенты с ИБС эффективнее снижали функциональную активность тромбоцитов в зависимости от носительства мутации Т13254С GP VI, то у больных ИМ степень АДФ-индуцированной агрегации (5 мкМ АДФ) при приеме аспирина была несколько выше при наличии мутации Т13254С GP VI - (56,9 ± 5,0) % и (70,2 ± 5,1) % для ТТ и ТС генотипов соответственно (р = 0,09). Показатели функциональной активности тромбоцитов на фоне приема аспирина, измеренные с помощью цитометрического анализа, также показывали более высокие значения у носителей мутантного аллеля С13254 GP VI: К\ = (4,0 ± 2,3) % и К2 = (67,8 ± 23,8) % для лиц с генотипом «дикого типа» ТТ, Ki = (17,2 ± 3,1) % и К2 = (72,4 ± 6,9) % для пациентов с генотипом ТС (р = 0,02 и р = 0,09 для K¡ и К2 соответственно). Таким образом, в группе больных ИМ старше 45 лет мы выявили ассоциацию Т13254С GP VI с низкой эффективностью аспирина, и данный результат согласуется с Lepantalo А. и соавт. (Lepantalo A. et al., 2006). Следует обратить особое внимание на критерии, по которым оценивалось снижение эффективности действия аспирина, в разных группах анализировались разные показатели - либо АДФ-индуцированная агрегация при различных концентрациях индуктора (группы ИБС и ИМс), либо показатели проточной цитометрии (группа ИМс), либо (у

Lepantalo А. и соавт.) - PFA-100 анализ. Полученные отличия в результатах фармакогенетического исследования говорят о необходимости стандартизировать методы оценки функциональной активности тромбоцитов и индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам с установлением четких критериев состояния «аспирин-резистентности». Наши выводы полностью согласуются с позицией рабочей группы по аспирин-резистентности (Working Group on Aspirin Resistance) Комитета по науке и стандартизации (SSC) Международного общества по тромбозу и гемостазу (ISTH) (Michelson A.D. et al., 2005).

Генотипы A1622G P2Y1 и G36T P2Y12 не влияли на развитие аспирин-резистентности, что не противоречит результатам других исследователей (Bernardo Е. et al., 2006; Goodman Т., Ferro A., Sharma P., 2008). Мы получили неожиданные результаты о влиянии полиморфизма С18Т P2Y12, описанного нами как протективный в отношении развития ИМ и гиперагреации тромбоцитов, на индивидуальную чувствительность больных ИМ к аспирину. Скорость АДФ-индуцированной агрегации (5 мкМ АДФ) была несколько выше у носителей Т18 аллеля - (38,9 ± 4,3) %/мин против (26,9 ± 3,8) %/мин у лиц с генотипом СС (р = 0,09). Выше был и показатель К2 - (85,9 ± 3,3) % и (63,7 ± 9,8) % у носителей СТ+ТТ и СС генотипов P2Y12 соответственно (р = 0,05). Параметр К\ также был несколько выше у носителей Т18 аллеля, но различия не достигали статистической значимости - (14,2 ± 4,2) % и (17,5 ± 2,6) % для СТ+ТТ и СС генотипов P2Y12 соответственно (р > 0,1). Однозначных выводов об ассоциации С18Т P2Y12 с развитием аспирин-резистентности на основании полученных результатов делать нельзя. Но следует учитывать, что ранее данный полиморфный вариант был ассоциирован с увеличением риска возникновения церебро-васкулярных осложнений на фоне стандартной терапии клопидогрелом (Zeigler S. et al., 2005).

Таким образом, несмотря на то, что функциональная активность тромбоцитов у пациентов, принимающих аспирин, может быть различной в зависимости от исследованных генотипов, нельзя назвать эти генетические варианты строгими факторами, определяющими развитие аспирин-резистентности. Тем не менее на практике у больных ССЗ целесообразно учитывать наличие полиморфных вариантов Т13254С GP VI и A-842G СОХ-1, модулирующих индивидуальный ответ на аспирин.

3. Клопидогрел

Результаты исследований, таких как COMMIT, CLARITY, CAPRIE, CURE и CREDO, показали высокую эффективность клопидогрела во вторичной профилактике неблагоприятных клинических исходов. Но одновременно были получены данные о варьировании индивидуального ответа на клопидогрел и описан феномен резистентности к клопидогрелу (Jaremo Р., 2002; Gurbel Р., 2003; Angiolillo D., 2004; Gurbel Р. et al., 2005; Rocca В., Patrono С., 2005).

Для анализа молекулярно-генетических факторов, влияющих на индивидуальную чувствительность к клопидогрелу, нами были обследованы 94 пациента с ОКС и 28 пациентов, перенесших ИМ в возрасте старше 45 лет.

Исследование АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов проводилось больным ОКС исходно (1-я точка), через 7 дней (2-я точка), через 30 дней (3-я точка), через 6-8 месяцев с момента госпитализации (4-я точка) при концентрациях АДФ 1, 2, 5, 10 и 20 мкМ, пациентам с ИМ - на 3-4 день (1-я точка), на 12-15 день (2-я точка, не менее 7 дней терапии клопидогрелом) и через 6 месяцев (3-я точка) при концентрации АДФ 2,5; 5 и 10 мкМ.

При первом измерении не было обнаружено ассоциации между активностью тромбоцитов и исследуемыми генетическими вариантами. Однако в динамике наблюдалось следующее: носители мутаций G36T P2Y12 и С807Т GP 1а, изначально показывая более высокую степень агрегации, на фоне терапии более эффективно ее снижали. Напротив, у носителей мутантных аллелей Leu33Pro GP Illa, С18Т P2Y12 и A1622G P2Y1 не наблюдалось уменьшения степени агрегации тромбоцитов, тогда как пациенты с генотипами «дикого типа» по указанным полиморфизмам вполне адекватно реагировали на антиагрегантную терапию клопидогрелом.

В настоящий момент нет однозначного мнения о влиянии полиморфизмов генов GP Illa, P2Y12 и P2Y1 на индивидуальную чувствительность кардиологических пациентов к клопидогрелу, результаты исследований носят противоречивый характер. Ряд работ не показывают ассоциации генетических вариантов ЬеиЗЗРго GP Illa, G36T P2Y12 и С18Т P2Y12 с вариабельностью ответа на клопидогрел (von Beckerath N. et al., 2005; Angiolillo D.J. et al., 2005; Smith S.M.G. et al., 2006; Lev E.I. et al., 2007). Другие авторы связывают полиморфизмы Leu33Pro GP Illa, G36T P2Y12 и A1622G P2Y1 с гиперреактивностью тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии и с развитием кпопидогрел-резистентности (Dropinski J. et al., 2005; Malek L.A. et al., 2008; Feher G. et al., 2009; Staritz P. et al., 2009), a C18T P2Y12 выступает фактором риска развития церебро-васкулярных осложнений на фоне терапии клопидогрелом (Ziegler S. et al., 2005). Более того, генетические варианты рецептора P2Y12 модулируют не только ответ тромбоцитов на клопидогрел, но и на ингибитор АДФ-рецепторов нового поколения - кангрелор (Bouman HJ. et al., 2010). Этот факт опровергает мнение некоторых исследователей о том, что новые препараты снимут вопрос «резистентности» и индивидуальной чувствительности к антиагрегантной терапии с повестки дня.

Под клопидогрел-резистентностью чаще всего подразумевается отсутствие снижения функциональной активности тромбоцитов или развитие неблагоприятных клинических исходов на фоне приема препарата. Патогенетически более корректным можно считать определение резистентности как неспособность препарата блокировать целевой рецептор P2Y12 и эффективно подавлять агрегацию тромбоцитов. Так как такое определение позволяет использовать лабораторные методы диагностики резистентности к клопидогрелу - определение остаточной активности P2Y12 рецепторов путем измерения АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов до и после начала терапии клопидогрелом (Gurbel Р.А., Tantry U.S., 2007). В своем исследовании мы относили пациентов к клопидогрел-резистентным,

если степень АДФ-индуцированной агрегации не снижалась или повышалась по отношению к исходной точке.

В группе пациентов, перенесших ИМ в возрасте старше 45 лет, клопидогрел-резистентность наблюдалась у 7 из 28 проанализированных по 2-м точкам пациентов, то есть составила 25 %. В группе больных с ОКС клопидогрел-резистентность была выявлена у 24 из 94 проанализированных на 1-й и 2-й точках пациентов, и также составила 25 %. Данная частота развития клопидогрел-резистентности в среднем соответствует таковой, описанной в литературе (Angiolillo D. et al„ 2004; Gurbel P. et al., 2005; Phillips D.R. et al., 2005; Barsky A.A., Arora R.R., 2006; Ferguson A. et al., 2008).

Клопидогрел является пролекарством, и для перехода его в активную форму необходима трансформация с помощью ферментов системы цитохромов Р-450 - CYP2C19, CYP3A4 и CYP3A5. Снижение активности данных ферментов может служить одной из причин развития клопидогрел-резистентности. Мы проанализировали генетические варианты A-293G CYP3A4, G6986A CYP3A5 и G681A CYP2C19 в группах ИМс и ОКС. Проведенный генетический анализ цитохромов CYP2C19, CYP3A4 и CYP3A5 не выявил полиморфизм, ассоциированный с развитием резистентности к клопидогрелу. И в группе ИМс, и в группе ОКС пациенты, в целом положительно отвечающие на клопидогрел, показывали более высокие значения АДФ-индуцированной агрегации, если являлись носителями GA или АА генотипа G6986A CYP3A5. Среди цитохромов Р-450 чаще связывают с пониженной чувствительностью к клопидогрелу полиморфизм гена CYP2C19 (Hulot J. et al., 2006; Frere С. et al., 2008; Varenhorst C. et al., 2009). Варианты CYP3A4 и CYP3A5 в полной мере не объясняют развитие клопидогрел-резистентности, и их ассоциация с данным феноменом оценивается исследователями по-разному (Lau W.C. et al., 2004; Smith S. et al., 2006; Angiolillo D. et al., 2006; Frere C. et al., 2008).

Мы оценили количество рецепторов P2Y12 и P2Y1 на поверхности тромбоцитов до приема клопидогрела и через 1 месяц двойной антиагрегантной терапии клопидогрел (75 мг/день) + аспирин (100 мг/день). Антитела, которые использовались в исследовании, способны связываться только со свободными, не заблокированными активным метаболитом клопидогрела, рецепторами. На фоне антиагрегантной терапии клопидогрелом наблюдалось статистически достоверное снижение количества рецепторов P2Y12 и P2Y1 на мембране тромбоцитов (рис. 13).

Количество рецептора Р2Х1 также было снижено, что довольно трудно объяснить, так как природа данного рецептора отлична от P2Y12 и P2Y1 - он является кальциевым каналом и активируется АТФ. Тем не менее известно, что он может играть ключевую роль в активации тромбоцитов рядом индукторов, даже на фоне антиагрегантной терапии (Grenegard М. et al., 2008). В нашем исследовании от количества свободных рецепторов Р2Х1 зависела АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов на фоне двойной терапии клопидогрел+аспирин - наблюдалась прямая и достоверная корреляция между

средней интенсивностью флуоресценции и степенью агрегации при 2,5 мкМ АДФ (R = 0,68; р = 0,02).

ажкодно □ ♦клопидогрел

"р<0,05

Рис, 13. Количество рецепторов Р2Х1, Р2У1 и Р2У12 на поверхности тромбоцитов пациентов исходно и через 1 месяц терапии клопидогрелом

Также был проанализирован уровень экспрессии генов АДФ-рецепторов Р2Х1, Р2У1 и Р2У12 в тромбоцитах здоровых доноров и у пациентов, чувствительных и резистентных к клопидогрелу. Уровень экспрессии генов Р2Х1 и Р2У1 не различался у пациентов с положительным и отрицательным ответом на клопидогрел. В то время как экспрессия гена Р2У12 была выше у пациентов, не чувствительных к антиагрегантной терапии (табл. 16).

Таблица 16

Уровень экспрессии генов АДФ-рецепторов тромбоцитов Р2Х1, Р2У1 и Р2У12 у

Экспрессия гена Доноры ИМ пациенты

(+) ответ на клопидогрел (-) ответ на клопидогрел

Р2Х1 3,29+0,83 3,96 ±1,39 1,30 ±0,48

P2Y1 2,42 ± 0,59 1,79 ±0,84 0,92 ± 0,77

P2Y12 3,71 ±0,76 1,74 ±0,45 2,79 ± 0,61*

*р < 0,01 - по сравнению с (+) ответом и контрольной группой.

Мы впервые выявили ассоциацию между высоким уровнем экспрессии гена P2Y12 и развитием клопидогрел-резистентности. Braun О.О. и соавт. не нашли такой взаимосвязи, однако они показали прямую корреляцию между количеством рецептора P2Y12 на поверхности тромбоцитов и эффективностью клопидогрела (Braun О.О. et al., 2007). Следует отметить, что работа Braun О.О. и соавт. - это единственное на настоящий момент исследование, которое, как и наше, было посвящено анализу уровня экспрессии гена и количества рецептора P2Y12 у пациентов, принимающих клопидогрел.

Таким образом, на основании проведенного нами фармакогенетического исследования можно заключить, что:

1) генетические варианты Leu33Pro GP Illa, С18Т P2Y12 и G6986A CYP3A5 модулируют индивидуальный ответ пациентов на терапию клопидогрелом -

степень АДФ-индуцированной агрегации у носителей полиморфных аллелей остается высокой;

2) резистентные к клопидогрелу пациенты, которые составляют 25 %, характеризуются высоким уровнем экспрессии гена Р2У12, кодирующего рецептор - «мишень» для клопидогрела;

3) лабораторным маркером, показывающим степень блокирования рецептора Р2У12 на мембране тромбоцитов, выступает количество свободных рецепторов, измеренное методом проточной цитометрии с использованием соответствующих флуоресцентно меченых антител.

Алгоритм лабораторного молекулярно-генетического исследования для оценки функционального состояния тромбоцитов у больных с ССЗ и определения индивидуальной чувствительности к антиагрегантным

препаратам

Поиск причин различной чувствительности к антиагрегантым препаратам и сложность в оценке состояния тромбоцитарного гемостаза привели к необходимости искать комплексный подход к анализу функциональной активности тромбоцитов, что и было предпринято в данной работе. Оценка эффективности действия антиагрегантного препарата должна вестись одновременно по двум направлениям: наблюдение за клиническими исходами и анализ биологического действия препарата, то есть подавления активации и агрегации тромбоцитов с использованием адекватных лабораторных тестов. При этом обязательно надо учитывать индивидуальный генотип пациента, который может влиять на эффективность лекарственного средства.

Рис. 14. Комплексный подход к анализу функциональной активности тромбоцитов и чувствительности к клопидогрелу с учетом молекулярно-генетических механизмов активации тромбоцитарного гемостаза

На примере клопидогрела (рис. 14) комплексный подход к анализу функциональной активности тромбоцитов и чувствительности к антиагрегантной терапии должен учитывать генетические варианты цитохромов Р-450, метаболизирующих клопидогрел, АДФ-рецепторов Р2У12 и Р2У1, являющихся «мишенью» для препарата, а также те генетические

факторы, которые определяют гиперагрегацию тромбоцитов, и в первую очередь - Leu33Pro GP Illa.

В настоящее время активно ведется поиск новых методов анализа функциональной активности тромбоцитов как таковой, а также остаточной реактивности тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии. Результаты исследований подтверждают наш тезис о необходимости проведения комплексного анализа. Так, Marcucci R. и соавт. показали, что только лабораторные тесты с использованием нескольких агонистов могут адекватно ( отразить состояние тромбоцитарного гемостаза и выявить высокую реактивность тромбоцитов на фоне терапии (Marcucci R. et al., 2010). Однако до сих пор нет четкого алгоритма обследования пациентов с целью выявления факторов риска высокой реактивности тромбоцитов, в том числе генетических, и рекомендаций по тактике анитиагрегантной терапии, основывающихся на проведенных лабораторных исследованиях. Помимо трудностей лабораторного определения состояния «резистентности» к антиагрегантным препаратам, существует проблема преодоления низкой чувствительности к лекарственному средству, решить которую возможно только с позиций персонализированной медицины. Уже появились сообщения о снижении функциональной активности тромбоцитов путем увеличения дозы аспирина до 325 мг/день (Brambilla М. et al., 2010), а также о возможном повышении дозы клопидогрела или замене клопидогрела на антагонисты АДФ-рецепторов последнего поколения, GP Ilb-IIIa блокаторы, антагонисты рецепторов тромбина (Zurn C.S., Geisler Т., Gawas М., 2010; Barrero А.Е., 2010).

Мы сформулировали алгоритм лабораторного молекулярно-генетического исследования для оценки функционального состояния тромбоцитов у больных с ССЗ и определения индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам (рис. 15).

Перед назначением клопидогрела рекомендуется провести анализ функциональной активности тромбоцитов, причем не ограничиваться одним методом, а использовать несколько подходов: АДФ-индуцированная агрегация при нескольких концентрациях индуктора (2,5; 5 и 10 мкМ АДФ), коллаген-индуцированная агрегация, исследования на проточном цитометре с расчетом параметров К\ и К2.

Следующее определение функциональной активности тромбоцитов проводится через 5-7 дней терапии клопидогрел 75 мг/день + аспирин 100 мг/день. Одновременно проводится молекулярно-генетический анализ Leu33Pro GP Illa, С18Т P2Y12, Т13254С GP VI, G6986A CYP3A5 и A-842G СОХ-1. Если у пациента отсутствуют указанные мутации, а показатели функциональной активности тромбоцитов снизились по сравнению с исходной точкой, можно сделать заключение об эффективном действии антиагрегантной терапии и продолжать прием клопидогрела и аспирина в стандартной дозировке 75 мг/день и 100 мг/день, соответственно, в течение рекомендованного срока согласно диагнозу. Наличие мутаций Т13254С GP VI и A-842G СОХ-1 при высокой степени коллаген-индуцированной агрегации и

отсутствии изменений параметров К\ и Кг в сторону уменьшения по сравнению с исходными говорят о низкой индивидуальной чувствительности к аспирину. В таком случае может быть рекомендована коррекция дозы аспирина до 325 мг/день, доза клопидогрела остается стандартной (75 мг/день).

ПЕРВИЧНАЯ ОЦЕНКА БОЛЬНОГО С ССЗ

Нет антиагрегантной терапии

J Аспирин 100 мг/день

Определение функциональной активности тромбоцитов

АДФ-индуцированная агрегация (2.5, 5 и 10 мкМ АДФ)

Проточная цитометрия: К1 и И2

Ко ллаген-индуии posa иная агрегация

+ , Генетияескии анализ

Leu33Pro GP lita

C18TP2Y12

G6986A CYP3A5 М T13254CGPVI

i A-842G COX-1

Аспирин Аспирин 100 мг/день +

100 мг/день Клопидогрел 75 мг/день

iá

Определение функциональной активности тромбоцитов

Контроль функциональной активности тромбоцитов

Рис. 15. Алгоритм лабораторного молекулярно-генетического исследования для оценки функционального состояния тромбоцитов у больных с ССЗ и определения индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам

Сохраняющаяся высокая функциональная активность тромбоцитов на фоне двойной антиагрегантной терапии клопидогрел (75 мг/день) + аспирин (100 мг/день) по сравнению с исходной с показателями степени индуцированной агрегации тромбоцитов больше 50 % для всех индукторов и параметрами Кх > 10 % и К2 > 50 %, особенно при детекции у данных пациентов генетических вариантов ЬеиЗЗРго GP Illa, С18Т P2Y12 или G6986A CYP3A5, говорит о развитии «клопидогрел-резистентности» и повышенном риске повторных сердечно-сосудистых событий. В таком случае следует пересмотреть тактику антиагрегантной терапии. В первую очередь может быть рекомендовано увеличение дозы клопидогрела до 150 мг/день, доза аспирина остается стандартной (100 мг/день). Если дальнейшее наблюдение за больным не покажет положительной динамики в снижении функциональной активности

тромбоцитов, следует поставить вопрос о смене антиагрегантной терапии -замене клопидогрела на более быстродействующие антагонисты P2Y12, в том числе не требующие метаболизации ферментом CYP3A5 (особенно актуально у носителей мутации G6986A CYP3A5), или на ингибиторы GP Ilb-IIIa рецепторов и рецепторов тромбина.

Контроль за антиагрегантной терапией необходимо продолжать, особенно если была проведена коррекция дозы аспирина и клопидогрела, для предотвращения как состояний с сохраняющейся высокой активностью тромбоцитов (остается риск повторных ССЗ), так и геморрагических осложнений при чрезмерном подавлении тромбоцитарной функции. При выборе тактики антиагрегантной терапии особое внимание необходимо уделять соблюдению баланса между уменьшением риска ССЗ и одновременной минимизацией риска геморрагических осложнений, это положение согласуется с мнением других исследователей (Merlini Р., 2010).

ВЫВОДЫ:

1. Выявлены следующие генетические факторы повышенного риска развития ССЗ: Leu33Pro GP Illa, Thrl45Met GP Iba, C807T GP 1а и G36T P2Y12 y мужчин в возрасте до 45 лет и Т13254С GP VI, Leu33Pro GP Illa и G36T P2Y12 у пациентов обоего пола в возрасте старше 45 лет. Генетический вариант С18Т P2Y12 оказался протективным в отношении развития инфаркта миокарда у мужчин моложе 45 лет.

2. Генетические варианты рецепторов GP Ilb-IIIa, P2Y12, GP VI и GP Ia-IIa определяют повышенную функциональную активность тромбоцитов у пациентов с ССЗ и доноров без тромбоэмболических и сердечно-сосудистых заболеваний в анамнезе.

3. Количественные характеристики тромбоцитарных рецепторов GP Ilb-IIIa, P2Y12 и P2Y1, такие как число рецепторов на поверхности клетки и уровень экспрессии соответствующих генов, коррелируют с показателями функциональной активности тромбоцитов и могут влиять на индивидуальную чувствительность к антиагрегантным препаратам - селективным блокаторам GP Ilb-IIIa рецепторов, аспирину и ингибиторам АДФ-рецепторов соответственно.

4. Количество рецепторов GP Ilb-IIIa на мембране тромбоцитов в большей степени определяет индивидуальную чувствительность к селективным блокаторам GP Ilb-IIIa, тогда как мутация ЬеиЗЗРго GP Illa может иметь значение при терапии препаратами антительной природы.

5. Генетические варианты ЬеиЗЗРго GP Illa, С18Т P2Y12 и G6986A CYP3A5 модулируют индивидуальную чувствительность к антиагрегантной терапии клопидогрелом, в то время как генетические варианты Т13254С GP VI и А-842G СОХ-1 влияют на индивидуальную чувствительность к аспирину.

6. Разработанный новый метод на основе проточной цитометрии с использованием специфичных флуоресцентно меченых антител позволяет оценивать функциональную активность тромбоцитов и эффективность антиагрегантной терапии клопидогрелом и аспирином. В качестве показателей

активности тромбоцитов предложены расчетные параметры К\ и К2, которые характеризуют относительные изменения количества GP Ilb-IIIa и Р-селектина на поверхности клетки в ходе активации.

7. Сформулированный на основании проведенной работы алгоритм лабораторного молекулярно-генетического исследования больных с ССЗ позволяет определить индивидуальную чувствительность к антиагрегантным препаратам клопидогрелу и аспирину и осуществить патогенетически обоснованную терапию с позиций персонализированной медицины.

Практические рекомендации

1. Для выявления генетических факторов высокого риска развития сердечнососудистых заболеваний и гиперагрегации тромбоцитов показано тестирование следующих полиморфизмов - Leu33Pro GP Illa, G36T P2Y12, СВ07Т GP la и Thrl45Met GP Iba у мужчин в возрасте до 45 лет, и Leu33Pro GP Illa, G36T P2Y12 и Т13254С GP VI у лиц обоего пола старше 45 лет.

2. Для оценки функциональной активности тромбоцитов и эффективности антиагрегантной терапии необходимо использовать несколько лабораторных методов, одним из которых является определение количества рецепторов GP Ilb-IIIa и Р-селектина на поверхности тромбоцитов с помощью проточной цитометрии. В качестве показателей тромбоцитарной активности следует рассчитывать параметры Кх и К2, которые характеризуют относительные изменения количества GP Ilb-IIIa и Р-селектина на поверхности клетки в ходе индуцированной активации с ЮмкМ АДФ. При значении K¡ < 10 % и К2 < 50 % действие антиагрегантного препарата оценивается как эффективное, значения К\ > 10 % и К2 > 50 % считаются маркерами высокой реактивности тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии или неэффективности действия антиагрегантного препарата.

3. В основе алгоритма обследования пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями, которым показан прием антиагрегантных препаратов, должен лежать комплексный подход, учитывающий генетические варианты G6986A CYP3A5 - цитохрома Р-450, метаболизирующего клопидогрел, С18Т P2Y12 -АДФ-рецепторов P2Y12, являющихся «мишенью» для препарата, а также те генетические факторы, которые определяют гиперагрегацию тромбоцитов, и в первую очередь - Leu33Pro GP Illa. Для определения индивидуальной чувствительности к аспирину необходимо проводить генотипирование Т13254С GP VI и A-842G СОХ-1.

Публикации по теме диссертационного исследования Статьи, опубликованные в журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ

1. Sirotkina O.V. The combination of glycoprotein Ilia P1(A) polymorphism with polymorphism of serotonin transporter as an independent strong risk factor for the occurrence of coronary thrombosis / Schwartz E., Demidova D., Sirotkina O., Kudinov S. // Molecular Genetics and Metabolism. - 2003. - V.79. - №3. - P. 229-230.

2. Сироткина O.B. Распределение аллельных вариантов генов, определяющих склонность к тромбофилии, у мужчин, перенесших инфаркт миокарда в молодом возрасте / Сироткина О.В., Шейдина A.M., Волкова М.В., Беркович О.А., Бажено-

ва Е.А., Черкашин Д.В., Бойцов С.А., Шляхто Е.В., Шварц Е.И. // Медицинский академический журнал. - 2004. - Т. 4. - № 1. - С. 29-35.

3. Сироткина О.В. Новая мутация гена GP Ша в российской популяции - Leu40Arg, сцепленная с ЬеиЗЗРго / О.В. Сироткина, A.M. Шейдина, Т.В. Вавилова, Е.И. Шварц // Генетика. - 2005. - Т. 41. - № 6. - С. 683-687.

4. Сироткина О.В. Участие гликопротеина Ilb-IIIa в спонтанной агрегации тромбоцитов / О.В. Сироткина, A.M. Заботина, А.Е. Тараскина, Е.Б. Сиваченко, Е.Е. Зуева, М.И. Кадинская, Л.И. Бурячковская, И.А. Учитель, С.Г. Хаспекова, Т.В. Вавилова, AJI. Шварцман, A.B. Мазуров // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 143. - № 4. - С. 398-^01.

5. Sirotkina O.V. Effect of platelet glycoprotein Ilb-IIIa number and glycoprotein Ilia Leu33Pro polymorphism on platelet aggregation and sensitivity to glycoprotein Ilb-IIIa antagonists / O.V. Sirotkina, S.G. Khaspekova, A.M. Zabotina, Y.V. Shimanjva, A.V. Mazurov // Platelet. - 2007. - V. 18. - № 7. - P. 506-514.

6. Сироткина О.В. Генетические факторы риска развития инфаркта миокарда у мужчин молодого возраста в Северо-Западном регионе России / С.Н. Пчелина, О.В. Сироткина, A.M. Шейдина, А.Е. Тараскина, Т.И. Родыгина, Е.П. Демина, A.M. Заботина, М.И. Митупова, Е.А. Баженова, O.A. Беркович, Е.В. Шляхто, A.J1. Шварцман, Е.И. Шварц // Кардиология. - 2007. - Т. 7. - С. 29-34.

7. Сироткина О.В. Вариации содержания гликопротеина Ilb-IIIa (allb/ß3 интегрина) у здоровых доноров. Влияние на агрегационную активность тромбоцитов и эффективность действия аспирина / С.Г. Хаспекова, О.В. Сироткина, Ю.В. Шиманова, A.B. Мазуров // Биомедицинская химия. - 2008. - Т. 54. - № 3. -С. 361-371.

8. Сироткина О.В. Эффективность антиагрегантной терапии клопидогрелом у пациентов, перенесших инфаркт миокарда с подъемом сегмента ST / О.В. Сироткина, Е.В. Богданова, H.A. Боганькова, А.Н. Столярова, Т.В. Вавилова, С.А.Болдуева // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2009. - Т.8. - №1. -С.51-55.

9. Сироткина О.В. Генетические варианты АДФ-рецептора тромбоцитов P2Y12, ассоциированные с изменением функциональной активности тромбоцитов и развитием сердечно-сосудистых заболеваний / О.В. Сироткина, A.M. Заботина, O.A. Беркович, Е.А. Баженова, Т.В. Вавилова, А.Л. Шварцман // Генетика. - 2009. -Т. 45. - №.2. - С. 247-253.

10. Сироткина О.В. Факторы риска тромботических осложнений и прогноз у больных с хронической формой ишемической болезни сердца / Комаров А.Л., Шахматова О.О., Стамбольский Д.В., Ребриков Д.В., Кофиади H.A., Сироткина О.В., Деев А.Д., Панченко Е.П. // Кардиология. - 2009. - Т. 11. - С.4-10.

И. Сироткина О.В. Молекулярно-генетический анализ АДФ-рецепторов тромбоцитов у здоровых лиц и пациентов, принимающих клопидогрел / Сироткина О.В., Боганькова H.A., Тараскина А.Е., Железняк Е.Л., Болдуева С.А., Вавилова Т.В. // Технологии живых систем. - 2009. - Т. 8. - С. 46-52.

12. Сироткина О.В. Резистентность к клопидогрелу у больных с острым коронарным синдромом / Н.С. Фролова, P.M. Шахнович, А.Б. Добровольский, О.В. Сироткина, М.Я. Руда // Терапевтический архив. - 2010. - Т. 8. - С. 14-19.

13. Сироткина О.В. Иммунологические методы в оценке функциональной активности тромбоцитов у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями / Сироткина О. В., Боганькова H.A., Ласковец А.Б., Кухарчик Г.А., Гайковая Л.Б., Вавилова Т.В. // Медицинская иммунология. - 2010. - Т. 12. - № 3. - С. 213-218.

14. Сироткина O.B. Молекулярно-генетические механизмы активации тромбоцитов и чувствительности к антиагрегантиым препаратам у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями / О.В. Сироткина // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. - 2010. - Т. 4. -№ 1. - С. 69-76.

15. Сироткина О.В. Резистентность к аспирину у больных с острым коронарным синдромом / Н.С. Фролова, P.M. Шахнович, Е.М. Казначеева, О.В. Сироткина, А.Б. Добровольский // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2010. - Т. 6. -С. 40-46.

Патенты на изобретение

16. Сироткина О.В. Способ оценки эффективности действия антиагрегантных препаратов на организм человека: Заявка на патент № 2010130629 (21.07.2010) / Сироткина О.В., Гайковая Л.Б., Вавилова Т.В., Кухарчик Г. А., Шабров A.B.

Учебно-методические пособия

17. Сироткина О.В. Генетические факторы риска развития сердечно-сосудистых заболеваний: Пособие для врачей / С.Н. Пчелина, О.В. Сироткина, А.М. Шейдина, O.A. Беркович, Т.В, Вавилова, Е.В. Шляхта, М.В. Дубина - Санкт-Петербург, 2006. -Изд. СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. - С. 27.

Статьи в сборниках

18. Сироткина О.В. Генетика тромбофильных состояний / Сироткина О.В., Шейдина A.M., Вавилова Т.В., Шварц Е.И. // В сб. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. - Вып. 6. - Новосибирск: Альфа Виста, 2004. - С. 127-143.

19. Сироткина О.В. Генетические факторы риска развития инфаркта миокарда у мужчин молодого возраста / Пчелина С.Н., Сироткина О.В., Шейдина A.M., Шварцман A.JI., Шварц Е.И. // В сб. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. -Вып. 6. - Новосибирск: Альфа Виста, 2004. - С. 24-58.

20. Сироткина О.В. Фармакогенетика антитромботических препаратов / О.В. Сироткина, А.Н. Столярова, A.C. Улитина, Т.В. Вавилова // В сб. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. - Вып. 9. - Новосибирск: Альфа Виста, 2006. - С. 67-83.

21. Сироткина О.В. Генетические причины гиперагрегации тромбоцитов / О.В. Сироткина// В сб. Бреслеровские чтения. - 2007. - С. 203-214.

22. Сироткина О.В. Р2-рецепторы тромбоцитов / О.В. Сироткина, A.M. Заботина, E.JI. Железняк, А.Н. Столярова, Т.В. Вавилова // В сб. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. - Вып. 12. - Новосибирск: Альфа Виста, 2008. - С.33-41.

23. Сироткина О.В. Исследование функциональной активности тромбоцитов: история, современность, перспективы / О.В. Сироткина // В сб. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. - Вып. 15. - Новосибирск: АртЛайн, 2010. - С. 60-74.

Прочие научные публикации

24. Сироткина О.В. Использование метода проточной цитометрии для определения количества гликопротеиновых рецепторов GP Ilb/Illa на поверхности тромбоцитов / Сиваченко Е.Б., Зуева Е.Е., Кадинская М.И., Заботина A.M., Тараскина А.Е., Сироткина О.В. // Кпинико-лабораторный консилиум. - 2006. - Т. 13. - С. 28-34.

25. Сироткина О.В. Молекулярно-генетические основы наследственных тромбофипий / О.В. Сироткина// Клинико-лабораторный консилиум. - 2006. - Т. 13. - С. 21-27.

26. Сироткина О.В. Фармакогенетика антитромботических препаратов / Сироткина О.В., Вавилова Т.В. // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2007. - Т. 2. - С. 3-15.

27. Сироткина О.В. Фармакогенетическое исследование как основа для индивидуализированного подхода к лекарственной терапии / A.C. Улитина, О.В. Сироткина, С.Н. Пчелина, М.В. Дубина // Клинико-лабораторный консилиум. - 2009. - Т. 3. - С. 36-43.

28. Сироткина О.В. Молекулярные дефекты гена рецептора тромбоцитов Ilb/IIIa, ассоциированные с гиперагрегацией / Сироткина О.В., Шейдина А.М., Кадинская М.И., Вавилова Т.В., Шварц Е.И. // Фундаментальные исследования и прогресс в кардиологии:

Сборник тезисов Конгресса ассоциации кардиологов стран СНГ. - Санкт-Петербург. -Научно-практический журнал «Кардиология СНГ». - 2003. - Т. 1. - № 1. - С. 263.

29. Сироткина О.В. Роль мутационных повреждений гена P2Y12, кодирующего АДФ-рсцсптор тромбоцитов, в патогенезе тромбофилических состояний / Сироткина О.В., Кудинов С.В., Топерверг О.Б., Вавилова Т.В., Шварц Е.И. // Современные достижения клинической генетики: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, Москва. -Медицинская генетика. - 2003. - Т. 2. - № 10. - С. 440.

30. Сироткина О.В. Молекулярные дефекты гемостаза в развитии инфаркта миокарда в молодом возрасте / Шейдина A.M., Сироткина О.В., Родыгина Т.Н., Демина Е.П., Беркович О.А., Шварц Е.И. II Современные достижения клинической генетики: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Москва. - Медицинская генетика. - 2003. - Т. 2. - № 10. -С. 447.

31. Сироткина О.В. Поиск мутационных повреждений гена P2Y12, кодирующего АДФ-рецептор тромбоцитов / О.В. Сироткина, О.Б. Топерверг, А.М. Новикова, Т.В. Вавилова, С.Н. Пчелина, Е.И. Шварц // Фундаментальные науки - медицине: Материалы конференции. - Москва. - М.: Фирма «Слово», 2003. -176 е., С. 23-25.

32. Сироткина О.В. Новые структурные полиморфизмы гена P2Y12, кодирующего АДФ-рецептор тромбоцитов, и их функциональное значение / Новикова A.M., Сироткина О.В., Вавилова Т.В., Пчелина С.Н. И Биология - наука XXI века: Сборник тезисов 8-й Международной Путинской школы-конференции молодых ученых. - Пущино. - 2004. - С. 24.

33. Sirotkina О. The new mutation in the GPIIIa gene associated with high platelet aggregation is found in Russia / Sirotkina 0., Sheydina A., Vavilova Т., Schwarzman A. // 18th International Congress on Thrombosis, Slovenia, Ljubljana. - Pathofysiology of Haemostasis and Thrombosis. - 2004. - Suppl. -P. OCO8O.

34. Сироткина О.В. Новые структурные полиморфизмы кодирующей области гена АДФ-рецептора тромбоцитов P2Y12 / Новикова A.M., Сироткина О.В. // Молодые ученые -промышленности Северо-Западного региона: Материалы семинаров политехнического симпозиума. - СПб.: Изд-во Политехи, ун-та, 2004. - 167 с. - С. 92-93.

35. Сироткина О.В. Сочетанное носительство аллельных вариантов генов системы тромбообразования как фактор риска развития инфаркта миокарда у мужчин молодого возраста / Сироткина О.В., Баженова Е.А., Беркович О.А., Пчелина С.Н. // Российская кардиология: от центра к регионам: Материалы Российского национального конгресса кардиологов, Томск, Россия. - Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2004. - Прил. -С. 447.

36. Сироткина О.В. Генетические механизмы гиперагрегации тромбоцитов: аллельные варианты гена АДФ-рецептора P2Y12 / Новикова A.M., Сироткина О.В., Яшина Е.С., Кадинская М.И., Вавилова Т.В. // Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии: Материалы второй всероссийской научной конференции (с международным участием), Москва. - 2005. - С. 250.

37. Сироткина О.В. Фармакогенетические критерии селективного применения антитромботических препаратов варфарина и плавикса / Сироткина О.В., Новикова A.M., Улитина А.С., Кадинская М.И., Вавилова Т.В. // Материалы V съезда Российского общества медицинских генетиков, Уфа. - Медицинская генетика. - 2005. - Т. 4. - № 6. - С. 267.

38. Сироткина О.В. Новые SNPs гена АДФ-рецептора тромбоцитов P2Y12 и риск развития инфаркта миокарда / Новикова А.М., Сироткина О.В. // Биология - наука XXI века: Сборник тезисов 9-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. - Пущино. -2005.

39. Sirotkina О. The new single nucleotide polymorphisms of ADP receptor P2Y12 gene affected platelet aggregation and myocardial infarction development were found in Russia / Sirotkina O., Novikova A., Vavilova T. // Abstract of XX International Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Sydney, Australia. - Journal of Thrombosis and Haemostasis. - 2005. -V.3.-Suppl. 1.-P.P0980.

40. Sirotkina O.V. New genetic risk factor for myocardial infarction development in patients with arterial hypertension / Novikova A.M., Sirotkina O.V. II International Congress "Hypertension - from Korotkov to present days": Abstract book. - Saint-Petersburg, Russia. - 2005. - P. 97-98.

41. Sirotkina O.V. The analysis of the relationship between the combined risk of the cardiovascular disease development's factors and the number of the genetic markers associated with the cardiovascular pathology in the healthy young men population / Chercashin D.V., Berkovitch O.A., Sirotkina O.V. // International Congress "Hypertension - from Korotkov to present days": Abstract book. - Saint-Petersburg, Russia. - 2005. - P.25.

42. Сироткина O.B. Вклад наследственных факторов в формирование наследственной предрасположенности к развитию сердечно-сосудистой патологии / Пчелина С.Н., Сироткина О.В., Шейдина A.M., Шварцман А.Л. // Перспективы российской кардиологии: Материалы Российского национального конгресса кардиологов, Москва. - Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2005. - Т. 4. - №4. - С. 270.

43. Сироткина О.В. Изменение активности тромбоцитов у больных с различным генотипом Leu33Pro GP Ша, принимающих плавике после чрескожной ангиопластики коронарных артерий / Яшина Е.С., Новикова A.M., Кадинская М.И., Вавилова Т.В., Сироткина О.В. // Материалы Одиннадцатого Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов, Москва. -Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. - 2005. - Т. 6. - № 5. - С. 297.

44. Sirotkina O.V. The Leu33Pro GP Ilia genetic variants and quantity of the GPIIb/IIIa receptors on platelet's membrane are the factors influenced the platelet hyperaggregation / O.V. Sirotkina, A.M. Novikova, M.I. Kadinskaya, T.V. Vavilova, A.L. Schwarzman // Abstract of European Human Genetics Conference, Amsterdam, The Nederlands. - European Journal of Human Genetics. - 2006. - V. 14. - Suppl. 1. - C. 258-259.

45. Сироткина О.В. Взаимосвязь P1A1/A2 полиморфизма гликопротеина Ilia с агрегационной активностью тромбоцитов и чувствительностью к антагонистам гликопротеина Ilb/IIIa / Сироткина О.В., Хаспекова С.Г., Заботина A.M., Мазуров А.В. // От диспансеризации к высоким технологиям: Материалы Российского национального конгресса кардиологов, Москва. - Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2006. - Т. 5. - С. 343.

46. Сироткина О.В. Генетические факторы риска развития тромбозов и функциоанльная активность тромбоцитов у больных, принимающих плавике и аспирин после чрескожных вмешательств на коронарных артериях / Яшина Е.С., Заботина A.M., Смурова Е.Л., Кадинская М.И., Азовцев Р.А., Вавилова Т.В., Сироткина О.В. // От диспансеризации к высоким технологиям: Материалы Российского национального конгресса кардиологов, Москва. -Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2006. - Т. 5. - С. 383.

47. Сироткина О.В. Аллельные варианты гена P2Y12 - распределение в двух возрастных группах популяции Северо-Запада России и патогенетическое действие / Смурова Е.Л., Новикова A.M., Тараскина А.Е., Сироткина О.В. // Биология - наука XXI века: Сборник тезисов 10-й Путинской школы-конференции молодых ученых. - Пущино. - 2006. - С. 49.

48. Sirotkina O.V. Variations of platelet glycoprotein Ilb-IIIa quantity affects platelet aggregation and sensitivity to glycoprotein Ilb-IIIa antagonists / A.V. Mazurov, S.G. Khaspekova, A.M. Zabotina, Y.V. Shimanova, O.V. Sirotkina // Abstracts XXIst Congress of the International Sosiety on Thrombosis and Haemostasis, Geneva, Switzerland. - Journal of Thrombosis and Haemostasis. -2007. - V. 5. - Suppl. 2. - P .P-T-296.

49. Sirotkina O.V. The GP lib gene expression, Ile843Ser GP lib gene polymorphism, glycoprotein Ilb-IHa number and platelet aggregation in healthy donors / O.V. Sirotkina, A.M. Zabotina, E.L. Zheleznjak, A.N. Stolyarova, T.V. Vavilova // Abstracts of European Human Genetics Conference, Nice, France. - European Journal of Human Genetics. - 2007. - V. 15. - Suppl. 1. - C. 200.

50. Сироткина О.В. Генетические особенности индивидуального ответа на антиагрегантную терапию аспирином / Столярова А.Н., Сироткина О.В. // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: Сборник тезисов к научно-практической конференции молодых ученых. - Санкт-Петербург. - 2007. - С. 49-51.

51. Сироткина О.В. Мутации коллагеновых рецепторов Т13254С GPVI и С807Т GPIa, количество гликопротеинов GPVI и GPIa-IIa на мембране тромбоцитов и их функциональная активность у здоровых доноров / Столярова А.Н., Сироткина О.В. // Молодые ученые - промышленности Северо-Западного региона: Материалы конференций Политехнического симпозиума 2007 года. - СПб.: Изд-во Политехи, ун-та, 2007. - 198 с. - С. 128-129.

52. Сироткина О.В. Анализ генетических вариантов тромбоцитарного рецептора коллагена у больных, перенесших инфаркт миокарда, и в контрольной группе / К.Л. Крышень,

А.Н. Столярова, Е.А. Баженова, О.А. Беркович, О.В. Сироткина // Тромбозы в клинической практике: факторы риска, диагностика, терапия: Материалы Всероссийской конференции с международным участие, Санкт-Петербург, Россия. - Клинико-лабораторный консилиум. -2007.-Т. 16.-С. 74.

53. Сироткина О.В. Анализ изменения агрегации тромбоцитов у больных ИБС, принимающих аспирин, в зависимости от генетических вариантов рецептора фибриногена (PLA1/A2 GPIIIa) и циклооксигеназы 1 (A-842G СОХ-1) / О.В. Сироткина, О.А. Каткова, П.С. Лагута., А.Н. Столярова, Е.Л. Железняк, А.Б. Добровольский, Е.П. Панченко // Тромбозы в клинической практике: факторы риска, диагностика, терапия: Материалы Всероссийской конференции с международным участие, Санкт-Петербург, Россия. - Клинико-лабораторный консилиум. - 2007. - Т. 16. - С. 87.

54. Sirotkina О. The Т13254С GPVI and С807Т GPIa gene polymorphisms, glycoproteins GPVI and GPIa-lIa number and collagen-induced platelet aggregation in healthy donors / Stolyarova A., Bychkova N„ Vavilova Т., Sirotkina O. // Abstracts of 52nd GTH Congress, Wiesbaden. -Hamostaseologie. - 2008. - V. 1-2. - P. A78.

55. Sirotkina O. The variability of the platelet collagen receptor GPVI quantity measured by flow cytometry as a result of GP VI gene / O. Sirotkina, A. Stolyarova, N. Bychkova, T. Vavilova // Abstracts of the XXIst International Symposium on Technological Innovations in Laboratory Hematology, Sydney, Australia. - International Journal of Laboratory Hematology. - 2008. - V. 30. - Suppl. l.-P. 117.

56. Sirotkina O. The mutant allele and expression of the ADP receptor gene P2Y12 as a novel molecular factor influencing platelet activity / O. Sirotkina, A. Stolyarova, N. Bogankova, T. Vavilova // Abstracts of the XXIst International Symposium on Technological Innovations in Laboratory Hematology, Sydney, Australia. - International Journal of Laboratory Hematology. - 2008. - V. 30. -Suppl. l.-P. 127.

57. Sirotkina O.V. Contribution of gene sequence variant CYP3A4*lb of the hepatic cytochrome P450 3A4 enzyme to variability in indnvidual response to clopidogrel / A.N. Stolyarova, O.V. Sirotkina // Abstracts of European Human Genetics Conference, Barselona, Spain. - European Journal of Human Genetics. - 2008. - V. 16. - Suppl. 2. - P. 305.

58. Sirotkina O. Efficiency of clopidorgel in patients with ST-elevation myocardial infarction (STEMI) and key platelet receptors gene polymorphisms / O. Sirotkina, A. Stolyarova, N. Bogankova, E. Bogdanova, S. Boldueva, T. Vavilova // Abstracts from the 20" International Congress on Thrombosis, Athens, Greece. - Pathofysiology of Haemostasis and Thrombosis. - 2008. - Suppl. - P. A58.

59. Сироткина О.В. Эффективность антаагрегантной терапии у пациентов, перенесших инфаркт миокарда, в зависимости от полиморфизма рецепторов тромбоцитов и цитохромов Р-450 / Сироткина О.В., Боганькова Н.А., Столярова А.Н., Богданова Е.В., Болдуева С.А., Вавилова Т.В. // Повышение качества и доступности кардиологической помощи: Материалы Российского национального конгресса кардиологов, Москва. - Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2008. - Т. 7. - № 6. - Прил. 1. - С. 341.

60. Сироткина О.В. Генетические вариации тромбоцитарных рецепторов и их вклад в гиперагрегацию тромбоцитов, риск инфаркта миокарда и чувствительность к антаагрегантной терапии клопидогрелем / О.В. Сироткина, Н.А. Боганькова, Е.Л. Железняк, Т.В. Вавилова // Фундаментальные науки - медицине: Тезисы докладов на конференциях и семинарах по научным направлениям Программы в 2008 году. - М.: Фирма «Слово», 2008. - 240 с. -С.48-49.

61. Сироткина О.В. Анализ экспрессионного профиля генов тромбоцитарных рецепторов -зависимость от возраста и влияние на функциональную активность тромбоцитов / Сироткина О.В., Заботина А.М., Железняк Е.Л., Боганькова Н.А., Богданова Е.В., Болдуева С.А., Гайковая Л.Б., Вавилова Т.В. // Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии: Материалы IV Всероссийской конференции (с международным участием). - Москва. - 2009. - С. 469-470.

62. Sirotkina O.V. The P2Y1, P2Y12, GPIIb and GPIIIa gene expressions in platelets of healthy donors and patients with myocardial infarction / O.V. Sirotkina, N.A. Bogankova, A.L. Schwarzman, T.V. Vavilova // Abstracts XXIIst Congress of the International Sosiety on Thrombosis and

Haemostasis, Boston, US. - Journal of Thrombosis and Haemostasis. - 2009. - V. 7. - Suppl. 2. -P. PP-TH-025.

63. Сироткина O.B. Новые подходы к оценке функциональной активности тромбоцитов -использование проточной цитометрии и генетического анализа / Боганькова Н.А., Сироткина О.В., Вавилова Т.В. // Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года: Труды научно-практической конференции. - Москва. -2009.-С. 184-185.

64. Сироткина О.В. Уровень экспрессии и генетические варианты тромбоцитарных рецепторов Р2 у больных, перенесших инфаркт миокарда, и здоровых доноров / О.В. Сироткина, E.JI. Железняк, Т.В. Вавилова, АЛ. Шварцман // Материалы V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. - Москва. - 2009. - С. 494.

65. Сироткина О.В. Экспрессионный профиль и генетические варианта АДФ-рецепторов у здоровых лиц и пациентов, принимающих клопидогрель / Сироткина О.В., Ласковец А.Б., Боганькова Н.А., Вавилова Т.В. // Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению: Материалы Всероссийской конференции с международным участием, Москва. - Тромбы, кровоточивость и болезни сосудов. - 2009. -Прил. 7.-С. 115-116.

66. Сироткина О.В. Новые подходы к оценке функциональной активности тромбоцитов с использованием проточной цитометрии / Сироткина О.В., Боганькова Н.А., Вавилова Т.В. // Кардиология: реалии и перспективы: Материалы Российского национального конгресса кардиологов, Москва. - Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2009. - Т. 8. - № 6. -Прил. 1.-С. 330.

67. Сироткина О.В. Генетическая вариабельность тромбоцитарных Р-2 рецепторов и новые маркеры эффективности антиагрегантной терапии клопидогрелем / О.В. Сироткина, Н.А. Боганькова, А.Е. Тараскина, Е.Л. Железняк, С.А. Болдуева, Т.В. Вавилова // Фундаментальные науки - медицине: Тезисы докладов на конференциях и семинарах по научным направлениям Программы в 2009 году. - М.: Фирма «Слово». - 2009. - 272 с. - С. 33-34.

68. Сироткина О.В. Фармакогенетика клопидогрела - полиморфизм и уровень АДФ-рецепторов / Сироткина О.В., Боганькова Н.А., Ласковец А.Б., Тараскина А.Е., Железняк Е.Л., Шварцман А.Л., Вавилова Т.В. И Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону. - Медицинская генетика. - 2010. - Прил. - С. 165.

69. Sirotkina О. Molecular-genetic analysis of platelet P2 receptors in healthy donors and patients treated with antiplatelet agents / O. Sirotkina, N. Bogankova, A. Laskovets, T. Vavilova // Abstracts from the 21st International Congress on Thrombosis, Milan, Italy. - Pathofysiology of Haemostasis and Thrombosis. - 2009-2010. - V. 37. - Suppl. 1. - P. A150.

70. Sirotkina O.V. Glycoprotein Ilb-IIIa content and platelet aggregation in healthy volunteers and patients with acute coronary syndrome / Yakushkin V.V., Zyuryaev I.T., Khaspekova S.G., Sirotkina O.V., Ruda M.Ya., Mazurov A.V. // Platelets - Past, Present and Future: Abstracts of the Nottingham Platelet Conference, Nottingham, UK. - Platelets. - 2010. - V. 21. - № 5. - P. 394.

71. Sirotkina O. The P2 receptors measuring as new approach in assess of clopidogrel efficacy / O. Sirotkina, N. Bogankova, L. Gaykovaya, A. Lipunova, S. Boldueva, T. Vavilova // Laboratory Medicine in Health Care: Abstracts of First European Joint Congress of EFCC and UEMS, Lisbon, Portugal.-2010.-P. 80.

72. Sirotkina O. New sensitive markers of platelet's reactivity in omega-3-acid ethyl esters treated donors / L. Gaykovaya, O. Sirotkina, N. Bogankova, A. Laskovets, G. Kuharchik, T. Vavilova // Laboratory Medicine in Health Care: Abstracts of First European Joint Congress of EFCC and UEMS, Lisbon, Portugal. - 2010. - P. 81.

73. Sirotkina O. Analysis of platelet's functional activity by immunological techniques in patients with cardiovascular disease / N. Bogankova, O. Sirotkina, A. Laskovets, L. Gaykovaya, T. Vavilova // Abstracts of XXIII International Symposium on Technological Innovations in Laboratory Hematology, Brighton, UK. - Int. Jnl. Lab. Hem. - 2010. - V. 32. - Suppl. 1. - P. 97-98.

74. Сироткина О.В. Новые молекулярные методы в оценке функции тромбоцитов и эффективности антиагрегантов / Сироткина О.В., Вавилова Т.В. // Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: Материалы I международной научно-практической конференции. - Москва. - 2010. - С. 198.

Отпечатано в типографии ПИЯФ РАН

188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 71, тир. 120, уч.-изд. л. 3; 02.03.2011 г.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Сироткина, Ольга Васильевна

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Механизмы активации тромбоцитов.

1.2. Ключевые тромбоцитарные рецепторы.

1.3. Антиагрегантная терапия - основные фармакологические средства, показания к применению.

1.4. Генетические факторы, влияющие на индивидуальную чувствительность к антиагрегантным препаратам.

1.5. Лабораторные методы оценки функциональной активности тромбоцитов и эффективности антиагрегантной терапии.

2. Материалы и методы.

2.1. Характеристика обследованных групп.

2.2. Выделение ДНК из периферической крови человека.

2.3. Полимеразная цепная реакция и рестрикционный анализ.

2.4. Анализ функциональной активности тромбоцитов.

2.5. Анализ количества исследуемых рецепторов на мембране тромбоцитов.

2.6. Измерение уровня экспрессии генов, кодирующих тромбоцитарные рецепторы.

2.7. Эксперименты in vitro по ингибированию тромбоцитарной агрегации селективными блокаторами GP lib-Ilia и аспирином.

2.8. Определение нуклеотидной последовательности исследованных генов для поиска новых SNP.

2.9. Статистическая обработка результатов исследования.

3. Результаты исследования и их обсуждение.

3.1. Анализ генетических вариантов тромбоцитарных рецепторов, ассоциированных с развитием сердечно-сосудистых заболеваний.

3.1.1. Значение генетических вариантов рецепторов тромбоцитов в развитии инфаркта миокарда у мужчин в возрасте до 45 лет.

3.1.2. Значение генетических вариантов рецепторов тромбоцитов в развитии инфаркта миокарда у пациентов обоего пола в возрасте старше 45 лет.

3.1.3. Значение генетических вариантов рецепторов тромбоцитов в развитии ИБС и ОКС у пациентов обоего пола в возрасте старше 45 лет.

3.2. Анализ молекулярно-генетических механизмов высокой функциональной активности тромбоцитов.

3.2.1. Влияние качественных (мутации) и количественных характеристик тромбоцитарных рецепторов (уровень экспрессии генов и количество зрелых рецепторов на поверхности клеток) на спонтанную агрегацию тромбоцитов.

3.2.2. Влияние качественных (мутации) и количественных характеристик тромбоцитарных рецепторов (уровень экспрессии генов и количество зрелых рецепторов на поверхности клеток) на индуцированную агрегацию тромбоцитов.^

3.3. Новый метод оценки функционального состояния тромбоцитов на основе проточной цитометрии.д-,

3.3.1. Методика определения активности тромбоцитов с использованием проточной цитометрии в сравнении с традиционным фотометрическим методом.

3.3.2. Применение лабораторного метода определения активности тромбоцитов с использованием проточной цитометрии в оценке эффективности антиагрегантной терапии.

3.3.3. Влияние молекулярно-генетических факторов тромбоцитарной активности на результаты цитометрического анализа.

3.4. Влияние молекулярно-генетических факторов на индивидуальную чувствительность к антиагрегантным препаратам.

3.4.1. Влияние генетических факторов, экспрессии генов и количества тромбоцитарных рецепторов на чувствительность к селективным блокаторам GP Ilb-IIIa.

3.4.2. Влияние генетических факторов, экспрессии генов и количества тромбоцитарных рецепторов на чувствительность к аспирину.

3.4.3. Влияние генетических факторов, экспрессии генов и количества тромбоцитарных рецепторов на чувствительность к клопидогрелу.

3.5. Алгоритм лабораторного молекулярно-генетического исследования для оценки функционального состояния тромбоцитов у больных с ССЗ и определения индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетические механизмы активации тромбоцитов и чувствительности к антиагрегантным препаратам"

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) справедливо называют эпидемией XXI века. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в 2005 году от ССЗ умерло 17,5 миллионов человек в мире, что составило 30% всех случаев смерти. К 2015 году около 20 миллионов человек могут уйти из жизни от ССЗ, главным образом, от болезней сердца и инсульта, которые, по прогнозам, останутся единственными основными причинами смерти. Наблюдается устойчивая тенденция к "омоложению" сердечно-сосудистой смертности. Следует отметить, что у лиц молодого возраста развитие артериальных тромбозов обусловлено, в первую очередь, нарушениями тромбоцитарного гемостаза (Trip M.D. et al, 1990; Koenig W., 1998; Руксин B.B., 1998; Ardissino D. et al, 1999; Folsom A.R., 2001). Важным фактором сохранения нормальной работы сердечно-сосудистой системы является своевременное предупреждение острых кардиологических состояний путем раннего и достоверного определения возможных рисков патологических изменений миокарда. В этой связи изучение молекулярных механизмов активации тромбоцитов, несомненно, является актуальным, и имеет большое практическое значение.

Несмотря на то, что теоретически процесс тромбоцитарной агрегации можно блокировать на различных уровнях, на практике широкое применение нашли аспирин, блокаторы гликопротеи новых Ilb-IIIa рецепторов абциксимаб, эптифибатид, монафрам) и клопидогрел (Бокарев И.Н. и др.,

2008; Phillips D.R. et al, 2005; Capodanno D., 2010). Но при назначении антиагрегантных препаратов врач и пациент могут столкнуться с индивидуальной чувствительностью к лекарству, причиной которой будут служить, в том числе, и генетические факторы. Учитывая распространенность сердечно-сосудистых заболеваний и медико-социальную значимость их терапии и вторичной профилактики, вопросы индивидуальной чувствительности к антитромботическим препаратам встают на первое место 7 в числе фармакогенетических исследований. В настоящее время объяснить вариабельность ответа тромбоцитов на индукцию агонистами и ингибирование селективными блокаторами известными генетическими вариантами тромбоцитарных рецепторов невозможно. Актуальным является и поиск лабораторных критериев оценки эффективности действия антиагрегантных препаратов. Само определение аспирин- или клопидогрел-резистентности, а также индивидуальной чувствительности к блокаторам GP Ilb-IIIa рецепторов подразумевает использование адекватных лабораторных тестов для анализа функциональной активности тромбоцитов (Cattaneo М., 2007; Gurbel Р.А., Tantry U.S., 2007; Oestreich J.H. et al, 2009). В связи с этим встает вопрос о развитии современных технологий оценки действия антиагрегантных препаратов. Последние рекомендации Американской ассоциации грудных врачей (АССР 2008) не предусматривают лабораторный мониторинг антиагрегантной терапии (Hirsh J. et al, 2008), тем не менее, использование различных методов анализа функциональной активности тромбоцитов для этой цели широко обсуждается. Мониторинг эффективности антиагрегантной терапии необходим для своевременного выявления пациентов, резистентных к аспирину или клопидогрелу, но отсутствие достаточной доказательной базы и оптимального лабораторного метода не позволило включить данный пункт в рекомендации. Все известные на данный момент функциональные тесты имеют свои положительные стороны и недостатки. При этом необходимо четкое определение пределов нормальных значений и терапевтических интервалов для каждого из лабораторных методов оценки тромбоцитарной активности и эффективности антиагрегантной терапии (Paniccia R. et al, 2007; van Werkum J.W. et al, 2008; Oestreich J., Smyth S., Campbell C., 2009; Vila P.M., Urooj Zafar M., Badimon J.J., 2009; Combescure C. et al, 2010). Однако стандартизированного параметра, по которому можно было бы однозначно судить о гиперактивности тромбоцитов и степени ее изменения на фоне антиагрегантных препаратов в настоящее время не существует. 8

Исследователи в своих работах либо ограничиваются анализом агрегации тромбоцитов in vitro при действии агонистов и ингибиторов различными методами, либо анализируют клинические исходы у пациентов, принимающих антиагреганты (Sharma R.K. et al, 2009; Mansour К. et al, 2009). Очевидно, что такого узкого подхода недостаточно. Для определения маркера «высокой реактивности тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии», который может в конечном итоге прогнозировать клинические исходы у пациентов (Hayward С.Р.М., 2009), необходимо проведение комплексных генетических, фармакогенетических и функциональных исследований, в том числе с использованием современных молекулярных технологий, что и было предпринято в данной работе.

Цель исследования Целью данной работы явилось определение молекулярно-генетических механизмов активации тромбоцитов, установление значения этих механизмов в развитии сердечно-сосудистых заболеваний и чувствительности к антиагрегантным препаратам.

Задачи исследования:

1. Определить роль генетических вариантов тромбоцитарных рецепторов в активации тромбоцитов и патогенезе ССЗ.

Научная новизна полученных результатов

В настоящей работе впервые проведена комплексная оценка активности тромбоцитов у пациентов с ССЗ и здоровых доноров на основании функциональных и молекулярно-генетических методов исследования, включая генотипирование с помощью полимеразной цепной реакции, анализ уровня экспрессии генов тромбоцитарных рецепторов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, определение количества ключевых тромбоцитарных рецепторов на мембране тромбоцитов на проточном цитометре, определение активности тромбоцитов одновременно 3-мя методами - индуцированная агрегация, спонтанная агрегация и проточная цитометрия.

Впервые у больных с ССЗ проведен одновременный анализ генетических вариантов шести ключевых тромбоцитарных рецепторов — GP Ilb-IIIa, GP Iba, GP Ia-IIa, GP VI, P2Y12 и P2Y1, выявлены генетические факторы риска развития ССЗ в разных поло-возрастных группах. Впервые в российской популяции идентифицированы генетические варианты Leu40Arg GP Ша, С18Т P2Y12, G36T P2Y12 и С-154Т GP VI, и охарактеризовано их влияние на функциональную активность тромбоцитов и риск развития ССЗ. Впервые измерен уровень экспрессии генов GP Ша, GP lib, GP VI, P2Y12, P2Y1 и Р2Х1 в тромбоцитах здоровых доноров и больных с ССЗ. Показано влияние количественных характеристик рецепторов GP IIb-Ша, P2Y12, P2Y1 и Р2Х1 на функциональную активность тромбоцитов.

Разработан оригинальный метод оценки функциональной активности тромбоцитов и эффективности антиагрегантной терапии на основе проточной цитометрии и сформулирован алгоритм лабораторного молекулярногенетического исследования для оценки функционального состояния

10 тромбоцитов у больных с ССЗ и определения индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам клопидогрелу и аспирину.

Практическая значимость работы В работе определены молекулярно-генетические факторы риска развития ССЗ и высокой функциональной активности тромбоцитов, которые позволяют формировать группы повышенного риска и проводить в этих группах патогенетически обоснованную профилактику. Выявлены молекулярно-генетические факторы, определяющие индивидуальную чувствительность к аспирину и клопидогрелу. Их учет позволит персонализировать антиагрегантную терапию у больных с ССЗ.

Разработан новый метод оценки функциональной активности тромбоцитов и эффективности антиагрегантной терапии на основе проточной цитометрии с использованием специфичных флуоресцентно-меченых антител. Сопоставление традиционных лабораторных методов оценки функциональной активности тромбоцитов и нового метода на основе, проточной цитометрии показало эффективность последнего в клинической практике для определения функциональной активности тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии. В результате проведенной работы показана необходимость комплексного лабораторного подхода к оценке тромбоцитарной активности с использованием функциональных и молекулярно-генетических исследований.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Генетические варианты тромбоцитарных рецепторов Leu33Pro GP Ша, G36T P2Y12, С807Т GP la и Т13254С GP VI вносят существенный вклад в формирование повышенной тромбоцитарной активности и увеличивают риск развития ССЗ.

2. Количество рецепторов GP Ilb-IIIa и АДФ-рецепторов P2Y12 и P2Y1 на поверхности тромбоцитов и уровень экспрессии генов GP IIb, GP Illa, P2Y12 и P2Y1 влияют на функциональную активность тромбоцитов.

3. Метод проточной цитометрии может быть использован для оценки функциональной активности тромбоцитов и эффективности антиагрегантной терапии. В качестве показателей тромбоцитарной активности предложены расчетные параметры K¡ и К2, которые характеризуют относительные изменения количества GP Ilb-IIIa и Р-селектина на поверхности клетки в ходе индуцированной активации.

4. Генетические варианты Leu33Pro GP Illa, С18Т P2Y12, G6986A CYP3A5 и Т13254С GP VI, A-842G СОХ-I модулируют индивидуальную чувствительность к антиагрегантной терапии клопидогрелом и аспирином, соответственно.

Апробация работы

Основные теоретические и практические положения диссертации представлены в докладах на конгрессе ассоциации кардиологов стран СНГ

Фундаментальные исследования и прогресс в кардиологии" (18-20 сентября

2003 г., Санкт-Петербург), Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики» (25-27 ноября 2003 г., Москва), на конференциях «Фундаментальные науки медицине» (2003 г., 2008 г., 2009 г., Москва), на 8-ой, 9-ой и 10-ой

Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых

Биология-наука XXI века» (17-21 мая 2004 г., 19-24 апреля 2005 г. и 17-21 апреля 2006 г., г. Пущино), на 18th, 20th и 21st International Congress on

Thrombosis (June 20-24, 2004, Slovenia, Ljubljana,; June 25-28, 2008, Athens,

Greece; July 6-9, 2010, Milan, Italy), семинарах политехнического симпозиума

Молодые ученые - промышленности Северо-Западного региона» (2004 г.,

2007 г., Санкт-Петербург), на II и IV Всероссийских научных конференциях с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (2-4 февраля 2005 г. и 4-6 февраля 2009 г.,

Москва), на Одиннадцатом Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (23-26 октября 2005 г., Москва), па V и VI съездах Российского общества медицинских генетиков (24-27 мая 2005 г., Уфа; 15-18 мая 2010 г.,

Ростов-на Дону), на XX, XXIst и XXIIst Congress of the International Society on

Thrombosis and Haemostasis (August 6-12, 2005, Sydney, Australia; July 6-12,

2007, Geneva, Switzerland; July 11-16, 2009, Boston, US), Международном конгрессе «Гипертензия - от Короткова до наших дней» (15-17 сентября 2005 г., Санкт-Петербург), на 3-х конференциях Eurepean Human Genetics

Conference (May 6-9, 2006, Amsterdam, The Nederlands; June 16-19, 2007, Nice,

France; May 31-June 3, 2008, Barselona, Spain), на 5-и Российских национальных конгрессах кардиологов (12-14 октября 2004 г., г. Томск, 18-20 октября 2005 г., 10-12 октября 2006 г., 7-9 октября 2008г. и 5-7 октября 2009 г., г. Москва), научно-практической конференции молодых ученых

Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (2007 г., Санкт-Петербург), Всероссийской конференции с международным участие

Тромбозы в клинической практике: факторы риска, диагностика, терапия»

5-7 июня 2007 г., Санкт-Петербург, Россия), на 52nd GTIT Congress (20-23

February 2008, Wiesbaden), научно-практической конференции

Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения

России до 2020 года» (28-30 сентября 2009 г., Москва), на XXI и XXIII

International Symposium on Technological Innovations in Laboratory Hematology

April 28 - May 1, 2008, Sydney, Australia; 10-12 May, 2010, Brighton, UK), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (21-28 июня 2009 г., Москва), Всероссийской конференции с международным участием

Тромбозы, кровоточивость, ДВС-сиидром: современные подходы к диагностике и лечению» (26-28 ноября 2009, Москва), на Nottingham Platelet Conference «Platelets - Past, Present and Future» (15-16 July 2010, Nottingham, UK), First European Joint Congress of EFCC and UEMS «Laboratory Medicine in Health Care» (13-16 October 2010, Lisbon, Portugal) и I Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (17-19 ноября 2010 г., Москва).

Результаты диссертационного исследования внедрены в практику лечебной и учебной работы ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия имени И.И.Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П.Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Публикации

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 217 страницах машинописного текста, содержит 36 таблиц, иллюстрирована 51 рисунком и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 259 научных источников (30 - на русском языке и 229 - на иностранном).

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Сироткина, Ольга Васильевна

ВЫВОДЫ:

1. Выявлены следующие генетические факторы повышенного риска развития ССЗ: ЬеиЗЗРго GP Illa, Thrl45Met GP Iba, C807T GP 1а и G36T P2Y12 у мужчин в возрасте до 45 лет и Т13254С GP VI, ЬеиЗЗРго GP Illa и G36T P2Y12 у пациентов обоего пола в возрасте старше 45 лет. Генетический вариант С18Т P2Y12 оказался протективным в отношении развития инфаркта миокарда у мужчин моложе 45 лет.

2. Генетические варианты рецепторов GP Ilb-IIIa, P2Y12, GP VI и GP Ia-IIa определяют повышенную функциональную активность тромбоцитов у пациентов с ССЗ и доноров без тромбоэмболических и сердечнососудистых заболеваний в анамнезе.

3. Количественные характеристики тромбоцитарных рецепторов GP Ilb-IIIa, P2Y12 и P2Y1, такие как число рецепторов на поверхности клетки и уровень экспрессии соответствующих генов, коррелируют с показателями функциональной активности тромбоцитов и могут влиять на индивидуальную чувствительность к антиагрегантным препаратам — селективным блокаторам GP Ilb-IIIa рецепторов, аспирину и ингибиторам АДФ-рецепторов, соответственно.

4. Количество рецепторов GP Ilb-IIIa на мембране тромбоцитов в большей степени определяет индивидуальную чувствительность к селективным блокаторам GP Ilb-IIIa, тогда как мутация ЬеиЗЗРго GP Ша может иметь j значение при терапии препаратами антительной природы.

5. Генетические варианты ЬеиЗЗРго GP Illa, С18Т P2Y12 и G6986A CYP3A5 модулируют индивидуальную чувствительность к антиагрегантной терапии клопидогрелом, в то время как генетические варианты Т13254С GP VI и A-842G СОХ-1 влияют на индивидуальную чувствительность к аспирину.

6. Разработанный новый метод на основе проточной цитометрии с использованием специфичных флуоресцентно-меченых антител позволяет оценивать функциональную активность тромбоцитов и эффективность антиагрегантной терапии клопидогрелом и аспирином. В качестве показателей активности тромбоцитов предложены расчетные параметры Ki и К2, которые характеризуют относительные изменения количества GP Ilb-IIIa и Р-селектина на поверхности клетки в ходе активации.

Практические рекомендации:

1. Для выявления генетических факторов высокого риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и гиперагреации тромбоцитов показано тестирование следующих полиморфизмов — Leu33Pro GP 111а, G36T P2Y12, С807Т GP 1а и Thrl45Met GP Iba у мужчин в возрасте до 45 лет, и Leu33Pro GP 111а, G36T P2Y12 и Т13254С GP VI у лиц обоего пола старше 45 лет.

ЮмкМ АДФ. При значении #/<10 % и К2<5 0% действие антиагрегантного препарата оценивается как эффективное, значения

Kj> 10% и К2> 50% считаются маркерами высокой реактивности

185 тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии или неэффективности действия антиагрегантного препарата.

3. В основе алгоритма обследования пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями, которым показан прием антиагрегантных препаратов, должен лежать комплексный подход, учитывающий генетические варианты G6986A CYP3A5 - цитохрома Р-450, метаболизирующего клопидогрел, С18Т P2Y12 - АДФ-рецепторов P2Y12, являющихся «мишенью» для препарата, а также те генетические факторы, которые определяют гиперагрегацию тромбоцитов, и в первую очередь - ЬеиЗЗРго GP Ша. Для определения индивидуальной чувствительности к аспирину необходимо проводить генотипирование Т13254С GP VI и A-842G СОХ-1.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Сироткина, Ольга Васильевна, Санкт-Петербург

1. Берковский А. Л., Васильев С.А. 2007. Пособие по изучению адгезивно-агрегационной функции тромбоцитов. М.: НПО «РЕНАМ»

2. Бокарев H.H. и соавт. Противотромбоцитарная терапия в клинической практике. Методические рекомендации. // Под общей редакцией проф. И.Н. Бокарева. М.: РКИ Соверо пресс, 2008. - 32с.

3. Вызова Т.В., Власик Т.Н., Мазуров A.B. Ингибирование тромбоцитарной агрегации моноклональными антителами к гликопротеиновому комплексу Ilb/IIIa // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 1994. — Т.118. - С.402-405.

4. Вавилова Т.В. Гемостазиология в клинической практике (пособие для врачей). СПб.: Издательство СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, 2005. - 92с.

5. Вавилова Т.В. Тромбоэмболические осложнения и лабораторные исследования системы гемостаза. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. — 64 с.

6. Вейр Б. Анализ генетических данных: Пер. с англ. М.: Мир, 1995. -400 е., ил.

7. Воронина E.H., Филиппенко М.Л., Сергеевичев Д.С., Пикалов И.В. Мембранные рецепторы тромбоцитов: функции и полиморфизм // Вестник ВОГиС. 2006. - Т.10. - С.553-564.

8. Габбасов З.А., Попов Е.Г., Гаврилов И.Ю., Позин Е.Я., Маркосян P.A. Новый высокочувствительный метод анализа агрегации тромбоцитов // Лабораторное дело. 1989. - Т. 10. - С. 15-18.

9. Кукес В.Г. Метаболизм лекарственных средств: клинико-фармакологические аспекты.-М.: Издательство «Реафарм», 2004.-144с.

10. Мазуров A.B. Мембранные гликопротеиды в реакциях адгезии и агрегации тромбоцитов. Автореф. На соискание ученой степ, д.м.н. Москва. 1998.-48 с.

11. Мазуров A.B., Певзнер Д.В., Власик Т.Н., Руда М.Я. Антитромбоцитарный эффект антагониста гликопротеина Ilb-IIIa Монафрама // Российский физиологический журнал. 2004. - Т.90. - С.586-599.

12. Маниатис Т. и др. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж.-М.: Мир, 1084.-480 е., ил.

13. Мешков А.Н., Стамбольский Д.В., Никитина JI.A., Абдуллаев С.М., Бочков В.Н., Ткачук В.А., Кухарчук В.В., Малышев П.П. Генетические факторы риска развития ишемической болезни сердца // Кардиология. 2005.- Т.45. С.10-14.

14. Моисеев C.B. Перспективы антитромбоцитарной терапии // Клиническая фармакология и терапия. — 2003. Т. 12. - №4. - С. 1-4.

15. Момот А.П. Патология гемостаза. Принципы и алгоритмы клинико-лабораторной диагностики. СПб.: ФормаТ, 2006. — 208 с.

16. Патрушев Л.И. Генетические механизмы наследственных нарушений гемостаза // Биохимия. 2002. - Т.67. - № 1. - С.40-55.

17. Руксин В.В. Тромбозы в кардиологической практике. СПб.: Невский Диалект, М.: Бином, 1998.- 126 с.

18. Сайт Всемирной Организации Здравоохранения: http://vAvw.who.int

19. Сироткина О.В. Молекулярно-генетические основы развития предрасположенности к артериальным тромбозам. Автореф. на соискание ученой степ, к.б.н. Санкт-Петербург. 2003. -22 с.

20. Сулимов В.А. Антитромботическая терапия при чрескожных. коронарных вмешательствах // Рациональная фармакотерапия в кардиологии. -2008. -Т.З. -С.91-100.

21. Сычев Д.А., Раменская Г.В., Игнатьев И.В., Кукес В.Г. Клиническая фармакогенетика: Учебное пособие / Под ред. В.Г. Кукеса, Н.П. Бочкова. -М: ГЭОТАР-Медиа, 2007. 248 с: ил.

22. Шейдина A.M., Сироткина О.В., Пчелина С.Н., Вавилова Т.В., Папаян К.А., Папаян Л.П., Шварц Е.И. Генетические факторы риска развития венозных тромбозов в молодом возрасте // Вопросы современной педиатрии.- 2005. Т.4. - №2. - С.42-46.

23. Шитикова A.C. Изменение формы тромбоцитов как показатель ихвнутрисосудистой активации. В сб. Клинико-лабораторная диагностикапредтромбоза и тромботических состояний.- СПб,1991.-С.38-52.189

24. Шитикова А.С. Тромбоцитарный гемостаз. СПб: Издательство СПб ГМУ, 2000. - 227с.

25. Шиффман Ф.Дж. Патофизиология крови. Пер. с англ. М. - СПб. "Издательство Бином" - "Невский диалект", 2000. - 448с., ил.

26. Afshar-Kharghan V., Li C. Q., Khoshnevis-Asl M., Lopez J. A. Kozak sequence polymorphism of the glycoprotein (GP) lb-alpha gene is a major determinant of the plasma membrane levels of the platelet GP Ib-IX-V complex // Blood. 1999.-V.94.-P.186-191.

27. Antithrombotic Trialists' Collaboration. Collaborative meta-analysis of randomized trials of antiplatelet therapyfor prevention of death, myocardial infarction, and stroke in high risk patients // B.M.J. 2002. - V.324. - P.71-86.

28. Bagamery K., Kvell K., Barnet M., Landau R., Graham J. Are platelet activated after a rapid, one-step density gradient centrifugation? Evidence from flow cytometric analysis // Clin. Lab. Haem. 2005. - V.27. - P.75-77.

29. Barragan P., Paganelli F., Camoin-Jau L., Bourguet N., Boulay-Moine D., Moulard M., Bonello L. Validation of a novel ELISA-based VASP whole blood assay to measure P2Y12-ADP receptor activity // Thromb. Haemost. 2010. -V.104.-№2.-P.410-411.

30. Barrero A.E. Platelet reactivity tests: why they are usful and which ones to use. E-Journal of the ESC Council for Cardiology Practice. 2010. - V. 18. -№18. -P.1-5.

31. Barsky A.A., Arora R.R. Clopidogrel resistance: myth or reality? J. Cardiovasc. Pharmacol. Therapeut. -2006. V.l 1. -№1. -P.47-53.

32. Beer J.H., Pedevina S., Pontiggia L. Genetics of platelt receptor singl-nucleotide polymorphisms: clinical implications in thrombosis // Ann. Med. -2000. V.32. - Suppl. 1. - P. 10-15.

33. Bennett JS, Catella-Lawson F, Rut AR, Vilaire G, Qi W, Kapoor SC,

34. Murphy S, FitzGerald GA. Effect of the P1A2 alloantigen on the function of ß3integrins in platelets // Blood. 2001. - V.97. - P.3093-3099.192

35. Berndt M.C., Du X., Booth W.J. Ristocetin-dependent reconstitution of binding of von Willebrand factor to purified human platelet membrane glycoprotein Ib-IX complex // Biochemistry. 1988. - V.27. - №2. - P.633-640.

36. Best D., Senis Y., Jarvis G.E., Eagleton H.J., Roberts D.J., Saito T., Jung S.M., Moroi M., Harrison P., Green F.R., Watson S.P. GPVI levels in platelets: relationship to platelet function at high shear // Blood. 2003. - V.102. - P.2811-2818.

37. Bhatt D., Topol E. Current role of platelet glycoprotein Ilb/IIIa inhibitors in acute coronary syndromes // JAMA. 2000. - V.284. - P. 1549-1558.

38. Bojesen S.E., Tybing-Hansen A., Nordestgaard B.G. Integrin (33 Leu33Pro homozygosity and risk of cancer // J. Natl. Cancer. Inst. 2003. - V.95. - P.l 1501157.

39. Born G. V. R. Quantitative investigations into aggregation of blood platelets //J. Physiol. 1962.-V. 162.-P.67-68.

40. Born G.V.R. Aggregation of platelet by adenosine diphosphate and its reversal //Nature. 1964. - V. 194. - P.927-929.

41. Bray P.F. Inherited diseases of platelet glycoproteins: considerations for rapid molecular characterization // Thromb. Haemost. 1994. - V.72. - P.492-502.

42. Breddin H.K., Lippold R., Bittner M., Kirchmaier C.M., Krzywanek H.J.,

43. Carter A.M., Catto A.J., Bamfor J.M., Grant P.J. Association of the platelet glycoprotein lib HPA-3 polymorphism with survival after acute ischemic stroke // Stroke. 1999. - V.30. - P.2606-2611.

44. Cattaneo M. New P2Y12 blockers // J. Thromb. Haemost. 2009. - V.7. -Suppl. - P.262-265.

45. Cattaneo M. Resistance to antiplatelet drugs: molecular mechanisms and laboratory detection // J. Thromb. Haemost. 2007. - V.5. - Suppl. 1. - P.230-237.

46. Cattaneo M., Zighetti M., Lombardi R. et al. Molecular bases of defective signal transduction in the platelet P2Y12 receptor of a patient with congenital bleeding // PNAS. 2003. - V.100. - №4. - P. 1978-1983.

47. Clemetson K.J. Platelet receptors and their role in diseases // Clin. Chem. Lab. Med. 2003. - V.41. - P.253-260.

48. Clifford E.E., Parker K., Humphreys B., Kertesy S.B., Dubyak G.R. The P2X1 receptor, an adenosine triphosphate-gated cation channel, is expressed in human platelets but not in human blood leukocytes // Blood. 1998. - V.91. -P.3172-3181.

49. Collet J.-P. Variable antiplatelet response to thyenopiridines: should we use lab tests? Yes. // Pathofysiology of Haemostasis and Thrombosis. 2009-2010. -V.37. - Suppl. 1. - P.P34.

50. COMMIT Collaborative Group. Addition of clopidogrel to aspirin in 45,852 patients with acute myocardial infarction: randomized placebo-controlled trial // Lance. 2005. - V.366. - P. 1607-1621.

51. Croft S., Samani N., Teare M.D., Hampton K.K., Steeds R.P., Channer K.S., Daly M.E. Novel platelet membrane glycoprotein VI dimorphism is a risk factorfor myocardial infarction // Circulation. 2001. - V.104. - P. 1459-1463.196

52. Czermak C., Lehofer M., Wagner E., Prietl B., Lemonis L., Rohrhofer A., Schanenstein K., Liebmann P. Reduced dopamine D4 receptor mRNA expression in lymphocytes of long-term abstinent alcohol and heroin addicts // Addiction. — 2004. V.99. — V.251-257.

53. Dai K., Wang Y., Yan R., Shi Q., Wang Z., Yuan Y., Cheng H., Li S., Fan Y., Zhuang F. Effect of microgravity and hypergravity on platelet functions // Thromb. Haemost. 2009. - V. 101. - №5. - P.902-910.

54. Daniel J.L., Dangelmaier C., Jin J., Ashby B., Smith J.B., Kunapuli S.P. Molecular basis for ADP-indused platelet activation // The Journal of Biological Chemistry. 1998. - V.273. - №4. - P.2024-2029.

55. Di Castelnuovo A., de Gaetano G., Benedetta Donati M., Iacoviello L. Platelet glycopropein Ilb/IIIa polymorphism and coronary artery disease: implications for clinical practice // Am. J. Pharmacogenomics. — 2005. V.5. -№2. - P.93-99.

56. Dorsam R. T., Kunapuli. S. P. Central role of the P2Y12 receptor in platelet activation // J. Clin. Invest. 2004. - V.l 13. - P.340-345.

57. Dropinski J., Musial J., Sanak M., Wegrzyn W., Nizankowski R., Szczeklik A. Antitrombotic effect of aspirin based on P1A1/A2 glycoprotein Ilia polymorphism in patients with coronary artery disease // Thromb. Res. 2007. -V.l 19. -P.301-303.

58. Enjeti A.K., Lincz L.F., Seldon M. Detection and measurement of microparticles: an evolving research tool for vascular biology // Semin. Thromb. Hemost. 2007. - V.33. - №8. - P.771-779.

59. Evans W.E., McLeod H.L. Pharmacogenomics — drug disposition, drug targets, and side effects // N. Engl. J. Med. 2003. - V.348. - №6. - P.538-549.

60. Feher G, Feher A, Pusch G, Lupkovics G, Szapary L, Papp E. The genetics of antiplatelet drug resistance // Clin. Genet. 2009. - V.75. - №1. - P. 1-18.

61. Ferguson A., Dokainish H., Lakkis N. Aspirin and clopidogrel response variability // Tex. Heart. Inst. J. 2008. - V.35. - №3. - P.313-320.

62. Fitzgerald D.J., Maree A. Aspirin and clopidogrel resistance // Hematology. Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2007. - 114-120.

63. Folsom A.R. Hemostatic risk factors for atherothrombotic disease: an epidemiologic view // Thromb. Haemost. 2001. - V.86. - P.366-373.

64. Fontana P., Dupont A., Gandrille S., Gaussem P. Adenosine diphophate-induced platelet aggregation is associated with P2Y12, gene sequence variations in healthy subjects // Circulation. 2003. - V.108. - P.989-995.

65. Fontana P., Gaussen P., Aiach M., Fiessinger J.N., Emmerich J., Reny J.L. P2Y12 H2 Haplotype is associated with peripheral arterial disease // Circulation. -2003. V.108. - P.2971-2973.

66. Fontana P., Remones V., Reny J.L., Aiach M., Gaussem P. P2Y1 gene polymorphism and ADP-induced platelet response // J. Thromb. Haemost. 2005.- V.3. -№10. P.2349-2350.

67. Fontana P., Reny J.L. Pharmacogenetics and antiplatelet drugs // Rev. Med. Interne. 2005. - V.26. - №9. - P.725-732.

68. Frelinger A.L., Li Y., Linden M.D., Tarnow I., Barnard M.R., Fox M.L., Michelson A.D. Aspirin 'resistance': role of pre-existent platelet reactivity and correlation between tests // J. Thromb. Haemost. 2008. - V.6. - №12. - P.2035-2044.

69. Frey UH, Aral N, Muller N, Siffert W. Cooperative effect of GNB3 825C>T and GPIIIa P1(A) polymorphisms in enhanced platelet aggregation // Thromb. Res.- 2003. V. 109. - P.279-286.

70. Furie B., Furie B.C. Thrombus formation in vivo // J. Clin. Invest. 2005. -V.l 15. — P.3355-3362.

71. Furihata K., Clemetson K.J., Deguchi H., Kunicki T.J. Variation in human platelet glycoprotein VI content modulates glycoprotein Vl-specific prothrombinase activity // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. — 2001. V.21. -P.1857-1863.

72. Furihata K., Nugent D., Kunicki TJ. Influence of platelet collagen receptor polymorphisms on risk for arterial thrombosis // Arch. Pathol. Lab. Med. — 2002. — V.126. P.305-309.

73. Fusegawa Y., Goto S., Handa S., Kawada T., Ando Y. Platelet spontaneous aggregation in platelet-rich plasma is increased in habitual smokers // Thromb. Res. 1999. - V.93. - №6. - P.271-278.

74. Gachet C. P2 receptors, platelet function and pharmacological implications // Thromb. Haemost. 2008. - V.99. - P.466-472.

75. Gachet C., Hechler B. The platelet P2 receptors in thrombosis // Seminars in Thrombosis and Haemostasis. 2005. - V.31. -№2. - P. 162-167.

76. Gawaz M., Langer H., May A.E. Platelets in inflammation and atherogenesis // J. Clin. Invest. 2005. - V. 115. - P.3378-3384.

77. Geiger J., Teichmann L., Grossmann R., Aktas B., Steigerwald U., Walter U., Schinzel R. Monitoring of Clopidogrel Action: Comparison of Methods // Clinical Chemistry. 2005. - V.51. - №6. - P.957-965.

78. Geisler T., Grass D., Bigalke B., Stellos K., Drosch T., Dietz K., Herdeg C., Gawaz M. The residual platelet aggregation after deployment of intracoronary stent (PREDICT) score // J. Thromb. Haemost. 2007. - V.6. - P.54-61.

79. Gibbins J., Okuma M., Farndale R., Barness M., Watson S.P. Glycoprotein VI is the collagen receptor in platelets which underlies tyrosine phosphorylation of the Fc receptor gamma-chain //FEBS Lett. 1997. - V.413. -№2. -P.255-259.

80. Gibbins J.M. Platelet adhesion signalling and the regulation of thrombusformation // Journal of Cell Science. 2004. - V.l 17. - P.3415-3425.200

81. González-Conejero R., Lozano M.L., Rivera J., Corral J., Iniesta J.A., Moraleda J.M., Vicente V. Polymorphisms of platelet membrane glycoprotein Iba associated with arterial thrombotic disease // Blood. — 1998. — V.92. P.2771-2776.

82. Goodman T., Ferro A., Sharma P. Pharmacogenetics of aspirin resistance: a comprehensive systematic review // Br. J. Clin. Pharmacol. — 2008. — V.66. №2. - P.222-232.

83. Griffin HM, Ouwehand WH. A human monoclonal antibody specific for the Leucine-33(P1A1, HPA-la) form of platelet glycoprotein Ilia from a V gene phage display library // Blood. 1995. - V.86. - P.4430-4436.

84. Gurbel P., Bliden K., Hiatt B., O'Connor C. Clopidogrel for coronarystenting: response variability, drag resistance, and the effect of pretreatmentplatelet reactivity // Circulation. 2003. - V. 107. - P.2908-2913.201

85. Gurbel P.A., Tantry U.S. Clopidogrel resistance? // Thromb. Research. -2007. V.120. - P.311-321.

86. Hankey G.J., Eikelboom J.W. Aspirin resistance // BMJ. 2004. - V.328. -P.477-479.

87. Hashemzadeh M., Furukawa M., Goldsberry S., Movahed M.R. Chemical structures and mode of action of intravenous glycoprotein Ilb/IIIa receptor blockers: A review // Exp. Clin. Cardiol. 2008. - V.13. - №4. - P. 192-197.

88. Hay ward C.P.M. Advances in understanding "high on-treatment platelet reactivity" // Thromb. Haemost. 2009. - V.102. - P.799-800.

89. Hechler B., Zhang Y., Eckly A., Cazenave J-P., Gachet C., Ravid K. Lineage-specific overexpression of the P2Y1 receptor induces platelet hyperreactivity in transgenic mice // J. Thromb. Haemost. 2003. — V.l. — P. 155-163.

90. Hirsh J., Guyatt G., Albers G.W., Harrington R., Schunemann H.J. Executive Summary American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines (8th Edition) // Chest. 2008. - V.133. - P.71s-105s.

91. Hollopeter G., Jantzen H.-M, Vincent D, Li G., England L., Ramakrishnan V., Yang R.B., Nurden P., Nurden A., Julius D., Conley P.B. Identification of the platelet ADP receptor targeted by antithrombotic drugs // Nature. 2001. — V.409. - P.202-207.

92. ISLH 2008. Coagulation/Haemostasis Workshop: Back to basics, platelet function and then back to the future. Sydney, 2008. - c.50.

93. Ivandic B., Schlick P., Staritz P., Kurz K., Katus H.A., Giannitsis E. Determination of clopidogrel resistance by whole blood platelet aggregometry andinhibitors of the P2Y12 receptors // Clinical Chemistry. 2006. - V.52. - №3. i1. P.383-388.

94. Jacquelin B., Rozenshteyn D., Kanaji S., Koziol J.A., Nurden A.T., Kunicki T.J. Characterization of Inherited Differences in Transcription of the Human Integrin a2 Gene // Journal of Biological Chemictry. 2001. - V.276. - P.23518-23524.

95. Jacquelin B., Tarantino M.D., Kritzik M., Rozenshteyn D., Koziol J.A., Nurden A.T., Kunicki T.J. Allele-dependent transcriptional regulation of the human integrin 2 gene // Blood. -2001.- V.97. P. 1721 -1726.

96. Jaremo P., Lindahl T., Fransson S., Richter A. Individual variations of platelet inhibition after loading doses of clopidogrel // J. Intern. Med. 2002. -V.252. - P.233-238.

97. Joutsi-Korhonen L., Smethurst P.A., Rankin A., Gray E., IJsseldijk M.,

98. Onley C.M., Watkins N.A., Williamson L.M., Goodall A.H., de Groot P.G.,

99. Farndale R.W., Ouwehand W.H. The low-frequency allele of the platelet collagen203signaling receptor glycoprotein VI is associated with reduced functional responses and expression // Blood. 2003. - V.101. - P.4372-43 79.

100. Judge H.M., Buckland R.J., Sugidachi A., Jakubowski J.A., Storey R.F. Relationship between degree of P2Y12 receptor blockade and inhibition of P2Y12-mediated platelet function // Thromb. Haemost. 2010. - V. 103. - №6. - P. 12101217.

101. Kalow W. Pharmacogenetics in biological perspective // Pharmacol. Rev. — 1997. V.49. - P.369-379.

102. Kaski S., Kekomaki R., Partanen J. Systemic screening for genetic polymorphism in human platelet glycoprotein lb-alpha // Immunogenetics. 1996. - V.44. - P.170-176.

103. Kauffenstein G., Bergmeier W., Eckly A. The P2Y12 receptor induces platelet aggregation through weak activation of the anbfb integrin a phosphoinositide 3-kinase-dependent mechanism // FEBS Letters. - 2001. -V.505.-P.281-290.

104. Koenig W. Haemostatic risk factors for cardiovascular diseases // Eur. Heart. J. 1998. - V.19. - Suppl.C. - P.C39-C43.

105. Kunicki T., Orchekowski R., Annis D., Honda Y. Variability of integrin alpha 2 beta 1 activity on human platelets // Blood. 1993. - V.82. - P.2693-2703.

106. Kunicki TJ, Newman PJ. The molecular immunology of human platelet proteins // Blood. 1992. - V.80. - P. 1386-1404.

107. Kuwahara M., Sugimoto M., Tsuji S., Matsui H., Mizuno T., Miyata S., Yoshioka A. Platelet shape changes and adhesion under high shear flow // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2002. - V.22. - P.329-334.

108. Lasne D, Krenn M, Pingault V, Arnaud E, Fiessinger JN, Aiach M, Rendu F. Interdonor variability of platelet response to thrombin receptor activation: influence of P1A2 polymorphism // Br. J. Haematol. 1997. - V.99. - P.801-807.

109. Leon C., Alex M., Klocke A., Morgenstern E., Moosbauer C., Eckly A., Spannagl M., Gachet C., Engelmann B. Platelet ADP receptors contribute to the initiation of intravascular coagulation // Blood. 2004. - V.103. - №2. - P.594-600.

110. Lev E., Patel R., Guthikonda S., Lopez D., Bray P.F., Kleiman N.S. Genetic polymorphisms of the platelet receptors P2Y(12), P2Y(1) and GP Ilia and response to aspirin and clopidogrel // Thromb. Res. 2007. - V.l 19. - №3. - P.355-360.

111. Lopez J.A., Andrews R.K., Afshar-Kharghan V., Berndt M.C. Bernard-Soulier syndrome // Blood. 1998. - V.91. - P.4397-4418.

112. Lordkipanidze M., Pharand C., Schampaert E., Turgeonl J., Palisaitis D.A.,

113. Diodati J. G. A comparison of six major platelet function tests to determine the205prevalence of aspirin resistance in patients with stable coronary artery disease // European Heart Journal. 2007. - V.28. - P. 1702-1708.

114. Lova P., Paganini S., Sinigaglia F., Balduini C., Torti M. A Gj-dependent pathway is required for activation of the small GTPase Rap IB in human platelets // J. Biol. Chemistry. 2002. - V.277. - №14. -P.12009-12015.

115. Lyman S., Aster R.H., Visentin G.P., Newman P.J. Polymorphism of human platelet membrane glycoprotein lib associated with the Baka/Bakb alloantigen system // Blood. 1990. - 75. - P.2343-2348.

116. Maiklejohn D.J., Urbaniak S.J., Greaves M. Platelet glycoprotein Ilia polymorphism HPAlb (P1A2): no association with fibrinogen binding // Br. J. Haematol. 1999. - V.105. -P.664-666.

117. Mansour K., Taher A.T., Musallam K.M., Alam S. Aspirin Resistance // Advances in Hematology. — 2009. P. 1-10.

118. Maree A.O., Curtin R.J., Chubb A., Dolan C., Cox D., O'Brien J., Crean P., Shields D.C., Fitzgerald D.J. Cyclooxygenase-1 haplotype modulates platelet response to aspirin // J. Thromb. Haemost. 2005. - V.3. - №10. - P.2340-2345.

119. McKee S.A., Sane D.C., Deliargyris G.N. Aspirin resistance in cardiovascular disease: a review of prevalence, mechanisms, and clinical significance // Thromb. Haemost. 2002. - V.88. - P.711-715.

120. Meadows T.A., Bhatt D.L. Clinical aspects of platelet inhibitors and thrombus formation // Circ. Res. 2007. - V.l 00. - P. 1261-1275.

121. Merlini P. New antiplatelet agents: why they are badly needed by the cardiologist // Pathofysiology of Haemostasis and Thrombosis. 2009-2010. -V.37. — Suppl.l. -P.P17.

122. Michelson A. P2Y12 antagonism: promises and challenges // Artherioscler. Thromb. Vase. Biol. 2008. - V.28. - P.s33-s38.

123. Michelson A.D. Flow cytometry: a clinical test of platelet function // Blood.- 1996. V.87. -№12. -P.4925-4936.

124. Michelson A.D. Platelet function testing in cardiovascular diseases // Circulation. 2004. - V. 110. - P.e489-e493.

125. Mikkelsson J., Perola M., Laippala P., Pettila A., Karhunen PJ. Glycoprotein Ilia PI (A1/A2) polymorphism and sudden cardiac death // Am. Coll. Cardiol. 2000. - V.36. - P.1317-1323.

126. Mikkelsson J., Perola M., Pettila A., Karhunen PJ. Platelet glycoprotein Iba HPA-2 Met/VNTR B haplotype as a genetic predictor of miocardial infarction and sudden cardiac death // Circulation. 2001. - V.104. - P.876-880.

127. Moffat K.A., Ledford-Kraemer M.R., Nichols W.L., Hayward C.P.M. Variability in clinical laboratory practice in testing for disorders of platelet function // Thromb. Haemost. 2005. - V.93. - P.549-553.

128. Murugappan S., Kunapuli S. The role of ADP receptors in platelet function // Frontiers in Bioscience. 2006. - V. 11. - P. 1977-1986.

129. Muszbek L., Bereczky Z., Kovacs E., Katona E., Balogh L., Homorodi N., Edes I. Aspirin resistance: myth or reality? // Pathofysiology of Haemostasis and Thrombosis. 2009-2010. - V.37. - Suppl. 1. - P.P98.

130. Negrier C., Grenier C., Attali O., Dechavanne M., Vinciguerra C. Identification of new and known polymorphisms in glycoprotein lib and Ilia genes by denaturing gradient gel electrophoresis // Platelets. 1998. - V.9. - №6.1. P.374-380.

131. Neiswandt B., Schulte V., Zywietz A., Gratacap M.P., Offermanns S. Costimulation of Gj-and G^/G^-mediated signaling pathways induces integrin otnbfo activation in platelets // J. Biol. Chem. 2002. - V.277. - №42. - P.39493-39496.

132. Nieswandt B., Watson S. Platelet-collagen interaction: is GPVI the central receptor? // Blood. 2003. - V.102. - P.449-461.

133. Nicholas R. Identification of the P2Y12 receptor: a novel member of the P2Y family of receptors activated by extracellular nucleotides // Molecular Pharmacology. 2001. - V.60. - №3. - P.416-420.

134. Nurden A.T. Polymorphisms of platelet receptors as risk factors in coronary thrombosis // European Heart Journal. 1996. - V.17. - P.1293-1294.

135. Nurden A.T., Nurden P. Inherited defects of platelet function // Rev. Clin. Exp. Hematol. 2001. - V.5. - №4. - P.314-334.

136. O'Brien D.K., Heywood J.B., Heady J.A. The quantitation of platelet aggregation induced by four compounds: A study relation to myocardial infarction // Thromb. Haemorrh. 1966. - V.16. - P.725-767.

137. Oestreich J.H., Smyth S., Campbell Ch. Platelet function analysis: at the edge of meaning // Thromb. Haemost. 2009. - V. 101. - №2. - P.217-219.

138. Okano K., Naitou A., Yamamoto M., Araki M., Mimura Y., Ichihara K., Yamada O. Development of an improved assay system for activated platelet counts and evaluation by aspirin monitoring // Transl. Res. 2010. - V. 155. - №2. -P.89-96.

139. Oury C., Toth-Zsamboki E., Thys C., Tytgat J., Vermylen J., Hoylaerts M. The ATP-gated P2X1 ion channel acts as a positive regulator of platelet responses to collagen // Thromb. Haemost. 2001. - V.86. - P. 1264-1271.

140. Oury C., Toth-Zsamboki E., Vermylen J., Hoylaerts M. P2X(l)-mediated activation of extracellular signal-regulated kinase 2 contributes to platelet secretion and aggregation induced by collagen // Blood. 2002. - V.100. - №7. - P.2499-2505.

141. Pampuch A., Cerletti C., de Gaetano G. Comparison of VASP-phosphorylation assay to light-transmission aggregometry in assessing inhibition of the platelet ADP P2Y12 receptor // Thromb. Haemost. 2006. - V.96. - №6. -P.767-773.

142. Park S., Park H., Park C„ Ko Y.G., Im E.K., Jo I., Shin C., Lee J.B., Shim

143. W.H., Cho S.Y., Jang Y. Association of the gene polymorphisms of plateletglycoprotein la and Ilb/IIIa with myocardial infarction and extent of coronary210artery disease in the Korean Population // Yonsei. Med. J. 2004. - V.45. - P.428-434.

144. Patrono C., Coller B., Dalen J.E., Fitzgerald G.A., Fuster V., Gent M., Hirsh J., Roth G. Platelet-active drugs : the relationships among dose, effectiveness, and side effects // Chest. 2001. - V.199. - Suppl. - P.39S-63S.

145. Patrono C., Rocca B. Aspirin, 110 years later // J. Thromb. Haemost. 2009. -V.7.-Suppl.-P.258-261.

146. Pettinella C., Romano M., Stuppia L., Santilli F., Liani R., Davi G. Cyclooxygenase-1 haplotype C50T/A-842G does not affect platelet response to aspirin // Thromb. Haemost. 2009. - V. 101. - №4. - P.687-690.

147. Phillips D.R., Charo I.F., Parise L.V., Fitzgerald L.A. The Platelet membrane glycoprotein Ilb-IIIa complex // Blood. 1988. - V.71. - №4. - P.831-843.

148. Phillips D.R., Conley P.B., Sinha U., Andre P. Therapeutic approaches in arterial thrombosis // Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2005. - V.3. -P.1577-1589.

149. Phillips D.R., Nannizzi-Alaimo L., Srinivasa Prasad K.S. p3 tyrosine phosphorylation in allb(33 (platelet membrane GP Ilb-IIIa) outside-in integrin signaling // Thromb. Haemost. 2001. - V.86. - P.246-258.

150. Prabhakaran S., Wells K.R., Lee V.H., Flaherty C.A., Lopes D.K. Prevalence and risk factors for aspirin and clopidogrel resistance in cerebrovascular stenting // Am. J. Neuroradiol. 2008. - V.29. - P.281-285.

151. Reiner A., Kumar P., Schwartz S., Longstreth W. T., Pearce R., Rosendaal F., Psaty B., Siscovick D. Genetic variants of platelet glycoprotein receptors and risk of stroke in young women // Stroke. 2000. - V.31. - P. 1628-1633.

152. Rocca B., Patrono C. Determinants of the interindividual variability in response to antiplatelet drugs // J. Thromb. Haemost. 2005. - V.3. - P. 15971602.

153. Rocca B., Petrucci G. Variable antiplatelet response to thyenopiridines: should we use lab tests? No // Pathofysiology of Haemostasis and Thrombosis. -2009-2010. V.37. - Suppl.l. - P.P35.

154. Rozalsky M, Watala C. Antagonists of platelet fibrinogen receptor are less effective in carriers of P1A2 polymorphism of beta3 integrin // Eur. J. Pharmacol. -2002.-V.454.-P.1-8.

155. Santoso S., Kunicki T.J., Kroll H., Haberbosch W., Gardemann A. Association of the platelet glycoprotein la C807T gene polymorphism with nonfatal myocardial infarction in younger patients // Blood. 1999. - V.93. -P.2449-2453.

156. Savi P., Heilmann E., Nurden P. Clopidogrel: an antitrombotic drug acting on the ADP-dependent activation pathway of human platelets // Clin. Appl. Thromb. Haemost. 1996. - V.2. - P.35-42.

157. Scarborough R.M., Kleiman N.S., Phillips D.R. Concerning their pharmacology and clinical use? Platelet glycoprotein Ilb/IIIa antagonists: what are the relevant issues // Circulation. 1999. - V.100. - P.437-444.

158. Schafer A.I. Genetic and acquired determinants of individual variability of response to antiplatelet drugs // Circulation. 2003. - V.108. - P.910-911.

159. Shantsila E., Lip G.Y.H. The role of monocytes in thrombotic disorders // Thromb. Haemost. 2009. - V. 102. - P.916-924.

160. Sharma R.K., Reddy H.K., Singh V.N., Sharma R., Voelker D.J., Bhatt G. Aspirin and clopidogrel hyporesponsiveness and nonresponsiveness in patients with coronary artery stenting // Vascular Health and Risk Management. 2009. -V.5. - P.965-972.

161. Smith S., Judge H., Peters G., Armstrong M., Fontana P., Gaussem P., Daly M., Storey R. Common sequence variations in the P2Y12 and CYP3A5 genes donot explain the inhibitory effects of clopidogrel therapy // Platelets. 2006. - V.17. — P.250-258.

162. Staritz P., Kurz K., Stoll M., Giannitsis E., katus H.A., Ivandic B.T. Platelet reactivity and clopidogrel resistance are associated with the H2 haplotype of the P2Y(12)-ADP receptor gene // Int. J. Cardiol. 2009. - V. 133. - №3. - P.341-345.

163. Steinhubl S., Berger P., Mann J. et al. Early and sustained dual oral antiplatelet therapy following percutaneous coronary intervention. A randomized controlled trial // JAMA. 2002. - V.288. - P.2411-2420.

164. Szczeklik A., Musial J., Undas A., Sanak M. Aspirin resistence // Journal of Thrombosis and Haemostasis. -2005. V.3. - P. 1655-1662.

165. Thornton M.A., Poncz M., Korostishevsky M., Yakobson E., Usher S., Seligsohn U., Peretz H. The human platelet lib gene is not closely linked to its integrin partner 3 // Blood. 1999. - V.94. - P.2039-2047.

166. Trip M.D., Cats M., van Cappelle F.J., Vreeken J. Platelet hyperreactivity and prognosis in survivors of myocardial infarction // N. Engl. J. Med. 1990. -V.322. - №22. - P. 1549-1554.

167. Turner N., Moake J., Mclntire L. Blockade of adenosine diphosphate receptors P2Y12 and P2Y1 is required to inhibit platelet aggregation in whole blood under flow // Blood. 2001. - V.98. - № 12. - P.3340-3344.

168. Undas A., Sanak M., Musial J., Szczeklik A. Platalet glicoprotein Ilia polymorphism, aspirin and thrombin generation // Lancet. — 1999. — V.353. — P.982-983.

169. Varon D., Spectre G. Antiplatelet agents. // Hematology. Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2009. - P.267-272.

170. Vial C., Pitt S., Roberts J. Rolf M.G., Mahaut-Smith M.P., Evans R.J. Lack of evidence for functional ADP-activated human P2X1 receptors supports a role for ATP during hemostasis and thrombosis // Blood. 2003. - V.102. - P.3646-3651.

171. Vijayan K.V., Goldschmidt-Clermont P.J., Roos C., Bray P.F. The P1A2 polymorphism of integrin p3 enhances outside-in signaling and adhesive functions // J. Clin. Invest. 2000. - V. 105. - P.793-802.

172. Vila P.M., Urooj Zafar M., Badimon J.J. Platelet reactivity and nonresponse to dual antiplatelet therapy: a review // Platelets. 2009. - V.20. - №8. - P.531-538.

173. Wang L., Ostberg O., Wihlborg A.-K., Brogren H., Jern S., Erlinge D.

174. Quantification of ADP and ATP receptor expression in human platelets // J.

175. Thromb. Haemost. 2003. - V. 1. - P.330-336.215

176. Weiss E.J., Goldschmidt-Clermont P.J., Grigoryev D., Jin Y., Kickler T., Bray P.F. A monoclonal antibody (SZ21) specific for platelet GP Ilia distinguishes P1A1 from P1A2 // Tissue Antigens. 1995. - V.46. - P.374-381.

177. Werkum van J.W., Harmsze A.M., Elsenberg E.H.A.M., Bouman H.J., ten Berg J.M., Hackeng C.M. The use of the Verify/Vow system to monitor antiplatelet therapy: A review of the current evidence // Platelets. 2008. - V.19. - №7. -P.479-488.

178. Wheeler G.L., Braden G.A., Bray P.F., Marciniak S.J., Mascelli M.A., Sane D.C. Reduced inhibition by abciximab in platelets with the P1A2 polymorphism // Am. Heart. J. 2002. - V.143. -№1. - P.76-82.

179. Willerson J.T., Cable G., Yeh E.T.H. PROCLAIM. Pilot study to examine the effects of clopidogrel on inflammatory markers in patients with metabolic syndrome receiving low-dose aspirin // Tex. Heart. Inst. J. 2009. - V.36. — №6. — P.530-539.

180. Wright J.H. The origin and nature of blood plates // Boston. Med. Surg. -1906. -V. 154. -P.643-645.

181. Zurn C.S., Geisler T., Gawas M. ADP-receptor blockade: a case for personalized pharmacotherapy? // Thromb. Haemost. 2010. - V.103. - P.496

182. Zutter M.M., Santoro S.A. Widespread histologic distribution of the alpha 2 beta 1 integrin cell-surface collagen receptor // Am. J. Pathol. 1990. - V.137.506.1. P.l 13-120.

Информация о работе

Сироткина, Ольга Васильевна
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2011
ВАК 03.02.07

Диссертация

Молекулярно-генетические механизмы активации тромбоцитов и чувствительности к антиагрегантным препаратам - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы