Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дестабилизация мембран эритроцитов при свертывании крови IN VITRO и ее влияние на специфичность ферментной диагностики острого инфаркта миокарда

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Дестабилизация мембран эритроцитов при свертывании крови IN VITRO и ее влияние на специфичность ферментной диагностики острого инфаркта миокарда"

Г I и V "

- 3 ИЮП 1995

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

На правах рукописи УДК 576.8.094.7:611-018.51:616-07:616.127-005.8

БЕЗРУКОВА Галина Александровна

ДЕСТАБИЛИЗАЦИЯ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ СВЕРТЫВАНИИ КРОВИ IN VITRO И ЕЕ ВЛИЯНИЕ НА СПЕЦИФИЧНОСТЬ ФЕРМЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ ОСТРОГО ИНФАРКТА МИОКАРДА

03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

РЯЗАНЬ — 1995

Работа выполнена в Саратовском НИИ кардиологии при Саратовском государственном медицинском университете.

Научный консультант: член-корр. РАЕН, доктор

медицинских наук профессор В. И. Рубин.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Давлетов Э. Г., доктор медицинских наук, профессор Б л и н о в В. А., доктор медицинских наук, профессор Узбекова Д. Г.

Ведущая организация — Российский государственный медицинский университет.

Защита состоится «_ »_ 1995 г. в_

часов на заседании диссертационного совета Д 084.67.02 при Рязанском государственном медицинском университете имени академика И. П. Павлова (391000, г. Рязань, ул. Высоковольтная, 9).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан « ¿6 » ^ _1995 г.

Ученый секретарь диссертационного

совета, кандидат биологических наук Е. А. Рязанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В основе возникновения любых патологических процессов в клетках, тканях и организме лежит дестабилизация структурно-функциональных свойств биомембран под воздействием неблагоприятных факторов внешней или внутренней среды (Биленко М.В., 1989; Владимиров Ю.А., 1989; Clemens H.H., v/aller H.D., IS©7). Это позволяет широко использовать выраженность снижения барьерных функций клеточных мекбран в качестве диагностического и прогностического критерия течения и исхода заболеваний независимо от их этиологии и патогенеза.

В соответствии с рекомендациями ВОЗ диагноз острого инфаркта миокарда монет быть поставлен при наличии у пациента, как минимум, двух из нике перечисленных факторов: характерные жалобы больного, характерные изменения на электрокардиограмме, характерная динашка преходящей гиперферментемии (Малая Л.Т. и др., I9S0; Чазов Е.И., 1982; Silber u., 1987).

Значимость ферментной диагностики ИМ резко возрастает при от- " сутствии четких электрокардиографических признаков заболевания, что обычно наблюдается при рецидивирующих (Суркин А.Л. и др., 1981) или повторных инфарктах Шопов В.Г., 1971; Чазов Е.Й., 1973), а также при осложнении течения основного заболевания нарушениями сократимости и проводимости сердечной ышцы (Фридберг Ч.К., 1975;. Schafer J.E. et al., 1989). В этих случаях биохимические теста становятся единственными объективными методами подтверждения или исключения предполагаемого диагноза ИМ (Титов В.Н., 1988; Walter А Р.", 1976; Sljaoons М.Ь., .1988).

В настоящее время для неотловной кардиологии общепринятыми ' "инфарктными" тестами являются: определение- активности креатин-фосфокиназы, аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы и ее изофорыы - гидрооксибутиратдегидрогеназы (Захария Е.А., и др., 1989; Junker V«I>. et al., 1990).

Отличительной чертой трех последних энзимов служит то, что наряду с некротизированныии ыиоцитаыи источником их повышенной активности в кровотоке могут быть поврежденные клетки печени, почек и форменные элемента крови, в частности эритроциты, изофер-ментный спектр ДДГ которых полностью совпадает с миокардиальшш (Hillis L.D., Braunwaed В., 1^77; Chapell J.P., 1980). . ;.

Последнее заставляет критически относится к традиционному отождествлению данных, получаемых' при ферментных исследованиях сыворотки,с биохимической картиной крови, имеющей место in vivo, что представляется некорректным по ряду причин.

Во-первых, в отличие от других жидкостей, формирующих: внутренне» среду, кровь не однородна по своему составу, так как вместе.с плазмой в нее входят форменные элементы: эритроциты, лейкоциты и тромбоциты, из которых в количественном отношении красные клетки крови составляют почти 100 процентов.

Во-вторых, форменные элементы 'крови являются соматическими клетками с автономным метаболизмом, ферментные системы которого во многом совпадают с клетками других органов и тканей организма, в первую очередь с миоцитама (Schoter w., 1974).

В-третьих, интрацеллюлярная активность форменных элементов крози по сравнению с плазмой на несколько порядков вше, поэтому любое изменение их мембранной проницаемости должно вести к неспецифическому росту фермеитемии.

В-четвертых, имеются отдельные наблюдения, свидетельствующие о более высокой активности диагностически важных ферментов в сыворотке крови по сравнению с плазмой (Яблучанский Н.И., 1987; Cohen Ii., Laser L., 1966).

Несмотря на все перечисленные вше обстоятельства, ни у нас в стране, ни за рубежом не проводилось исследований, посвященных влиянию свертывания крови на мембранную проницаемость ее форменных элементов, а также не была дана научная опенка правомерности использования сыворотки кроеи в качестве адекватного объекта биохимических анализов, в первую очередь ферментных.

Цель работы. Исследование влияния свертывания крови in vitro на состояние структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов и использование выявленных биохимических механизмов в качестве теоретической основы для разработки комплекса методических приемов, повышающих специфичность и надежность классических ферментных тестов, применяемых в неотложной кардиологии.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние свертывания крови vitro на мембранную проницаемость ее форменных элементов.

2. Изучить основные биохимические механизмы, приводящие к дестабилизации структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов при.свертывании крови ia vitro.

3. Выявить пусковой механизм дестабилизации мембран эритроцитов при свертывании крови in vitro- к роль экстрацэллюлярного кальция в повышении их мембранной проницаемости.

4. Провести сравнительное исследование динамики активности ферментов с сочеталиой миокардиально-эритроцитарной специфичностью в сыворотке и плазме больных острым ИМ,, леченных традиционно и с помощью иктракоропарного тромболизиса. .

5. Выявить неинвазивные критерии тромболитической реперфузии инфарктзависимой артерии и ферментативными методами оценить влияние способа лечения на ограничение размеров некроза сердечной мышцы.

6. Изучить влияние факторов внешней среды (контакт образцов крови с. атмосферным кислородом, эффект "старения" проб и эффект "разведения") на специфичность ферментной диагностики острого ИМ.

7. Разработать комплекс методических; приемов, повышающих надежность лабораторной диагностики острого КМ за счет роста специфичности и разрешающей способности классических "инфарктных" тестов.

Научная новизна исследования.

В результате проведенных экспериментальных исследований нами разработана научная концепция дестабилизации структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов в процессе свертывания крови in vitro. Предложена принципиальная схема "порочного" круга био-хлшческих реакций коагуляционного микрогемолиза красных клеток крови, в соответствии с которой пусковым механизмом деструкции их мембран служит инициация свободнорадикального и перекисного окисления при контакте образцов крови с атмосферным кислородом, способствующая активации кальций-зависимого ферментативного фос- ; фолиполиза.

Выявлено свойство цитрата натрия оказывать опосредованный мембраностабилизирующий эффект в отношении красных клеток крови, обусловленный способностью данного антикоагулянта свяеывать свободные ионы кальция, пассивное вхождение которых в эритроциты 9ттоглирует реакции цитотоксического кальциевого каскада.

Дано теоретическое обоснование выявляемым различиям в уровне активности "инфарктных" ферментов с сочетадаой миокардиально-эритроцитарной специфичностью в сыворотке и плазме крови. Показано, что предпочтительным объектом исследований для этой группы

энзимов должна служить не сыворотка, а цнтратная плазма крови.

Одними из первых в стране показаны особенности динамики преходящей гиперферментемии у больных острым ИМ, леченных с помощью интракоронарного тромболиэиса, а такие разработаны неинвазивные биохимические критерии коронарной реперфуэии, позволяющие с высокой степенью достоверности судить о реканалиэацки инфаркт-зависимой артерии.

Выявлены физико-химические закономерности денатурационных изменений активности "инфарктных" ферментов с сочетанной миокарди-ально-эритроцитариой специфичностью в процессе хранения образцов крови и в результате действия эффекта "разведения", а также разработаны методические приемы их коррекции.

Практическая значимость. На основании результатов проведенных исследований разработан комплекс методических приемов, повышающих надежность й диагностическую ценность ферментной диагностики острого ИМ, применение которого в практической деятельности биохимических лабораторий кардиологических и терапевтических стационаров без каких-либо материальных затрат позволяет:

- повысить специфичность и разрешающую возможность АсТ, ДДГ к ГВДГ тестов более чем в два раза;

- расширить временной интервал их диагностической ценности;

- использовать любой из "инфарктных" ферментов с сочетанной • миокардиально-эритроцитарной специфичностью для неинвазивного

контроля за успешностью рекакалкззци;: ::::фср:ст-псиПг.кыиД артерии;

- ферментативными методами оценивать влияние способа лечения на ограничение размеров некроза сердечной мышцы;

- избежать появления локнополокительных и ложноотрицательных результатов ферментных исследований, вызываемых эффектами "старения" и "разведения" образцов крови.

Внедрение. Научная концепция дестабилизации мембран эритроцитов при свертывании крови in vitro изложена в статьях, ' опубликованных 'в центральной печати. Разработанный комплекс методических приемов, повышающих надежность биохимическая диагностики ИМ, опубликован в виде методических рекомендаций "Ферментная диагностика острого инфаркта миокарда", утвержденных зам.министра IB А.М.Москвичевым (6.10.92).

Апробация работы. Апробация диссертационной работы состоялась 9 июля 1994 года на расширенном заседании Ученого совета Саратовского НИИ кардиологии я кафедры пропедевтики внутренних болезней Саратовского государственного медицинского университета.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 25 публикациях.

Объем «структура работы. Диссертация изложена на 300 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 таблицами и 38 рисунками. Состоит из введения и 10 глав, содержащих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результатов собственных наблюдений, а также заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, включающего 135 работ отечественных и 324 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы образцы крови, полученной от 523 доноров (средний возраст 21,2 года), среди которых было 319 мужчин и 204 женщины. Включение доноров в грущу практически здоровых лиц осу- . ществляли при отсутствии у них в анамнезе заболеваний, способных вызывать повшеиие мембранной проницаемости форменных элементов крови или сопровождаться неспецифической сывороточной гиперфер-ментешей: острые гепатиты и панкреатиты любой этиологии, острая почечная недостаточность, язвенная болезнь желудка или двенадцатиперстной кишки в период обострения, сахарный диабет и другие гормональные расстройства, генетически обусловленные или приобретен-, ные болезни крови.

Под наблюдением также находилось 217 больных острым трансцу-ральным ИМ в возрасте от 34 до 79 лет (средний возраст 56,3 года), среди которых было 172 мужчины и 35 женщин, поступивших в клинику СарЗЛНИИК не позже 12 часа с момента заболевания. У 73 больных наблюдаемый Ш бьи первой манифестацией ишемической болезни сердца, 64 пациента имели в анамнезе один и более перенесенных ИМ, 80 человек до этого находились на амбулаторном или стационарном лечении по поводу стенокардии различных функциональных классов.

Диагноз острого трансмурального ИМ устанавливали на основании приступа типичных загрудинных болей,не купирующегося наркотическими аналгетиками, и характерных электрокардиографических признаков: появления патологического зубца Q или синдрома QS с измененной конечной частью сегмента ST (Афончиков Ю.В. и др., 1991; Lavis G.Y., 1990). В дальнейшем диагноз подтверждался характерной динамикой преходящей гиперферментемии.

Кеослокненное течение болезни имело, место у 128 больных, тяжелое, ослонненное - у 89 пациентов, из которых за период наблюдения в острую фазу заболевания умерло 35 человек.

При подборе больных ИМ, включенных в исследование, придерживались тех же ограничений, что и при выборе доноров, составивших группу практически здоровых лиц. В связи с отим у наблюдаемых пациентов основным сопутствующим заболеванием была гипертоническая болезнь (42,8 %), хронический бронхит встречался в 7,3 % случаев, у пяти больных (2,3 %) в анамнезе была язвенная болезнь нелудка, четверо (1,8 %) страдали аденомой предстательной железы.

Лечебные мероприятия, проводимые пациентам в палатах интенсивной терапии, являлись традиционными (Мазур H.A., IS88; Yusuf s. et al., 1990), и были направлены на купирование болевого приступа, нормализацию сердечного ритма, стабилизацию артериального давления, ликвидацию сердечно-сосудистой и легочной недостаточности. В остром периоде все больные в качестве антикоагулянта получали раствор гепарина, в дальнейшем профилактика ретромбозов проводилась с помощью аспиринотерапии.

У 44 больных, поступивших в клинику не позднее 6 часов с начала заболевания, традиционная терапия была дополнена интракоронарным тромболизисом препаратом стрептокиназы (Голиков А.П. и др., 1988; Eugeaholtz P.G. et al., 1989), который проводили на рентге-ноангиографическом комплексе "PoiyDi&gnost-c" с генератором "Орьimuai-M200" фирмы "Pnilips" (Голландия), оснащенным оборудованием для цифровой субтракционной ангиографии DVI-2CV той же фирмы.. В этой группе больных ИМ реканализация инфаркт-зависимой артерии была достигнута в 32 случаях. Среди пациентов с безуспешным тромболизисом погибло трое: два в процессе проведения ИКТ, один на следующие сутки.

Объектом исследования являлась кровь больных ИМ и практически е-дсроБчх лиц, которую забирали путем пунктирования кубитальной вены. .В зависимости от поставленных задач в работе использовали

следующие образцы венозной крови: сыворотка и цитратная плазма крови; фракции форменных элементов крови (Кузник В.И., 1965); эритроцитарная масса, полученная из цельной и цитратной крови (Климов А.Н. и др., 1984); мембраны эритроцитов, ввделенные из цельной и цитратной крови (Федотов Э.А., 1984); липидная фракция мембран эритроцитов, вццеленных из цельной и цитратной крови (Тырышкин A.M. и др., 1987).

Для оценки влияния свертывания крови на основные структурно-функциональные свойства мембран эритроцитов использовали следующие биохимические методы и показатели:

1. Определение концентрации свободного гемоглобина (Van Kampea E.L., Zijlstra W.G., I96I)X.

2. Определение концентрации пировиноградной кислоты (Ещенко Н.Д., 1982).

3. Определение концентрации молочной кислоты (Ещенко Н.Д., 1982).

4. Величина окислительно-восстановительного потенциала системы лактат/пируват (Райскина М.Е., 1970).

5. Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (КиЪу S.A. et al., I969)x.

6. Определение перекисной резистентности мембран эритроцитов (Юрков Ю.А. и др., 1984).

7. Определение концентрации общих липидов (Knight д. et al., 1972).

8. Определение концентрации общих фосфолипидов (Покровский А.А., 1969).

9. Определение фосфолипидного состава меибран эритроцитов методом тонкослойной хроматографии (Тырышкин A.M. и др., 1987). •

10. Определение содержания свободных агарных кислот (Прохоров.' M.D. и др., 1977).

11. Определение концентрации общего холестерина эритроцитов (Richmond W., 1972)*.

12. Определение концентрации малоновых диальдегидов (Суплов Q.H., Баркова Э.Н., 1986).

13. Определение активности эритроцитарной фосфолипазы Ag (Безрукова Г.А., Рубин В.И., 1989).

х

Методы, адаптированные к определению в полуавтоматическом режиме на химической анализаторной системе ФП-900 фирмы "Labsynteas" по разработанным нами программам.

14. Определение активности суперокскддисмутазы (Fried н., 1975).

15. Определение активности каталазы по методу М.А.Королюка (1988) в напей модификации.

16. Определение концентрации дисульфидных и сульфгидрильных групп белковой и небелковой природы по методу К.М.Рубииой (1961) в нашей модификации.

17. Определение концентрации аденилатнуклеотидов (Комаров Ф.И. идр., 1976).

18. Величина аденилатного энергетического заряда и отношение действующих масс аденилаткиназной реакции (Косенко Е.А. и др., 1987).

19. Определение активности глутатионредуктазы ( Beutler в., 1963)х.

20. Определение активности транспортных аденозинтрифосфатаз (Федотов Э.А., IS34).

21. Определение концентрации внутриэритроцитарного кальция (Меньшиков В.В., 1987)х.

22. Видимая энергия активации ферментных реакций ( Wevers R.A. ' et al., 1985).

Биохимическая диагностика острого Ш основывалась на мониторыом исследоваши динамики активности АсТ, ДЦГ и ГВДГ в сыворотке и цит-ратной плазме крови, которые определяли кинетическими методами с помощью наборов реактивов фирм "Orion" и "Labsystems" (Финляндия) . в полуавтоматическом режиме на химической анализаторной системе

ЖГТ Г>ЛЛ ___U V _

vu-ítw тем же фирмы в соответствии с указаниями S.C.E.

Все цифровые данные обрабатывали с обязательным, учетом степени разведения образцов крови, пользуясь методом вариационной статистики с определением t критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ РШЩЦОВАНИЯ

Сравнительный анализ в параллельных образцах сыворотки и цит-ратной плазмы крови практически здоровых лиц активности "инфарктных" ферментов с сочетанной миокардиально-эритроцитарнб'Я специфичностью показал значительное снижение уровня их активности в присутствии данного антикоагулянта (табл.1). Однако, дополнительная серия опытов не выявила ни прямого, ни опосредованного инги-

Примечание на стр. 9.

бирувдего эффекта цитрата натрия в отношении АсТ, ЛДГ н ГЕДГ, исключив тем самым одну из возмояных причин более высокой активности этих энзимов в сыворотке крови.

Верность существующего в литературе предположения (Kossrud G.o., Trick K.i)., 1973) о выходе из форменных элементов в процессе свертывания крови дополнительного количества диагностически важных энзимов.была подтверждена более высокими значениями в образцах сыворотки крови как уровня активности, так и внешней энергии активации реакции,катализируемой ферментом - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой, являющейся общепринятым маркером повышенной мембранной проницаемости (Колмаков В.Н., Радченко В.Г., 1982; Aebi Н., v/yss s.H., 1979). Аналогичные данные были получены и для "инфарктных" ферментов с сочетанной шокардиально-эритроцитарной специфичностью (табл.1).

Идентификация вида форменных элементов, барьерная функция мембран которых в большей степени снижалась при свертывании кроЕи in vitro показало (табл.2), что тромбоциты, возмогло, из-за своей малочисленности практически не влияли на прирост количества ферментов в сыворотке крови. Не вызывали статистически достоверно^ го увеличения ни одного из исследованных энзимов и лейкоциты, хотя в отдельных наблюдениях нами прослеживалась определенная тенденция к росту абсолютных значений ферментеыии. И только в случае внесения в цитратную плазму красных клеток крови,стимуляция свертывающей системы сопровождалась повышением активности Г-65-ДГ и "инфарктных" ферментов практически до тех же величин, которые определялись в сыворотке крови, полученной традиционным способом.

Деструкция мембран эритроцитов при свертывании крови in vitro также подтверждалась двухкратной разницей в концентрации свободного гемоглобина между цитратной плазмой и сывороткой крови (табл.3). Этот факт, несмотря на отсутствие видимых различий в окраске проб плазмы и сыворотки крови, позволял сделать заключение о том, что свертывание крови в пробирке всегда сопровождается микрогеыолизом.

Все указанные наблюдения свидетельствовали, что традиционно определяемый в сыворотке крови уровень активности "инфарктных" ферментов не является истинной активностью энзимов, циркулирующих в кровотоке in. vivo, а представляет собой суммарную плазмеино-эритроцитарную активность. То есть, все усредненные значения активности АсТ, ЛДГ и ГЕДГ, получаемые при массовых обследованиях практически здоровых лиц не могут рассматриваться в качестве нор-моферментемии.

• Сравнительное определение уровня активности АсТ, ДЦГ, ГЦЩ1 и Г-6-ФДГ в сыворотке и цитратной плазме практически здоровых лиц (а =50)

Объект исследования

Уровень - активности ферментов

АсТ (Е&./л) ; ВДГ (Е&./л) | ГВДГ (Б^./л) :.Г-6-§ДГ (ншр,/с.л)

X ±г> : X +г» : X ±& : X +&

24,06+4,59** (92,30+21, Г7)х 368,76+32,90** (75,90+18,82)* 172,92+17,05** (49,71+19,50)* 14,17+3,32'® (62,81+9,43)*

22,16+4,01 367,08+30,90 165,60+15,41 14,29+2,89

22,22+3,79 358,42+30,51 162,43+15,86 14,13+3,22

11,72+3,32«« (81,49+17,87)* 11,68+3,27 . 171,10+22,82** (51,83+14,52)* 157,66+28,14 80,53+12,24** (30,43+9,95)* 75,14+10,32 8,06+2,32** (51,76+8,92)* 7,98+2,21

11,74+3,77 150,91+20,44 71,44+10,07 7,99+2,25

Сыворотка крови

Сыворотка крови, содержащая цитрат Иа

Сыворотка крови, содержащая тромбин

Цитратная плазма крови

Цитратная плазма, содержащая СаС12

Цитратная плазма, содержащая тромбин Р

Внешняя энергия активацш ферментной реакции ( кдж )

моль«град

^Достоверность различий р / 0,05

Таблица 2

Влияние форменных элементов крови на уровень активности АсТ, ДЦГ, ГБДГ и Г-6Ф-ДГ практически здоровых лиц (а =50) . ,

Объект исследования Активность ферментов

; АсТ (%./л) ЛДГ (Ед./л) ; ГБДГ (Ед./л); Г-бш-ДГ (нмяль/с: :л) х 10-<з

: х Х+г> | Х+г» : Х+ &

Вестромбоцитарная плазма 11,72+3,32* 171,10+22,82х 80,53+12,24* 8,10+2,IIх

Плазма, тромбоциты 12,40+3,42 173,14+25,49 83,72+12,74 7,99+2,05

Плазма, тромбоциты и лейкоциты 13,38+3,59 194,52+20,74 92,36+14,07 8,54+2,25

Плазма,, тромбоциты, лейкоциты и 23,34+5,15х 379,61+37,52х181,78+19,71х 14,46+3,55х

эритроциты

эс * Достоверность различий . р ¡_ 0,05 - -

Повышение мембранной проницаемости красных клеток крови при ее свертывании в пробирке дополнительно оказывало искажающее воздействие на уровень нормальных концентраций основных субстратов лактатдегидрогеназной системы в жидкой части крови. Благодаря тому, что молочная кислота является главным конечным продуктом утилизации глюкозы эритроцитами (Schröter W., 1974), нарушение барьерной функции их мембран сопровождалось существенным ростом в сыворотке крови содержания лактата при незначительном увеличении уровня пировиноградной кислоты (табл.3).

Таблица 3

Влияние свертывания крови на основные субстраты ЛДГ-реакции и уровень свободного гемоглобина у практически здоровых лиц

Исследованный показатель : Обт,ект исследования

•цитратная плазма ; сыворотка крови

(п = 30) : X + ь : Х+г>

ДО (мг/дл) 9,46+1,17х 12,30+1,46х

ПВК (мг/дл) 0,732+0,075 0,766+0,089

до/пвк 12,92+1,78х 16,06+2,31х

ОВД ¡¿К/ПЕК (мв) Свободный Гб (мг/дл)

-237,69+10,32 18,13+4,86х .

-241,01+10,51 48,33+9,Iх

Достоверность различий р £ 0,05

Непропорциональное изменение концентрации основных субстратов ДДГ-реакции вело к смещению равновесия всей лактатдегидрогеназной системы сыворотки крови в сторону преобладания восстановленных, форм и, как следствие, мнимому снижению окислительно-восстанови- . тельного потенциала системы лактат/пируват.

Исследование динамики активности Г-6Ф-ДГ, "инфарктных" ферментов и содержания гемоглобина в жидкой части крови при ее свертывании ia vitro показало, что временной интервал, в течение которого происходил рост в сыворотке всех этих показателей ограничивался 30 минутами с момента забора крови. Причем наибольший прирост активности энзимов и концентрации свободного гемоглобина

отмечались в первые 15 минут нахождения ' крови в пробирке. То есть, несмотря на многократные различия в молекулярных массах исследованных ферментов и гемоглобина, скорость их выхода из эритроцитов в процессе свертывания крови при-комнатной температуре была одинакова (рис.1, 2).

Искусственное замедление свертывания крови охлаждением проб (+ 10 °С) позволило выявить, что последовательность выхода из эритроцитов гемоглобина, Г-6Ф-ДГ и "инфарктных" ферментов обратно пропорциональна величине их молекулярных масс, а, следовательно, подчиняется физико-химическим законам диффузии молекул через биологические мембраны (§райфельдер Д., 1989).

При сопоставлении временных интервалов, в течение которых при комнатной температуре отмечался рост в сыворотке крови содержания свободного гемоглобина и активности исследованных ферментов, с длительностью стадий свертывания крови (Кудряшов Б.А., 1975; Гаврилов А.К., 1981) нами бьшо.установлено, что основные изменения барьерной функции мембран эритроцитов происходят п фазу свертывания крови и формирования сгустка. Следующая за ними стадия ретракции кровяного crycTica не вызывает дополнительного выхода гемоглобина и белков-ферментов из красных клеток крови.

Все вышеперечисленные данные не только дополняют результаты многочисленных исследований, посвященных вопросам участия эритроцитов в процессах внутреннего тромбообразования (Ашкинази И.Я., 1974; lana и., et al., I988), но и показывают, что независимо от условий свертывания крови (in vivo или in vitro ) этот процесс Есегда сопровождается повышением мембранной проницаемости красных клеток крови и выходом из них биологически активных веществ белковой и небелковой природы. '>

По современным представлениям причиной дестабилизации структурно-функциональных свойств клеточных мембран и снижения их барьерной роли являются два биохимических механизма: активация ПОЛ и усиление процессов фосфолиполиза (Болдырев A.A., I98ô; Maxime н., 1985). В этом отношении повревдающее воздействие свертывания крови на мембраны эритроцитов не было исключением. У всех обследованных лиц в красных клетках цельной крови отмечалась интенсификация процессов фосфолиполиза, проявляющая себя статистически достоверным повышением уровня активности эндогенной фосфолипаэы (табл.4).

о и о

5

$ Я

В Р-,

о S

« У!

<а s

Q- V3

о

х

&

о «

ч <

л §

I

а.

л е<

о

0 К ю к

1

40

30

20

10 15

ю.

5 .

v— - -

15 _i_

30

_I_

45 _

60 _1_

75

I

90 _

120 Т/мин/

_I_

РисЛ. Динамика концентрации свободного гемоглобина и активности Г-6Ф-ДГ в процессе свертывания крови. . in vitro.

_ -О—

- в цитратной плазме крови при 24 С

- в цитратной плазме крови при 10

- в сыворотке крови при 24 °С

- в сыворотке крови при 10 °С

25 2Q

15

IQ

< 300.

ё

т о м я О) 43 200-

а, & 100-

Й

fr» •jj

Л Ä § с 150-

Л £< g 100.

К ю я

4 50 .

-------

ДЦГ

--------

ЩЦГ

15 ... i...

-------e

45 60 75

30 _1_

90 _l_

120 Т/мин/, i

Рис.2. Динамика активности "инфарктных" ферментов в процессе свертывания крови ia vitro.

--®(---в цитратной плазме крови при 24 °С

—о—г в цитратной плазме крови при 10 °С

-в— - в сыворотке крови при 24 °С

- в сыворотке крови при 10 °С

Влияние свертывания крови на основные параметры фосфолипидного комплекса мембран эритроцитов

Исследованный параметр ( п .= 30)

Эритроциты нитратной крови

X +ô

Эритроциты цельной крови

х +г>

Фосфолипаза (усл.ед.) СЖК (мкмоль/л). Общий ХС (млмоль/л) Общие ФЛ (млмоль/л) ХС/ФЛ •

$осфолипидный спектр (%);

ЛФХ - СФМ ФХ ФС ФЭА

Общий ХС (мг/дл)

0,565+0,104х 58,41+8,45х 3,65+0,41х 4,03+0,27х 0,91х

Ï,08+0,23х 25,78+1,52 31,96+2,34 16,29+3,37 24,90+2,57

цитратная плазма 200,9^20,6

0,695+0,109х 69,69+10,10х 3,25+0,24х 3,87+0,32х 0,84х

2,86+0,51х 24.62+1,82 30,63+2,23 15,89+3,56 26,13+2,44

сыворотка крови 231,5+24,7

Достоверность различий р / 0,05

Одновременно с йктивыцивй эндогенной фисфолииазы Ри^ в эритроцитах цельной крови происходило накопление свободных жирных кислот, обладающих выраженным мембранотропным действием детергенто-подобного характера (Горбатая О.Н. и др., 1984; Vander Vusee G.I. et al., 1982). Повышение в красных клетках цельной крови концентрации СШ сопровождалось незначительным снижением в них уровня общих фюсфолипидов и изменениями в количественном распределении фракций фосфолипидного спектра. Наибольшее влияние свертывание крови оказывало на лизофосфатидилхолиновую фракцию, доля которой в результате активации процессов фосфолиполизалвозраста-ла в среднем в 2,7 раза. Изменения в количественном соотношении медцу другими фракциями фосфолипидов не были статистически достоверными. Однако, у всех обследованных лиц параллельно росту ЛФК отмечалось снижение в лиПидных комплексах эритроцитов цельной кропи содержания фосфатидилхолина, сфингоьиелина и ф-осфатидил-

серина при незначительном увеличении пула фосфотидилэтаноламина.

Изменение количественной состава фосфолипидного спектра, характеризующееся ростом содержания MX, повышающего мембранную проницаемость и увеличивающего силу адгезивного притяжения красных клеток крови (Othmane А., 1990), при одновременном снижении концентрации ФХ и ФС, препятствующих гиперкоагуляции (Жихарева А.И., 1983), свидетельствовало об идентичности механизмов свертывания крови in vitro и in vivo, для которого необходимым компонентом внутрисосудистого тромбообразования является активация ферментативного фосфолиполиза (Тырывкин A.M. и др., 1987).

Свертывание крови в пробирке проявляло себя и статистически достоверным снижением концентрации общего холестерина, обладающего выраженным мембраностабилизирующим эффектом (Jeagle P.L., 1985). Так как з отличие от фосфолипидов, фиксированных в мембране посредством белковых структур (Carter J.H., 1973), холестерин связан с ФЛ менее прочной водородной связью ( Green У.В., 1975), мы считаем, что модификация фосфолипидного комплекса приводит к частичному разрыву связи между ФЛ и ХС, вследствие чего последний теряется мембраной. Об этом свидетельствовала более высокая концентрация общего холестерина в сыворотке крови по сравнению с цитратной плазмой (табл.4). Неравномерное снижение в красных клетках цельной' крови содержания фосфолипидов и холестерина вело к уменьшению микровязкости их мембран за счет падения молярного соотношения ХС/ФЛ ниже порога физиологической нормы.

Все эти изменения в структуре липидннх комплексов мембран ; эритроцитов были так-же направлены на активацию гемокоагуляцион-ных процессов. Данное положение подтверждается работами Q.F. Ahkong (1973), показавшим, что основой механизма инициированного; слияния форменных элементов крови является снижение микровязкости их мембран, обусловленное падением в них содержания общего холестерина'. . ,

Дестабилизация структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов при свертывании крови in vitro была связана не только с активацией ферментативного фосфолиполиза. Такой достоверный, хотя и косвенный признак, как снижение устойчивости эритроцитов к перекисному гемолизу ( Holliwell В., 1987), однозначно указывал на пероксидацию липидных комплексов красных клеток крови в процессе гемокоагуляции (табл.5).

Влияние свертывания крови на интенсивность ПОЛ и активность антиоксидгнтных систем эритроцитов

Исследованный параметр {g^SSS" ^^ Эритроциты цельной киови

(п = 40 •) : X ±0 X + а

Перекисный гемолиз ( %) 27,76+5,31х 44,82+7,34х

ОДНА -(нмоль на мг липидов) 13,31+0,27х 18,61+0,34х

Каталаза (ед. наг Гб)хЮ2 15,8 +1,8 14,9 +3,2

СОД (ед. на г Гб) х Ю2 85,90+15,3х 105,9+16,8х

СОД/каталаза 5,44х "7,11х

Общий глутатион (млмоль/л) 2,80+0,18 2,64+0,21

ВТ (млмоль/л) ' 2,61+0,20 2,29+0,23

ОГ (млмоль/л) 0,198+0,046х 0,369+0,094х

ВГ/ОГ 13,18х ~6,20х

ГР (ккмоль НДда-Н/мин на г Гб) 9,57+0,87х 7,68+0,71х

SH -группы (млмоль/л) 55,78+4,49х 37,98+5,66х

Достоверность различий р 0,05

Статистически достоверное увеличение в эритроцитах цельной крови концентрации малоновых диальдегидов, образующихся в результате окислительной деструкции гидроперекисей липидов (Ciemene u.R.', I9S7), являлось прямым доказательством того, что дестабилизирующее воздействие свертывания крови на мембраны эритроцитов реализует себя с помощью двух механизмов : активации' ферментативного фосфолиполиза и интенсификации процессов перекисного окисления липидных комплексов.

Свертывание крови существенным образом сникало протективше возможности антиокислительной защиты эритроцитов, в первую очередь за счет разбалансировки работы основных антиоксидантных ферментных систем: статистически достоверного повышения активности супероксиддисмутазы на фоне не меняющейся активности каталазы (табл.5). л

Механизм усиления пероксидации липидных комплексов мембран эритроцитов при свертывании крови in vitro, по нашему мнению, является следующим. Активация СОД, вызванная накоплением внутри клеток, находящихся вне кровотока, неполностью окисленных продуктов метаболизма усиливает генерацию свсбоднорадикальных форм

кислорода (Маринов B.C., 1987), что ведет к повышенному образованию перекиси водорода. В свою очередь, накапливающийся в эритроцитах пероксид в полной мере не обезвреживается каталазой, активность которой остается на прежнем уровне, и ак"уму.таруется в виде мембранотоксичных продуктов пероксидации лишдных комплексов, вызывающих гемолиз эритроцитов по типу перекисного стресса ( Burk R.F., 1990).

Свертывание крови сопровождалось также угнетением вспомогательной антиоксидантной системы - глутатионредуктазной (табл.5). Состояние, характерное для красных клеток крови на начальных ста- • диях ее свертывания, с полным основанием можно считать аналогом глутатионовой недостаточности, генетически детерминированной . (Smith J.е., 1974) или возникающей при ряде заболеваний (lankisch P. V., 1973).

Пул общего глутатиона в эритроцитах цельной крови снижался незначительно, оставаясь в пределах физиологической нормы. Однако, нарушение нормального количественного распределения между фракциями восстановленного и окисленного глутатиона вело более чем к двукратному уменьшению величины отношения ЕГ/ОГ, указывающему 0 на истощение емкости глутатионовой системы эритроцитов в целом (Бурлакова Е.В., 1986). Несмотря на чрезвычайно высокий восстановительный потенциал глутатиона (Abbott Н.Е., 1988), его концентрация была явно недостаточна для полноценной антиокислительной защиты протеиновых структур мембран, вследствие чего содержанке сульфгидрильных групп белковой природы в красных клетках крови, несодержащей антикоагулянт, падало на одну треть (табл.5).

Указанные выше изменения в структуре липопротеинового каркаса мембран эритроцитов реализовали себя и в дестабилизации их функ-циснальных свойств, являющихся, в основном, энерговависимыми ;, (Leders L. et al., 1987). Сопровождающее свертывание крови накопление в эритроцитах содержания АДФ и АШ при одновременном снижении как абсолютной, так и относительной концентрации АТФ (табл.6) однозначно свидетельствовало о падении энергетических ресурсов клеток за счет уменьшения в них уровня макроэргов. Особое внимание обращает на себя факт преимущественного по сравнению с А:й увеличения концентрации Ада, являющейся мощным агрегирую- , щим агентом (Alkhamis т.м., 1988). Такое перераспределение во фракциях аденилнуклеотидов мы рассматриваем как приспособитель-

ный физиологический механизм, обеспечивающий необратимость агрегации форменных элементов крови.

Таблица б

Влияние свертывания крови на энергетические процессы в эритроцитах

Исследованный параметр (а = 40)

Эритроциты штрат* Эритроциты цельной крови ■_: ной крови_

I +г

X + ¿>

АТФ (мкмоль/л) ДДФ (мкмоль/л) Ai© (мкмоль/л) АТФ+АДФ+АШ (мкмоль/л) Энергетический заряд АТФ х Ш/АДФ tíg- АТФ-аза2* Са-АТФ-аза55 На- К-АТФ-азак Са + (мкмоль/л) .

671,43+50,66** 207,93+22,40хх 58,42+5,92хх 937,78+41,28 0,82+0,04хх ~0,907хх 27,38±3,96хх 77,97+5,48™ 43,36+4,95хх 215,29+19, П3™

558,47+59,00хх 302,40+35,94хх 75,31±9,26хх 936,18+62,12 O.^SfP.OS?«

О^бО3™ 40,37+5,53хх 59,02+9,45хх 29,83+5,00хх 310,02+35,38х*

н 4

Удельная активность АТФ-аз - мкмоль Р„ на мг белка в мин х 10

у» 11

Достоверность различий р ¡_ 0,05

Снижение величины яденилатного энергетического заряда красных клеток цельной крови, а также почти двухкратное увеличение отношения действующих масс аденилаткиназной реакции указывали на компенсаторный сдвиг равновесия аденилатной системы в сторону энергосин-тезирующих процессов, активация которых в данных условиях была явно недостаточной, что сказывалось на работе транспортных адено-зинтрифосфатаз.

Благодаря тому, что активность последних зависит как от энергетического потенциала клетки ( Schachter D., 1988), так и от липид-ного микроокружения и наличия в молекуле энзима активных1 sh -групп ( Galo i:.g., et al., 1975), эти ферменты являются своеобразным связующим звеном между структурой и функцией биомембраны, вовлечение которого в патологический процесс замыкает "порочный" круг структурно-функциональных изменений, ведущих к гемолизу и гибели клетки ( Kaxfer , 1936).

Свертывание крови in vitro характеризовалось разнонаправленными изменениями в активности транспортных аденозинтрифосфатаз: снижением активности Na, K-ATS-азы и Са-АТЗ-азы при одновременном существенном повышении уровня активности Mg -\Т5-азы (табл.6). По нашему мнению, возникающая в условиях энергодефицита активация Mg-ATS-азы связана со специфичностью функций, присущих данному ферменту, являющемуся по своей структуре актиноподобным белком, способным вызывать натяжение мембраны эритроцита и изменять его форму ( Crespo Z.U., 1987), способствуя тем самым облегчению межклеточных взаимодействий и усиленна процесса гемо-коагуляции.

В то же время, угнетение работы ионных насосов мембраны эритроцитов, заключающееся в падении активности Ca- и На, К-АТФ-азы, вело к появлению у них пассивной катионной проницаемости и статистически достоверному накоплению в красных клетках цельной крови ионов кальция (табл.6), обладающего цитотоксическим эффектом (Петруняка Б.В., 1990).

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что в основе коагуляциодного гемолиза эритроцитов лежат'два биб-химических механизма: активация ферментативного фосфолиполкза и интенсификация процессов пероксидации их мембранных структур.

Учитывая, что интенсивность ПОЛ можно снизить изоляцией проб крови от атмосферного кислорода, способного при пассивном окислении эритроцитов инициировать в них синтез свободных радикалов (Valentine J.D., 1982) или внесением в пробы высокоэффективных синтетических ангиоксидантов (Жмуров В.Н., 1987), а активацию ферментативного фосфолиполиэа - связыванием" свободных ионов кальция (Larand L., 1979),нами была проведена серия опытов по , изучению влияния способа забора крови на мембранную проницаемость эритроцитов.

Из двух исследованных факторов: атмосферного кислорода и внеклеточного кальция, последний оказывал более выраженное воздействие на барьерную функцию красных клеток крови, что проявлялось в (¡>олее высокой концентрации свободного гемоглобина и "инфарктных" ферментов в сыворотке крови, неконтактной .с атмосферным кислородом или содержащей антиоксидант по сравнению с плазмой, экстрацелдю-лярный кальций в которой был нейтрализован цитратом натрия (табл. 7).

Влияние способа забора крови на мембранную проницаемость эритроцитов и выражешость ферментемии

Объект исследования (п = 30)

:Свободный ге-гмоглобин (мг/ : дл) :ЛДГ (Е&./л) :ГБДГ (Ей./л) АсТ (Ед./л)

! X : х ±г> : х ±г> X + г>

31,8314,73** 360,51+37,85х* 175,93+17,76** 23,25+4,90**

(72,05+16,67)* (49,60+12,45)* (78,08+15,10)*

23,87+5,25** 264,28+37,08** 105,95+19,48^ 19,10+3.79**

(71,10+11,07)* (49,05+13,71) (66,68+15,71)*

21,27+4,67 233,43+37,77 100,25+17,01 18,13+3,45

(66,32+12,57)х (48,60+12,44)* (64,69+13,03)*

17,69+3,19 176,46+25,69** е0,6%13,07**; 11,51+3,39**

(51,56+8,83)* (37,10+10,81)х (43,47+13,56)*

14,10+3.00 165,41+23,55 72,01+11;51 10,28+2,87

(50,58+11,54)* (34,23+7,11)* (39,61+8,14)*

Кровь контаяная с кислородом

Кровь не контактная с кислородом

Кровь, содержащая антиоксид ант

Кровь, содержащая цитрат натрия, контактная с кислородом

Кровь, содержащая цитрат натрия, неконтактная с кислородом

!\Э ГО

X & -

Значения энергии активации исследованных ферментов (кда/моль-град) ^Достоверность результатов р 0,05

В ряде наблюдений отсутствие контакта плазмы крови с воздухом приводило к некоторому снижению абсолютных значений активности энзимов и уровня свободного гемоглобина. Однако, статистически достоверного влияния на мембранную проницаемость эритроцитов такой способ забора крови не оказывал. Данное обстоятельство, а такие технические трудности, которые сопровождали взятие и подготовку проб к анализам в условиях исключения их контакта с кислородом, позволили нам сделать заключение, что при проведении массовых исследований без искажений истинных значений ферментемии можно использовать цитратную плазму крови, контактную с кислородом.

Ведущая роль кальций-зависимого фосфолиполиза в развитии микрогемолиза эритроцитов при свертывании крови in vitro, а также мемб-раностабилизирующий эффект цитрата натрияг обладающего свойством связывать экстрацеллюлярный кальций (Машковский М.Д., 1979) подтверждается данными, представленными в таблице 8.

Анализ взаимосвязи между концентрацией хДДА. и уровнем активности эритроцитарной фосфолипазы показал, что прямая зависимость мевду этими показателями существовала только в образцах цельной крови. Присутствие в пробах цитрата натрия, препятствующего свертыванию крови, стабилизировало уровень активности данного фермента независимо от контакта образцов крови с окружающим воздухом, не оказывая подобного воздействия на пероксидацию липидных комплексов мембрвн эритроцитов, интенсивность которых была выше в цитратной крови, контактной с кислородом.

Прямая корреляция между концентрацией внутриклеточного кальция и уровнем активности фосфолипазы Ag эритроцитов указывала на опосредованный характер активации этого энзима и развитие гемолиза по типу цитотоксического кальциевого каскада ( Freedman J.I., 1987).

В результате проведенных экспериментальных исследований нами разработана концепция дестабилизации структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов в процессе свертывания крови ia vitro и предложена следующая схема взаимосвязанных биохимических реакций, приводящих к коагулйвдонному микрогемолизу (схема I).

При контакте образцов крови с воздухом внешней среды избыточное количество кислорода, которое содержит атмосферный воздух по сравнению с альвеолярным, легко диффундирует в венозную кровь и, окисляя железо гемоглобина, генерирует свободнорадинальные процессы в условиях разбалансированной работы основных антиоксидант-

Влияние способа забора крови на интенсивность процессов ПОЛ и фосфолиполиза в эритроцитах

Объект исследования (п = 40)

ЗДА (нмоль/мг общих липидов)

5>Л-аза (ед.на : мг гемоглобина);

Эритроцитарный кальций (мкмоль/л)

х ±г>

х ±г>

х + &

Кровь, контактная с кислородом

Кровь, неконтактная с кислородом

Кровь, содержащая антиокскдант

Кровь, содержащая цитрат натрия, контактная с кислородом

Кровь, содержащая цитрат натрия, неконтактная с кислородом

19,32+3,28х 15,63+3,03х 14,13+3,06

12,99+2,49х 10,62+2,32

0,709+0,145х 0,622+0,127х 0,607+0,129

0,541+0,122х 0,519+0,119

310,02+35,38х 269,91+21,40х 263,92+20,71

251,29+19,IIх 247,60+20,68

м

Достоверность результатов р 0„05

Атмосферный кислород

I

Активация СРП и ПОЛ (дисбаланс в работе клеточной анти-оксидантной защиты)

Падение уровня макроэргов

Угнетение активных трансмембранных процессов

Вход ионов кальция-в эритроциты

Повышение мембранной-проницаемости эритроцитов

■ Активация эндогенной• фосфолипазы Ag

Выход из эритроцитов гемоглобина и ферментов в сыворотку крови

Гидролиз фосфолипидов и делипидизация мембраны

го сл

Схема I. "Порочный" круг биохимических механизмов дестабилизации структурно-

функциональных свойств мембран эритроцитов при свертывании крови in vitro

ных систем. Итогом оксидации и пероксидации мембран эритроцитов является их делипидизация и окисление реакционноспособных тиоло-вых групп белковой и небелковой природы.

Все вышеизложенное реализует себя в повшении мембранной проницаемости красных клеток крови, падении их энергетического потенциала и угнетении работы активного транспорта катионов. Благодаря высокому содержанию во внеклеточной жидкости свободных ионов кальция, последний по градиенту концентрации устремляется внутрь клеток и активизирует эндогенную фосфолипазу Ag, катализирующую гидролиз мембранных фосфолипидов. Образующиеся в результате ферментативного фосфолиполиза высокотоксичные для эритроцита метаболиты (лизопроизводные ФЛ и СЖК) усугубляют делипидизацию мембран и нестабильность их структурно-функциональных свойств, что проявляет' себя нарастанием в сыворотке крови концентрации свободного гемоглобина и ферментов эритроцитарного происхождения.

В этой связи большую практическую значимость к.дает тот факт, что использование в ферментных анализах в качестве объекта исследований не сыворотки, а цитратной плазмы крови позволяет "разорвать" каскад биохимических процессов, приводящих к повышению мембранной проницаемости красных клеток крови при ее свертывании in vitro и выходу из них дополнительного, фоноврго количества субстратов и ферментов.

Еамена сыворотки крови на цитратную плазцу не влияла на характер динамики преходящей гиперфермеятемии у больных острым ИМ. Во

плог иа/^тпппоитлатг timnr* пr\-*uciu"t.7urv у\огпппм^>п*эпм irnnnunnuw япфрпнй

----- •*———----"'1 -----------------с " - С-------------С——£-----------------

мы отмечали классический монофазный подъем активности "инфарктных" ферментов с последующей их инактивацией (рис.3). У всех пациентов нарастание активности энзимов в сыворотке и плазме крови шло строго параллельно, а длительность гиперферментемии в цитратной плазме полностью совпадала с временным периодом повышенной активности этих энзимов в сыворотке крови.

Независимо от вида биологического материала, использованного при проведении анализов, максимальная активность АсТ отмечалась в пробах крови, взятых на 36 час с момента развития у пациентов болевого статуса, а для ДЦГ и ЩЦГ - приходилась на конец вторых суток. Во избежание ложноотрицательных результатов ферментных анализов эти сроки следует учитывать при"биохимической диагностике острого ИМ в случаях стертой клинической картины заболевания или

АсТ

150-

100-

^ 50 и

0 е.

1 2000-

а,

Л

, 1500 И

к

еь

а

А И О О

Я £1

1000

500

1500

1000

лдг

500 .

ГВДГ

I. , I_I_1111_1_I_

т (чао)

ь 12 2436486072

96

120

Рис. 3. Динамика "активности "инфарктных" ферментов в

сыворотке и цитратной плазме больных ИМ, леченых традиционно

цитратная плазма крови сыворотка крови ■

нечетких электрокардиографических признаках состоявшегося некроза сердечной мышцы.

Осложнение наблюдаемого ИМ ретромбозом кроме характерных клинических и электрокардиографических признаков распространения зоны некроза сопровождалось пбявлением второй, дополнительной волны гиперферментемии как в сыворотке, так и в цитратной плазме крови. Повторное повышение активности всех исследованных "инфарктных" ферментов по своим абсолютным значениям было несколько ниже первого, что совпадало с литературными данными по сывороточной гиперферментемии при различных вариантах течения Ш (Сыркин А.Л., 1981; Chapell J.-Р., 1980).

На протяжении всего периода гиперферментемии более низкий уровень активности ферментов с сочетанной миокардиально-эритроци-тарной специфичностью отмечался в цитратной плазме, что соответствовало результатам, полученным при определении значений нормальной активности АсТ, ДЦГ и ЩЦГ в сыворотке и плазме крови практически здоровых лиц. Однако, в процентном отношении эта разница у больных острым ИМ была значительно ниже по сравнению с данными, полученными для образцов крови доноров, и ее величина зависела от времени, прошедшего с момента заболевания. По мере роста гиперферментемии разрыв между активностью "инфарктных" ферментов в сыворотке и цитратной плазме крови постепенно сглаживался и был минимальным в момент достижения энзимами своей максимальной активности. В дальнейшем, при возвращении гиперферментемии к значениям нормы это различие возрастало, хотя и на пятый день состоявшегося ИМ его величина была ниже, чем в образцах крови практически здоровых лиц.

Исследование специфичности ферментных тестов, которую оценивали по кратности увеличения активности энзимов в крови больных Ш по сравнению со средними значениями их нормальной активности, выявило, что независимо от времени, прошедшего с момента развития некроза сердечной мышцы,показатель специфичности в случае цитратной плазмы был более чем в 1,5 раза выше по сравнению с сывороткой крови (табл.9). То есть, устранение эритроцитарного ферментного "фона", сопрововдающего свертывание крови in vitro , позволяло повысить разрешающую возможность общеприняты* в кардиологии "инфарктных" тестов и, как следствие, снизить процент ложноотрица-тельных результатов ферментной диагностики острого ИМ.

Влияние объекта исследований на специфичность ферментной диагностики острого ИМ

: Увеличение активности ферментов в цитратной плаз-Длительность : ме и сыворотке крови больных Ш по сравнении со заболевания :_средними значениями нормы_

(час) : АсТ : лиг - : гбдг_

: СЫВОрОТ' • ка •плазма ;сыворот-. ка плазма :сыворот-• ка ": плазма

б 2,56 3,37 1,65 2,51 2,03 2,98

12 3,96 5,75 • 2,08 3,10 2,96 4,52

24 6,58 10,40 3,16 5,26 5,08 8,42

36 9,29 15,41 4,47 7,88 7,94 13,28

48' 8,80 13,25 5,09 10,82 10,75 19,25

60 6,29 9,92 4,94 8,87 9,01 15,65

72 4,62 7,00 3,91 6,81 6,72 11,18

С высокой степенью надежности подтвердить диагноз инфаркта миокарда биохимическими методами можно лишь в том случае, если уровень гиперферментемии у больного в три и более раз превышает средние значения нормы (Титов В.Н., 1988; Walter Р.F., 1976). Этим обстоятельством объясняются строгие временные интервалы диагностической ценности ферментных тестов, не позволяющие использовать их в первые часы заболевания. Замена объекта исследований на цитратную плазму крови обеспечивало надежные результаты биохимической диагностики ИМ при анализе активности АсТ уже через б часов с момента возникновения заболевания, а ДДГ и ПЗДГ - через 12 часов, что, соответственно, на б и 12 часов раньше чем при определении активности этих энзимов в сыворотке крови.

Помимо больных острым ОД, получавших общепринятое медикаментозное лечение, под нашим наблюдением находились пациенты, интенсивная терапия которых включала интракоронарное введение тромболити-ческого препарата стрептокиназы (Kloner H.A., 1984).

Способ лечения не оказывал влияния на характер различий между уровнем гиперферментемии в образцах сыворотки и плазмы крови этих больных. Как у пациентов, леченных традиционно, так и у больных, "подвергнутых ИКТ, активность "инфарктных" энзимов в пробах цитратной плазмы была достоверно ниже, чем в сыворотке

крови (рис.4). В связи с тем, что у этой категории больных отсутствовали случаи ретромбозов коронарных артерий, преходящая гиперферментемия характеризовалась типичным монофазным подъемом активности энзимов с последующей их инактивацией. Как нарастание, так и снижение активности ферментов в плазме и сыворотке крови шло параллельно. Наибольшие различия между уровнем активности энзимов в образцах крови отмечались в первые часы заболевания и последние часы гиперферментемии, минимальный разрыв регистрировался в период соответствующий максимальной активности ферментов в кровотоке.

Сравнительный анализ профилей кривых динамики АсТ, ДЦГ и ЩЦГ в образцах крови больных с успешным ИКТ и пациентов, получивших традиционное лечение, выявил и принципиальные особенности гиперферментемии у больных с реканализованной инфарктзависимой артерией. Несмотря на то, что в образцах сыворотки и плазмы крови пациентов обеих групп отмечалась характерная для острого ИМ последовательность выхода ферментов на свои максимальные значения, у больных с успешным ИКТ это происходило в среднем на 12 часов раньше, и максимальная активность АсТ регистрировалась на 24-й час от момента развития болевого статуса, а пик ДЦГ и ЩЦГ совпадал по времени.и соответствовал 36-му часу заболевания. По своим абсолютным значениям у отдельных больных, леченных ИКТ, максимальный уровень активности "инфарктных" ферментов и в сыворотке, и в плазме крови был вше, чем в группе контроля. Однако, статистически достоверное различие определялось лишь при.определении активности ЩЦГ.

Ускоренная динамика преходящей гиперферментемии у больных, получивших тромболитическую терапию, не была следствием введения в кровоток стрептокиназы, что подтверждалось полным совпадением профилей кривых гиперферментемии в образцах сыворотки и плазмы крови больных с неуспешным ИКТ и пациентов, леченных традиционно.

Общепринятый метод расчета массы некроза сердечной мышцы по величине прироста активности ферментов в сыворотке' (плазме) крови ( Gran.de Р., 1983) выявил невозможность использования классической математической модели в.£.БоЪе1 (1972) для оценки влияния способа лечения данного заболевания на, размеры состоявшегося инфаркта миокарда. Ускоренная динамика гиперферментемии, сопровождающая реперфузионный эффект, смещала временной интервал

250 4 АсТ

л_и

_|_и

Т (час)

6 12 24 36 48 60 72 96 120

Рис.4. Динамика активности "инфарктных" ферментов в ^ сыворотке и цитратной плазме больных ИМ, леченных

тромболизисом

—о-— цитратная плазма —в- сыворотка крови

достижения энзимами значений своей максимальной активности и за счет увеличения наклона профилей кривых гиперферментемии вела к искусственному завышению рассчитываемой массы некроза сердечной мышцы у больных с успешным тромболизисом.

Для анализа эффективности различных методов лечения острого ИМ нами был предложен расчет относительной зоны некроза миокарда, заключающийся в вычислении значений интегралов профилей кривых активности ферментов по Фортран-системе, реализующей алгоритм Симпсона для вычисления обратных интегралов:

N__т

S - у~ Е ( t. ) , где N - А-

ТТ Лг

£ (t.) - уровень активности фермента (Ед./л) в сыворотке или цитратной плазме крови в каждый момент измерения,

Т - общий, произвольно выбранный временной интервал наблюдения,

t - временной интервал, равный одному часу,

И - количество измерений.

Проведенные нами расчеты показали высокую зависимость определяемой величины интегралов кривых гиперферментемии от длительности временного интервала, в течение которого происходило наблюдение за динамикой активности "инфарктных" ферментов (табл.10). Если,как и в классических моделях, выбирался временной интервал,соответствующий периоду нарастания активности энзимов в образцах крови,величина относительной зоны некроза миокарда независимо от исследованного фермента и объекта, использованного в анализах, свидетельствовала о расширении более чем в полтора раза размеров инфаркта сердечной мышцы у больных с успешным ЙКТ по сравнению с группой контроля получившей традиционное лечение. Хотя нгии данные клинического, электрокардиографического и вентрикулографиче-ского наблюдения,а также работы других исследователей (Староверов И.И., 1990; Wolfe C.L., 1989) говорили об улучшении функции левого желудочка за счет уменьшения переинфарктн'ой зоны у больных с реканализированныш артериями.

Биохимическое подтверждение результатов клинического наблюдения за состоянием больных,леченных традиционно и ИКТ, было получено при расчете интегралов профилей кривых гиперферментемии за более длительный период,охватывающий полную динамику преходящего увеличения активности энзимов. Независимо от объекта, который использовался для анализа их активности,и вида исследованного фермента

во всех случаях величина относительной зоны некроза миокарда была достоверно ниже у больных с успешным ИКТ. Совпадение получегешх данных с результатами зарубежных ядерномагнитных исследований (Crines C.L., 1990) массы некроза сердечней шшцы у пациентов, леченных традиционно и ИКТ, свидетельствовало о правомерности применения предложенного нами метода расчета относительной зоны некроза миокарда для объективной оценки влияния способа лечения на размеры ИМ и прогноз исхода заболевашш.

Таблица 10

Значения интегралов кривых динамики гиперферментемии у больных ИМ, леченных разными методами, за различные временные интервалы наблюдения

Исследованный фермент

Интеграл динамики активности выбранный временной интервал

эрмента за т Sq./л х час )

ИКТ

Хт

TS

традиционное лечение

АсТ сыворотка плазма

2046 1650

7788 6336

1386 1056

8568 6664

ДРГ

сыворотка плазма

ЩДГ

сыворотка плазма

I5I8I 13583

12600 10800

I15855 95880

96000 83400

II985 7990

9000 6600

133433 107086

I10400 87000

Кроме рассмотренных пыле причин, приводящих к ложноотрицатель-ным и ложноположительным результатам биохимической диагностики острого Ш, на чувствительность и специфичность "инфарктных" ферментных тестов влияют такие факторы, как "старение" образцов крови при ее хранении (Wevers R.A., 1985) и эффект "разведения", заключающийся в нарушении прямой зависимости между активностью энзима в сыворотке крови и степенью ее разведения (Панченко Н.И., 1974).

В отличие от общепринятого представления о линейном снижении активности энзимов при хранении образцов крови (Веремеенко К.Н., Голобородко С.Н., 1985),мониторное наблюдение за уровнем активности "инфарктных" ферментов в сыворотке и плазме крови практически здоровых лиц и больных Ш, у которых кровь бьша взята на пике гиперферментемии, выявило полифазный характер изменения их активности при "старении" образцов крови (рис.5,6).

Линейному снижению активности энзимов, вызывающему ложноотри-цательные результаты определения, предшествовал период спонтанных колебаний, занимаюцщй независимо от исходного уровня активности фермента, температуры хранения образцов крови и объекта исследований для АсТ около двух суток наблюдения, а для ЛДГ и ГЦЦГ - трое суток. У всех ферментов эти колебания описывались • двухволновой кривой подъема их активности, которую условно можно разделить на фазу ранней и поздней активации. Периодичность появления этих фаз была индивидуальна для каждого из энзимов и находилась в обратной зависимости от величины их молекулярных масс. Появление пиков спонтанной активации, способной стать источником ложноположительных результатов лабораторной диагностики, не зависело от температурных условий хранения сыворотки или цитратной плазмы, и, как у здоровых лиц, так и у больных Ш приходилось в случае АсТ на 12 и 36 час хранения проб, а для ЛДГ и ГБДГ - на 15 и 48 час от момента забора крови. Амплитуда колебаний активности "инфарктных".ферментов по второй волне значительно превышала те изменения, которые отмечались в фазу рашиис колебаний.

Анализ размаха колебаний от значений исходного уровня активности энзимов показал обратную зависимость между сравниваемыми величинами. В процентном соотношении наибольшие изменения претерпевали образцы крови практически здоровых лиц, активность ферментов в которых при хранении сыворотки или плазмы крови достигала патологических, инфарктных значений.

Присутствие в образцах крови антикоагулянта не оказывало статистически достоверного стабилизирующего влияния ни на один из исследованных ферментов, хотя, судя по абсолютным значениям, их активность в цитратной плазме изменялась.меньше, чем в сыворотке здоровых или больных лиц.

Хранение образцов крови при пониженной температуре так же не предохраняло ферменты от колебаний активности, однако, в случае АсТ они были менее выражены. Для ЛДГ и ЩЦГ температура окружающей среды практически не влияла на степень денатурационных из-

^ АсТ • Г 120

- 60

- 40

ЛДГ 500

- 300

.100

---о'

50 _««■■»«

Т(час)

л_I_1111

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 72 Рис.5. Динамика активности "инфарктных" ферментов в процессе хранения образцов крови практически здоровых лиц:

цитратная плазма крови сыворотка крови —о— температура +24 °С . —о— температура +24 °С

--о- - температура +4 С

-о-- температура +4 С

АсТ

£

о о

Ё

0) г

о. &

к

о-

&

л

О О К я

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60

Рис.6. Динамика активности'"инфарктных" ферментов в процессе хранения образцов крови больных острым ИМ:

цитратная плазма крови сыворотка крови

_о— температура +24 °С —о— температура +24 °С температура +4 °С - -й-- температура +4 С

менений.

■ По мнению ряда авторов (Торчинский И.М., 1971), такие колебания активности энзимов в процессе их денатурации являются результатом конформационной перестройки их белковых молекул и связанного с этим изменения доступности активных центров ферментов.

Учитывая, что хранение образцов крови в зависимости от своей продолжительности может вести как к ложноотрицательным, так и ложноположительным результатам определения активности энзимов, считаем необходимым вьщелить следующие критические сроки хранения биологического материала: при'анализах активности АсТ - не более трех часов с момента забора крови, для ЛДГ и ГДЦГ - первые шесть часов.

При возникновении у больных обширных трансмуральных ИМ уровень активности ферментов в сыворотке или плазма крови обычно достигает, сверхвысоких значений, требующих для сохранения оптимальных условий проведения реакции разведения исследуемых проб. Изучение влияния степени разведения образцов крови и природы растворителя на результаты определения уровня активности "инфарктных" ферментов у здоровых и больных ИМ показало, что основные закономерности проявления эффекта "разведения", завышающего истинные значения ферментемии, являются общими для всех исследованных энзимов (табл.II, 12).

Независимо от вида растворителя наибольшую устойчивость к разведению сыворотки или цитратной плазмы проявляли образцы крови больных ИМ, в то время как разведение сыворотки, полученной от здоровых лиц, широко применяемым для этих целей физиологическим раствором вело к повышению активности энзимов до патологических величин, свойственных ИМ.

Эффект "разведения" проявлял себя и при исследовании образцов цитратной плазмы, хотя присутствие в пробах, антикоагулянта несколько. стабилизировало активность ферментов. Наименьшую устойчивость к разведению сыворотки или плазмы крови у всех обследованных лиц проявляла АсТ, а наибольшую - ГБДГ.

Выраженность эффекта "разведения" в первую очередь зависела не столько от степени разведения тестируемых образцов, сколько от физико-химических свойств использованных растворителей и находилась в прямой зависимости от их полярности. Разведение сыворотки или плазмы крови растворителем с пониженной полярностью (глицерин: физиологический раствор в объемном отношении 2:8) практически

Влияние титра разведения и природы растворителя на выраженность эффекта разведения в плазме (сыворотке) крови практически здоровых лиц

Растворитель (по мере убы- :Фер-| Гмент: Среднее увеличение активности ферментов при разведении плазмы (сыворотки) крови ( /о )

вания полярности) титр разведения

1:1 : 1:4 : 1:9

Дистиллированная АсТ вода

ЛДГ гвдг

Физиологический раствор

АсТ

адг

ГВДГ

Смесь глицери- АсТ

На С фИЗИОЛО- ттпп

гическим раст- ^ вором ЩЦГ

175,4 162,3 156,3

152.3 142,8

133.4 123,7

117.5 Ш,6

(186,9)*

(181,4)

(171,7)

(175,4) (169,7) (149,6) (138,9) (125,6) (124,4) '

257.2 (271,6) 202,1 (235,2)

168.0 (186,4)

184,7 (217,6) 173,5 (194,2)

152.1 (170,9)

131,5 (150,1) 124,9 (127,8)

116.3 (129,0)

360,5

284.2

242.3

351,2 213,8

205.8

156.9 136,8 121,2

(383.5)

(279.6) (269,2)

(369,1)

(258.6) (237,4)

(172,4) (149,4)

(135.7)

Среднее.увеличение активности ферментов при разведении образцов сыворотки крови

Таблица 12

Влияние титра разведения и природы растворителя на выраженность эффекта "разведения" в плазме (сыворотке) крови больных ИМ

Растворитель (по мере убывания полярности)_

Фер-; ыент:

Среднее увеличение активности ферментов

ки). .<

при разведении плазмы (сыворотки титр разведения

.{рови Ш

1:1

1:4

1:9

Дистиллированная вода

АсТ

адг гвдг

Физиологиче- АсТ ский раствор ддр

ГВДГ

Смесь глицерина АсТ с физиологичес- _ппр ким раствором

162,9 (176,7)** 223,8(243,5) 318,7 (327,4)

145,2 (165,8) 179,6 (191,7) 259,7 (271,6)

129,1 (138,2) 147,6 (166,1) 215,3 (236,4)

140.1 (152,3) 161,2 (184,4) 309,2 (312,6)

131.2 (145,7) 164,2 (180,2) 193,3 (204,7) 124,7 (140,6) 132,0 (158,9) 185,1 (194,6)

111.2 (115,9) 110,4 (118,6) 119,8 (129,5) 108,4 (113,8) 110,0 (117,3) 117,8 (120,6)

104.3 (108,4) -105,1 (111,9) 116,1 (119,7)

^Примечание то же, что в табл.П

полностью исключало завышение истинных значений активности "инфарктных" ферментов независимо от их исходного уровня.

Полученные данные позволяют нам рассматривать эффект "разведения" как частный вид белковой денатурации в сильно разбавленных растворах (Фрайфельдер Д., 1980), которая, как и хранение образцов крови, способна вызывать неспецифическое повышение активности энзимов и вести к ложноположительным результатам определения.

Таким образом, несмотря на то, что классические ферментный тесты не одно десятилетие широко применяются в лабораторной диагностике острого инфаркта миокарда детальное рассмотрение биохимических механизмов, лежащих в основе причин и факторов, снижающих их специфичность, позволяют разработать методические приемы, повышающие надежность и разрешающую возможность традиционных "инфарктных" тестов.

ВЫВОДЫ

1. Процесс свертывания крови in vitro приводив к дестабилизации структурно-функциональных'свойств мембран эритроцитов и их микрогемолнзу, в основе которого леиат следующие биохимические механизмы:

- интенсификация процессов перекисного окисления липидных комплексов мембран;

- снижение общей антиоксидантной защиты красных клеток крови;

- активация ферментативного фосфолиполиза;

- преобладание энергопотребляющих процессов над энергосинтези-рующими;

- снижение интенсивности активных трансмембранных катионных процессов.

2. Пусковым механизмом дестабилизации структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов при свертывании крови in vitro является спонтанная инициация свободнорадикальных процессов при ее контакте с атмосферным кислородом. Возникающая при э^ом опосредованная кальцийзависимая активация ферментативного фосфолиполиза служит основной причиной микрогемолиза эритроцитов.

3. Цитрат натрия обладает протективным эффектом в отношении мембран красных клеток крови, обусловленным способностью этого антикоагулянта связывать экстрацеллюлярный кальций, что исключает повышение внутриэритроцитарной концентрации последнего выше

значений физиологической нормы.

4. Все биохимические процессы, сопровождающие начальные стадии свертывания крови in vitro, направлены на усиление коагуляции и облегчение адгезивного притяжения эритроцитов.

5. Следствием дестабилизации структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов при свертывании крови in vitro является выход из них в сыворотку крови определенной доли биосубстратов, а также низко- и высокомолекулярных белков, в том числе ферментов, имеющих диагностическое значение при остром инфаркте миокарда.

6. Использование в качестве предпочтительного объекта ферментных анализов цитратной плазмы крови позволяет за счет устранения эритроцитарного "фона" повысить специфичность традиционных "инфарктных" тестов и расширить временной интервал их диагностической ценности.

7. Трсмболитическая реканализация инфарктзависимой артерии всегда сопровождается ускоренной динамикой гиперферментемии, что делает невозможным использование классических математических моделей расчета массы некротизированного миокарда у этой категории больных.

8. Предложенный метод расчета относительной зоны некроза сердечной мышцы позволяет объективно оценивать и.сравнивать влияние разных способов лечения на ограничение размеров инфаркта миокарда.

9. Воздействие факторов внешней среды на образцы крови (эффект "разведения, эффект "старения") служит источником как ложно-

mov v птптгггптгнгитоттитпг n£>!avir*4*nftq*rm QrmPTiATTPMHff

w . ■ . W«11MI» , >«vl»>>v>i^>VMi»* С — — — —, ---~ r~4----' ~-----

активности "инфарктных" ферментов, обусловленных денатурационной модификацией их молекулярных структур. .

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Исследование активности ферментов в цитратной плазме крови позволяет с высокой степенью надежности биохимически диагносциро-вать острый инфаркт миокарда по уровню активности.АсТ через б часов с момента возникновения болевого статуса, а по активности ДДГ и ГЦЦГ после 12 часов заболевания, что, соответственно, на

6 и 12 часов раньше, чем при определении активности этих энзимов в сыворотке крови.

2. При клинически и электрокардиографически ясном диагнозе острого инфаркта миокарда достаточно однократного определения активности фермента, временной.интервал диагностической ценности

которого совпадает со сроками поступления пациента в клинику. В диагностически сложных случаях следует исследовать полную динамику гиперферментемии или анализировать активность, как минимум, двух энзимов в сроки, соответствующие достижению ими максимальной активности в кровотоке, что при традиционном лечении для АсТ соответствует 36 часу заболевания, а для ЛДГ и ГБДГ - концу вторых суток.

3. При отсутствии инвазивных методов контроля за восстановлением кровотока в инфарктаависимой артерии в качестве объективного признака реперфузии у этой категории больных можно использовать ускоренную динамику гиперферментемии со смещением времени достижения максимальной активности АсТ на 24 час, а ЛДГ и ГБДГ - на 36 час заболевания.

4. Сопоставимые объективные результаты влияния разных способов лечения на ограничение размеров инфаркта миокарда можно получить при стандартизированном мониторном наблюдении за активностью АсТ, ЛДГ и ГЕДГ за весь период гиперферментемии и расчете интегралов профилей кривых их активности.

5. Во избежание ложноположительных и ложноотрицательных результатов определения активности ферментов следует придерживаться следующих сроков хранения образцов цитратной плазмы крови: при анализах активности АсТ - не более трех часов с момента забора крови, в случаях ЛДГ и ГБДГ - первых шести часов.

6. Для снижения искажающего влияния эффекта "разведения" на результаты определения активности ферментов у больных с обширными трансцуральными ИМ при разведении образцов крови следует использовать растворы с пониженной полярностью, например, смесь физиологического раствора с глицерином.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Безрукова Г.А., Ансимова О.М. Влияние'разведения сыворотки крови и природы растворителя на результаты определения активности ферментов крови //Принципы организации гематологической помощи. -Л., 1987. - С.307-308. '

2. Факторы, влияющие на успех интракоронарной тромболитической терапии /С.В.Штерн, Г.А.Безрукова, Ю.В.Лабунекий, И.Л.Шварц, Е.В.Котельникова, Е.Б.Коц, И.Л.Струченевская //Кардиология. -1987. - №10. - С .19-22.

3. Безрукова Г.А. Динамика общей активности лактатдегидроге-назы и ее эритроцитарной изоформы в процессе свертывания крови //Гематология и трансфузиология. - 1988. - № II. - С.25-27.

4. Безрукова Г.А. Изменения параметров лактатдегидрогеназной системы крови в процессе ее свертывания //Организация гематологической помощи. - Саратов, 1989. - C.I08-II2.

5. Безрукова Г.А., Рубин В.И. Сравнительная оценка активности лактатдегидрогеназы сыворотки и плазмы крови //Лабораторное дело. - 1989. - № I. - С.62-63.

6. Безрукова Г.А., Рубин В.И. Метод определения фосфолипазной активности эритроцитов //Лабораторное дело. - 1989. - }? 8. -

С. 18—20.

.7. Безрукова Г.А., Рубин В.И. Изменение, мембранной проницаемости эритроцитов при свертывании крови in vitro //Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 1989. - № 5. - С.22-23.

8. Сравнительная оценка эффективности интракгронарной и системной тромболитической терапии острого инфаркта миокарда /Э.Ш.Халфен, С.В.Штерн, И.Л.Шварц, Г.А.Безрукова, В.А.Золотарев, М.Е.Раковский //Кардиология. - 1989. - №8. - С. 15-19.

9. Безрукова Г.А., Иконникова Е.И. Функциональное состояние глутатионредуктазной системы красных клеток крови при ее свертывании in vitro / Саратовский НИИ кардиологии. - Саратов, 1989. -

8 с. - Деп. в ВИНИТИ 21.09.89 Jf> 6035. - В.89.

10. Безрукова Г.А., Ансимова О.М. Закономерности денатурации креатинфосфокиназы, аспартатаминотрансферазы и лактатдегидрогеназы в процессе старения образцов сыворотки крови /Саратовский НИИ кардиологии. - Саратов, 1990. - 12 с. - Деп. в ВИНИТИ 26.03.90

Н> I62I-B.90.

11. Рубин В.И., Безрукова Г.А. Дестабилизация липидных структур эритроцитов.при свертывании крови //Вопросы медицинской химии. -1990. - № 3. - С.32-34.

12. Безрукова Г.А., Рубин В.И. Факторы вызывающие мембраноде-струкцию эритроцитов при свертывании крови ia vitro //Противо-тромболитическая терапия в клинической практике. Вопросы фибрино-лиза и тромбсшиза: Тез .докладов. - М., I9S0. - С.35-36.

13. Безрукова Г.А., Рубин В.И.. Активация процессов перекисного окисления липидов в эритроцитах при свертывании крови //Гематология и трансфузиология. - 1990. - № 7. - С.8-9.

14. Безрукова Г.А.; Ансимова О.Ы., Рубин В.И. Ферментная оценка зоны некроза у больных инфарктом миокарда, лечебнных интракоро-нарным введением прнпарата стрептокиназы //Метаболическая реанима- . ция (Регуляция обменных процессов в клинической реаниматологии). -Саратов, 1990. - C.I40-I4I.

15. Безрукова Г.А. Роль молекулярного кислорода в повышении проницаемости мембран эритроцитов //Ш Всесоюзный съезд гематологов и трансфузиологов: Тез.докладов. - М., 1991. - T.I. - С.46.

16. Безрукова Г.А. Способ спектрофотометрчческого определения количества сульфгидрильных групп //1У Всесоюзный съезд фрачей-лабо-рантов: Тез.докладов.- Ивано-Франковск, 1991. - С.124.

17. Безрукова Г.А., Рубин В;И., Ансимова О.М. Исследование фер-. ментов в цитратной плазме крови //Лабораторное дело. - 1991. -

№ 3. - С.29-31.

18. Безрукова Г.А., Ансимова Q.M., Рубин В.И. Влияние молекулярного кислорода и ионов кальция на мембранную проницаемость эритроцитов //Лабораторное дело. - 1991. - № 9. - C.3&-4I.

19. Безрукова Г.А. Свободнорадикальное окисление липидных структур мембран эритроцитов как пусковой механизм повышения мембранной проницаемости красных клеток крови при ее свертывании in vitro //Гематология и трансфузиология. г 1991. - № II. - С.7-9.

20. Безрукова Г.А. Влияние свертывания крови на аденилатнуклео-тидный обмен эритроцитов практически здоровых лиц //Патол.физиол. и экспер.терапия. - 1992. - № I. - С.46-47.

21. Безрукова Г.А., Рубин В.И. Влияние свертывания крови на уровень активности транспортных аденозинтрифосфатаз эритроцитов //Гематология и трансфузиология. - 1992. - № 3. - С.31-33.

22. Безрукова Г.А. Метаболические аспекты повышения мембранной проницаемости эритроцитов при свертывании крсви //Обмен веществ в норме и патологии. - "йомень, 1992. - С.9.

23. Безрукова Г.А. Ферментная диагностика острого инфаркта миокарда. Методические рекомендации. - Саратов, 1992. - 24 с.

24. Безрукова Г.А., Ансимова О.М., Рубин В.И. Использование сыворотки и плазмы крови для ферментной диагностики инфаркта миокарда //Клиническая лабораторная диагностика. - 1993. - № 6. -

С.13-15. .

25. Безрукова Г.А., Темкин R.M. Ферментная диагностика инфаркта миокарда с помощью энзимов, обладающих сочетанной миокардиально-эритроцитарной специфичностью //Актуальные проблемы кардиологии.

- Саратов, 1995. - С.82-84.

Список принятых сокращений и обозначений

АДФ - аденозиццифосфорная кислота АШ - аденоэинмонофосфорная кислота АТФ - аденозинтрифосфорная кислота АТФ-ааа - аденозинтрифосфатаза АсТ - аспартатаминотрансфераза ВТ - восстановленный глутатион Гб - гемоглобин

ГБДР - щдрооксибутиратдегидрогеназа

ГР - глутатионредуктаза

Г-6-ЩР - глюкоз о-б-фосфатдегвдрогеназа

ИКТ - интракоронарный тромболизис

ИМ - инфаркт миокарда

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

ЛФХ - лизофсофатидилхолин

ЩА - малоновые диальдегиды

№ - молочная кислота

ОВД - окислительно-восстановительный потенциал

ОГ - окисленный глутатион

ПШ - пировиноградная кислота

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СЖК - свободные жирные кислоты

СОД - супероксвддисцутаза

СМ$ - сфингоыиелин

ФЛ - фосфолипиды

ФЛ-аза - фосфолиназа •

ФС - фосфатдилсерин

ФХ - фосфатдилхслин

ФЭА - фосфатидилатаноламин

ХС - холестерин

Формат 60Х841/,в. Усл.-печ. л. 2,55. Тираж 100 экз. Заказ 4465.

Типография издательства «Слово», Саратов, ул. Волжская, 28.