Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы спонтанного свертывания плазмы крови у пациентов с различными патологиями

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы спонтанного свертывания плазмы крови у пациентов с различными патологиями"

На правах рукописи

Липец Елена Николаевна

Механизмы спонтанного свертывания плазмы крови у пациентов с различными патологиями

03.01.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2013

005541353

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Гематологический научный центр» » Министерства здравоохранения Российской

Федерации

и в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» Российской академии наук

Научный руководитель: доктор физико-математических наук,

Пантелеев Михаил Александрович

Официальные оппоненты: Каминский Юрий Георгиевич,

доктор биологических наук, заведущий лабораторией Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Твердислов Всеволод Александрович, доктор физико-математических наук, заведующий кафедрой биофизики МГУ им. Ломоносова

Ведущая организация: ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр

детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Минздрава России

Защита диссертации состоится «17» декабря 2013 гола в //часов на заседании Диссертационного совета Д.002.252.01 при ФГБУ «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» РАН по адресу ул.Саморы Машела. д. 1. г.Москва, ГСП-7

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» РАН.

Автореферат разослан « /3 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Николаева Ирина Сергеевна

процента от физиологических концентраций предшественников.

3. Факторы Va и Vila при добавлении в плазму здоровых добровольцев незначительно влияют на скорость роста сгустка и вызывают равномерное свертывание плазмы.

4. На группе пациентов с различными болезнями показано, что большинство случаев возникновения СС не связано с присутствием в плазме крови пациентов циркулирующего тканевого фактора. ТФ вносил вклад в образование СС лишь в 4 из 23 образцов плазм со СС.

5. Основным источником спонтанного свертывания являются циркулирующие в крови микровезикулы. Они способны не только ускорять реакции свертывания, но и самостоятельно активировать спонтанное свертывание плазмы крови по контактному пути. Это подтвержается тем, что спонтанные сгустки пропадают при осаждении микровезикул и в плазме большинства пациентов со спонтанными сгустками количество микровезикул повышено.

Апробация работы. Работа прошла апробации: 1 ноября 2013 года на заседании межлабораторного семинара Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.

Результаты диссертационной работы были представлены: Gordon Research Conference on Heraostasis (Waterville Valley, NH, USA, 22-27.07 2012), "54th ASH 2012 Annual Meeting and Exposition" (Atlanta, GA, USA, 8-11.12 2012), IV Съезд биофизиков России, симпозиум III «Физика - медицине и экологии» (Нижний Новгород, Россия, 2225.08.2012), Конгресс гематологов России (Москва, Россия, 2-4.07.2012), V-ой Конференция по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (Москва, Россия, 3-5.02.2011)

Публикации. По материалы диссертационной работы опубликовано 6 научных работ. Статей в рецензируемых журналах - 1; публикаций в трудах конференций и съездов-5.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на_страницах

машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 - обзора литературы, главы 2 - описания материалов и методов, главы 3 - описание экспериментальных результатов, главы 4 - обсуждения результатов), выводов и

библиографического указателя, включающего_источников. Работа выполнена на

базе ФГБУ Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН в лаборатории молекулярных механизмов гемостаза (зав. лабораторией д.ф.-м.н. Пантелеев М.А.).

5 мин 20 мин 35 мин 50 мин

1 - плазма

2 - сгусток

3 - иммобилизованный тканевый фактор

4 - термостат, Т=37°С

5 - световой диод, А=625нм

6 - CCD камера

Нормальный донор

Диффузная В-крупноклеточн ая лимфома

тромбофилия

лимфогрануле матоз

Р 1 ш

.................

Щ I I

i

■ Í > 1 1

tgp-стационарная скорость

Ь 1000 2-

10 20 30 40 50

Время, мин

i

£ MOO

Время, мин

Рис1. А. Принципиальная схема установки. В. снимки растущего сгустка в нормальной плазме и в плазме пациентов. Активирующая поверхность расположена по нижнему краю снимка, светлая полоса на ней - растущий сгусток, светлые области, возникающие вдали от активатора -спонтанные сгустки. С. Определение скорости роста сгустка и времени начала спонтанного свертывания (То i). Стационарная скорость роста сгустка определяется как тангенс угла наклона линейной аппроксимации зависимости размера сгустка от времени в интервале от 10 до 40 мин после начала свертывания. Время начала спонтанного свертывания определялось как время достижения средней интенсивностью светорассеяния свободного объема плазмы 10% от максимума либо время свертывания 5% свободного объема плазмы (исключались стенки кюветы и пространство занятое сгустком от активатора).

Приготовление VHai

Метод инактивации Vila был взят из статьи [Arnljots В et al. J Vase Surg 1997] e изменениями. Ингибитор ТФ готовился из Vila (препарат Novo Seven, Novo Nordisk, Дания) блокированием активного сайта. Vila инкубировался с РРАСК в течении 60 мин при 4°С в соотношении 1:2. Полученный VIlai очищался от РРАСК диализом с перемешиванием против буфера Tris 6 ч при комнатной температуре. Конечная концентрация VIlai измерялась на спектрофотометре по поглощению на 280 нм.

Приготовление везикул.

5 мин 25 мин 45 мин

обедненная везикулами +0.57MPL

20 мин 35 мин 50 мин 65 мин

свободная от тромбоцитов плазма

свободная от тромбоцитов плазма + 150 рМ Xla

обедненная везикулами + 150 рМ Xla

обедненная везикулами +0.57М PL

обедненная везикулами +0.57М PL+150рМ Xla

Рис. 5 Характерные картины зарастания после центрифугирования и восполнения фосфолипидных везикул в плазме пациентов в случае, когда спонтанные сгустки восстанавливались(А) (п=5) и не восстанавливались (В) (п=17), в плазме нормального донора с добавленным ПХа (С) (п=4). Спонтанные сгустки в плазме с добавленым фХ1а при центрифугировании и восполнении восстанавливаются аналогично образцам с ф!Ха (п=3).

Активация контактного пути везикулами. В литературе есть данные, что активированные тромбоциты и микровезикулы могут активировать плазму по контактному пути [Van Der Meijden et al J Thromb Haemost 2012, Back J et al Biochem Biophys Res Commun 2010, Muller F et al 2009]. Мы хотели проверить, могут ли циркулирующие в плазме везикулы приводить к спонтанному свертыванию в тесте

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Липец, Елена Николаевна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение ЦЕНТР ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ ФАРМАКОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201450524

ЛИПЕЦ Елена Николаевна

Механизмы спонтанного свертывания плазмы крови у пациентов с различными патологиями

03.01.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор М. А. Пантелеев

Москва 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................9

1.1. Система свертывания крови. Введение.............................................................9

1.2. Плазменное свертывание крови....................................................................10

1.3. Система фибринолиза................................................................................15

1.4. Нарушения гемостаза.................................................................................16

1.5. Роль микровезикул в нарушениях гемостаза.....................................................18

1.6 Роль тканевого фактора, циркулирующих активных факторов в нарушениях гемостаза.....................................................................................................21

1.7. Лабораторные методы исследования плазменного свертывания...........................24

1.8. Постановка задачи....................................................................................27

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.................................................................29

2.1 Материалы...............................................................................................29

2.2 Доноры крови...........................................................................................29

2.3 Приготовление плазмы................................................................................29

2.4 Тромбодинамика.......................................................................................30

2.5 Тест генерации тромбина.............................................................................32

2.6 Приготовление У1Ы...................................................................................33

2.7 Приготовление искусственных везикул...........................................................33

2.8 Проточная цитометрия................................................................................34

2.9 Динамическое рассеяние света......................................................................34

2.10 Измерение активности факторов контактного пути..........................................36

2.11 Статистический анализ..............................................................................36

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.................................................................................37

Характеризация феномена, контрольные опыты.....................................................37

3.1 Частота возникновения спонтанных сгустков при различных патологиях.................36

3.2 Воспроизводимость спонтанных сгустков........................................................37

Проверка, не является ли изучаемый феномен артефактом.метода..............................38

3.3. Подтверждение значимости феномена спонтанных сгустков независимым методом. 38

3.4. Роль различных активных факторов в образовании спонтанных сгустков...............39

3.5. Роль прокоагулянтных зимогенов в образовании спонтанных сгустков...................45

3.6. Роль микровезикул в образовании СС.............................................................45

3.7. Прокоагулянтные свойства МВ из плазмы здоровых доноров..............................50

3.8. Активация контактного пути везикулами........................................................51

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..........................................................54

ВЫВОДЫ.....................................................................................................57

СПИСИК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................58

ПРИЛОЖЕНИЕ.............................................................................................67

Список сокращений

ФНО - фактор некроза опухоли

ИЛ1 -интерлейкин 1

СС - спонтанные сгустки

ТД - Тромбодинамика

ТФ - тканевый фактор

ФЛ - фосфолипиды

IIa - тромбин

C1INH - С1 ингибитор

TFPI - ингибитор пути тканевого фактора

PC - протеин С

EPCR - эндотелиальный рецептор к протеину С

ТМ - тромбомодулин

ИБС - ишемическая болезнь сердца

AMC - амино-метил-кумарин

S7 - Z-Gly-Gly-Arg-AMC*HCI

РРАСК - D-Phe-Pro-Arg- chloromethyl ketone

PFP - platelet free plasma, свободная от тромбоцитов плазма

MB - микровезикулы

ДВС - диссеминированное внутрисосудистое свертывание РAI - ингибитор активации плазминогена

Введение

Система свертывания крови — каскад ферментативных реакций в плазме крови, который обеспечивает остановку кровотечения при повреждении кровеносной системы. В то же время чрезмерная активация этой системы вследствие различных патологий может приводить к образованию тромбов там, где они не нужны, и вызывать нарушение кровоснабжения тканей. В процессе свертывания выделяют три звена: сосудистое, тромбоцитарное и плазменное. Сужение сосудов, вазоконстрикция, уменьшает ток крови через поврежденный участок или пережимает разрыв, если повреждение маленькое. Тромбоциты при активации агрегируют, образуя рыхлый сгусток, не пропускающий клетки крови. Каскад ферментативных реакций белков плазмы приводит к образованию плотного фибринового геля, не пропускающего плазму. Все звенья свёртывания тесно взаимодействуют.

В настоящий момент не существует, универсального метода, позволяющего оценить состояние всей системы свертывания в целом. Рассматривают отдельно тромбоцитарный, отдельно плазменный гемостаз в гомогенной системе без потока крови и сосудистой стенки. Результаты анализов недостаточно хорошо отражают клиническое состояние пациентов. Известно, что при различных патологиях в плазме пациентов может появляться прокоагулянтный материал: активные факторы свертывания; прокоагулянтные везикулы, выпущенные опухолевыми клетками, клетками крови, эндотелием; ТФ, основной физиологический активатор свертывания, может появляться на эндотелии и моноцитах под действием липополисахаридов, ФНО, ИЛ1, повышенной концентрацией С-реактивного белка. Только в нескольких работах сопоставляли наличие активирующего материала и риск тромботических осложнений, большинстве случаев функциональная значимость перечисленных факторов не ясна. Определить ее

с помощью гомогенных тестов на свертывание крови сложно из-за добавления сильного внешнего активатора и перемешивания с ним.

Более близким к физиологии анализом, плазменного свертывания является метод Тромбодинамики (ТД). В этом методе регистрируется рост сгустка в свободной от тромбоцитов плазме от поверхности с нанесенным тканевым фактором. Если в плазме пациента присутствуют факторы, способные запустить свертывание, метод позволяет увидеть в объеме плазмы образование центров спонтанного свертывания.

Цель работы: выяснение механизмов формирования спонтанных сгустков (СС) в плазме крови пациентов с различными заболеваниями.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать воспроизводимость и стабильность СС, оценить частоту их встречаемости при различных патологиях.

2. Определить роль различных путей активации плазменного свертывания в образовании СС: контактной активации, пути тканевого фактора (ТФ), циркулирующих активных факторов.

3. Выяснить, почему спонтанное свертывание происходит неоднородно по всему объему, запускается от отдельных центров.

Научная новизна. Обнаружен новый феномен спонтанного свертывания в свободной от тромбоцитов плазме пациентов с различными патологиями. Показано, что присутствие в плазме крови пациентов циркулирующего тканевого фактора лишь в малой доле случаев является причиной спонтанного свертывания. Среди активных факторов, имеющих значительное время жизни в плазме, причиной спонтанного свертывания могут быть факторы 1Ха и Х1а.

Показано, что циркулирующие микровезикулы, выделенные из плазмы пациентов и даже здоровых доноров способны не только ускорять реакции свертывания, но и самостоятельно активировать спонтанное

свертывание плазмы крови по контактному пути. Эта реакция показана как в плазме, так и в системе с очищенными факторами контактного пути. Значимость этой реакции для процесса свертывания подтверждается в тесте Тромбодинамики.

Научно-практическое значение. Преобладание феномена спонтанных сгустков у пациентов говорит о его возможной диагностической значимости. Проведение предложенных в работе дополнительных тестов для выяснения природы спонтанного свертывания может помочь в дальнейшем для выбора адекватной терапии. Данные о влиянии микровезикул на плазменное свертывание вносит вклад в понимание регуляции гемостаза.

Положения, выносимые на защиту:

1. У пациентов с острой лейкемией, инфарктом миокарда, гемолитической анемией наблюдается гиперкоагуляцонное состояние, при котором обнаружено явление спонтанного свертывания плазмы крови in vitro. При этом в плазме больного через 10-50 минут появляются активные центры спонтанного свертывания, из которых начинают расти фибриновые сгустки. Светорассеяние и скорость роста этих сгустков похожи на соответсвующие характеристики сгустка, растущего от поверхности, покрытой таневым фактором.

2. Исследовано, является ли молекулярной причиной этого явления повышение в плазме пациентов уровня активных факторов Va, Vila, IXa и XIa. Показано, что причиной спонтанного свертывания могут быть только факторы IXa и XIa. Эти факторы вызывают свертывание от отдельных центров, подобно плазме пациентов при добавлении в плазму здоровых доноров в концентрациях, составляющих десятые доли процента от физиологических концентраций предшественников.

3. Факторы Va и Vila, при добавлении в плазму здоровых добровольцев незначительно влияют на скорость роста сгустка и вызывают равномерное свертывание плазмы.

4. На группе пациентов с различными, болезнями показано, что большинство случаев возникновения СС не связано с присутствием в плазме крови пациентов циркулирующего тканевого фактора. ТФ вносил вклад в образование СС лишь в 4 из 23 образцов плазм со СС.

5. Основным источником спонтанного свертывания являются циркулирующие в крови микровезикулы. Они способны не только ускорять реакции свертывания, но и самостоятельно активировать спонтанное свертывание плазмы крови по контактному пути. Это подтвержается тем, что спонтанные сгустки пропадают при осаждении микровезикул и в плазме большинства пациентов со спонтанными сгустками количество микровезикул повышено.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Система свертывания крови. Введение.

Система свертывания крови защищает организм от кровотечения. В

ней выделяют сосудисто-тромбоцитарное и плазменное звено [1]. Первым

срабатывает сосудисто-тромбоцитарное. Происходит вазоконстрикция,

сужение сосуда, оно может быть настолько полным, что поток крови через

небольшой сосуд прекратится полностью [2]. Вазоконстрикция происходит

за счет сокращения мышц оболочки сосуда в результате получения сигнала

от нервов и под действием серотонина и тромбоксана А2, секретируемых

активированными тромбоцитами. За 1-3 мин. повреждение закрывается

рыхлой пробкой из тромбоцитов, не пропускающей клетки крови, но

проницаемой для небольших молекул. Ключевую роль в первоначальной

адгезии тромбоцитов играет прикрепление к месту повреждения через

фактор фон Виллебранда (ффВ). Он связывается с одной стороны с

обнажившемся коллагеном на месте травмы, с другой - с гликопротеином 1Ь

на поверхности тромбоцита. Первичными активаторами тромбоцитов, по-

видимому, являются коллаген, открывшийся из-под эндотелия, и АДФ,

выделенный при разрушении клеток. АДФ является сравнительно слабым

активатором и даже не может вызвать все виды секреции тромбоцита. Тем не

менее, АДФ обеспечивает активацию тромбоцитов в потоке, их адгезию к

коллагену и агрегацию. Это приводит к формированию первичного

тромбоцитарного тромба. Коллаген, а затем и тромбин, который

вырабатывается плазменной системой свертывания, полностью активируют

тромбоциты. Те, в свою очередь, секретируют АДФ и тромбоксан А2,

вовлекая в процесс активации все новые тромбоциты. Кроме того, коллаген и

тромбин вызывают изменения в клеточной мембране, приводящие к

связыванию факторов и ускорению реакций свертывания [3]. За время

порядка десяти минут плазменное звено приводит к образованию плотного

сгустка из полимера фибрина. Оно может активироваться либо по

внутреннему пути, при контакте с чужеродной поверхностью, либо по

9

внешнему пути тканевым фактором (ТФ) при повреждении стенки сосуда. Далее следует каскад протеолитических реакций, оканчивающийся образованием фибрина, который, полимеризуясь, закрывает повреждение. Процесс ускоряется положительными обратными связями. В данной работе изучается именно плазменная часть свертывания. Ниже она будет рассмотрена более подробно.

1.2 Плазменное звено свертывания крови

Каскад реакций свертывания состоит из сериновых протеаз. Эти трипсин-подобные белки способны активировать друг друга путем специфического расщепления в определенных местах. В результате активации, неактивные факторы приобретают ферментативную активность. Основные реакции плазменного звена свертывания представлены на рис.1. Основным физиологическим активатором свертывания является ТФ. Он находится на поверхности всех клеток, кроме клеток эндотелия и функционирует в качестве рецептора/кофактора. При контакте с плазмой он, объединяясь в комплекс с фактором Vila, расщепляет .фактор X, переводя его в активное состояние Ха. Комплекс фактора Vila и тканевого фактора называется комплексом внешней теназы. Таким образом, с помощью ТФ организм распознает место повреждения. Фактор Ха в свою очередь превращает протромбин (II) в тромбин (Па). Напрямую эта реакция идет очень медленно, но в присутствии кофактора Va и фосфолипидной поверхности реакция ускоряется на 5 порядков. В качестве источников фосфолипидной поверхности в организме могут выступать тромбоциты, микровезикулы, липопротеины. Комплекс факторов Va, Ха на фосфолипидной поверхности называют протромбиназой. Тромбин превращает фибриноген в фибрин, который, полимеризуясь создает гель. Эта реакция представляет итог работы системы свертывания - образование сгустка. Но для роста, остановки и регуляции характеристик сгустка существуют еще ряд реакций.

С тромбина начинаются положительные и отрицательные обратные связи. Тромбин активирует кофакторы Va и Villa, входящие в состав комплексов внутренней теназы (IXa, Villa, фосфолипидная поверхность,

2~ь 2+

Са ) и протромбиназы (Ха, Va, фосфолипидная поверхность, Са ), которые увеличивают скорость расщепления своих субстратов на 3-5 порядков [4-6]. Кроме того поскольку прокоагулянтная фосфолипидная поверхность оказывается вблизи от места повреждения, ускорение реакции на поверхности способствует локализации тромба.

Связь факторов с фосфолипидами осуществляется через Са2+ «мостики». Чтобы связывать

CaZT проферманты II, VII, IX, X, XI, а также протеины С и S проходят посттрансляционную модификацию, в которой витамин К-зависимая карбоксилаза превращает остатки глутаминовой кислоты исходно входящей в состав факторов в у-карбоксиглутаминовую.

Другим субстратом для тромбина является фактор XI, реакция идет довольно медленно, оказывает заметное влияние только на больших временах на распространение сгустка в пространстве [7]. Отрицательная обратная связь, идущая от тромбина, заключается в активировации PC. аРС расщепляет Va и Villa, обрывая положительные обратные связи, что приводит к остановке роста сгустка.

Еще одна положительная обратная связь начинается с фактора Ха. Фактор Vila, способный активировать факторы IX и X, составляет в плазме всего лишь 1% от неактивного фактор VII. Этот зимоген может активироваться многими ферментами, но основными считаются фактор Ха и тромбин.

Все активные ферменты системы инактивируются присутствующими

в плазме ингибиторами протеаз, основными из которых являются

антитромбин III (AT-III) и ингибитор пути тканевого фактора (TFPI). AT-III

— главный ингибитор тромбина, Ха, IXa, XIa. TFPI ингибирует внешнюю

теназу по сложному Ха-зависимому механизму [8]. Кроме AT-III и TFPI, в

ингибировании факторов свертывания в разной степени участвуют а2-

11

макроглобулин, ои-антитрипсин, а2-антиплазмин, кофактор гепарина II, ингибитор протеина С, С1-ингибитор и другие [8-10].

Дополнительную положительную обратную связь дает взаимодействие плазменного и тромбоцитарного звеньев свертывания: тромбин активирует тромбоцты, а те в ответ предоставляют прокоагулянтную фосфолипидную поверхность для образования ферментативных комплексов, секретируют в кровь гранулы.

652}

УНа) фермент [ уа | кофактор Г ингибирование

VII ) эимоген [V] прокофактор -»-(УНа) активация

Рис.1 (Пантелеев и др. 2010) [11]. Основные реакции плазменной системы свертывания крови. Ферментативный катализ и превращения под его действием показаны красными и черными стрелками, соответственно. Ингибирование показано короткими пустыми стрелками. Условные обозначения: ТР - тканевой фактор, римскими цифрами обозначены соответствующие факторы свертывания, РС - протеин С, Fg - фибриноген, Рп - фибрин. Два находящихся рядом обозначения факторов свертывания - комплекс, образованный этими факторами (например, ХаУа).

В норме, тромбоциты поддерживают неравновес